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HK1248137A1 - 用於治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素-10 - Google Patents

用於治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素-10 Download PDF

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HK1248137A1
HK1248137A1 HK18107795.2A HK18107795A HK1248137A1 HK 1248137 A1 HK1248137 A1 HK 1248137A1 HK 18107795 A HK18107795 A HK 18107795A HK 1248137 A1 HK1248137 A1 HK 1248137A1
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cells
agent
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peg
therapeutically effective
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John Brian MUMM
Ivan Ho CHAN
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阿尔莫生物科技股份有限公司
阿爾莫生物科技股份有限公司
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Description

用于治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素-10
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月28日提交的美国临时申请序列号62/167,699的优先权益，其通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及在肿瘤学和免疫相关疾病、病症和病状的治疗或预防中使用IL-10药剂调节免疫应答的方法。
引言
细胞因子白细胞介素-10(IL-10)是一种多效性细胞因子，通过对T细胞、B细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞(APC)的作用来调节多种免疫应答。IL-10可以通过抑制活化单核细胞和活化巨噬细胞中的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF和G-CSF的表达来阻遏免疫应答，并且还阻遏NK细胞产生IFN-γ。尽管IL-10主要在巨噬细胞中表达，但在活化T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中也已经检测到表达。IL-10除阻遏免疫应答外，还表现出免疫刺激性，包括刺激经IL-2和IL-4处理的胸腺细胞的增殖，增强B细胞的活力，及刺激MHC II类的表达。
人IL-10是在破坏两个单体亚基之间的非共价相互作用后变得无生物活性的同型二聚体。从公开的IL-10晶体结构获得的数据表明功能性二聚体与IFN-γ表现出某些相似性(Zdanov等，(1995)Structure(Lond)3:591-601)。
由于其多效性活性，已将IL-10与广泛的疾病、病症和病状(包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症、代谢病症和癌症)联系起来。用IL-10对许多此类疾病、病症和病状进行的临床和临床前评价已经巩固了其治疗潜力。而且，已经证实聚乙二醇化IL-10在某些治疗背景下比非聚乙二醇化IL-10更有效。
概述
本公开考虑使用IL-10药剂(例如聚乙二醇化IL-10)作为嵌合抗原受体-T细胞疗法(CAR-T细胞疗法)的组分。CAR代表癌症(例如治疗B和T细胞淋巴瘤)和其它恶性肿瘤的新兴疗法。CAR-T T细胞通常包含患者来源的记忆CD8+T细胞，其经修饰以表达对例如目标肿瘤上存在的已知抗原具有特异性的重组T细胞受体。虽然在使用CAR-T细胞疗法治疗癌症的上下文中一般性地描述了本公开，但是应该理解，此类疗法不限于此。
CAR-T T细胞疗法包括使用过继性细胞转移(ACT)，该过程利用患者自身培养的T细胞。在CAR-T细胞疗法中，将T细胞从患者体内取出并进行基因改变以表达针对已知癌症(例如肿瘤)的特异性抗原的CAR。离体扩增足够数量后，将自体细胞输注回患者体内，导致癌症的抗原特异性破坏。以这种方式，CAR-T T细胞疗法类似于血浆分离置换法，其中取自患者的血液以分离出一种特定组成部分的方式(例如在白细胞去除疗法过程中去除恶性白血细胞)进行处理，然后使其余部分返回到病人的循环中。
如下文所进一步讨论的，用CAR-T细胞疗法治疗已经部分受到以下限制：靶向表达靶抗原的正常组织的抗原特异性毒性的诱导，和导致威胁生命的细胞因子释放综合征的CAR-T细胞治疗的极高效力。具体而言，已经观察到高亲和力T细胞受体与显著抗原负荷的相互作用可导致活化诱导的细胞死亡。历史上，科学文献已在增强活化诱导的细胞死亡的背景下讨论了IL-10(Georgescu等(1997)J Clin Invest 100(10):2622-33)。然而，本文提供的数据表明IL-10药剂可以连同CAR-T T细胞疗法一起使用以预防或限制活化诱导的细胞死亡，同时增强CD8+T细胞功能和存活。
如下文所进一步讨论的，人IL-10是同型二聚体，且每个单体包含178个氨基酸，其中前18个氨基酸包含信号肽。本公开的特定实施方案包含缺乏信号肽的成熟人IL-10多肽(参见例如，美国专利第6,217,857号)或成熟人PEG-IL-10。在另外的特定实施方案中，IL-10药剂是成熟人IL-10的变体。该变体可以表现出比成熟人IL-10的活性低、与之相当或比成熟人IL-10活性高的活性；在某些实施方案中，所述活性与成熟人IL-10的活性相当或比成熟人IL-10的活性高。
本公开的某些实施方案考虑修饰IL-10以增强一种或多种性质(例如，药代动力学参数、功效等)。此类IL-10修饰包括聚乙二醇化、糖基化、白蛋白(例如、人血清白蛋白(HSA))缀合和融合以及羟乙基淀粉化。在特定实施方案中，IL-10经聚乙二醇化。在另外的实施方案中，IL-10的修饰不会对免疫原性产生治疗相关的有害作用，并且还有另外的实施方案中，经修饰的IL-10比未经修饰的IL-10免疫原性低。术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“药剂”等意在广泛地解释并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括其同系物、变体(包括突变蛋白)及片段，以及具有例如前导序列(例如信号肽)的IL-10多肽，以及前述的修饰形式。在另外的特定实施方案中，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“药剂”为激动剂。特定实施方案涉及聚乙二醇化IL-10，其在本文中也称为“PEG-IL-10”。本公开还考虑到编码前述物质的核酸分子，包含该核酸分子的载体等，以及表达IL-10药剂的细胞(例如，转化细胞和宿主细胞)。
本公开考虑了使用CAR-T细胞疗法和IL-10药剂调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法。一个特定实施方案考虑了一种调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括a)向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和b)向所述受试者施用足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂。在特定实施方案中，CAR包含特异性识别靶细胞群的抗原结合结构域。
在本公开的某些实施方案中，IL-10药剂增强活化记忆CD8+T细胞的功能。在其它实施方案中，所施用的IL-10药剂的量足以增强细胞毒性功能。
考虑了其中在施用治疗有效的多个细胞之前、同时或之后施用IL-10药剂的实施方案。在本公开的某些实施方案中，IL-10药剂经皮下施用。
在某些实施方案中，本公开考虑以足以实现10至100ng/mL的血清浓度的量施用IL-10药剂。在一些实施方案中，以足以维持1pg/mL至10.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度的量向受试者施用IL-10药剂。在一些实施方案中，1.0pg/mL至10.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度维持至少95％的限定时间段。在本公开的其它实施方案中，平均IL-10血清谷浓度在1.0pg/mL至100pg/mL；从0.1ng/mL至1.0ng/mL；从1.0ng/mL至10ng/mL；从0.5ng/mL至5.0ng/mL；从0.75ng/mL至1.25ng/mL或从0.9ng/mL至1.1ng/mL的范围内。在本公开的特定实施方案中，平均IL-10血清谷浓度为至少1.25ng/mL、至少1.5ng/mL、至少1.6ng/mL、至少1.7ng/mL、至少1.8ng/mL、至少1.85ng/mL、至少1.9ng/mL、至少1.95ng/mL、至少1.97ng/mL和至少1.98ng/mL、至少1.99ng/mL、至少2.0ng/mL或高于2ng/mL。
在另外的实施方案中，前述时间段为至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少6周、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少9个月或大于12个月。
在本公开的特定实施方案中，平均IL-10血清谷浓度维持至少85％的时间段，至少90％、至少96％、至少98％、至少99％或100％的时间段。
按照设想，足以维持期望稳态血清谷浓度(例如，1ng/mL)的给药方案可导致初始血清谷浓度高于期望稳态血清谷浓度。由于IL-10在哺乳动物受试者中的药效学和药代动力学特征，即使在给药参数(例如，量和频率)保持恒定时，初始谷浓度(例如，通过施用一个或多个负荷剂量，接着施用一系列维持剂量而实现)在一段时间内也逐渐但持续地下降。这个时间段后，逐渐但持续下降结束并且维持稳态血清谷浓度。
举例来说，需要向小鼠(例如，C57BL/6小鼠)肠胃外施用(例如，SC和IV)约0.1mg/kg/天的IL-10药剂(例如，mIL-10)以维持2.0ng/mL的稳态血清谷浓度。然而，稳态血清谷浓度在按0.1mg/kg/天开始给药约30天后(以及任何负荷剂量后)才能达到。相反，在达到初始血清谷浓度(例如，2.5ng/mL)之后，该浓度在例如大约30天期间逐渐但持续地降低，在此之后维持期望稳态血清谷浓度(2.0ng/mL)。本领域技术人员将能够使用例如ADME和患者特异性参数来确定维持期望稳态谷浓度所需的剂量。
本公开考虑了其中所述IL-10药剂包含至少一种修饰以形成经修饰的IL-10药剂，其中所述修饰不改变IL-10药剂的氨基酸序列的方法。在一些实施例中，经修饰的IL-10药剂为PEG-IL-10药剂。在其它实施方案中，PEG-IL-10药剂可包含与IL-10的至少一个亚基的至少一个氨基酸残基共价连接的至少一个PEG分子或包含单聚乙二醇化IL-10和二聚乙二醇化IL-10的混合物。PEG-IL-10药剂的PEG组分的分子质量可大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa或大于约50kDa。在一些实施方案中，分子质量为约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。
在一些实施方案中，经修饰的IL-10药剂包含至少一种Fc融合分子、至少一种血清白蛋白(例如，HSA或BSA)、HSA融合分子或白蛋白缀合物。在另外的实施方案中，经修饰的IL-10药剂经糖基化、羟乙基淀粉化或包含至少一个白蛋白结合结构域。一些经修饰的IL-10药剂可以包含多于一种类型的修饰。在特定实施方案中，修饰是定点的。一些实施方案包含接头。下文将详细讨论经修饰的IL-10药剂。
本公开还考虑连同向受试者引入经遗传修饰以表达IL-10药剂的细胞一起，使用CAR-T细胞疗法治疗或预防受试者的疾病、病症或病状(例如，癌症相关病症)。由于其直接和局部作用，从此类细胞分泌的对于减弱靶向表达靶抗原的正常组织的抗原特异性毒性的诱导和导致威胁生命的细胞因子释放综合征的CAR-T细胞治疗的极高效力而言所必需的IL-10药剂的量，远远低于以常规方式(例如经皮下)向受试者施用的IL-10药剂的量。事实上，实现上述效果所必需的分泌IL-10药剂的量可能在血清中不可检测。
在一些此类实施方案中，本公开考虑了一种调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达以下物质的细胞：a)嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和b)足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体和IL-10药剂由相同载体表达，而在其它实施方案中，嵌合抗原受体和IL-10药剂由不同载体表达。在特定实施方案中，治疗有效的多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。载体可以是，例如质粒或病毒载体。本公开还考虑使用表达IL-10药剂的任何其它手段。在特定实施方案中，IL-10药剂的表达受表达控制元件调节。
在上述实施方案中，所述多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。在一些实施方案中，所述多个细胞通过血浆分离置换法从所述受试者获得。在本公开的其它实施方案中，所述多个细胞是记忆CD8+T细胞，而在其它实施方案中，它们是自体肿瘤细胞。
本公开考虑了调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入a)治疗有效的第一多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和b)治疗有效的第二多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂。
在特定实施方案中，治疗有效的多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。在其它实施方案中，治疗有效的第二多个细胞包含用表达IL-10药剂的载体转染的CD8+T细胞。
在特定实施方案中，第一多个细胞从受试者获得并离体经遗传修饰，而在其它实施方案中，第二多个细胞从受试者获得并且离体经遗传修饰。本公开考虑了其中第一多个细胞和第二多个细胞通过血浆分离置换法从受试者获得的实施方案。在一些实施方案中，第一多个细胞是记忆CD8+T细胞，且第二多个细胞是初始CD8+T细胞。在其它实施方案中，第一多个细胞和第二多个细胞是自体肿瘤细胞。
在前述实施方案的每一个中，靶细胞群可包含肿瘤抗原。Vigneron,N.等((2013年7月15日)Cancer Immunity 13:15)描述了含有超过400种肿瘤抗原肽的T细胞限定的人肿瘤抗原的数据库。肿瘤抗原的实例包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR或其任何组合。
本公开还考虑结合施用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)或引入表达IL-10药剂的载体，使用CAR-T细胞疗法治疗或预防受试者的疾病、病症或病状(例如，癌症相关病症)。
特定实施方案包括治疗患有癌症相关的疾病、病症或病状(例如，肿瘤)的受试者的方法，其包括a)向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和b)向所述受试者施用足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂。在特定实施方案中，所治疗的受试者患有本文描述的免疫相关疾病、病症或病状或另一种疾病、病症或病状。
在本公开的某些实施方案中，此类方法用于预防受试者中癌症相关的疾病、病症或病状的治疗方案中，而在其它实施方案中，此类方法用于预防免疫相关病症的治疗方案中。上述方法的其它方面，包括IL-10药剂的给药参数和方案以及此类药剂的示例性类型，在本文其它地方有描述。
本公开另外的实施方案考虑了治疗患有癌症相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达以下物质的细胞：a)嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和b)足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体和IL-10药剂由相同载体表达，而在其它实施方案中，嵌合抗原受体和IL-10药剂由不同载体表达。在特定实施方案中，治疗有效的多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。载体可以是，例如质粒或病毒载体。本公开还考虑使用表达IL-10药剂的任何其它手段。在特定实施方案中，IL-10药剂的表达受表达控制元件调节。
在上述实施方案中，所述多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。根据本公开，在一些实施方案中，所述多个细胞通过血浆分离置换法从所述受试者获得。在特定实施方案中所述多个细胞是记忆CD8+T细胞，而在其它实施方案中是自体肿瘤细胞。
本公开考虑了其中在向受试者引入后至少一周，IL-10药剂以足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的量表达的方法。在其它特定实施方案中，在向受试者引入后至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月或至少一年或更长时间，IL-10药剂以足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的量表达。
本公开的其它实施方案考虑了治疗患有癌症相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，其包括向所述受试者引入a)治疗有效的第一多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和b)治疗有效的第二多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂。本文中其它地方描述了IL-10药剂以足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的量表达的时间长度的实例。
在某些实施方案中，上述方法用于预防受试者中的疾病、病症或病状(包括癌症或免疫相关的疾病、病症或病状)的治疗方案中。
本公开考虑了其中IL-10药剂以足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的量表达一段时间(在本文其它地方描述)的方法。
在特定实施方案中，治疗有效的第一多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。在其它实施方案中，治疗有效的第二多个细胞包含用表达IL-10药剂的载体转染的CD8+T细胞。
在特定实施方案中，第一多个细胞从受试者获得并离体经遗传修饰，而在其它实施方案中，第二多个细胞从受试者获得并且离体经遗传修饰。本公开考虑了其中第一多个细胞和第二多个细胞通过血浆分离置换法从受试者获得的实施方案。在一些实施方案中，第一多个细胞是记忆CD8+T细胞，且第二多个细胞是初始CD8+T细胞。在其它实施方案中，第一多个细胞和第二多个细胞是自体肿瘤细胞。
在前述实施方案的每一个中，靶细胞群可包含肿瘤抗原，其实例描述于本文其它地方。
本公开考虑了编码本文描述的IL-10药剂的核酸分子。在某些实施方案中，所述核酸分子与赋予编码所述IL-10药剂的核酸分子表达的表达控制元件可操作连接。在一些实施方案中，载体(例如，质粒或病毒载体)包含核酸分子。本文还考虑了表达IL-10药剂的转化或宿主细胞。
还有其它实施方案中，本公开提供了增强CAR-T T细胞的功能的方法，其包括a)基因工程化T细胞以表达CAR，从而产生CAR-T T细胞；和b)用减少CAR-T T细胞分泌的至少一种细胞因子的量的药剂(例如，小干扰RNA(siRNA))调节CAR-T T细胞。细胞因子的实例包括但不限于肿瘤坏死因子家族或转化生长因子β超家族的成员(例如，TGF-β)。考虑了其中减少TGF-β的量减少了T调节细胞的增殖的实施方案。
基于本公开的教导，其它实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图简述
图1描绘了用PEG-rHuIL-10处理29天后，PD-1和LAG3+外周T细胞的增加倍数。
图2表明与初始CD8+T细胞相比，PEG-IL-10优先增加记忆CD8+T细胞(CD45RO+)中的IFNγ生成。
