ITTO980473A1 - Nuovo procedimento per la rivelazione di anticorpi e/o isotipi di anticorpi specifici per almeno due differenti fasi di un'infezione - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: procedimento per la rivelazione di anticorpi e/o isotipi di anticorpi specifici per almeno due differenti fasi di un'infezione e relativo corredo"

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la rivelazione di anticorpi e/o di isotipi di anticorpi specifici per almeno due diverse fasi di un'infezione, il procedimento dell'invenzione è caratterizzato dalla simultanea incubazione di un campione da un paziente con almeno due composti preferibilmente antigenici. Questi composti comprendono un epitopo che è riconosciuto da un anticorpo/anticorpo appartenente ad un particolare isotipo, in cui detto anticorpo è specificatamente presente in una di dette fasi di detta infezione. Il procedimento dell'invenzione richiede anche che siano presenti nella reazione di incubazione almeno due epitopi che sono specifici per differenti fasi dell'invenzione e così legano anticorpi/isotipi di anticorpi specifici per dette almeno due differenti fasi di detta invenzione.

L'invenzione si riferisce anche ad un corredo utile per attuare il procedimento dell'invenzione.

La diagnosi precoce di infezioni con patogeni è desiderabile per diverse ragioni. Ad esempio, risultati pubblicati recentemente portano alla conclusione che la rivelazione dell'infezione da HIV in uno stadio precoce migliora significativamente la prognosi del paziente. Inoltre, unitamente alla migliorata informazione disponibile sull'eziologia di numerose malattie, una dettagliata conoscenza dello stadio della malattia sarà altamente vantaggioso. Così, nel caso di infezioni di donne incinte da virus patogeni, l'informazione sulla fase dell'infezione sarà essenziale per il benessere del feto.

Diversi studi sono stati effettuati per differenziare tra o identificare fasi distinte di infezioni da patogeno. Ad esempio, Vomhagen et al., J. Clin.Microbiol . 34 (1996), 1020-1023 hanno identificato reattività di immunoglobulina A-specifiche di antigeni di Cytomegalovirus umano ricombinante indicative della fase acuta dell'infezione. Lo stesso gruppo ha identificato un principale antigene bersaglio per la risposta di anticorpo IgM durante l'infezione acuta (Vornhagen et al., J.Clin. Microbiol. 33 (1995), 1927-1930). EP-B1-0 32B 588 descrive un -procedimento per determinare la quantità di IgM associato a toxoplasmosi in un campione in cui un elevato contenuto di IgM è indicativo di un'infezione acuta di Toxoplasma. US-A-4.877 .726 descrive un procedimento per distinguere l'infezione acuta e cronica con Toxoplasma sulla base di proprietà di un anticorpo specifico. Angrano et al., J.Clin.Microbiol. 19 (1984) 1905-1910 ha pubblicato un principio di rivelazione simultanea di anticorpo totale e IgM-specifico per 1'antigene del nucleo di epatite B. La domanda di brevetto giapponese esaminata n.2523332 descrive un procedimento per differenziare tra anticorpi IgM e IgG. Il diverso isotipo può essere misurato sulla base di attività diverse in reazioni di agglutinazione verso questi isotipi. Infine, US-A-5.670.310 descrive un procedimento per distinguere tra l'infezione acuta e cronica da HCV impiegando una raccolta di peptidi distinti e misurando la resistenza di legame di detti peptidi con anticorpi in un campione.

Tutti questi metodi della tecnica anteriore sono sia utili per la rivelazione di solo una fase specifica di un'infezione, o sono basati su analisi dispendiose in termini di costo e/o di tempo per differenziare tra tali differenti fasi; tali analisi includono ELISA, RIA, Western blot, ecc.. Così, tali metodi non sono ottimali per analisi di routine giornaliere di un gran numero di campioni. D'altra parte, in WO92/21024, è stato definito un procedimento che permette il saggio simultaneo di analiti multipli in un singolo campione di fluido. Tale procedimento può essere impiegato per il saggio simultaneo di igG umane, IgA umane e IgM umane in analiti. Tuttavia, WO92/21024 non fornisce né insegnamenti né suggerimenti in relazione alla possibilità di impiegare il procedimento descritto per distinguere tra diverse fasi di infezioni con patogeni .

Così, il problema tecnico alla base dell'invenzione era quello di fornire un procedimento migliorato per l'analisi conveniente di fasi di un'infezione da parte di un patogeno. La soluzione a tale problema tecnico è conseguita grazie alle forme di attuazione caratterizzate nelle rivendicazioni.

