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WO2025154793A1 - 多重特異性抗体の製造に使用するための共通のｌ鎖を同定する方法 - Google Patents

多重特異性抗体の製造に使用するための共通のｌ鎖を同定する方法

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Publication number
WO2025154793A1
WO2025154793A1 PCT/JP2025/001321 JP2025001321W WO2025154793A1 WO 2025154793 A1 WO2025154793 A1 WO 2025154793A1 JP 2025001321 W JP2025001321 W JP 2025001321W WO 2025154793 A1 WO2025154793 A1 WO 2025154793A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
chain
antigen
library
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/001321
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English (en)
French (fr)
Inventor
万里子 近藤
順平 大屋
由範 鵜飼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Perseus Proteomics Inc
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perseus Proteomics Inc filed Critical Perseus Proteomics Inc
Publication of WO2025154793A1 publication Critical patent/WO2025154793A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Definitions

  • Antibodies consist of two different genes for the heavy and light chains, which form a pair of building blocks that form an antigen-binding molecule.
  • a multispecific antibody is an artificial protein that binds to two or more different antigens simultaneously.
  • As an antibody-related technology there has been an increasing trend in the development of multispecific antibodies in recent years.
  • Non-Patent Document 1 describes how a common L chain can be found by modifying each of the L chains that bind to the two antigens bound by a bispecific antibody. Specifically, a chimeric L chain was genetically engineered by shuffling the amino acid sequences of each L chain, and co-expressed with each H chain. The L chain that maintained binding to the target antigen was selected, and a common L chain was successfully obtained.
  • Non-Patent Document 2 it is also known to use a light chain library to obtain a common light chain (Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 3 the natural antibody diversification process occurring in B cells is mimicked, and an antibody with high binding activity is obtained by a step of affinity maturation by introducing mutations into light chains directly isolated from the library.
  • Non-Patent Document 2 states that the repertoire size of the L chain library is 1.1x105 and 1.7x106 , and Document 3 does not provide any specific information such as the library size for the L chain library.
  • both of them use heavy chains derived from the library to commonize the light chains, there is a disadvantage that the versatility for using common light chains is poor.
  • a common L chain for use in the production of a multispecific antibody can be identified by producing a first library containing a plurality of antibodies that recognize a first antigen and a second library containing a plurality of antibodies that recognize a second antigen, and selecting an antibody that recognizes a first antigen and an antibody that recognizes a second antigen, which have a common L chain, from the first library and the second library.
  • One of the features of the present invention is that even when using a heavy chain derived from mouse immunization or a heavy chain derived from a human antibody produced by a humanized mouse, a new combination can be selected by screening the same light chain library, making it highly versatile.
  • the binding activity actually measured using ELISA after screening shows a signal intensity equal to or greater than that of the original sequence.
  • the method of the present invention is very efficient in that the isolated light chain can be used as is.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 2>, wherein the library containing a plurality of antibodies having H chains and L chains contains 10 9 or more types of antibodies.
  • ⁇ 4> The method according to ⁇ 2>, wherein the number of types of H chains in the library containing a plurality of antibodies having H chains and L chains is 10 6 or more.
  • ⁇ 5> The method according to ⁇ 2>, wherein the number of types of L chains in the library containing a plurality of antibodies having H chains and L chains is 103 or less.
  • ⁇ 6> The method according to ⁇ 2>, wherein the ratio of the types of H chains to the types of L chains in the library containing a plurality of antibodies having the H chains and the L chains is 1000 times or more.
  • step (1) (1-A) a step of producing an antibody library containing the H chain and L chain of an antibody recognizing the first antigen by incorporating a nucleic acid encoding the H chain of an antibody recognizing a first antigen into a library of nucleic acids encoding an L chain; and (1-B) a step of selecting an antibody recognizing the first antigen from the antibody library obtained in the step (1-A).
  • the step (1) is a step of producing a first library by selecting a plurality of antibodies that recognize a first antigen from a library containing a plurality of antibodies having an H chain and an L chain;
  • the step (2) (2-A) a step of producing an antibody library containing the H chain and L chain of an antibody recognizing the second antigen by incorporating a nucleic acid encoding the H chain of an antibody recognizing the second antigen into a library of nucleic acids encoding an L chain; and (2-B) a step of selecting an antibody recognizing the second antigen from the antibody library obtained in the step (2-A).
  • a third embodiment of the present invention is shown in FIG.
  • a method for producing a multispecific antibody comprising:
  • a common L chain is used to produce a multispecific antibody, which reduces the number of combinations of L chains and H chains, making it easier to express and purify the multispecific antibody.
  • the process of producing a multispecific antibody using an L chain, an H chain that recognizes a first antigen, and an H chain that recognizes a second antigen involves inserting DNA encoding the L chain, the H chain that recognizes the first antigen, and the H chain that recognizes the second antigen into an expression vector to produce an expression vector, expressing the vector in a host cell, and recovering and purifying the secreted supernatant to obtain the antibody.
  • the antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in frame to the amino terminus of the immunoglobulin chain.
  • the signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide from a non-immunoglobulin protein).
  • the antibody expression vector may contain additional sequences, such as sequences that control replication of the vector in a host cell (e.g., origins of replication) and a selectable marker gene.
  • the selectable marker gene facilitates selection of a host cell into which the vector has been introduced.
  • the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on the host cell into which the vector has been introduced.
  • Preferred selectable marker genes include the dehydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr- host cells with methotrexate selection/amplification), the neomycin phosphotransferase gene (for G418 selection), and the glutamate synthetase gene.
  • DHFR dehydrofolate reductase
  • Host cells are transformed with the antibody gene expression vector prepared by the above method. Any cells capable of producing antibodies may be used as host cells, including bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, but animal cells are preferred. Examples of animal cells include Chinese hamster ovary cells CHO/dhfr (-) cells CHO/DG44 cells, monkey-derived COS cells (A. Wright & S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402 (1998)), and SP2/O cells (mouse myeloma) (K. Motmans et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-5199 (1996), R. P. Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495-1502 (1990)).
  • methods that are suitable for transformation include the lipofectin method (R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6007 (1989), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)), electroporation, the calcium phosphate method (F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973)), and the DEAE-Dextran method.
  • SEQ ID NO: 97 CD3 ⁇ antibody_0039 heavy chain variable region QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREMSNWDDAFDIWGQGTMVTVSR SEQ ID NO: 98: CD3 ⁇ antibody_0039 light chain SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Additional CD3 light chain variable region sequence SEQ ID NO: 99: CD3 ⁇ antibody_0039 light chain variable region S
  • RNA extraction 5-10x10 7 cells were prepared and 1mL of TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific) was added to disrupt the cells, followed by the addition of 50 ⁇ L of 4-bromoanisole. After incubation, the cells were centrifuged to recover 600 ⁇ L of the upper aqueous layer containing RNA, and the sample was transferred to a spin cartridge after adding 70% ethanol. The spin column was washed with 350 ⁇ L of Wash Buffer I and 500 ⁇ L of Wash Buffer II, and eluted by adding 100 ⁇ L of RNase-free water.
  • RNA precipitate 5 ⁇ L of the cDNA synthesized RNA is precipitated with ethanol, and the RNA precipitate is suspended in a premixed solution (1 ⁇ L of 50 ⁇ M Oligo d(T)20 primer, 1 ⁇ L of 10 mM dNTP Mix, and 11 ⁇ L of DEPC-water). Then, a solution prepared in advance (5XSSIV RT Buffer 4 ⁇ L, 100 mM DTT 1 ⁇ L, RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor 1 ⁇ L, SuperScript IV Reverse Transcriptase (200 U / ⁇ L) 1 ⁇ L Thermo Fisher Scientific) was added and reacted at 50 ° C. for 10 minutes and 80 ° C. for 10 minutes. After the reaction, purification was performed with PCR Purification Kit (QIAGEN), and cDNA was eluted in 100 ⁇ L.
  • QIAGEN PCR Purification Kit
  • VH1 GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG (SEQ ID NO: 86) VH2 GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC (SEQ ID NO: 87) VH3 GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (SEQ ID NO: 88) VH4 GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG (SEQ ID NO: 89) VH4-2 GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG (SEQ ID NO: 90) VH6 GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG (SEQ ID NO: 91) VH7 GTCCTCGCAACTGCGGCCCA
  • a reaction was carried out at 94°C for 30 seconds, 65°C for 30 seconds, and 74°C for 2 minutes for 30 cycles, and the amplified DNA fragment was collected. In this manner, a series of operations from RNA extraction to cDNA synthesis and heavy chain fragment amplification were repeated to prepare antibody fragments from approximately 5 to 10 x 107 immune cells prepared.
  • An antibody library was constructed by incorporating the amplified DNA fragments into a vector (phagemid vector) for phage display.
  • the phagemid was designed to code for a signal sequence, a heavy chain antibody sequence, a linker sequence, a light chain antibody sequence, and M13 phage cp3 protein, and is composed of a replication origin for E. coli amplification and an ampicillin resistance gene for drug selection.
  • the PCR amplified fragments were treated with Sfi-I and XhoI restriction enzymes, while the vector side was similarly treated. The antibody fragments and the vector were then ligated, and the ligation product was introduced into E.
  • the ligation product was precipitated with ethanol and dissolved in QW. 2 ⁇ L of the suspension was suspended in 20 ⁇ L of DH12S (Thermo Fisher Scientific), and electroporation was performed according to the bacterial program (25 ⁇ F, 200 ⁇ , 1.8 kV, cuvette width 0.1 cm) of Gene Pulser Xcell (Bio-Rad). The entire ligation product was then transformed, and the introduced E. coli was cultured in 2xYT medium containing ampicillin. After overnight culture, the cells were collected and the plasmid was purified.
