HK1225065B - 应用改变的辅助噬菌体制备抗原结合分子的方法 - Google Patents

Description

应用改变的辅助噬菌体制备抗原结合分子的方法

技术领域

[相关申请]

本专利申请基于2013年9月30日申请的日本国专利申请2013-203528号主张优先权，同时所述在先专利申请中的全部公开内容通过引用成为本说明书的一部分。

本发明在一个实施方式中涉及制备展示抗原结合分子的噬菌体的方法等。

背景技术

抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多个IgG型抗体药物上市，目前还有多个抗体药物在开发(非专利文献1和非专利文献2)。另一方面，作为可适用于第2代抗体药物的技术，开发了各种技术，报道了提高效应子功能、抗原结合能力、药物动力学或稳定性的技术或降低免疫原性风险的技术等(非专利文献3)。

作为使抗体高功能化的方法之一，双特异性抗体（bispecific antibody; BsAb）等的多特异性抗体近年来得到关注。BsAb是通过在1个分子内具有能够结合2个不同的抗原决定簇（表位）的部位而能够与2种抗原结合的多价抗体中的一种。

BsAb中通常包含2种H链和2种L链，制备BsAb时的问题是，将这些H链和L链导入1个细胞表达时，免疫球蛋白的H链以及L链随机组合，因此可能产生10种不同的抗体分子（非专利文献4、专利文献1）。产生的10种抗体中，具有期望的双特异性的抗体只有通过组合正确的H链和L链、进一步组合结合特异性不同的2组H链以及L链对而构成的1种抗体。

作为用于解决该问题的方法，已知将产生的H链有效地异二聚化的方法。例如，已知的是，向2个CH3结构域导入彼此立体互补的结构的方法（非专利文献5、专利文献2）；利用IgG与IgA的CH3结构域不彼此结合的性质，将2个CH3结构域通过以IgG衍生的序列和IgA衍生的序列相互不同地置换而仅制成期望的组合的方法（SEEDbodies: 非专利文献6）；通过向CH3结构域导入突变、利用2个H链的电荷相互作用促进二聚化的方法（专利文献3）等。

但是，通过这些方法制备的H链也仍然可以与错误的L链形成对。因此，报告了促进H链的异二聚化、同时制备具有共同L链的多特异性抗体的方法。作为获得共同的L链的方法，已知的是，通过制备L链的文库、将其与2个抗体的H链连续地组合筛选能够与各自的抗原结合的抗体，获得共同L链的方法（专利文献4）；从L链的所有组分受限的抗体文库获得与不同的抗原结合的抗体、从这些之中选择具有同一L链的抗体的方法（非专利文献7、专利文献1）；制备改组2种抗体L链的CDR而成的嵌合L链、筛选能够与两种抗原结合的共同L链的方法(非专利文献8)；免疫导入了特定L链基因的转基因小鼠获得L链是共同的抗体的方法（专利文献5、专利文献6）；从导入了特定L链基因、仅H链具有多样性的抗体文库，获得与不同的抗原结合的抗体，获得L链是共同的抗体的方法（非专利文献14）等。

另外，作为其它方法，也已知的是，通过改变H链和L链的恒定区促进选择性异二聚化的方法(专利文献3)；通过交叉H链可变区/L链可变区（VH/VL）或H链恒定区CH1/L链恒定区（CH1/CL）制备仅期望的异二聚体的方法（Crossmab: 专利文献7)；配制2种抗体之后、通过体外二硫键异构化制备双特异性抗体的方法（DuoBody: 专利文献8）等。

另外，与获得共同的H链的方法相关联，已知应用共同H链文库、以及L链文库，获得对各种抗原的抗体之后，通过共同H链和2种L链(κ链、λ链)制备双特异性抗体的方法（Kappa-Lambda Body：专利文献11）。

另外，也考虑获得识别对同一抗原的不同表位的抗体、作为双特异性抗体(特别地，双互补位抗体(biparatopic antibody))利用。通过抗原结合双互补位抗体，抗原即使为单体也可通过双互补位抗体交联，形成免疫复合体（Immune complex; IC）。通过生物体中形成免疫复合体，期望该免疫复合体从血中快速清除（专利文献9）。

另一方面，作为获得抗原结合分子的方法之一，噬菌体展示（phage display）技术被日益广泛采用。噬菌体展示技术是，例如，抗体的H链可变区以及L链可变区在噬菌体的颗粒上展示的技术。通过应用本技术制备展示序列不同的抗体的多数噬菌体群（噬菌体抗体文库），从这些之中选择（挑选）与任意抗原结合的抗体，能够获得与期望的抗原特异地结合的抗体。

噬菌体展示技术中应用的代表性的噬菌体是丝状噬菌体M13。噬菌体颗粒上的抗体展示通常可如下进行：将编码g3p等噬菌体外壳蛋白质的基因与抗体的H链可变区的基因以及L链可变区的基因连接而成的基因插入噬菌粒载体，将其导入大肠杆菌，大肠杆菌用辅助噬菌体感染。对于从噬菌体抗体文库的抗体的筛选，将固定化的抗原与抗体文库混合，通过结合、洗涤、洗脱操作（淘选，panning），能够选择（挑选）展示可与抗原结合的抗体的噬菌体。回收的噬菌体可通过感染作为宿主的大肠杆菌等而扩增，通过应用如此扩增的噬菌体重复淘选，能够提高与抗原特异性结合的抗体的比率（非专利文献9）。

通过噬菌体展示方法获得抗体片段时，通常，以Fab或单链Fv（scFv）与噬菌体外壳蛋白质的融合蛋白质的形式制备抗体文库。起初应用包含噬菌体的全部基因信息的噬菌体载体，但是，现在应用噬菌粒载体的方法成为一般性的。噬菌粒载体是尺寸比噬菌体载体小的质粒载体。将编码要展示的蛋白质的基因与编码基因3、基因8等噬菌体外壳蛋白质的基因的N末端侧连接，将得到的基因插入噬菌粒载体。噬菌体展示方法中，编码展示的蛋白质的基因需要包装在噬菌体颗粒内，因此，在噬菌粒载体上需要噬菌体的包装信号。另外，为了从含有噬菌粒载体的大肠杆菌产生噬菌体，需要感染供给噬菌体的结构蛋白质等的M13KO7、VCSM13等辅助噬菌体。

应用如此制备的噬菌体抗体文库，作为鉴定对目的抗原具有高亲和性的抗体片段的方法，也可应用链改组。在本方法中，例如，编码抗体的抗原结合部位（例如，L链可变区）的多核苷酸通过随机或定点诱变而多样化，另一方面，编码抗体的其它抗原结合部位（例如，H链可变区）的多核苷酸是固定的。这可以如下实现，例如，将编码与目的抗原结合的抗体的H链可变区的野生型多核苷酸克隆到具有多样化L链可变区多核苷酸的文库的噬菌体展示载体系统中，随后，筛选以高亲和性结合抗原的抗体。典型地，起初，边固定H链可变区，边改组L链可变区。利用这样的L链改组的抗体的亲和力成熟的方法可列举，利用包含pLf1T-3（L链）噬菌粒载体和pHg3A-3（H链-基因3）质粒的组的双载体系统-III (DVS-III)的方法（非专利文献15）；应用H链可变区的噬菌体展示文库，对抗原进行淘选操作，随后，对通过淘选操作富集的H链可变区结合文库化的VL基因，再次进行淘选操作的方法（非专利文献16）。

另外，噬菌体展示法也作为用于人源化与目的抗原结合的非人动物衍生抗体的手段使用。例如，对小鼠免疫并将得到的抗体的H链固定，与人幼稚衍生(Naive-derived)L链抗体文库组合，对抗原进行淘选操作而得到人衍生抗体L链，随后，将L链固定并与人幼稚衍生H链抗体文库组合，对抗原再次进行淘选操作，可进一步得到人衍生抗体H链。如此地，通过相继地与人抗体文库置换，以非人动物衍生抗体为基础可获得人抗体（非专利文献17）。

关于改变辅助噬菌体的基因改良噬菌体展示的例子，存在一些报告。例如，已知Hyper噬菌体(非专利文献10)、CT辅助噬菌体(非专利文献11)、Ex-噬菌体（非专利文献12）等。另外，作为向噬菌体的基因组导入外来基因的例子，报告了导入编码抑制药物抗性基因的物质的基因的例子（非专利文献13、专利文献10）。但是，迄今没有报告构建适于改变辅助噬菌体、获得L链或H链是共同的抗体的新颖噬菌体展示方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1 : WO98/50431

专利文献2 : WO96/27011

专利文献3 : WO2006/106905

专利文献4 : WO2004/065611

专利文献5 : WO2011/097603

专利文献6 : US2010/0146647

专利文献7 : WO2009/080251

专利文献8 : WO2008/119353

专利文献9 : WO2013/081143

专利文献10 : WO2009/108406

专利文献11 : WO2012023053

非专利文献

非专利文献1 : Nat Biotechnol (2005) 23, 1073-1078

非专利文献2 : Eur J Pharm Biopharm (2005) 59, 389-396

非专利文献3 : Mol Cells (2005) 20, 17-29

非专利文献4 : Methods Enzymol (1986) 121, 210-228

非专利文献5 : Protein Eng (1996) 9, 617-621

非专利文献6 : Protein Eng Des Sel (2010) 23, 195-202

非专利文献7 : Nat Biotechnol (1998) 16, 677-681

非专利文献8 : PLoS One (2013) 8, e57479

非专利文献9 : Methods Enzymol (1993) 217, 228-257

非专利文献10 : Nat Biotechnol (2001) 19, 75-78

非专利文献11 : Nucleic Acids Res (2003) 31, e59

非专利文献12 : Nucleic Acids Res (2002) 30, e18

非专利文献13 : Proc Natl Acad Sci U S A (2009) 106, 4629-4634

非专利文献14 : J Biol Chem. 2010 Jul 2;285(27):20850-9

非专利文献15 : Immunol Lett. 2010 Aug 16;132(1-2):24-30

非专利文献16 : Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):691-700

非专利文献17 : J Mol Biol. 2000 Feb 25;296(3):833-49。

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于这种情况作出的，在一个实施方式中，其目的是，提供有效地获得在包含二条多肽的抗原结合分子中，一条多肽（第一多肽）共同、另一条多肽（第二多肽）不同的多数抗原结合分子的新方法。

解决课题的手段

本发明人对有效制备包含共同的第一多肽的多数抗原结合分子的方法进行深入研究，结果令人惊讶地发现，通过制备能够表达第一多肽的辅助噬菌体以及能够表达第二多肽的细菌，并用该辅助噬菌体感染该细菌，能够制备展示由第一多肽以及第二多肽形成的抗原结合分子的噬菌体。同时发现，通过制备能够表达氨基酸序列不同的多数第二多肽的细菌群，并用能够表达第一多肽的辅助噬菌体感染它们，能够制备展示第一多肽的氨基酸序列共同、第二多肽的氨基酸序列不同的抗原结合分子的噬菌体群（抗原结合分子展示文库）。进一步发现，从如此制备的抗原结合分子展示文库，能够获得特异性结合期望的抗原的抗原结合分子。本发明人发现，通过从该抗原结合分子展示文库分别获得与多数抗原特异性结合的抗原结合分子，能够制备与该多数抗原特异性结合的多特异性抗原结合分子，即，第一多肽在各抗原结合分子中共同的多特异性抗原结合分子。

本发明在这些发现的基础上完成，在具体的实施方式中，涉及例如以下的发明。

〔1〕 制备展示抗原结合分子的噬菌体的方法，其特征在于，包含使能够表达第一多肽的辅助噬菌体与能够表达第二多肽的细菌接触的步骤，该第一多肽与该第二多肽缔合形成该抗原结合分子。

〔2〕 〔1〕中记载的方法，其中将编码第一多肽的多核苷酸插入辅助噬菌体的基因组中。

〔3〕 〔1〕或〔2〕中记载的方法，其中将编码第一多肽的多核苷酸与启动子功能性连接。

〔4〕 〔1〕至〔3〕中任一项中记载的方法，其中第一多肽与噬菌体的外壳蛋白质融合。

〔5〕 〔1〕至〔4〕中任一项中记载的方法，其中辅助噬菌体是M13KO7。

〔6〕 〔1〕至〔5〕中任一项中记载的方法，其中细菌包含编码第二多肽的多核苷酸。

〔7〕 〔1〕至〔6〕中任一项中记载的方法，其中编码第二多肽的多核苷酸插入噬菌粒载体。

〔8〕 〔1〕至〔7〕中任一项中记载的方法，其中第二多肽与噬菌体的外壳蛋白质融合。

〔9〕 〔1〕至〔8〕中任一项中记载的方法，其中抗原结合分子是抗体可变区。

〔10〕〔9〕中记载的方法，其中第一多肽以及第二多肽分别选自包含L链可变区的多肽以及包含H链可变区的多肽，并且彼此不同。

〔11〕〔10〕中记载的方法，其中包含L链可变区的多肽是进一步包含L链恒定区的多肽，和/或包含H链可变区的是进一步包含H链恒定区的多肽。

〔12〕 制备包含共同的第一多肽的抗原结合分子展示文库的方法，其包含以下步骤：

(a) 多次进行〔1〕至〔11〕中任一项中记载的方法的步骤，其中该步骤中应用的多数细菌是能够表达氨基酸序列不同的多数第二多肽的细菌群，并且该步骤中应用的辅助噬菌体是能够表达相同氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，以及

(b) 回收步骤(a)中制备的、展示抗原结合分子的多数噬菌体的步骤。

〔13〕 通过〔12〕中记载的方法制备的抗原结合分子展示文库。

〔14〕 获得对预定的抗原特异性结合的抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a) 使抗原与〔13〕中记载的抗原结合分子展示文库接触的步骤，以及

(b) 从该抗原结合分子展示文库中选择与该抗原结合的抗原结合分子的步骤。

〔15〕 制备包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a) 对多数抗原进行〔14〕中记载的方法的步骤，以及

(b) 应用步骤(a)中获得的多数抗原结合分子中含有的、多数相同氨基酸序列的第一多肽以及多数不同氨基酸序列的第二多肽，制备多特异性抗原结合分子的步骤，其特征在于，该多数第二多肽分别与该第一多肽缔合，形成与该多数抗原特异性结合的该多数抗原结合分子。

〔16〕 制备包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a) 对多数抗原进行〔14〕中记载的方法的步骤，

(b) 对步骤(a)中获得的多数抗原结合分子中含有的、多数相同氨基酸序列的第一多肽以及多数不同氨基酸序列的第二多肽，分别配制编码该第一多肽的多核苷酸以及编码该多数第二多肽的多核苷酸的步骤，

(c) 将步骤(b)中配制的各多核苷酸导入宿主细胞的步骤，以及

(d) 培养步骤(c)的宿主细胞，回收多特异性抗原结合分子的步骤，其特征在于，该多数第二多肽分别与该第一多肽缔合，形成与该多数抗原特异性结合的该多数抗原结合分子。

〔17〕〔15〕或〔16〕中记载的方法，其中多特异性抗原结合分子是双特异性抗原结合分子。

〔18〕 制备抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a) 使能够表达与能够与预定抗原特异性结合、第一多肽以及第二多肽缔合的、作为参照的抗原结合分子（亲本抗原结合分子）的第一多肽具有相同氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，与能够分别表达与亲本抗原结合分子的第二多肽具有不同的氨基酸序列的第二多肽的细菌群接触，制备包含展示共同的第一多肽与氨基酸序列不同的第二多肽分别缔合的抗原结合分子（子代抗原结合分子）的多数噬菌体的抗原结合分子展示文库的步骤，以及

(b) 使前述抗原与步骤(a)中制备的抗原结合分子展示文库接触，选择能够对前述抗原特异性结合的子代抗原结合分子的步骤。

〔19〕 〔18〕中记载的方法，其进一步包含以下步骤：

(d) 使能够表达与〔18〕中记载的步骤(b)中得到的子代抗原结合分子的第二多肽具有相同的氨基酸序列的第二多肽的辅助噬菌体，与能够分别表达与子代抗原结合分子的第一多肽具有不同的氨基酸序列的第一多肽的细菌群接触，制备包含展示共同的第二多肽与氨基酸序列不同的第一多肽分别缔合的抗原结合分子（孙代抗原结合分子）的多数噬菌体的抗原结合分子展示文库的步骤，以及