图3表明PEG-IL-10能够限制CD8+T细胞(CD45RO+)中活化诱导的细胞死亡。
具体实施方式
在进一步描述本公开之前，应当理解本公开不限于本文阐述的特定实施方案，并且还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并非意在限制。
当提供数值范围时，应理解除非上下文另外明确指出，否则介于该范围上下限与该规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个中间值(到下限单位的十分之一)，都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也涵盖在本发明内，受限于规定范围中任何特别排除的限值。当规定范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。
必须注意，如在本文中和在所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。还应注意，权利要求书可以起草为排除任何任选要素。因而，本声明意在用作使用诸如“只是”、“仅仅”等等这类排除性术语，连同叙述权利要求要素或使用“否定”限制的前提基础。
本文所讨论的出版物仅为其在本申请的提交日期之前公开而提供。此外，所提供的出版日期可以不同于实际出版日期，其可能需要单独确认。
综述
CAR-T T细胞疗法是例如治疗癌症相关(例如B和T细胞淋巴瘤)和免疫相关的恶性肿瘤的有前景的治疗方法。CAR-T T细胞通常包含患者来源的记忆CD8+T细胞，其经修饰以表达对例如目标肿瘤上存在的已知抗原具有特异性的重组T细胞受体。虽然在使用CAR-T细胞疗法治疗癌症的上下文中一般性地描述了本公开，但是应该理解，此类疗法还可用于治疗其它适应症。
如本文进一步讨论的，在已将CAR-T细胞疗法用于治疗某些癌症(例如，非B细胞恶性肿瘤)时，已经观察到具有显著抗原负荷的高亲和力T细胞受体相互作用可以导致活化诱导的细胞死亡。尽管先前已将IL-10与活化诱导的细胞死亡的增强联系起来，但本文提供的数据表明IL-10药剂可以连同CAR-T T细胞疗法一起使用以预防或限制活化诱导的细胞死亡，同时增强CD8+T细胞功能和存活。
应该注意的是，与本公开的多肽和核酸分子有关的任何对“人”的提及并非意在限制获得多肽或核酸的方式或来源，而只是与该序列有关，因为它可以对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。除了人多肽和编码它们的核酸分子之外，本公开还考虑了来自其它物种的IL-10相关多肽和相应的核酸分子。
定义
除非另有说明，否则以下术语意在具有以下阐述的含义。在整个说明书的其它地方定义了其它术语。
术语“患者”或“受试者”可互换用于指人或非人动物(例如，哺乳动物)。
术语“施用”等在应用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指例如IL-10或PEG-IL-10)、核酸(例如，编码天然人IL-10的核酸)、包含上述物质的药物组合物或者诊断药剂与受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。在细胞的情况下，施用包括试剂与细胞接触(例如体外或离体)，以及试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。
术语“治疗”等是指在疾病、病症或病状或其症状已被诊断、观察等之后，为了暂时或永久性消除、减轻、阻遏、缓和或改善折磨受试者的疾病、病症或病状的至少一种根本原因，或与折磨受试者的疾病、病症、病状相关的至少一种症状而开始的作用过程(例如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)。因此，治疗包括抑制(例如阻止疾病、病症或病状或与之相关的临床症状的发展或进一步发展)活动性疾病。该术语还可以用于其它情况下，例如IL-10或PEG-IL-10在例如流体相或胶体相中与IL-10受体接触的情形。
如本文所用的术语“需要治疗”是指由医师或其它护理者作出的受试者需要或将受益于治疗的判断。这种判断是基于医师或护理者专业知识领域中的各种因素而作出的。
术语“预防”等是指以某种方式(例如，在疾病、病症、病状或其症状发作之前)，为了暂时或永久性预防、阻遏、抑制或降低受试者发展疾病、病症或病状等的风险(如通过例如临床症状的缺乏来确定)或延迟其发作，通常在倾向于患有特定疾病、病症或病状的受试者的情况下开始的作用过程(例如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)。在某些情况下，该术语还指减缓疾病、病症或病状的发展或抑制其发展成有害或其它不期望的状态。
如本文所用的术语“需要预防”是指由医师或其它护理者作出的受试者需要或将受益于预防保健的判断。这种判断是基于医师或护理者专业知识领域中的各种因素而作出的。
短语“治疗有效量”是指将药剂单独或作为药物组合物的一部分，并且以单次剂量或作为一系列剂量的一部分，以施用给受试者时能够对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的、积极作用的量向受试者施用。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定，并且可以结合给药方案和对受试者状况的诊断分析等进行调整。举例来说，测量施用后产生的炎性细胞因子的量可以指示是否已经使用了治疗有效量。
短语“足以实现变化的量”是指在施用特定疗法之前(例如，基线水平)和之后测量的指标水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(例如IL-10的血清浓度)或主观参数(例如受试者的幸福感)。
术语“小分子”是指分子量小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的化学化合物。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子和合成分子。治疗上，小分子可以比大分子对细胞更易渗透，不易降解，而且引发免疫应答的可能性更小。
术语“配体”是指例如可充当受体激动剂或拮抗剂的肽、多肽、膜缔合分子或膜结合分子或其复合物。“配体”涵盖天然和合成的配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白以及源自抗体的结合组合物。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。该术语还涵盖既不是激动剂也不是拮抗剂的药剂，但其可以结合受体而不显著影响其生物学性质，例如信号传导或粘附。而且，该术语包括已经例如通过化学或重组方法改变为膜结合配体的可溶形式的膜结合配体。配体或受体可以完全是细胞内的，即它可以存在于细胞质、细胞核或一些其它细胞内区室中。配体和受体的复合物称为“配体-受体复合物”。
术语“抑制剂”和“拮抗剂”或“活化剂”和“激动剂”分别是指例如用于活化例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的抑制或活化分子。抑制剂是减少、阻断、阻止、延迟活化、灭活、脱敏化或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。活化剂是增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。抑制剂也可定义为减少、阻断或灭活组成型活性的分子。“激动剂”是与靶标相互作用以引起或促进靶标活化增加的分子。“拮抗剂”是一种对抗激动剂作用的分子。拮抗剂阻止、降低、抑制或中和激动剂的活性，并且拮抗剂也可以阻止、抑制或降低靶标(例如靶受体)的组成型活性，即使在没有鉴定的激动剂的情况下。
术语“调节”等是指分子(例如活化剂或抑制剂)直接或间接增加或降低IL-10药剂(或编码它们的核酸分子)的功能或活性)的能力；或增强分子产生与IL-10药剂相当的效果的能力。术语“调节剂”广义上意在指可以影响上述活性的分子。举例来说，例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性可被活化、抑制，或改变其调节性质。调节剂可以单独作用，或者可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。术语“调节剂”包括通过与IL-10相同的作用机制进行操作(即以与之类似的方式调节与IL-10相同的信号传导途径的药剂)，并且能够引发与IL-10相当(或更强)的生物反应的药剂。
调节剂的实例包括小分子化合物和其它生物有机分子。小分子化合物的许多文库(例如组合文库)可商购获得并且可以作为鉴定调节剂的起点。本领域技术人员能够开发一种或多种测定法(例如，基于生物化学或细胞的测定法)，其中可以筛选此类化合物文库以鉴定具有期望性质的一种或多种化合物；此后，熟练的药物化学家能够通过例如合成和评价其类似物和衍生物来优化这样的一种或多种化合物。合成和/或分子建模研究也可以用于鉴定活化剂。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或与受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性；对其它分子活性的调节；等等。该术语还可以指调节或维持细胞间相互作用(例如粘附)的活性或维持细胞(例如细胞膜)结构的活性。“活性”还可以意指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等。术语“增殖活性”涵盖促进(例如)正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管发生所必需的或与之特异性相关的活性。
如本文中所用，“相当的”、“相当活性”、“与......相当的活性”、“相当效果”、“与......相当的效果”等是可以定量和/或定性地观察的相对术语。术语的含义通常取决于使用它们的上下文。举例来说，从定性角度看两种活化受体的药剂可被视为具有相当的效果，但是如果在本领域接受的测定法(例如，剂量-反应测定法)中或在本领域接受的动物模型中测定，一种药剂仅能达到另一种药剂活性的20％，则从定量角度看两种药剂可被视为没有相当的效果。当比较一个结果与另一个结果(例如，一个结果与参考标准)时，“相当”通常意指一个结果与参考标准的偏差小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在特定实施方式中，如果一个结果与参考标准的偏差小于15％、小于10％或小于5％，则其与参比标准相当。举例来说，但不是限制，活性或效果可以指功效、稳定性、溶解度或免疫原性。
术语例如细胞、组织、器官或生物体的“应答”涵盖生物化学或生理学行为，例如生物区室内的浓度、密度、粘附或迁移、基因表达的速率或分化状态的变化，其中变化与活化、刺激或处理相关，或者与内部机制如基因编程相关。在某些情况下，术语“活化”、“刺激”等是指受内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化；而术语“抑制”、“下调”等是指相反的作用。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸聚合形式，其可以包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸及具有经修饰的多肽骨架的多肽。术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；有或无N-端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫标记蛋白的融合蛋白；等等。
应该认识到，在整个公开中，参照根据单字母或三字母代码的氨基酸。为了方便读者，下面提供单字母和三字母的氨基酸代码：
如本文中所用，术语“变体”涵盖天然存在的变体和非天然存在的变体。天然存在的变体包括同系物(一个物种与另一个物种，分别在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)和等位基因变体(物种内的一个个体与另一个体，分别在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)。非天然存在的变体包括分别包含氨基酸或核苷酸序列变化的多肽和核酸，其中人工引入序列变化(例如突变蛋白)；例如，该变化是通过人为干预(“人工”)在实验室产生的。因此，本文中的“突变蛋白”广泛地指突变的重组蛋白，其通常携带单个或多个氨基酸取代并且经常源自已经进行了定点或随机诱变的克隆基因或来自完全合成的基因。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
如本文在多肽结构的上下文中所使用的，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别是指多肽的氨基和羧基最末端，而术语“N-端”和“C-端”分别是指在多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并且可以分别包括在N-末端和C-末端处的残基。“紧接N-端”或“紧接C-端”是指第一个氨基酸残基相对于第二个氨基酸残基的位置，其中第一个和第二个氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中“源自”(例如，“源自”IL-10多肽的氨基酸序列)意在表明多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸(例如，天然存在的IL-10多肽或编码IL-10的核酸)的序列，并非意在限制制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例来说，术语“源自”包括参考氨基酸或DNA序列的同系物或变体。
在多肽的上下文中，术语“分离的”是指目标多肽，如果是天然存在的，则处于与天然存在的环境不同的环境中。“分离的”意在包括基本上富集目标多肽和/或其中目标多肽部分或基本上纯化的样品内的多肽。在多肽不是天然存在的情况下，“分离的”表明该多肽已经从通过合成或重组手段制备的环境中分离出来。
“富集”意指样品经非自然操作(例如由科学家)，使得目标多肽以a)比原始样品，例如生物样品(例如多肽天然存在于其中或在施用后存在于其中的样品)中的多肽浓度更高的浓度(例如，至少3倍、至少4倍、至少8倍、至少64倍或更多)，或b)比制备多肽的环境(例如，如同在细菌细胞中)更高的浓度存在。
“基本上纯的”表明组分(例如多肽)构成组合物总含量的大于约50％，并且通常为总多肽含量的大于约60％。更通常地，“基本上纯的”是指其中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多是目标组分的组合物。在一些情况下，多肽将构成组合物总含量的大于约90％或大于约95％。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，术语“特异性结合”或“选择性结合”表示决定蛋白质和其它生物制剂的异质群体中蛋白质的存在的结合反应。因此，在指定条件下，指定配体与特定受体结合而不以显著的量与样品中存在的其它蛋白质结合。所考虑的方法的抗体或源自抗体的抗原结合位点的结合组合物与其抗原或其变体或突变蛋白结合，其亲和力比与任何其它抗体或源自其的结合组合物的亲和力高至少两倍、至少十倍、至少20倍或至少100倍。在特定实施方案中，正如通过例如Scatchard分析测定，抗体的亲和力将高于约109升/摩尔(Munsen等，1980Analyt.Biochem.107：220-239)。
IL-10和PEG-IL-10
抗炎细胞因子IL-10，也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，分类为2型(类)细胞因子，即包括IL-19、IL-20、IL-22、IL-24(Mda-7)和IL-26、干扰素(IFN-α、-β、-γ、-δ、-ε、-κ、-Ω和-τ)和干扰素样分子(limitin、IL-28A、IL-28B和IL-29)的一组细胞因子。
IL-10是一种在免疫调节和炎症中具有多效性作用的细胞因子。它是由肥大细胞产生的，抵消了这些细胞在过敏反应部位具有的炎症作用。虽然它能够抑制促炎细胞因子，例如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成，但IL-10也对某些T细胞和肥大细胞有刺激作用并且刺激B细胞成熟、增殖和抗体产生。IL-10可以阻断NF-κB活性并参与JAK-STAT信号传导途径的调控。它还诱导CD8+T细胞的细胞毒活性和B细胞的抗体产生，并且阻遏巨噬细胞活性和促肿瘤炎症。对CD8+T细胞的调节是剂量依赖性的，其中剂量越高诱导的细胞毒性反应越强。
人IL-10是分子质量为37kDa的同型二聚体，其中每个18.5kDa的单体包含178个氨基酸，其中前18个氨基酸包含信号肽，两个半胱氨酸残基形成两个分子内二硫键。在破坏两个单体亚基之间的非共价相互作用后，IL-10二聚体变得无生物活性。
本公开考虑展示出80％同源性的人IL-10(NP_000563)和鼠IL-10(NP_034678)及其用途。另外，本公开的范围包括来自其它哺乳类动物物种，包括大鼠(登记号NP_036986.2；GI 148747382)；牛(登记号NP_776513.1；GI 41386772)；羊(登记号NP_001009327.1；GI 57164347)；狗(登记号ABY86619.1；GI 166244598)；和兔(登记号AAC23839.1；GI 3242896)的IL-10直系同源物及其修饰形式。
正如上面提到的，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“IL-10分子”、“IL-10药剂”等意在广泛地解释并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括其同系物、变体(包括突变蛋白)及片段，以及具有例如前导序列(例如信号肽)的IL-10多肽，以及前述的修饰形式。在另外的特定实施方案中，IL-10、IL-10多肽和IL-10药剂为激动剂。
IL-10受体，一种II型细胞因子受体，由α和β亚基组成，它们也分别称为R1和R2。受体活化需要与α和β两者结合。IL-10多肽的一个同二聚体与α结合且相同IL-10多肽的另一个同二聚体与β结合。
重组人IL-10的实用性通常受其相对短的血清半衰期限制，这可能是由于例如肾清除、蛋白水解降解和血流中的单体化所致。因此，已经探索了各种方法来改善IL-10的药代动力学特性，而不破坏其二聚体结构，从而不对其活性产生不利影响。IL-10的聚乙二醇化引起某些药代动力学参数(例如血清半衰期)改善和/或活性增强。
如本文中所用，术语“聚乙二醇化IL-10”和“PEG-IL-10”是指有一个或多个聚乙二醇分子，通常经由接头与IL-10蛋白的至少一个氨基酸残基共价连接，使得连接稳定的IL-10分子。术语“单聚乙二醇化IL-10”和“单-PEG-IL-10”表明一个聚乙二醇分子通常经由接头与IL-10二聚体的一个亚基上的单个氨基酸残基共价连接。如本文中所用，术语“二聚乙二醇化IL-10”和“二-PEG-IL-10”表明至少一个聚乙二醇分子通常经由接头与IL-10二聚体的每个亚基上的单个残基连接。
在某些实施方案中，本公开中使用的PEG-IL-10是其中1至9个PEG分子经由接头与IL-10二聚体的一个亚基的N末端处的氨基酸残基的α氨基共价连接的单-PEG-IL-10。一个IL-10亚基上的单聚乙二醇化通常由于亚基改组而产生非聚乙二醇化、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化IL-10的不均匀混合物。而且，使聚乙二醇化反应进行至完成通常会产生非特异性和多聚乙二醇化的IL-10，从而降低其生物活性。因此，本公开的特定实施方案包括施用通过本文描述的方法产生的单聚乙二醇化IL-10和二聚乙二醇化IL-10的混合物。
在特定实施方案中，PEG部分的平均分子量介于约5kDa和约50kDa之间。虽然PEG与IL-10连接的方法或位点不是关键的，但在某些实施方案中，聚乙二醇化不会改变，或者仅最小程度地改变IL-10药剂的活性。在某些实施方案中，半衰期的增加大于生物活性的任何降低。通常通过评估经细菌抗原(脂多糖(LPS))攻击并且经PEG-IL-10处理的受试者血清中炎性细胞因子(例如TNF-α或IFN-γ)的水平来测量PEG-IL-10的生物学活性，如美国专利第7,052,686号中所述。
头脑中可以有各种目的来制备IL-10变体，包括增加血清半衰期，减少针对IL-10的免疫应答，促进纯化或制备，减少IL-10向其单体亚基的转化，改善治疗功效，及在治疗使用期间减轻副作用的严重性或发生率。氨基酸序列变体，尽管一些可以是翻译后变体，例如糖基化变体，但通常是自然界中未发现的预定变体。可以使用IL-10的任何变体，条件是其保持合适水平的IL-10活性。
短语“保守性氨基酸取代”是指通过用具有类似酸性、碱性、电荷、极性或侧链尺寸的侧链的氨基酸置换蛋白质中的氨基酸来保持蛋白质活性的取代。保守性氨基酸取代通常需要下列组内氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；及6)D、E。取代、插入或缺失的指导可以基于不同变体蛋白或来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对。因此，除了任何天然存在的IL-10多肽之外，本公开还考虑具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个通常不超过20、10或5个氨基酸酸取代，其中取代通常是保守性氨基酸取代。