  • an antibody library was prepared by combining the heavy chain antibody library prepared above with an artificially synthesized light chain antibody.
  • the synthesized 400 types of light chain antibody fragments were treated with NcoI and AscI restriction enzymes and purified with PCR Purification Kit (QIAGEN).
  • the heavy chain antibody library was treated with NcoI and AscI restriction enzymes and vector-sized DNA fragments were excised by agarose electrophoresis. This was collected with GEL Extraction Kit (QIAGEN), purified by ethanol precipitation, and then dissolved in QW.
  • the light chain fragments and heavy chain antibody library were then ligated under the following conditions.
  • coli was cultured overnight at 30°C in 100 mL of 2xYTGA medium (2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 1% glucose). 10 mL of this overnight culture was mixed with 100 mL of 2xYTA medium (2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate) and cultured at 37° C. for 1.5 hours. Then, 1 x 10 helper phage KO7 was added and cultured at 37° C. for 1 hour. After that, 400 mL of 2xYTGAK (2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 0.05% glucose, 50 ⁇ g/mL kanamycin) was added and cultured overnight at 30° C.
  • 2xYTGA medium 2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 1% glucose
  • 10 mL of this overnight culture was mixed with 100 mL of 2xYTA medium (2xYT, 200 ⁇ g/m
  • the plate was washed 20 times with PBS, and 100 ⁇ L/well of 0.2 M Glycine HCl (pH 3.0) was added to recover the phages.
  • the recovered phages were infected with 10 mL of E. coli DH12S at OD 0.5 for 1 hour, and a portion of the infected cells was plated on an ampicillin LBG plate to calculate the titer of the recovered phages.
  • the phage-infected E. coli was cultured overnight at 30° C. in 50 mL of 2xYTGA medium (2xYT, 100 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 1% glucose).
  • the antigen was immobilized in the same manner as in the second screening, and the series of procedures was repeated using 1 x 10 10 of the second screening phage solution.
  • Identification of positive clones was determined by ELISA using human CD3 ⁇ extracellular domain protein. That is, the antigen was adjusted to 10 ⁇ g/mL with PBS, added to Immuno Module/Strip (NUNC) at 100 ⁇ L/well, and left to stand at 37°C for 2 hours. Thereafter, the antigen solution was discarded, and blocking solution (2.5% skim milk/PBS) was added at 200 ⁇ L/well, and blocking was performed at 37°C for 2 hours. The blocking solution was removed, washed with PBS, and the monoclonal culture supernatant prepared from the above 3rd screening was added at 100 ⁇ L/well, and reacted at 37°C for 1 hour.
  • NUNC Immuno Module/Strip
  • Preparation of Antibody against AXL (1) Preparation of AXL antigen Based on the amino acid information of human AXL (Genebank accession number AAH32229), a gene encoding 451 amino acids of the extracellular domain (amino acid residues 1-451) and a gene encoding the subsequent 8xHis tag were designed and artificially synthesized. This synthetic gene was inserted into the pCXN3 vector using restriction enzymes to prepare a human AXL expression vector. Expression and purification were performed in the same manner as for the CD3 antigen and CD73 antigen, and the AXL-His protein was prepared.
  • SEQ ID NO: 97 CD3 ⁇ antibody_0039 heavy chain variable region QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREMSNWDDAFDIWGQGTMVTVSR SEQ ID NO: 98: CD3 ⁇ antibody_0039 light chain SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Additional CD3 light chain variable region sequence SEQ ID NO: 99: CD3 ⁇ antibody_0039 light chain variable region S
  • SEQ ID NO: 100 CD73 antibody_3001 heavy chain variable region QVQLVQSGAEMKKPGESLRISCQGSGYSFTSYWISWVRQTPGKGLEWMGRIDPSDSYTNYSPSLQGHVTISADKSTSTAYLQWNSLKASDSGIYYCARLSRYFYGMDVWGRGTTVTVSR SEQ ID NO:101: CD73 antibody_3001 light chain SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
  • SEQ ID NO: 102 AXL antibody_2079 heavy chain variable region QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGAHTELLLSVGAFDIWGQGTMVTVSR
  • SEQ ID NO: 103 AXL antibody_2079 light chain SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
  • SEQ ID NO: 104 AXL antibody_2085 heavy chain variable region
  • a heavy chain sequence is identified from the sequence information of EGFR antibodies Cetuximab and Panitumumab, which are marketed as antibody drugs, and a new light chain is searched for by combining this as a foreign heavy chain with an antibody light chain library.
  • a heavy chain is not derived from an antibody library, it can be incorporated into a nucleic acid library encoding a light chain, and an antibody that functions without impairing binding activity can be selected as long as the L chain has an optimal combination with the inserted heavy chain.
  • a heavy chain variable region is identified from the antibody amino acid sequence described in the CTD (Common Technical Document) for drug approval application, and then artificial synthesis is performed as a nucleic acid corresponding to the amino acid.
  • This heavy chain variable region sequence is inserted into a library containing nucleic acids encoding a light chain, and a light chain library is completed in which the heavy chain is fixed to the variable region of Cetuximab.
  • 117 amino acids SEQ ID NO: 106
  • the artificially synthesized DNA fragment was ligated to a vector containing an L-chain library by restriction enzyme treatment.
  • SEQ ID NO: 106 Cetuximab heavy chain variable region QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVSS
  • coli was cultured overnight at 30° C. in 100 mL of 2xYTGA medium (2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 1% glucose). 10 mL of this overnight culture was mixed with 100 mL of 2xYTA medium (2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate) and cultured at 37° C. for 1.5 hours. Then, 1 x 10 helper phage KO7 was added and cultured at 37° C. for 1 hour. After that, 400 mL of 2xYTGAK (2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 0.05% glucose, 50 ⁇ g/mL kanamycin) was added and cultured overnight at 30° C.
  • 2xYTGA medium 2xYT, 200 ⁇ g/mL ampicillin sulfate, 1% glucose
  • 10 mL of this overnight culture was mixed with 100 mL of 2xYTA medium (2xYT, 200 ⁇ g/
  • the antigen was immobilized in the same manner as in the first screening, 1x109 of the first screening phage solution was used, and the number of washing operations was changed to 15, and a series of operations was repeated.
  • the antigen was immobilized in the same manner as in the previous screening, 1x109 of the second screening phage solution was used, and the number of washing operations was changed to 25, and screening operations were performed.
  • Identification of positive clones was determined by ELISA using human EGFR extracellular domain protein. That is, the antigen was adjusted to 10 ⁇ g/mL with PBS, added to Immuno Module/Strip (NUNC) at 100 ⁇ L/well, and left to stand at 37 ° C for 2 hours. Thereafter, the antigen solution was discarded, and blocking solution (2.5% skim milk/PBS) was added at 200 ⁇ L/well, and blocking was performed at 37 ° C for 2 hours.
  • NUNC Immuno Module/Strip
  • the blocking solution was removed, washed with PBS, and the monoclonal culture supernatant prepared from the above 3rd screening was added at 100 ⁇ L/well, and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • 1 ⁇ g/mL Moese anti-cp3 antibody diluted with PBS/0.05% Tween 20 was added at 100 ⁇ L/well and reacted at 37° C. for 1 hour.
  • 100 ⁇ L/well of HRP-labeled anti-Mouse IgG (H+L) antibody (MBL) diluted 2000-fold with PBS/0.05% Tween 20 was added and reacted at 37° C. for 1 hour.
  • panitumumab Construction of heavy chain fixed library (Panitumumab) According to the method described in (1) above, the sequence of panitumumab was obtained from the CTD, and the sequence of the heavy chain variable region was synthesized.
  • a light chain library fixed to the heavy chain of panitumumab was prepared according to the above method.
  • SEQ ID NO:110 Pa006 light chain DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISRYLNWYQQKPGKAPELLIYDASDLETGVPSRFSGSGSGTGFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDTLPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
  • SEQ ID NO:111 Pa007 light chain DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
  • TfR transferrin receptor
  • TfR protein Based on the amino acid information of human TfR (Genebank accession number NP_003225.2), a gene encoding amino acid residues 89 to 760 and a gene encoding the subsequent His tag were designed and artificially synthesized. This synthetic gene was inserted into the pCXN3 vector using a restriction enzyme to prepare a human TfR expression vector. The expression vector was transiently transfected into FreeStyle-293F cells (Invitrogen) and then cultured with shaking for one week. The culture supernatant collected from this was used as a sample and purified by passing it through a His-Trap HP column (Cytiva) to prepare the extracellular domain TfR-His protein.
  • SEQ ID NO: 114 TfR443 heavy chain variable region QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFATYGMHWVRQAPGQSLEWMGWINVGSGDTEYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRFEDTAVYYCARDNGRWGQGTLVTVSS
  • SEQ ID NO: 115 TfR443 light chain DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
  • Cetuximab which is marketed as an antibody against EGFR protein, is a chimeric antibody obtained by immunization with mice, and the Fc portion is replaced with human Fc by genetic modification. Therefore, the mouse antibody gene remains in the variable portion.
  • the light chain library used this time is configured using human naive sequences. The examples of the present invention suggest that it is possible to discover a combination of sequences that does not lose reactivity when a heavy chain variable region derived from a mouse antibody is combined with a light chain derived from a human antibody, which is thought to be of great significance in creating a common light chain for bispecific antibodies.
  • panitumumab is an antibody created by Amgen, Inc. of the United States, using Xenomouse technology, and was isolated from a human antibody-producing mouse with a human antibody gene inserted into it. In recent years, many of the pharmaceuticals that have been marketed as fully human antibodies are said to be derived from such human antibody-producing mice.
  • the fact that a common light chain was obtained for the panitumumab heavy chain obtained by immunizing this human antibody-producing mouse and for the light chain derived from the library suggests that the light chain derived from the library has a versatile sequence group.
