FR3130994A1 - Procédé de dosage - Google Patents

Abstract

L’invention vise un procédé de de dosage d’un analyte cible dans un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant les étapes (a.) mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques portant un premier récepteur spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques avec l’analyte cible cette mise en contact s’accompagnant, lorsqu’un analyte interférent est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non-spécifique dudit analyte interférant aux premières particules magnétiques; (b.) application d’un premier champ magnétique, et son maintien, de sorte à réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents ; (c.) annulation du premier champ magnétique et ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques portants un deuxième récepteur spécifique à un deuxième site d’attache de l’analyte cible; (d.) mesure d’une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide ; (e.) application d’un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes par la liaison des premiers complexes avec des deuxièmes particules magnétiques; et (f.) mesure d’une deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxième complexes dans le milieu liquide de sorte à déterminer la quantité de deuxièmes complexes formés à l’étape (e.) en fonction de la première grandeur pour en déduire la quantité d’analyte cible présent dans l’échantillon biologique. Figure d’abrégé : pas de Figure

Description

PROCÉDÉ DE DOSAGE

L’invention se rapporte à un procédé de dosage d’un analyte cible dans un échantillon liquide, et à un dispositif de dosage agencé pour réaliser ce procédé.

Plus généralement, l’invention relève du domaine du dosage de molécules d’intérêt solubles dans un milieu liquide. Il s’agit en particulier du domaine du dosage immunologique de protéines, par exemple dans un échantillon de sang total.

L’état de la technique propose des méthodes de dosage qui utilisent des particules magnétiques pour la capture et/ou l’extraction d’analytes présents dans un échantillon liquide. Pour cela, les particules magnétiques portent un ou plusieurs récepteurs spécifiques à l’analyte cible, ce qui leur permet de se lier à l’analyte pour former des complexes. Les complexes peuvent ensuite être capturés par l’application d’un champ magnétique.

Les applications des dosages à base de particules magnétiques sont vastes. Certaines visent des applications en oncologie, voir par exemple le document Xu, Hengyi,et al."Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood", Biomaterials 32.36 (2011): 9758-9765. D’autres visent des applications dans l’extraction d’acides nucléiques, comme décrit notamment dans les documents US9976136 ou Tan, Siun Chee, and Beow Chin Yiap. "DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present" BioMed Research International, 2009.

Les applications concernant l’extraction d’acides nucléiques comportent généralement une pluralité d’étapes successives dont la lyse des cellules pour libérer les acides nucléiques, la mise en contact de la solution lysée avec les particules magnétiques pour capturer les acides nucléiques, l’application d’un champ magnétique (aussi appelé « aimantation ») et le lavage. Ceci est suivi de l’élution des acides nucléiques (généralement par un changement de pH) et l’élimination des particules magnétiques. Les acides nucléiques isolés peuvent ensuite être traités et dosés.

Toutefois, la lyse des cellules suivie du lavage entraîne une dilution de l’échantillon et en conséquence une diminution des performances de la capture. De plus, une fois capturés, les acides nucléiques doivent être séparés des particules magnétiques pour être traités, ce qui augmente le nombre d’étapes.

D’autres applications, telles qu’en diagnostic ou en oncologie, visent le dosage d’analytes directement dans le sang. L’état de la technique propose ainsi des méthodes de dosage immunologique qui tentent de doser des protéines dans un échantillon de sang total. On connaît notamment les documents US6030845, US6855562, et US7326579, ou encore le document de la Demanderesse EP2810042. Mais ces méthodes reposent, elles aussi, sur une première étape de lyse du sang pour détruire les cellules. La lyse est suivie d’une étape de dosage par immuno-agglutination sur l’échantillon lysé. Si cette étape de lyse permet de réaliser la mesure d’agglutination dans de bonnes conditions, elle implique une dilution de l’échantillon relativement importante, ce qui a un impact négatif sur la limite de détection.

D’autres méthodes de dosage immunologique avec des particules magnétiques existent. Il existe en particulier les méthodes qualifiées d’homogènes et celles qualifiées d’hétérogènes.

Les méthodes homogènes ont l’avantage de s’affranchir de l’étape de lavage. Les documents Baudry, Jean,et al., "Acceleration of the recognition rate between grafted ligands and receptors with magnetic forces", Proceedings of the National Academy of Sciences 103.44 (2006): 16076-16078; Ranzoni, Andrea,et al."One-step homogeneous magnetic nanoparticle immunoassay for biomarker detection directly in blood plasma" Acs Nano 6.4 (2012): 3134-3141; et Aurich, Konstanze,et al."Determination of the magneto-optical relaxation of magnetic nanoparticles as a homogeneous immunoassay", Analytical chemistry 79.2 (2007): 580-586, décrivent des tests homogènes. Toutefois, l’absence d’étape de lavage rend ces méthodes de dosage difficilement utilisables dans des milieux complexes tels que le sang. En effet, la présence de cellules, dans le sang en particulier, perturbe fortement les mesures.

Les méthodes hétérogènes nécessitent un plus grand nombre d’étapes, ce qui les rend généralement longues à mettre en œuvre. Elles sont par ailleurs complexes à implémenter. Le document Kourilov, Vitaly, and Michael Steinitz, "Magnetic-bead enzyme-linked immunosorbent assay verifies adsorption of ligand and epitope accessibility" Analytical biochemistry 311.2 (2002): 166-170 décrit une méthode hétérogène.

Quelle que soit la méthode de dosage, il existe un risque de mesurer un signal non-spécifique. Un signal non-spécifique est notamment mesuré lorsqu’au moins un analyte interférent est en concurrence avec l’analyte cible pour se lier aux particules magnétiques ou au récepteur spécifique à l’analyte cible.

La nature de l’analyte interférent peut varier. À titre d’exemple, il peut s’agir d’une protéine dont la structure tridimensionnelle est proche de celle de l’analyte cible ou encore d’une molécule portant une charge électrique. Plus généralement, un analyte interférent peut être toute molécule présentant une affinité non négligeable pour les particules magnétiques ou pour les récepteurs greffés à leur surface. Il s’ensuit que le signal mesuré lors du test de dosage n’est jamais nul. Les méthodes existantes cherchent donc à réduire la probabilité d’un signal non-spécifique. Toutefois, les méthodes existantes ne permettent généralement pas de différencier entre un signal spécifique et un signal non-spécifique.

Tout cela fait que les méthodes de dosage d’échantillons complexes, et en particulier le dosage d’échantillon de sang total, ne sont pas satisfaisantes. La présence de cellules dans l’échantillon, le besoin le lyser celles-ci suivi d’au moins une étape de lavage, et le risque de signal non-spécifique peuvent dégrader les performances de la méthode.

La présente invention vient améliorer la situation.
Ainsi, la présente invention vise un procédé de dosage d’un analyte cible dans un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant les étapes suivantes :

1. la mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques portant un premier récepteur spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques avec l’analyte cible, cette mise en contact s’accompagnant, lorsqu’un analyte interférent est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non-spécifique dudit analyte interférent aux premières particules magnétiques ;
2. l’application d’un premier champ magnétique, et son maintien, de sorte à réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents ;
3. l’annulation du champ magnétique appliqué à l’étape b. et l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques portant un deuxième récepteur spécifique à un deuxième site d’attache de l’analyte cible ;
4. la mesure d’une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents ;
5. l’application d’un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes par la liaison des premiers complexes avec des deuxièmes particules magnétiques ; et
6. la mesure d’une deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxièmes complexes dans le milieu liquide de sorte à déterminer la quantité de deuxièmes complexes formés à l’étape e. en fonction de la première grandeur pour en déduire la quantité d’analytes cibles présents dans l’échantillon biologique, et le cas échéant la quantité d’analytes interférents.