In accordo, l'invenzione si riferisce ad un procedimento . per la rivelazione di anticorpi/isotipi di anticorpi specifici per almeno due differenti fasi di un'infezione che comprende

(a) l'incubazione di un campione da un paziente simultaneamente con almeno due tipi di composti, ciascun tipo di composto comprendendo un diverso epitopo in condizioni che permettono il legame di detti anticorpi a detto epitopo, in cui ciascun epitopo è riconosciuto da anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo specifici per una di dette fasi di tale infezione, in cui inoltre nella reazione di incubazione sono presenti almeno due epitopi riconosciuti da anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo specifici per almeno due diverse fasi di detta infezione, in cui inoltre ciascun tipo di composto e/tutti i tipi di composti comprendenti epitopi riconosciuti da anticorpi/isotipi di anticorpi indicativi della stessa fase di infezione sono fissati allo stesso tipo di supporto ed in cui ciascun tipo di supporto ha proprietà che permettono la distinzione fisica di detto tipo di composti da altri tipi di supporto mediante mezzi fisici;

(b) la distinzione fisica di detti composti; e

(c) la valutazione se anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo sono legati a detti tipi di composti.

Secondo la presente invenzione, si è trovato sorprendentemente che fasi diverse di un'infezione possono essere identificate in modo conveniente incubando un campione da un paziente che notoriamente è affetto o è sospettato di essere affetto da infezione da parte di un patogeno, con almeno due composti che comprendono differenti epitopi, in cui ciascun epitopo reagisce con anticorpi che si trovano specificamente in certe fasi dell'infezione, Ciò, a sua volta, significa usualmente che l'epitopo è esposto al sistema immune di questa fase dell'infezione. Mentre nella forma di attuazione dell'invenzione l'anticorpo apparterrebbe allo stesso isotipo, gli anticorpi specifici per diverse fasi di un'infezione alternativamente appartengono a diversi isotipi. Così, è noto che una fase precoce di un'infezione è spesso associata con la presenza di anticorpi delle classi IgM e IgA, mentre nelle fasi più tardive di un'infezione IgG può essere predominante. Secondo l'invenzione, il legame da parte dell'anticorpo è preferibilmente specifico, vale a dire gli anticorpi non danno reazioni crociate con altri epitopi. E' essenziale che gli anticorpi reagenti con un epitopo utilizzato nel procedimento dell'invenzione non diano reazioni crociate con un altro epitopo utilizzato in detto procedimento, in cui detto altro epitopo è indicativo di una fase differente dell'infezione.

In certi casi, ci può essere una rivelazione simultanea di differenti tipi di anticorpi, in cui ciascun tipo di anticorpo sarebbe considerato indicativo di una certa fase di infezione. Tuttavia, l'esperto del settore sarebbe di solito nella posizione di identificare la fase dell'infezione, ad esempio valutando il rapporto tra anticorpi differenti. La ragione di questo tipo di scoperta potrebbe essere ad esempio che un certo tipo di anticorpo/isotipo di anticorpo è indotto durante una fase dell'infezione, quale ad esempio una fase precoce di infezione, ma può persistere nel corpo durante fasi più tardive dell'infezione. In tal caso, la fase effettiva dell'infezione può essere identificata mediante la determinazione del rapporto della quantità di un anticorpo/isotipo di anticorpo indicativo di una fase più tardiva dell'infezione in relazione alla quantità di anticorpi persistenti. In alternativa, può essere valutata la presenza concomitante di due tipi di anticorpi/isotipi di anticorpi o l'assenza di un tipo di anticorpo/isotipo di anticorpo.

Il procedimento dell'invenzione è anche adatto all'identificazione della fase di un'infezione mediante rivelazione di più di due di detti anticorpi/isotipi di anticorpi. L'esperto del settore, applicando i principi sopra citati e la sua comune conoscenza generale, interpreterà i dati per determinare la fase effettiva della malattia di un paziente. Egli è anche in grado di stabilire condizioni di saggio che permettano un legame rivelabile anticorpo-epitopo; vedere ad esempio Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, New York.

Come risulta da ciò che è stato detto precedentemente, il procedimento dell'invenzione si basa inoltre sul principio che i composti comprendenti i vari epitopi sono fissati su differenti tipi di supporto che sono distinguibili mediante le loro proprietà fisiche. Il termine "tipo di supporto" può anche, ma non necessariamente, significare che un tipo di supporto è distinguibile da un altro tipo di supporto mediante la sua costituzione chimica. Il composto comprendente l'epitopo può essere fissato a detto supporto mediante una varietà di mezzi noti nella tecnica. Tali mezzi includono l'accoppiamento chimico, il rivestimento, il legame mediante forze di van-der-Waals, ecc.. Tuttavia, è importante, che la conformazione dell'epitopo non venga distrutta e che l'epitopo sia accessibile al legame dell'anticorpo.

