FR2917173A1 - Procede multiplexe de detection d'une infection - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détection diagnostique in vitro d'une infection par un microorganisme, comprenant la mise en présence, dans un seul récipient d'essai, d'un échantillon biologique avec des particules, porteuses chacune d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture anti-IgM et l'autre groupe étant porteur d'un antigène de capture dérivé dudit microorganisme,
Description
L'invention concerne la détection in vitro d'une infection par un
microorganisme infectieux, notamment viral. L'invention concerne un procédé de détection simultanée des immunoglobulines totales et des immunoglobulines M dirigées contre ce même microorganisme infectieux.
L'invention concerne plus particulièrement la détection simultanée des immunoglobulines totales et des immunoglobulines M dirigées contre un virus de l'hépatite humaine. Les infections provoquées par les microorganismes, en particulier par des virus tels que, par exemple, les virus de l'hépatite chez l'homme, io constituent, de manière générale, un problème de santé préoccupant et reconnu depuis longtemps, en particulier en transfusion sanguine et en diagnostic. D'une manière générale, afin d'éviter la propagation incontrôlée d'un agent infectieux, en particulier d'un virus de l'hépatite, il est essentiel de 15 déterminer le plus précocement possible si un échantillon de patient, ou une poche de sang en transfusion, est contaminé par un tel agent ou virus. Par ailleurs, il est tout aussi important de pouvoir suivre l'état immunitaire du patient tout au long de l'infection afin de déterminer si le patient est entré en convalescence ou non, et ainsi appliquer les mesures thérapeutiques 20 appropriées et/ou une vaccination quand celles-ci existent. Les méthodes de détection in vitro de ce type d'infection reposent le plus fréquemment sur la détection par immunoessai (ou dosage immunologique) des anticorps dirigés contre les agents infectieux. Les immunoglobulines M ( IgM ), qui sont d'apparition précoce et transitoire signent une infection 25 récente aiguë, ou primaire. Les immunoglobulines totales qui regroupent les différents isotypes d'immunoglobulines (IgM, IgG et IgA) signent la chronicité ou la durée dans le temps de l'infection, ou encore la phase de convalescence du patient. A distance d'une infection aiguë, les immunoglobulines totales sont majoritairement constituées d'IgG support de l'immunité à long terme (Hollinger 30 et al., Fields Virology, p. 735-785, 1996). C'est pour cette raison qu'il est important de pouvoir différencier, tout du long d'une infection, les IgM et les immunoglobulines totales chez un patient. Ceci est un cas de figure très général en sérologie in vitro.
Ce type de problématique se retrouve notamment dans le cas des infections provoquées par les virus de l'hépatite chez l'homme : infection par le virus de l'hépatite A dénommé VHA; infection par le virus de l'hépatite B dénommé VHB, etc... Une situation comparable se retrouve avec d'autres virus du sang chez l'homme : les virus HSV (Herpes simplex virus), CMV (Cytomégalovirus), virus de la dengue, autres flavivirus, [tels que le virus du Nil occidental (West Nile Virus)], les virus de la rubéole, de l'influenza, VZV (Varicella Zooster Virus), etc..., avec diverses bactéries (Treponema pallidum, 8orrelia burgdorferi, etc...), et divers parasites unicellulaires (Toxoplasma io gondii, par exemple). La détection des immunoglobulines totales par le format indirect (réaction de l'échantillon sur une phase solide porteuse de l'antigène cible, puis révélation par un anticorps anti immunoglobuline humaine, marqué) est connue depuis de nombreuses années, entre autres, avec les brevets pionniers de 15 l'ELISA dans les années 1970. Cependant ce format n'est pas préféré car il est sujet à interférence non-spécifique, entre autres, par le facteur rhumatoïde, présent potentiellement dans l'échantillon testé. De plus, Heinz FX, et al. Comparison of two different enzyme immunoassays for detection of tick-borne encephalitis virus in serum and 20 cerebrospinal fluid (Journal of Clinical Microbiology, 14 : p. 141-146, (1981)), a noté l'existence, en essai EIA (essai immunoenzymatique) indirect de détection d'IgM, d'une compétition entre les IgM et les IgG qui affecte la sensibilité et la spécificité de la détection finale. La détection des immunoglobulines totales par le format sandwich 25 double antigène (réaction de l'échantillon porteur d'immunoglobulines à détecter avec une phase solide porteuse de l'antigène, puis révélation par un deuxième antigène, marqué détectablement) est connue depuis 1978 (Maiolini, R. et al. ; Journal of Immunological Methods, 20 (1978) p. 25-34 ; et aussi la demande de brevet français publiée avec le FR 2 383 446). 30 La détection des immunoglobulines spécifiques de classe par le format capture d'immunoglobuline est connue, elle aussi, depuis de nombreuses années. Elle a été décrite en 1979 par Duermeyer W. et al., (Journal of Medical Virology 4 (1979) : p. 25-32) pour la détection spécifique des IgM anti VHA par ELISA (Voir aussi le brevet US 4,292,403). Le principe de l'essai repose sur l'utilisation de cupules de microplaque revêtues d'anticorps anti IgM humaine, auxquelles est ajouté l'échantillon sanguin contenant les IgM à détecter. Après un temps d'incubation, les cupules de la microplaque sont lavées et de l'antigène VHA est ajouté en quantité connue, puis mis à incuber. Finalement, après un autre lavage, tout antigène lié à la cupule est alors détecté par une ultime incubation réalisée en présence d'un anticorps (F(ab')2), dirigé contre l'antigène VHA et marqué par une enzyme. Le brevet US 4,273,756 décrit pareillement des formats capture des immunoglobulines spécifiques de classe pour la détection des IgA, IgD, IgE, IgG et IgM dirigées contre divers io virus de l'hépatite (VHA, VHB). D'une manière générale, et au-delà du seul diagnostic relatif au VHA, on a bien entendu, pour des raisons évidentes de coût et de simplification, cherché à mettre au point une méthode pour détecter simultanément les IgM précoces et les IgG (qui constituent généralement l'essentiel des 15 immunoglobulines totales) plus tardives. Tel que le rapportent 011i Meurman ("Detection of antiviral IgM antibodies and its problems - A rewiew", in New Developments in Diagnostic Virology, Peter A. Bachmann editor, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York 1983) et W . Duermeyer ( A new principle for the detection of specific 20 IgM antibodies applied in an ELISA for hepatitis A ), (Journal of Medical Virology 4 (1979) : p. 25-32 - supra) les tentatives faites se sont avérées consommatrices de temps et trop lourdes. En effet, elles impliquent une étape préliminaire de séparation des différents types d'immunoglobulines soit par ultracentrifugation zonale ou sur gradient de saccharose, soit par filtration sur 25 gel, soit par adsorption des IgG par la protéine A staphyloccale ou par un anticorps anti Fc gamma, soit encore par clivage des IgM par le R-mercaptoéthanol. Une autre alternative est de combiner deux révélations différentes. Angarano et al., (Journal of Clinical Microbiology, June 1984, p. 905-910) 30 propose un système de détection simultané d'IgM et Ig totales (IgG essentiellement) anti HBc, appelé RIELISA (Radio-Immune Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay), qui combine un radio-immunoessai compétitif pour la détection des immunoglobulines totales anti HBc (essai CORAB d'Abbott Laboratories) avec un immunoessai ELISA indirect pour la détection des IgM anti HBc. Dans les deux essais, un même antigène (antigène HBc recombiné) est adsorbé sur une seule et unique phase solide (une bille de polystyrène, déposée dans une cupule), mais on utilise, d'un côté, un anticorps dirigé contre l'antigène HBc et marqué radioactivement (iode125) pour la détection des immunoglobulines totales anti HBc, et, de l'autre, un anticorps anti IgM marqué enzymatiquement (à la peroxydase) pour la détection des IgM anti HBc. Angarano et al. (supra), précise que le seul point crucial est que le marquage de l'anticorps spécifique de l'antigène doit être différent et ne pas interférer avec celui de l'anticorps spécifique de classe de l'immunoglobuline. io Il est évident que le système d'Angarano et al., avec ses deux systèmes signal (i.e. à deux marqueurs détectables) distincts obligatoires, n'a rien de simple : après une première étape immunologique réalisée simultanément pour les deux essais, il faut faire la mesure des signaux de manière séparée, séquentielle et complexe. En effet, on commence par la mesure du premier 15 signal, radioactif, lié à la phase solide, reflétant ainsi le taux d'immunoglobulines totales anti HBc, puis dans un deuxième temps, on procède à l'addition, à la bille, de l'anticorps anti IgM marqué à la peroxydase, puis, après incubation, à l'addition du mélange substrat (H2O2) + chromogène (OPD). Après l'incubation et le développement de la couleur, on arrête cette 20 ultime réaction à l'acide chlorhydrique et on mesure la densité optique finale obtenue, qui reflète le taux des IgM anti HBc. De plus, comme on peut le constater, le système complexe d'Angarano et al., qui a le mérite de clairement différencier les taux d'immunoglobulines totales anti HBc et les taux d'IgM anti HBc, suppose néanmoins de prendre des 25 précautions particulières en raison des risques associés à la manipulation de