L’invention permet ainsi de vérifier la présence ou non d’un analyte interférent dans l’échantillon biologique. Ainsi, lorsque l’échantillon biologique comporte à la fois un analyte cible et un analyte interférent, l’étape a. comprend la formation de complexes interférents par la liaison des premières particules magnétiques avec l’analyte interférent; l’étape b. comprend ainsi la formation d’agrégats entre les complexes interférents ; l’étape d. prévoit ensuite la mesure quantitative des agrégats interférents formés ; et l’étape f. prévoit un calcul pour déterminer la quantité d’analyte cible présent dans l’échantillon biologique, ainsi que la quantité d’analyte interférent.

En outre, le procédé de l’invention permet de s’affranchir d’une dilution trop importante et en conséquence d’assurer une bonne sensibilité analytique. En outre, l’invention limite les étapes afin de simplifier l’ensemble du test. Cela résulte notamment en un temps drastiquement réduit qui ne dépasse pas la durée maximale de 15 minutes environ.

Bien évidemment, lorsqu’aucun analyte interférent est présent dans l’échantillon biologique, les complexes interférents, et de ce fait les agrégats interférents, ne se forment pas. Il s’ensuit que la grandeur mesurée à l’étape d. est nulle ou ne dépasse pas une valeur seuil prédéfinie.

Le procédé de l’invention permet ainsi, non seulement d’identifier la présence d’un analyte interférent dans l’échantillon biologique, mais également de quantifier celui-ci. En parallèle, le procédé permet de déduire la quantité d’analyte cible dans l’échantillon biologique.

L’étape f. peut comporter le calcul de la différence entre la deuxième grandeur mesurée à cette étape f. et la première grandeur mesurée à l’étape c. afin de déterminer la quantité d’analyte cible.
Dans le mode de réalisation principal, l’annulation du premier champ magnétique à l’étape c. est suivie ou accompagnée de l’ajout de deuxièmes particules magnétiques, puis on procède à la mesure de l’étape d. de la première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents. Dans un autre mode de réalisation, cette mesure peut être réalisée directement après l’annulation du champ magnétique, c’est-à-dire avant l’introduction des deuxièmes particules magnétiques dans le milieu liquide (ou milieu réactionnel).

Pour la mesure à l’étape f., c’est-à-dire la mesure de la deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxièmes complexes, le deuxième champ magnétique est de préférence annulé au préalable de ladite mesure. Ceci augmente la sensibilité de la mesure.

Pour assurer la spécificité du procédé de l’invention chaque premier récepteur est spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible et chaque deuxième récepteur est spécifique à un deuxième site d’attache, différent du premier, de l’analyte cible. La flexibilité provenant de deux sites d’attaches distincts permet d’adapter rapidement le procédé de l’invention aux besoins divers selon la nature de l’application mise en œuvre.

Dans un mode particulier de l’invention qui vise l’extraction de particules magnétiques du milieu liquide, le champ magnétique appliqué à l’étape b. est supérieur ou égal à 100 mT, et le maintien du champ magnétique est inférieur ou égal à 5 minutes, et de préférence inférieur ou égal à 3 minutes. Dans un autre mode particulier, l’application du premier champ magnétique à l’étape b. et l’application du deuxième champ magnétique à l’étape e. comporte une aimantation à 8 mT pendant 1 seconde, suivi de trois séquences successives d’aimantations et de coupures suivantes : 15 mT pendant 60 secondes, 0 mT pendant 28 secondes, 8 mT pendant 1 seconde, 0 mT pendant 1 seconde.

Cela permet de réaliser le procédé de l’invention dans un temps rapide et notamment dans un temps inférieur à 15 minutes. De plus, la séquence d’aimantation et de coupure choisie permet une précision augmentée du procédé de l’invention en favorisant la formation des complexes entre les analytes et les particules magnétiques d’une part, et en permettant une lecture plus précise d’autre part.

Dans un mode de réalisation préférentiel, les mesures effectuées aux étapes d. et f. sont choisies parmi le groupe constitué d’une mesure par turbidimétrie, une mesure par néphélométrie et une mesure par comptage (par analyse et/ou traitement d’image ou par flux notamment). Cela permet d’obtenir des résultats fiables, et ce de manière rapide.

Dans un autre mode de réalisation, l’étape a. comporte l’ajout d’un diluant de manière à diluer l’échantillon biologique, le rapport entre l’échantillon et le diluant étant supérieur ou égal à 1:10.

Cette dilution permet en particulier de diminuer la viscosité du milieu pour faciliter la capture de la molécule à doser, ou autrement dit de la formation des premiers complexes. De plus, le diluant peut contenir des agents permettant de réduire la probabilité d’agrégation des particules magnétiques entre elles. À cet effet on peut utiliser des tensioactifs non ioniques, des tensioactifs anioniques, des tensioactifs cationiques, des tensioactifs zwitterioniques, des protéines (albumine, caséine, gélatine, anticorps notamment) ou des polymères (tels que polyvinylpyrrolidone, alcool polyvinylique).

Dans un mode de réalisation particulier, l’application du premier champ magnétique à l’étape b. permet d'extraire les premiers complexes du milieu liquide. Cela permet tout particulièrement de travailler dans des milieux complexes (dans le sang total par exemple). Ainsi, un mode de réalisation particulier, prévoit spécifiquement que l’échantillon biologique est du sang total. Un avantage de l’invention est que les étapes du procédé peuvent directement s’appliquer sur un échantillon de sang, et ce sans nécessiter de lavage et/ou de dilution.

Dans un autre mode de réalisation, l’étape b. comporte l’élimination du milieu liquide et l’ajout d’un tampon de réaction. Le tampon de réaction peut comporter un agent anti-agrégation (tensioactifs non ioniques, tensioactifs anioniques, tensioactifs cationiques, tensioactifs zwitterioniques, protéines ou polymères) et/ou comporter un agent de lyse cellulaire (saponines, ammoniums quaternaires, sodium dodecyl sulfate notamment). On peut en outre prévoir au moins un lavage entre l’élimination du milieu liquide et l’ajout du tampon de réaction. Ce lavage permet d’augmenter davantage la spécificité du procédé de l’invention.

Les agents anti-agrégation permettent de dissocier des éventuels agrégats de particules magnétiques formés, tandis que l’agent de lyse cellulaire permet de lyser des potentielles cellules qui n’auraient pas été évacuées avec l’élimination du milieu liquide. On peut noter que contrairement aux méthodes de l’art antérieur, l’agent de lyse ne nécessite pas une dilution supplémentaire de l’échantillon. Dans ce mode de réalisation, on peut alors prévoir une incubation plus ou moins longue de sorte à permettre une action suffisante du ou des agents présents dans le tampon de réaction.