Il procedimento dell'invenzione comprende inoltre forme di attuazione, in cui differenti epitopi riconosciuti da anticorpi/isotipi di anticorpi indicativi della stessa fase dell'infezione sono accoppiati allo stesso tipo di supporto. Con queste forme di attuazione si può conseguire una determinazione più accurata della fase dell'infezione. Inoltre, se gli anticorpi/epitopi sono indicativi di certi momenti temporali/intervalli temporali all'interno di una certa fase di un'infezione, si può determinare uno stadio di progressione all'interno di una certa fase dell'infezione/malattia.

In una forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, detti anticorpi sono anticorpi IgM. Questa forma di attuazione è favorita nei casi in cui differenti tipi di IgM possono essere impiegati per distinguere tra due differenti fasi dell'infezione. Come illustrato precedentemente, lo stesso tipo di anticorpo può essere inizialmente presente in una certa fase dell'infezione e persistere durante la seconda fase dell'infezione. Gli anticorpi IgM che riconoscono un diverso epitopo possono essere inizialmente presenti nella stessa fase, ma non persistere nella fase più tardiva. Quindi, la presenza del primo e del secondo anticorpo in questo scenario sarebbe indicativa di una fase precoce, mentre la rivelazione di soltanto il primo anticorpo sarebbe indicativa della fase più tardiva dell'infezione. Lo stesso principio si applica anche ad altri isotipi, quali IgG e IgA.

In un'altra forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, detti anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo sono anticorpi IgM, IgG o IgA. In questa forma di attuazione,·usualmente la rivelazione di IgM sarebbe indicativa di una fase precoce dell'infezione, mentre gli anticorpi IgG o IgA sarebbero indicativi di una fase più tardiva dell'infezione.

In un'ulteriore forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, dette almeno due differenti fasi di un'infezione includono la fase acuta, la fase post-acuta, la fase cronica, la fase di remissione di un'infezione o una fase post-infezione. Le sopra citate fasi di un'infezione sono ben accettate in campo medico, ma possono, in relazione alla loro distinzione dalle fasi precoce o tardiva, non essere chiaramente definite in varie malattie per ogni tipo di infezione. In questi casi, la rispettiva fase deve essere interpretata secondo ciò che l'esperto del settore intende con il termine rispettivo. Il termine "fase post-infezione" deve intendersi nel senso di una fase in cui il patogeno infettivo non è più rivelabile nell'organismo e gli effetti patogeni non sono più rivelabili.

In un'ulteriore forma di attuazione del procedimento della presente invenzione, tale infezione è un'infezione con virus, batterio o protozoo.

In una forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento della presente invenzione, detto virus è Cytomegalovirus umano, virus di epatite C, virus di epatite A, virus di epatite B, virus Epstein-Barr, HIV o virus Herpes simplex.

In un'altra forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento della presente invenzione, detto batterio è Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum o Helicobacter pylori.

In una diversa forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento della presente invenzione, detto protozoo è Toxoplasma gondii o Trypanosoma cruzi.

In un'ulteriore forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, detto campione da un paziente è sangue, siero o è da questi derivato. Dalla tecnica anteriore è ben noto che il sangue ed il siero possono essere trattati prima dell'analisi e/o che certe loro frazioni possono essere utilizzate per l'analisi. Il termine "è da questi derivato" viene inteso come includente questi fluidi corporei trattati o loro frazioni.

Secondo l'invenzione, possono essere impiegati numerosi composti differenti comprendenti gli epitopi di interesse. Ad esempio, il composto può essere un portatore di origine naturale o non naturale. Preferibilmente, in un'altra forma di attuazione preferita, l'invenzione si riferisce ad un procedimento, in cui detto composto è un antigene. Preferibilmente, detto antigene è un antigene naturale o un antigene ricombinante.

Secondo l'invenzione, è inoltre preferito che detto antigene sia trattato con detergenti, come SDS, Triton-x o altri detergenti noti all'esperto del settore precedentemente alla fase a.

In una forma di attuazione più preferita del procedimento della presente invenzione, detto antigene è un (poli)peptide o DNA. Il termine "(poli)peptide" , secondo la presente invenzione, si riferisce ad un peptide o ad un polipeptide. Il termine "(poli)peptide" include anche il termine "proteina" .