composés radioactifs (iode125, en l'occurrence). Enfin la méthodologie d'Angarano et al. doit toujours recourir à l'élimination préalable de l'interférence du facteur rhumatoïde (inhérente au système d'immunoessai indirect utilisé pour la détection d'IgM) par l'addition d'immunoglobuline G agrégée 30 thermiquement dans le tampon de dilution. Tout cela rend la méthodologie d'Angarano et al. peu avantageuse. Classiquement, la détection des IgM et IgG dirigées contre le même virus se fait principalement par la réalisation de deux immunoessais sur phase solide séparées, pour éviter toute interférence possible entre les deux essais et obtenir des signaux IgM et IgG bien différenciés. On a ainsi utilisé, en format classique de capture d'immunoglobuline deux phases solides distinctes par exemple, deux cupules de microplaque selon Duermeyer W. et al. (supra) ou deux bandelettes de nitrocellulose selon la technique de Venture Technologies Malaisie (Médecines et maladies infectieuses, 33, 2003, p. 396-412). L'une est revêtue d'anticorps anti IgM et l'autre d'anticorps anti IgG, et l'on a ajouté l'échantillon pour chacun des essais. Ces techniques nécessitent donc la réalisation de deux tests distinctifs io et sont donc peu avantageuses. Par ailleurs, il est possible d'utiliser de multiples types de techniques de détection par immunoessai des immunoglobulines : à côté de l'ELISA et du radioimmunoessai évoqués plus haut, il existe des techniques par immunofluorescence, immunoluminescence, etc...en phase hétérogène ou 15 homogène, etc... Il existe aussi des techniques reposant sur l'immunoagglutination particulaire dont le signal final peut être détecté visuellement ou quantifié à l'aide d'un instrument de détection, inter alla, à l'aide d'un instrument de détection par cytométrie en flux. L'un des avantages bien connus de la mesure par cytométrie en flux est qu'elle constitue un moyen 20 rapide et sensible de détection d'un analyte. La cytométrie en flux repose sur le passage d'une suspension de microparticules, sous forme d'un courant, devant un rayon lumineux. Des capteurs électro-optiques font qu'une seule particule à la fois passe devant le rayon lumineux. Le signal provoqué par la perturbation du rayon lumineux lors 25 du passage de la particule est alors détecté et enregistré. Le brevet US 6,872, 578 B2 décrit en particulier un système d'immunoessai multiplex (i.e. un système d'immunoessai à détection simultanée de plusieurs analytes dans un échantillon unique). Ce système combine en immunoessai hétérogène l'utilisation de la cytométrie en flux et de 30 plusieurs groupes de particules solides. Ces particules sont magnétiques et portent, chacune, un paramètre détectable particulier (i.e. une caractéristique physique telle que, par exemple, une taille, une couleur unique ou encore une fluorescence spécifique). Chaque groupe de microparticules comprend une gamme de valeurs permettant de différencier les particules en plusieurs groupes non-chevauchants distinguables par des méthodes de détection automatisées appropriées aux paramètres concernés. Ces particules portent, chacune, lié à la surface, un réactif d'essai différent d'un groupe à l'autre. Toutes les particules d'un même groupe portent le même réactif. La caractéristique magnétique de ces particules permet l'automatisation des séparations des phases solides et liquides lors des lavages. Le brevet US 6,872, 578 B2 décrit, entre autres, un exemple de détection simultanée d'anticorps de différentes classes d'immunoglobulines io (IgG et IgM) dirigées contre l'antigène du virus de la rubéole. Dans cet exemple, les IgG et IgM sont immunopurifiées par utilisation d'une première particule magnétique sensibilisée avec l'antigène spécifique des IgG et IgM à détecter. Après cette première incubation les immunoglobulines non spécifiques sont éliminées lors du lavage. Les immunoglobulines spécifiques, 15 qui sont capturées par l'antigène adsorbé sur la particule, sont ensuite libérées dans le surnageant par ajout d'acide acétique. Ce surnageant est ensuite transféré dans un autre tube et les IgG et IgM sont dosées à l'aide d'un format de type sandwich utilisant des phases solides et des conjugués constitués d'anticorps anti IgM humaines et anti IgG humaines. Cette technique est lourde 20 car elle nécessite un prétraitement de l'échantillon pour ne conserver que les Ig spécifiques de l'antigène. On peut aussi utiliser, comme c'est le cas du système Multimetrix Borrelia IgG- or IgM- assay , de la société Multimetrix GmbH, (Heidelberg, Allemagne), un mélange de particules revêtues, chacune, d'un antigène 25 Borrelia recombiné différent, et une détection différentielle des IgM et IgG par format indirect à l'aide d'anticorps anti IgG et d'anticorps anti IgM marqués par un marqueur fluorescent (la phycoérythrine). La fluorescence du complexe final de chaque bille est mesurée en cytométrie en flux par un analyseur de la société Luminex Corporation. Aucune étape de lavage n'est requise, ce qui en 30 fait un immunoessai simplifié. Toutefois, le protocole requiert plusieurs tubes réactionnels et plusieurs réactifs vendus sous des références de trousses (kits) différentes. Ce système est présenté selon la brochure commerciale obtenue comme étant sensible et fiable. Le principe de détection des anticorps IgG et IgM anti EBV sur Bioplex 2200 , décrits dans la publication de Klutts et al. (Journal of Clinical Microbiology, November 2004, p. 4996-5000) est identique. Il nécessite, comme ci-dessus, deux réactifs différents et les réactions immunologiques sont réalisées dans deux tubes réactionnels différents. Ces deux tests EBV utilisent un mélange de particules revêtues, chacune, d'un antigène EBV différent, et une détection différentielle des IgM et IgG par format indirect à l'aide d'anticorps anti IgG et d'anticorps anti IgM marqués par un marqueur fluorescent (la phycoérythrine), à l'aide de deux trousses différentes. La fluorescence du complexe final de chaque particule est mesurée en cytométrie en flux par un détecteur de la société Luminex Corporation. i0 Il existe donc un réel besoin de disposer d'une méthode de mise en oeuvre simple rapide, sensible, spécifique, quantitative ou semi-quantitative, reproductible, et automatisable ù en vue du dépistage sur toute la durée de l'infection et aussi en suivi pré- et post-vaccination - pour détecter et 15 différencier les IgM et les immunoglobulines totales (Ig totales) et ceci de façon totalement simultanée, c'est à dire à partir d'un seul et unique échantillon, non pré-traité, dans un seul et unique récipient d'essai, en un même nombre d'incubations, à l'aide d'un seul système signal, et en un seul temps unique de lecture des signaux. 20 Résumé de l'invention: Les auteurs de la présente invention se sont donc attachés à résoudre le problème posé ci-dessus et, pour cela, à mettre au point une méthode alternative de détection simultanée des IgM et immunoglobulines 25 totales dirigées contre un seul et même antigène dans un seul et unique récipient et à partir d'un seul et unique échantillon biologique, de préférence non pré-traité. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de détection diagnostique in vitro d'une infection par un microorganisme, comprenant la 30 détection simultanée des immunoglobulines G ou des immunoglobulines totales et des immunoglobulines M dirigées contre ledit microorganisme, présentes dans un échantillon biologique, procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en présence, dans un seul récipient d'essai, dudit échantillon biologique avec des particules, porteuses chacune d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture anti-IgM et l'autre groupe étant porteur d'un antigène de capture dérivé dudit microorganisme, b) l'incubation du mélange dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques sur chaque groupe de particules, c) l'élimination des immunoglobulines qui ne se sont pas liées aux particules io d) l'incubation du mélange de l'étape b) avec au moins un conjugué marqué, ledit au moins un conjugué étant exclusivement constitué d'un antigène de détection dérivé dudit microorganisme, e) l'élimination de l'antigène de détection non lié aux complexes immunologiques de l'étape b); 15 f) la détection simultanée, au moyen d'un détecteur capable de différencier les deux groupes de particules susdits, des complexes immunologiques de l'étape d) sur chaque particule, par ce en quoi est révélée la présence ou non d'immunoglobulines G ou d'immunoglobulines totales et/ou d'immunoglobulines M dirigées contre ledit microorganisme. 20
Selon un mode de réalisation particulier, les groupes desdites particules se différencient par des fluorochromes, détectables par un détecteur approprié. 25 De manière avantageuse, le détecteur approprié est associé à un cytomètre en flux . Le marquage de l'antigène de détection peut être direct ou indirect. Par exemple, l'antigène de détection peut porter une biotine, qui est révélée par l'ajout d'avidine ou streptavidine marquée. 30 De préférence, le microorganisme est un virus de l'homme, notamment les virus de l'hépatite humaine.
L'invention a également pour objet une trousse de diagnostic ou un ensemble de réactifs destinés à mettre en oeuvre le procédé de détection, comprenant notamment des particules, porteuses chacune d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture anti-IgM et l'autre groupe étant porteur d'un antigène de capture dérivé d'un microorganisme à détecter.