  • the fact that multiple light chains can be isolated for heavy chains other than those derived from the library may also be useful for producing bispecific antibodies derived from two types of heavy chains other than those from the library.

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Abstract

本発明の課題は、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法を提供することである。本発明によれば、（１）第一の抗原を認識する複数の抗体を含む第一のライブラリを製造する工程、（２）第二の抗原を認識する複数の抗体を含む第二のライブラリを製造する工程、および（３）前記の第一のライブラリ、および前記の第二のライブラリの中から、共通のＬ鎖を有する、第一の抗原を認識する抗体と、第二の抗原を認識する抗体とを選別する工程、を含む、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法が提供される。

Description

多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法
　本発明は、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法に関する。本発明はさらに、多重特異性抗体の製造方法に関する。
　抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖の異なる２つの遺伝子からなり、１対の構成単位で抗原結合分子を形成する。また、多重特異性抗体とは、２種類以上の異なる抗原に同時に結合する人工的なタンパク質である。抗体に関連した技術として、近年、多重特異性抗体の開発が増加傾向にある。
　多重特異性抗体の開発における課題としては、それぞれの特異性のため異なるH鎖とL鎖の対が必要となり、発現構造が複雑になることが挙げられる。二重特異性（Bispecific）抗体の場合には、２種類のH鎖および２種類のL鎖が必要となり、正しい組み合わせを得るためには、発現および精製時に繁雑な工程が必要となる。そのため抗体のＬ鎖を共通化するための工夫が行われている。
　例えば、非特許文献１には、二重特異性抗体が結合する２つの抗原に対するそれぞれのＬ鎖を改変することによって、共通Ｌ鎖を見い出すことが記載されている。具体的には，それぞれのＬ鎖のアミノ酸配列をシャッフリングしたキメラＬ鎖を遺伝子工学的に作製し，各Ｈ鎖と共発現させ，目的の抗原への結合を維持しているＬ鎖を選抜することにより、共通Ｌ鎖の取得に成功している。
　また、共通軽鎖を取得するために軽鎖ライブラリを使用することは知られている（非特許文献２および非特許文献３）。非特許文献３においては、Ｂ細胞で発生する自然な抗体多様化プロセスを模倣しており、ライブラリから直接単離された軽鎖に変異を入れて親和性成熟させる工程によって、高い結合活性を有する抗体を取得している。また、非特許文献２ではＬ鎖ライブラリのレパートリーサイズが１．１ｘ１０５および１．７ｘ１０６とされており、文献３においては、Ｌ鎖のライブラリについてはライブラリーサイズなどの具体的な情報はない。また共にライブラリに由来する重鎖を使用して、軽鎖の共通化を図っているため、共通軽鎖を利用するための汎用性に乏しいという欠点がある。
Zenjiro Sampei　et al., PLos One 8 e57479 (2013) Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81. MABS. 2018, VOL. 10, NO. 2, 256-268
　多重特異性抗体の製造において抗体のＬ鎖を共通化するための工夫が行われているが、汎用性の高い技術はいまだ構築されていない。本発明は、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記の方法で同定された共通のＬ鎖を用いた多重特異性抗体の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために検討した結果、第一の抗原を認識する複数の抗体を含む第一のライブラリ、および第二の抗原を認識する複数の抗体を含む第二のライブラリをそれぞれ製造し、前記の第一のライブラリ、および前記の第二のライブラリの中から、共通のＬ鎖を有する、第一の抗原を認識する抗体と、第二の抗原を認識する抗体とを選別することによって、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定できることを見出した。本発明の特徴の一つは、マウス免疫由来の重鎖またはヒト化マウスが産生するヒト抗体由来重鎖を使用する場合であっても、同一の軽鎖ライブラリをスクリーニングすることによって新しい組み合わせ選出できることにあり、非常に汎用性が高い。本発明においては、実際にスクリーニング後にELISAを用いて測定した結合活性はオリジナルの配列と同等もしくはそれ以上のシグナル強度を示している。すなわち、本発明の方法は、単離した軽鎖をそのまま利用できる点においては非常に効率的である。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　（１）第一の抗原を認識する複数の抗体を含む第一のライブラリを製造する工程、
（２）第二の抗原を認識する複数の抗体を含む第二のライブラリを製造する工程、および
（３）前記の第一のライブラリ、および前記の第二のライブラリの中から、共通のＬ鎖を有する、第一の抗原を認識する抗体と、第二の抗原を認識する抗体とを選別する工程、
を含む、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法。
＜２＞　前記工程（１）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第一の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第一のライブラリを製造する工程であり、
前記工程（２）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第二の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第二のライブラリを製造する工程である、
＜１＞に記載の方法。
＜３＞　前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリが、１０９種以上の抗体を含む、＜２＞に記載の方法。
＜４＞　前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＨ鎖の種類が１０６以上である、＜２＞に記載の方法。
＜５＞　前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＬ鎖の種類が１０３以下である、＜２＞に記載の方法。
＜６＞　前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＨ鎖の種類とＬ鎖の種類の比率が、１０００倍以上である、＜２＞に記載の方法。
＜７＞　前記工程（１）が、
（１－Ａ）第一の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第一の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
（１－Ｂ）前記工程（１－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第一の抗原を認識する抗体を選別する工程、
を含み、
前記工程（２）が、
（２－Ａ）第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
（２－Ｂ）前記工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第二の抗原を認識する抗体を選別する工程、
を含む、
＜１＞に記載の方法。
＜８＞　前記の工程（１－Ａ）で得た抗体ライブラリおよび工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリにおけるＬ鎖の種類がそれぞれ１０３以下である、＜７＞に記載の方法。
＜９＞　前記工程（１）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第一の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第一のライブラリを製造する工程であり、
前記工程（２）が、
（２－Ａ）第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
（２－Ｂ）前記工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第二の抗原を認識する抗体を選別する工程、
を含む、
＜１＞に記載の方法。
＜１０＞　第一の抗原および第二の抗原がそれぞれ、がん抗原、免疫細胞の抗原、生理活性分子、および酵素から選択される、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞　＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法によりＬ鎖を同定する工程、および
前記で同定されたＬ鎖と、第一の抗原を認識するＨ鎖と、第二の抗原を認識するＨ鎖とを用いて多重特異性抗体を製造する工程、
を含む、多重特異性抗体の製造方法。
　本発明によれば、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定することができる。多重特異性抗体の製造に必要な複数のＬ鎖を共通化することにより、多重特異性抗体の構成要素を削減することができ、多重特異性抗体の発現および精製時の工程を減らすことができる。
図１は、本発明の第一の態様を示す。 図２は、本発明の第二の態様を示す。 図３は、本発明の第三の態様を示す。 図４は、共通軽鎖配列の同定の結果を示す。 図５は、共通軽鎖配列の同定の結果を示す。 図６は、ＣｅｔｕｘｉｍａｂのＨ鎖を挿入したＬ鎖ライブラリからスクリーニングした結果からＥＬＩＳＡを実施して、反応性を確認した結果を示す。 図７は、ＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂのＨ鎖を挿入したＬ鎖ライブラリからスクリーニングした結果からＥＬＩＳＡを実施して、反応性を確認した結果を示す。 図８は、ＴｆＲタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性の確認の結果を示す。
　次に、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明は、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法であって、
（１）第一の抗原を認識する複数の抗体を含む第一のライブラリを製造する工程、
（２）第二の抗原を認識する複数の抗体を含む第二のライブラリを製造する工程、および
（３）前記の第一のライブラリ、および前記の第二のライブラリの中から、共通のＬ鎖を有する、第一の抗原を認識する抗体と、第二の抗原を認識する抗体とを選別する工程、
を含む方法に関する。
　多重特異性抗体とは、２種以上の抗原を認識する抗体である。特に二重特異性抗体はよく用いられている。
　多重特異性抗体が認識する第一の抗原および第二の抗原の種類は特に限定されないが、例えば、それぞれ、がん抗原、免疫細胞の抗原、生理活性分子、および酵素から選択することができる。例えば、第一の抗原および第二の抗原の組み合わせとしては、がん抗原とがん抗原との組み合わせ、がん抗原と免疫細胞の抗原との組み合わせ、生理活性分子と生理活性分子との組み合わせ、酵素と酵素との組み合わせなどが挙げられるが、特に限定されない。
　がん抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＣＤＨ３、Ｈｅｒ２、ＨＬＡＡ／ｇｐ１００、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＰＲＡＭＥ、ＧＰＣ３、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＳＬＮ、ＥｐｈＡ２、ＲＯＲ１、ＤＬＬ３などが挙げられる。
　免疫細胞の抗原としては、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＯＸ４０などが挙げられる。
　生理活性分子としては、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質などが挙げられる。具体的には、ＩＬ－２、ＩＦＮ-α、β、γ、ＴＮＦ、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２などが挙げられる。
　酵素としては、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９などＭＭＰｓなどが挙げられる。