In un'altra forma di attuazione più preferita del procedimento della presente invenzione, detto antigene o (poli)peptide è proteina di fusione CM2 (HCMV) (Vornhagen et al., J. of Virological Methods, 60: 73-80 (1996) e Vornhagen et al., DE-4435 789-C1 (1995)), p52 (HCMV) (Vornhagen et al., J. of Clinical Microbiology, 34: 1020-1023 (1996)) o una particella virale da HCMV, gp36, gp33, gp27, p30 o p24 (virus di epatite B) (Meisel et al., Intervirology, 37: 330-339 (1994); Milich et al., PNAS 82 8168-8172 (1985); Milich et al., Science 228:1195-1199 (1985)), un lisato di Toxoplasma gondii, opzionalmente trattato con proteìnasi K (Cambiaso, EP 0 328 588B1 (1994)) o deglicosilato, o proteina di 41 kDa (Coleman e Benach, J. of Infectious Diseases, 155: 756-765 (1987)) o proteina di 31/34 kDa (Craft et al., J. Clin.Invest., 78: 934-939 (1996)) da Borrelia burgdorferi.

Nella tecnica sono noti numerosi supporti adatti per servire gli scopi della presente invenzione. In una forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, detto supporto è una perla. .

Preferibilmente, dette perle hanno un intervallo di diametro compreso tra 1,5 e 2 μπι, quali 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 e 2 μm.

In una forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento della presente invenzione, detta perla è una perla di lattice, una particella di metallo colloidale, quale una particella d'oro, o qualsiasi loro combinazione.

In un'altra forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, detta proprietà che permette la distinzione fisica di detti tipi di composti è la massa, la dimensione, l'indice di rifrazione, una proprietà magnetica, una proprietà elettrica o loro combinazioni.

In un'altra forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione, la distinzione fisica di detto composto viene effettuata misurando un cambiamento in detta proprietà causato dall'agglutinazione di detti composti.

L'agglutinazione di detti composti viene effettuata mediante il loro legame crociato per mezzo del legame di un anticorpo agli epitopi. A seconda della concentrazione dell'anticorpo specifico presente nel campione (ed a seconda della concentrazione dell'epitopo), si verificherà un maggiore o minore grado di agglutinazione.

in una forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento della presente invenzione, detta agglutinazione è un'agglutinazione di due o tre composti.

In un'ulteriore forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento della presente invenzione, detta misurazione è la misurazione della diffusione di luce, della variazione di campo magnetico o della variazione di campo elettrico.

Con riferimento alla forma di attuazione, in cui la misurazione viene effettuata mediante diffusione di luce, viene preferibilmente impiegata la tecnologia sviluppata in WO92/21024 e W094/15193, che sono qui menzionati come riferimento. La metodologia come descritta in WO92/21024 si base sull'utilizzo di una cella ottica a flusso schermato ad elevata risoluzione, un rivelatore singolo per la misurazione di segnali ad impulso da diffusione di luce in avanti ("forward light scatter") unidirezionale a basso angolo da dette perle di differenti dimensioni e differentemente rivestite e loro multimeri aggregati, e un'apparecchiatura analizzatore di flusso di particelle.

Detto procedimento implica la miscelazione di campioni con dette particelle monomeriche rivestite ed un periodo di incubazione di detti campioni con le particelle monomeriche rivestite, allo scopo di permettere il verificarsi di reazioni di agglutinazione. Detta agglutinazione viene misura in detto analizzatore di flusso di particelle, in cui particelle monomeriche, dimeriche o n-meriche passano all'interno di un flusso di tipo schermato attraverso un raggio ottico finemente focalizzato prodotto da un laser a semiconduttore. Poiché ciascun tipo di particella passa attraverso il raggio, si produce un singolo segnale di diffusione di luce, che viene rivelato attraverso un fotodiodo. Questi segnali sono classificati in base all'ampiezza in un istogramma per l'analisi dei dati elettronici. Mentre questo procedimento fornisce dati qualitativi e semiquantitativi, la tecnologia migliorata sviluppata in W094/15193, basata su principi simili, ma che impiega microsfere polimeriche rivestite con molecole leganti e particelle di metallo colloidale rivestite con molecole leganti, ha permesso la determinazione simultanea qualitativa e quantitativa di differenti analiti. Ciò viene ottenuto mediante l'utilizzo di due diversi fotodiodi che rivelano segnali di luce diffusa in avanti o lateralmente .