Description détaillée de l'invention : Les inventeurs, pour résoudre le problème posé, ont tout d'abord réalisé un essai multiplex de détection simultanée, en un seul récipient, d'IgG et IgM io anti-VHA dans un échantillon (sérum ou plasma), combinant deux formats par immunocapture (voir le détail du protocole et les résultats dans la Section expérimentale, Exemple 1 comparatif, et les formats d'essai sur la Figure 1) : - le premier avec des particules superparamagnétiques porteuses d'anticorps anti IgG humaines, 15 - le second avec des particules superparamagnétiques porteuses d'anticorps anti IgM humaines. Après incubation (capture des IgG et des IgM de l'échantillon et formation des premiers complexes immunologiques) et un premier lavage, l'antigène VHA était ajouté. Après une deuxième incubation, l'antigène VHA 20 (Ag VHA) était lié aux deux types de complexes formés. Après un deuxième lavage, la révélation des deux réactions se faisait par ajout d'un anticorps monoclonal (AcM) anti VHA couplé à un fluorochrome (phycoérythrine, symbolisée PE). Après incubation de ce conjugué et un troisième lavage, la lecture du signal était réalisée en cytométrie en flux sur 25 chaque particule. Les résultats des IgM et IgG étaient obtenus séparément grâce à la lecture des signaux par les deux rayons laser, appropriés, du cytomètre en flux. La détection des IgM atteignait une sensibilité acceptable, même en basses concentrations, qui représentent une situation assez fréquente suite à 30 une infection par le VHA. La sensibilité de la détection des IgG était, par contre, clairement insuffisante, dans cette configuration, en raison de la grande abondance naturelle des IgG (toutes spécificités antigéniques confondues) dans l'échantillon. En effet, les particules superparamagnétiques anti IgG étaient très i0 vite saturées par les IgG non spécifiques du VHA présentes dans l'échantillon et ne capturaient plus assez d'IgG anti-VHA, surtout en basses concentrations d'IgG anti-VHA. Ceci aboutissait à une sensibilité analytique insuffisante.
C'est précisément le cas en détection d'immunoglobulines totales anti VHA pour lesquelles il existe un seuil de sensibilité clinique indispensable à la détection des anticorps anti-VHA dans le cadre du suivi de protection post-vaccinale. Ce seuil de protection a été fixé par consensus à 20 mUl/ml, par rapport à un étalon de l'OMS - anti-VHA (97/646). En dessous de cette valeur io l'individu n'est pas protégé ; au dessus de cette valeur, le taux d'IgG est suffisant pour assurer à l'individu une protection vis à vis du virus. Les inventeurs ont donc conçu d'autres formats d'essai pour résoudre le problème du manque de sensibilité IgG décrit dans l'essai ci-dessus. De façon tout à fait surprenante, les inventeurs ont montré que le 15 multiplex combinant les deux formats décrits ci après dans l'Exemple 2 (voir le détail du protocole et les résultats dans la Section expérimentale, Exemple 2, et les formats d'essai sur la Figure 2), arrive à détecter de manière simultanée, et en un seul récipient, les basses concentrations d'IgG sans désensibiliser la détection des IgM, et, de plus, permet de différencier, de façon tout à fait 20 sensible et spécifique, les anticorps IgM anti VHA des immunoglobulines totales anti VHA. Ainsi ce procédé de détection simultanée, et en un seul récipient, d'IgG et d'IgM anti-VHA dans un échantillon (sérum ou plasma) [procédé qui est donc le procédé selon la présente invention] combine deux formats d'essai (un 25 format d'essai de capture d'immunoglobuline selon Duermeyer W. et al., pour les IgM, et un format d'essai sandwich double antigène selon Maiolini R., et al., pour les IgG) : - le premier avec des particules superparamagnétiques porteuses d'anticorps anti IgM humaines, 30 - le second avec des particules superparamagnétiques porteuses d'antigène VHA de capture. Après incubation (capture des IgG et des IgM de l'échantillon et formation des premiers complexes immunologiques) et un premier lavage, un 2917173 Il antigène VHA biotinylé est ajouté. Après une deuxième incubation, l'antigène VHA est lié aux deux types de complexes formés. Après un deuxième lavage, la révélation des deux réactions se fait par ajout de streptavidine couplée à un fluorochrome (phycoérythrine). Après 5 incubation et lavage , la lecture du signal est réalisée en cytométrie en flux sur chaque particule. Les résultats des IgM et IgG sont obtenus séparément grâce à la lecture des signaux par les deux rayons laser, appropriés, du cytomètre en flux. L'invention, qui aboutit à une détection sensible et différentielle des Ig io totales et des IgM anti VHA, est tout à fait surprenante : en effet, le risque était grand, avec la combinaison, en un seul récipient, des deux formats selon le procédé selon l'invention, qu'il existe pour les IgM anti VHA de l'échantillon, une compétition entre l'antigène VHA immobilisé et l'anticorps anti IgM immobilisé. En d'autres termes, en raison de la mise en oeuvre simultanée des 15 deux formats décrits ci-dessus, en un seul et même récipient, le risque existait qu'une partie des IgM anti VHA de l'échantillon soient capturées (comme le représente la flèche en pointillé de la figure 2) par les particules superparamagnétiques porteuses d'antigène VHA, utilisées précisément pour capturer les IgG, et ne soient plus détectées comme IgM. Une telle 20 compétition aurait abouti inévitablement à une détection de la réponse IgM totalement insuffisante (manque de sensibilité) et donc à une impossibilité de détecter les IgM précocement. Un homme du métier aurait parfaitement réalisé l'importance de ce risque et aurait donc été clairement dissuadé d'adopter cette combinaison (multiplex) selon l'invention. 25 Les inventeurs ont pareillement mis en oeuvre le procédé multiplex selon l'invention pour détecter simultanément les anticorps IgG et IgM dirigés contre la capside du virus de l'hépatite B (détection des anticorps IgG et IgM anti HBc, HB core IgG and IgM en anglais). Voir à cet effet la Section expérimentale, Exemple 3, et les formats d'essai sur la figure 3. 30 Sur cette base, les inventeurs proposent un procédé de détection générale en format multiplex des IgG et IgM, adaptable à de nombreux microorganimes pour lesquels il est important, sur le plan diagnostic, de détecter les IgG et IgM.
Dans la section ci-après, un certain nombre de définitions utiles à la compréhension de l'invention sont fournies.
Définitions Dans le contexte de l'invention, un échantillon biologique est de préférence constitué par un fluide biologique, tel que du sang, plasma, sérum, de l'urine, du liquide céphalorachidien, de la salive, etc... De préférence, l'échantillon est du plasma ou du sérum. L'échantillon à tester de préférence d'origine humaine, mais peut également provenir d'un animal pour lequel une détection d'une infection microbiologique est nécessaire. Le terme détection multiplex se réfère, dans le cadre de la présente invention, à la détection simultanée d'au moins deux types d'anticorps dirigés contre un même ou plusieurs microorganisme(s) infectieux, et choisis dans le groupe constitué par les immunoglobulines M, G, A, D, E et les immunoglobulines totales du sang. Le terme anticorps se réfère à tout anticorps entier ou fragment fonctionnel d'un anticorps comprenant ou consistant en au moins un site de combinaison antigénique, permettant audit anticorps de se lier à au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique. A titre d'exemple de fragments d'anticorps on peut citer les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les chaînes scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment), etc... Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique. Par fragment antigénique ou antigène , on entend tout ou partie d'une protéine naturelle ou recombinée d'un microorganisme infectieux tel que le virus de l'hépatite A capable d'induire la synthèse d'anticorps chez un patient infecté ou chez un animal immunisé En particulier, par antigène dérivé du microorganisme , qu'il soit de capture ou de détection, on entend tout antigène sélectionné dans le groupe constitué par un lysat dudit microorganisme, un de ses antigènes naturels semi-purifié ou purifié, une protéine recombinée, un fragment de celle-ci et un peptide synthétique. Par antigène de capture , on entend un fragment antigénique fixé sur une phase solide, qui est capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le microorganisme, tels que des anticorps anti-VHA et de permettre une liaison affine avec ces derniers. Par anticorps de capture , on entend un anticorps ou une partie d'anticorps, fixé sur une phase solide, qui est capable de retenir au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique présent dans un échantillon biologique, par liaison affine. Les anticorps de capture anti-IgM et les antigènes de capturepeuvent être fixés aux particules par toute technique appropriée. Ils peuvent être fixés par covalence directe, ou de manière non-covalente, notamment par affinité. La fixation covalente directe peut être réalisée par le biais d'une activation des groupements carboxyliques présents sur les particules, impliquant une liaison par hydroxysuccinimide ou carbodiimide par exemple. Par antigène de détection , on entend un antigène marqué qui permet soit de détecter des anticorps IgM par méthode immunocapture , soit de détecter des anticorps IgG par méthode sandwich antigène-anticorpsantigène classique, encore appelée méthode sandwich double antigène (Maiolini et al. (1978)). L'antigène de détection peut être identique ou différent de l'antigène de capture. Le terme marqué se réfère aussi bien à un marquage direct (par le biais de fluorochromes, composés luminescents, etc) qu'à un marquage indirect (par exemple, par le biais d'anticorps ou d'antigène, eux-mêmes marqués de manière directe, ou à l'aide de réactifs d'une paire d'affinité marquée, telle que, mais non exclusivement, la paire avidine marquée-biotine, etc.).