本发明还考虑了含有源自成熟IL-10的连续氨基酸残基的成熟IL-10的活性片段(例如子序列)。肽或多肽子序列的连续氨基酸残基的长度根据子序列所来源的特定天然存在的氨基酸序列而变化。通常，肽和多肽可以是约20个氨基酸至约40个氨基酸，约40个氨基酸至约60个氨基酸，约60个氨基酸至约80个氨基酸，约80个氨基酸至约100个氨基酸，约100个氨基酸至约120个氨基酸，约120个氨基酸至约140个氨基酸，约140个氨基酸至约150个氨基酸，约150个氨基酸至约155个氨基酸，约155个氨基酸直至全长肽或多肽。
另外，IL-10多肽可以在限定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)上与参考序列相比具有限定的序列同一性。用于比较的序列比对方法在本领域是公知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过以下方式进行：例如，通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过计算机执行这些算法(Wisconsin Genetics软件包Madison,Wis中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手动比对和目视检查(参见，例如，Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel等编辑，1995年增刊))。
例如，合适的IL-10多肽可以包含与一连串约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸至全长肽或多肽具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
如下面进一步讨论的，IL-10多肽可以从天然来源(例如，除天然存在的环境以外的环境)中分离并且也可以重组制备(例如在经遗传修饰的宿主细胞中如细菌、酵母、毕赤酵母、昆虫细胞等)，其中经遗传修饰的宿主细胞经包含编码多肽的核苷酸序列的核酸修饰。IL-10多肽也可以合成产生(例如，通过无细胞化学合成)。
本公开考虑了编码IL-10药剂的核酸分子，包括其天然存在的和非天然存在的同种型、等位基因变体和剪接变体。本公开还涵盖了与来自天然存在的DNA序列有一个或多个碱基不同，但由于遗传密码的简并性，仍然翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列的核酸序列。
嵌合抗原受体T细胞
嵌合抗原受体T细胞(CAR；也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体和嵌合免疫受体)代表了癌症(例如治疗B和T细胞淋巴瘤)和其它恶性肿瘤的新兴疗法。CAR-T T细胞通常包含患者来源的记忆CD8+T细胞，其经修饰以表达对例如目标肿瘤上存在的已知抗原具有特异性的重组T细胞受体。本文考虑的其它类型的T细胞包括初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。虽然在使用CAR-T细胞疗法治疗癌症的上下文中一般性地描述了本公开，但是应该理解，此类疗法不限于此。
CAR-T T细胞疗法包括使用过继性细胞转移(ACT)。利用患者自身培养的T细胞的ACT已经显示出作为患者特异性癌症疗法的希望(Snook和Waldman(2013)Discov Med 15(81):120-25)。使用基因工程方法将具有确定特异性的抗原靶向受体插入到T细胞中已大大扩展了ACT的潜在能力。在大多数情况下，这些工程化嵌合抗原受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。
CAR-T细胞疗法的开始包括从患者中取出T细胞。然后将T细胞基因工程化以表达针对对已知癌症(例如肿瘤)有特异性的抗原的CAR。离体扩增足够数量后，将自体细胞输注回患者体内，导致癌症的抗原特异性破坏。
CAR是一类由通常与细胞外肿瘤结合部分，最常见地来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)融合的细胞内T细胞信号传导结构域构成的抗原靶向受体。CAR直接识别细胞表面抗原，不依赖于MHC介导的呈递，容许在所有患者中使用对任何给定抗原有特异性的单一受体构建体。
嵌合抗原受体通常包含几种主要组分，其中一些在下文中有描述。
如本文中所用，短语“抗原特异性靶向区域”(ASTR)是指引导CAR至特定抗原的区域。CAR上的靶向区域是细胞外的。在本公开的特定实施方案中，CAR包含至少两个靶向至少两种不同抗原的靶向区域。在其它特定实施方案中，CAR包含三个或更多个靶向至少三种或更多种不同抗原的靶向区域。在一些实施方案中，抗原特异性靶向区域包含抗体或其功能等效物或其片段或其衍生物，并且每个靶向区靶向不同的抗原。靶向区域可以包含全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双链抗体，其中每一种对靶抗原都有特异性。在本公开的某些方面，靶向区域可以包含连接的细胞因子、来自天然存在的受体的配体结合结构域、受体的可溶性蛋白质-肽配体、肽、亲和体和疫苗以促使免疫应答。技术人员知道可以用作抗原特异性靶向区域的其它分子。
如本文中所用，术语“细胞外间隔结构域”(ESD)是指抗原特异性靶向区域和跨膜结构域之间的亲水性区域。本公开考虑了其中CAR包含ESD的实施方案，其实例包括Fc Ab片段或其片段或衍生物；抗体或其片段或衍生物的铰链区；抗体的CH2或CH3区；人工间隔区序列，包括IgG(如人IgG4)的Gly3或CH1和CH3结构域；或前述的组合。本领域的普通技术人员知道其它ESD，这在本文中有考虑到。
如本文中所用，术语“跨膜结构域”(TMD)是指穿过质膜的CAR区域。在一些实施方案中，跨膜区是跨膜蛋白(例如，I型跨膜蛋白)、人工疏水序列或其组合。本领域技术人员知道可以连同本公开的教导一起使用的其它跨膜结构域。
如本文中所用，术语“细胞内信号传导结构域”(ISD)和“细胞质结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行其特化功能的CAR部分。ISD的实例包括T细胞受体复合物的ζ链或其任何同系物(例如η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(δ、Δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其它参与T-细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。本领域技术人员知道可以连同本公开的教导一起使用的其它ISD。
术语“共刺激结构域”(CSD)是指增强记忆细胞的增殖、存活或发育的CAR部分。如本文其它地方所指出的，本公开的CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。在本公开的一些实施方案中，CSD包含TNFR超家族的一个或多个成员：CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。本领域普通技术人员知道可以连同本公开的教导一起使用的其它共刺激结构域。
当连同本文描述的CAR-T T细胞技术一起使用时，术语“接头”、“接头结构域”和“接头区域”是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将本公开的CAR的任何结构域/区域连接在一起。接头可以由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸组成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。某些实施方案包括当希望确保两个相邻结构域在空间上不彼此干涉时使用长度较长的接头。在一些实施方案中，接头是不可裂解的，而在其它实施方案中它们是可裂解的(例如，2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物，以及前述的组合)。考虑了本公开的实施方案，其中接头包括微小核糖核酸病毒2A样接头、猪捷申病毒(P2A)、明脉扁刺蛾四体病毒(T2A)的CHYSEL序列或其组合、变体和功能等效物。还有另外的实施方案中，接头序列包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-pro(2B)基序，该基序导致2A甘氨酸和2B脯氨酸之间的裂解。其它接头对于本领域技术人员而言将是显而易见的并且考虑与本公开的教导一起使用。
CAR-T T细胞疗法有相对较快的进展(通常参见，美国专利申请公布第20150038684号)。第一代CAR涉及抗原识别结构域与T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ活化链的融合。虽然这些第一代CAR在体外诱导T细胞效应功能，但体内功效在很大程度上受其抗肿瘤功效差的限制。CAR技术的进展产生了第二代CAR，其包括与一个CSD串联的CD3ζ活化链，其实例包括来自CD28的细胞内结构域或多种TNF受体家族分子如4-1BB(CD137)和OX40(CD134)。已经开发出第三代CAR，除了CD3ζ活化链之外，还包括两个共刺激信号，CSD最常来自于CD28和4-1BB。第二代和第三代CAR显著提高了抗肿瘤功效。然而，共刺激分子的特定组合是否有利于其它方面尚不完全清楚。而且，第二代和第三代CAR的功效增加，加上缺乏真正的肿瘤特异性抗原靶标，也增加了严重毒性的风险。(参见，例如Carpenito等(2009)ProcNatl Acad Sci USA 106(9):3360-65；Grupp等(2013)N Engl J Med 368(16):1509-18)。
活化诱导的细胞死亡
输注针对特定靶抗原的经遗传修饰的T细胞具有几个潜在益处，包括长期疾病控制，与细胞毒性化学疗法或靶向疗法类似的迅速起效作用，以及规避T细胞库的免疫耐受和MHC限制。然而，用CAR-T细胞疗法治疗某些癌症(例如非B细胞恶性肿瘤)已部分受限于靶向表达靶抗原的正常组织的抗原特异性毒性的诱导和有时导致威胁生命的细胞因子释放综合征的CAR-T细胞治疗的极高效力(Magee(2014年11月)Discov Med 18(100):265-71)。具体而言，已经观察到高亲和力T细胞受体与显著抗原负荷的相互作用可导致活化诱导的细胞死亡(Song等(2012)Blood 119(3):696-706；Hombach等(2013)Mol Ther 21(12):2268-77)。
活化诱导的细胞死亡(AICD)、由Fas受体(例如Fas、CD95)与Fas配体(例如FasL、CD95配体)的相互作用而导致的程序性细胞死亡有助于维持外周免疫耐受。AICD效应细胞表达FasL，并在表达Fas受体的细胞中诱导细胞凋亡。活化诱导的细胞死亡是由反复刺激其T细胞受体所产生的活化T淋巴细胞的负调节因子。该过程的改变可能导致自身免疫性疾病(Zhang J等，(2004)Cell Mol Immunol.1(3):186-92)。
在机制上，Fas配体与Fas受体的结合触发Fas受体三聚化，其胞质结构域然后能够结合衔接蛋白FADD的死亡结构域(具有死亡结构域的Fas相关蛋白)。半胱天冬酶原8结合FADD的死亡效应结构域并且经蛋白水解自活化半胱天冬酶8；Fas、FADD和半胱天冬酶原8一起形成诱导死亡的信号传导复合物。活化的半胱天冬酶8被释放到细胞溶质中，在那里它活化启动凋亡的半胱天冬酶级联反应(Nagata S.(1997)Cell.:88(3):355-65s。
效应细胞的活化诱导的增殖和死亡的平衡是T细胞稳态扩增的关键点。虽然静止性T细胞易于凋亡，但在细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-7和IL-12)的存在下通过TCR/CD3刺激T细胞导致克隆扩增。有趣的是，这些分子在T细胞稳态中的作用有时是自相矛盾的。举例来说，IL-2对于CD4+T细胞的增殖和存活是必需的，但它也是活化诱导的细胞死亡的先决条件。而且，已经证实IL-18促进活化CD8+T细胞的扩增和存活。IL-18可在暴露于刺激后通过调节具有特定功能的CD8+T细胞群的大小来影响免疫/炎症应答。对活化T细胞的增殖和活化诱导的细胞死亡的调节与免疫/炎症应答密切相关(Li,W.等(2007年7月)J LeukocyteBio 82(1):142-51)。
IL-10对CAR-T T细胞疗法的影响
IL-10药剂(例如PEG-IL-10)的特征在本文其它地方有描述。作为抗炎和免疫抑制分子，IL-10抑制抗原呈递、CD4+T细胞功能、CD8+T细胞病原体特异性功能(Biswas等(2007)J Immunol 179(7):4520-28)、病毒表位特异性CD8+T细胞IFNγ应答(Liu等，(2003)JImmunol 171(9):4765-72)和抗LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)CD8+T细胞应答(Brooks等(2008)PNAS USA 105(51):20428-433)。
虽然已经在增强活化诱导的细胞死亡的背景下讨论了IL-10(Georgescu等(1997)J Clin Invest 100(10):2622-33)，但本文提供的体外和体内数据表明，可以将IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与CAR-T T细胞疗法组合以预防或限制活化诱导的细胞死亡，同时增强CD8+T细胞功能和存活。
举例来说，实验部分的实施例1中呈现的发现表明施用PEG-IL-10介导CD8+T细胞免疫活化。如实施例1中所述，在用PEG-rHuIL-10治疗之前和之后，在肿瘤患者中比较表达PD-1和LAG3的CD8+T细胞的数量(参见实施例1)。PD-1和LAG3都是CD8+T细胞活化和细胞毒性功能的标志物。表达PD-1的外周CD8+T细胞数量增加约2倍，而表达LAG3的外周CD8+T细胞数量增加约4倍。总的来说，这些数据表明施用PEG-IL-10介导了CD8+T细胞免疫活化。
还观察到施用PEG-IL-10增强了活化记忆CD8+T细胞的功能(参见实施例2)。记忆T细胞(也称为经历抗原的T细胞)是在之前感染、癌症暴露或先前接种期间已经预先遇到其同源抗原并对其同源抗原有应答的一类T淋巴细胞(例如，辅助性T细胞(CD4+)和细胞毒性T细胞(CD8+))。相反，初始T细胞在周围尚未遇到其同源抗原；其通常特征在于缺乏活化标志物CD25、CD44或CD69以及缺乏记忆CD45RO同种型。记忆T细胞(通常为CD45RO+)能够再生和产生比初始T细胞更快和更强的免疫应答。
由于CAR-T T细胞源自记忆CD8+T细胞，所以体外评估了PEG-IL-10对记忆CD8+T细胞的影响。实施例2中呈现的数据与PEG-IL-10增强活化记忆CD8+T细胞功能的作用一致。
方法和模型
本公开考虑了用于鉴定已经遭受或怀疑已经遭受由CAR-T细胞疗法导致活化诱导的细胞死亡，可对本文描述的疗法应答的候选受试者群体(或单个受试者)的各种方法和模型。此类疗法包括用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的单一疗法和用IL-10药剂与一种或多种已经证实在预防或限制活化诱导的细胞死亡中显示出有益活性的不同药剂的组合疗法。在一些实施方案中，所述方法和模型允许确定施用IL-10药剂是否在活化诱导的细胞死亡上实现期望降低水平或者IL-10药剂与另一药剂的组合是否更有益。在其它实施方案中，所述方法和模型允许确定组合的施用是否导致更少的不期望作用。
本公开的某些实施方案包括使用体外、离体和体内方法和/或模型。在本公开的某些实施方案中，受试者群体(或个体受试者)是非人动物(例如，啮齿动物)或人。
举例来说，但不是限制，本公开的一个方面考虑了用于确定已经遭受或怀疑已经遭受活化诱导的细胞死亡的测试受试者是否是用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)治疗的候选者的方法，所述方法包括a)提供具有活化诱导的细胞死亡标记的测试受试者，b)以足以在参考群体中实现期望的应答的量向所述测试受试者施用IL-10药剂，和c)确定测试受试者是否表现出期望的应答；其中期望的应答的确定表明测试受试者是治疗的候选者。本领域技术人员能够修改此类方法供组合疗法使用。期望的应答可以是在该情况下认为有利的任何结果。
如上所述，本公开还考虑了各种模型。可以使用提供可靠的、可重现的结果的任何模型。本领域技术人员熟悉可以连同本公开的主题一起使用的模型；在一个实施方案中，在包含非人受试者(例如，小鼠)的模型中评价IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)。本公开的特定实施方式考虑了用于确定IL-10药剂，与或不与另一种药剂组合，是否是预防或减少活化诱导的细胞死亡的候选方案的模型。
本公开另外的实施方案包括用于确定与或不与另一种药剂组合的IL-10药剂的最佳量的方法或模型。最佳量可以是，例如在受试者或受试者群体中达到最佳效果的量。通过控制药剂的量，临床医生能够确定用于预防或减少活化诱导的细胞死亡的最佳给药方案。
生物标志物
本公开还考虑将生物标志物连同本文描述的方法和模型一起使用。术语“生物标志物”是指作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标而客观测量和评价的特征。指标可以是可在体内或其产物中测量，并且影响或预测结果或疾病的发生率的任何物质、结构或过程。
在本公开的一些实施方案中，使用生物标志物预测用IL-10药剂(例如PEG-IL-10)治疗的临床反应。在一些情况下，治疗前生物标志物可以用于此类疗法中，其中已经验证了生物标志物以致于可以将其作为护理标准治疗决策制定的一部分应用。
血清浓度
在本文描述的方法中IL-10的血浆水平可以以几种方式表征，包括：(1)高于某一指定水平或在一定水平范围内的平均IL-10血清谷浓度；(2)某一段时间高于某一指定水平的平均IL-10血清谷浓度；(3)高于或低于某一指定水平或在一定水平范围内的稳态IL-10血清浓度水平；或(4)高于或低于某一指定水平或在一定水平范围内的浓度曲线的Cmax。如本文所述，已经发现平均IL-10血清谷浓度对于某些适应症的功效是特别重要的。
在本公开的一些实施方案中，可以生成的血浆和/或血清水平浓度曲线包括：高于约1.0pg/mL、高于约10.0pg/mL、高于约20.0pg/mL、高于约30pg/mL、高于约40pg/mL、高于约50.0pg/mL、高于约60.0pg/mL、高于约70.0pg/mL、高于约80.0pg/mL、高于约90pg/mL、高于约0.1ng/mL、高于约0.2ng/mL、高于约0.3ng/mL、高于约0.4ng/mL、高于约0.5ng/mL、高于约0.6ng/mL、高于约0.7ng/mL、高于约0.8ng/mL、高于约0.9ng/mL、高于约1.0ng/mL、高于约1.5ng/mL、高于约2.0ng/mL、高于约2.5ng/mL、高于约3.0ng/mL、高于约3.5ng/mL、高于约4.0ng/mL、高于约4.5ng/mL、高于约5.0ng/mL、高于约5.5ng/mL、高于约6.0ng/mL、高于约6.5ng/mL、高于约7.0ng/mL、高于约7.5ng/mL、高于约8.0ng/mL、高于约8.5ng/mL、高于约9.0ng/mL、高于约9.5ng/mL或高于约10.0ng/mL的平均IL-10血浆和/或血清谷浓度。
在本公开的特定实施方案中，平均IL-10血清谷浓度在1.0pg/mL至10ng/mL的范围内。在一些实施方案中，平均IL-10血清谷浓度在1.0pg/mL至100pg/mL的范围内。在其它实施方案中，平均IL-10血清谷浓度在0.1ng/mL至1.0ng/mL的范围内。还有其它实施方案中，平均IL-10血清谷浓度在1.0ng/mL至10ng/mL的范围内。应该理解的是，即使未明确列举此类范围，但本公开也考虑到了并入由本文所述的那些所涵盖的任何浓度的范围。举例来说，在一个实施方案中，平均血清IL-10浓度可以在0.5ng/mL至5ng/mL的范围内。再举例来说，本公开的特定实施方案包括在约0.5ng/mL至约10.5ng/mL、约1.0ng/mL至约10.0ng/mL、约1.0ng/mL至约9.0ng/mL、约1.0ng/mL至约8.0ng/mL、约1.0ng/mL至约7.0ng/mL、约1.5ng/mL至约10.0ng/mL、约1.5ng/mL至约9.0ng/mL、约1.5ng/mL至约8.0ng/mL、约1.5ng/mL至约7.0ng/mL、约2.0ng/mL至约10.0ng/mL、约2.0ng/mL至约9.0ng/mL、约2.0ng/mL至约8.0ng/mL和约2.0ng/mL至约7.0ng/mL的范围内的平均IL-10血清谷浓度。
在特定实施方案中，在治疗持续时间内维持1-2ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。本公开还考虑了其中在治疗持续时间内平均IL-10血清峰浓度低于或等于约10.0ng/mL的实施方案。另外的实施方案考虑了高于或等于约1.0pg/mL的平均IL-10血清谷浓度。最佳平均血清浓度通常是未引入不期望有害作用而达到期望治疗效果时的平均血清浓度。