(e) 使前述抗原与步骤(d)中制备的抗原结合分子展示文库接触，选择能够对前述抗原特异性结合的孙代抗原结合分子的步骤。

〔20〕 改变的辅助噬菌体以及该辅助噬菌体可感染的细菌的组合，其特征在于，该辅助噬菌体是能够表达第一多肽的辅助噬菌体，并且该细菌是能够表达第二多肽的细菌，该第一多肽与该第二多肽缔合形成抗原结合分子。

〔21〕 能够表达特定多肽的改变的辅助噬菌体，该多肽是以缔合形成抗原结合分子为特征的二条多肽中的任一个。

〔22〕 本领域技术人员当然理解，上述中记载的1个或多数实施方式的任意组合也包含在本发明中，只要基于本领域技术人员的技术常识没有技术上的矛盾。

附图说明

[图1] 辅助噬菌体M13KO7TC的基因组的示意图。图中的SacI位点插入L链表达单元。

[图2] 对由H链（PF1H）表达噬菌粒载体和L链（PF1L）表达辅助噬菌体的组合产生的噬菌体，进行针对抗人κ链抗体的ELISA的结果的图。在应用L链表达辅助噬菌体（M13KO7TC-PF1L）的情况下，确认到Fab展示在噬菌体上。另一方面，在应用阴性对照的辅助噬菌体（M13KO7TC）的情况下，没有确认到Fab展示在噬菌体上。

[图3] 对由H链（PF1H）表达噬菌粒载体和L链（PF1L）表达辅助噬菌体的组合产生的噬菌体，进行针对作为抗原的人IL-6R的ELISA的结果的图。在应用L链表达辅助噬菌体（M13KO7TC-PF1L）的情况下，确认到Fab展示噬菌体对抗原具有结合能力。另一方面，在应用阴性对照的辅助噬菌体（M13KO7TC）的情况下，没有观察到对抗原的结合。

[图4] 显示应用Octet RED384(forteBIO)，评价获得的抗体：6RNH-2_02（图4(a)）, 6RNH-2_37（图4(b)）, 6RNH-3(2)_32（图4(c)）, 6RNH-2_42（图4(d)）对可溶型人IL-6R的结合活性的结果的图。

[图5] 显示应用Octet RED384(forteBIO)，评价获得的抗体：PANH-2_52（图5(a)）, PANH-2_68（图5(b)）, PANH-3_10（图5(c)）、以及PF1抗体（图5(d)）对可溶型人PlexinA1、可溶型人IL-6R的结合活性的结果的图。

[图6] 显示应用Octet RED384(forteBIO)，评价获得的抗体：mIANH-2_27（图6(a)）, mIANH-3_79（图6(b)）、以及PF1抗体（图6(c)）对小鼠IgA、可溶型人IL-6R的结合活性的结果的图。

[图7] 显示应用Octet RED384(forteBIO)，评价获得的抗体：6RPAB3_03（图7(a)）、以及抗PlexinA1抗体hPANKB2-3#135（图7(b)）对可溶型人IL-6R、可溶型人PlexinA1的结合活性的结果的图。

[图8] 显示应用Octet RED384(forteBIO)，评价获得的抗体：6RmIAB3(2)_02（图8(a)）, 6RmIAB3(2)_06（图8(b)）, 6RmIAB3(2)_16（图8(c)）、以及抗小鼠IgA抗体mIANMIgL_095（图8(d)）对可溶型人IL-6R以及小鼠IgA的结合活性的结果的图。

[图9] 显示应用Octet RED384(forteBIO)，评价获得的抗体：6RhCEB3(2)_10（图9(a)）、以及抗CD3抗体hCE115HA/L0000（图9(b)）对可溶型人IL-6R以及人CD3e的结合活性的结果的图。

[图10] 对于由L链（PF1L）表达噬菌粒载体和H链（PF1H）表达辅助噬菌体的组合产生的噬菌体，进行针对抗人κ链抗体的ELISA的结果的图。在应用H链表达辅助噬菌体（M13KO7AG-PF1H）的情况下，确认到Fab展示在噬菌体上。另一方面，在应用阴性对照的辅助噬菌体（M13KO7TC）的情况下，没有确认到Fab展示在噬菌体上。

[图11] 对由L链（PF1L）表达噬菌粒载体和H链（PF1H）表达辅助噬菌体的组合产生的噬菌体，进行针对作为抗原的人IL-6R的ELISA的结果的图。在应用H链表达辅助噬菌体（M13KO7AG-PF1H）的情况下，确认到Fab展示噬菌体对抗原具有结合能力。另一方面，在应用阴性对照的辅助噬菌体（M13KO7TC）的情况下，没有观察到对抗原的结合。

具体实施方式

以下说明本发明的优选实施方式。

在一个实施方式中，本发明涉及制备展示抗原结合分子的噬菌体的方法，其包含使能够表达第一多肽的辅助噬菌体与能够表达第二多肽的细菌接触的步骤。

本发明中第一多肽和第二多肽的特征是，彼此缔合形成一个抗原结合分子。作为使辅助噬菌体与细菌接触的结果，期望该辅助噬菌体感染该细菌。

辅助噬菌体是噬菌体（bacteriophage）（也仅称为噬菌体（phage））中的一种，指代具有辅助其它噬菌体复制的功能的噬菌体。通常，在野生型噬菌体感染宿主细胞、其基因组在宿主细胞内存在的情况下，能够从中产生噬菌体复制所需的全部蛋白质，因此，在宿主细胞内构建噬菌体的噬菌体颗粒（毒粒），进一步地该基因组在其噬菌体颗粒内包装，由此噬菌体重构，其最终释放到细胞外。但是，在为噬菌体的基因组衍生的DNA的、由于基因组的一部分缺失或者不活化等而无法产生噬菌体复制所需的全部蛋白质的不完全噬菌体DNA的情况下，这样的DNA即使在宿主细胞内存在，其自身也不能重构噬菌体。在对这样的宿主细胞感染辅助噬菌体的情况下，连同辅助噬菌体的基因组衍生的蛋白质，能够产生噬菌体复制所需的全部蛋白质，因此，可在宿主细胞内构建噬菌体颗粒，重构噬菌体。这时，作为辅助噬菌体的特征，辅助噬菌体的基因组在基因组的复制起点或包装信号中具有缺陷，因此，与野生型噬菌体的基因组相比在噬菌体颗粒内包装的能力低（Methods Enzymol (1987) 153,3-11）。因此，即使如上述的不完全噬菌体DNA，只要是具有通常的包装能力的DNA（例如，噬菌粒载体等），在噬菌体颗粒内也优先包装该不完全噬菌体DNA而不是辅助噬菌体的基因组。结果，即使是其自身无法重构噬菌体的噬菌体DNA，也能够以其在内部包含的形式重构噬菌体。

通常应用的辅助噬菌体属于感染革兰氏阴性细菌的丝状噬菌体，其中感染具有F因子的大肠杆菌的Ff噬菌体（f1, fd, M13等）广泛应用。Ff噬菌体的基因组由环状单链DNA组成，已知其编码11种蛋白质。它们归类为噬菌体颗粒结构蛋白质（g3p（也称为基因3蛋白或pIII，下文同样）, g6p, g7p, g8p, g9p）、与噬菌体DNA的复制有关的蛋白质（g2p, g5p,g10p）、与噬菌体颗粒的构建和分泌有关的蛋白质（g1p, g4p, g11p），它们对于噬菌体的增殖全部是必要的。

在一个实施方式中，本发明中辅助噬菌体的基因组也可编码与野生型相同的无突变的11种蛋白质，它们之中也可导入一些突变。这些突变通常为了提高后述制备抗原结合分子展示文库时的展示效率的目的、或为了提高从抗原结合分子展示文库选择（挑选）期望的抗原结合分子时的选择效率的目的而导入。作为这样的突变，可列举例如，编码g3p的基因（基因3或III）的一部分或全部的缺失、向基因3的琥珀突变导入、向基因3的罕用密码子导入、向基因3的核糖体结合部位的突变导入、向编码g9p的基因（基因9或IX）的琥珀突变导入、向g3p的蛋白酶（例如胰蛋白酶）切割位点导入等。

在一个实施方式中，作为本发明中应用的辅助噬菌体，可列举M13KO7、R408、VCSM13、KM13（Res Microbiol (2001) 152, 187-191）、M13MDD3.2（FEMS Microbiol Lett(1995) 125, 317-321）、R408d3（Gene (1997) 198, 99-103）、VCSM13d3（Gene (1997)198, 99-103）、Hyperphage（Nat Biotechnol (2001) 19, 75-78）、CT辅助噬菌体（NucleicAcids Res (2003) 31, e59）、Ex-噬菌体（Nucleic Acids Res (2002) 30, e18）、Phaberge（J Immunol Methods (2003) 274, 233-244）、XP5（J Immunol Methods (2012)376, 46-54）、DeltaPhage（Nucleic Acids Res (2012) 40, e120）等。一般地，M13系的辅助噬菌体是优选的，特别优选的例子可列举M13KO7。

在一个实施方式中，本发明中的细菌只要是辅助噬菌体能够感染的细胞则无特别限定，通常是革兰氏阴性细菌，优选大肠杆菌（例如TG1、XL1-Blue、XL1-Blue MRF'、ER2738等）。只要是具有F因子的大肠杆菌，Ff噬菌体（包含M13系的辅助噬菌体）能够感染其任一种。

在一个实施方式中，本发明中能够表达第一多肽或第二多肽的辅助噬菌体或细菌意味着具有在某些条件下表达这些多肽的能力的辅助噬菌体或细菌。例如，在辅助噬菌体的情况下，只要在感染细菌时具有表达这些多肽的能力即可，在辅助噬菌体单独存在时也可不一定表达这些多肽。另外，在细菌的情况下，可总是表达这些多肽，或者，只要具有在某种表达诱导物质存在的条件下表达这些多肽的能力，在表达诱导物质不存在的通常生长条件下也可不表达这些多肽。

能够表达第一多肽的辅助噬菌体感染能够表达第二多肽的细菌的结果是，分别包含的第一多肽以及第二多肽在细菌内表达，彼此缔合形成抗原结合分子，同时，噬菌体颗粒从辅助噬菌体重构时该抗原结合分子整合，从而最终产生展示抗原结合分子的噬菌体。此时优选地，重构的噬菌体颗粒内包装编码细菌衍生的第二多肽的多核苷酸，与第二多肽有关的基因信息装载到新产生的噬菌体中。因此，没有限定地，编码第二多肽的多核苷酸优选通过插入噬菌粒载体等，具有比辅助噬菌体的基因组更有效地在噬菌体颗粒内包装的性质。

在一个实施方式中，对于本发明中的辅助噬菌体，优选其基因组中插入编码第一多肽的多核苷酸。

编码第一多肽的多核苷酸在辅助噬菌体的基因组中插入的位置没有特别限定，优选地，对辅助噬菌体本来的功能没有影响地、在不编码噬菌体蛋白质的基因组的非翻译区中插入。作为这样的优选位置的具体例子，在辅助噬菌体是M13KO7的情况下，可列举位于卡那霉素抗性基因与p15A ori之间的SacI位点、位于p15A ori与M13 ori之间的SacII位点等。或者，如后述地，在第一多肽与噬菌体的外壳蛋白质融合的情况下，编码第一多肽的多核苷酸也可插入与基因组中编码噬菌体的外壳蛋白质的多核苷酸以符合读框的形式连接的位置。

在一个实施方式中，优选地，本发明中编码第一多肽的多核苷酸与启动子功能性地连接。启动子表示能够结合细胞中的RNA聚合酶、启动下游（3'方向）序列的转录的多核苷酸序列。本说明书中，与启动子功能性连接可意味着，通过启动子配置于针对某些特定序列的适当位置，该序列的转录成为可控制的状态，也可以是启动子的该位置配置于与该序列物理分开的地点。本发明中应用的启动子可为组成型启动子，也可为诱导型启动子，可应用广泛多种的启动子。作为适于原核细胞的启动子，可列举β-内酰胺酶（bla）启动子、乳糖（lac）启动子、色氨酸（trp）启动子、如tac启动子的杂合启动子；四环素（tet）启动子、阿拉伯糖启动子、λ噬菌体启动子、T7噬菌体启动子、T5噬菌体启动子等。

在一个实施方式中，优选地，本发明中编码第一多肽的多核苷酸与Shine-Dalgarno（SD）序列等核糖体结合部位（RBS）连接。通过核糖体结合部位配置于适当的位置，位于其下游的多核苷酸的翻译得到促进。核糖体结合部位可配置于启动子与由其控制的多核苷酸序列之间。

在一个实施方式中，本发明中第一多肽优选与信号序列连接。信号序列表示与蛋白质在细胞内表达后其局限化相关的肽链。信号序列可与编码蛋白质的序列相邻配置。本发明中应用的信号序列优选将蛋白质局限于作为宿主的细菌的壁膜间隙（periplasimicspace）。这样的信号序列的例子可列举，pelB信号序列、基因III(geneIII)信号序列、OmpA信号序列、phoA信号序列、malE信号序列、dsbA信号序列、大肠杆菌耐热性肠毒素信号序列、β内酰胺酶信号序列等。

在一个实施方式中，本发明中第一多肽可与噬菌体的外壳蛋白质融合。第一多肽与噬菌体的外壳蛋白质的融合可通过编码第一多肽的多核苷酸与编码噬菌体的外壳蛋白质的多核苷酸以符合读框的形式连接而进行。噬菌体的外壳蛋白质可为g3p、g6p、g7p、g8p、g9p等结构蛋白质。本发明中第一多肽融合的外壳蛋白质优选g3p或g8p，更优选g3p。

与外壳蛋白质的融合是为了将第一多肽在噬菌体颗粒表面展示的目的进行的，因此，在外壳蛋白质的N末端或C末端进行是优选的。外壳蛋白质可为全长蛋白质，也可为N末端、C末端等一部分缺失的蛋白质。另外，融合可直接进行，也可通过任意的接头肽进行。此处，接头肽可包含6xHis标签、Myc标签、FLAG标签等标签序列，或者，也可包含对于胰蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白酶的蛋白酶识别序列。标签序列用于该融合蛋白质的检测等。从通过用蛋白酶消化该融合蛋白质，第一多肽与第二多肽缔合形成的抗原结合分子能够从噬菌体的外壳蛋白质分离回收的观点看来，蛋白酶识别序列是有用的。

在一个实施方式中，本发明中能够表达辅助噬菌体的第一多肽的数目、种类没有特别限定，通常可为仅一种，根据情况也可能够表达氨基酸序列不同的二种以上的第一多肽。另外，本发明的辅助噬菌体能够表达的通常只是抗原结合分子中的一个（第一多肽），根据情况也可以能够同时表达另一个（第二多肽）。

在一个实施方式中，本发明中的细菌优选包含编码第二多肽的多核苷酸。此处，细菌含有多核苷酸期望该细菌由该多核苷酸转化。然后，优选该多核苷酸与启动子功能性连接。启动子可为组成型启动子，也可为诱导型启动子，可应用广泛多种的启动子。作为适于原核细胞的启动子，可列举β-内酰胺酶（bla）启动子、乳糖（lac）启动子、色氨酸（trp）启动子、如tac启动子的杂合启动子；四环素（tet）启动子、阿拉伯糖启动子、λ噬菌体启动子、T7噬菌体启动子、T5噬菌体启动子等。通过使与编码第一多肽的多核苷酸连接的启动子和与编码第二多肽的多核苷酸连接的启动子为不同种类，例如促进一个的表达、抑制另一个的表达等，也可以以不同的方式控制两者的转录。

在一个实施方式中，本发明中编码第二多肽的多核苷酸优选地与Shine-Dalgarno（SD）序列等核糖体结合部位（RBS）连接。通过核糖体结合部位配置于适当的位置，位于其下游的多核苷酸的翻译得到促进。核糖体结合部位可配置于启动子和由其控制的多核苷酸序列之间。

在一个实施方式中，本发明中第二多肽优选与信号序列连接。信号序列可与编码蛋白质的序列相邻配置。本发明中应用的信号序列优选将蛋白质局限于作为宿主的细菌的壁膜间隙（periplasimic space）。作为这样的信号序列的例子，可列举pelB信号序列、基因III信号序列、OmpA信号序列、phoA信号序列、malE信号序列、dsbA信号序列、大肠杆菌耐热性肠毒素信号序列、β内酰胺酶信号序列等。