La production d'anticorps monoclonaux ou d'anticorps polyclonaux utiles dans le cadre de l'invention relève de techniques conventionnelles. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de fusion lymphocytaire et culture d'hybridomes décrite par KôhIer et Milstein (Nature, 256, p. 495-497(1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues (Harlow et al. editors, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés en immunisant un mammifère (par exemple une souris, un rat, un lapin, voire un être humain, etc...) et en utilisant la technique de fusion lymphocytaire conduisant à des hybridomes (Kdhler et Milstein, 1975, supra). Des techniques alternatives à cette technique usuelle existent. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique cloné à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ( phage display ), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux (par exemple, fUSES pour E.coli, Scott et al. (Science, 249, pp. 386-390 (1990)). Ces derniers constituent des banques et présentent des fragments scFv à leur surface. Des protocoles de construction de ces banques d'anticorps sont décrits dans Marks et al. (1991) (J. Mol. Biol., 222, pp. 581-597, (1991)). Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un antigène de nature peptidique selon les modes opératoires usuels. D'une manière générale, on peut utiliser, par exemple, comme immunogène, un polypeptide, en particulier recombiné, ou un oligopeptide. Selon un protocole classique, des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'immunogène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. [PNAS USA, 79, pp. 917-921 (1982)]. A intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 pg d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, on évalue la capacité de l'anti-sérum à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode à la chloramine-T. On le purifie ensuite par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions constituée de carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps recueillies par élution sont ensuite ajustées à la concentration souhaitée par des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, en utilisant du DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG.
Par particules , on entend toutes particules, de préférence de forme approximativement sphérique (on les appelle alors généralement des billes), de tailles pouvant être comprises entre 0.3pm et 100pm de diamètre et de préférence entre 0.5pm et 40pm.. De telles particules sont fabriquées par exemple par les sociétés Luminex, Merck, Dynal.
Les particules sont de préférence constituées de polymères inertes vis à vis des constituants des échantillons biologiques ; elles sont solides et insolubles dans les échantillons. Les polymères utilisés peuvent être des polyesters, polyéthers, polyoléfines, polyamides, polysaccharides, polyuréthanes ou celluloses. Des agents liants peuvent être également utilisés pour apporter une intégrité et une structure aux particules. Des groupes fonctionnels peuvent être incorporés avec ces polymères pour permettre la fixation ou le couplage de macromolécules d'intérêts biologiques (protéines, lipides, glucides, acides nucléiques). Ces groupes fonctionnels, connus de l'homme du métier, peuvent être des fonctions animes (-NH2) ou anmmonium (-NH3+ ou -NR3+), des fonctions alcooliques (-OH), des fonctions carboxyliques (-0O0H) ou isocyanate (-NCO). Les monomères les plus couramment utilisés pour introduire des fonctions COOH dans les polyoléfines sont l'acide acrylique ou l'acide méthacrylique.
La fixation de réactifs sur la surface des particules peut se faire par attractions électrostatiques, interactions d'affinité, interactions hydrophobes ou couplage covalent. Le couplage covalent est préféré. Les particules utilisées ici sont distinguables en ce qu'elles portent des paramètres physiques détectables particuliers, c'est à dire des marqueurs différentiels permettant de les distinguer les unes des autres par cytométrie en flux. De préférence, au moins deux types de marqueurs ou paramètres différents sont utilisés. Par exemple, les particules peuvent être imprégnées d'un ou plusieurs colorants (par exemple, fluorescent, luminescent, etc), le cas échéant à différentes concentrations, ou d'un marqueur de type radioisotope, enzymatique, etc. (Venkatasubbarao S. Microarrays-Status and prospects Trends in Biotechnologoy Dec 2004, 22(12) :630-637 ; Morgan et al, Cytometric bead array : a multiplexed assay platform with applicaitons in various areas of biology , Clin. Immunol. (2004) 100:252-266). De manière alternative, des particules de différentes tailles peuvent être utilisées.
Dans un mode de réalisation préféré, les particules distinguables émettent des signaux luminescents ou fluorescents. On peut par exemple utiliser des billes fluorescentes superparamagnétiques de Luminex. Ces propriétés physicochimiques peuvent également permettre, lors de la réaction avec l'échantillon biologique, la séparation des fractions capturées par ces microparticules de celles non liées. Cette séparation pouvant se faire entre autre par centrifugation, filtration ou aimantation. La séparation par aimantation est préférée et pour cela des billes contenant des composants paramagnétiques, ferromagnétiques, ferrimagnétiques et métamagnétiques peuvent être utilisées. Les composants paramagnétiques sont préférés comme par exemple le fer, le cobalt, le nickel ou des oxydes métalliques tel que le Mn2O3, Cr2O ou le Fe3O4. La quantité de composants magnétiques peut être comprise (en poids) entre 2% et 50 % et préférentiellement entre 3% et 25%.
Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention met en oeuvre une méthodologie d'immunoessai qui combine la cytométrie en flux avec l'utilisation de support particulaire, de préférence superparamagnétique, comme phase solide (mettant en oeuvre, dans un seul et même récipient, plusieurs catégories ou groupes de particules distinctes). Chaque groupe de particules est spécifique d'une réaction immunologique et peut être différenciée des autres particules par des propriétés physico-chimiques (taille, granulométrie, fluorescence, et/ou densité optique). La propriété des particules superparamagnétiques facilite les séparations entre les phases solide et liquide aux étapes de lavages et permet l'automatisation des tests. Toutefois il n'est pas obligtatoire que les billes utilisées soient superparamagnétiques. Comme billes superparamagnétiques pouvant être utilisées, on peut citer notamment celles décrites dans le brevet US 6,872,578. La phase finale de détection selon le procédé de l'invention comprend généralement : i) la lecture simultanée, au moyen d'un détecteur capable de différencier les signaux des deux groupes de particules susdits, des complexes immunologiques marqués de l'étape c) sur chaque particule, ii) l'obtention de manière séparée des résultats pour chaque groupe de 30 particules, et iii) l'interprétation des résultats comme indication de la présence ou non d'immunoglobulines totales (Ig totales), et/ou d'immunoglobulines M dirigées contre ledit microorganisme.
Les particules sont de préférence soumises à une mesure par cytométrie en flux, comme décrit par exemple dans la demande de brevet de Luminex WO97/14028. Ainsi, des sous-groupes de particules porteuses d'un réactant (anticorps ou antigène) sont exposées à un échantillon biologique, chaque sous-groupe ayant un ou plusieurs paramètres de classification qui permettent de distinguer les particules d'un sous-groupe par rapport à un autre sous-groupe. Les particules ainsi exposées à l'échantillon passent ensuite dans une zone d'examen (à savoir un cytomètre), où sont recueillies les données relatives aux paramètres de classification (par exemple les intensités io d'émission de fluorescence), et de préférence aussi les données relatives à la présence ou à l'absence d'un complexe formé entre le réactant et l'analyte d'intérêt. Ainsi par exemple, dans le cas où les particules émettent des signaux fluorescents, après ajout de l'échantillon à doser et des conjugués spécifiques 15 (marqués par exemple par un marqueur fluorescent), on mesure le signal de fluorescence émis par les complexes immunologiques formés sur chaque particule, à l'aide d'un cytomètre en flux particulaire à lecture laser (par exemple du type de l'appareil LuminexTM) La fluorescence spécifique de chaque particule est enregistrée 20 séparément, mais simultanément pour toutes les particules. On obtient finalement un signal totalement séparé et distinct pour chaque groupe de particules. La présente invention permet ainsi d'obtenir, par le biais d'un protocole simple et automatisable, deux mesures séparées et sensibles, l'une pour les 25 IgM, l'autre pour les immunoglobulines totales, dirigées contre un même microorganisme infectieux. Il va de soi que la présente invention, qui est décrite plus particulièrement en vue de la détection simultanée des IgM et IgG (ou des Ig totales) pour le virus de l'hépatite A et pour le virus de l'hépatite B, s'applique 30 de manière large à tous les virus (HSV, virus de la Dengue, autres flavivirus, tels que le virus du Nil occidental ; les virus de la rubéole et de l'influenza, le VZV, le CMV, etc..), à toutes les bactéries (Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi,,..) et/ou tous les parasites (Toxoplasma gondii, etc..) dans lesquels il existe pareillement un besoin de détecter simultanément, dans un même récipient d'essai, les IgM et les IgG (ou les immunoglobulines totales), sans perte de sensibilité. Dans le procédé selon l'invention, l'échantillon n'a pas besoin de subir de pré-traitement tel qu'une réaction, une digestion, ou une modification enzymatique, ou tel qu'une réaction ou une modification chimique ou autre, etc (par exemple, par ultracentrifugation zonale ou sur gradient de saccharose, filtration sur gel, adsorption des IgG par la protéine A de Staphylococcus ou par un anticorps anti Fc gamma, soit encore clivage des IgM par le R-mercaptoéthanol. Toutefois, il est possible de mettre en oeuvre le procédé io selon l'invention sur un échantillon qui a subi un tel pré-traitement. Le récipient peut être n'importe quel container solide, par exemple un tube à essai, une cupule de microplaque, une cuvette réactionnelle en polypropylène. L'élimination des réactifs non liés peut être effectuée par toute technique 15 connue de l'homme du métier, comme le lavage à l'aide d'étapes de centrifugation répétées ou la mise à profit du caractère superparamagnétique des billes, par utilisation d'aimants. Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus, les bactéries 20 et les parasites, de préférence unicellulaires, de l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus humains. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de la méthode selon l'invention, le microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus de l'hépatite 25 humaine tels que les virus VHA et VHB. Dans un mode de réalisation préféré, ledit microorganisme est le virus de l'hépatite A humaine (VHA), pour lequel on peut alors obtenir une limite de détection inférieure des immunoglobulines totales anti VHA d'environ 20 mUI/ml. 30 La présente invention a aussi pour objet un ensemble de réactifs pour mettre en oeuvre le procédé du procédé selon l'invention. La présente invention a encore pour objet une trousse ( kit ) de réactifs pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention. 15 20 30 Le type de détection simultanée et combinée des IgM dirigées contre un microorganisme infectieux, et des anticorps IgG ou Ig totales contre ce même microorganisme infectieux est appelé dans le cadre de la présente invention une détection multiplex par opposition à une détection simplex (où les détections des IgM et des IgG ou Ig totales sont réalisées indépendamment, i.e. non combinées). La présente invention vise et englobe aussi toutes les variantes d'une méthode de détection simultanée, variantes susceptibles d'être obtenues par des méthodes en soi connues ou déductibles de l'homme du métier sans sortir de l'esprit de la présente invention. La présente invention va être maintenant expliquée en plus grands détails avec les exemples qui suivent.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures
La Figure 1 est un schéma montrant la détection des IgG et des IgM anti-VHA par double format immunocapture (art antérieur).