D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après et sur les dessins annexés sur lesquels :

montre un schéma de principe de l’invention.

montre une figure de principe d’une première étape d’incubation d’un échantillon biologique avec des premières particules magnétiques selon l’invention ;

montre une figure de principe d’une première étape d’aimantation du procédé de l’invention ;

montre une figure de principe d’une deuxième étape d’incubation d’un échantillon biologique avec des deuxièmes particules magnétiques selon l’invention ;

montre une figure de principe d’une deuxième étape d’aimantation du procédé de l’invention ;

montre une figure de principe d’une première étape d’incubation d’un échantillon biologique comportant des molécules interférentes avec des premières particules magnétiques selon l’invention ;

montre une figure de principe d’une première étape d’aimantation du procédé de l’invention appliqué sur un échantillon biologique comportant des molécules interférantes ;

montre une figure de principe d’une deuxième étape d’incubation d’un échantillon biologique comportant des molécules interférentes avec des deuxièmes particules magnétiques selon l’invention ;

montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en antigène spécifique de la prostate (PSA) dans un premier exemple de réalisation ;

montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en anticorps (Ac) d’un deuxième exemple de réalisation ;

montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en anticorps (Ac) du deuxième exemple de réalisation ;

montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en anticorps anti-PCT (procalcitonine) d’un troisième exemple de réalisation ;

montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en antigène spécifique de la prostate (PSA) d’un sixième exemple (non selon l’invention) ; et

montre un graphe de la densité optique en fonction d’une concentration en antigène spécifique de la prostate (PSA) d’un septième exemple (selon l’invention).

Les figures, tableaux et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Les figures et tableaux font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.

D’une manière générale, la présente invention concerne l’identification d’un analyte dans un échantillon biologique liquide. L’échantillon peut être de tout type adapté, tel que par exemple un échantillon de moelle osseuse, de liquide céphalorachidien, de lymphe, d’urine, ou de préférence un échantillon de sang total. L’analyte cible peut être par exemple une protéine, un acide nucléique ou toute autre molécule d’intérêt présente dans l’échantillon. L’analyte cible est présent en une quantité plus ou moins grande dans l’échantillon. Ainsi, un échantillon peut comprendre une molécule cible présente en un nombre d’exemplaires plus ou moins élevé. Autrement dit, la concentration en analyte cible peut être plus ou moins importante dans l’échantillon. Ceci s’applique également à tout autre analyte non-cible potentiellement présent dans l’échantillon.

L’invention utilise une technique de capture du ou des analytes cibles par des particules magnétiques qui ont été fonctionnalisées en surface avec des ligands spécifiques à chaque analyte cible. Il peut s’agir de particules du type décrit plus haut. Le diamètre des particules magnétiques employées est généralement compris entre 5 nm et 10000 nm, préférentiellement entre 100 nm et 500 nm.

Dans le procédé de dosage de l’invention, une première étape a. comporte la mise en contact de l’échantillon biologique avec des premières particules magnétiques

La montre un schéma de principe de l’invention.

Ainsi ce schéma montre de manière générale un mode de réalisation de la mise en œuvre du procédé de l’invention. Dans une première étape a. on mélange des premières particules magnétiques avec un échantillon biologique liquide dans lequel se trouve ou pas un analyte cible à doser en présence d’un tampon. L’échantillon biologique peut en outre, mais pas nécessairement, comporter un analyte interférent.

Dans un premier temps, on procède à la mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques. Chaque particule magnétique porte un récepteur spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques avec l’analyte cible lorsque ce dernier se trouve dans l’échantillon biologique. Cette mise en contact s’accompagne lorsqu’un analyte interférent est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non-spécifique de l’analyte interférent aux premières particules magnétiques. Logiquement, lorsqu’il n’existe pas d’analyte interférent dans l’échantillon biologique, il ne se forme pas de complexes interférents.

La montre un échantillon biologique comportant un milieu liquide contenant des molécules. La montre des premières particules magnétiques 10 ou PM1 portant des récepteurs spécifiques, appelés ici premiers récepteurs 101. Ces premières particules magnétiques 10 sont mises en contact avec la molécule à doser présente dans l’échantillon biologique. La molécule à doser se qualifie d’analyte cible 20. L’échantillon biologique comporte en outre d’autres espèces ou molécules 40, 50 qui peuvent être par exemple des molécules solubles, des cellules ou des particules (ou des molécules interférentes 30 comme on le verra plus loin).

Cette mise en contact de l’étape a. a pour conséquence que la molécule 20 est capturée par les premiers récepteurs 101. Pour cela les premiers récepteurs 101 sont spécifiques à l’analyte cible 20. Pour une bonne spécificité on utilise notamment des anticorps monoclonaux ou des parties d’anticorps en tant que récepteurs. La liaison entre chaque récepteur et chaque analyte cible a pour conséquence la formation de complexes, que l’on qualifie ici de premiers complexes C1. Les complexes sont donc formés par les premières particules magnétiques 10 associées aux analytes cibles 20. Ces complexes sont dispersés dans le milieu liquide.

Généralement, la mise en contact de l’étape a. peut durer environ 10 minutes, de préférence moins de 5 minutes. Optionnellement, on peut prévoir de mélanger ou d’agiter le milieu liquide durant la phase d’incubation en vue d’augmenter le rendement de capture.

L’étape a. peut comporter l’ajout d’un diluant de manière à diluer l’échantillon biologique, ou plus particulièrement le milieu liquide. Généralement on choisira une dilution ne dépassant pas une division par dix de la concentration initiale (c’est-à-dire 10x).

Le procédé de l’invention prévoit ensuite une étape b., dans laquelle on applique un premier champ magnétique. Cela permet de réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents. On entend par réunir localement les complexes une organisation de ces derniers au sein du milieu liquide. Selon le champ magnétique appliqué la localisation peut varier.

Il faut retenir qu’un effet principal de cette étape b., et plus particulièrement de l’application du champ magnétique, est bien la formation d’agrégats interférents provenant de l’agglomération de complexes interférents entre eux, lorsque ces derniers se sont formés à l’étape a. de mise en contact entre l’échantillon biologique et les premières particules magnétiques.

Dans un mode particulier de l’invention, cette étape prévoit d’attirer les premières particules magnétiques vers un aimant. En conséquence, les premiers complexes formés à l’étape a., lesquels sont pour l’essentiel constitués de l’association des premières particules magnétiques avec l’analyte cible, sont attirés vers l’aimant. Il s’ensuit que l’ensemble des complexes formés à l’étape a. sont réunis localement contre l’aimant, ou contre un environnement proche de l’aimant. Cela permet d’isoler les premiers complexes et de les séparer du milieu liquide. Autrement dit, dans ce mode de réalisation particulier, on extrait les premiers complexes du milieu liquide de l’échantillon biologique. Logiquement la séparation des premiers complexes du milieu liquide ne sera que totale lorsque le milieu liquide est évacué dans la suite du procédé. Dans ce mode de réalisation, l’étape b. peut prévoir le maintien du champ magnétique pendant un certain temps, par exemple 5 à 10 minutes, de préférence moins de 5 minutes. Cela contribue à la bonne extraction de l’ensemble des premiers complexes formés à l’étape a. du milieu liquide.

La montre les particules magnétiques 10 attirées ou organisées selon le champ B₀généré par un aimant. Les premiers complexes C1 sont assemblés localement.

Dans un mode de réalisation particulier, on prévoit l’élimination du milieu liquide de l’échantillon biologique, puis l’ajout d’un tampon de réaction. Autrement dit, on remplace le milieu liquide par un tampon de réaction, lui aussi liquide. Pour cela on évacue d’abord le milieu liquide de la cuve de réaction, puis on verse le tampon de réaction dans la cuve. Dans ce mode de réalisation, on prévoit généralement un aimant permanent qui permet d’assembler les premiers complexes C1 portant l’analyte cible 20 localement contre celui-ci. Les molécules d’analyte cible 20, liées aux récepteurs 101 sont isolées et conservées pendant l’évacuation du milieu liquide de l’échantillon biologique. Le tampon de réaction est ajouté en remplacement du milieu liquide.