在一个实施方式中，本发明中编码第二多肽的多核苷酸优选插入噬菌粒载体。噬菌粒载体是制备成含有噬菌体基因组的一部分的质粒载体，含有对于细菌的复制起点（例如ColE1等）以及噬菌体（例如M13、f1、fd等）的基因组衍生的复制起点。噬菌粒载体与质粒载体同样具有在宿主细菌内扩增的性质，同时，也具有在噬菌体的噬菌体颗粒内包装的性质。因此，在用辅助噬菌体感染用噬菌粒载体转化的细菌的情况下，在重构的噬菌体颗粒内，噬菌粒载体比辅助噬菌体本来的基因组优先包装。噬菌粒载体可列举pHEN1、pComb3、pCANTAB5E、pCES1等。

在一个实施方式中，本发明中第二多肽可与噬菌体的外壳蛋白质融合。第二多肽与噬菌体的外壳蛋白质的融合可通过编码第二多肽的多核苷酸与编码噬菌体的外壳蛋白质的多核苷酸以符合读框的形式连接进行。噬菌体的外壳蛋白质可为g3p、g6p、g7p、g8p、g9p等结构蛋白质。本发明中第二多肽融合的外壳蛋白质优选g3p或g8p，更优选g3p。

与外壳蛋白质的融合是为了将第二多肽在噬菌体颗粒表面展示的目的进行的，因此，在外壳蛋白质的N末端或C末端进行是优选的。外壳蛋白质可为全长蛋白质，也可为N末端、C末端等一部分缺失的蛋白质。另外，融合可直接进行，也可通过任意的接头肽进行。此处，接头肽可包含6xHis标签、Myc标签等标签序列，或者，也可包含对于胰蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白酶的蛋白酶识别序列。标签序列用于该融合蛋白质的检测等。从通过用蛋白酶消化该融合蛋白质，第一多肽与第二多肽缔合形成的抗原结合分子能够从噬菌体的外壳蛋白质分离回收的观点看来，蛋白酶识别序列是有用的。

为了在噬菌体上展示由第一多肽以及第二多肽形成的抗原结合分子，优选第一多肽或第二多肽的至少一个与噬菌体的外壳蛋白质融合。在第一多肽以及第二多肽两者与噬菌体的外壳蛋白质融合的情况下，优选该外壳蛋白质从相同种类（例如g3p、g6p、g7p、g8p、g9p等）中选择。

关于噬菌体的外壳蛋白质的插入位置，在一个实施方式中，可将编码第一多肽的多核苷酸与编码g3p、g8p等噬菌体外壳蛋白质的基因的N末端或C末端侧连接而成的基因插入辅助噬菌体，并且将编码第二多肽的多核苷酸插入噬菌粒载体而不与噬菌体外壳蛋白质连接；或者，也可将编码第一多肽的多核苷酸插入辅助噬菌体而不与噬菌体外壳蛋白质连接，并且将编码第二多肽的多核苷酸与编码g3p、g8p等噬菌体外壳蛋白质的基因的N末端或C末端侧连接而成的基因插入噬菌粒载体。

本发明中“在Y上展示X”意味着，将X以X保持本来具有的功能的状态结合在Y的表面。例如，在噬菌体上展示抗原结合分子可意味着，将抗原结合分子以保持其抗原结合能力的状态结合在噬菌体颗粒的表面。结合可通过共价键进行，也可通过非共价键进行。在X和Y都是多肽的情况下，通过制备X和Y的融合蛋白质可使X与Y适当地结合。本发明中，优选第一多肽或第二多肽中的至少一个与噬菌体的外壳蛋白质融合。或者，通过二硫键将抗原结合分子展示在噬菌体上的方法也是已知的（WO01/005950），可应用这样的方法进行展示。

在一个实施方式中，本发明中，细菌能够表达的第二多肽的数目、种类没有特别限定，如后述地，本发明涉及包含第一多肽共同、第二多肽不同的多数抗原结合分子的抗原结合分子展示文库，因此，为了制备这样的抗原结合分子展示文库，需要能够表达不同种类第二多肽的多数细菌。也即，本发明中应用的个别细菌是能够表达彼此氨基酸序列不同的第二多肽的细菌，整体看来，优选能够表达富含多样性的多数第二多肽的细菌群。另外，本发明的细菌通常能够表达仅仅抗原结合分子中的一个（第二多肽），根据情况也可能够同时表达另一个（第一多肽）。

在一个实施方式中，本发明中的抗原结合分子只要以包含第一多肽以及第二多肽二条多肽的形式形成，是具有对特定抗原的特异性结合能力的分子，则无特别限定。第一多肽以及第二多肽优选彼此氨基酸序列不同的多肽。作为抗原结合分子的优选例子，可列举抗体、Fab、F(ab')₂、双抗体（Nature Nanotechnology (2007) 2, pp. 751-760）、抗体可变区、含有抗体可变区的抗体片段、受体蛋白质、Fc蛋白质、含有Fc蛋白质的抗体片段、Fc融合蛋白质、或者它们的功能片段（具有抗原结合部位、具有它们的功能的片段）或它们的功能等价物（它们的糖链修饰体等具有抗原结合部位、具有它们的功能的等价物）等。

本说明书中的抗原结合分子可衍生自所有动物物种（例如，人；或者小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴、食蟹猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩、山羊、绵羊、犬、牛、骆驼等非人动物）或所有鸟类。

在本说明书中的抗原结合分子是抗体（免疫球蛋白）或其衍生的分子的情况下，其可为所有同种型（例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等）、以及亚类（例如，人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3等），也可由它们衍生。抗体或其衍生的分子的H链可为例如γ链、μ链、α链、δ链、ε链等中的任一，也可由其衍生，另外，抗体或其衍生的分子的L链可为例如κ链、λ链等中的任一，也可由其衍生。抗体或其衍生分子也可为，例如嵌合抗体、人源化抗体、亲和性成熟抗体等改造抗体或由其衍生的分子。

在一个实施方式中，在本发明中的抗原结合分子是抗体的情况下，优选地，第一多肽是包含L链（或由其组成）、同一的二条多肽，并且第二多肽是包含H链（或由其组成）、同一的二条多肽；或者，第一多肽是包含H链（或由其组成）、同一的二条多肽，并且第二多肽是包含L链（或由其组成）、同一的二条多肽。也即，第一多肽以及第二多肽优选地分别选自包含L链（或由其组成）的二条多肽、以及包含H链（或由其组成）的二条多肽，并且彼此不同。应用这样的抗体的噬菌体文库（IgG噬菌体展示）例如如在FEBS J. 2010 May; 277(10):2291-303、WO2011062859中记载，是本领域技术人员公知的，抗体可用作本发明的抗原结合分子是本领域技术人员当然理解的。

已知F(ab')₂是能够通过用胃蛋白酶消化IgG抗体制备的抗原结合分子。F（ab')₂是具有2分子的Fab'通过2个二硫键连接、从抗体除去Fc区的结构（2分子的Fab'＋铰链区）的、具有2个抗原结合部位的2价分子。

在一个实施方式中，在本发明中的抗原结合分子是F(ab')₂的情况下，优选地，第一多肽是含有L链可变区的、同一的二条多肽，并且第二多肽是包含H链可变区的、同一的二条多肽；或者，第一多肽是包含H链可变区的、同一的二条多肽，并且第二多肽是包含L链可变区的、同一的二条多肽。也即，第一多肽以及第二多肽优选地分别选自含有L链可变区的二条多肽、以及含有H链可变区的二条多肽，并且彼此不同。应用这样的F(ab')₂的噬菌体文库，例如如J Immunol Methods. 2004 Jan;284(1-2):119-32中记载，是本领域技术人员公知的，F(ab')₂可用作本发明的抗原结合分子是本领域技术人员当然理解的。该文献中，通过在Fab与M13噬菌体的g3p (基因3蛋白)之间插入由IgG1铰链区与同二聚体化亮氨酸拉链组成的二聚化结构域使“Fab'-zip-”在噬菌体上展示，噬菌体上形成F(ab')₂（“Fab'-zip-噬菌体”），展示与IgG抗体类似的结合力高的二价Fab的噬菌体文库得以构建。

双抗体是使可变区和可变区以接头等结合而成的2个片段（例如，单链抗体（scFv）等）（下文称为构成双抗体的片段）结合而二聚体化，通常包含2个H链可变区和2个L链可变区，具有2个抗原结合部位(P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)， EP404097号，WO93/11161号，Johnson et al., Method in Enzymology,203, 88-98, (1991)，Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996)，Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)，John et al., ProteinEngineering, 12(7), 597-604, (1999)，Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90, 6444-6448, (1993)，Atwell et al., Mol.Immunol. 33, 1301-1312, (1996))。

构成双抗体的片段优选结合了H链可变区（或其片段）和L链可变区（或其片段）。构成双抗体的片段中，结合可变区与可变区的接头没有特别制限，优选应用同一片段中的可变区之间不引起非共价键那样短的接头。这样的接头的长度是本领域技术人员能够适当确定的，通常是2～14个氨基酸、优选3～9个氨基酸、特别优选4～6个氨基酸。此情况下，同一片段上编码的H链可变区（或其片段）和L链可变区（或其片段）由于其间的接头短，同一链上的H链可变区（或其片段）和L链可变区（或其片段）之间不产生非共价键，不形成单链V区片段，因此能够与其它片段形成二聚体。形成二聚体时，构成双抗体的片段之间的结合可以是非共价键（例如，氢键、静电相互作用、或范德华力）、共价键（例如二硫键）、或共价键与非共价键二者。

在一个实施方式中，在本发明中的抗原结合分子是双抗体的情况下，优选地，第一多肽是H链可变区（或其片段）与L链可变区（或其片段）通过接头结合而成的，第二多肽是L链可变区（或其片段）与H链可变区（或其片段）通过接头结合而成的；或者，第一多肽是L链可变区（或其片段）与H链可变区（或其片段）通过接头结合而成的，第二多肽是H链可变区（或其片段）与L链可变区（或其片段）通过接头结合而成的。也即，第一多肽以及第二多肽优选地分别选自H链可变区（或其片段）与L链可变区（或其片段）通过接头结合而成的，以及L链可变区（或其片段）与H链可变区（或其片段）通过接头结合而成的，并且彼此不同。应用这样的双抗体的噬菌体文库，例如如Nat Biotechnol. 1996 Sep;14(9):1149-54；US20070036789记载的，是本领域技术人员公知的，可使用双抗体作为本发明的抗原结合分子是本领域技术人员当然理解的。

在一个实施方式中，以包含二条多肽的形式形成的、对特定配体特异性结合的受体蛋白质，也可包含在本发明的抗原结合分子中。此情况下，受体蛋白质优选由二条彼此氨基酸序列不同的多肽形成的异聚受体蛋白质。受体蛋白质可为受体蛋白质的细胞外区、受体蛋白质的配体结合区、或它们与抗体Fc区的融合蛋白质等。在抗原结合分子是受体蛋白质的情况下，抗原指受体蛋白质的配体。异聚受体的例子可列举，IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-15受体、IL-17受体、IL-23受体、IL-31受体、GM-CSF受体、IFN-α受体、IFN-β受体、IFN-γ受体、CNTF受体、LIF受体、OSM受体、CT-1受体等。

在一个实施方式中，以包含二条多肽的形式形成的、对特定Fc受体特异性结合的Fc蛋白质，可包含在本发明的抗原结合分子中。Fc蛋白质表示由抗体分子中铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域组成的区域，一般地表示EU编号226号至C末端、或者230号至C末端的氨基酸序列。或者，也可为CH2结构域以及CH3结构域、或仅仅CH3结构域。此情况下的Fc蛋白质优选天然型Fc蛋白质中加入某些氨基酸突变的改变型Fc蛋白质，并且优选由二条彼此氨基酸序列不同的多肽形成。这样的异聚Fc蛋白质的例子可列举，WO98/50431、WO2006/106905、WO2007/114325、WO2011/078332、WO2013/002362等中记载的Fc蛋白质。特别地WO98/50431记载了，通过固定构成异聚Fc蛋白质的一条多肽的氨基酸序列、改变另一条多肽的氨基酸序列，可从多种序列中选择（挑选）最彼此适合的二条多肽的组合。在抗原结合分子是Fc蛋白质的情况下，抗原指各种Fc受体（例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII、或FcRn等）。例如，据报告，通过改变抗体的Fc区的氨基酸，使pH中性条件下与FcRn(新生Fc受体)的结合增强（WO2011/122011）、pH中性条件下与Fcγ受体的结合增强（WO2013/047752），可以从血中快速地除去抗原。

在其它实施方式中，上述Fc蛋白质中融合了蛋白质（例如，细胞因子或受体细胞外结构域）、肽的Fc融合蛋白质也可包含在本发明的抗原结合分子中。Fc融合蛋白质也可包含抗体铰链区和/或接头。可溶性Fc融合蛋白质在体外、体内实验中广泛应用，与非融合蛋白质相比可具有许多优势（Meg L et al., Methods in Molecular Biology 378:33-52,2007）。另外，可溶性Fc融合蛋白质可在人抗体制剂生产中维持抗原特异性、同时排除许多免疫学问题。代表性的可溶性Fc融合人抗体制剂可列举作为自身免疫病治疗剂的Etanercept（Amgen），这是通过可溶性TNF受体2与人IgG1的Fc融合而制备的。本领域技术人员理解，应用例如如WO2009/136568、WO2007/048122、WO2011/115323记载的公知的方法，本领域技术人员能够适当制备Fc融合蛋白质，用于噬菌体文库。

在一个实施方式中，在本发明中的抗原结合分子是抗体可变区的情况下，优选地，第一多肽是包含L链可变区（或由其组成）的多肽，并且第二多肽是包含H链可变区（或由其组成）的多肽；或者，第一多肽是包含H链可变区（或由其组成）的多肽，并且第二多肽是包含L链可变区（或由其组成）的多肽。也即，第一多肽以及第二多肽优选分别选自包含L链可变区（或由其组成）的多肽以及包含H链可变区（或由其组成）的多肽，并且彼此不同。

在一个实施方式中，本发明的目的之一是，提供适于制备包含共同的第一多肽的多数抗原结合分子的辅助噬菌体以及该辅助噬菌体可感染的细菌的组合。这样的第一多肽只要是构成抗原结合分子的多肽中的一条，可选择具有任意氨基酸序列的多肽。例如，在抗原结合分子是抗体可变区、第一多肽是包含L链可变区的多肽或包含H链可变区的多肽的情况下，该L链可变区或H链可变区可从具有任意氨基酸序列的L链可变区或H链可变区之中选择。也即，即使选择任何氨基酸序列的L链可变区或H链可变区，都可制备将其作为共同的第一多肽包含的多数抗原结合分子（此处称为抗体可变区）。L链可变区或H链可变区可从与特定抗原结合的抗体中包含的L链可变区或H链可变区中选择，或者，也可从用特定抗原免疫前的幼稚抗体中包含的L链可变区或H链可变区中选择。

与特定的抗原结合的抗体可通过本领域技术人员公知的杂交瘤法（Nature(1975) 256, 495）、噬菌体抗体文库法（Nature (1991) 352, 624-628、J Mol Biol(1991) 222, 581-597）制备。对于制备的抗体的L链可变区、H链可变区的氨基酸序列，如果是杂交瘤法，可将编码产生该抗体的杂交瘤中包含的L链、H链的基因用抗体基因特异性引物通过PCR法扩增，进行其序列分析而鉴定（J Mol Biol (1991) 222, 581-597、MolImmunol (1992) 29, 193-203）。另外，如果是噬菌体抗体文库法，可通过分离展示该抗体的噬菌体内包含的载体，对其中插入的编码L链、H链的基因进行序列分析而鉴定。

用特定的抗原免疫前的幼稚抗体(naive antibodies)中包含的L链可变区或H链可变区的氨基酸序列可如下多数地鉴定，从人、其它动物等配制产生这样的抗体的末梢血单核细胞、骨髄细胞、或脾细胞等，应用抗体基因特异性引物通过PCR法扩增这些细胞中包含的编码L链、H链的基因，进行其序列分析，因此，可从它们中选择应用任意的L链可变区或H链可变区（J Mol Biol (1991) 222, 581-597、Mol Immunol (1992) 29, 193-203）。