La Figure 2 est un schéma montrant le procédé de l'invention pour la détection des Ig totales anti-VHA en sandwich et des IgM anti-VHA par immunocapture.
La Figure 3 est un schéma montrant le procédé de l'invention pour la détection 25 des Ig totales anti-HBc en sandwich et des IgM anti-HBc par immunocapture.
La Figure 4 est un graphe montrant une comparaison des gammes étalon Ig totales anti-VHA dosées en format unitaire IgG (immunocapture) et en format unitaire sandwich Ig totales. La Figure 5 est un graphe montrant une comparaison des gammes étalons Ig totales anti-VHA dosées en format sandwich unitaire et en multiplex.
Section expérimentale Exemple 1 : Procédé selon l'art antérieur Le principe de cet essai selon l'art antérieur est illustré sur la Figure 1.
Matériels et méthodes : io Matériels : 1. Système d'analyse : On a utilisé l'analyseur BioPlex 2200 (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France), selon les instructions du fabricant. Cet automate d'immunoanalyse contient un cytomètre en flux et un détecteur Luminex 100TM 15 (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis) et utilise des jeux hétérogènes de particules superparamagnétiques. Chaque groupe de particules, composées de polystyrène et d'acide méthacrylique (fonction COOH), et d'une taille de 8 pm de diamètre est fabriqué avec différents pourcentages de fluorochromes (CL1 et CL2) produisant un code d'identification unique assigné à chaque 20 groupe de particules et détectable par le laser du détecteur Luminex 100TM (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis).Après la réaction immunologique, les billes passent une à une à travers une cellule à flux, au centre d'une gaine liquide, pour être simultanément excitées et lues par deux lasers distincts. Les mesures sont réalisées au passage de chaque bille. 25 Le laser à rayon rouge de 638 nm excite les fluorochromes d'identification (CL1 et CL2) incrustés à la surface de chaque particule et le signal composite est interprété pour identifier l'analyte de la particule. Ce laser sert donc, en identifiant la catégorie de particule, à identifier le test en cours. Le laser à rayon vert de 532 nm excite la sonde fluorescente (conjugué marqué 30 à la phycoérythrine (PE)) et la fluorescence émise est proportionnelle au conjugué fixé sur la particule. Ce laser sert donc à mesurer la réactivité de l'analyte immobilisé sur ladite particule. Le logiciel du système convertit le signal du conjugué en une valeur d'intensité relative de fluorescence (IRF en français ou RFI en anglais). Les signaux sont 20 ensuite comparés à une courbe d'étalonnage spécifique au test pour déterminer la concentration de l'analyte. Un ratio peut aussi être calculé afin de classer le résultat qualitativement en positif ou négatif. 2. Phase solide : On a utilisé deux groupes distincts de particules superparamagnétiques LuminexTM (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis). Chaque groupe de particules est revêtu d'un ligand spécifique à un test particulier. Chaque ligand est couplé à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel. - qroupe 1 : anticorps monoclonal de souris anti-IgM humaines (Hytest, Finlande) immobilisé à 10 pg/mg de particules. - qroupe 2 : anticorps monoclonal de souris anti IgG humaines (Fc gamma ; Jackson Immuno Research, Etats-Unis) immobilisé à 20 pg/mg de particules. 3. Antigène VHA : Antigène VHA de Viral Antigen, Memphis, Tennessee, Etats-Unis.
4. Fluorochrome : Phycoérythrine de Cyanotech, Hawai, Etats-Unis. 5. Conjugué : Anticorps monoclonal de souris anti VHA (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) couplé à la phycoérythrine (PE) à l'aide d'un réactif hétérobifonctionnel en soi connu de l'homme du métier. 25 6. Diluants : 6.1. Diluant des particules superparamagnétiques : Solution de tampon citrate 20 mM, pH 5,6 contenant : NaCl 116 mM, EDTA 5,6 mM, Triton à 2%, Sérum de mouton à 10 %, IgG de souris 0,5 g/l, Proclin 30 300TM (marque de la société Supelco) à 0,5%, lait de vache (100% écrémé) à 25%, IgG BS3 à 0,13%. 6.2. Diluant de l'antigène VHA et du conjugué : Solution de tampon phosphate 50 mM, pH 7,1 contenant : NaCI 150 mM ; NaN3 à 0,1 %, BSA à 1%, PEG 6000 à 2,75 %, Tween 20 TM (marque de la société Sigma) à 0,1 %, sérum de mouton à 1 %, IgG de souris à 1 g/I. 6.3. diluant de l'étape 1 ou Solution de lavage : Tampon phosphate, pH 7,4 contenant : NaCI 150 mM, Tween 20TM (marque de la société Sigma) à 0,1 %, Proclin 300 TM (marque de la société Supelco) à 0,034%, NaN3 à 0,095 %.
7. Cuvettes réactionnelles : io Les réactions immunologiques ont lieu dans une cuvette réactionnelle en polypropylène de l ml de volume.
8. Etalons : L'étalon Immunoglobuline totale anti VHA de l'OMS (code 97/646) a été 15 reconstitué selon les recommandations et dilué de façon à fournir les points de gamme suivants : 0 ; 20 ; 80 ; 160 ; 320 et 640 mUl/ml.
Méthodes : Protocole d'essai : 20 étape 1 : 1. Dans chaque cuvette réactionnelle on distribue successivement : 5 pl d'échantillon ou d'étalon + 250 pl de diluant de l'étape 1, pl de particules immunoréactives (mélange 50:50 de particules des groupes 1 et 2) + 250 pl diluant de l'étape 1. 25 2. Après homogénéisation, on procède à l'incubation du mélange pendant 40 minutes à 37 C. 3. On procède ensuite aux étapes de lavage : séparation des phases solide et liquide par aimantation et 3 lavages successifs avec au moins 300 pl de solution de lavage. Au dernier lavage les particules sont remises en 30 suspension.
étape 2 : 4. On distribue 50 pl de solution d'antigène VHA (Ag VHA) dans chaque cuvette réactionnelle. 30 5. Après homogénéisation, on procède à l'incubation du mélange pendant 15 minutes à 37 C. 6. On procède ensuite aux étapes de lavage (idem point 3). étape 3 : 7. On distribue 50 pl de conjugué (anticorps anti VHA-phycoérythrine, i.e. AcM-PE) dans chaque cuvette réactionnelle. 8. Après homogénéisation, on procède à l'incubation du mélange pendant 15 minutes à 37 C. 9. On procède ensuite aux étapes de lavage (idem point 3). io 10. On resuspend les particules de chaque cupule en leur ajoutant 35 pl de solution de lavage sous agitation. 11. La suspension de particules de chaque cupule est aspirée par le cytomètre en flux. 12. La suspension de particules de chaque cuvette est lue à l'aide des deux 15 rayons lasers. 13. Les résultats des lectures sont directement traités par le cytomètre en flux et enregistrés en unités Relatives d'Intensité de Fluorescence (unités RFI) 14. Pour l'interprétation des résultats, pour chaque point étalon (ou échantillon) un ratio est calculé par rapport à une valeur-seuil ( cut-off ). En Ig totales 20 anti VHA, la valeur-seuil correspond à la valeur en RFI du point étalon à 20 mUl/ml considéré comme le seuil de protection.