Dans ce mode de réalisation, on peut prévoir un ou plusieurs lavages entre l’élimination du milieu liquide et l’ajout du tampon de réaction. Ce lavage permet d’augmenter la spécificité du procédé de l’invention. Durant le ou les lavages, le champ magnétique peut être maintenu ou coupé. Dans ce dernier cas, il est nécessaire de réappliquer le champ magnétique pendant un temps donné après chaque lavage de façon à capturer de nouveau les particules magnétiques en suspension.

Dans un mode de réalisation, le tampon de réaction peut comprendre un ou plusieurs agents anti-agrégation et/ou un ou plusieurs agents de lyse cellulaire. Les agents anti-agrégation permettent de dissocier des éventuels agrégats ou amas de particules magnétiques formés à l’étape a. et/ou à l’étape b. On augmente ainsi la précision du procédé de l’invention. L’agent de lyse cellulaire permet de lyser des potentielles cellules qui n’auraient pas été évacuées avec l’élimination du milieu liquide décrit plus haut. On peut noter que contrairement aux méthodes de l’art antérieur, l’agent de lyse ne nécessite pas une dilution supplémentaire de l’échantillon.

L’étape c. du procédé de l’invention comporte l’annulation du champ magnétique B₀. Lorsque le champ est coupé, les particules et complexes se dispersent dans le milieu liquide, ainsi que les éventuels agrégats formés.

La montre les complexes C1 remis en suspension. L’étape c. comporte en outre l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques 11, ou PM2, portants un deuxième récepteur 111 spécifique à l’analyte cible 20. À ce stade, les deuxièmes récepteurs 111 des deuxièmes particules magnétiques 11 ne se lient pas, ou très peu, à l’analyte cible 20. Au besoin, on peut prévoir une agitation du milieu réactionnel.

On notera que les analytes cibles 20 présentent généralement une forme tridimensionnelle permettant de choisir des récepteurs spécifiques 101, 111, diversifiés. Ainsi, chaque premier récepteur 101 est spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible 20 et chaque deuxième récepteur 111 est spécifique à deuxième site d’attache de l’analyte cible, différent du premier. Cela permet d’augmenter la spécificité du procédé de l’invention. Cette flexibilité provenant de deux sites d’attaches permet en outre d’adapter rapidement le procédé de l’invention au besoins diverses, et notamment selon la nature de l’application mise en œuvre. On peut ainsi diversifier les récepteurs selon l’analyte cible à doser.

Le procédé de l’invention prévoit ensuite une étape d., dans laquelle on mesure une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents. Lorsque la grandeur mesurée est nulle ou se situe en dessous d’une valeur seuil prédéfinie, il n’existe pas (ou extrêmement peu) d’agrégats interférents dans le milieu liquide. Dans ce cas on peut partir du principe qu’il n’existe pas (ou extrêmement peu) d’analytes interférents dans l’échantillon biologique. Lorsque la grandeur mesurée est non nulle ou dépasse la valeur seuil prédéfinie, il existe des agrégats interférents dans le milieu liquide, et donc un analyte interférent dans l’échantillon biologique.

La mesure peut notamment être réalisée par turbidimétrie, par néphélométrie ou par comptage (par analyse et/ou traitement d’image ou par flux notamment).

Le procédé de l’invention prévoit ensuite une étape e., dans laquelle on applique un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes par la liaison des premiers complexes C1 aux deuxièmes particules magnétiques 11, ou plus précisément aux récepteurs 111 portés par les deuxièmes particules magnétiques. En termes de détectabilité, ces deuxièmes complexes sont comparables aux agrégats interférents, à savoir qu’on arrive relativement facilement à les détecter par des mesures de densité optique notamment.

La montre les deuxièmes complexes 61 générés par l’application du deuxième champ magnétique B1. L’analyte cible 20 est pris en sandwich par les premiers et deuxièmes récepteurs respectivement portés par les premiers 10 et deuxièmes 11 particules magnétiques. D’une manière générale, cette étape e. a pour but de générer des chaînons ou amas de particules magnétiques. Les complexes ou molécules « sandwich », formés par les premiers 10 et deuxièmes 11 particules magnétiques bordant l’analyte cible 20, sont détectables par différentes techniques dont notamment une mesure de densité optique.

Les documents WO 2009/034271, FR2919390 et FR2959820 décrivent des procédés de dosage dans lesquels on applique au milieu réactionnel liquide une série de cycles d’applications et de coupures d’un champ magnétique pour provoquer la formation de chaînons ou d’amas de particules magnétiques lors de la réaction entre les particules magnétiques et un analyte cible. Chaque application du champ a pour conséquence une augmentation du nombre de liaisons analyte / particule magnétique et chaque coupure du champ cause une dispersion des particules magnétiques non liées dans le milieu liquide. Durant le procédé, le nombre et/ou la taille des chaînons ou amas de particules liées augmentent. Cela augmente proportionnellement la turbidité du milieu réactionnel. Les mesures de la densité optique du milieu après chaque coupure du champ magnétique permettent ainsi de calculer la concentration de l’analyte cible dans l’échantillon.

D’autre types de séquences d’impulsions magnétiques sont possible. Des exemples sont décrits dans la publicationFast Magnetic Field-Enhanced Linear Colloidal Agglutination Immunoassay, Daynèset al., Anal. Chem. 2015, 87, 7583-7587.

Dans la présente invention, le premier champ magnétique B₀appliqué durant l’étape b. peut être identique ou différent du deuxième champ magnétique B1 appliqué à l’étape e.

Il peut être avantageux d’appliquer des champs magnétiques ayant des propriétés différentes durant ces deux étapes. Ceci est le cas dans le mode de réalisation où l’on prévoit l’extraction des premiers complexes du milieu liquide. Dans ces conditions, pour permettre une capture optimale des premières particules magnétiques 10, le champ B₀de l’étape b. doit combiner une intensité importante (typiquement supérieure à 100 mT) avec un gradient important dans la direction d’aimantation. Au contraire, il est préférable d’appliquer un champ B1 d’intensité modérée (typiquement inférieure à 50 mT) et dont le gradient est faible pour l’étape e. On pourra également appliquer le champ B1 de l’étape e. sous la forme de plusieurs impulsions, séparées par des périodes de relaxation. La durée et l’intensité de ces impulsions peut être variable.

Plus généralement, l’application du deuxième champ magnétique B1 comporte de préférence une pluralité d’impulsions magnétiques, séparées par des temps de repos. Dans un mode de réalisation, cette étape e. prévoit une aimantation à 8 mT pendant 1 seconde, suivi de trois séquences successives d’aimantations et de coupures suivantes : 15 mT pendant 60 secondes, 0 mT pendant 28 secondes, 8 mT pendant 1 seconde, 0 mT pendant 1 seconde :

1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, 0mT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT].

Les différentes impulsions à 8 mT pendant 1 seconde permettent essentiellement une lecture plus précise de l’état d’agrégation des particules PM1 en cas de présence d’analyte interférent. La série d’impulsions/repos de 15 mT pendant 60 secondes, suivie de repos (0 mT) pendant 28 secondes, suivie de 8 mT pendant 1 seconde, suivie de repos (0 mT) pendant 1 seconde permet essentiellement la formation de complexes.