　抗体を含むライブラリとしては、特に限定されないが、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に提示させたライブラリ、無細胞翻訳系を使用したライブラリ、細胞またはウイルス表面に抗体を提示したライブラリ、エマルジョンを使用したライブラリ等が知られている。例えば、無細胞翻訳系を使用する技術としては、終止コドンの除去等によりリボゾームを介してｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質の複合体を形成させるリボゾームディスプレイ法、ピューロマイシン等の化合物を用いて遺伝子配列と翻訳されたタンパク質を共有結合させるｃＤＮＡディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法や、核酸に対する結合タンパク質を用いて遺伝子と翻訳されたタンパク質の複合体を形成させるＣＩＳディスプレイ法等が挙げられる。細胞またはウイルス表面に抗原結合分子を提示する技術としては、ファージディスプレイ法以外にも、Ｅ．　ｃｏｌｉディスプレイ法、グラム陽性菌ディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、哺乳類細胞ディスプレイ法、ウイルスディスプレイ法等が挙げられる。エマルジョンを使用する技術としては、エマルジョン中に遺伝子及び翻訳関連分子を内包させることによる、インビトロウイルスディスプレイ法等が挙げられる。
　特定の抗原を認識する抗体は、公知の方法を用いて選別することができる。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光法（ＥＣＬ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した方法などが挙げられる。
　本発明の第一の態様によれば、第一の抗原を認識する複数の抗体を含む第一のライブラリを製造する工程（１）は、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第一の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第一のライブラリを製造する工程であり、第二の抗原を認識する複数の抗体を含む第二のライブラリを製造する工程（２）は、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第二の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第二のライブラリを製造する工程である。その後、前記の第一のライブラリ、および前記の第二のライブラリの中から、共通のＬ鎖を有する、第一の抗原を認識する抗体と、第二の抗原を認識する抗体とを選別することによって、共通のＬ鎖を同定することができる。本発明の第一の態様を図１に示す。抗原Ａ（第一の抗原）および抗原Ｂ（第二の抗原）に対して抗体ライブラリからファージディスプレイ法でスクリーニングする。スクリーニングを実施すると、各抗原に対して結合性をもつ複数のクローンが得られる。得られた抗抗原Ａ抗体群、抗抗原Ｂ抗体群からＬ鎖が共通するクローンを選び出す。
　本発明の第一の態様において、のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリは、１０９種以上の抗体を含むことが好ましく、２×１０９種以上の抗体を含むことがより好ましく、５×１０９種以上の抗体を含むことがさらに好ましい。
　Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＨ鎖の種類は１０６以上であることが好ましく、２×１０６以上であることがより好ましく、５××１０６以上であることがさらに好ましい。
　Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＬ鎖の種類が１０３以下であることが好ましく、７００以下であることがより好ましく、５００以下であることがさらに好ましい。
　また、前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＨ鎖の種類とＬ鎖の種類の比率が、１０００倍以上であることが好ましく、５０００倍以上であることがより好ましく、１００００倍以上であることがさらに好ましい。
　上記のように、L鎖の種類が限定されているライブラリを使用することにより、抗原Ａ（第一の抗原）および抗原Ｂ（第二の抗原）にも反応するＬ鎖が得られる可能性が高くなる。
　本発明の第二の態様によれば、前記工程（１）が、
（１－Ａ）第一の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第一の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
（１－Ｂ）前記工程（１－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第一の抗原を認識する抗体を選別する工程、
を含み、
前記工程（２）が、
（２－Ａ）第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
（２－Ｂ）前記工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第二の抗原を認識する抗体を選別する工程、
を含む。本発明の第二の態様を図２に示す。第二の態様においては、抗抗原Ａ抗体のH鎖部分を、L鎖ライブラリに導入する。同じように、抗抗原Ｂ抗体のH鎖部分を、L鎖ライブラリに導入する。抗原Ａ（第一の抗原）および抗原Ｂ（第二の抗原）に対してそれぞれの抗体ライブラリからファージディスプレイ法でスクリーニングする。スクリーニングを実施すると、各抗原に対して結合性をもつ複数のクローンが得られる。得られた抗抗原Ａ抗体群、抗抗原Ｂ抗体群からＬ鎖が共通するクローンを選び出す。
　本発明の第二の態様において、工程（１－Ａ）で得た抗体ライブラリおよび工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリにおけるＬ鎖の種類がそれぞれ１０３以下であることが好ましく、７００以下であることがより好ましく、５００以下であることがさらに好ましい。
　本発明の第三の態様によれば、
前記工程（１）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第一の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第一のライブラリを製造する工程であり、
前記工程（２）が、
（２－Ａ）第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
（２－Ｂ）前記工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第二の抗原を認識する抗体を選別する工程、
を含む。本発明の第三の態様を図３に示す。
　本発明において使用するＬ鎖（軽鎖）のライブラリの作製方法は特に限定されない。
　ヒト抗体の生殖系列遺伝子は『ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ　ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭ（ＩＭＧＴ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）』において公開されており、軽鎖可変領域のサブグループを確認したところ、カッパ鎖では機能的クラスターとしてＩＧＫＶは３５－４０種類（内訳ＩＧＫＶ１：１７（＋２）種、ＩＧＫＶ２：９（＋１）種、ＩＧＫＶ３：５（＋２）種、ＩＧＫＶ４：１種、ＩＧＫＶ５：５種、ＩＧＫＶ６：２種、ＩＧＫＶ７：―種）であり、ラムダ鎖ではＩＧＬＶは２９－３０種（内訳ＩＧＬＶ１：５種、ＩＧＬＶ２：５種、ＩＧＬＶ３：８種。ＩＧＬＶ４：３種。ＩＧＬＶ５：３－４種、ＩＧＬＶ６：１種、ＩＧＬＶ７：１種、ＩＧＬＶ８：１種類、ＩＧＬＶ９：１種、ＩＧＬＶ１０：１種、ＩＧＬＶ１１：―種）である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６４，２２０－２３２（１９９６）、Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，７，２５０－２６１（１９９７））。
　上記を参照して、カッパ鎖基本生殖系列アミノ酸配列として後記の表１（配列番号１～３９）の配列を設計し、ラムダ鎖基本生殖系列アミノ酸配列として後記の表２（配列番号４０～７０）を設計することができる。上記したカッパ鎖基本生殖系列アミノ酸配列およびラムダ鎖基本生殖系列アミノ酸配列に含まれる配列はＶ領域であり、Ｊ領域およびＣＬ領域は含まれていないので、軽鎖J領域はヒトJ遺伝子配列の配列（表３および４に記載の配列番号７１～８３）を参考に、また軽鎖定常領域はＣＬ遺伝子配列を参考に軽鎖可変部領域に付与することができる（配列番号８４、８５）。
　さらに、上記した軽鎖基本配列に多様性を持たせるために、ファミリー遺伝子のサブグループの割合をヒト生体内の存在割合に合わせ、さらにフレーム領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、や相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に人為的に変異や付加配列を挿入することができる。具体的にはカッパ鎖、ラムダ鎖の遺伝子ファミリーの生体内割合は先行研究など（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　ＡＤ，　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）、Ｐｒａｂａｋａｒａｎ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．（２０１２）など）を参考にして各サブグループの存在割合を決定することができる。例えば、カッパ鎖（ＩＧＫＶ１－ＩＧＫＶ６）のうち、ライブラリに占めるそれぞれのサブグループの割合はおおよそＩＧＫＶ１：３６％、ＩＧＫＶ２：１１％、ＩＧＫＶ３：３５％、ＩＧＫＶ４：１１％、ＩＧＫＶ５：４％、ＩＧＫＶ６：３％とし、ラムダ鎖（ＩＧＬＶ１―IＧＬＶ１０）のうち、ライブラリに占めるそれぞれのサブグループの割合はＩＧＬＶ１：４０％、ＩＧＬＶ２：１６％、ＩＧＬＶ３：２１％、ＩＧＬＶ４：３％、ＩＧＬＶ５：６％、ＩＧＬＶ６：６％、ＩＧＬＶ７：２％、ＩＧＬＶ８：２％、ＩＧＬＶ９：２％、ＩＧＬＶ１０：２％ とすることができる。抗原認識に最も関与すると考えられているＣＤＲ３に関しては長さをカッパ鎖で７から１１アミノ酸の幅で平均９．２アミノ酸とし、ラムダ鎖では８から１２アミノ酸の幅で平均１０．４アミノ酸とすることができる。疎水性を示す指標であるＧＲＡＶＹ ｉｎｄｅｘ（Ｇｒａｎｄ　Ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ．　Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）はカッパ鎖で平均－１．００、ラムダ鎖で平均－０．３８とすることができる。さらにＣＤＲ３に含まれる非極性アミノ酸（Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｙ）の数は、カッパ鎖で平均３．９、ラムダ鎖で平均４．７として設計することができる。
　上記の通り、本発明において使用するＬ鎖（軽鎖）のライブラリとしては、ナイーブレパートリーを反映していること、L鎖遺伝子ファミリーは生体内の構成比率にしていること、および人為的な変異が挿入されていること、という特徴を有するものを使用することが好ましい。
　本発明によれば、
本発明の方法によりＬ鎖を同定する工程、および
前記で同定されたＬ鎖と、第一の抗原を認識するＨ鎖と、第二の抗原を認識するＨ鎖とを用いて多重特異性抗体を製造する工程、
を含む、多重特異性抗体の製造方法が提供される。
　本発明においては、共通Ｌ鎖を使って多重特異性抗体を作製することから、Ｌ鎖とＨ鎖の組み合わせが少なくなり、多重特異性抗体の発現および精製が容易になる。
　Ｌ鎖と、第一の抗原を認識するＨ鎖と、第二の抗原を認識するＨ鎖とを用いて多重特異性抗体を製造する工程は、Ｌ鎖と、第一の抗原を認識するＨ鎖と、第二の抗原を認識するＨ鎖とをそれぞれコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製により抗体を取得することができる。二重特異性抗体のように２対の異なるH鎖－L鎖対（第一の抗原を認識するH鎖－L鎖対と、第二の抗原を認識するH鎖－L鎖対）をそれぞれ含む二重特異性抗体の作製は、第一の抗原を認識するH鎖－L鎖の同種２対からなる抗体と、第二の抗原を認識するH鎖－L鎖対の同種２対からなる抗体とを区別して精製する必要がある。共通L鎖を用いていても区別して精製することには変わりがないが先行研究（'Knobs-into-holes'　Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21.）などにより効率的に二重特異性抗体を作製する技術が確立されている。これらのことから'Knobs-into-holes'技術と共通L鎖を使用した抗体の設計を組み合わせることにより発現・精製効率を上げることが出来る。
　発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。
　好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
　抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
　以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (－)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１６０, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９９(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
　形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液より抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
＜抗体の一例＞