Le ratio des échantillons est donc calculé de la façon suivante :
25 Ratio échantillon = moyenne* du siqnal RFI de l'échantillon Valeur-seuil
Les échantillons dont les ratios sont supérieurs à 1 sont déclarés positifs, ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés négatifs. * Tous les dosages d'échantillons humains sont faits en double (en deux réplicats) et les résultats en RFI exploités proviennent de la moyenne des deux réplicats.
Résultats des essais réalisés sur la qamme étalon La détection des IgM en immunocapture n'a pas posé de problème. L'attention avait été particulièrement portée sur le format immnunocapture des IgG anti VHA afin d'atteindre une sensibilité analytique de 20 mUl/ml.
Toutefois, dans les essais réalisés, le format immunocapture pour la détection des IgG anti VHA montre un manque de sensibilité évident (voir le Tableau 1, et graphe 1). En effet, les ratios calculés pour les étalons compris entre 0 et 80 mUl/mI ne sont pas significativement différents entre eux et ils sont beaucoup trop proches de celui de l'étalon 20 mUl/mI (ratio = 1,0) pour être sélectifs de manière fiable. Les ratios commencent seulement à augmenter et à être donc le reflet d'une détection des Ig totales, pour les étalons compris entre 160 et 640 mUl/mI.
Tableau 1 : Dosage de la gamme étalon Ig totales anti VHA Dosage des IgG par Immunocapture IgG Etalon (mUI/ml) RFI Ratio o 19 0,79 10 22 0,92 40 29 1,21 80 41 1,71 160 60 2,50 320 89 3,71 640 133 5,54 Ce manque de sensibilité est dû au fait que la phase solide utilisée (particules anti IgG humaines) ne permet pas de capturer spécifiquement les IgG dirigées contre l'analyte. La phase solide est alors saturée par toutes les autres IgG du sérum. i0 Ce phénomène n'est pas vu dans le format en immunocapture pour les IgM car il est rare d'avoir simultanément plusieurs infections et d'avoir dans le sérum des IgM dirigées contre différents agents infectieux lors d'une infection aigüe. Ce format immunocapture a donc été conservé pour la détection des IgM mais abandonné pour la détection des IgG et remplacé par un format Sandwich. Les résultats obtenus pour ce dernier format seront décrits ci dessous.
Exemple 2 : Procédé de détection de l'invention appliqué à la détection des Iq totales et des IqM anti HAV Le procédé de détection multiplex selon l'invention est décrit ci-dessous et en Figure 2.
Matériels et méthodes : 15 Matériels : Le matériel est pour l'essentiel identique à celui utilisé dans l'exemple 1, sauf exceptions indiquées ci-dessous.
1. Le système d'analyse : voir description de l'exemple 1. 20 2. Phase solide : 2 groupes distincts de particules superparamagnétiques LuminexTM (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis) sont utilisés : - qroupe 1 : anticorps monoclonal de souris anti-IgM humaines (Hytest, 25 Finlande) immobilisé à 10 pg/mg de particules ; - qroupe 2: antigène VHA (Viral Ag, Memphis, Tennessee, Etats-Unis) immobilisé à 2,5 pg/mg de particules.
5. Conjugué 1 : 30 Antigène VHA (Viral Ag, Memphis, Tennessee, USA) marqué à la biotine (Pierce, Rockford, IL, Etats-Unis).
6. Conjugué 2 : Streptavidine (abrégée Strepta Roche Mannheim, Allemagne), couplée à la phycoérythrine (abrégée PE ) provenant de Cyanotech, Hawai, Etats-Unis.
5. Diluants Les diluants des billes, des conjugués 1 et 2, le diluant de l'étape 1 et la solution de lavage sont identiques à ceux de l'exemple 1.
6. Etalons : L'étalon Immunoglobuline totale anti VHA de l'OMS (code 97/646) est identique io à celui utilisé dans l'exemple 1.
7. Echantillons : Les échantillons humains dosés sont des échantillons plasmatiques ou sériques, positifs ou négatifs en immunoglobulines totales et/ou IgM anti HAV. 15 Ces échantillons proviennent d'échantillothèques internes, constituées à partir de poches de prélèvement et d'échantillons commercialisés par les sociétés : ABO Pharmaceuticals û 7930 Arjons Drive, Suite A, San Diego, CA 92126, Etats-Unis, Teragenix û 5440 NW 33rd Avenue, Suite 108, Ft. Lauderdale, FL 33309, 20 Etats-Unis, PromedDx û 10 Commerce Way, Norton, MA 02766, Etats-Unis, Zeptometrix Corporation û 872 Main St., Buffalo, NY 14202, Etats-Unis, BBI Diagnostoc û 375 West Street, West Bridgewater, MA 02379, Etats-Unis, Life Sera û 780 Park North Blvd, Suite 100, Clarkston, GA 30021, Etats-Unis, 25 Les échantillons humains dosés se répartissent en : - 30 échantillons négatifs en immunoglobulines totales et IgM anti VHA (doubles négatifs). - 26 échantillons positifs en immunoglobulines totales anti VHA et négatifs en 30 IgM anti VHA. échantillons positifs en IgM anti VHA et négatifs en immunoglobulines totales anti VHA.
Méthodes : Protocoles d'essai : Dans les essais décrits ci-après, 3 protocoles d'essai sont mis en oeuvre : le protocole multiplex selon l'invention (i.e. le protocole Ig totales + le protocole gM) et deux protocoles unitaires (un protocole Ig totales et un protocole IgM). Ces trois protocoles sont identiques à l'exception de l'étape d'addition des particules superparamagnétiques immunoréactives qui sont utilisées. Le protocole multiplex utilise les deux groupes de billes et chaque protocole unitaire utilise un seul groupe de billes. La quantité de particules du groupe io 1 (porteuses d'anticorps anti IgM) utilisée dans le protocole unitaire IgM et le protocole multiplex reste la même. De la même manière, la quantité de particules du groupe 2 (porteuses d'antigène VHA) utilisée dans le protocole unitaire Ig totales et le protocole multiplex reste la même.
15 A. Protocole unitaire pour la détection des Iq totales anti VHA
étape 1 : 1. Dans chaque cuvette réactionnelle on distribue successivement : 25 pl d'échantillon ou d'étalon + 225 pl de diluant de l'étape 1, 20 10 pl de particules immunoréactives du groupe 2 (antigène VHA) + 250 pl diluant de l'étape 1 2. Après homogénéisation, on procède à l'incubation du mélange pendant 40 minutes à 37 C. 3. On procède ensuite aux étapes de lavage : idem point 3 de l'exemple 1. 25 étape 2 : 4. On distribue 50 pl de solution de conjugué 1 (antigène VHA biotinylé, i.e. Ag VHA biotine ) dans chaque cuvette réactionnelle. 5. Après homogénéisation, on procède à l'incubation du mélange pendant 15 minutes à 37 C. 30 6. On procède ensuite aux étapes de lavage : idem point 3. étape 3 : 7. On distribue 50 pl de conjugué 2 (streptavidine-phycoéryhtrine, i.e. Strepta-PE ) dans chaque cuvette réactionnelle. 8. Après homogénéisation, on procède à l'incubation du mélange pendant 15 minutes à 37 C. 9. On procède ensuite aux étapes de lavage : idem point 3. 10. On resuspend les particules de chaque cuvette réactionnelle en leur ajoutant 35 pl de solution de lavagesous agitation. 11. La suspension de particules de chaque cuvette réactionnelle est aspirée par le cytomètre en flux. 12. La lecture de la suspension de particules de chaque cuvette est réalisée à l'aide des deux rayons lasers. io 13. Les résultats des lectures sont directement traités par le cytomètre en flux et enregistrés en unités Relatives d'Intensité de Fluorescence (unités RFI) . 14. Pour l'interprétation des résultats, pour chaque point étalon ou échantillon un ratio est calculé par rapport à une valeur-seuil ( cut-off ). En Ig totales anti VHA, la valeur-seuil correspond à la valeur en RFI du point étalon de 20 15 mUl/ml considéré comme seuil de protection.
Le ratio des échantillons est donc calculé de la façon suivante :
Ratio échantillon = moyenne* du siqnal RFI de l'échantillon 20 Valeur seuil
Les échantillons dont les ratios sont supérieurs à 1 sont déclarés positifs, ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés négatifs.
25 * Tous les dosages d'échantillons humains sont faits en double (en deux réplicats) et les résultats en RFI exploités proviennent de la moyenne des deux réplicats.