本公开的某些实施方案提供了用于监测接受IL-10疗法的受试者以预测并因此可能避免不利效应的方法，所述方法包括：(1)测量受试者的IL-10峰浓度；(2)测量受试者的IL-10谷浓度；(3)计算峰谷波动；以及，(4)利用计算出的峰谷波动预测受试者中的潜在不利效应。在特定受试者群体中，峰谷波动越小表明受试者将经历与IL-10有关的不利效应的可能性越低。另外，在一些实施方案中，对于特定疾病、病症和病状的治疗而言使用特定给药参数确定特定峰谷波动，并将那些波动用作参考标准。
对于大多数药物，血浆药物浓度以多指数方式下降。紧接在静脉内施用后，药物迅速分布于整个初始空间(最低限度定义为血浆体积)，然后发生向血管外空间(例如某些组织)的较慢、平衡分布。静脉施用IL-10与此类二室动力学模型有关(参见Rachmawati,H.等(2004)Pharm.Res.21(11):2072-78)。也已经研究了皮下重组hIL-10的药代动力学(Radwanski,E.等(1998)Pharm.Res.15(12):1895-1901)。因此，在评估适当的IL-10剂量相关参数时，分布容积因素是相关的。而且，已经努力探索使IL-10药剂靶向特定细胞类型(参见，例如，Rachmawati,H.(2007年5月)Drug Met.Dist.35(5):814-21)，并且IL-10药代动力学和给药原理的利用可以证明这种努力的成功是无价的。
本公开考虑引起上述任何IL-10血清谷浓度维持的任何剂量施用和给药方案。举例来说，但不是限制，当受试者为人时，可以按高于0.5μg/kg/日、高于1.0μg/kg/日、高于2.5μg/kg/日、高于5μg/kg/日、高于7.5μg/kg、高于10.0μg/kg、高于12.5μg/kg、高于15μg/kg/日、高于17.5μg/kg/日、高于20μg/kg/日、高于22.5μg/kg/日、高于25μg/kg/日、高于30μg/kg/日或高于35μg/kg/日的剂量施用非聚乙二醇化hIL-10。另外，举例来说，但不是限制，当受试者为人时，可以按高于0.5μg/kg/日、高于0.75μg/kg/日、高于1.0μg/kg/日、高于1.25μg/kg/日、高于1.5μg/kg/日、高于1.75μg/kg/日、高于2.0μg/kg/日、高于2.25μg/kg/日、高于2.5μg/kg/日、高于2.75μg/kg/日、高于3.0μg/kg/日、高于3.25μg/kg/日、高于3.5μg/kg/日、高于3.75μg/kg/日、高于4.0μg/kg/日、高于4.25μg/kg/日、高于4.5μg/kg/日、高于4.75μg/kg/日或高于5.0μg/kg/日的剂量施用包含相对较小的PEG的聚乙二醇化hIL-10(例如，5kDa单-PEG-hIL-10、二-PEG-hIL-10)。
虽然前面关于IL-10血清浓度，达到特定IL-10血清浓度所必需的剂量和治疗方案等的讨论涉及用IL-10药剂(例如PEG-IL-10)的单一疗法，但是当IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与一种或多种附加疗法组合施用时，熟练的技术人员(例如，药理学家)能够确定最佳给药方案。
IL-10的生成方法
本公开的多肽可以通过任何合适的方法生成，包括非重组(例如，化学合成)和重组方法。
A.化学合成
在化学合成多肽的情况下，合成可以通过液相或固相进行。固相肽合成(SPPS)允许并入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质骨架修饰。各种形式的SPPS如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁基氧基羰基(Boc)，可用于合成本公开的多肽。化学合成的详情是本领域已知的(例如，Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；和Camarero J.A.等，(2005)Protein Pept Lett.12:723-8)。
可以如下所述进行固相肽合成。α功能(Nα)和任何反应性侧链用酸不稳定或碱不稳定基团保护。保护基团在连接酰胺键的条件下是稳定的，但是可以容易地裂解而不损害已经形成的肽链。α-氨基官能团的合适保护基团包括但不限于：Boc、苄氧基羰基(Z)、O-氯苄氧基羰基、二苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧基羰基、邻-硝基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧基-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)等。
合适的侧链保护基包括但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧基羰基(Z)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基甲基(Bom)、邻溴苄氧基羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄氧基羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，C-端氨基酸偶联于合适的载体材料。合适的载体材料是对于合成过程的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件为惰性并且不溶于所使用的反应介质中的载体材料。可商购获得的载体材料的实例包括已经用反应性基团和/或聚乙二醇改性的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；等等。当期望制备肽酸时，可以使用聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或经4-苄氧基苄醇(Wang-锚定剂)或2-氯三苯甲基氯衍生化的在肽酰胺的情况下，可以使用聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或经5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚定剂)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基(Rink酰胺锚定剂)衍生化的
可在室温或高温下(例如介于40℃和60℃之间)和例如2至72小时的反应时间下，通过在乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中添加活化试剂，使C-端受Fmoc-保护的氨基酸与载体材料反应来实现与聚合物载体的连接。
Nα保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚定剂的偶联可以例如借助偶联试剂如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其它碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)或其它脲盐、O-酰基-脲、苯并三唑-1-基-三吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(PyBOP)或其它鏻盐、N-羟基琥珀酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟，在存在或不存在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑的情况下进行，例如，借助于添加了HOBt的TBTU，在添加或不添加碱例如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉(例如二异丙基乙胺)的情况下进行，反应时间为2-72小时(例如，在1.5至3倍过量的氨基酸和偶联试剂中，例如2倍过量且在约10℃至50℃之间，例如25℃的温度下，在溶剂如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷例如二甲基甲酰胺中为3小时)。
代替偶联试剂，在上述情况下也可以使用活性酯(例如五氟苯基、对硝基苯基等)、Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酰基氯或酰基氟。
Nα保护的氨基酸(例如Fmoc氨基酸)可以在添加了DIEA的二氯甲烷中与2-氯三苯甲基树脂偶联且反应时间为10至120分钟，例如20分钟，但不限于使用这种溶剂和这种碱。
受保护的氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中的常规方法进行，通常是在自动肽合成仪中进行。通过用例如于二甲基甲酰胺中的哌啶(10％至50％)处理5至20分钟，例如用50％于DMF中的哌啶处理2×2分钟和用20％于DMF中的哌啶处理1×15分钟，裂解固相上偶联氨基酸的Nα-Fmoc保护基团之后，使3至10倍过量(例如10倍过量)的下一受保护的氨基酸与惰性、非水性、极性溶剂如二氯甲烷、DMF或二者的混合物中的前一氨基酸，在约10℃至50℃(例如25℃)的温度下偶联。前面提到的用于使第一Nα-Fmoc氨基酸与PAL、Wang或Rink锚定剂偶联的试剂适合作为偶联试剂。受保护的氨基酸的活性酯或其氯化物或氟化物或对称酸酐也可以用作替代物。
在固相合成结束时，肽从载体材料上裂解，同时裂解侧链保护基团。可用三氟乙酸或其它强酸性介质，添加5％-20％V/V的清除剂如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、茴香硫醚、硫代甲酚、间甲酚、茴香醚乙二硫醇、苯酚或水，例如15％v/v的1:1:1二甲基硫醚/乙二硫醇/间甲酚，在0.5至3小时，例如2小时内进行裂解。具有完全受保护的侧链的肽通过用2:2:6的冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷裂解2-氯三苯甲基锚定剂得到。受保护的肽可以通过硅胶色谱法纯化。如果肽通过Wang锚定剂与固相连接并且如果打算获得具有C端烷基酰胺化的肽，则可以通过用烷基胺或氟烷基胺氨解来进行裂解。氨解在约-10℃至50℃(例如约25℃)的温度下进行，并且反应时间介于约12至24小时之间(例如，约18小时)。另外，可以通过例如用甲醇再酯化使肽从载体上裂解。
所获得的酸性溶液可以与3至20倍量的冷醚或正己烷，例如10倍过量的乙醚混合，以便使肽沉淀并因此分离留在醚中的清除剂和裂解的保护基团。可以通过使肽从冰醋酸中重新沉淀数次来进行进一步纯化。得到的沉淀物可以放入水或叔丁醇或两种溶剂的混合物，例如叔丁醇/水的1:1混合物中，并冷冻干燥。
得到的肽可以通过各种色谱方法纯化，包括在乙酸盐形式的弱碱性树脂上进行离子交换；在非衍生化的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如，XAD)上进行疏水性吸附色谱法；在硅胶上进行吸附色谱法；离子交换色谱法，例如在羧甲基纤维素上；分配色谱法，例如在G-25上；逆流分配色谱法；或高压液相色谱法(HPLC)，例如在辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ODS)相上的反相HPLC。
B.重组生成
描述人和小鼠IL-10的制备的方法可以在例如美国专利第5,231,012号中找到，其教导了用于生成具有IL-10活性的蛋白质的方法，包括重组和其它合成技术。IL-10可以是病毒来源的，并且在Moore等(1990)Science 248:1230中公开了来自埃-巴二氏病毒(BCRF1蛋白)的病毒IL-10的克隆和表达。可以使用本领域已知的标准技术，例如本文描述的那些技术，以多种方式获得IL-10。重组人IL-10也是可商购获得的，例如来自PeproTech,Inc.,Rocky Hill,N.J。
当使用重组技术生成多肽时，可以使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞生成呈胞内蛋白或分泌蛋白的多肽，宿主细胞可以分别是原核或真核细胞的，如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。当使用哺乳动物宿主细胞时，它们可以包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类细胞(例如Cos 1、Cos 7和CV1)；和仓鼠细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
根据本领域已知的标准程序，可以使用各种适于表达多肽的宿主-载体系统。参见，例如，Sambrook等，1989Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press,New York；和Ausubel等，1995Current Protocols in Molecular Biology，Wiley和Sons编辑。将遗传物质引入宿主细胞的方法包括，例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等。可以选择转移的方法以便提供引入的编码多肽的核酸的稳定表达。编码多肽的核酸可以作为可遗传的附加体元件(例如质粒)提供或者可以基因组整合。用于生成目标多肽的各种适当载体是可商购获得的。
载体可以提供宿主细胞内的染色体外维持或者可以提供向宿主细胞基因组的整合。表达载体提供转录和翻译调控序列，并且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。通常，转录和翻译调控序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化子序列。启动子可以是组成型或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如T7)。
表达构建体通常具有位于启动子序列附近的合宜限制性位点，以提供编码目标蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中具操作性的选择性标记以利于对含有该载体的细胞的选择。而且，表达构建体可以包括附加元件。例如，表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而使其保持在生物体中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中用于表达及在原核宿主中用于克隆和扩增。另外，表达构建体可以含有选择性标记基因以允许选择已转化的宿主细胞。选择基因在本领域中是公知的并且将随所用的宿主细胞而变化。
蛋白质的分离和纯化可根据本领域已知的方法完成。例如，可以从经遗传修饰以组成性地和/或在诱导后表达蛋白质的细胞裂解物中分离蛋白质，或者通过免疫亲和纯化从合成反应混合物中分离蛋白质，免疫亲和纯化通常涉及使样品与抗蛋白质抗体接触，洗涤去除非特异性结合的物质，以及洗脱特异性结合的蛋白质。分离的蛋白质可以通过透析和通常用于蛋白质纯化的其它方法进一步纯化。在一个实施方案中，可以使用金属螯合色谱法分离蛋白质。蛋白质可含修饰以利于分离。
可以制备呈基本上纯或分离的形式(例如不含其它多肽)的多肽。该多肽可以存在于组合物中，该组合物相对于可以存在的其它组分(例如，其它多肽或其它宿主细胞组分)而言富含该多肽。例如，可以提供纯化多肽，使得多肽存在于基本上不含其它表达蛋白，例如小于约90％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或小于约1％的其它表达蛋白的组合物中。
可以使用重组技术来生成IL-10多肽，以操作本领域已知的不同的IL-10相关核酸以提供能够编码IL-10多肽的构建体。应认识到，当提供特定氨基酸序列时，普通技术人员鉴于其背景和经验，例如分子生物学，将会识别各种编码此类氨基酸序列的不同核酸分子。
酰胺键取代
在一些情况下，IL-10包括除肽键以外的一个或多个键联，例如至少两个相邻的氨基酸通过除酰胺键以外的键联连接。例如，为了减少或消除不期望的蛋白水解或其它降解方式，和/或增加血清稳定性，和/或限制或增加构象灵活性，可以取代IL-10骨架内的一个或多个酰胺键。
在另一个实例中，IL-10中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)可以被是酰胺键的电子等排体的键联置换，例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-。IL-10中的一个或多个酰胺键也可以被例如还原的电子等排体假肽键置换。参见Couder等(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184。此类置换及其实现方式是本领域普通技术人员已知的。
氨基酸取代
可以在IL-10多肽中产生一个或多个氨基酸取代。以下是非限制性的实例：
a)取代经烷基取代的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或其它简单α-氨基酸被来自C1-C10碳的脂肪族侧链取代，包括支链、环状和直链烷基、烯基或炔基取代；
b)取代经芳香族取代的疏水性氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸，包括上述芳族氨基酸的经氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(来自C1-C4)取代的形式，其说明性实例为：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸，2-、3-或4-氯苯丙氨酸，2-、3-或4-甲基苯丙氨酸，2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸，5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色氨酸，2'-、3'-或4'-氨基-，2'-、3'-或4'-氯-，2、3或4-联苯基丙氨酸，2'-、3'-或4'-甲基-，2-、3-或4-联苯基丙氨酸和2-或3-吡啶基丙氨酸；
c)取代含有碱性侧链的氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括前述氨基酸经烷基、烯基或芳基取代的(C1-C10支链、直链或环状)衍生物，无论取代是否是在杂原子上(例如α氮或远端的一个或多个氮上，或在α碳上，例如在前-R位上)。作为说明性实例的化合物包括：N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括其中烷基占据α-碳的前-R位的化合物，例如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸。还包括由烷基、芳香族、杂芳族(其中杂芳族基团单独或组合地具有一个或多个氮、氧或硫原子)、羧酸或许多公知的活化衍生物中的任一种如酰基氯、活性酯、活性偶氮杂环(azolide)及相关衍生物，以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸；
d)取代酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、2,4-二氨基丙酸、鸟氨酸或赖氨酸的烷基、芳基、芳烷基和杂芳基磺酰胺及四唑取代的烷基氨基酸；
e)取代侧链酰胺残基，包括天冬酰胺、谷氨酰胺及天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳香族取代的衍生物；及
f)取代含羟基的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸和丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳香族取代的衍生物。
在一些情况下，IL-10包含一种或多种天然存在的非遗传编码的L-氨基酸、合成的L-氨基酸或氨基酸的D-对映体。例如，IL-10可以仅包含D-氨基酸。例如，IL-10多肽可以包含一个或多个以下残基：羟脯氨酸、β-丙氨酸、邻-氨基苯甲酸、间-氨基苯甲酸、对-氨基苯甲酸、间-氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、rho-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基十四酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。
另外的修饰
可以向IL-10多肽中引入半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物以通过二硫键提供与另一个肽的键联或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法是本领域已知的；参见，例如美国专利第8,067,532号。