Les deuxièmes complexes 61 forment des agrégats qui sont détectables par une mesure de densité optique ou par comptage par exemple. Plus généralement, les deuxièmes complexes peuvent être détectés du fait que les particules magnétiques sont agrégées entre elles du fait de la liaison de l’analyte cible aux deux récepteurs (sandwich), alors que le signal d’un premier complexe ne diffère pas significativement de celui d’une particule magnétique libre, étant donné la différence de taille (et/ou indice optique et/ou moment magnétique) entre une particule magnétique et une molécule d’analyte cible.

Ainsi, l’étape f. du procédé de l’invention vise la détermination de la quantité de deuxièmes complexes formés afin d’en déduire la quantité d’analytes cibles présents dans l’échantillon biologique. Pour cela, l’étape f. prévoit la mesure de l’ensemble des agrégats, c’est-à-dire la totalité des deuxièmes complexes et le cas échéant des agrégats interférents.In fine, cette mesure permet de déterminer la quantité de deuxièmes complexes 61 formés à l’étape e., et ce en particulier en fonction de la mesure d’agrégats interférents seuls effectuée au préalable à l’étape d. Le résultat de la mesure permet ensuite de calculer la quantité d’analyte cible 20 présent dans l’échantillon biologique.

L’invention a l’avantage d’identifier non seulement l’analyte cible, mais également un analyte interférent, voire plusieurs analytes interférents.

Il est maintenant fait référence aux figures 6, 7 et 8 pour décrire plus en détail les étapes du procédé avec la présence d’un analyte interférent.

L’étape a. (voir ) comprend dans ce cas non seulement la formation des premiers complexes C1, mais également la formation de complexes interférents Cint par la liaison entre les premières particules magnétiques 10 et un analyte interférant 30. Les complexes interférents Cint sont alors dispersés dans le milieu liquide de l’échantillon biologique.

Plus généralement, dans l’étape a. les particules magnétiques 10 portant des récepteurs spécifiques 101 sont mises en contact avec la molécule à doser 20, en présence d’autres espèces 30, 40, qui peuvent être des molécules solubles, des cellules, des particules, ou autre. L’une parmi ces espèces (les molécules 30 sur la ) se lie de manière non spécifique aux premières particules magnétiques 10. La molécule 20 est néanmoins capturée par les récepteurs 101.

Lors de l’étape b. (voir ), les premières particules magnétiques 10 sont attirées ou organisées localement au sein du milieu liquide selon le champ B₀généré par l’aimant. Dans le mode particulier de l’invention décrit plus haut en référence à l’extraction des particules magnétiques, le milieu liquide est remplacé par le tampon de réaction. Dans ce cas précis, il convient d’utiliser un aimant permanent (non montré sur les dessins) qui attire les particules magnétiques.

Plus généralement, les molécules 20 (analyte cible) liées aux récepteurs 101 ainsi que les molécules 30 liées de manière non-spécifique au particules magnétiques 10 sont réunies localement au sein du milieu liquide. Cet assemblage local à un endroit donné au sein du milieu liquide des premiers complexes C1 et des complexes interférents Cint a pour conséquence la formation d’agrégats non-spécifiques 60 (ou agrégats interférents 60) entre les premiers complexes C1 et les complexes interférents Cint. Ces agrégats non spécifiques peuvent également se former par l’agglomération des complexes interférents Cint entre eux. Plus généralement, les agrégats non spécifiques se forment de manière essentiellement identique aux complexes d’intérêt, c’est-à-dire entre un complexe Cint et une particule magnétique voisine. Celle-ci peut être liée à une molécule d’analyte (C1), à une molécule interférente (Cint), ou être une particule libre PM1. Ces agrégats non-spécifiques 60 sont détectables en milieu liquide, par mesure de turbidimétrie par exemple (voir ).

Une fois les agrégats formés, l’étape d. permet la mesure quantitative de ceux-ci dans le milieu liquide.

Comme expliqué plus haut, l’étape f. utilise la mesure faite durant l’étape d. pour calculer la quantité des agrégats spécifiques constitués par les deuxièmes complexes. À cet effet, le calcul tient compte à la fois de la mesure réalisée à l’étape d. et de celle effectuée à l’étape f. On peut ainsi en déduire la quantité d’analyte cible présent dans l’échantillon biologique.

La mesure de l’état d’agrégation lors de l’étape d. permet de limiter le risque d’interférences pouvant mener à des résultats faux positifs. En présence d’une molécule pouvant entraîner de telles interférences, l’étape b. peut mener à la formation d’agrégats non-spécifiques de premières particules magnétiques 10 (PM1). En l’absence de l’étape d., ces agrégats seraient détectés lors de l’étape f. seulement, et ce sans qu’il soit possible de distinguer les agrégats spécifiques, provoqués par la présence de la molécule à doser (analyte cible), des agrégats non-spécifiques, provoqués par la présence d’une autre molécule (analyte interférent). En appliquant l’étape d., il est par exemple possible de déterminer un seuil d’agrégation initial au-delà duquel aucun résultat ne sera rendu, du fait d’interférences, évitant ainsi de rendre des résultats erronés. Un avantage de l’invention est que les mesures d’agrégation lors des étapes d. et f. peuvent être combinées pour calculer une estimation de l’agrégation spécifique, en excluant l’agrégation non-spécifique.

Optionnellement, il est aussi possible de stopper le procédé de l’invention après l’étape d. Si la quantité d’agrégats non spécifiques mesurée est trop élevée et/ou dépasse un seuil de sensibilité prédéfini, le procédé de l’invention peut être interrompu après réalisation de la mesure de l’étape d. Il est alors possible de recommencer le procédé de l’invention en sélectionnant d’autres récepteurs spécifiques à l’analyte cible.

Dans un mode particulier de l’invention, le procédé décrit ci-avant est donc stoppé après l’étape d, à savoir après la mesure de la première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide. À cet effet on peut fixer une grandeur seuil au-delà de laquelle les résultats ne sont pas suffisamment sensible. On évite ainsi l’exécution des étapes subséquentes qui deviennent inutiles ou du moins inexploitables. Des surcoûts et des pertes de temps inutiles peuvent ainsi être évités.

EXEMPLES DE RÉALISATION

Une première série d’expériences (exemples 1 à 3) est réalisée en vue de démontrer la faisabilité et la sensibilité de l’invention.

EXEMPLE 1

Un test de dosage de la PSA (prostate-specific antigen) est mis en œuvre. Des particules magnétiques (Carboxyl Adembeads 200nm, Ademtech), sont fonctionnalisées avec des anticorps anti-PSA. Un lot de particules est fonctionnalisé avec un premier clone (P4, référence 7820-0370, disponible auprès de la société Bio-Rad). En référence à la description générale, il s’agit des premières particules magnétiques PM1. Un deuxième lot est fonctionnalisé avec un second clone reconnaissant un épitope différent (214, référence 7820-0217, disponible auprès de la société Bio-Rad). En référence à la description générale, il s’agit des deuxièmes particules magnétiques PM2. Les échantillons consistent en PSA (référence P3338, disponible auprès de la société Sigma-Aldrich) purifiée à 100nM diluée dans du sérum de cheval (référence H1270, disponible auprès de la société Sigma-Aldrich) à différentes concentrations. La concentration cible de PSA dans les échantillons est donc connue.