30 B. Protocole unitaire pour la détection des Iq M anti VHA
étape 1 : 1. Dans chaque cuvette réactionnelle on distribue successivement : 25 pl d'échantillon ou d'étalon + 225 pl de diluant de l'étape 1, 15 10 pl de particules immunoréactives du groupe 1 (anticorps anti IgM) + 250 pl diluant de l'étape 1. Toutes les autres étapes (2-13) du protocole unitaire IgM sont rigoureusement identiques aux étapes 2-13 du protocole unitaire Ig totales. 14. Pour le calcul des ratios des échantillons, en HAV IgM la valeur seuil ( cutoff ) est la moyenne des RFIs des échantillons négatifs + 12 écart-types.
Le ratio des échantillons calculé est donc le suivant : Ratio échantillon = moyenne* du siqnal RFI de l'échantillon valeur-seuil
Les échantillons dont les ratios sont supérieurs à 1 sont déclarés positifs, ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés négatifs. * Tous les dosages d'échantillons humains sont faits en double (en deux réplicats) et les résultats en RFI exploités proviennent de la moyenne des deux réplicats.
20 C. Protocole multiplex selon l'invention (détection simultanée des Id totales et des IgM anti VHA) :
étape 1 : 1. Dans chaque cuvette réactionnelle on distribue successivement : 25 25 pl d'échantillon ou d'étalon + 225 pl de diluant de l'étape 1, 10 pl de particules immunoréactives (mélange 50:50 de particules des groupes 1 et 2) + 250 pl diluant de l'étape 1. Toutes les autres étapes (2-14) du protocole multiplex sont rigoureusement identiques aux étapes 2-14 des protocoles unitaires Ig totales et IgM. 30 Résultats obtenus : 1. Gammes d'étalonnage : 1.1. Gamme étalon Ig totales anti VHA dosée en sandwich unitaire : 5 Les résultats obtenus avec la gamme étalon (0 à 640 mUl/ml) mise en oeuvre en sandwich unitaire montrent que le format sandwich des Ig totales est beaucoup plus sensible que le format Immunocapture des IgG de l'exemple 1 (voir tableau 2, et Figure 4).
Tableau 2 : comparaison de la gamme étalon Ig totales anti VHA dosée en format unitaire immunocapture IgG (exemple 1) et en format unitaire sandwich Ig Totales (exemple 2) Format Immunocapture IgG en unitaire (exemple 1) Format Sandwich Ig Totales en unitaire (exemple 2) Etalon (mUI/ml) RFI Ratio RFI Ratio 10 15 29 1,21 307 1,86 41 1,71 604 3,66 60 2,50 820 4,97 89 3,71 1403 8,50 133 5,54 2994 18,15 1.2. Gamme étalon Ig totales anti VHA dosée en multiplex Les résultats obtenus avec la gamme étalon mise en oeuvre en sandwich selon le protocole multiplex selon l'invention sont reportés dans le tableau 3, et la Figure 5.
Tableau 3 : comparaison des gammes étalons Ig totales en format sandwich unitaire et en multiplex Format Sandwich Ig Format Sandwich Ig totales en unitaire totales en multiplex Etalon (mUI/ml) RFI Ratio RFI Ratio 0 53 0,32 53 0,35 o 10
40 80 160 320 640 On constate que la sensibilité du format sandwich Ig totales en multiplex reste inchangée par rapport à la sensibilité obtenue en format sandwich unitaire. 5 2. Echantillons : 2.1. Dosages des échantillons en Ig totales anti VHA en sandwich unitaire et en sandwich multiplex : Les résultats obtenus avec les échantillons humains en Ig totales anti VHA lo sont reportés dans le tableau 4.
Tableau 4 : comparaison des dosages d'échantillons en Ig totales anti VHA en format sandwich unitaire et en multiplex selon l'invention Format Sandwich Format Sandwich Ig Totales Ig Totales en unitaire en multiplex RFI Ratio RFI Ratio Valeur seuil RFI étalon à 20 mUI/ml 165 1, 00 150 1, 00 Echantillons négatifs 39 0, 24 46 0, 30 en IgG VHA et IgM VHA Moyenne (n=30) Echantillons positifs 1 1767 10,71 2208 14,72 en IgG VHA et 2 2576 15, 61 4106 27, 37 32 négatifs en IgM VHA 3 1793 10,87 1382 9,21 (n=26) 4 2172 13,16 3829 25,53 1732 10,50 2763 18,42 6 2229 13,51 3344 22,29 7 2051 12,43 3245 21,63 8 2755 16,70 4612 30,75 9 1755 10,63 2503 16,69 3479 21,08 4898 32,65 11 2601 15,76 3429 22,86 12 2338 14,17 4014 26,76 13 3008 18,23 4362 29,08 14 3296 19,98 4034 26,89 2447 14,83 2468 16,45 16 1676 10,16 1809 12,06 17 714 4,32 622 4,15 18 2325 14,09 4392 29,28 19 1385 8,39 1300 8,67 2871 17,40 3668 24,45 21 2565 15,55 3011 20,07 22 2315 14,03 2611 17,41 23 2998 18,17 3555 23,70 24 1904 11,54 3259 21,73 2250 13,64 4644 30,96 26 1853 11,23 3190 21,27 On constate une très bonne discrimination entre les échantillons négatifs (n = 30) et les échantillons positifs (n = 26) dans l'essai sandwich des Ig totales anti VHA, qu'il soit mis en oeuvre en unitaire, ou en multiplex selon l'invention. 5 Ces résultats montrent donc que la détection des Ig totales anti VHA n'est pas désensibilisée dans le procédé multiplex selon l'invention. Tous les échantillons positifs sont bien retrouvés positifs par le procédé selon l'invention qui permet donc d'obtenir aussi une bonne sensibilité clinique. 2.2. Dosages des échantillons en IgM anti VHA en format immunocapture en unitaire et multiplex : Les résultats obtenus avec les échantillons humains en IgM anti VHA sont 5 reportés dans le tableau 5.
Tableau 5 : comparaison des dosages d'échantillons en IgM anti VHA en format immunocapture unitaire et multiplex selon l'invention. Format immunocapture IgM Format immunocapture IgM en unitaire en multiplex RFI Ratio RFI Ratio Valeur seuil 655 1,00 653 1,00 moyenne négatifs + 12 ET Echantillons négatifs en Ig6 76 0,12 75 0,12 VHA et IgM VHA Moyenne (n=30) Echantillons positifs en Ig6 72 0,17 89 0,14 VHA et négatifs en IgM VHA Moyenne (n=26) Echantillons positifs en 1 9978 15,23 8605 13,18 IgM VHA et négatifs en 2 12090 18,46 12389 18,97 Ig6 VHA (n=15) 3 17619 26,90 16789 25,71 4 13037 19,90 14024 21,48 8923 13,62 8658 13,26 6 20325 31,03 17150 26,26 7 15444 23,58 13629 20,87 8 15047 22,97 13561 20,77 9 20611 31,47 19929 30,52 15374 23,47 14068 21,54 11 16774 25,61 20497 31,39 12 19430 29,66 18986 29,0815 13 9501 14,51 13334 20,42 14 16785 25,63 16113 24,68 15 12647 19,31 16708 25,59 On constate une très bonne discrimination entre les échantillons négatifs en IgM anti VHA (n = 30 + 26) et les échantillons positifs en IgM anti VHA (n = 15) dans l'essai IgM anti VHA en immunocapture, qu'il soit mis en oeuvre en unitaire, ou en multiplex selon l'invention. Ces résultats montrent donc que la détection des IgM par immunocapture n'est pas désensibilisée par la combinaison au test sandwich dans le procédé multiplex selon l'invention. Tous les échantillons positifs sont bien retrouvés positifs par le procédé selon 10 l'invention qui permet donc d'obtenir aussi une bonne sensibilité clinique.
Exemple 3 : Procédé de détection de l'invention appliqué à la détection des lq totales et des IqM anti HBc Le procédé de détection multiplex selon l'invention a également été mis en oeuvre pour le dosage des Ig totales et des IgM anti HBc. Ce procédé est illustré en Figure 3 et décrit ci dessous.
20 Matériels et méthodes : Matériels : Le matériel utilisé est équivalent à celui de l'exemple 2 à l'exception des particules, du conjugué 1 biotinylé et des échantillons testés.
25 1. Phase solide : 2 groupes distincts de particules superparamagnétiques LuminexTM (Luminex Corp., Austin, Texas, Etats-Unis) sont utilisés. - qroupe 1 : anticorps polyclonal de chèvre anti-IgM humaines (Bio-Rad, Marnes la Coquette) immobilisé à 10 pg/mg de particules ; 30 - qroupe 2 : antigène HBc recombiné (Virogen, Watertown, MA, Etats-Unis) immobilisé à 10 pg/mg de particules. 2. Conjugué 1 : Antigène HBc recombiné (Biokit, Barcelone, Espagne) marqué à la biotine (Pierce, Rockford, IL, Etats-Unis ) 3. Echantillons : Les échantillons humains dosés sont des échantillons plasmatiques ou sériques, positifs ou négatifs en immunoglobulines totales et/ou IgM anti HBc. Ces échantillons proviennent d'échantillothèques internes, d'échantillons commercialisés par les sociétés : ABO Pharmaceuticals û 7930 Arjons Drive, Suite A, San Diago, CA 92126, Etats-Unis, PromedDx û 10 Commerce Way, Norton, MA 02766, Etats-Unis, Zeptometrix Corporation û 872 Main St., Buffalo, NY 14202, Etats-Unis, Les échantillons humains dosés se répartissent en : échantillons négatifs en immunoglobulines totales et IgM anti HBc (doubles négatifs). - 10 échantillons positifs en immunoglobulines totales anti HBc et négatifs en 20 IgM anti HBc. - 10 échantillons positifs en IgM anti HBc et négatifs en immunoglobulines totales anti HBc. 25 Méthodes :
Protocoles d'essai : Les protocoles utilisés sont identiques aux protocoles A, B et C décrits ci-dessus dans l'exemple 2, à l'exception du volume échantillon utilisé à l'étape 1 30 qui est de 5 pl + 250 pl de diluant de l'étape 1. Les autres étapes sont identiques y compris l'étape d'interprétation. Pour les dosages des Ig totales anti HBc et des IgM anti HBc, la valeur-seuil est la moyenne des RFIs des échantillons négatifs + 12 écart-types.