IL-10多肽可以环化。可以向IL-10多肽中引入一个或多个半胱氨酸或半胱氨酸类似物，其中引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物可与引入的第二个半胱氨酸或半胱氨酸类似物形成二硫键。其它环化方式包括引入肟接头或羊毛硫氨酸接头；参见，例如美国专利第8,044,175号。可以使用和/或引入可形成环化键的氨基酸(或非氨基酸部分)的任何组合。可以用具有允许引入桥的官能团的氨基酸(或氨基酸和-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-)的任何组合来生成环化键。一些实例为二硫化物、二硫化物模拟物例如-(CH2)n-碳桥、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)及含有酯和醚的桥。在这些实例中，n可以是任何整数，但通常小于十。
其它修饰包括例如N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或主链与构建体内酰胺和其它环状结构的交联。其它衍生物包括C端羟甲基衍生物、o-修饰的衍生物(例如，C端羟甲基苄基醚)、N端修饰的衍生物，包括经取代的酰胺如烷基酰胺和酰肼。
在一些情况下，IL-10多肽中的一个或多个L-氨基酸被一个或多个D-氨基酸置换。
在一些情况下，IL-10多肽是逆反类似物(retroinverso analog)(参见，例如Sela和Zisman(1997)FASEB J.11:449)。逆反肽类似物是线性多肽的异构体，其中氨基酸序列的方向被逆转(逆向)，并且例如使用D-氨基酸而不是L-氨基酸使其中一个或多个氨基酸的手性(D或L)反转(反向)。[参见，例如Jameson等(1994)Nature 368:744；和Brady等(1994)Nature 368:692]。
IL-10多肽可包括“蛋白质转导结构域”(PTD)，其指的是利于穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机分子。连接到另一分子的PTD利于分子穿过膜，例如从细胞外空间到细胞内空间，或从细胞溶质到细胞器内。在一些实施方案中，PTD与IL-10多肽的氨基末端共价连接，而在其它实施方案中，PTD与IL-10多肽的羧基末端共价连接。示例性蛋白质转导结构域包括但不限于最小十一氨基酸多肽的蛋白质转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT的残基47-57；SEQ ID NO:1)；包含许多足以引导进入细胞的精氨酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10个或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22结构域(Zender等(2002)Cancer Gene Ther.9(6):489-96)；果蝇触角足蛋白转导结构域(Noguchi等(2003)Diabetes 52(7):1732-1737)；截短的人降钙素肽(Trehin等(2004)Pharm.Research 21:1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13003-13008)；RRQRRTSKLMKR(SEQ ID NO：2)；穿膜肽GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：3)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQ ID NO：4)；和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：5)。示例性的PTD包括但不限于YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)、RKKRRQRRR(SEQ ID NO:6)；从3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性的PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下任一种：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO:7)；YARAAARQARA(SEQ ID NO:8)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO:9)；和GGRRARRRRRR(SEQ ID NO:10)。
在IL-10多肽C末端处的氨基酸的羧基COR3可以呈游离形式(R3＝OH)或呈生理学耐受的碱或碱土金属盐(例如钠盐、钾盐或钙盐)的形式存在。羧基还可以与伯醇、仲醇或叔醇例如甲醇、支链或无支链的C1-C6-烷基醇例如乙醇或叔丁醇酯化。羧基也可以用伯胺或仲胺如氨，支链或无支链的C1-C6-烷基胺或C1-C6二烷基胺例如甲胺或二甲胺进行酰胺化。
在IL-10多肽的N-末端处的氨基酸NR1R2的氨基可以呈游离形式(R1＝H且R2＝H)或呈生理学耐受的盐(例如氯化物或乙酸盐)的形式存在。氨基也可以用酸乙酰化，使得R1＝H且R2＝乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以呈受到肽化学中常规使用的氨基保护基，例如上文提供的那些(例如Fmoc、苄氧基-羰基(Z)、Boc和Alloc)保护的形式存在。氨基可以N-烷基化，其中R1和/或R2＝C1-C6烷基或C2-C8烯基或C7-C9芳烷基。烷基可以是直链、支链或环状的(例如分别为乙基、异丙基和环己基)。
增强和/或模拟IL-10功能的特定修饰
改善本文公开的治疗方式(例如，IL-10)的一种或多种物理性质和/或其施用方式中的通常是有益的，并且有时是必要的。物理性质的改善包括，例如调节免疫原性；增加水溶性、生物利用率、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰也可用于，例如产生用于检测测定的抗体(例如表位标签)并提供蛋白质纯化的便利。通常必须赋予此类改善，而不会对治疗方式的生物活性产生不利影响和/或增加其免疫原性。
IL-10的聚乙二醇化是本公开所考虑的一种特定修饰，而其它修饰包括但不限于糖基化(N-和O-连接的)；聚唾液酸化；包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)，猕猴血清白蛋白(cyno serum albumin)或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子；通过例如缀合的脂肪酸链结合白蛋白(酰化)；及Fc-融合蛋白。
聚乙二醇化：蛋白质治疗剂的临床有效性常常受血浆半衰期短和蛋白酶降解易感性的限制。对各种治疗性蛋白质(例如，非格司亭(filgrastim))的研究已经证实可以通过各种修饰来克服此类困难，包括使多肽序列缀合或连接至各种非蛋白聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯中的任一种。这通常通过共价结合蛋白质和非蛋白聚合物(例如PEG)的连接部分实现。已经证实此类PEG-缀合的生物分子具有临床上有用的性质，包括物理和热稳定性更佳，防止酶促降解的易感性，溶解性增加，体内循环半衰期更长和清除率降低，免疫原性和抗原性降低以及毒性降低。
除了聚乙二醇化对药代动力学参数的有益作用之外，聚乙二醇化本身还可以增强活性。例如，已证实PEG-IL-10比未聚乙二醇化的IL-10对某些癌症更有效(参见，例如EP206636A2)。
适合与多肽序列缀合的PEG通常在室温下可溶于水，并具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R为氢或保护基团如烷基或烷醇基团，并且其中n是1至1000的整数。当R为保护基团时，它通常具有1至8个碳。与多肽序列缀合的PEG可为直链或支链。本公开考虑了支链PEG衍生物、“星形-PEG”和多臂PEG。本公开中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围，并且在本文其它地方列出了实例；举例来说，某些实施方案具有介于5kDa和20kDa之间的分子量，而其它实施方案具有介于4kDa和10kDa之间的分子量。
本公开还考虑了缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，并且因此各种不同的PEG以特定比例存在。例如，一些组合物包含其中n＝1、2、3和4的缀合物的混合物。在一些组合物中，其中n＝1的缀合物的百分比为18-25％，其中n＝2的缀合物的百分比为50-66％，其中n＝3的缀合物的百分比为12-16％，以及其中n＝4的缀合物的百分比高达5％。此类组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法来生成。整个说明书中描述了示例性反应条件。可以使用阳离子交换色谱法分离缀合物，然后鉴定含有具有(例如)期望数量的连接PEG的缀合物的级分，从未经修饰的蛋白质序列中和从具有其它数量的连接PEG的缀合物中纯化。
聚乙二醇化最常发生在多肽N末端的α氨基、赖氨酸残基侧链的ε氨基和组氨酸侧链上的咪唑基处。由于大多数重组多肽具有单个α氨基和多个ε氨基和咪唑基团，所以根据接头化学性质可以产生许多位置异构体。本领域已知的一般聚乙二醇化策略可以在本文中应用。
两种广泛使用的第一代活化单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如Zalipsky等(1992)Biotehnol.Appl.Biochem 15:100-114；及Miron和Wilcheck(1993)Bio-conjug.Chem.4:568-569)和苯并三唑碳酸酯PEG(BTC-PEG；参见，例如Dolence等，美国专利第5,650,234号)，其优先与赖氨酸残基反应形成氨基甲酸酯键联，但也已知会与组氨酸和酪氨酸残基反应。已经证实与某些分子(例如，IFNα)上的组氨酸残基的键联是水解不稳定的咪唑氨基甲酸酯键联(参见例如Lee和McNemar，美国专利第5,985,263号)。已经设计了第二代聚乙二醇化技术以避免这些不稳定的键联，以及在残留物反应性方面的选择性缺乏。使用PEG-醛接头通过还原胺化作用靶向多肽N-末端的单个位点。
PEG可以经由介导一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键的末端反应性基团(“间隔区”)与本公开的多肽结合。具有可与游离氨基结合的间隔区的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，其可通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯而制得。另一种可与游离氨基结合的活化聚乙二醇是2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应而制得。与游离羧基结合的活化聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。
本公开的一种或多种多肽序列与具有间隔区的PEG的缀合可以通过各种常规方法进行。例如，缀合反应可以在pH为5至10的溶液中，在4℃至室温的温度下，利用摩尔比为4:1至30:1的试剂与蛋白质进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以指导反应主要产生期望的取代度。通常，低温、低pH(例如，pH＝5)和短反应时间往往会减少连接的PEG的数量，而高温、中性至高pH(例如，pH≥7)和更长的反应时间往往会增加连接的PEG的数量。可以使用本领域已知的各种手段来终止反应。在一些实施方案中，通过酸化反应混合物并在例如-20℃冷冻而终止反应。各种分子的聚乙二醇化在例如美国专利第5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462和5,985,263号中有讨论。在例如美国专利第7,052,686号中描述了PEG-IL-10。考虑用于本文的具体反应条件在实验部分中列出。
本公开还考虑使用PEG模拟物。已经开发了重组PEG模拟物，其保留了PEG的属性(例如，增加的血清半衰期)，同时赋予了几种附加有利性质。举例来说，能够形成类似于PEG的延伸构象的简单多肽链(包含，例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)可以重组生成，已经与目标肽或蛋白质药物融合(例如，Amunix的XTEN技术；Mountain View,CA)。这避免了在生产过程中对附加缀合步骤的需要。而且，建立的分子生物学技术能够控制多肽链的侧链组成，从而允许优化免疫原性和生产性质。
糖基化：为了本公开的目的，“糖基化”意在广泛地指将聚糖连接至蛋白质、脂质或其它有机分子的酶促过程。连同本公开一起使用术语“糖基化”通常旨在表示添加或缺失一个或多个碳水化合物部分(通过去除潜在糖基化位点或通过用化学和/或酶促手段使糖基化位点缺失)和/或添加可能存在或可能不存在于天然序列中的一个或多个糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白质糖基化的质变，质变涉及存在的各种碳水化合物部分的特性和比例的变化。
糖基化可显著影响多肽例如IL-10的物理性质(例如溶解性)，并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也可能是重要的。糖基化多肽还可以表现出增强的稳定性或者可以改善一种或多种药代动力学性质，例如半衰期。另外，溶解性改善可以，例如，使得能够产生比包含非糖基化多肽的制剂更适合于药物施用的制剂。
糖基化位点的添加可以通过改变氨基酸序列来完成。例如，可以通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点而言)或天冬酰胺残基(对于N-连接的糖基化位点而言)或用其取代来进行对多肽的改变。N-连接的和O-连接的寡糖的结构和在每种类型中发现的糖残基可以不同。在两者上通常发现的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(以下称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和O-连接的寡糖的末端残基，并且凭借其负电荷，可以赋予糖蛋白酸性。本公开的特定实施方案包括N-糖基化变体的生成和使用。
本公开的多肽序列可以任选地通过核酸水平的变化而改变，特别是通过使编码多肽的核酸在预选碱基处突变，从而产生将会翻译成期望的氨基酸的密码子。
聚唾液酸化：本公开还考虑使用聚唾液酸化，将多肽与天然存在的、可生物降解的α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)缀合以改善多肽的稳定性和体内药代动力学。PSA是一种可生物降解的、无毒天然聚合物，其具有高度亲水性，赋予在血液中的高表观分子量，这增加了其血清半衰期。另外，一系列肽和蛋白质治疗剂的聚唾液酸化导致蛋白水解明显降低，体内活性保持，且免疫原性和抗原性降低(参见，例如G.Gregoriadis等，Int.J.Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。用于定点聚唾液酸化的各种技术可用(参见，例如T.Lindhout等，PNAS 108(18)7397-7402(2011))。
白蛋白融合：用于缀合的附加合适组分和分子包括白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
根据本公开，白蛋白可以在羧基末端、氨基末端、羧基末端和氨基末端以及内部与药物分子(例如，本文描述的多肽)缀合(参见，例如USP 5,876,969和USP 7,056,701)。
在本公开所考虑的HSA-药物分子缀合物中，可以使用各种形式的白蛋白，例如白蛋白分泌前序列(pre-sequence)及其变体、其片段和变体以及HSA变体。此类形式通常具有一种或多种期望的白蛋白活性。在另外的实施方案中，本公开涉及包含直接或间接与白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等融合的多肽药物分子的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有比未融合药物分子更高的血浆稳定性，和/或融合蛋白保持了未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，间接融合是通过接头，如肽接头或其修饰形式实现的。
如上所述，白蛋白与本公开的一种或多种多肽的融合可以，例如通过基因操纵实现，使得编码HSA或其片段的核酸与编码所述一个或多个多肽序列的核酸连接。
替代性白蛋白结合策略：已经开发了几种白蛋白-结合策略作为直接融合的替代方案并且可以与本文描述的IL-10药剂一起使用。举例来说，本公开考虑了通过缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合和包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和本文描述的一种或多种多肽的序列的融合蛋白结合白蛋白。
与其它分子缀合：用于缀合的附加合适组分和分子包括，例如甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)的聚氨基酸；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血球凝集素、流感病毒核蛋白；钥孔血蓝素(KLH)；和乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述的任何组合。
因此，本公开考虑在多肽序列的N-和/或C-末端缀合一个或多个附加组分或分子，例如另一多肽(例如，具有与受试者多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以作为与另一组分或分子的缀合物提供。
IL-10多肽也可以与大的、缓慢代谢的大分子如蛋白质；多糖如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠粒；聚合氨基酸如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒粒子；灭活的细菌毒素，例如来自白喉、破伤风、霍乱或白细胞毒素分子的类毒素；灭活的细菌；和树突细胞缀合。如果需要，此类缀合形式可用于产生针对本公开多肽的抗体。
用于偶联的附加候选组分和分子包括适合于分离或纯化的那些。特定的非限制性实例包括结合分子，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁珠、测试条和膜。
Fc-融合分子：在某些实施方案中，本公开多肽序列的氨基或羧基末端可以与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已经证实Fc融合缀合物会增加生物药物的全身性半衰期，并且因此生物药物产品可能需要低频率施用。
Fc与血管内衬的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)结合，并且在结合后，Fc融合分子被保护免于降解并重新释放到循环中，从而保持分子循环更长。据信这种Fc结合是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，最近的Fc-融合技术将生物药物的单个拷贝连接到抗体的Fc区域以优化生物药物的药代动力学和药效学性质。
其它修饰：本公开考虑使用当前已知或未来开发的其它IL-10修饰来改善一种或多种性质。实例包括羟乙基淀粉化，其各个方面在例如美国专利申请第2007/0134197和2006/0258607号中有描述，及包含作为融合标签的SUMO的融合分子(LifeSensors,Inc.；Malvern,PA)。
接头：上面已经描述了接头及其用途。用于修饰本公开多肽序列的前述组分和分子中的任一种可以任选地经由接头缀合。合适的接头包括“柔性接头”，其通常具有足够的长度以容许在经修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间的一些移动。接头分子通常长约6-50个原子。接头分子也可以是，例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择并且可以具有任何合适的长度，例如1个氨基酸(例如，Gly)，2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50个或超过50个氨基酸。
柔性接头的实例包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GmSo)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:11)、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n(SEQ ID NO:12)、(GSGGSm)n(SEQ ID NO:11)、(GSGSmG)n(SEQ ID NO:12)和(GGGSm)n(SEQ ID NO:13)及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1至20的整数，例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以作为组分之间的中性系链。柔性接头的实例包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:14)、GGSGG(SEQ ID NO:15)、GSGSG(SEQ ID NO:12),GSGGG(SEQID NO:16)、GGGSG(SEQ ID NO:17)和GSSSG(SEQ ID NO:18)。