　本発明によれば、後記の実施例において取得されたCD3ε抗体が提供される。即ち、本発明によれば、配列番号９７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号９９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体が提供される。また、本発明によれば、配列番号９７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号９８のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む抗体が提供される。
配列番号９７：CD3ε抗体＿００３９重鎖可変領域
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREMSNWDDAFDIWGQGTMVTVSR
配列番号９８：CD3ε抗体＿００３９軽鎖
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
CD3軽鎖可変領域配列追加
配列番号９９：CD3ε抗体＿００３９軽鎖可変領域
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLG
　以下の実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜軽鎖ライブラリの作製＞
（１）軽鎖の設計
　ヒト抗体の生殖系列遺伝子は『ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ　ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭ（ＩＭＧＴ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）』において公開されており、軽鎖可変領域のサブグループを確認したところ、
　カッパ鎖では機能的クラスターとしてＩＧＫＶは３５－４０種類（内訳ＩＧＫＶ１：１７（＋２）種、ＩＧＫＶ２：９（＋１）種、ＩＧＫＶ３：５（＋２）種、ＩＧＫＶ４：１種、ＩＧＫＶ５：５種、ＩＧＫＶ６：２種、ＩＧＫＶ７：―種）であり、ラムダ鎖ではＩＧＬＶは２９－３０種（内訳ＩＧＬＶ１：５種、ＩＧＬＶ２：５種、ＩＧＬＶ３：８種。ＩＧＬＶ４：３種。ＩＧＬＶ５：３－４種、ＩＧＬＶ６：１種、ＩＧＬＶ７：１種、ＩＧＬＶ８：１種類、ＩＧＬＶ９：１種、ＩＧＬＶ１０：１種、ＩＧＬＶ１１：―種）であった（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｓ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２６４，　２２０－２３２　（１９９６）、Ｋａｗａｓａｋｉ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　７，　２５０－２６1　（１９９７））。
　そこでこれを参照して基本となる生殖系列遺伝子を設定した。（表１及び表２）

　この基本となるアミノ酸配列に含まれる配列はＶ領域であり、Ｊ領域およびＣＬ領域は含まれていない。そこで軽鎖J領域はヒトJ遺伝子配列の配列（表３および４）を参考に、また軽鎖定常領域はＣＬ遺伝子配列を参考に軽鎖可変部領域に付与した（配列番号８４、８５）。
配列番号８４
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号８５
QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
　上述の軽鎖基本配列に多様性を持たせるために、ファミリー遺伝子のサブグループの割合をヒト生体内の存在割合に合わせ、さらにフレーム領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、や相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に人為的に変異や付加配列を挿入した。具体的にはカッパ鎖、ラムダ鎖の遺伝子ファミリーの生体内割合は先行研究など（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　ＡＤ，　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）、Ｐｒａｂａｋａｒａｎ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．（２０１２）など）を参考にして各サブグループの存在割合を決定した。すなわち、カッパ鎖（ＩＧＫＶ１－ＩＧＫＶ６）のうち、ライブラリに占めるそれぞれのサブグループの割合はおおよそＩＧＫＶ１：３６％、ＩＧＫＶ２：１１％、ＩＧＫＶ３：３５％、ＩＧＫＶ４：１１％、ＩＧＫＶ５：４％、ＩＧＫＶ６：３％とし、ラムダ鎖（ＩＧＬＶ１―IＧＬＶ１０）のうち、ライブラリに占めるそれぞれのサブグループの割合はＩＧＬＶ１：４０％、ＩＧＬＶ２：１６％、ＩＧＬＶ３：２１％、ＩＧＬＶ４：３％、ＩＧＬＶ５：６％、ＩＧＬＶ６：６％、ＩＧＬＶ７：２％、ＩＧＬＶ８：２％、ＩＧＬＶ９：２％、ＩＧＬＶ１０：２％ とした。抗原認識に最も関与すると考えられているＣＤＲ３に関しては長さをカッパ鎖で７から１１アミノ酸の幅で平均９．２アミノ酸とし、ラムダ鎖では８から１２アミノ酸の幅で平均１０．４アミノ酸とした。疎水性を示す指標であるＧＲＡＶＹ ｉｎｄｅｘ（Ｇｒａｎｄ　Ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ．　Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）はカッパ鎖で平均－１．００、ラムダ鎖で平均－０．３８とした。さらにＣＤＲ３に含まれる非極性アミノ酸（Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｙ）の数は、カッパ鎖で平均３．９、ラムダ鎖で平均４．７として設計した。
＜参考文献＞
Lefranc, M.-P.; Lefranc, G. Immunoglobulins or Antibodies: IMGTTM Bridging Genes, Structures and Functions. Biomedicines 2020, 8, 319.
Prabakaran P, Chen W, Singarayan MG, Stewart CC, Streaker E, Feng Y, Dimitrov DS. Expressed antibody repertoires in human cord blood cells: 454 sequencing and IMGT/High　V-QUEST analysis of germline gene usage, junctional diversity, and somatic mutations. Immunogenetics. 2012 May;64(5):337-50.
Foster SJ, Brezinschek HP, Brezinschek RI, Lipsky PE. Molecular mechanisms and selective influences that shape the k gene repertoire of IgM+ B cells. J Clin Invest 1997;99:1614-27.
Farner NL, Dorner T, Lipsky PE. Molecular mechanisms and selection influence the generation of the human V lambda J lambda repertoire. J Immunol 1999;162:2137-45
Griffiths AD, et al. EMBO J. 1994;13(14):3245-3260.
（２）遺伝子合成
　前述したように軽鎖生殖系列遺伝子の配列を参考にして、軽鎖可変領域であるＶ領域、Ｊ領域ならびに軽鎖定常領域を含む遺伝子配列をカッパ鎖２００種類、ラムダ鎖２００種類を（１）に設定した割合で遺伝子合成を行った。その際、ベクターへの接合部位として末端に制限酵素ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを設計した。
（３）　ライブラリの構築
　ヒト抗体ライブラリを構築するために、ヒトＢ細胞が含まれる正常ヒト骨髄由来単核球細胞、正常ヒト末梢血由来単核球細胞、ヒト臍帯血などの試料を準備した。
ＲＮＡ抽出
　準備した細胞５～１０ｘ１０７ｃｅｌｌに対し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加して細胞を破砕した後に４－Ｂｒｏｍｏａｎｉｓｏｌｅを５０μＬ添加した。インキュベートの後に遠心してＲＮＡを含む上層水層６００μLを回収し、７０%エタノールを添加した後にスピンカートリッジにサンプルを移した。このスピンカラムをＷａｓｈ　ＢｕｆｆｅｒＩ　３５０μＬ、Ｗａｓｈ　ＢｕｆｆｅｒＩＩ　５００μＬで洗浄してＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒを１００μL添加して溶出した。
ｃＤＮＡ合成
　ＲＮＡ ５μL分をエタノール沈殿し、ＲＮＡ沈殿物を予め混合しておいた溶液（５０μM　Ｏｒｉｇｏ　ｄ（Ｔ）２０　ｐｒｉｍｅｒ　１μＬ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　１μＬ、ＤＥＰＣ―ｗａｔｅｒ　１１μＬ）にて懸濁する。その後予め調製したおいた溶液（５ＸＳＳＩＶ　ＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ、１００ｍＭ　ＤＴＴ　１μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｒｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１μＬ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００Ｕ／μＬ）１μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加えて５０℃１０分、８０℃１０分反応させた。反応後ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｃｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、ｃＤＮＡの溶出は１００μＬとした。
重鎖断片の増幅
　上記で作成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。テンプレートｃＤＮＡは１５ng使用し、ポリメラーゼはＱ５（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。プライマーには重鎖可変領域を特異的に増幅させるフォワード側：ＶＨ１―ＶＨ７の７種と、リバース側：ＪＨ１―２、３、４―５、６の６ファミリーを含む４種をそれぞれ終濃度０．５μM用いた。（Ｍａｒｋｓ　ＪＤ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２，５８１－５９７、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２９，１９３－２０3.）
VH1　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG（配列番号８６）
VH2　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC（配列番号８７）
VH3　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG（配列番号８８）
VH4　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG （配列番号８９）
VH4-2　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG（配列番号９０）
VH6　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG（配列番号９１）
VH7　GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT（配列番号９２）
ヒト重鎖J領域プライマー
JH1-2　GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC（配列番号９３）
JH3　　GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC（配列番号９４）
JH4-5　GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC（配列番号９５）
JH6　　GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC（配列番号９６）
　９４℃３０秒、６５℃３０秒、７４℃２分の反応を３０サイクル実施し、増幅されたＤＮＡ断片を回収した。このようにしてRNA抽出からｃDNA合成、重鎖断片の増幅までの一連の操作を繰り返し、用意した免疫細胞約５～１０ｘ１０７細胞から抗体断片を調製した。
重鎖ライブラリの構築
　増幅したＤＮＡ断片をファージディスプレイ用のベクター（ファージミドベクター）に組み込むことにより抗体ライブラリを構築した。ファージミドにはシグナル配列、重鎖抗体配列、リンカー配列、軽鎖抗体配列、Ｍ１３ファージｃｐ３タンパク質をコードするように設計し、大腸菌増幅の為の複製起点および薬剤選択用のアンピシリン耐性遺伝子で構成される。重鎖可変領域の断片をベクターに組み替えるため、ＰＣＲ増幅断片をＳｆｉ－ＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で処理し、一方ベクター側も同様に処理した。その後抗体断片とベクターをライゲーションし、以下のようにしてライゲーション産物を大腸菌に遺伝子導入することで形質転換株を得た。すなわちライゲーション産物をエタノール沈殿し、ＱＷで溶解。その内２μL分をＤＨ１２Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２０μLに懸濁し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）のバクテリア用プログラム（２５μＦ、２００Ω、１．８ｋV、キュベット幅０，１ｃｍ）に従いエレクトロポレーションを行った。その後ライゲーション産物全量を形質転換し、遺伝子導入された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｘYT培地で培養し、通夜培養の後に菌体を回収、プラスミドを精製した。