在一个实施方式中，在本发明中第一多肽、第二多肽是包含L链可变区的多肽、包含H链可变区的多肽的情况下，它们也可进一步包含L链恒定区、H链恒定区。在第一多肽中不包含恒定区的情况下，优选第二多肽中也不包含恒定区，在第一多肽中包含恒定区的情况下，优选第二多肽中也包含恒定区。另外，H链恒定区特别优选H链恒定区CH1结构域。此处，H链恒定区CH1结构域表示H链恒定区起始至铰链区前面紧邻的区域，一般地指EU编号118号至225号的氨基酸序列。通常，这些恒定区以可变区后面紧邻连接的形式包含。L链恒定区也可为κ链或λ链中的任一衍生的恒定区，另外，H链恒定区也可为γ链、μ链、α链、δ链、ε链中的任一衍生的恒定区。进一步，这些恒定区可为全长，也可为一部分缺失。另外，也可一部分氨基酸置换、缺失、插入等而改变。在第一多肽以及第二多肽中包含恒定区的情况下的优选抗原结合分子的例子是Fab。

另外，其它实施方式中，本发明涉及制备包含共同的第一多肽的抗原结合分子展示文库的方法，其包含以下步骤：

(a) 多次进行制备展示抗原结合分子的噬菌体的本发明方法的步骤，该步骤中应用的多数细菌是能够表达氨基酸序列不同的多数第二多肽的细菌群，并且该步骤中应用的辅助噬菌体是能够表达相同氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，以及

(b) 回收步骤(a)中制备的展示抗原结合分子的多数噬菌体的步骤。

多数细菌是个别细菌能够表达彼此氨基酸序列不同的第二多肽的细菌，整体看来，优选能够表达富含多样性的多数第二多肽的细菌群。通过使这样的多数细菌分别感染能够表达相同氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，能够制备展示抗原结合分子的多数噬菌体，这些抗原结合分子全部包含共同的第一多肽和彼此不同的第二多肽。通过回收并混合展示如此制备的抗原结合分子的多数噬菌体，能够制备包含共同的第一多肽的抗原结合分子展示文库。

本说明书中，文库意味着具有多样的所有组分的多数构成要素的集合体。本发明中，主要表示多数噬菌体集合构成的噬菌体文库（噬菌体文库）。抗原结合分子展示文库意味着以表面展示抗原结合分子的噬菌体为构成要素的文库，其中包含的抗原结合分子优选具有多样的所有组分。文库的构成要素的数目（文库的尺寸）越大越优选，优选例如10⁶以上、10⁷以上、10⁸以上、10⁹以上、10¹⁰以上、10¹¹以上、10¹²以上、10¹³以上、10¹⁴以上等。制备抗原结合分子展示文库的本发明方法中，其步骤中应用的能够表达多数第二多肽的细菌的数目为该文库的构成要素的数目，因此，该步骤中应用的细菌群优选例如10⁶以上、10⁷以上、10⁸以上、10⁹以上、10¹⁰以上、10¹¹以上、10¹²以上、10¹³以上、10¹⁴以上的细菌。

通常，为了如上述进行多次感染，能够表达多数第二多肽的细菌群以混合状态培养，同时可使能够表达相同第一多肽的多数辅助噬菌体共同感染。或者，也可使辅助噬菌体个别地感染包含1个以上细菌的小规模细菌群。由于制备的噬菌体通常释放到细菌的培养上清中，噬菌体的回收也可仅仅对辅助噬菌体感染后的细菌培养液进行离心分离等来分离培养上清，也可进一步加入进行向其中加入聚乙二醇（PEG）使噬菌体沉淀的方法（PEG沉淀法）等而分离纯化噬菌体的步骤。

在抗原结合分子是抗体可变区、第二多肽是包含L链可变区的多肽或包含H链可变区的多肽的情况下，编码彼此氨基酸序列不同的多数L链可变区、H链可变区的基因可分离生物体中等天然存在的多数抗体基因等而得到。例如，从人、其它动物等配制末梢血单核细胞、骨髄细胞、脾细胞等抗体产生细胞，以从这些细胞得到的RNA为基础，应用对L链可变区、H链可变区特异的引物通过进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），能够扩增编码L链可变区、H链可变区的基因。该情况下，从得到高度多样性的观点看来，优选应用特定抗原免疫前的幼稚抗体产生细胞，根据情况，也可应用特定抗原免疫后的偏置的(biased)抗体产生细胞。或者，也可通过对编码特定L链可变区、H链可变区的基因加入人工突变等合成多样性提高的多数基因而得到。这样的基因可通过应用例如易错PCR等手法人工诱导突变而制备，或者，也可通过全部合成以具有期望的多样性的形式进行序列设计的基因而制备。

其它实施方式中，通过制备抗原结合分子展示文库的本发明方法制备的抗原结合分子展示文库也包含在本发明中。

其它实施方式中，本发明涉及获得与预定抗原特异性结合的抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a) 使抗原与本发明的抗原结合分子展示文库接触的步骤，以及

(b) 从该抗原结合分子展示文库中选择与该抗原结合的抗原结合分子的步骤。

在一个实施方式中，本发明的抗原结合分子展示文库包含彼此序列不同的富含多样性的多数抗原结合分子，因此，整体看来，是能够结合多种抗原的抗原结合分子群。因此，通过筛选，能够从本发明的抗原结合分子展示文库中选择（挑选）对期望的抗原特异性结合的抗原结合分子。也即，通过使抗原与本发明的抗原结合分子展示文库接触，其中包含的可对该抗原特异性结合的抗原结合分子与该抗原结合形成复合体。然后，通过从该文库中包含的多数抗原结合分子中，以本领域技术人员公知的某些方法，分离与抗原形成复合体的抗原结合分子以及不与抗原结合的抗原结合分子，能够仅仅选择（挑选）对该抗原特异性结合的抗原结合分子。作为分离与抗原形成复合体的抗原结合分子方法，例如，通过预先将用生物素标记的抗原与抗原结合分子展示文库接触后，使该生物素标记的抗原与珠、板等载体上固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合，能够在珠、板上仅回收与该抗原形成复合体的抗原结合分子。然后，洗涤该珠、板，通过从抗原结合分子展示文库中除去不与抗原结合的抗原结合分子，能够将与抗原形成复合体的抗原结合分子和不与抗原结合的抗原结合分子分离。

挑选对抗原特异性结合的抗原结合分子的上述操作也可重复进行多次。也即，认为通过第一挑选操作分离的抗原结合分子群中，与抗原的结合能力弱的抗原结合分子与结合能力强的抗原结合分子共存，因此，通过重复上述挑选操作，与抗原的结合能力强的抗原结合分子的存在比率能够逐渐提高。在一个实施方式中，展示通过第一挑选操作分离的抗原结合分子的噬菌体一旦感染作为宿主的细菌后，培养该细菌并使其增殖。由于本发明中制备的噬菌体内通常包装有编码第二多肽的多核苷酸，前述噬菌体感染的细菌内存在编码第二多肽的多核苷酸。也即，由于该状态的细菌是能够表达第二多肽的细菌，该细菌通过感染与制备最初的抗原结合分子展示文库时应用的相同辅助噬菌体（也即，能够表达相同第一多肽的辅助噬菌体），展示与通过第一选择操作分离的抗原结合分子相同的抗原结合分子的噬菌体可在数目扩增的状态下繁殖。通过使如此得到的展示抗原结合分子的噬菌体再次作为原料重复进行上述的选择操作，形成大量包含仅仅与抗原的结合能力强的抗原结合分子的抗原结合分子群成为可能。

抗原结合分子展示文库中包含的抗原结合分子以在噬菌体上展示的状态存在，通过某些方法获得仅仅抗原结合分子也是可能的。例如，在抗原结合分子与噬菌体的外壳蛋白质融合、在其间导入蛋白酶（例如胰蛋白酶）切割位点的情况下，通过展示抗原结合分子的噬菌体与蛋白酶反应，抗原结合分子可与噬菌体分离，仅分离抗原结合分子。另外，在通过本发明方法制备的噬菌体的噬菌体颗粒中包装有编码第二多肽的多核苷酸的情况下，其与本发明的辅助噬菌体中包含的编码第一多肽的多核苷酸组合、能够鉴定该抗原结合分子的序列信息，可通过基因工程方法单独制备该抗原结合分子。

在一个实施方式中，本发明中的抗原只要是包含能够作为抗原决定簇（表位）的结构的化合物即可，没有特别限定，可为低分子化合物，也可为高分子化合物。作为一般的抗原的例子，可列举多肽、多核苷酸、糖链、脂质、或者它们组合而成的分子等。它们可通过从天然存在的材料分离而配制，也可通过人工合成而配制。例如，在抗原是多肽的情况下，通过基因工程方法配制是可能的。也即，通过以基因克隆法、核酸合成法等本领域技术人员公知的方法配制编码该多肽的氨基酸序列的多核苷酸，将其插入公知的表达载体等并导入适当的宿主细胞，能够配制该多肽。表达的多肽可通过通常的离子层析、亲和层析等方法纯化。

本说明书中，抗原结合分子与抗原特异性结合意味着，抗原结合分子对特定抗原的结合活性与对其它抗原的结合活性相比，例如，优选为2倍以上、3倍以上、5倍以上高，更优选10倍以上、20倍以上、30倍以上高，进一步优选50倍以上、100倍以上高。抗原结合分子对抗原的结合活性可通过ELISA、FACS、Biacore等本领域技术人员公知的方法测定以及比较。上述定义的抗原也可与表位互换。也即，抗原结合分子与抗原特异性结合意味着，抗原结合分子对特定表位的结合活性与对其它表位的结合活性相比，例如，优选为2倍以上、3倍以上、5倍以上高，更优选10倍以上、20倍以上、30倍以上高，进一步优选50倍以上、100倍以上高。

其它实施方式中，本发明涉及制备包含共同第一多肽的多特异性抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a) 对多数抗原进行获得对预定抗原特异性结合的抗原结合分子的本发明方法的步骤，以及

(b) 应用步骤(a)中获得的多数抗原结合分子中包含的、多数相同氨基酸序列的第一多肽以及多数不同氨基酸序列的第二多肽，制备多特异性抗原结合分子的步骤，其特征在于，该多数第二多肽分别与该第一多肽缔合，形成对该多数抗原特异性结合的该多数抗原结合分子。

或者，在又一实施方式中，上述发明是制备包含共同第一多肽的多特异性抗原结合分子的方法，其也可包含以下步骤：

(a) 对多数抗原进行获得对预定抗原特异性结合的抗原结合分子的本发明方法的步骤，

(b) 对于步骤(a)中获得的多数抗原结合分子中包含的、多数相同氨基酸序列的第一多肽以及多数不同氨基酸序列的第二多肽，分别配制编码该第一多肽的多核苷酸以及编码该多数第二多肽的多核苷酸的步骤，

(c) 将步骤(b)中配制的各多核苷酸导入宿主细胞的步骤，以及

(d) 培养步骤(c)的宿主细胞，回收多特异性抗原结合分子的步骤，其特征在于，该多数第二多肽分别与该第一多肽缔合，形成对该多数抗原特异性结合的该多数抗原结合分子。

通过获得对预定抗原特异性结合的抗原结合分子的本发明方法获得的抗原结合分子中必须包含第一多肽，因此对多数抗原进行该方法，结果获得的多数抗原结合分子中，均包含共同的第一多肽、以及彼此不同的第二多肽。通过使如此得到的第一多肽以及多数第二多肽组合，多数第二多肽分别与第一多肽缔合形成多数抗原结合分子，因此，如果这些多数抗原结合分子彼此连接形成一个分子而进行重构，能够容易地制备包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子。此时，也可应用基因工程方法制备多特异性抗原结合分子。也即，分别配制编码第一多肽的多核苷酸以及编码多数第二多肽的多核苷酸，将它们导入宿主细胞，在能够表达该多核苷酸的条件下培养该宿主细胞。由于从该多核苷酸表达的多数第二多肽分别与第一多肽缔合形成多数抗原结合分子，如果这些多数抗原结合分子彼此连接形成一个分子而进行重构，能够容易地表达包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子。宿主细胞外表达的多特异性抗原结合分子的回收可通过从宿主细胞的培养液离心分离培养上清进行，或者，可通过配制宿主细胞的细胞提取液进行。也可进一步加入从中分离、纯化多特异性抗原结合分子的步骤（Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81.）。

编码第一多肽的多核苷酸、编码多数第二多肽的多核苷酸优选插入某些表达载体。各多核苷酸可插入个别表达载体，这些多核苷酸也可共同插入相同的表达载体。表达载体的例子可列举，如果用于大肠杆菌为pET，如果用于哺乳动物细胞为pcDNA3等。

导入编码第一多肽的多核苷酸、编码多数第二多肽的多核苷酸的宿主细胞的例子可列举，如果是大肠杆菌为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等，如果是哺乳动物细胞为CHO、COS、HEK293等。

多核苷酸向宿主细胞的导入可应用磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法、脂转染法、显微注射法等本领域技术人员公知的方法进行。

从宿主细胞回收的多特异性抗原结合分子也可通过例如离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、透析、超滤、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等公知方法来分离纯化。

在一个实施方式中，本发明中的多特异性抗原结合分子意味着，一个分子内包含对多数抗原分别特异性结合的多数抗原结合分子的分子。抗原结合分子可彼此以某些方式彼此连接形成一个分子，此时的连接可通过共价键（例如，肽键、二硫键等）进行，也可通过非共价键进行。抗原结合分子彼此的结合可直接进行，也可借助接头肽这样的接头分子进行。作为多特异性抗原结合分子的例子，在抗原结合分子是抗体可变区的情况下，可列举多数H链可变区以及L链可变区直接或者借助接头肽以肽键连接、进一步地分子内H链可变区与L链可变区适当缔合形成多数抗体可变区的分子（例如，双抗体、三抗体、单链双抗体等）。另外，作为其它例子，可列举H链可变区与H链恒定区、以及L链可变区与L链恒定区分别以肽键连接，同时H链恒定区彼此以二硫键等连接，进一步地分子内H链可变区与L链可变区适当缔合形成多数抗体可变区的分子（例如，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等抗体（免疫球蛋白）分子）。多特异性抗原结合分子中包含的各抗原结合分子可为与彼此不同的抗原结合的抗原结合分子，也可为与相同抗原中包含的不同的抗原决定簇（表位）结合的抗原结合分子。根据情况，也可为与相同抗原的相同表位结合的抗原结合分子。通过多特异性抗原结合分子中包含的抗原结合分子的数目增加至2、3、4个等，可分别制备双特异性抗原结合分子、三重特异性抗原结合分子、四重特异性抗原结合分子等。本发明中优选的多特异性抗原结合分子是双特异性抗原结合分子（例如，双特异性抗体）。

多特异性抗原结合分子可以以各种目的使用，已知其中之一为，可作为药物组合物的有效成分在疾病的治疗中使用。例如，在癌症的治疗中，包含与肿瘤抗原结合的抗原结合分子以及与诱导细胞毒性活性的分子结合的抗原结合分子的双特异性抗原结合分子，作为能够对肿瘤细胞诱导特异性细胞毒性的分子是有用的。肿瘤抗原可列举，例如，CD15、p185（HER2）、p97、OVCAR-3、L-D1、EGFR、CAMA1、CD19、MoV18、NCAM、FBP、AMOC-31、Id-1、CD22、CD7、CD38、CEA、CD30等。另外，诱导细胞毒性活性的分子可列举例如，FcγRI、FcγRIII（CD16）、CD3等。另外，感染性疾病的治疗中，含有与病毒结合的抗原结合分子以及与诱导细胞毒性活性的分子结合的抗原结合分子的双特异性抗原结合分子，作为能够对病毒感染细胞诱导特异性细胞毒性的分子是有用的。病毒可列举例如，单纯疱疹病毒（HSV）、流感病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）等。此外，含有与纤维蛋白结合的抗原结合分子以及与纤溶酶原活化因子结合的抗原结合分子的双特异性抗原结合分子，作为使血栓溶解的药物是有用的。纤溶酶原活化因子可列举例如，组织型纤溶酶原活化因子（tPA）、尿激酶型纤溶酶原活化因子（uPA）等。进一步地，从包含与构成细胞因子的异聚受体的各多肽链分别结合的抗原结合分子的双特异性抗原结合分子中，能够获得该细胞因子的激动剂分子（WO2004/060919）。具有异聚受体的细胞因子可列举例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-31、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CNTF、LIF、OSM、CT-1等。另外，从包含与酶结合的抗原结合分子以及与该酶的底物结合的抗原结合分子的双特异性抗原结合分子中，能够获得能够代替增强该酶反应的辅因子的作用的功能性分子（WO2005/035754）。这样的酶-底物-辅因子的组合可列举例如，凝血因子IX（FIXa）-凝血因子X（FX）-凝血因子VIII（FVIII/FVIIIa）的组合、蛋白Z依赖性蛋白抑制剂(ZPI)- 凝血因子X（FX/FXa）-蛋白Z（PZ）的组合、凝血酶-凝血酶活化纤溶抑制因子（TAFI）-凝血调节蛋白（TM）的组合等。