柔性接头的其它实例包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:11)、(GGGS)n(SEQ ID NO:13)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:19)，其中n＝1至50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50)。示例性的柔性接头包括但不限于GGGS(SEQ ID NO:13)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGSG(SEQ ID NO:14)、GGSGG(SEQ IDNO:15)、GSGSG(SEQ ID NO:12)、GSGGG(SEQ ID NO:16)、GGGSG(SEQ ID NO:17)和GSSSG(SEQID NO:18)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起以提供可以用于将异源氨基酸序列缀合至本文公开的IL-10药剂的柔性接头。如本文所述，异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合伴侣，例如白蛋白、Fc序列等。
治疗和预防用途
本公开考虑使用本文描述的IL-10药剂(例如PEG-IL-10)来预防或降低进行CAR-T细胞疗法的患者中活化诱导的细胞死亡的严重程度。更具体地，IL-10药剂用于涉及调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡。
在特定实施方案中，足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂通过肠胃外(例如皮下)施用给受试者。在其它实施方案中，将治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的细胞和足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂引入受试者体内。还有另外的实施方案中，借助于经遗传修饰以表达IL-10药剂的细胞将足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂引入受试者体内，由此表达构建体存在于与表达CAR的细胞不同的细胞中。
编码IL-10药剂的遗传物质可以通过本领域技术人员已知的任何方式引入细胞中。两类主要的方法是使用重组病毒(也称为病毒载体)的方法和使用裸DNA或DNA复合物的方法(非病毒方法)。可以使用的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒。非病毒方法的实例包括但不限于注射裸DNA，增强递送的物理方法(例如，电穿孔)和增强递送的化学方法(例如，脂质复合物(lipoplex))。
在本公开的某些实施方案中，载体(例如，病毒载体)经基因工程化以递送基因。载体可以静脉内给予或直接注射到体内的特定组织中，在那里载体被单个的细胞摄取。可选地，可以取出受试者的一部分细胞并在离体环境中暴露于载体，接着将含有载体的细胞放回到患者体内。在特定实施方案中，IL-10药剂的表达受表达控制元件调节。
连同本文描述的IL-10药剂一起使用的CAR-T细胞疗法可以用于治疗或预防增殖性疾病、病症或病状，包括癌症，例如子宫癌、子宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胃肠道癌(例如食管癌、口咽癌、胃癌、小肠癌或大肠癌、结肠癌或直肠癌)、肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、皮肤癌、头颈癌、肝癌、胆囊癌、心癌、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、脑癌(例如神经胶质瘤)、神经节癌、中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)癌症及造血系统和免疫系统(例如脾或胸腺)的癌症。本公开还提供了治疗或预防其它癌症相关的疾病、病症或病状的方法，所述其它癌症相关的疾病、病症或病状包括例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导的癌症(例如，上皮细胞癌，内皮细胞癌，鳞状细胞癌和乳头瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤、癌瘤、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学诱导的癌症、转移癌和血管生成。本公开考虑降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性，例如通过调节调节性T细胞和/或CD8+T细胞的活性(参见，例如Ramirez-Montagut等(2003)Oncogene22:3180-87；及Sawaya等(2003)New Engl.J.Med.349:1501-09)。在特定实施方案中，肿瘤或癌症是结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤或白血病。术语癌症相关的疾病、病症和病状的使用意在广义地指与癌症直接或间接相关的病状，并且包括，例如血管生成和癌前期状态例如发育异常。
在其它实施方案中，连同本文描述的IL-10药剂一起使用的CAR-T细胞疗法可用于治疗或预防免疫/炎症相关的病症。如本文中所用，诸如“免疫性疾病”、“免疫性病状”、“免疫性病症”、“炎性疾病”、“炎性病状”、“炎性病症”等术语意在广义地涵盖任何免疫或炎症相关的病状(例如，病理性炎症和自身免疫性疾病)。此类病状经常与其它疾病、病症和病状密不可分。举例来说，“免疫性病状”可指增殖性病状，例如癌症、肿瘤和血管生成；包括抵抗受免疫系统根除的感染(急性和慢性)、肿瘤和癌症。
免疫和炎症相关的疾病、病症和病状的非限制性列表包括关节炎(例如类风湿性关节炎)、肾衰竭、狼疮、哮喘、牛皮癣、结肠炎、胰腺炎、变态反应、纤维化、手术并发症(例如，其中炎性细胞因子防止愈合)、贫血和纤维肌痛。可能与慢性炎症相关的其它疾病和病症包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、充血性心力衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、动脉硬化、骨质疏松症、帕金森病(Parkinson's disease)、感染、炎症性肠病(例如，克罗恩病和溃疡性结肠炎)、变应性接触性皮炎和其它湿疹、全身性硬化、移植和多发性硬化。
药物组合物
向受试者施用IL-10药剂时，本公开考虑使用适于向受试者施用的任何形式的组合物。通常，此类组合物是包含IL-10和一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。药物组合物可用于本公开的方法中；因此，例如，药物组合物可以离体或在体内施用于受试者以便实践本文描述的治疗和预防方法及用途。
可以将本公开的药物组合物配制成与预期施用方法或途径相容；本文阐述了示例性的施用途径。此外，药物组合物可以与本文描述的其它治疗活性剂或化合物组合使用，以便治疗或预防本公开所考虑的疾病、病症和病状。
药物组合物通常包含治疗有效量的本公开所考虑的IL-10药剂和一种或多种药学和生理上可接受的配方药剂。合适的药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶剂、填料、填充剂、去污剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充有用于肠胃外施用的药物组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。本领域技术人员将容易地认识到可用于本文考虑的药物组合物和剂型中的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。例如，缓冲剂组分可以是水溶性物质，如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括，例如Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在配制药物组合物后，可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉储存在无菌小瓶中。此类制剂可以呈即用形式、使用前需要复水的冻干形式、使用前需要稀释的液体形式或其它可接受的形式储存。在一些实施方案中，在一次性使用的容器(例如，一次性使用的小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于，例如))中提供药物组合物，而在其它实施例中提供了多次使用的容器(例如，多次使用的小瓶)。任何药物递送装置均可用于递送IL-10，包括植入物(例如，可植入式泵)和导管系统、缓慢注射泵和装置，其全部都是本领域技术人员公知的。通常通过皮下或肌内施用的积存注射剂也可用于在限定时间段内释放本文公开的多肽。积存注射剂通常是基于固体或油的，并且通常包含本文所列制剂组分中的至少一种。本领域的普通技术人员熟悉积存注射剂的可能配方和用途。
药物组合物可以呈无菌注射水性或油性悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术使用本文提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、等渗氯化钠溶液、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。另外，按照惯例将无菌、固定油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成甘油一酯或甘油二酯。而且，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。通过包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)可以实现特定注射制剂的长期吸收。
含有活性成分的药物组合物可以呈适于口服使用的形式，例如片剂、胶囊、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊或糖浆剂、溶液、微珠或酏剂。在特定实施方案中，与本文描述的IL-10药剂共同施用的药剂的活性成分呈适于口服使用的形式。旨在用于口服使用的药物组合物可以根据本领域已知用于生产药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可含一种或多种药剂，例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂以提供药学上精致且可口的制剂。片剂、胶囊等含有与适于生产片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶，及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
适于口服施用的片剂、胶囊剂等可以无包衣或通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供持续作用。例如，可采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以通过本领域已知的技术包衣以形成用于控释的渗透性治疗片剂。其它药剂包括生物可降解的或生物相容的颗粒或聚合物质如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物，或乙烯乙酸乙烯酯共聚物以控制所施用的组合物的递送。例如，口服药剂可以包封在微胶囊或胶体药物递送系统中，微胶囊通过凝聚技术或通过界面聚合制备，分别通过使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。胶体分散系统包括大分子复合物，纳米胶囊、微球、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。制备上面提到的制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。
供口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊呈现，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合，或作为软明胶胶囊呈现，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮液含有与适于其生产的赋形剂混合的活性物质。此类赋形剂可以是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇)，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。
油性悬浮液可通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂例如上面列出的甜味剂，及调味剂以提供可口的口服制剂。
适于通过加水制备水性悬浮液的可分散粉剂和粒剂提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文例举了合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，以及源自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脱水山梨糖醇酐单油酸酯；和偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酐单油酸酯。
制剂还可以包括载体以保护组合物免于从身体快速降解或消除，诸如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微胶囊化递送系统。例如，可以采用延时材料，例如单独的或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本公开考虑以直肠施用的栓剂形式施用IL-10多肽。栓剂可通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此在直肠中会融化以释放药物。此类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。
本公开所考虑的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)和其它药剂可以呈目前已知或未来开发的任何其它合适的药物组合物的形式(例如用于鼻腔或吸入用途的喷雾剂)。
制剂中的多肽(例如IL-10)或其片段的浓度可以广泛地变化(例如，按重量计从小于约0.1％，通常为或至少约2％到至多20％至50％或更高)，并且通常将主要基于流体体积、粘度和基于受试者的因素，根据例如所选择的特定施用模式来选择。
施用途径
本公开考虑以任何适当的方式施用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)及其组合物。适合的施用途径包括肠胃外(例如，肌内、静脉内、皮下(例如，注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(脑实质内)和脑室内)、口服、鼻、阴道、舌下、眼内、直肠、局部(例如，透皮)、舌下和吸入。通常通过皮下或肌内施用的积存注射剂也可用于在限定时间段内释放本文公开的IL-10药剂。
在本公开的一些特定实施方案中，在肠胃外施用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)，并且在其它特定实施方案中，肠胃外施用是经皮下的。
至于CAR-T细胞疗法，本文描述了向受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的细胞的替代方式，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡。
组合疗法
连同本文描述的CAR-T T细胞疗法，本公开考虑将IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与一种或多种活性剂(例如，化学治疗剂)或其它预防性或治疗性非药物学方式(例如，局部放射疗法或全身放射疗法)组合使用。举例来说，本公开考虑了其中在放射阶段之前或之后是用一种或多种附加疗法(例如，CAR-T T细胞疗法和施用IL-10药剂)或如本文所描述的药剂治疗的治疗方案。在一些实施方案中，本公开还考虑了将CAR-T T细胞疗法和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与骨髓移植、外周血干细胞移植或其它类型的移植疗法组合使用。
如本文中所用，“组合疗法”意在包括可以单独施用或引入，例如单独配制用于单独施用(例如，可以在试剂盒中提供)的疗法和可以一起施用或引入的疗法。在某些实施方案中，IL-10药剂和其它药剂依序施用或应用，例如，其中一种药剂在一种或多种其它药剂之前施用。在其它实施方案中，IL-10药剂和其它药剂同时施用，例如同时或大约同时施用两种或更多种药剂；两种或更多种药剂可以存在于两种或更多种单独制剂中或组合成单一制剂(即，共制剂)。无论药剂是依序施用还是同时施用，为了本公开的目的考虑将它们组合施用。
在所述情况下本公开的IL-10药剂可以以任何合适的方式与至少一种其它活性剂组合使用。在一个实施方案中，在一段时间内维持用IL-10药剂和其它药剂治疗。在另一个实施方案中，减少或中断用所述至少一种其它药剂治疗(例如，当受试者稳定时)，而用本公开的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的治疗维持在恒定给药方案。在另一个实施方案中，减少或中断用所述其它药剂治疗(例如，当受试者稳定时)，同时减少用本公开的IL-10药剂治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短治疗方案)。又一个实施方案中，减少或中断用所述其它药剂治疗(例如，当受试者稳定时)，并且增加用本公开的IL-10药剂治疗(例如，更高剂量、更频繁给药或更长治疗方案)。又一个实施方案中，维持用所述其它药剂治疗并且减少或中断用本公开的IL-10药剂治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短治疗方案)。又一个实施方案中，减少或中断用所述其它药剂治疗和用本公开的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短治疗方案)。
连同本文描述的CAR-T T细胞疗法，本公开提供了用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)和至少一种表现出期望活性的附加治疗剂或预防剂或诊断剂治疗和/或预防增殖性病状、癌症、肿瘤或癌前疾病、病症或病状的方法。本公开的一些实施方案考虑使用传统的化学治疗剂(例如，烷化剂、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、抗激素剂和紫杉烷)。本公开的其它实施方案考虑了肿瘤阻遏或肿瘤生长的方法，其包括与信号转导抑制剂(例如，GLEEVEC或HERCEPTIN)或免疫调节剂组合施用本文描述的IL-10药剂以实现对肿瘤生长的加和或协同阻遏。
连同本文描述的CAR-T T细胞疗法，本公开还提供了用IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)和至少一种表现出期望活性的附加药剂或诊断剂治疗和/或预防免疫和/或炎症相关的疾病、病症和病状，以及与之相关的病症的方法。用于组合疗法中的治疗剂的实例包括但不限于非甾体类抗炎药(NSAID)、环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、类固醇、TNF拮抗剂(例如，REMICADE和ENBREL)、干扰素-β1a(AVONEX)、干扰素-β1b(BETASERON)和免疫检查点抑制剂(例如，YERVOY)。
给药
本公开的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)可以按取决于以下因素的量向受试者施用，例如施用目标(例如，期望的消退程度)；施用该制剂的受试者的年龄、体重、性别及健康和身体状况；和施用途径。有效剂量和剂量方案可以容易地从例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如，动物模型)和本领域技术人员已知的其它方法确定。
如其它地方所详细讨论的，本公开考虑了其中施用IL-10以达到某些血清谷浓度和/或维持某些平均血清谷浓度的实施方案。