軽鎖抗体遺伝子の挿入
　上記で作製した重鎖抗体ライブラリに人工合成した軽鎖抗体を組み合わせて抗体ライブラリを作製した。先ず、合成した４００種類の軽鎖抗体断片をＮｃｏＩおよびＡｓｃＩ制限酵素で処理し、ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｃｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製した。また同様に重鎖抗体ライブラリもＮｃｏＩおよびＡｓｃＩ制限酵素で処理してアガロース電気泳動にてベクターサイスのDNA断片を切り出した。これをＧＥＬ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収し、エタノール沈殿にて精製後、ＱＷにて溶解した。その後軽鎖断片と重鎖抗体ライブラリを以下の条件でライゲーションした。すなわち軽鎖断片１５０μｇと重鎖ライブラリ１００μｇをＴ４　Ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）１０μＬで１５℃通夜反応させた。その後エタノール沈殿にて精製し、ＤＮＡをＱＷにて溶解した。
　ライゲーション産物の内２μL分をＤＨ１２Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２０μLに懸濁し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）のバクテリア用プログラム（２５μＦ、２００Ω、１．８ｋV、キュベット幅０，１ｃｍ）に従いエレクトロポレーションを行った。その後ライゲーション産物全量を形質転換し、遺伝子導入された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｘYT培地で培養した。形質転換体の数はエレクトロポレーション後の大腸菌を希釈して寒天培地に撒く事で換算され、上記方法によって１ｘ１０１０の形質転換体を得た。
（４）ファージ抗体ライブラリの調製
　形質転換した大腸菌を０．０５％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴＧＡ）２Ｌに希釈し、３０℃通夜培養した。その後５Ｌの２ｘＹＴＧＡに通夜培養した大腸菌を６２５ｍＬ加え、３７℃で培養し波長６００ｎｍにおける吸光度を測定しながら、吸光度が1.0になるまで増殖させた。培養液にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ液（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）をフラスコ当たりＭＯＩ：１０を加えて感染させ、３７℃、２時間培養した。その後全量で１２Ｌになるように培養液に２ｘＹＴＧＡを添加し、再度３０℃通夜培養を行った。翌日培養液を８０００ｒｐｍ１０分遠心し、回収した培養上清に１／６量の20％ のポリエチレングリコール／ ２．５Ｍ　ＮａＣｌを加えて攪拌した。その後８０００ｒｐｍ２０分遠心して沈殿をＰＢＳにて懸濁し、これをファージ溶液とした。
＜ＣＤ３に対する抗体の作製＞
（１）ＣＤ３抗原の作製
　ヒトＣＤ３εのアミノ酸情報（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　アセッション番号　ＮＰ＿０００７２４）より１２６アミノ酸（アミノ酸残基１－１２６番目）をコードする遺伝子とそれに続く８ｘＨｉｓタグをコードする遺伝子を設計し、人工的に合成を行った。この合成遺伝子は制限酵素を利用してｐＣＸＮ３ベクターに挿入し、ヒトＣＤ３ε発現ベクターを作製した。発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ－２９３Ｆ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に一過性トランスフェクションしてその後１週間の振盪培養をした。ここから回収した培養上清をサンプルとしＨｉｓ－Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通すことにより精製し、細胞外ドメインＣＤ３ε－Ｈｉｓタンパク質を作製した。
（２）　細胞外ドメインＣＤ３εに対する抗体のスクリーニング
　ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン精製タンパク質を用いてファージ抗体ライブラリからスクリーニングを行った。ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬになるように抗原を調製し、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ （ＮＵＮC社）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で通夜静置した。その後、抗原液を捨て、ブロッキング液（２．５％  スキムミルク／  ＰＢＳ）２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、室温で２時間ブロッキングを行った。
　次にブロッキング液を除いたＩｍｍｕｎｏＭｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐに２．５％ スキムミルク／ＰＢＳで調製した１×１０１３のファージ抗体を添加し、２時間室温で反応させた。反応終了後、ＰＢＳにて１０回洗浄し、０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を１００μＬ／ｗｅｌｌに添加してファージを回収した。回収したファージはＯＤ０．５の大腸菌ＤＨ１２Ｓ ２０ｍＬに１時間感染させその一部をアンピシリンＬＢＧプレートに蒔いて回収されたファージのタイターを算出した。ファージ感染大腸菌は１００ｍＬの２ｘＹＴＧＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，１％  ｇｌｕｃｏｓｅ）にて３０℃で通夜培養した。この通夜培養１０ｍＬを２ｘＹＴＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）１００ｍＬと混ぜ、３７℃にて１．５時間培養後ヘルパーファージＫＯ７を１ｘ１０11入れ、３７℃にて１時間培養したのち、４００ｍＬの２ｘＹＴＧＡＫ（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，０．０５％  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ５０μｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を入れて３０℃にて通夜培養した。これを８０００ｒｐｍにて１０分間遠心して上清５００ｍＬを調製、それに１００ｍＬのＰＥＧ液（２０％ ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ６０００，２．５Ｍ ＮａＣｌ）を混ぜてよくかきまぜたのち、８０００ｒｐｍ１０分間の遠心を行うことでファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これを１ｓｔスクリーニングのファージとした。
　次に再度ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン精製タンパク質を用いて２ｎｄスクリーニングを行った。１ｓｔスクリーニングと同様に抗原をＩｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐに固相し、４℃通夜静置の後に抗原液を捨ててブロッキング液（２．５％  スキムミルク／  ＰＢＳ）２００μＬ／ｗｅｌｌにて室温で２時間ブロッキングを行った。その後ブロッキング液を除いたＩｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐに２．５％ スキムミルク／ＰＢＳで調製した１×１０１１の１ｓｔスクリーニングファージ抗体液を添加し、２時間室温で反応させた。反応終了後、ＰＢＳにて２０回洗浄し、０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を１００μＬ／ｗｅｌｌに添加してファージを回収した。回収したファージはＯＤ０．５の大腸菌ＤＨ１２Ｓ １０ｍＬに１時間感染させその一部をアンピシリンＬＢＧプレートに蒔いて回収されたファージのタイターを算出した。ファージ感染大腸菌は５０ｍＬの２ｘＹＴＧＡ培地（２ｘＹＴ，１００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，１％  ｇｌｕｃｏｓｅ）にて３０℃で通夜培養した。この通夜培養５ｍＬを２ｘＹＴＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０ｍＬと混ぜ、３７℃にて１．５時間培養後ヘルパーファージＫＯ７を１ｘ１０９入れ、３７℃にて１時間培養したのち、２００ｍＬの２ｘＹＴＧＡＫ（２ｘＹＴ，１００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，０．０５％  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ５０μｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を入れて３０℃にて通夜培養した。これを８０００ｒｐｍにて１０分間遠心して上清２５０ｍＬを調製、それに５０ｍＬのＰＥＧ液（２０％ ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ６０００，２．５Ｍ ＮａＣｌ）を混ぜてよくかきまぜたのち、８０００ｒｐｍ１０分間の遠心を行うことでファージを沈殿させた。これを５０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これを２ｎｄスクリーニングのファージとした。
　次に３ｒｄスクリーニングでは２ｎｄスクリーニングと同様に抗原を固相し、２ｎｄスクリーニングファージ液を１ｘ１０１０使用して一連の操作を繰り返した。
（３）　陽性クローンの同定
　陽性クローンの同定はヒトＣＤ３ε細胞外ドメインタンパク質を用いたＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、抗原をＰＢＳで１０μｇ / ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ（ＮＵＮＣ社）に１００μＬ／ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、抗原液を捨て、ブロッキング液（２．５％  スキムミルク／ＰＢＳ）  ２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記３ｒｄスクリーニングより調製したモノクローナル培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ／ｍＬ  Ｍｏｅｓｅ  ａｎｔｉ－ｃｐ３抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＭＢＬ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ  ｉｎ  ０．１Ｍクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ2Ｏ2  を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ2ＳＯ4を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果からヒトＣＤ３抗原タンパク質に陽性反応を示す抗体クローンを選別し、そのＤＮＡ配列を解析して６種類の抗体クローンのアミノ酸配列を同定した。
＜ＣＤ７３に対する抗体の作製＞
（１）ＣＤ７３抗原の作製
　ヒトＣＤ７３のアミノ酸情報（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　アセッション番号　ＡＡＨ６５９３７）より５４７アミノ酸（アミノ酸残基１－５４７番目）をコードする遺伝子とそれに続く８ｘＨｉｓタグをコードする遺伝子を設計し、人工的に合成を行った。この合成遺伝子は制限酵素を利用してｐＣＸＮ３ベクターに挿入し、ヒトＣＤ７３発現ベクターを作製した。発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ－２９３Ｆ細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に一過性トランスフェクションしてその後１週間の振盪培養をした。ここから回収した培養上清をサンプルとしＨｉｓ－Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通すことにより精製し、ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質を作製した。
（２）ＣＤ７３に対する抗体のスクリーニング
　ヒトＣＤ７３抗原タンパク質を使用してファージ抗体ライブラリからスクリーニングを行った。操作はＣＤ３に対するスクリーニングと同様に行い、３ｒｄスクリーニングまで繰り返し行った。