Le dosage des échantillons est mené comme suit :

71.5 µL d’échantillon sont mis en contact avec 1.5µL de particules fonctionnalisées PM1 (P4) à 1% pendant 2 min ;

Le milieu est aimanté 3 min sur un aimant permanent, et le surnageant est éliminé ;

Les particules sont reprises par 73.5 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN₃0.09% et 1.5 µL de particules fonctionnalisées PM2 (214) à 1% sont ajoutés.

Le milieu réactionnel ainsi formé est soumis à la séquence de champ magnétique suivante :

1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, 0mT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT].

L’intensité lumineuse à travers le milieu réactionnel éclairé par une RC-LED à 650 nm est mesurée et la différence de densité optique avant et après application de la dernière impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff₃) est utilisée comme signal d’intérêt.

Des mesures témoins sont réalisées avec les mêmes échantillons et les mêmes particules, mais sans étape d’extraction (étape c. en référence à la description générale). Le milieu réactionnel, constitué de de 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN₃0.09%, 15 µL d’échantillon et 1.5 µL de chaque lot de particules fonctionnalisées, est soumis au même cycle de champ magnétique que décrit ci-dessus.

On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 1 ci-dessous, en fonction de la concentration en PSA dans les échantillons testés.

[PSA] (nM)	0	0.5	1	2	4
Dodiff3 (extraction)	10.27	22.49	34.35	53.45	59.01
Dodiff3 (témoin)	8.87	14.62	22.14	35.42	52.12

Tableau 1.

La montre les résultats et les courbes correspondantes des Dodiff3 en fonction de la concentration en PSA.

On constate que la méthode utilisant le procédé selon l’invention permet d’obtenir un signal croissant avec la concentration en PSA dans l’échantillon, et avec une activité supérieure aux essais témoin.

EXEMPLE 2

Des essais permettant de simuler la présence d’une molécule interférente dans l’échantillon d’intérêt sont mis en œuvre. Des particules magnétiques (Carboxyl Adembeads 200 nm, de la société Ademtech), sont fonctionnalisées avec des anticorps anti-PSA. Un lot de particules PM1 est fonctionnalisé avec un premier clone (P4, référence 7820-0370, disponible auprès de la société Bio-Rad), et un deuxième lot PM2 est fonctionnalisé avec un second clone reconnaissant un épitope différent (214, référence 7820-0217, disponible auprès de la société Bio-Rad). Les échantillons consistent en une solution de NaCl à 9 g/L dans laquelle est ajouté un anticorps (Ac) anti-IgG de souris (M8642, disponible auprès de la société Sigma-Aldrich) capable de se lier de manière non-spécifique aux anticorps anti-PSA greffés sur les particules.

Le dosage des échantillons est mené comme suit :

71.5 µL d’échantillon sont mis en contact avec 1.5µL de particules fonctionnalisées PM1 (P4) à 1% pendant 2 min ;

Le milieu est aimanté 3 min sur un aimant permanent, et le surnageant est éliminé ;

Les particules sont reprises par 73.5 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN₃0.09% et 1.5 µL de particules fonctionnalisées PM2 (214) à 1% sont ajoutés.

Le milieu réactionnel ainsi formé est soumis à la séquence de champ magnétique suivante :

1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, 0mT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT].

L’intensité lumineuse à travers le milieu réactionnel éclairé par une RC-LED à 650nm est mesurée et la différence de densité optique avant et après application de la dernière impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff3) est utilisée comme signal d’intérêt. Ce même signal peut être mesuré lors de l’application de la première impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff0) pour déterminer l’agrégation du milieu avant application du champ magnétique.

Des mesures témoin sont réalisées avec les mêmes échantillons et les mêmes particules, mais sans étape d’extraction. Le milieu réactionnel, constitué de de 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; NaN₃0.09%, 15 µL d’échantillon et 1.5 µL de chaque lot de particules fonctionnalisées, est soumis au même cycle de champ magnétique que décrit précédemment.

On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 2 ci-dessous, en fonction de la concentration en anticorps dans les milieux réactionnels, en ce qui concerne la mesure avant agglutination :

[Ac] (nM)	0	2.2	4.4	8.8
Dodiff0(extraction)	2.72	13.02	15.3	6.08
Dodiff0(témoin)	1.41	1.84	2.12	1.41

Tableau 2.

La montre les résultats et les courbes correspondantes des Dodiff3 en fonction de la concentration en Ac avant agrégation.

Alors que le signal avant application du champ ne dépend pas de la concentration en anticorps interférent sur la mesure témoin, on constate que l’ajout de cet anticorps entraîne une augmentation du signal d’agrégation avant application du champ du fait de l’étape d’aimantation, ce qui permet d’envisager d’alarmer ces mesures.

On obtient les résultats suivants qui figurent dans le tableau 3 ci-dessous, en fonction de la concentration en anticorps dans les milieux réactionnels, en ce qui concerne la mesure après agglutination :

[Ac] (nM)	0	2.2	4.4	8.8
Dodiff3(extraction)	4.1	17.29	18.57	10.01
Dodiff3(témoin)	3.95	27.47	65.23	90.46

Tableau 3.

La montre les résultats et les courbes correspondantes des Dodiff3 en fonction de la concentration en Ac après agrégation.

Dans les deux cas, le signal d’agrégation est augmenté en présence de l’anticorps interférent. Ainsi, en l’absence de la mesure initiale menée lors de l’extraction, il serait impossible de déterminer si l’échantillon contient le la PSA ou une molécule interférente.

EXEMPLE 3

Des essais permettant de vérifier l’applicabilité du procédé de l’invention sur un échantillon de sang total sont menés.

Des particules magnétiques (Carboxyl Adembeads 200nm, disponibles auprès de la société Ademtech), sont fonctionnalisées avec des anticorps anti-PCT (procalcitonine). Un lot de particules PM1 est fonctionnalisé avec un premier clone (E86813M, disponibles auprès de la société Meridian Life Sciences), et un deuxième lot PM2 est fonctionnalisé avec un second clone reconnaissant un épitope différent (E01342M, disponibles auprès de la société Meridian Life Sciences). Les échantillons consistent en PCT recombinante à 400 nM diluée dans du sang humain à différentes concentrations. La concentration cible de PCT dans les échantillons est donc connue.

Le dosage des échantillons est mené comme suit :

71.5 µL d’échantillon sont mis en contact avec 1.5µL de particules fonctionnalisées E86813M à 1% et 71.5 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; DTT 10mM ; NaN3 0.09% pendant 2 min ;

Le milieu est aimanté 3 min sur un aimant permanent, et le surnageant est éliminé ;

Les particules sont reprises par 73.5 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8% ; NaCl 800 mM ; DTT 10mM ; NaN3 0.09% et 1.5 µL de particules fonctionnalisées E01342M à 1% sont ajoutés.

Le milieu réactionnel ainsi formé est soumis à la séquence de champ magnétique suivante :

1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, 0mT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT].

L’intensité lumineuse à travers le milieu réactionnel éclairé par une RC-LED à 650nm est mesurée et la différence de densité optique avant et après application de la dernière impulsion de 8 mT d’intensité (Dodiff3) est utilisée comme signal d’intérêt.

Les mêmes essais sont réalisés sur les échantillons de plasma issus des échantillons de sang. Ceux-ci sont centrifugés 10 min à 1500g pour en extraire le plasma. L’hématocrite de l’échantillon de sang étant de 40.4%, Il est alors possible de calculer la concentration plasmatique attendue en PCT en fonction de la concentration attendue de PCT dans le sang.