通常，给药参数规定剂量应小于对受试者可能具有不可逆毒性的量(即，最大耐受剂量，“MTD”)并且不小于对受试者产生可测效果所需的量。考虑到施用途径和其它因素，通过例如与ADME相关的药代动力学和药效学参数来确定此量。
有效剂量(ED)是在服用它的一部分受试者中产生治疗反应或期望效果的药剂的剂量或量。药剂的“半数有效剂量”或ED 50是在施用它的群体的50％中产生治疗反应或期望效果的药剂的剂量或量。虽然ED50通常用作药剂效果的合理期望值的度量，但临床医生在考虑所有相关因素后不一定认为该剂量合适。因此，在一些情形下，有效量可大于计算的ED50，在其它情形下，有效量可小于计算的ED50，并且在还有其它情形下，有效量可与计算的ED50相同。
PEG-IL-10的治疗有效量范围可为约0.01至约100μg蛋白质/kg体重/天，约0.1至20μg蛋白质/kg体重/天，约0.5至10μg蛋白质/kg体重/天，或约1至4μg蛋白质/kg体重/天。在一些实施方案中，通过连续输注施用PEG-IL-10以递送约50至800μg蛋白质/kg体重/天(例如，约1至16μg蛋白质/kg体重/天的PEG-IL-10)。输注速率可以根据例如不利影响和血细胞计数的评价而变化。本文其它地方描述了IL-10药剂的其它具体给药参数。
在某些实施方案中，公开的IL-10药剂的剂量含在“单位剂型”中。短语“单位剂型”是指物理离散单位，每个单位含有单独的或与一种或多种附加药剂组合的，足以产生期望效果的预定量的本公开的IL-10药剂。应该认识到，单位剂型的参数将取决于特定药剂和要达到的效果。
试剂盒
本公开还考虑了包含IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)及其药物组合物的试剂盒。试剂盒通常为容纳各种组分的物理结构的形式，如下所述，并且可用于例如实践上述方法。
试剂盒可以包括本文公开的(例如，无菌容器中提供的)IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)，IL-10药剂可以呈适于向受试者施用的药物组合物的形式。IL-10药剂可以呈即用形式提供，或者呈需要例如在施用前复水或稀释的形式提供。当IL-10药剂呈需要使用者复水的形式时，试剂盒还可以包括与IL-10药剂一起或单独包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。试剂盒还可含IL-10药剂和/或要使用的特定CAR-T T细胞疗法的组分；该试剂盒可以单独含有几种药剂或可将药剂已经组合在试剂盒中。本公开的试剂盒可设计用于适当地维持容纳在其中的组分(例如，冷藏或冷冻)所必需的条件。
试剂盒可含标签或包装插页，包括其中组分的鉴定信息及其使用说明书(例如，给药参数、活性成分的临床药理学性质，包括作用机理、药代动力学和药效学性质、不利影响、禁忌症等)。试剂盒的每种组分都可以封装在单独的容器内，并且所有的各种容器都可以处于单个包装内。标签或插页可以包括生产商信息，如批号和有效日期。标签或包装插入物可以，例如整合到容纳组分的物理结构中，单独含在物理结构中，或贴到试剂盒的组件(例如安瓿、注射器或小瓶)上。
标签或插页可另外包括或并入到计算机可读介质中，如磁盘(例如，硬盘、卡、存储磁盘)、光盘(如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3)、磁带或电子存储介质如RAM和ROM或这些的混合如磁/光存储介质、FLASH介质或记忆型卡。在一些实施例中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了从远程来源，例如经由互联网网站获得说明书的方式。
实验
提出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，而非旨在限制发明人认为是其发明的范围，也非旨在表示执行下面的实验并且是所有可以执行的实验。应该理解的是，用现在时写出的示例性描述不一定被执行，而是可以执行所述描述以生成其中描述的数据等。虽然已尽力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)，且压力是或接近大气压。使用标准缩写，包括以下：s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；bp＝碱基对；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；nM＝纳摩尔；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌肉内；i.p.＝腹膜内；SC或SQ＝皮下；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单位；ns＝无统计学意义；PMA＝佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；DMEM＝达尔伯克改良伊格尔培养基；PBMC＝原代外周血单核细胞；FBS＝胎牛血清；FCS＝胎牛血清；HEPES＝4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；LPS＝脂多糖；RPMI＝洛斯维·帕克纪念研究所培养基；APC＝抗原呈递细胞；FACS＝荧光活化细胞分选。
材料和方法。
在指出时，使用以下一般材料和方法，或者可用于下面的实施例中：
分子生物学程序.在科学文献中描述了分子生物学中的标准方法(参见，例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.；及Ausubel等，(2001)Current Protocols inMolecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons,Inc.New York,N.Y.，其描述了在细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷))。
抗体相关的过程.描述了多克隆和单克隆抗体的生成、纯化和片段化(例如，Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)；表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,NY)；流式细胞术，包括荧光活化细胞分选(FACS)的方法是可用的(参见，例如Shapiro(2003)Practical FlowCytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)；及适于修饰核酸的荧光试剂，包括用作例如诊断试剂的核酸引物和探针、多肽和抗体是可用的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO.)。对抗体的进一步讨论出现在本文其它地方。
软件.用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的(参见，例如GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；和DeCypherTM(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,NV)。
聚乙二醇化.如本文所描述的聚乙二醇化IL-10可以通过本领域技术人员已知的任何方式合成。已经描述了生成单-PEG-IL-10和单-/二-PEG-IL-10混合物的示例性合成方案(参见，例如美国专利第7,052,686号；美国专利公布第2011/0250163号；WO 2010/077853)。本公开的特定实施方案包含选择性聚乙二醇化的单-和二-PEG-IL-10的混合物。除了利用自己的适于本公开实践的PEG生产和使用技术(和其它药物递送技术)外，本领域技术人员熟悉PEG相关技术的许多商业供应商(例如，NOF America Corp(Irvine,CA)和Parchem(New Rochelle,NY))。
动物.本领域技术人员已知的各种小鼠和其它动物品系可以连同本公开的教导一起使用。例如，免疫活性的Balb/C或B细胞缺陷型Balb/C小鼠可以从The Jackson Lab.,BarHarbor,ME获得，并根据标准程序使用(参见，例如Martin等(2001)Infect.Immun.,69(11):7067-73和Compton等(2004)Comp.Med.54(6):681-89)。
IL-10浓度.血清IL-10浓度水平和暴露水平可以通过本领域中使用的标准方法来确定。例如，当实验受试者为小鼠时，通过以下方式进行血清暴露水平测定：从小鼠剪尾向普通毛细管收集全血(～50μL/小鼠)，通过离心分离血清和血细胞，并通过标准ELISA试剂盒和技术测定IL-10暴露水平。
FACS分析.用于FACS分析的许多方案、材料和试剂是可商购获得的并且可以连同本文的教导一起使用(例如，Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ；Cell SignalingTechnologies,Danford,MA；Abcam,Cambridge,MA；Affymetrix,Santa Clara,CA)。可以使用直接流式细胞术(即，使用缀合的一抗)和间接流式细胞术(即，使用一抗和缀合的二抗)。示例性的直接流动方案如下：洗涤收获的细胞并且在冰冷的PBS、10％FCS、1％叠氮化钠中将细胞悬浮液浓度调节至1-5x106个细胞/mL。细胞可以在12x75mm2的圆底聚苯乙烯Falcon管中染色。细胞可以充分离心，所以可以去除上清液而细胞很少损失，但是未达到细胞难以重新悬浮的程度。可以添加经标记的一抗(0.1-10μg/mL)，并且如有必要，可以在3％BSA/PBS中制备稀释液。在4℃下孵育至少30分钟后，可以通过在400g离心5分钟将细胞洗涤3次，然后可以重新悬浮于0.5-1mL冰冷的PBS、10％FCS、1％叠氮化钠中。细胞可在黑暗中保持在冰上，直至分析(优选在同一天内)。也可以使用标准方法固定细胞，以将其保存数天；不同抗原的固定可能需要抗原特异性优化。
下文描述的分析是有代表性的，而不是排他性的。
PBMC和CD8+T细胞基因表达测定.以下方案提供了检查基因表达的示例性测定。
可根据任何标准方案分离人PBMC(参见例如，Fuss等(2009)Current Protocolsin Immunology，7.1单元，John Wiley,Inc.,NY)。在任何标准组织培养物处理的6孔板(BD；Franklin Lakes,NJ)中，每孔用含有RPMI(Life Technologies；Carlsbad,CA)、10mM HEPES(Life Technologies；Carlsbad,CA)、10％FCS(Hyclone Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)和青霉素/链霉素混合物(Life Technologies；Carlsbad,CA)的完全RPMI可培养2.5mL的PBMC(细胞密度为800万个细胞/mL)。人聚乙二醇化IL-10可以按100ng/mL的最终浓度添加到孔中，随后进行7天孵育。可以使用Miltenyi Biotec的MACS细胞分离技术，根据生产商的方案(Miltenyi Biotec；Auburn,CA)从PBMC中分离CD8+T细胞。分别使用Qiagen的RNeasy试剂盒和RT2First Strand试剂盒，按照生产商的说明(Qiagen N.V.；Netherlands)，可以提取RNA并且可以由分离的CD8+T细胞和CD8+T细胞耗尽的PBMC合成cDNA。可以使用来自Qiagen的RT2SYBR Green qPCR Mastermix和引物(IDO1、GUSB和GAPDH)根据生产商的方案对cDNA模板进行定量PCR。IDO1Ct值可以归一化为管家基因GUSB和GAPDH的平均Ct值。
PBMC和CD8+T细胞细胞因子分泌测定.当用PEG-IL-10，然后用抗CD3抗体处理时，活化的原代人CD8+T细胞分泌IFN-γ。以下方案提供了检查细胞因子分泌的示例性测定。
可根据任何标准方案分离人PBMC(参见例如，Fuss等(2009)Current Protocolsin Immunology，7.1单元，John Wiley,Inc.,NY)。在任何标准组织培养物处理的6孔板(BD；Franklin Lakes,NJ)中，每孔用含有RPMI(Life Technologies；Carlsbad,CA)、10mM HEPES(Life Technologies；Carlsbad,CA)、10％FCS(Hyclone Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)和青霉素/链霉素混合物(Life Technologies；Carlsbad,CA)的完全RPMI培养2.5mL的PBMC(细胞密度为800万个细胞/mL)。人聚乙二醇化IL-10可以按100ng/mL的最终浓度添加到孔中，随后进行3天孵育。可以使用Miltenyi Biotec的MACS细胞分离技术，根据生产商的方案(Miltenyi Biotec；Auburn,CA)从PBMC中分离CD8+T细胞。然后可以用含有1μg/mL抗CD3抗体(Affymetrix eBioscience)的完全RPMI在任何标准组织培养板中培养分离的CD8+T细胞4小时。孵育4小时后，可以收集培养基并且使用商用ELISA试剂盒并按照生产商的方案(Affymetrix eBioscience)测定IFN-γ。
TNFα抑制测定.PMA-刺激U937细胞(来自可获自Sigma-Aldrich(#85011440)；St.Louis,MO的肺部的成淋巴细胞人细胞系)引起细胞分泌TNFα，随后用人IL-10处理这些TNFα分泌细胞引起TNFα分泌以剂量依赖性方式减少。示例性的TNFα抑制测定可以使用以下方案进行。
在含有10％FBS/FCS和抗生素的RMPI中培养U937细胞后，在96孔平底板中(可使用任何经血浆处理的组织培养板(例如，Nunc；Thermo Scientific,USA))，将1x105个90％活力的U937细胞铺板，每种条件一式三份。将细胞铺板以提供以下条件(全部至少一式三份；对于‘单独培养基’而言，孔的数量加倍，因为在用10nM PMA孵育后一半将因活力而被使用)：单独的5ng/mL LPS；5ng/mL LPS+0.1ng/mL rhIL-10；5ng/mL LPS+1ng/mL rhIL-10；5ng/mL LPS+10ng/mL rhIL-10；5ng/mL LPS+100ng/mL rhIL-10；5ng/mL LPS+1000ng/mLrhIL-10；5ng/mL LPS+0.1ng/mL PEG-rhIL-10；5ng/mL LPS+1ng/mL PEG-rhIL-10；5ng/mLLPS+10ng/mL PEG-rhIL-10；5ng/mL LPS+100ng/mL PEG-rhIL-10；和5ng/mL LPS+1000ng/mL PEG-rhIL-10。将每个孔暴露于200μL的10nM PMA中24小时，在37℃下于5％CO2孵化器中培养，此后约90％的细胞应贴壁。三个额外的孔可以重新悬浮，细胞计数以评估活力(>90％应该是有活力的)。用新鲜的不含PMA的培养基轻轻地但彻底地洗涤3次，确保细胞仍在孔中。每个孔添加100μL含有适当浓度(该体积100％稀释时为2倍)的rhIL-10或PEG-rhIL-10的培养基，在37℃下于5％CO2孵化器中孵育30分钟。每个孔添加100μL的10ng/mL LPS原液以达到每个孔中最终浓度为5ng/mL LPS，并在37℃下于5％CO2孵化器中孵育18-24小时。根据生产商的说明书去除上清液并进行TNFαELISA。在ELISA中运行每种经调节的上清液，一式两份。
MC/9细胞增殖测定.向MC/9细胞(可获自Cell Signaling Technology；Danvers,MA的具有肥大细胞特征的鼠细胞系)施用IL-10引起细胞增殖以剂量依赖性方式增加。Thompson-Snipes,L.等(1991)J.Exp.Med.173:507-10)描述了其中为MC/9细胞补充IL3+IL-10和IL-3+IL-4+IL-10的标准测定方案。供应商(例如，R&D Systems,USA；和CellSignaling Technology,Danvers,MA)使用该测定法作为rhIL-10的批次放行测定法。本领域普通技术人员将能够修改Thompson-Snipes,L.等描述的标准测定方案，使得细胞仅补充IL-10。
活化诱导的细胞死亡测定.以下方案提供了示例性的活化诱导的细胞死亡测定。
可根据任何标准方案分离人PBMC(参见例如，Fuss等(2009)Current Protocolsin Immunology，7.1单元，John Wiley,Inc.,NY)。可以使用Miltenyi Biotec的抗CD45ROMACS珠粒和MACS细胞分离技术，根据生产商的方案(Miltenyi Biotec Inc；Auburn,CA)分离CD8+T细胞(CD45RO+)。为了活化细胞，可将1mL分离的细胞(密度为3x106个细胞/mL)在预先涂布有抗CD3和抗CD28抗体(Affymetrix eBioscience,San Diego,CA)的标准24孔板(BD；Franklin Lakes,NJ)中，在AIM V培养基中培养3天(Life Technologies；Carlsbad,CA)。预先涂布过程可以通过向每个孔添加300μL含有10μg/mL抗CD3和2μg/mL抗CD28抗体的碳酸盐缓冲液(0.1M NaHCO3(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、0.5M NaCl(Sigma-Aldrich)，pH 8.3)，在37℃下孵育2小时，并用AIM V培养基洗涤每个孔来实现。在3天活化期后，可以收集细胞、计数、在标准24孔板中的1mL AIM V培养基中重新铺板(密度为2x106个细胞/mL)并用100ng/mL PEG-hIL-10处理3天。可以重复用PEG-hIL-10进行活化和处理的过程，之后可通过台盼蓝拒染法(Trypan Blue exclusion)根据生产商的方案(Life Technologies)对活细胞计数。
肿瘤模型与肿瘤分析.可以使用本领域接受的任何肿瘤模型、测定法等来评价本文描述的IL-10药剂对各种肿瘤的作用。下文描述的肿瘤模型和肿瘤分析是可以利用的那些的代表。按每次肿瘤接种104、105或106个细胞皮下或皮内注射同基因小鼠肿瘤细胞。可以使用Ep2乳腺癌、CT26结肠癌、皮肤PDV6鳞状癌和4T1乳腺癌模型(参见，例如Langowski等(2006)Nature 442:461-465)。可以使用免疫活性的Balb/C或B细胞缺陷型Balb/C小鼠。可以向免疫活性小鼠施用PEG 10-mIL-10，而PEG-hIL-10治疗可以是在B细胞缺陷型小鼠中。在治疗开始之前允许肿瘤达到100-250mm3的尺寸。在远离肿瘤植入的部位皮下施用IL-10、PEG-mIL-10、PEG-hIL-10或缓冲液对照。通常使用电子卡尺监测肿瘤生长，每周两次。在各个终点收获肿瘤组织和淋巴器官以测量许多炎症标志物的mRNA表达并对几种炎症细胞标志物进行免疫组织化学分析。将组织在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。通常使用电子卡尺监测原发性肿瘤生长，每周两次。肿瘤体积可以使用公式计算(宽度2x长度/2)，其中长度是较长的尺寸。在治疗开始之前允许肿瘤达到90-250mm3的尺寸。
实施例1
PEG-IL-10介导CD8+T细胞免疫活化
在用PEG-rHuIL-10处理29天之前和之后，在癌症患者中测定表达PD-1和LAG3的CD8+T细胞数量的变化。两位以持续部分应答对疗法有应答的患者血液中的PD1+CD8T细胞增加。第一位患者(肾细胞癌)每天皮下接受20μg/kg PEG-rHuIL-10，并在22周后经历总肿瘤负荷减少71％。第二位患者(黑素瘤)每天皮下接受40μg/kg PEG-rHuIL-10，并在22周后经历总肿瘤负荷减少57％。
治疗前和治疗期间从每位患者的外周部分离外周血单核细胞(PBMC)并进行FACS分析。如图1所示，表达PD-1的外周CD8+T细胞的数量在29天内增加了约2倍，并在治疗期间持续增加，而表达LAG3的外周CD8+T细胞的数量在29天内增加了约4倍。PD-1和LAG3都是CD8+T细胞活化和细胞毒性功能的标志物。这些发现表明施用PEG-rHuIL-10介导了CD8+T细胞免疫活化。
实施例2
PEG-IL-10增强活化记忆CD8+T细胞的功能
记忆T细胞(也称为经历抗原的T细胞)是在之前感染、癌症暴露或先前接种期间已经预先遇到其同源抗原并对其同源抗原有应答的一类T淋巴细胞(例如，辅助性T细胞(CD4+)和细胞毒性T细胞(CD8+))。相反，初始T细胞在周围尚未遇到其同源抗原；其通常特征在于缺乏活化标志物CD25、CD44或CD69以及缺乏记忆CD45RO同种型。记忆T细胞(通常为CD45RO+)能够再生和产生比初始T细胞更快和更强的免疫应答。
鉴于CAR-T T细胞源自记忆CD8+T细胞，所以使用标准方法(本文描述了其实例)体外评估了PEG-IL-10对记忆CD8+T细胞的作用。如图2所示，PEG-IL-10优先增强记忆CD8+T细胞(CD45RO+)而非初始CD8+T细胞中的IFNγ生成。这些数据与PEG-IL-10增强活化记忆CD8+T细胞功能的作用一致。
实施例3
PEG-IL-10治疗产生更多数量的活化记忆CD8+T细胞