（３）陽性クローンの同定
　陽性クローンの同定はＣＤ３抗原に反応するＥＬＩＳＡと同様に行った。ＣＤ７３抗原をＰＢＳで１０μｇ / ｍＬに調製し、１００μＬ / ｗｅｌｌを固相してＣＤ７３スクリーニングの３ｒｄより調製したモノクローナル培養上清のＥＬＩＳＡ反応性を確認した。その結果陽性クローンは配列を解析して抗体クローンのアミノ酸配列を複数同定した。
＜ＡＸＬに対する抗体の作製＞
（１）　ＡＸＬ抗原の作製
　ヒトＡＸＬのアミノ酸情報（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　アセッション番号　ＡＡＨ３２２２９）より細胞外ドメイン４５１アミノ酸（アミノ酸残基１－４５１番目）をコードする遺伝子とそれに続く８ｘＨｉｓタグをコードする遺伝子を設計し、人工的に合成を行った。この合成遺伝子は制限酵素を利用してｐＣＸＮ３ベクターに挿入し、ヒトＡＸＬ発現ベクターを作製した。発現および精製はＣＤ３抗原、ＣＤ７３抗原と同様に行い、ＡＸＬ－Ｈｉｓタンパク質を作製した。
（２）　ＡＸＬに対する抗体のスクリーニング
　ヒトＡＸＬ細胞外ドメインタンパク質に対する抗体のスクリーニングはＣＤ３抗原タンパク質やＣＤ７３抗原タンパク質のスクリーニングと同様に行い、ヒトＡＸＬに反応する抗体クローンのアミノ酸配列を複数同定した。
＜共通軽鎖配列の同定＞
（１）抗体配列の比較
　ヒトＣＤ３ε細胞外ドメインタンパク質に反応する抗体クローンと、ヒトＣＤ７３タンパク質に反応する抗体クローンの中で相互に同じ配列の軽鎖が存在しているかを確認した。
その結果軽鎖のアミノ酸配列が完全に一致した抗体クローンが１種類見つかった（図４）。
　さらにＣＤ３ε細胞外ドメインタンパク質に反応する抗体クローンと、ヒトＡＸＬタンパク質に反応する抗体クローンの中で共通した軽鎖を持つクローンが存在しているかを確認した結果、２クローンが抗ＣＤ３ε抗体と一致することが判明した（図５）。
配列番号９７：CD3ε抗体＿００３９重鎖可変領域
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREMSNWDDAFDIWGQGTMVTVSR
配列番号９８：CD3ε抗体＿００３９軽鎖
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
CD3軽鎖可変領域配列追加
配列番号９９：CD3ε抗体＿００３９軽鎖可変領域
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLG
配列番号１００：CD73抗体＿３００１重鎖可変領域
QVQLVQSGAEMKKPGESLRISCQGSGYSFTSYWISWVRQTPGKGLEWMGRIDPSDSYTNYSPSLQGHVTISADKSTSTAYLQWNSLKASDSGIYYCARLSRYFYGMDVWGRGTTVTVSR
配列番号１０１：CD73抗体＿３００１軽鎖
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号１０２：AXL抗体＿２０７９重鎖可変領域
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGAHTELLLSVGAFDIWGQGTMVTVSR
配列番号１０３：AXL抗体＿２０７９軽鎖
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号１０４：AXL抗体＿２０８５重鎖可変領域
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFRFDDYGMHWVRLAPGKGLEWVSTITWNGAYTAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTALYYCAKDGPEISSAGIDSWGQGTLVTVSR
配列番号１０５：　AXL抗体＿２０８５軽鎖
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
＜外来由来重鎖と軽鎖ライブラリのシャッフリング＞
（１）重鎖固定抗体ライブラリの作製（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）
　抗体医薬品として上市されているEGFR抗体CetuximabおよびPanitumumabの配列情報から重鎖配列を特定し、これを外来の重鎖として抗体軽鎖ライブラリとの組み合わせにより新規の軽鎖を探索する。本発明の第二の態様では抗体ライブラリに由来しない重鎖であっても、軽鎖をコードする核酸ライブラリに組み込むことにより、挿入した重鎖と最適な組み合わせを持つL鎖であれば、結合活性を損なわずに機能する抗体を選定することができる。具体的には医薬品の承認申請のためのCTD(Common Technical Document)に記載の抗体アミノ酸配列から重鎖可変領域を特定し、その後にアミノ酸と対応する核酸として人工合成を実施した。この重鎖可変領域配列を、軽鎖をコードする核酸が含まれるライブラリに挿入し、重鎖としてCetuximabの可変領域に固定した軽鎖ライブラリが完成した。
　さらに具体的にはCTDより117アミノ酸（配列番号１０６）を入手し、人工合成したDNA断片を制限酵素処理により、L鎖ライブラリを含むベクターにライゲーションした。すなわち、重鎖断片５μgとベクター５μgをＴ４　Ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）２μＬ１５℃４時間反応させた。その後エタノール沈殿にて精製し、プラスミドＤＮＡはＱＷに溶解した。
配列番号１０６：Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　重鎖可変領域
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVSS
　その後ライゲーション産物の遺伝子導入およびファージ抗体ライブラリの調製は上記実施例に記載されている内容に準じて実施し、ファージ溶液を調製した。
（２）抗体スクリーニング（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）
　作製したCetuximabの重鎖に固定した軽鎖ライブラリからＥＧＦＲタンパク質に反応するクローンを選別するために、スクリーニング操作を実施した。具体的にはリコンビナントタンパク質（GenScript社）をＰＢＳで２０μｇ／ｍＬになるように抗原を調製し、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ （ＮＵＮC社）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で通夜静置した。その後、抗原液を捨て、ブロッキング液（２．５％  スキムミルク／  ＰＢＳ）２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、室温で２時間ブロッキングを行った。次にブロッキング液を除いたＩｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐに２．５％ スキムミルク／ＰＢＳで調製した１×１０１０のファージ抗体を添加し、２時間室温で反応させた。反応終了後、ＰＢＳにて１０回洗浄し、０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を１００μＬ／ｗｅｌｌに添加してファージを回収した。回収したファージはＯＤ０．５の大腸菌ＤＨ１２Ｓ ２０ｍＬに１時間感染させその一部をアンピシリンＬＢＧプレートに蒔いて回収されたファージのタイターを算出した。ファージ感染大腸菌は１００ｍＬの２ｘＹＴＧＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，１％  ｇｌｕｃｏｓｅ）にて３０℃で通夜培養した。この通夜培養１０ｍＬを２ｘＹＴＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）１００ｍＬと混ぜ、３７℃にて１．５時間培養後ヘルパーファージＫＯ７を１ｘ１０11入れ、３７℃にて１時間培養したのち、４００ｍＬの２ｘＹＴＧＡＫ（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，０．０５％  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ５０μｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を入れて３０℃にて通夜培養した。これを８０００ｒｐｍにて１０分間遠心して上清５００ｍＬを調製、それに１００ｍＬのＰＥＧ液（２０％ ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ６０００，２．５Ｍ ＮａＣｌ）を混ぜてよくかきまぜたのち、８０００ｒｐｍ１０分間の遠心を行うことでファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これを１ｓｔスクリーニングのファージとした。
　同様に２ｎｄスクリーニングでは１ｓｔスクリーニングと同様に抗原を固相し、１ｓｔスクリーニングファージ液を１ｘ１０９使用し、また洗浄操作を１５回に変更して一連の操作を繰り返した。さらに３ｒｄスクリーニングではこれまでと同様に抗原を固相し、２ｎｄスクリーニングファージ液を１ｘ１０９使用し、洗浄操作を２５回に変更してスクリーニング操作を実施した。
（３）陽性クローンの同定（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）
陽性クローンの同定はヒトEGFR細胞外ドメインタンパク質を用いたＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、抗原をＰＢＳで１０μｇ / ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ（ＮＵＮＣ社）に１００μＬ／ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、抗原液を捨て、ブロッキング液（２．５％  スキムミルク／ＰＢＳ）  ２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記３ｒｄスクリーニングより調製したモノクローナル培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ／ｍＬ  Ｍｏｅｓｅ  ａｎｔｉ－ｃｐ３抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＭＢＬ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ  ｉｎ  ０．１Ｍクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ2Ｏ2  を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ2ＳＯ4を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果からヒトEGFR抗原タンパク質に陽性反応を示すファージクローンを選別し、ＥＬＩＳＡ反応のシグナル強度から上位４クローンのＤＮＡ配列を解析した。４種類の内、上位１クローンと残り３クローンに分類され最終的に２種類の抗体クローンのアミノ酸配列が同定された。以上の結果からＣｅｔｕｘｉｍａｂ由来の重鎖をもち、軽鎖ライブラリから選択された新規の配列を組み合わせた場合においてもＥＧＦＲタンパク質への反応性を保持したクローンが得られることが判明した。（図６）また１クローンはコントロールとして使用したscFv型Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと比較してシグナル強度が高いことも確認された。
（４）Ｌ鎖配列の特定（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）
　ＥＬＩＳＡによって確認された軽鎖配列は以下に示す。
配列番号１０７：Ｃｅ００７軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSGFLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSNRATGIPARFSGSGSGADFTLTISSLESEDLAVYYCQQRSAWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１０８：Ｃｅ０１６軽鎖
ETTLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGKEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（５）重鎖固定ライブラリの作製（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）
　上記（１）に記載の方法に準じてＣＴＤよりＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂの配列を入手し、重鎖可変領域の配列を合成した。
配列番号１０９：Ｐａｍｉｎｔｕｍｕｍａｂ　重鎖可変領域
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS
また上記方法に準じてＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂの重鎖に固定した軽鎖ライブラリを作製した。
（６）抗体スクリーニング（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）
　上記（２）に記載の方法に準じてＥＧＦＲタンパク質に対してスクリーニングを実施した。