On obtient les résultats qui figurent dans les tableaux 4 (sang) et 5 (plasma) suivants :

[PCT]sang(nM)	0	0.0625	0.13	0.26	1.04
Dodiff3	6.83	22.82	37.1	48.62	79.75

Tableau 4.

[PCT]plasma(nM)	0	0.106	0.22	0.5	0.88	1.76
Dodiff3	8.19	39.02	52.99	72.81	79.74	81.91

Tableau 5.

La montre ces résultats dans un graphe.

On constate que le signal mesuré en fonction de la concentration en PCT dans l’échantillon est indépendant de la nature de celui-ci, sang ou plasma. Ceci démontre la possibilité d’appliquer la méthode décrite à un échantillon de sang total.

Une deuxième série d’expériences (exemples 4 à 7) est réalisée en vue de démontrer l’effet d’un anticorps interférent sur l’agrégation de particules magnétiques.

Pour cela des mesures d’agrégation en présence de différentes concentrations en anticorps anti-souris sont réalisées. Ceci est fait pour simuler ou mimer l’effet d’un anticorps interférent.

On utilise pour cette série d’expériences des particules Adembeads 200 nm fonctionnalisées soit par l’anticorps P4 (référence 7820-0370, disponibles auprès de la société Bio-Rad), soit par l’anticorps 214 (référence 7820-0217, disponibles auprès de la société Bio-Rad).

EXEMPLE 4 : Mesures sans PSA

Dans cette exemple les premières et deuxièmes particules magnétiques (PM1 et PM2) sont introduits dans le milieu liquide simultanément. En conséquence, il ne s’agit pas d’un exemple selon l’invention.

Dans un premier temps on réalise un cycle standard. Les échantillons préparés comprennent :

– 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;

– 15 µL d’anticorps anti-souris (M8642, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ;

– 3 µL de particules P4 1% w/v (weight per volume, ou p/v c.à.d. poids par unité de volume) ; et

– 3 µL de particules 214 1% w/v.

On applique ensuite aux échantillons le cycle suivant (Cagg) :

1 s, 8 mT + 3x[60 s, 15 mT + 28 s, 0mT + 1 s, 8 mT + 1 s, 0 mT].

On peut mesurer pour chaque échantillon la différence de densité optique avant et après la première impupulsion d’intensité 8 mT (Dodiff₀) comme indicateur du niveau initial d’agrégation des particules. Pour mesurer le niveau d’agrégation final, on peut mesurer la différence de densité optique avant et après la dernière impulsion d’intensité 8 mT (Dodiff₃) ou la différence de densité optique entre la fin et le début du cycle Cagg (ΔDO).

On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 6, en fonction de la concentration en anticorps (Ac) dans le milieu réactionnel :

[Ac] (nM)	0	1	2	3	4	5
ΔDO (mDO)	2,86	25,62	51,46	74,37	79,03	101,08
Dodiff0(mDO)	2,71	2,23	2,58	2,28	2,58	2,78
Dodiff3(mDO)	6,08	23,89	42,62	56,59	60,09	71,79

Tableau 6.

On constate que l’anticorps choisi provoque une interférence puisque la Dodiff₃ou le ΔDO augmentent avec la concentration en anticorps introduit. La mesure de la Dodiff₀, quant à elle, ne varie pas significativement avec la concentration en anticorps, ce qui ne permet donc pas d’alarmer cette interférence.

EXEMPLE 5 : Mesures sans PSA

Les échantillons préparés comprennent :

– 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM;

– 15 µL d’anticorps anti-souris (M8642, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ; et

– 3 µL de particules P4 1% w/v.

On applique le cycle Cagg (détaillé ci-dessus) à cet échantillon, puis on ajoute 3 µL de particules 214 1% w/v au milieu et on applique de nouveau le cycle Cagg.

On peut mesurer les mêmes indicateurs que précédemment sur le premier cycle, appliqué seulement aux particules P4 (Dodiff₀ ¹, Dodiff₃ ¹, ΔDO¹), ou sur le second cycle, appliqué à l’ensemble des particules (Dodiff₀ ², Dodiff₃ ², ΔDO²). On obtient les résultats figurants dans le tableau 7 ci-après :

[Ac] (nM)	0	1	2	3	4	5
ΔDO1(mDO)	1,39	13,96	25,84	31,87	35,36	45,75
Dodiff0 1(mDO)	1	0,99	1,09	0,89	0,77	0,96
Dodiff3 1(mDO)	1,82	12,7	22,15	25,67	28,19	34,69
ΔDO2(mDO)	2,22	19,65	40,27	50,02	54,94	61,28
Dodiff0 2(mDO)	3,21	13,72	22,83	26,53	28,59	34,63
Dodiff3 2(mDO)	4,87	28,54	51,43	56,41	63,23	74,97

Tableau 7.

Les indicateurs ΔDO²ou Dodiff₃ ²augmentent avec la concentration en anticorps introduit. Cependant, avec ce protocole, on peut utiliser les valeurs de ΔDO¹ou Dodiff₃ ¹pour détecter la présence d’agrégats préalablement à l’application du second cycle, liés à une interférence dans l’échantillon. Ainsi, dans cet exemple, l’application d’un seuil choisi à 5 mDO permet de détecter les échantillons contenant l’anticorps interférent.

EXEMPLE 6 : Courbes dose-réponse PSA

Dans cette exemple les premières et deuxièmes particules magnétiques (PM1 et PM2) sont introduits dans le milieu liquide simultanément. En conséquence, il ne s’agit pas d’un exemple selon l’invention.

Dans un premier temps, on réalise une courbe dose-réponse sans anticorps interférent.

Les échantillons comprennent :

– 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;

– 15 µL de PSA (P3338, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ;

– 3 µL de particules P4 1% w/v ; et

– 3 µL de particules 214 1% w/v.

Après application du cycle Cagg, on obtient les résultats figurants dans le tableau 8 ci-dessous :

[PSA] (nM)	0	1	3	5	10
ΔDO (mDO)	2,86	6,45	14,27	20,83	33,28
Dodiff0(mDO)	2,71	2,23	2,18	2,56	2,11
Dodiff3(mDO)	6,08	9,11	17,32	24,24	33,5

Tableau 8.

Ensuite, une courbe dose-réponse en ajoutant un anticorps anti-souris est réalisée.

Pour cela, les échantillons comprennent :

– 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;

– 15 µL de PSA (P3338, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L + 5 nM d’anticorps anti-souris ;

– 3 µL de particules P4 1% w/v ; et

– 3 µL de particules 214 1% w/v.

On a donc une concentration en anticorps de 1 nM dans le milieu réactionnel. Après application du cycle Cagg, on obtient les résultats figurants dans le tableau 9 ci-dessous :

[PSA] (nM)	0	1	3	5	10
ΔDO (mDO)	25,62	30,98	38,59	42,72	49,9
Dodiff0(mDO)	2,23	2,48	2,17	2,35	2,07
Dodiff3(mDO)	23,89	30,63	33,57	39,42	45,52

Tableau 9

La reporte ces résultats dans un graphe.

On constate qu’en l’absence ou en présence d’anticorps anti-souris, la valeur de Dodiff₀ne varie pas significativement, et ne permet donc pas de prédire la présence d’une molécule interférente. Or, cette molécule mène à une surestimation des valeurs de Dodiff₃ou de ΔDO. Ainsi, en reportant les valeurs de ΔDO mesurées en présence de l’anticorps sur la courbe dose réponse en l’absence d’anticorps, employée comme courbe étalon, on aboutirait à une surestimation des titres en PSA. Par exemple, l’échantillon ne comportant pas de PSA serait dosé à 5 nM environ, et l’échantillon contenant 1nM de PSA serait titré à plus de 8 nM.