另外，上述以外，据报告，多特异性抗原结合分子可用于真菌治疗（日本特开平5-199894）、免疫应答诱导（日本特表平10-511085）、免疫化学（R.R. Suresh et al. (1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7989-7993、C. Milstein and A.C. Cuello (1983)Nature 305: 537-540）等。

在一个实施方式中，在本发明中的多特异性抗原结合分子是双特异性抗体（例如，IgG等）且L链共同的情况下，优选加入用于促进2种H链的异二聚化的各种改变等。这样的改变已知有，2种H链的CH3结构域中导入彼此立体互补结构的改变（Ridgway et al. (1996)Protein Eng. 9: 617-21、WO96/27011）、2种H链的CH3结构域以IgG衍生的序列和IgA衍生的序列相互不同地置换的改变（SEEDbodies: Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4):195-202）、2种H链的CH3结构域中导入产生电荷相互作用那样的突变的改变（WO2006/106905）等。

其它实施方式中，本发明涉及抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤：

(a) 使能够表达与可对预定抗原特异性结合、第一多肽以及第二多肽缔合的、作为参照的抗原结合分子（亲本抗原结合分子）的第一多肽具有相同的氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，与能够分别表达与亲本抗原结合分子的第二多肽具有不同的氨基酸序列的第二多肽的细菌群接触，制备包含展示共同的第一多肽与氨基酸序列不同的第二多肽分别缔合的抗原结合分子（子代抗原结合分子）的多数噬菌体的抗原结合分子展示文库的步骤，以及

(b) 使前述抗原与步骤(a)中制备的抗原结合分子展示文库接触，选择能够对前述抗原特异性结合的子代抗原结合分子的步骤。

该方法可进一步包含以下步骤。

(c) 从步骤(b)中选择的子代抗原结合分子中，获得与亲本抗原结合分子相比具有不同的物理性质的子代抗原结合分子的步骤。

在进一步的实施方式中，该抗原结合分子的制备方法也可涉及进一步包含以下步骤的方法：

(d) 使能够表达与前述步骤(b)中选择的、或前述步骤(c)中获得的子代抗原结合分子的第二多肽具有相同的氨基酸序列的第二多肽的辅助噬菌体，与能够分别表达与子代抗原结合分子的第一多肽具有不同的氨基酸序列的第一多肽的细菌群接触，制备包含展示共同的第二多肽与氨基酸序列不同的第一多肽分别缔合的抗原结合分子（孙代抗原结合分子）的多数噬菌体的抗原结合分子展示文库的步骤，以及

(e) 使前述抗原与步骤(d)中制备的抗原结合分子展示文库接触，选择能够对前述抗原特异性结合的孙代抗原结合分子的步骤。

该方法可进一步包含以下步骤。

(f) 从步骤(e)中选择的孙代抗原结合分子中，获得与子代抗原结合分子比较具有不同的物理性质的孙代抗原结合分子的步骤。

此处，前述步骤(c)或前述步骤(f)中的前述物理性质没有限定，例如，其可意味着等电点、热稳定性、化学稳定性、溶解度、粘度、糖基化状况、抗原结合分子自身的均一性、免疫原性和/或对前述抗原的亲和性或结合特异性（J Biol Chem 2005; 280:24880-7）。

在一个实施方式中，根据该抗原结合分子的制备方法，提供了下列：与参照抗原结合分子比较，对抗原的亲和性或结合特异性优异的抗原结合分子；热稳定性或化学稳定性优异的抗原结合分子；溶解度提高的抗原结合分子；不包含糖基化氨基酸序列的抗原结合分子；抗原结合分子自身的均一性提高的分子；免疫原性（的风险）降低的抗原结合分子；和/或等电点或粘度改变的抗原结合分子。在该抗原结合分子的制备方法提供对抗原的亲和性优异的抗原结合分子的情况下，该方法涉及使抗原结合分子亲和性成熟的方法。

进一步地，即使在根据该方法得到物理性质劣化的抗体的情况下，由于其可用于例如非人动物衍生抗体的人源化等，因而是有利的(J Mol Biol. 2000 Feb 25;296(3):833-49.)。例如，通过固定非人动物衍生的第一多肽、与人衍生的第二多肽的文库组合、对抗原进行淘选操作，能够获得人衍生的第二多肽。随后，通过固定第二多肽与人衍生的第一多肽的文库组合、对抗原进行淘选操作，能够获得人衍生的第一多肽。如此，通过连续地与人抗体文库置换，以非人动物衍生抗体为基础获得人抗体是可能的。

据报告，例如，通过置换抗体可变区的氨基酸残基中可露出表面的至少1个氨基酸残基并改变电荷（pI：等电点），可延长或缩短抗体的血中半衰期、平均血中滞留时间，或者降低或提高血中清除率（WO2007/114319；WO2009/041643）。

据报告，例如，通过改变位于抗体的H链可变区与L链可变区的界面的氨基酸残基，可提高热稳定性（J Mol Biol. 2003 Jan 17;325(3):531-53）。

据报告，例如，通过将抗体可变区的谷氨酰胺残基置换为谷氨酸残基，可提高化学稳定性（Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-16）。

据报告，例如，通过将抗体可变区的疏水性残基置换为疏水性低的残基，可提高溶解度（Protein Sci. 2010 May;19(5):954-66）。

另外，据报告，通过从抗体可变区除去N型糖基化序列，可降低产生的抗体的不均一性（J Mol Biol. 2011 Oct 14;413(1):261-78）。

因此，本领域技术人员理解，根据预定目的，通过该抗原结合分子的制备方法，改变抗体的稳定性、等电点等，从而能够例如延长或缩短抗体的血中半衰期、平均血中滞留时间，或者降低或提高血中清除率。

在实施前述步骤(c)或前述步骤(f)的情况下，获得抗原结合分子的方法只要是本领域技术人员公知的方法，则没有特别限定。

例如，可在与抗原接触、选择可对该抗原特异性结合的抗原结合分子之后，对具有期望的物理性质的抗原结合分子群评价（例如，测定或预测）该物理性质而不进行淘选操作（MAbs. 2011 May-Jun;3(3):243-52）。或者，也可在进行淘选操作，挑选作为候补的抗原结合分子（缩小范围）后，评价该物理性质。

例如，在前述“不同的物理性质”是对抗原的亲和性的情况下，可利用ELISA、FACS、利用表面等离子体共振的Biacore、或者本实施例中应用的Octet系统那样的生物膜层干涉法（BioLayer Interferometry: BLI）。

例如，在前述“不同的物理性质”是等电点的情况下，可根据得到的抗原结合分子的氨基酸序列，应用Getetyx等本领域技术人员公知的市售软件，计算（预测）等电点。在一个实施方式中，可对对抗原具有足够的特异性结合能力的抗原结合分子的氨基酸序列进行等电点预测，选择具有期望的等电点的分子。或者，也可应用等电点电泳（IEF）等，实际地测定等电点（Protein Eng Des Sel. 2010 May;23(5):385-92）。

例如，在前述“不同的物理性质”是热稳定性或化学稳定性的情况下，可在淘选操作前对抗原结合分子施加热后、或者使抗原结合分子变性后，对抗原进行淘选操作（Methods Mol Biol. 2012;907:123-44）。

在其它实施方式中，本发明涉及改变的辅助噬菌体以及该辅助噬菌体可感染的细菌的组合，该辅助噬菌体是能够表达第一多肽的辅助噬菌体，并且该细菌是能够表达第二多肽的细菌。

本发明中第一多肽与第二多肽的特征在于，彼此缔合形成1个抗原结合分子。

在一个实施方式中，本发明中辅助噬菌体以及细菌的组合是指，以该辅助噬菌体感染该细菌为前提，包含这两者作为构成要件的全部组合。辅助噬菌体和细菌这两者混合之前彼此单独、即这两者尚不处于可感染状态的组合也包含在本发明中，这两者混合后的混合物、即这两者已处于可感染状态的组合也包含在本发明中。

在其它实施方式中，制备本发明的改变的辅助噬菌体以及该辅助噬菌体可感染的细菌的组合的方法包含在本发明中。本发明的改变的辅助噬菌体可如下制备，利用制限酶切割位点在辅助噬菌体的基因组DNA中插入编码第一多肽的多核苷酸，将如此制备的改变辅助噬菌体的基因组DNA导入作为宿主的细菌。在辅助噬菌体是M13KO7的情况下的优选制限酶切割位点可列举，位于卡那霉素抗性基因与p15A ori之间的SacI位点、位于p15A ori与M13 ori之间的SacII位点等。如上述改变的辅助噬菌体的基因组DNA在导入的细菌内产生噬菌体颗粒，进一步地在其中包装该改变的辅助噬菌体的基因组DNA，从而重构改变的辅助噬菌体。另外，该辅助噬菌体可感染的细菌可通过在细菌中导入编码第二多肽的多核苷酸而制备。

在其它实施方式中，在本发明的改变的辅助噬菌体以及该辅助噬菌体可感染的细菌的组合中，其中包含的改变的辅助噬菌体也包含在本发明中。也即，本发明涉及能够表达特定多肽的改变的辅助噬菌体，该多肽是特征在于缔合形成抗原结合分子的二条多肽中的任一个。或者，本发明涉及能够表达第一多肽的改变的辅助噬菌体，特征在于该第一多肽可与其它第二多肽缔合形成1个抗原结合分子。

在其它实施方式中，包含本发明的改变的辅助噬菌体的试剂盒也包含在本发明中。也即，本发明涉及包含辅助噬菌体的试剂盒，所述辅助噬菌体是能够表达特定多肽的改变的辅助噬菌体，该多肽是特征在于缔合形成抗原结合分子的二条多肽中的任一个。或者，本发明涉及包含辅助噬菌体的试剂盒，所述辅助噬菌体是能够表达第一多肽的改变的辅助噬菌体，特征在于该第一多肽可与其它第二多肽缔合形成1个抗原结合分子。这些试剂盒可为，用于制备展示抗原结合分子的噬菌体的试剂盒、用于制备包含共同的第一多肽的抗原结合分子展示文库的试剂盒、用于获得对预定抗原特异性结合的抗原结合分子的试剂盒、用于制备包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子的试剂盒、或者用于制备与参照抗原结合分子具有不同的物理性质的抗原结合分子的试剂盒。本发明的试剂盒也可进一步包含该辅助噬菌体能够感染的细菌，其能够表达形成抗原结合分子的前述二条多肽中剩余一条多肽，或者该辅助噬菌体能够感染的细菌，其能够表达前述第二多肽。

本领域技术人员当然理解，本说明书中记载的1个或多个实施方式的任意组合都包含在本发明中，只要基于本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾。

本说明书中引用的全部现有技术文献都作为参考并入本说明书。

第一、第二等用语用于表现各个要素，但应当理解，这些要素不限于这些用语。这些用语仅用于将1个要素与其它要素相区别，例如，应当理解，第一要素可描述为第二要素，同样地，第二要素可描述为第一要素，这不超出本发明的范围。

本说明书中应用的用语用于说明特定的实施方式，不应理解为限定发明的意图。只要没有明示不同的定义，本说明书中应用的用语（包含技术用语以及科学用语）解释为与本发明所属技术领域的技术人员广泛理解的意义具有相同意义，并且不应解释为理想化或过度形式的意义。

本说明书中应用的用语“包含”意图表示存在所述事项（部件、步骤、要素、数字等），不排除存在所述事项之外的事项（部件、步骤、要素、数字等），除非上下文需要明显不同的理解。

本发明的实施方式可参照示意图说明，为了清楚地说明起见可进行扩大。

只要上下文不矛盾，本说明书中记载的数值理解为按照本领域技术人员的技术常识具有一定范围的值。例如。“1mg”的记载理解为记载“约1mg”，理解为包含一定的变化量。另外，本说明书中，例如，在记载“1～5个”的情况下，只要上下文不矛盾，理解为“1个、2个、3个、4个、5个”各自值被个别具体地记载。

实施例

本发明通过以下实施例示例，但不限于下述实施例。

［实施例1］通过H链表达噬菌粒载体与L链表达辅助噬菌体的组合的Fab展示噬菌体产生方法的建立

（1－1）整合L链表达单元的L链表达辅助噬菌体的构建

通过在辅助噬菌体的基因组中整合启动子、信号序列、抗体L链基因等，进行L链表达辅助噬菌体的构建。从本辅助噬菌体感染的大肠杆菌可表达抗体L链。

具体地，用辅助噬菌体(M13KO7: Invitrogen)感染大肠杆菌株XL1-Blue，进行振荡培养一夜后，从辅助噬菌体提取基因组（QIAprep Spin Miniprep Kit : QIAGEN）。辅助噬菌体基因组中包含的基因3基因的N2结构域中具有BamHI位点、基因1中具有PacI位点。得到的辅助噬菌体基因组用BamHI、PacI切割后，在0.6%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过进行凝胶提取纯化（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system: Promega），分别配制基因3～基因1部分的DNA片段以及残余的基因组侧的DNA片段。以配制的基因3～基因1部分的DNA片段为模板进行PCR，新制备基因3的N2结构域与CT结构域之间插入编码胰蛋白酶切割序列的DNA的DNA片段。改变前的基因3的氨基酸序列显示于序列编号：1，改变的基因3的氨基酸序列显示于序列编号：2。通过将该DNA片段与预先配制的残余的基因组侧的DNA片段再次连接，构建辅助噬菌体的pIII蛋白质的N2结构域与CT结构域之间插入胰蛋白酶切割序列的辅助噬菌体M13KO7TC(参考日本特表2002-514413)。

用辅助噬菌体M13KO7TC感染大肠杆菌株ER2738，进行振荡培养一夜后，从感染大肠杆菌提取辅助噬菌体M13KO7TC的基因组（NucleoBond Xtra Midi Plus）。整合L链表达单元的位置选择位于卡那霉素抗性基因与p15A ori之间的SacI位点（图1）。认为不限于该位置，位于p15A ori与M13 ori之间的SacII位点等的插入也没有问题。用SacI切割通过上述方法纯化的辅助噬菌体M13KO7TC基因组后，在0.6% 琼脂糖凝胶上进行电泳，进行凝胶提取纯化（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system: Promega），从而得到目的DNA片段（M13KO7TC/SacI）。

导入的抗体L链(VL以及CL)应用作为抗人IL-6R抗体的PF1的L链。此时，L链恒定区的C末端具有的Cys向Ala的置换已知对大肠杆菌中Fab表达是有利的（J Biol Chem. 2003Oct 3; 278(40): 38194-38205），因此，应用这样的序列。将lac启动子 - pelB信号序列 -PF1 L链基因以in-fusion法（In-Fusion HD Cloning Kit: Clontech）插入M13KO7TC/SacI，通过电穿孔法导入大肠杆菌株ER2738。分别地，lac启动子的核酸序列显示于序列编号：3，pelB信号序列的氨基酸序列以及核酸序列显示于序列编号：4以及序列编号：5，PF1 L链的氨基酸序列以及核酸序列显示于序列编号：6以及序列编号：7。

培养得到的大肠杆菌，在培养上清中添加2.5 M NaCl/10%PEG通过PEG沉淀法纯化辅助噬菌体。得到的辅助噬菌体M13KO7TC-PF1L的滴度通过一般的噬斑形成方法确认。