如本文所述，CAR-T细胞疗法源自记忆CD8+T细胞。为了有效，输注的记忆CD8+T细胞不但必须显示出细胞毒性，而且必须持续(Curran KJ,Brentjens RJ.(2015年4月20日)JClin Oncol pii:JCO.2014.60.3449；Berger等，(Jan 2008)J Clin Invest 118(1):294-305)。然而，T细胞的重复活化导致活化诱导的细胞死亡，这减少了细胞的数量并因此而降低了总体疗效。
使用本文描述的程序，在用和不用PEG-IL-10处理的情况下测定来自两个供体的人CD45RO+记忆CD8+T细胞的活化诱导的细胞死亡。如图3所示，在两轮TCR和共刺激诱导的活化后用PEG-IL-10处理人CD45RO+记忆CD8+T细胞产生更多数量的活细胞。这些数据表明PEG-IL-10能够限制活化诱导的细胞死亡，从而导致更多数量的活化记忆T细胞持续存在。这些观察结果表明与CAR-T细胞疗法组合使用PEG-IL-10提供了另外的临床益处。
本文描述了本发明的特定实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述内容后，对于本领域的技术人员来说，所公开的实施方案的描述、变型可变得显而易见，并且预计技术人员可以视情况采用此类变型。因此，旨在以与本文具体描述的方式不同的方式来实践本发明，并且本发明包括适用法律允许的所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等效方案。而且，除非本文另有说明或另外明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变型中上述要素的任何组合。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登记号和其它参考文献都通过引用并入本文，如同具体和单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用并入一样。
序列表
<110> J·B·穆姆
陈伊万昊
<120> 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
<130> ARMO-016WO
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<223> 合成核酸
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Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
1 5
<210> 8
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<223> 合成核酸
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<223> 合成核酸
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Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (95)

1.一种调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括：
a)向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，
其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且
其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和
b)向所述受试者施用足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂；
从而调节所述T细胞介导的免疫应答。
2.一种调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达以下物质的细胞：
a)嵌合抗原受体(CAR)，
其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且
其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和
b)足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂；
从而调节所述T细胞介导的免疫应答。
3.一种调节受试者中对靶细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入：
a)治疗有效的第一多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，
其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且
其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和
b)治疗有效的第二多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂，
从而调节所述T细胞介导的免疫应答。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述CAR包含特异性识别所述靶细胞群的抗原结合结构域。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述CAR还包含跨膜结构域和信号传导结构域。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述信号传导结构域包含至少一个共刺激结构域。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂增强活化记忆CD8+T细胞的所述功能。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述治疗有效的多个细胞之前施用所述IL-10药剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述治疗有效的多个细胞的同时施用所述IL-10药剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述治疗有效的多个细胞之后施用所述IL-10药剂。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由相同载体表达。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由不同载体表达。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述治疗有效的多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的所述IL-10药剂的载体转染。
15.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗有效的第二多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的所述IL-10药剂的载体转染。
16.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗有效的第二多个细胞包含用表达所述IL-10药剂的载体转染的CD8+T细胞。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述载体包括质粒。
18.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述载体包括病毒载体。
19.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂的表达受表达控制元件调节。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所施用的所述IL-10药剂的量足以增强细胞毒性功能。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所施用的所述IL-10药剂的量足以实现10-100ng/mL的血清浓度。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述IL-10药剂为PEG-IL-10。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述PEG-IL-10包含与IL-10的至少一个单体的至少一个氨基酸残基共价连接的至少一个PEG分子。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述PEG-IL-10包含单聚乙二醇化IL-10和二聚乙二醇化IL-10的混合物。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述PEG-IL-10的PEG组分的分子质量为5kDa至20kDa。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述PEG-IL-10的PEG组分的分子质量为至少20kDa。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述PEG-IL-10的PEG组分的分子质量为至少30kD。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述IL-10药剂经皮下施用。
29.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多个细胞通过血浆分离置换法从所述受试者获得。
31.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。
33.根据权利要求31和32所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞通过血浆分离置换法从所述受试者获得。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述多个细胞是记忆CD8+T细胞。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一多个细胞是记忆CD8+T细胞。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二多个细胞是初始CD8+T细胞。
37.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多个细胞是自体肿瘤细胞。
38.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞是自体肿瘤细胞。
39.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群包含肿瘤抗原。
40.根据权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR或其任何组合。
41.一种治疗患有癌症相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，其包括：
a)向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，
其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且
其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和
b)向所述受试者施用足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂。
42.一种治疗患有癌症相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个经遗传修饰以表达以下物质的细胞：
a)嵌合抗原受体(CAR)，
其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且
其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和
b)足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂。
43.一种治疗患有癌症相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，其包括向所述受试者引入：
a)治疗有效的第一多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，
其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够与所述靶细胞群结合的抗原特异性靶向区域，并且
其中所述嵌合抗原受体靶向区域与所述靶细胞群的结合能够引发活化诱导的细胞死亡；和
b)治疗有效的第二多个细胞，所述细胞经遗传修饰以表达足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量的IL-10药剂。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述CAR包含特异性识别所述靶细胞群的抗原结合结构域。
45.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述CAR还包含跨膜结构域和信号传导结构域。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述信号传导结构域包含至少一个共刺激结构域。
48.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂增强活化记忆CD8+T细胞的所述功能。
49.根据权利要求41所述的方法，其中在施用所述治疗有效的多个细胞之前施用所述IL-10药剂。
50.根据权利要求41所述的方法，其中在施用所述治疗有效的多个细胞的同时施用所述IL-10药剂。
51.根据权利要求41所述的方法，其中在施用所述治疗有效的多个细胞之后施用所述IL-10药剂。
52.根据权利要求42所述的方法，其中所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由相同载体表达。
53.根据权利要求42所述的方法，其中所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由不同载体表达。
54.根据权利要求42所述的方法，其中所述治疗有效的多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的所述IL-10药剂的载体转染。
55.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗有效的第二多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的所述IL-10药剂的载体转染。
56.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗有效的第二多个细胞包含用表达所述IL-10药剂的载体转染的CD8+T细胞。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述载体包括质粒。
58.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述载体包括病毒载体。
59.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂的表达受表达控制元件调节。
60.根据权利要求41所述的方法，其中所施用的所述IL-10药剂的量足以增强细胞毒性功能。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所施用的所述IL-10药剂的量足以实现10-100ng/mL的血清浓度。
62.根据权利要求41所述的方法，其中所述IL-10药剂为PEG-IL-10。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述PEG-IL-10包含与IL-10的至少一个单体的至少一个氨基酸残基共价连接的至少一个PEG分子。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述PEG-IL-10包含单聚乙二醇化IL-10和二聚乙二醇化IL-10的混合物。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述PEG-IL-10的PEG组分的分子质量为5kDa至20kDa。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述PEG-IL-10的PEG组分的分子质量为至少20kDa。
67.根据权利要求62所述的方法，其中所述PEG-IL-10的PEG组分的分子质量为至少30kD。
68.根据权利要求41所述的方法，其中所述IL-10药剂经皮下施用。
69.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述多个细胞通过血浆分离置换法从所述受试者获得。
71.根据权利要求43所述的方法，其中所述第一多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二多个细胞从所述受试者获得并且离体经遗传修饰。
73.根据权利要求71和72所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞通过血浆分离置换法从所述受试者获得。
74.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个细胞是记忆CD8+T细胞。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述第一多个细胞是记忆CD8+T细胞。
76.根据权利要求73所述的方法，其中所述第二多个细胞是初始CD8+T细胞。
77.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述多个细胞是自体肿瘤细胞。
78.根据权利要求43所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞是自体肿瘤细胞。
79.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群包含肿瘤抗原。
80.根据权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR或其任何组合。
81.根据权利要求42或43所述的方法，其中在向所述受试者引入后至少两周，所述IL-10药剂以足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量表达。
82.根据权利要求42或43所述的方法，其中在向所述受试者引入后至少一个月，所述IL-10药剂以足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量表达。
83.根据权利要求42或43所述的方法，其中在向所述受试者引入后至少三个月，所述IL-10药剂以足以预防或限制所述活化诱导的细胞死亡的量表达。
84.一种核酸分子，其编码根据权利要求42或43所述的IL-10药剂。
85.根据权利要求84所述的核酸分子，其中所述核酸分子与赋予编码所述IL-10药剂的核酸分子表达的表达控制元件可操作连接。
86.一种载体，其包含根据权利要求84或85所述的核酸分子。
87.根据权利要求86所述的载体，其中所述载体包括病毒载体。
88.根据权利要求87所述的载体，其中所述载体包括质粒。
89.一种转化或宿主细胞，其表达权利要求52或43所述的IL-10药剂。
90.一种增强CAR-T T细胞的功能的方法，其包括：
a)基因工程化T细胞以表达CAR，从而产生CAR-T T细胞；和
b)用减少所述CAR-T T细胞分泌的至少一种细胞因子的量的药剂调节所述CAR-T T细胞，
从而增强所述CAR-T T细胞的所述功能。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述药剂为小干扰RNA(siRNA)。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述细胞因子是所述肿瘤坏死因子家族或所述转化生长因子β超家族的成员。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述肿瘤坏死因子家族的成员是TNFα。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述转化生长因子β超家族的成员是TGF-β。
95.根据权利要求94所述的方法，其中减少TGF-β的所述量减少了T调节细胞的所述增殖。
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