（７）陽性クローンの同定（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）
　上記（３）に準じて３ｒｄスクリーニングが終了した段階でモノクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡにて陽性クローンを同定した。（図７）その結果３６クローン中、多くのクローンで陽性判定が得られたため、上位８クローンについてＤＮＡ配列を解析した。
（８）Ｌ鎖配列の特定（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）
　配列解析の結果、上位８クローンは２種類の配列に分類されることが判明した。
配列番号１１０：Pa００６軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISRYLNWYQQKPGKAPELLIYDASDLETGVPSRFSGSGSGTGFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDTLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１１１：Pa００７軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＜二重特異性抗体の単離＞
　ＥＧＦＲタンパク質に結合する抗体と対になる抗体としてトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する抗体を作製する。すなわち、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ由来の重鎖と軽鎖ライブラリ由来の軽鎖の組み合わせと対になるように、重鎖ライブラリ由来の抗ＴｆＲ抗体と上記Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの重鎖との組み合わせで見つけた軽鎖を共通軽鎖として、ＴｆＲに対して結合活性を有する重鎖を探索する。
（１）ＴｆＲタンパク質の作製
　ヒトＴｆＲのアミノ酸情報（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　アセッション番号　NP_003225.2）よりアミノ酸残基89から760番目をコードする遺伝子とそれに続くＨｉｓタグをコードする遺伝子を設計し、人工的に合成を行った。この合成遺伝子は制限酵素を利用してｐＣＸＮ３ベクターに挿入し、ヒトＴｆＲ発現ベクターを作製した。発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ－２９３Ｆ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に一過性トランスフェクションしてその後１週間の振盪培養をした。ここから回収した培養上清をサンプルとしＨｉｓ－Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通すことにより精製し、細胞外ドメインＴｆＲ－Ｈｉｓタンパク質を作製した。
（２）ＴｆＲタンパク質に対する抗体スクリーニング
　ＥＧＦＲタンパク質に対するスクリーニングに記載した方法に準じてＴｆＲタンパク質に対するスクリーニングを実施した。すなわち、上記の「（４）ファージ抗体ライブラリの調製」で作製した抗体ライブラリを使用してＴｆＲタンパク質に対するスクリーニングを３ラウンド実施後にＴｆＲに対するクローンを複数同定した。
（３）共通する軽鎖の同定
　ＴｆＲタンパク質に反応する抗体クローン集団の中からＣｅｔｕｘｉｍａｂの重鎖と新たに組み合わさった軽鎖と同一の配列を選出した。その結果、Ｃｅ０１６軽鎖配列とＴｆＲ６７２の軽鎖配列は完全に一致した。
配列番号１１２：ＴｆＲ６７２重鎖可変領域
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSDYAMQWVRQAPGKGLEYVAAISHEGGTTYYADSVKGRFIISRDNSENTVHLQMSGLRRDDTALYYCVQDRFYYGSQSETHNWGQGTLVTVSS
配列番号１１３：ＴｆＲ６７２軽鎖
ETTLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGKEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
　さらにＴｆＲタンパク質に反応する抗体集団の中からＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂの重鎖と新たに組み合わさった軽鎖と同一の配列を選出した。その結果、Ｐａ００７軽鎖配列をＴｆＲ４４３の軽鎖配列は完全に一致した。
配列番号１１４：ＴｆＲ４４３重鎖可変領域
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFATYGMHWVRQAPGQSLEWMGWINVGSGDTEYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRFEDTAVYYCARDNGRWGQGTLVTVSS
配列番号１１５：ＴｆＲ４４３軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（４）反応性の確認
　ＴｆＲ６７２およびＴｆＲ４４３のＥＬＩＳＡ活性を測定した。具体的にはＴｆＲタンパク質を抗原とし、ＥＧＦＲタンパク質に対するＥＬＩＳＡと同様の方法にて実施した。
その結果、ＴｆＲ６７２とＴｆＲ４４３はＴｆＲタンパク質に対して結合活性を有することが確認された（図８）。
　すなわちＣｅｔｕｘｉｍａｂ重鎖とＣｅ０１６軽鎖をもつ抗体断片と、ＴｆＲ６７２重鎖とＴｆＲ６７２軽鎖（Ｃｅ０１６軽鎖と同一配列）をからなる抗体断片をもつ二つの抗体断片を組み合わせることで共通の軽鎖をもつ二重特異性抗体（ＥＧＦＲとＴｆＲを認識する）を作り出すことができる。
　同様にＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂ重鎖とＰａ００７をもつ抗体断片と、ＴｆＲ４４３重鎖とＴｆＲ４４３軽鎖（Ｐａ００７軽鎖と同一配列）からなる抗体断片をもつ二つの抗体断片を組み合わせることで共通の軽鎖をもつ二重特異性抗体（ＥＧＦＲとＴｆＲを認識する）を作り出すことができる。
（５）考察
　ＥＧＦＲタンパク質に対する抗体として上市されているＣｅｔｕｘｉｍａｂはマウス免疫によって取得され、遺伝子改変によってＦｃ部分をヒトＦｃに置き換えたキメラ抗体である。したがって可変部位はマウスの抗体遺伝子が残されている。一方で今回使用した軽鎖ライブラリはヒトのナイーブ配列を利用した構成になっている。本発明の実施例によればマウス抗体由来の重鎖可変領域にヒト抗体由来の軽鎖を組み合わせても反応性を喪失しない配列の組み合わせが発見できることが示唆され、二重特異性抗体の共通軽鎖創出に非常に大きな意味をもたらすと考えられる。
　さらにＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂは米国アムジェン社によってＸｅｎｏｍｏｕｓｅ技術を利用して作られた抗体であり、ヒト抗体遺伝子を挿入したヒト抗体産生マウスによって単離されている。近年完全ヒト抗体として上市されている医薬の多くはこうしたヒト抗体産生マウス由来であるとされている。このヒト抗体産生マウスに免疫して得られたＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂ重鎖に対してライブラリ由来の軽鎖に対しても共通の軽鎖が得られることも、ライブラリ由来の軽鎖が汎用性のある配列群を有していることが伺われる。ライブラリ由来以外の重鎖に対して複数の軽鎖が単離できるという事実は、ライブラリ以外の重鎖２種類を由来とする二重特異性抗体の作製に利用できることも可能と思われる。

Claims (11)

  1. （１）第一の抗原を認識する複数の抗体を含む第一のライブラリを製造する工程、
    （２）第二の抗原を認識する複数の抗体を含む第二のライブラリを製造する工程、および
    （３）前記の第一のライブラリ、および前記の第二のライブラリの中から、共通のＬ鎖を有する、第一の抗原を認識する抗体と、第二の抗原を認識する抗体とを選別する工程、
    を含む、多重特異性抗体の製造に使用するための共通のＬ鎖を同定する方法。
  2. 前記工程（１）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第一の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第一のライブラリを製造する工程であり、
    前記工程（２）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第二の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第二のライブラリを製造する工程である、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリが、１０９種以上の抗体を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＨ鎖の種類が１０６以上である、請求項２に記載の方法。
  5. 前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＬ鎖の種類が１０３以下である、請求項２に記載の方法。
  6. 前記のＨ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリにおけるＨ鎖の種類とＬ鎖の種類の比率が、１０００倍以上である、請求項２に記載の方法。
  7. 前記工程（１）が、
    （１－Ａ）第一の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第一の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
    （１－Ｂ）前記工程（１－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第一の抗原を認識する抗体を選別する工程、
    を含み、
    前記工程（２）が、
    （２－Ａ）第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
    （２－Ｂ）前記工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第二の抗原を認識する抗体を選別する工程、
    を含む、
    請求項１に記載の方法。
  8. 前記の工程（１－Ａ）で得た抗体ライブラリおよび工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリにおけるＬ鎖の種類がそれぞれ１０３以下である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記工程（１）が、Ｈ鎖とＬ鎖とを有する複数の抗体を含むライブラリの中から、第一の抗原を認識する複数の抗体を選別することによって第一のライブラリを製造する工程であり、
    前記工程（２）が、
    （２－Ａ）第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖をコードする核酸を、Ｌ鎖をコードする核酸のライブラリに組み込むことにより、第二の抗原を認識する抗体のＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体ライブラリを製造する工程、および
    （２－Ｂ）前記工程（２－Ａ）で得た抗体ライブラリの中から、第二の抗原を認識する抗体を選別する工程、
    を含む、
    請求項１に記載の方法。
  10. 第一の抗原および第二の抗原がそれぞれ、がん抗原、免疫細胞の抗原、生理活性分子、および酵素から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 請求項１から１０の何れか一項に記載の方法によりＬ鎖を同定する工程、および
    前記で同定されたＬ鎖と、第一の抗原を認識するＨ鎖と、第二の抗原を認識するＨ鎖とを用いて多重特異性抗体を製造する工程、
    を含む、多重特異性抗体の製造方法。

      
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065611A1 (ja) * 2003-01-21 2004-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の軽鎖スクリーニング方法
JP2022033762A (ja) * 2017-08-21 2022-03-02 アダジーン インコーポレイテッド ダイナミックヒト抗体軽鎖ライブラリー

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065611A1 (ja) * 2003-01-21 2004-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の軽鎖スクリーニング方法
JP2022033762A (ja) * 2017-08-21 2022-03-02 アダジーン インコーポレイテッド ダイナミックヒト抗体軽鎖ライブラリー

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MERCHANT, A. M. ET AL.: "An efficient route to human bispecific IgG", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, July 1998 (1998-07-01), pages 677 - 681, XP002141015, DOI: 10.1038/nbt0798-677 *

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