（1－2）H链表达噬菌粒载体的构建

构建用于在噬菌体表面上表达抗体H链的噬菌粒载体。噬菌粒载体通过在质粒载体中分别功能性地插入噬菌体颗粒的包装信号、启动子、信号序列、抗体H链基因、接头基因、基因3基因等而制备。抗体H链借助接头肽与基因3蛋白质（g3p）融合。导入的抗体H链(由VH以及CH1构成的Fd)应用作为抗人IL-6R抗体的PF1的H链。PF1 H链的氨基酸序列显示于序列编号：8。构建的噬菌粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌株ER2738，构建携带PF1 H链表达噬菌粒载体的大肠杆菌ER2738/pAG-PF1H。

（1－3）通过H链表达噬菌粒载体与L链表达辅助噬菌体的组合产生Fab展示噬菌体

培养大肠杆菌ER2738/pAG-PF1H直至OD大约0.5后，使其感染辅助噬菌体M13KO7TC-PF1L或M13KO7TC。实施培养基交换后，在30℃培养一夜，回收培养上清。在产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG使噬菌体沉淀，将其在TBS中溶解获得噬菌体液。得到的噬菌体的滴度通过一般的集落形成方法确认。

（1－4）通过噬菌体ELISA法在噬菌体上的Fab展示的确认

通过噬菌体ELISA法，进行产生的噬菌体的Fab展示的确认以及与抗原的结合能力的确认。向StreptaWell 96孔微量滴定板（Roche）添加含有山羊抗人κ生物素抗体（EYLABORATORIES）、或生物素标记人IL-6R的100μL的PBS来包被板。该板的各孔用0.1×TBST（含有0.1%Tween20的0.1×TBS）洗涤而除去抗原后，在该孔中添加250μL的0.02% 脱脂乳-0.1×TBS(含有0.02% 脱脂乳的0.1×TBS) 封闭1小时以上。除去0.02% 脱脂乳-0.1×TBS后，各孔中添加用0.02% 脱脂乳-0.1×TBS稀释的噬菌体液在37℃静置1小时，从而噬菌体上展示的抗体与山羊抗人κ生物素抗体或生物素化人IL-6R结合。用0.1×TBST洗涤后，在各孔中添加用0.1×TBST稀释的HRP偶联抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）温育1小时。用0.1×TBST洗涤后，在各孔中添加TMB单组分溶液(TMB single solution)（ZYMED），进一步添加硫酸使溶液的显色反应停止，然后测定450 nm的吸光度。

结果确认到，仅仅在组合H链表达噬菌粒载体与L链表达辅助噬菌体M13KO7TC-PF1L产生噬菌体的情况下，噬菌体上展示Fab（图2），另外，噬菌体上展示的Fab维持抗原结合能力（图3）。

［实施例2］包含幼稚H链(naive H chains)的噬菌粒文库的构建与包含幼稚H链以及PF1 L链的Fab噬菌体文库的产生

以从人末梢血单核细胞（PBMC）配制的聚A RNA、市售人聚A RNA等为模板，通过PCR法扩增幼稚H链可变区基因。将它们插入噬菌粒载体，通过电穿孔法将构建的噬菌粒载体导入大肠杆菌株ER2738，得到大约1.1×10¹⁰的克隆。

通过在这些大肠杆菌中感染实施例1中构建的辅助噬菌体M13KO7TC-PF1L进行培养，构建展示含有幼稚H链与PF1 L链的Fab的人抗体噬菌体展示文库（NH-PF1L文库）。

［实施例3］具有PF1 L链、并且可与各种抗原结合的Fab的获得

（3－1）生物素标记人PlexinA1的配制

如下配制作为单次跨膜蛋白质的人Plexin A1（hPlexinA1）的细胞外区。从以NCBIReference Sequence NP_115618（序列编号：9）的氨基酸序列为基础合成的hPlexinA1基因除去推测为跨膜区的1245号丙氨酸之后，替代地加入FLAG 标签序列（序列编号：13)。1-26号为止的信号肽 (序列编号：14) 进一步置换为人工信号肽HMM+38 (序列编号：15)。将制备的编码hPlexinA1（序列编号：10）的基因整合到用于动物细胞的表达载体中，应用293Fectin (Invitorgen)导入FreeStyle293细胞(Invitorgen)。此时，为了提高目的基因的表达效率，同时导入表达EBNA1（序列编号：17）的基因。将按照前述顺序导入基因的细胞在37℃、8% CO₂培养6日，使目的蛋白质分泌到培养上清中。

将包含目的hPlexinA1的细胞培养液用0.22μm瓶顶过滤器(bottle-top filter)过滤，得到培养上清。将培养上清应用到用D-PBS(-)(日本和光纯药)平衡的抗FLAG抗体M2琼脂糖(Sigma-Aldrich)后，通过加入溶解了FLAG肽的D-PBS洗脱目的hPlexinA1。随后，应用用D-PBS(-)平衡的Superdex 200(GE Healthcare)通过凝胶过滤层析，分离含有hPlexinA1的级分。

通过对如上述制备的hPlexinA1应用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoSCIENTIFIC)，配制生物素标记hPlexinA1。

（3－2）生物素标记小鼠IgA-Fc区的配制

以在小鼠IgA-Fc区（mIgA-Fc：小鼠IgA的CH2以及CH3结构域、序列编号：11）的C末端附加生物素为目的，在编码mIgA-Fc的基因片段下游，借助接头连接编码通过生物素连接酶附加生物素的特异性序列（AviTag序列，序列编号：16）的基因片段。将编码mIgA-Fc与AviTag序列连接的蛋白质（mIgA_CH2-CH3-Avitag（序列编号：12））的基因片段整合到用于动物细胞表达的载体中，应用293Fectin (Invitrogen)将构建的质粒载体导入FreeStyle293细胞 (Invitrogen)。此时将表达EBNA1（序列编号：17）的基因以及表达生物素连接酶（BirA，序列编号：18）的基因同时导入，进一步以生物素标记mIgA-Fc为目的添加生物素。将按照前述顺序导入基因的细胞在37℃、8% CO₂中培养6日，使目的蛋白质分泌到培养上清中。

将包含目的mIgA-Fc的细胞培养液用0.22μm瓶顶过滤器过滤，得到培养上清。将用相同溶液稀释的培养上清应用到用20 mM Tris-HCl、H7.4平衡的HiTrap Q HP (GEHealthcare)中，通过NaCl的浓度梯度洗脱目的mIgA-Fc。随后，在用50 mM Tris-HCl,pH8.0平衡的SoftLink Avidin 柱（Promega）中应用用相同溶液稀释的前述HiTrap Q HP洗脱液，用5 mM 生物素, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH8.0洗脱目的mIgA-Fc。随后，应用Superdex200(GE Healthcare)通过凝胶过滤层析，除去目的之外的杂质mIgA-Fc缔合体，缓冲液置换为20 mM组氨酸-HCl, 150 mM NaCl, pH6.0得到纯化mIgA-Fc。

（3－3）生物素标记人IL-6R的配制

以在可溶型人IL-6R（hIL-6R、序列编号：19）的C末端附加生物素为目的，在编码可溶型hIL-6R的基因片段下游，借助接头连接编码通过生物素连接酶附加生物素的特异性序列（AviTag序列，序列编号：16）的基因片段。将编码可溶型hIL-6R与AviTag序列连接的蛋白质（shIL6R-Avitag，序列编号：20）的基因片段整合到用于动物细胞表达的载体中，应用293Fectin (Invitrogen)将构建的质粒载体导入FreeStyle293细胞 (Invitrogen)。此时同时导入表达EBNA1（序列编号：17）的基因以及表达生物素连接酶（BirA，序列编号：18）的基因，进一步以生物素标记可溶型hIL-6R为目的添加生物素。将按照前述顺序导入基因的细胞在37℃、8% CO₂培养，使目的蛋白质分泌到培养上清中。

从包含目的可溶型hIL-6R的细胞培养液，以与（3－2）同样的方法进行纯化，得到生物素标记hIL-6R。

（3－4）从NH-PF1L文库获得与各种抗原（人PlexinA1、小鼠IgA-Fc、人IL-6R）结合的抗体片段

从实施例2构建的含有PF1 L链的抗体文库（NH-PF1L文库），以对各抗原的结合能力为指标，实施与各种抗原（hPlexinA1、mIgA-Fc、hIL-6R）结合的抗体片段的挑选。

通过对携带插入人幼稚H链基因的噬菌粒载体的大肠杆菌感染辅助噬菌体M13KO7TC-PF1L并培养，构建展示包含人抗体H链和PF1 L链的Fab的人抗体噬菌体展示文库（NH-PF1L文库）。在产生噬菌体的大肠杆菌培养液中加入2.5 M NaCl/10%PEG使噬菌体沉淀，将其用TBS稀释而得到噬菌体文库液。随后，在噬菌体文库液中添加BSA至终浓度为4%，封闭噬菌体文库液。淘选方法参考一般的方法，即应用在磁珠上固定的抗原的淘选方法（J.Immunol. Methods. (2008) 332(1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247(1-2),191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2), 212-220、Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-69）。磁珠应用NeutrAvidin包被珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或Streptavidin包被珠（Dynabeads M-280 Streptavidin）。具体地，在配制的噬菌体文库液中加入生物素标记抗原（生物素标记hPlexinA1、生物素标记mIgA-Fc、生物素标记hIL-6R），使噬菌体文库液与抗原在室温接触60分钟。分别地，第1次淘选应用250 pmol、第2次淘选应用40 pmol、第3次淘选应用10 pmol的生物素标记抗原。向其中加入以BSA溶液封闭的磁珠，使抗原-噬菌体复合体和磁珠在室温结合15分钟。回收的珠用1 mL的TBST（含有0.1%Tween20的TBS）与1 mL的TBS洗涤。随后，向珠加入0.5 mL的1 mg/mL的胰蛋白酶溶液在室温悬浮15分钟后，立即应用磁力支架(magnetic stand)分离珠，回收上清噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至培养至对数增殖期（OD600 =0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌株ER2738，在37℃缓慢搅拌培养1小时，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种到225 mm ×225 mm板。随后，将接种的大肠杆菌回收培养后，使辅助噬菌体M13KO7TC-PF1L感染并培养，而产生展示包含PF1 L链的Fab的噬菌体。通过从培养液回收噬菌体，噬菌体文库液得以配制。将其作为1次淘选，反复进行共计3次淘选。

（3－5）通过噬菌体ELISA法筛选与各种抗原（人PlexinA1、小鼠IgA-Fc、人IL-6R）结合的抗体

从（3－4）中实施的淘选完成2次或3次后得到的大肠杆菌的单个克隆，根据常规方法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）产生噬菌体，回收含噬菌体的培养上清。这时，辅助噬菌体应用M13KO7TC-PF1L。培养上清按照以下顺序接受ELISA。

用含有或不含有生物素标记抗原（hPlexinA1、mIgA-Fc、hIL-6R）的100μL的PBS，包被StreptaWell 96孔微量滴定板（Roche）一晩。该板的各孔用0.1×TBST（含有0.1%Tween20的0.1×TBS）洗涤而除去抗原后，各孔用250μL的0.02% 脱脂乳-0.1×TBS(含有0.02% 脱脂乳的0.1×TBS)封闭1小时以上。除去0.02% 脱脂乳-0.1×TBS后，各孔中加入噬菌体培养上清，将板在37℃静置1小时，使噬菌体上展示的抗体与各孔中存在的生物素标记抗原结合。各孔用0.1×TBST洗涤后，添加通过0.1×TBST稀释的HRP偶联抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），温育板1小时。各孔用TBST洗涤后，添加TMB单组分溶液（ZYMED），进一步通过硫酸的添加使显色反应停止后，测定各孔的450 nm的吸光度。

上述噬菌体ELISA的结果是，将包被抗原的板相对于不包被抗原的板的显色比是2倍以上、并且包被抗原的板的显色是0.2以上判断为抗原特异性结合的克隆。进一步，对判断为抗原特异性结合的克隆进行抗体片段基因的碱基序列分析。

噬菌体ELISA的结果示于表1。分别地，表中的R2表示淘选完成2次后的克隆，R3表示淘选完成3次后的克隆。结果，得到对hPlexinA1、mIgA-Fc、hIL-6R各抗原特异性结合、并且序列不同的多数克隆。

[表1]

［实施例4］具有PF1 L链的各种抗原结合抗体的通过IgG的结合能力评价

（4－1）获得的具有PF1 L链的各种抗原（人PlexinA1、小鼠IgA-Fc、人IL-6R）结合抗体的表达以及纯化

应用以下方法表达实施例3中作为与人IL-6R结合抗体获得的抗体之中的RNH-2_02（重链、序列编号：21）、6RNH-2_37（重链、序列编号：22）、6RNH-3(2)_32（重链、序列编号：23）、6RNH-2_42（重链、序列编号：24）4个抗体，作为与人PlexinA1结合抗体获得的抗体之中的PANH-2_52（重链、序列编号：25）、PANH-2_68（重链、序列编号：26）、PANH-3_10（重链、序列编号：27）3个抗体，作为与小鼠IgA-Fc结合抗体获得的抗体之中的mIANH-2_27（重链、序列编号：28）、mIANH-3_79（重链、序列编号：29）2个抗体，进行这些抗体的纯化。全部这些抗体是具有PF1的L链（轻链、序列编号：67）作为轻链的抗体。另外，作为比较对象，也应用以下方法表达作为抗IL-6R抗体的PF1抗体（重链、序列编号：68；轻链、序列编号：67），进行该抗体的纯化。悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基（Invitrogen）的人胎肾细胞衍生FreeStyle 293-F株（Invitrogen）以1.33 × 10⁶细胞/mL的细胞密度在6孔板的各孔中各接种3 mL。配制的质粒通过脂转染法导入细胞。在CO₂培养箱（37度、8%CO₂、90 rpm）中培养4日。应用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）应用本领域技术人员公知的方法，从上述得到的培养上清纯化抗体。应用分光光度计测定纯化的抗体溶液的280 nm吸光度。通过应用PACE法算出的消光系数，从得到的测定值算出抗体浓度（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。

（4－2）获得的抗体对可溶型人IL-6R的结合能力的评价

应用Octet RED384(forteBIO)，评价(4－1)中获得的抗体（6RNH-2_02, 6RNH-2_37, 6RNH-3(2)_32, 6RNH-2_42）对可溶型人IL-6R的结合活性。应用HBS-EP+ Buffer(GEHealthcare)作为缓冲液，进行结合评价。

对Protein G Biosensors (forteBIO)结合抗体后，使可溶型人IL-6R接触120秒，与生物传感器上的抗体相互作用，随后与缓冲液接触120秒，测定抗体・抗原的相互作用。其后，与10mmol/L Glycin-HCl, pH1.5接触，使生物传感器再生。测定在30℃进行。得到的传感器图示于图4。6RNH-2_02, 6RNH-2_37, 6RNH-3(2)_32, 6RNH-2_42的全部抗体显示与可溶型人IL-6R结合。

（4－3）获得的抗体对可溶型人PlexinA1的结合能力的评价

应用Octet RED384(forteBIO)，评价(4－1)中获得的抗体（PANH-2_52, PANH-2_68, PANH-3_10）以及作为抗人IL-6R抗体的PF1抗体对可溶型人PlexinA1、可溶型人IL-6R的结合活性。应用HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)作为缓冲液，进行结合评价。

对Protein G Biosensors (forteBIO)结合抗体后，使可溶型人PlexinA1或可溶型人IL-6R接触120秒，与生物传感器上的抗体相互作用，随后与缓冲液接触120秒，测定抗体・抗原的相互作用。其后，与10mmol/L Glycin-HCl, pH1.5接触，使生物传感器再生。测定在30℃进行。得到的传感器图示于图5。PANH-2_52, PANH-2_68, PANH-3_10的全部抗体显示不与可溶型人IL-6R结合，与可溶型人PlexinA1结合。

（4－4）获得的抗体对小鼠IgA的结合能力的评价

应用Octet RED384(forteBIO)，评价(4－1)中获得的抗体（mIANH-2_27, mIANH-3_79）以及PF1抗体对小鼠IgA、可溶型人IL-6R的结合活性。应用HBS-EP+ Buffer(GEHealthcare)作为缓冲液，进行结合评价。