Le ratio des échantillons calculé par rapport à la valeur-seuil est donc le suivant:
Ratio échantillon = moyenne* du siqnal RFI de l'échantillon 5 valeur-seuil
Les échantillons dont les ratios sont supérieurs à 1 sont déclarés positifs, ceux pour lesquels les ratios sont inférieurs à 1 sont déclarés négatifs.
io * Tous les dosages d'échantillons humains sont faits en double (en deux réplicats) et les résultats en RFI exploités proviennent de la moyenne des deux réplicats.
15 Résultats obtenus:
Tableau 6 : comparaison des dosages d'échantillons en Ig totales anti HBc en format sandwich unitaire et en multiplex selon l'invention Format Sandwich Format Sandwich Ig totales Ig totales en unitaire en multiplex RFI Ratio RFI Ratio Valeur seuil 202 1,00 231 1,00 moyenne négatifs + 12 ET Echantillons négatifs en Ig 52 0, 25 54 0, 26 totales HBc et IgM HBc Moyenne (n=10) Echantillons positifs en 1 1035 5,12 1027 4,44 Ig totales HBc et 2 2151 10,63 2225 9,61 négatifs en IgM HBc 3 1161 5,74 1334 5,76 (n=20) 4 1577 7,79 1596 6,90 37 2345 11,59 2134 9,22 3499 17, 29 3238 13,99 1672 8,26 1316 5,69 492 2,43 375 1,62 3892 19,24 2435 10,52 1565 7,74 1228 5,31 682 3,37 1042 4,50 1198 5,92 1705 7,37 630 3,11 1408 6,08 1188 5,87 2291 9,90 2318 11,46 3311 14,31 2402 11,87 3 550 15,34 3887 19,21 3888 16,80 2020 9,98 2414 10,43 1039 5,13 1720 7,43 1334 6,59 1700 7,34 On constate une très bonne discrimination entre les échantillons négatifs (n = 10) et les échantillons positifs (n = 20) dans l'essai sandwich des Ig totales anti HBc, qu'il soit mis en oeuvre en unitaire ou en multiplex selon l'invention.
Ces résultats montrent donc que la détection des Ig totales anti HBc n'est pas désensibilisée dans le procédé multiplex selon l'invention. Tous les échantillons positifs sont bien retrouvés positifs par le procédé selon l'invention qui permet donc d'obtenir aussi une bonne sensibilité clinique.
io Tableau 7 : comparaison des dosages d'échantillons en IgM anti HBc en format immunocapture unitaire et en format immunocapture multiplex selon l'invention Format immunocapture IgM Format immunocapture IgM en unitaire en multiplex RFI Ratio RFI Ratio Valeur seuil 321 1,00 431 1,00 moyenne négatifs + 12 ET Echantillons négatifs en Ig 99 0,35 112 0,32 totales HBc et IgM HBc Moyenne (n=10) Echantillons positifs en Ig 135 0, 42 155 0,36 totales HBc et négatifs en IgM HBc Moyenne (n=10) 1 3852 12,01 3239 7,52 2 3687 11,50 3275 7,60 3 2273 7,09 1549 3,60 4 1697 5,29 1501 3,49 Echantillons positifs en 2333 7,27 1570 3,64 IgM HBc et négatifs en 1302 4,06 1058 2,46 6 Ig totales HBc (n=10) 5462 17,03 5813 13,50 7 8 2595 8,09 3110 7,22 9 1515 4,72 1857 4,31 1128 3,52 1132 2,63 On constate une très bonne discrimination entre les échantillons négatifs en IgM anti HBc (n = 10 + 10) et les échantillons positifs en IgM anti HBc (n = 10) dans l'essai IgM anti HBc en immunocapture, qu'il soit mis en oeuvre en 5 unitaire, ou en multiplex selon l'invention. Ces résultats montrent donc que la détection des IgM par immunocapture n'est pas désensibilisée par la combinaison au test sandwich dans le procédé multiplex selon l'invention. Tous les échantillons positifs sont bien retrouvés positifs par le procédé selon io l'invention qui permet donc d'obtenir aussi une bonne sensibilité clinique.
En conclusion, les résultats obtenus dans les exemples 2 et 3 par le procédé multiplex selon l'invention, qui combine une détection des IgM par 15 immunocapture et des Ig totales en sandwich, montrent bien que le procédé selon l'invention permet la détection et la différenciation sensibles des anticorps de classes Ig totales ou des IgG et des IgM, dirigés contre un même microorganisme. L'homme du métier en conclura aisément que le procédé de détection multiplex des IgG et IgM selon l'invention est en fait un procédé de portée générale, adaptable à de nombreux microorganimes pour lesquels il est important, sur le plan diagnostic, de détecter les IgG et IgM. De plus, le procédé selon l'invention est aisément automatisé grâce à l'emploi d'un automate, tel que, par exemple, le BioPlex 2200 de Bio-Rad, qui permet la réalisation des protocoles d'essai de façon simultanée, en un io récipient unique, de façon rapide, et la lecture des signaux en un seul temps.
Claims (16)
1. Procédé de détection diagnostique in vitro d'une infection par un microorganisme, comprenant la détection simultanée des immunoglobulines G ou des immunoglobulines totales, et des immunoglobulines M, dirigées contre ledit microorganisme, présentes dans un échantillon biologique, procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en présence, dans un seul récipient d'essai, dudit échantillon io biologique avec des particules, porteuses chacune d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture anti-IgM et l'autre groupe étant porteur d'un antigène de capture dérivé dudit microorganisme, 15 b) l'incubation du mélange dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques sur chaque groupe de particules, c) l'élimination des immunoglobulines qui ne se sont pas liées aux particules d) l'incubation du mélange de l'étape b) avec au moins un conjugué marqué, ledit au moins un conjugué étant exclusivement constitué d'un antigène de 20 détection dérivé dudit microorganisme, e) l'élimination de l'antigène de détection non lié aux complexes immunologiques de l'étape b); f) la détection simultanée, au moyen d'un détecteur capable de différencier les deux groupes de particules susdits, des complexes immunologiques de l'étape 25 d) sur chaque particule, par ce en quoi est révélée la présence ou non d'immunoglobulines G ou d'immunoglobulines totales et/ou d'immunoglobulines M dirigées contre ledit microorganisme.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène dérivé du 30 microorganisme est sélectionné dans le groupe constitué par un lysat dudit microorganisme, un de ses antigènes naturels semi-purifié ou purifié, une protéine recombinée, un fragment de celle-ci et un peptide synthétique. 25
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les groupes desdites particules se différencient par des fluorochromes, détectables par un détecteur approprié.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le détecteur approprié est un cytomètre en flux.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'antigène de détection porte une biotine, qui est révélée par l'ajout d'avidine ou streptavidine marquée.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'échantillon biologique est du plasma ou du sérum.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'échantillon biologique est d'origine humaine.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus, les bactéries et les parasites unicellulaires.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus de l'hépatite humaine.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit microorganisme est choisi dans le groupe constitué par le virus de l'hépatite A humaine (VHA) et le virus de l'hépatite B humaine (VHB). 30
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit microorganisme est le virus de l'hépatite A humaine (VHA) et que l'on obtient une limite de détection inférieure des immunoglobulines totales anti VHA d'environ 20 mUl/ml.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel les particules sont des particules superparamagnétiques.
13. Ensemble de réactifs destinés à mettre en oeuvre le procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant des particules, porteuses chacune d'au moins un paramètre physique détectable particulier, et appartenant à au moins deux groupes différents, l'un des groupes étant porteur d'un anticorps de capture anti-IgM et l'autre groupe étant porteur d'un antigène de capture dérivé d'un microorganisme à détecter. io
14. Ensemble selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus, les bactéries et les parasites unicellulaires . 15
15. Ensemble selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit microorganisme est choisi dans le groupe constitué par les virus de l'hépatite humaine.
16. Ensemble selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit 20 microorganisme est choisi dans le groupe constitué par le virus de l'hépatite A humaine (VHA) et le virus de l'hépatite B humaine (VHB).
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