Exemple 7 : Courbes dose-réponse PSA

Dans un premier temps, on réalise une courbe dose-réponse sans anticorps interférent.

Les échantillons comprennent :

– 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;

– 15 µL de PSA (M8642, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L ; et

– 3 µL de particules P4 1% w/v.

On applique le cycle Cagg à cet échantillon, puis on ajoute 3 µL de particules 214 1% w/v au milieu et on applique de nouveau le cycle Cagg.

On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 10 ci-dessous, en fonction de la quantité de PSA présente dans le milieu réactionnel :

[Ac] (nM)	0	1	3	5	10
ΔDO1(mDO)	1,39	0,93	1,07	1,23	1,89
Dodiff0 1(mDO)	1	0,72	0,86	0,9	0,77
Dodiff3 1(mDO)	1,82	1,78	2,19	2,58	3,21
ΔDO2(mDO)	2,22	11,51	22,98	33,79	51,34
Dodiff0 2(mDO)	3,21	2,98	3,6	3,44	4,57
Dodiff3 2(mDO)	4,87	14,03	25,83	34,35	47,64

Tableau 10.

On constate qu’alors que les valeurs de Dodiff₃ou de ΔDO augmente avec la quantité de PSA après le second cycle d’agglutination, comme attendu, elles ne varient pas significativement après le premier cycle agglutination, puisque les agrégats spécifiques ne se forment qu’entre des particules portant l’anticorps P4 et des particules portant l’anticorps 214. Ces échantillons ne seront donc pas alarmés en conservant l’hypothèse d’un seuil à 5 mDO comme décrit plus haut.

On réalise ensuite une courbe dose-réponse en ajoutant un anticorps anti-souris.

Les échantillons comprennent :

– 57 µL de tampon HEPES 50 mM, pH 7.5 ; F108 0.8 % ; NaCl 800 mM ;

– 15 µL de PSA (M8642, Sigma-Aldrich) à la concentration souhaitée dans une solution de NaCl 9 g/L + 5nM d’anticorps anti-souris ; et

– 3 µL de particules P4 1% w/v.

On applique le cycle Cagg à cet échantillon, puis on ajoute 3 µL de particules 214 1% w/v au milieu et on applique de nouveau le cycle Cagg.

On obtient les résultats qui figurent dans le tableau 11 ci-dessous, en fonction de la quantité de PSA présente dans le milieu réactionnel :

[Ac] (nM)	0	1	3	5	10
ΔDO1(mDO)	13,96	14,92	13,9	11,83	11,63
Dodiff0 1(mDO)	0,99	0,89	0,87	0,8	0,72
Dodiff3 1(mDO)	12,7	13,95	13,88	11,82	12,09
ΔDO2(mDO)	19,65	28,29	40,83	48,06	58,91
Dodiff0 2(mDO)	13,72	15	14,69	12,69	13,06
Dodiff3 2(mDO)	28,54	36,01	44,95	47,54	56,29

Tableau 11

Les valeurs de Dodiff₃ ²ou de ΔDO²sont plus élevées, à concentration en PSA donnée, que dans le cas sans anticorps interférent. Cependant, contrairement à la mesure standard, ici la mesure de Dodiff₃ ¹ou de ΔDO¹permet de détecter la présence de la molécule interférente. Il est donc possible d’appliquer une alarme pour éviter de rendre un résultat erroné.

La montre les différences de densité optique (mDO) des Dodiff₃ ¹respectivement avec et sans anticorps interférant.

Le procédé de l’invention peut être réalisé dans un dispositif de type connu, au besoin adapté au moyen des connaissances de l’homme du métier.
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Claims (14)

1. Procédé de dosage d’un analyte cible (20) dans un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant les étapes suivantes :

   1. la mise en contact de l’échantillon biologique avec de premières particules magnétiques (10) portant un premier récepteur (101) spécifique à un premier site d’attache de l’analyte cible (20) de sorte à former de premiers complexes par la liaison de premières particules magnétiques (10) avec l’analyte cible (20) cette mise en contact s’accompagnant, lorsqu’un analyte interférent (30) est présent dans l’échantillon, de la formation de complexes interférents par la liaison non-spécifique dudit analyte interférent (30) aux premières particules magnétiques (10) ;
   2. l’application d’un premier champ magnétique, et son maintien, de sorte à réunir localement l’ensemble des complexes formés à l’étape a., et le cas échéant à agglomérer des complexes interférents entre eux pour former des agrégats interférents ;
   3. l’annulation du premier champ magnétique appliqué à l’étape b. et l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques (11) portants un deuxième récepteur (111) spécifique à un deuxième site d’attache de l’analyte cible (20) ;
   4. la mesure d’une première grandeur représentative de la quantité d’agrégats interférents dans le milieu liquide, pour identifier la présence ou non desdits agrégats interférents ;
   5. l’application d’un deuxième champ magnétique de sorte à former des deuxièmes complexes (61) par la liaison des premiers complexes avec des deuxièmes particules magnétiques (11) ; et
   6. la mesure d’une deuxième grandeur représentative de l’ensemble de la quantité d’agrégats interférents et de la quantité des deuxièmes complexes (61) dans le milieu liquide de sorte à déterminer la quantité de deuxièmes complexes (61) formés à l’étape e. en fonction de la première grandeur pour en déduire la quantité d’analyte cible (20) présent dans l’échantillon biologique, et le cas échéant la quantité d’analyte interférent (30).
2. Procédé de dosage selon la revendication 1, dans lequel l’étape f. comporte le calcul de la différence entre la deuxième grandeur mesurée à cette étape f. et la première grandeur mesurée à l’étape d.
   
3. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les étapes c. et d. sont exécutées sensiblement simultanément.
4. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape d. est réalisée après l’annulation du premier champ magnétique, avant l’ajout dans le milieu liquide de deuxièmes particules magnétiques.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le maintien du champ magnétique appliqué à l’étape b. est inférieur ou égal à une durée de 5 minutes, de préférence inférieur ou égal à une durée de 3 minutes.
6. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’application du deuxième champ magnétiques comporte une aimantation à 8 mT pendant 1 seconde, suivi de trois séquences successives d’aimantations et de coupures suivantes : 15 mT pendant 60 secondes, 0 mT pendant 28 secondes, 8 mT pendant 1 seconde, 0 mT pendant 1 seconde.
7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la mesure de la première et/ou de la deuxième grandeur est choisie parmi le groupe constitué d’une mesure par turbidimétrie, une mesure par néphélométrie et une mesure par comptage.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape a. comporte l’ajout d’un diluant de manière à diluer l’échantillon biologique, le rapport entre l’échantillon et le diluant étant supérieur ou égal à 1:10 (volume).
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape b. comporte l’extraction des premiers complexes du milieu liquide.
10. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape b. comporte une sous-étape b1. comprenant l’élimination du milieu liquide suivi de l’ajout d’un tampon de réaction, et de préférence au moins un lavage entre l’élimination du milieu liquide et l’ajout du tampon de réaction.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le tampon de réaction comprend au moins un agent anti-agrégation et/ou un agent de lyse cellulaire.
12. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon est un échantillon de sang total.
13. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les agrégats interférents sont identifiés lorsque la première grandeur dépasse une grandeur seuil prédéfinie.
14. Dispositif agencé pour réaliser le procédé selon l’une des revendications précédentes.