对Protein G Biosensors (forteBIO)结合抗体后，使小鼠IgA或可溶型人IL-6R接触120秒，与生物传感器上的抗体相互作用，随后与缓冲液接触120秒，测定抗体・抗原的相互作用。其后，与10mmol/L Glycin-HCl, pH1.5接触，使生物传感器再生。测定在30℃进行。得到的传感器图示于图6。mIANH-2_27, mIANH-3_79的全部抗体显示不与可溶型人IL-6R结合，与小鼠IgA结合。

［实施例5］具有固定L链、可与IL-6R结合的Fab的获得

（5－1）具有固定L链（相同氨基酸序列的L链）的Fab噬菌体文库的产生

按照实施例1中记载的方法，构建作为表达抗人PlexinA1抗体hPANKB2-3#135的L链（序列编号：30）的辅助噬菌体的M13KO7TC-PAL、作为表达抗小鼠IgA抗体mIANMIgL_095的L链（序列编号：31）的辅助噬菌体的M13KO7TC-IAL、以及作为表达抗人CD3抗体人源化CE115的L链L0000（序列编号：32）的辅助噬菌体的M13KO7TC-CEL。

在导入实施例2中记载的含有幼稚H链的噬菌粒文库的大肠杆菌中，通过感染上述辅助噬菌体，构建展示包含幼稚H链与抗PlexinA1抗体L链的Fab的人抗体噬菌体展示文库（NH-PAL文库）、展示包含幼稚H链与抗小鼠IgA抗体L链的Fab的人抗体噬菌体展示文库（NH-IAL文库）、展示包含幼稚H链与抗CD3抗体L链的Fab的人抗体噬菌体展示文库（NH-CEL文库）。在产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG使噬菌体沉淀，将其用TBS稀释而得到噬菌体文库液。

（5－2）从固定L链抗体文库（NH-PAL文库、NH-IAL文库、NH-CEL文库）得到与IL-6R结合的抗体片段

从（5－1）中构建的固定L链抗体文库（NH-PAL文库、NH-IAL文库、NH-CEL文库）的噬菌体文库液，以对人IL-6R的结合能力为指标，实施与人IL-6R结合的抗体片段的挑选。

在各噬菌体文库液中添加BSA至终浓度4%，封闭噬菌体文库液。淘选方法参考一般的方法，即应用在磁珠上固定的抗原的淘选方法（J. Immunol. Methods. (2008) 332(1-2), 2-9、 J. Immunol. Methods. (2001) 247(1-2), 191-203、 Biotechnol. Prog.(2002) 18(2), 212-220、 Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-69）。磁珠应用NeutrAvidin包被珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或Streptavidin包被珠（Dynabeads M-280 Streptavidin）。具体地，在配制的噬菌体文库液中加入生物素标记抗原（生物素标记hIL-6R），使噬菌体文库液与抗原在室温接触60分钟。分别地，第1次淘选应用250 pmol、第2次淘选应用40 pmol、第3次淘选应用10 pmol的生物素标记抗原。向其中加入以BSA溶液封闭的磁珠，使抗原－噬菌体复合体和磁珠在室温结合15分钟。回收的珠用1mL的TBST（含有0.1% Tween20的TBS）与1 mL的TBS洗涤。随后，向珠加入0.5 mL的1 mg/mL的胰蛋白酶溶液在室温悬浮15分钟后，立即应用磁力支架分离珠，回收上清噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至培养至对数增殖期（OD600 =0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌株ER2738，在37℃缓慢搅拌培养1小时，而使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种到225 mm× 225 mm板。随后，将接种的大肠杆菌回收培养后，使辅助噬菌体（M13KO7TC-PAL、M13KO7TC-IAL或M13KO7TC-CEL）感染并培养，产生展示包含抗PlexinA1抗体L链、抗小鼠IgA抗体L链、或抗CD3抗体L链的Fab的噬菌体。通过从培养液回收噬菌体，噬菌体文库液得以配制。将其作为1次淘选，反复进行共计3次淘选。

（5－3）通过噬菌体ELISA法筛选与抗原（人IL-6R）结合的抗体、

从（5－2）中实施的淘选完成2次或3次后得到的大肠杆菌的单个克隆，根据常规方法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）产生噬菌体，回收含噬菌体的培养上清。这时，辅助噬菌体根据应用的噬菌体文库应用M13KO7TC-PAL、M13KO7TC-IAL或M13KO7TC-CEL。培养上清按照以下顺序接受ELISA。

用含有或不含有生物素标记抗原（生物素标记hIL-6R）的100μL的PBS，包被StreptaWell 96孔微量滴定板（Roche）一晩。该板的各孔用0.1×TBST（含有0.1% Tween20的0.1×TBS）洗涤而除去抗原后，各孔用250μL的0.02% 脱脂乳-0.1×TBS(含有0.02% 脱脂乳的0.1×TBS)封闭1小时以上。除去0.02% 脱脂乳-0.1×TBS后，各孔中加入噬菌体培养上清，静置1小时，使噬菌体上展示的抗体与各孔中存在的生物素标记抗原结合。各孔用0.1×TBST洗涤后，添加通过0.1×TBST稀释的HRP偶联抗M13抗体（Amersham PharmaciaBiotech），温育板1小时。各孔用TBST洗涤后，添加TMB单组分溶液（ZYMED），进一步通过硫酸的添加使显色反应停止后，测定各孔的450 nm的吸光度。

上述噬菌体ELISA的结果是，将包被抗原的板相对于不包被抗原的板的显色比是2倍以上、并且包被抗原的板的显色是0.2以上判断为抗原特异性结合的克隆。进一步，对判断为抗原特异性结合的克隆进行抗体片段基因的碱基序列分析。

噬菌体ELISA的结果示于表2。分别地，表中的R2表示淘选完成2次后的克隆，R3表示淘选完成3次后的克隆。结果，从各个噬菌体文库得到对hIL-6R特异性结合、并且序列不同的多数克隆。

[表2]

［实施例6］能够通过固定L链与人IL-6R结合的抗体的通过IgG的结合能力评价

（6－1）人CD3e(hCD3e)的配制

人CD3e(hCD3e)的细胞外区如下配制。从以NCBI Reference Sequence NP_000724（序列编号：33）的氨基酸序列为基础合成的hCD3e基因，除去推测为跨膜区的130号缬氨酸之后，替代地加入FLAG 标签序列（序列编号：13)。制备插入了编码制备的hCD3e（序列编号：34）的基因的表达载体。

将制备的表达载体导入FreeStyle293-F细胞（Invitrogen公司），瞬时表达hCD3e。将得到的培养上清添加到通过20 mM Tris-HCl, pH7.4平衡的Q Sepharose FF柱（GEHealthcare公司），洗涤该柱后，借助氯化钠的浓度梯度实施洗脱。将含有hCD3e的级分添加到通过10 mM 磷酸钠缓冲液pH7.4平衡的macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type-I,20μm柱（Bio-Rad公司），洗涤该柱后，借助磷酸钠缓冲液的浓度梯度实施洗脱。将含有hCD3e的级分以超滤膜浓缩后，将浓缩液添加至通过D-PBS(-)平衡的Superdex 200柱（GEHealthcare公司）。通过仅回收其洗脱液的hCD3e级分，得到纯化hCD3e。

（6－2）获得的各种具有固定L链的人IL-6R结合抗体的表达以及纯化

用以下方法表达实施例5中作为具有抗小鼠IgA抗体mIANMIgL_095的L链的、对人IL-6R的结合抗体获得的抗体中的6RmIAB3(2)_02（重链、序列编号：35；轻链、序列编号：65）、6RmIAB3(2)_06（重链、序列编号：36；轻链、序列编号：65）、6RmIAB3(2)_16（重链、序列编号：37；轻链、序列编号：65）这3个抗体，回收培养上清。将FreeStyle 293 ExpressionMedium培养基（Invitrogen）中悬浮的人胎肾细胞衍生FreeStyle 293-F株（Invitrogen）以8.0 × 10⁵细胞/mL的细胞密度向96孔深孔板的各孔中分别接种0.4mL。将配制的质粒通过脂转染法导入细胞。在CO₂培养箱（37度、8%CO₂、450 rpm）中培养4日。

用以下方法表达实施例5中作为具有抗PlexinA1抗体hPANKB2-3#135的L链的、对人IL-6R的结合抗体获得的抗体中的6RPAB3_03（重链、序列编号：38；轻链、序列编号：64）这1个抗体，作为具有抗CD3抗体人源化CE115的L链的、对人IL-6R的结合抗体获得的抗体中的6RhCEB3(2)_10（重链、序列编号：39；轻链、序列编号：66）这1个抗体，纯化该抗体。将FreeStyle 293 Expression Medium培养基（Invitrogen）中悬浮的人胎肾细胞衍生FreeStyle 293-F株（Invitrogen）以1.33 × 10⁶细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中分别接种3 mL。将配制的质粒通过脂转染法导入细胞。在CO₂培养箱（37度、8%CO₂、90 rpm）中培养4日。应用利用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）的本领域技术人员公知的方法，从上述得到的培养上清纯化抗体。应用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280 nm的吸光度。通过应用借助PACE法算出的消光系数，从得到的测定值算出抗体浓度（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。

（6－3）获得的具有抗PlexinA1抗体L链的抗体对人IL-6R的结合能力的评价

应用Octet RED384(forteBIO)，评价(6－2)中获得的抗体（6RPAB3_03）以及抗PlexinA1抗体hPANKB2-3#135（重链、序列编号：40； 轻链、序列编号：64）对可溶型人IL-6R以及可溶型人PlexinA1的结合活性。应用HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)作为缓冲液进行结合评价。

Protein G Biosensors (forteBIO)与抗体结合之后，使可溶型人IL-6R以及可溶型人PlexinA1接触120秒，与生物传感器上的抗体相互作用，随后与缓冲液接触120秒，测定抗体・抗原的相互作用。随后，与10mmol/L Glycin-HCl, pH1.5接触，再生生物传感器。测定在30℃进行。得到的传感器图示于图7。

显示6RPAB3_03抗体不与可溶型人PlexinA1结合、与可溶型人IL-6R结合。

（6－4）获得的具有抗小鼠IgA抗体L链的抗体对人IL-6R的结合能力的评价

应用Octet RED384(forteBIO)，评价(6－2)中获得的抗体（6RmIAB3(2)_02,6RmIAB3(2)_06, 6RmIAB3(2)_16）以及抗小鼠IgA抗体mIANMIgL_095（重链、序列编号：41；轻链、序列编号：65）对可溶型人IL-6R以及小鼠IgA的结合活性。应用HBS-EP+ Buffer(GEHealthcare)作为缓冲液进行结合评价。

Protein G Biosensors (forteBIO)与抗体结合后，使可溶型人IL-6R以及小鼠IgA接触120秒，与生物传感器上的抗体相互作用，随后与缓冲液接触120秒，测定抗体・抗原的相互作用。随后，与10mmol/L Glycin-HCl, pH1.5接触，再生生物传感器。测定在30℃进行。得到的传感器图示于图8。

显示6RmIAB3(2)_02, 6RmIAB3(2)_06, 6RmIAB3(2)_16的全部抗体不与小鼠IgA结合，与可溶型人IL-6R结合。

（6－5）获得的具有抗CD3抗体L链的抗体对人IL-6R的结合能力的评价

应用Octet RED384(forteBIO)，评价(6－2)中获得的抗体（6RhCEB3(2)_10）以及抗CD3抗体hCE115HA/L0000(重链、序列编号：42；轻链、序列编号：66)对可溶型人IL-6R以及人CD3e(hCD3e)的结合活性。应用HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)作为缓冲液进行结合评价。

Protein G Biosensors (forteBIO)与抗体结合后，使可溶型人IL-6R以及人CD3e接触120秒，与生物传感器上的抗体相互作用，随后与缓冲液接触120秒，测定抗体・抗原的相互作用。随后，与10mmol/L Glycin-HCl, pH1.5接触，再生生物传感器。测定在30℃进行。得到的传感器图示于图9。

显示6RhCEB3(2)_10抗体不与人CD3e结合，与可溶型人IL-6R结合。

［实施例7］通过L链表达噬菌粒载体和H链表达辅助噬菌体的组合的Fab展示噬菌体产生方法的确立

（7－1）整合了H链-基因3融合体表达单元的H链表达辅助噬菌体的构建

通过在辅助噬菌体的基因组中整合启动子、信号序列、抗体H链基因、噬菌体基因3基因等，构建H链(由VH以及CH1组成的Fd)-基因3表达辅助噬菌体。抗体H链(由VH以及CH1组成的Fd)-基因3可由本辅助噬菌体感染的大肠杆菌表达。

具体地，使辅助噬菌体M13KO7TC感染大肠杆菌株ER2738，进行振荡培养一夜之后，从感染大肠杆菌提取辅助噬菌体M13KO7TC的基因组（NucleoBond Xtra Midi Plus）。作为整合H链-基因3表达单元的位点，选择位于卡那霉素抗性基因（KanR）与p15A ori之间的SacI位点（图1）。不限于该位点，认为插入位于p15A ori与M13 ori之间的SacII位点等也不是问题。用SacI切割用上述方法纯化的辅助噬菌体M13KO7TC基因组后，用0.6% 琼脂糖凝胶进行电泳，进行凝胶提取纯化（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system: Promega），由此得到目的DNA片段（M13KO7TC/SacI）。

导入的抗体H链(由VH以及CH1组成的Fd)应用作为抗人IL-6R抗体的PF1的H链。分别地，PF1的H链的氨基酸序列在序列编号8中示出，碱基序列在序列编号43中示出。抗体H链(由VH以及CH1组成的Fd)借助接头肽与基因3蛋白质（g3p）融合。araC阻抑物 - araBAD改变启动子- malE信号序列 - PF1H链基因 - 基因3基因用in-fusion法（In-Fusion HDCloning Kit: Clontech）插入M13KO7TC/SacI，通过电穿孔法导入大肠杆菌株ER2738。分别地，araC阻抑物的核酸序列示于序列编号：44，araBAD改变启动子的核酸序列示于序列编号：45，malE信号序列的氨基酸序列以及核酸序列示于序列编号：46以及序列编号：47。基因3基因应用与辅助噬菌体中存在的基因3基因不同的核酸序列（序列编号48）。

培养得到的大肠杆菌，在培养上清中加入2.5 M NaCl/10%PEG，通过PEG沉淀法纯化辅助噬菌体。通过一般的噬斑形成方法确认得到的辅助噬菌体M13KO7AG-PF1H的滴度。

（7－2）L链表达噬菌粒载体的构建

构建用于表达抗体L链的噬菌粒载体。噬菌粒载体通过在质粒载体中分别功能性插入噬菌体颗粒的包装信号、启动子、信号序列、抗体L链基因等而制备。此时，L链恒定区的C末端的Cys置换为Ala已知对大肠杆菌中的Fab表达是有利的（J Biol Chem. 2003 Oct 3;278(40): 38194-38205），因此应用这样的序列。通过将构建的噬菌粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌株ER2738，构建携带PF1 L链表达噬菌粒载体的大肠杆菌ER2738/pL-PF1L。

（7－3）通过L链表达噬菌粒载体和H链表达辅助噬菌体的组合产生Fab展示噬菌体

培养大肠杆菌ER2738/pL-PF1L直至OD大约0.5后，使其感染辅助噬菌体M13KO7AG-PF1H或M13KO7TC。用包含IPTG 25uM、阿拉伯糖0.2%的培养基实施培养基交换后，在30℃培养一晩，回收培养上清。在产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG使噬菌体沉淀，将其在TBS中溶解获得噬菌体液。通过一般的集落形成方法确认得到的噬菌体的滴度。

（7－4）通过噬菌体ELISA法确认噬菌体上的Fab展示

利用噬菌体ELISA法，确认产生的噬菌体的Fab展示以及确认对抗原的结合能力。向StreptaWell 96孔微量滴定板（Roche）添加含有山羊抗人κ生物素抗体（EYLABORATORIES）、或生物素标记人IL-6R的100μL的PBS，并包被板。用0.1×TBST（含有0.1%Tween20的0.1×TBS）洗涤该板的各孔除去抗原后，向该孔加入250μL的0.02% 脱脂乳-0.1×TBS(含有0.02% 脱脂乳的0.1×TBS)封闭1小时以上。除去0.02% 脱脂乳-0.1×TBS后，向各孔加入用0.02% 脱脂乳-0.1×TBS稀释的噬菌体液静置1小时，使噬菌体上展示的抗体与山羊抗人κ生物素抗体或生物素标记人IL-6R结合。用0.1×TBST洗涤后，向各孔添加用0.1×TBST稀释的HRP偶联抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）温育1小时。用0.1×TBST洗涤后，向各孔添加TMB单组分溶液（ZYMED），进一步添加硫酸停止溶液的显色反应后，测定450 nm的吸光度。

结果确认，仅在L链表达噬菌粒载体与H链表达辅助噬菌体M13KO7AG-PF1H组合产生噬菌体的情况下，Fab展示在噬菌体上（图10），另外，噬菌体上展示的Fab维持抗原结合能力（图11）。

［实施例8］包含幼稚L链的噬菌粒文库的构建、与包含幼稚L链以及抗PlexinA1抗体H链的Fab噬菌体文库的产生

（8－1）包含幼稚L链的噬菌粒文库的构建

以从人末梢血单核细胞（PBMC）配制的聚A RNA、市售人聚A RNA等为模板，通过PCR法扩增幼稚L链基因。将它们插入噬菌粒载体，通过电穿孔法将构建的噬菌粒载体导入大肠杆菌株ER2738，得到大约6.5×10⁶的克隆。

（8－2）含有幼稚L链以及抗PlexinA1抗体H链的Fab噬菌体文库的产生

按照实施例7中记载的方法，分别构建表达抗PlexinA1抗体hPANLB2-3_264的H链（序列编号：49）、抗PlexinA1抗体hPANLB2-3_342的H链（序列编号：50）、以及抗PlexinA1抗体hPANLB2-3_359的H链（序列编号：51）的辅助噬菌体（M13KO7AG-hPNL264H、M13KO7AG-hPNL342H、M13KO7AG-hPNL359H）。

通过在导入（8－1）中记载的包含幼稚L链的噬菌粒文库的大肠杆菌中分别感染上述辅助噬菌体（M13KO7AG-hPNL264H、M13KO7AG-hPNL342H、M13KO7AG-hPNL359H），构建展示包含幼稚L链与各种抗PlexinA1抗体H链的Fab的人抗体噬菌体展示文库（264H-NL文库、342H-NL文库、359H-NL文库）。在产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG使噬菌体沉淀，将其用TBS稀释而得到噬菌体文库液。

［实施例9］抗PlexinA1抗体的抗原结合能力增强的Fab的获得

（9－1）应用固定H链抗体文库获得与人PlexinA1强结合的抗体片段

从实施例8中构建的固定H链抗体文库（264H-NL文库、342H-NL文库、359H-NL文库）的噬菌体文库液，以与人PlexinA1的结合能力为指标，实施与人PlexinA1结合的抗体片段的挑选。

向各噬菌体文库液添加BSA至终浓度4%，封闭噬菌体文库液。淘选方法参考一般的方法，即应用磁珠于固定的抗原的淘选方法（J. Immunol. Methods. (2008) 332(1-2),2-9、 J. Immunol. Methods. (2001) 247(1-2), 191-203、 Biotechnol. Prog. (2002)18(2), 212-220、 Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-69）。磁珠应用NeutrAvidin包被珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或Streptavidin包被珠（DynabeadsM-280 Streptavidin）。具体地，在配制的噬菌体文库液中加入生物素标记抗原（生物素标记hPlexinA1），使噬菌体文库液与抗原在室温接触60分钟。分别地，第1次淘选应用10pmol、第2次以后的淘选应用1 pmol的生物素标记抗原。其后，加入应用的生物素标记抗原的100倍量的未标记抗原（可溶型人PlexinA1），使其竞争10分钟。向其中加入用BSA溶液封闭的磁珠，使抗原－噬菌体复合体与磁珠在室温结合15分钟。回收的珠用1 mL的TBST（含有0.1% Tween20的TBS）和1 mL的TBS洗涤。其后，向珠加入0.5 mL的1 mg/mL的胰蛋白酶溶液在室温悬浮15分钟后，立即用磁力支架分离珠，回收上清噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液加入培养至对数增殖期（OD600 =0.4-0.7）的10 mL的大肠杆菌株ER2738，在37℃缓慢搅拌培养1小时，从而使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种到225 mm × 225 mm板。随后，回收接种的大肠杆菌并培养后，使（8－2）中构建的导入了抗PlexinA1抗体H链基因的辅助噬菌体感染该大肠杆菌，进行培养，从而产生展示包含各种抗PlexinA1抗体H链的Fab的噬菌体。通过从培养液回收噬菌体，配制噬菌体文库液。将其作为第1次淘选，共重复4次淘选。

（9－2）通过噬菌体ELISA法筛选与抗原（人PlexinA1）结合的抗体

从（9－1）中实施的淘选完成2次、3次或4次后得到的大肠杆菌的单个克隆，根据常规方法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）产生噬菌体，回收含噬菌体的培养上清。这时，辅助噬菌体根据应用的噬菌体文库应用M13KO7AG-hPNL264H、M13KO7AG-hPNL342H、或M13KO7AG-hPNL359H。培养上清按照以下顺序接受ELISA。

用含有或不含有生物素标记抗原（生物素标记hPlexinA1）的100μL的PBS包被StreptaWell 96孔微量滴定板（Roche）一晩。该板的各孔用0.1×TBST（含有0.1% Tween20的0.1×TBS）洗涤而除去抗原后，各孔用250μL的0.02% 脱脂乳-0.1×TBS(含有0.02% 脱脂乳的0.1×TBS)封闭1小时以上。除去0.02% 脱脂乳-0.1×TBS后，各孔中加入噬菌体培养上清，将板在37℃静置1小时，使噬菌体上展示的抗体与各孔中存在的生物素标记抗原结合。各孔用0.1×TBST洗涤后，添加通过0.1×TBST稀释的HRP偶联抗M13抗体（AmershamPharmacia Biotech），温育板1小时。各孔用TBST洗涤后，添加TMB单组分溶液（ZYMED），进一步通过硫酸的添加使显色反应停止后，测定各孔的450 nm的吸光度。

上述噬菌体ELISA的结果是，将包被抗原的板相对于不包被抗原的板的显色比是2倍以上、并且包被抗原的板的显色是0.2以上判断为抗原特异性结合的克隆。进一步，对判断为抗原特异性结合的克隆进行抗体片段基因的碱基序列分析。

噬菌体ELISA的结果示于表3。分别地，表中的R2表示淘选完成2次后的克隆，R3表示淘选完成3次后的克隆，R4表示淘选完成4次后的克隆。结果，从各个噬菌体文库（264H-NL文库、342H-NL文库、359H-NL文库）得到对hPlexinA1特异性结合、并且序列不同的多数克隆。

[表3]

［实施例10］抗PlexinA1抗体的亲和力成熟产物的通过IgG的结合能力评价

（10－1）获得的人PlexinA1结合抗体的表达以及纯化

应用以下方法表达实施例9中从264H-NL文库中作为与人PlexinA1结合抗体获得的抗体之中的PLR2H264#002（重链、序列编号：58；轻链、序列编号：52）、PLR4H264#061（重链、序列编号：58；轻链、序列编号：53）、PLR3H264#022（重链、序列编号：58；轻链、序列编号：54）这3个抗体、从342H-NL文库中作为与人PlexinA1结合抗体获得的抗体之中的PLR2H342#009（重链、序列编号：59；轻链、序列编号：55）这1个抗体、从359H-NL文库中作为与人PlexinA1结合抗体获得的抗体之中的PLR2H359#087（重链、序列编号：60；轻链、序列编号：56）、PLR2H359#062（重链、序列编号：60；轻链、序列编号：57）这2个抗体，对这些抗体进行纯化。另外，作为比较对象，也应用以下方法表达作为亲本抗体的hPANLB2-3_264（重链、序列编号：58、轻链、序列编号：61）、hPANLB2-3_342（重链、序列编号：59、轻链、序列编号：62）、hPANLB2-3_359（重链、序列编号：60、轻链、序列编号：63），对这些抗体进行纯化。将FreeStyle 293 Expression Medium培养基（Invitrogen）中悬浮的人胎肾细胞衍生FreeStyle 293-F株（Invitrogen）以1.33 × 10⁶细胞/mL的细胞密度在6孔板的各孔中各接种3 mL。配制的质粒通过脂转染法导入细胞。在CO₂培养箱（37度、8%CO₂、90 rpm）中进行4日培养。应用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）应用本领域技术人员公知的方法，从上述得到的培养上清纯化抗体。应用分光光度计测定纯化的抗体溶液的280 nm吸光度。通过应用由PACE法算出的消光系数，从得到的测定值算出抗体浓度（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。

（10－2）获得的抗PlexinA1抗体的结合能力评价

通过表面等离子体共振(SPR)分析评价（10－1）中得到的抗体对抗原的结合性。

SPR分析中应用BiacoreT200（GE Healthcare日本公司）进行分析。应用重组型蛋白A/G（Thermo Fisher Scientific公司）和Amine Coupling Kit（GE Healthcare日本公司）将抗人PlexinA1抗体固定在传感器芯片CM4的表面。抗原使用蛋白质C末端附加FLAG标签的人PlexinA1蛋白质的sema结构域 (28号谷氨酸-514号丝氨酸)。抗原的配制如下。将整合了与人PlexinA1的sema结构域对应的cDNA的表达载体导入FreeStyle293细胞培养后，使得到的培养液通过固定了抗FLAG-M2抗体的亲和柱，将用FALG肽洗脱的级分凝胶过滤纯化。将得到的抗原用20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05%聚山梨醇酯20, 1.2 mM CaCl₂, pH7.4连续稀释，以流速30 μL/min添加。通过该测定体系，应用数据分析软件（BIA T200Evaluation software ver.2）计算人PlexinA1蛋白质与抗人PlexinA1抗体的解离常数（KD）。结果示于表4。

与再选择L链之前的抗体比较，能够获得结合能力增强的抗体。

另外，作为该方法的其它利用方法，即使结合能力不增强的抗体，也可用于非人动物衍生抗体的人源化(J Mol Biol. 2000 Feb 25;296(3):833-49.)。通过将非人动物衍生抗体的H链固定、与人幼稚衍生L链抗体文库组合、对抗原进行淘选操作，能够获得人衍生抗体L链。随后，通过固定L链与人幼稚衍生H链抗体文库组合、对抗原进行淘选操作，能够获得人衍生抗体H链。本领域技术人员会理解，如此地，通过与人抗体文库连续置换，可以以非人动物衍生抗体为基础获得人抗体。

[表4]

表4中，相对KD改进是显示与亲本抗体比较就KD值而言结合能力增强多少倍的值。获得相对于各个亲本抗体亲和性增强的抗体。

工业实用性

在一个实施方式中，通过本发明，提供了有效制备包含共同的第一多肽的多数抗原结合分子的方法。

根据以前的噬菌体展示技术，也可制备第一多肽的序列固定的抗原结合分子展示文库，但是，由于制备能够同时表达第一多肽和第二多肽两者的细菌的文库，随后改变临时制备的文库中第一多肽的序列是极其困难的，另外，由于抗原结合分子展示文库的制备中通常需要巨大的时间和努力，制备多数第一多肽的序列固定的文库是非常困难的。

另一方面，本发明中，一旦制备能够表达第二多肽的细菌的文库，则通过改变辅助噬菌体中包含的仅仅第一多肽，能够接连地简便制备第一多肽的序列固定的抗原结合分子展示文库，因此，可强烈地提高操作效率。本发明作为新颖的噬菌体展示技术是极其有用的。作为应用本发明的一个例子，可列举包含共同的L链或H链的多特异性抗体的开发等。

Claims (11)

1.制备包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a)对多个不同抗原进行获得特异性结合预定抗原的抗原结合分子的方法，其中所述方法包括下述步骤(a-1)和(a-2)，

(a-1)使所述抗原与制备包含共同的第一多肽的抗原结合分子展示文库的方法制备的抗原结合分子展示文库接触，其中所述方法包括下述步骤(1)和(2)，

(1)多次进行制备展示抗原结合分子的噬菌体的方法，所述方法包括使能够表达第一多肽的辅助噬菌体与能够表达第二多肽的细菌接触，其中所述第一多肽与所述第二多肽缔合形成所述抗原结合分子，其中步骤中应用的多个细菌是能够表达氨基酸序列不同的多个第二多肽的细菌群，并且步骤中应用的辅助噬菌体是能够表达相同氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，以及

(2)回收步骤(1)中制备的、展示相同氨基酸序列的第一多肽的抗原结合分子的多个噬菌体；和

(a-2)从所述抗原结合分子展示文库中选择与所述抗原结合的抗原结合分子；以及

(b)应用步骤(a)中获得的多个抗原结合分子中含有的、多个相同氨基酸序列的第一多肽以及多个不同氨基酸序列的第二多肽，制备多特异性抗原结合分子的步骤，其特征在于，所述多个第二多肽分别与所述第一多肽缔合，形成与所述多个抗原特异性结合的所述多个抗原结合分子，

其中所述多特异性抗原结合分子具有抗体可变区，其中第一多肽以及第二多肽分别选自包含L链可变区的多肽以及包含H链可变区的多肽，并且彼此不同。

2.制备包含共同的第一多肽的多特异性抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：

(a)对多个不同抗原进行获得特异性结合预定抗原的抗原结合分子的方法，其中所述方法包括下述步骤(a-1)和(a-2)，

(a-1)使所述抗原与制备包含共同的第一多肽的抗原结合分子展示文库的方法制备的抗原结合分子展示文库接触，其中所述方法包括下述步骤(1)和(2)，

(1)多次进行制备展示抗原结合分子的噬菌体的方法，所述方法包括使能够表达第一多肽的辅助噬菌体与能够表达第二多肽的细菌接触，其中所述第一多肽与所述第二多肽缔合形成所述抗原结合分子，其中步骤中应用的多个细菌是能够表达氨基酸序列不同的多个第二多肽的细菌群，并且步骤中应用的辅助噬菌体是能够表达相同氨基酸序列的第一多肽的辅助噬菌体，以及

(2)回收步骤(1)中制备的、展示相同氨基酸序列的第一多肽的抗原结合分子的多个噬菌体；

(a-2)从所述抗原结合分子展示文库中选择与所述抗原结合的抗原结合分子；以及

(b)对步骤(a)中获得的多个抗原结合分子中含有的、多个相同氨基酸序列的第一多肽以及多个不同氨基酸序列的第二多肽，分别配制编码所述第一多肽的多核苷酸以及编码所述多个第二多肽的多核苷酸的步骤，

(c)将步骤(b)中配制的各多核苷酸导入宿主细胞的步骤，以及

(d)培养步骤(c)的宿主细胞，回收多特异性抗原结合分子的步骤，其特征在于，所述多个第二多肽分别与所述第一多肽缔合，形成与所述多个抗原特异性结合的所述多个抗原结合分子，

其中所述多特异性抗原结合分子具有抗体可变区，其中第一多肽以及第二多肽分别选自包含L链可变区的多肽以及包含H链可变区的多肽，并且彼此不同。

3.权利要求1或2中记载的方法，其中将编码第一多肽的多核苷酸插入辅助噬菌体的基因组中。

4.权利要求1或2中记载的方法，其中将编码第一多肽的多核苷酸与启动子功能性连接。

5.权利要求1或2中记载的方法，其中第一多肽与噬菌体的外壳蛋白质融合。

6.权利要求1或2中记载的方法，其中辅助噬菌体是M13KO7。

7.权利要求1或2中记载的方法，其中细菌包含编码第二多肽的多核苷酸。

8.权利要求1或2中记载的方法，其中编码第二多肽的多核苷酸插入噬菌粒载体。

9.权利要求1或2中记载的方法，其中第二多肽与噬菌体的外壳蛋白质融合。

10.权利要求1或2中记载的方法，其中包含L链可变区的多肽是进一步包含L链恒定区的多肽，和/或包含H链可变区的多肽是进一步包含H链恒定区的多肽。

11.权利要求1或2中记载的方法，其中多特异性抗原结合分子是双特异性抗原结合分子。