L'invenzione si riferisce anche ad un corredo comprendente diversi tipi di perle con proprietà fisiche distinguibili, in cui a ciascun tipo di perla è ricoperto un composto differente comprendente un epitopo, in cui inoltre ciascun epitopo è riconosciuto da un anticorpo/anticorpo appartenente ad un particolare isotipo e ciascun anticorpo/anticorpo appartenente ad un particolare isotipo è specifico per una fase di una malattia ed in cui detti composti differenti ed epitopi, rispettivamente, sono anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo specifico per almeno due fasi differenti di detta infezione.

Il corredo dell'invenzione è particolarmente utile nell'esecuzione del procedimento dell'invenzione che è stata precedentemente descritta in dettaglio.

In una forma di attuazione preferita del corredo della presente invenzione, dette perle sono perle di lattice, particelle di metallo colloidale, preferibilmente particelle d'oro, o loro combinazioni.

In un'altra forma di attuazione preferita del corredo della presente invenzione, detto composto è proteina di fusione CM2 (HCMV), p52 (HCMV) o una particella virale da HCMV, gp36, gp33, gp27, p30 o p24 (virus di epatite B), un U sato di Toxoplasma gondii, opzionalmente trattato con proteinasi K o deglicosilato, o proteina di 41 kDa o proteina di 31/34 kDa da Borrelia burgdorferi.

Le figure illustrano:

Figura 1:

Profili di serioconversioni valutati con il sistema Copalis I, le particelle impiegate sono sensibilizzate con le proteine CM2 e p52.

Sull'asse delle ordinate è riportato il segnale espresso in CTR, sull'asse delle ascisse i giorni dell 'infezione.

Sono riportate le linee di cut-off per le due particelle.

Figura 2:

Profili di sieroeonversioni valutati con il sistema Copalis I, le particelle impiegate sono sensibilizzate con la proteina CM2 e la particella virale (VP).

Sull'asse delle ordinate è riportato il segnale espresso in CTR, sull'asse delle ascisse i giorni dell'infezione .

Sono riportate le linee di cut-off per le due particelle .

Figura 3:

Alto, sinistra. Distribuzione di frequenza di una popolazione di sieri IgM e IgG negativi per anticorpi anti-Toxoplasma Gondii valutata con il sistema Copalis I; la particella impiegata è sensibilizzata con un lisato di Toxoplasma g. trattato con proteinasi-K.

Alta, destra. Risultati della comparazione della popolazione di sieri IgM e IgG negativi per anticorpi anti-Toxoplasma Gondii fra il sistema Copalis I ed un test di riferimento.

Basso, sinistra. Distribuzione di frequenza di una popolazione di sieri IgM negativi e IgG positivi per anticorpi anti-Toxoplasma Gondii valutata con il sistema Copalis I; la particella impiegata è sensibilizzata con un lisato di Toxoplasma g. trattato con proteinasi-K.

Alta, destra. Risultati della comparazione della popolazione di sieri IgM negativi e IgG positivi per anticorpi anti-Toxoplasma Gondii fra il sistema Copalis I ed un test di riferimento.

Figura 4:

Distribuzione di una popolazione di sieri IgM positivi per anticorpi anti-Toxoplasma Gondii valutata con il sistema Copalis I (sinistra)ed un sistema di riferimento (destra).

In basso. Risultati della comparazione della popolazione di sieri IgM positivi per anticorpi anti-Toxoplasma Gondii fra Copalis I ed un test di riferimento .

Esempio 1

Differenziazione tra la fase acuta e post-acuta dell'infezione da HCMV

Allo scopo di differenziare la fase acuta dalla fase post-acuta di un'infezione da HCMV e per discriminare in un immunosaggio simultaneo tra gli anticorpi IgM ed IgG, microparticelle di lattice di diverse dimensioni sono state rivestite con diversi antigeni virali HCMV specifici. Perle di lattice di dimensione diametrale di 1,8 μπι sono state rivestite con la proteina di fusione CM2, perle di lattice di diametro di 1,7 μm sono state rivestite con la proteina p52 e perle di lattice con un diametro di 1,6 μm sono state rivestite con particelle virali (VP). Le perle di lattice rivestite sono state utilizzate per la misura simultanea di IgM o IgG in un Flow Particle Analyzer ottico a flusso schermato (Hansen (WO92/21204)).

Per la procedura di rivestimento sono stati utilizzati un tampone di rivestimento (CB), comprendente 1,59 g/1 Na2C03, 2,93 g/1 NaHC03 a pH 9,6 ed un tampone di sovrarivestimento (OB), comprendente 7,51 g/1 di glieina, 10 g/1 di frazione V di BSA esente da proteasi, 50 g/1 di saccarosio e 2 g/1 di NaN3.

Allo scopo di rivestire CM2 (da Biotest AG, Germania; Vòrnhagen et al., J.of Virological Methods, 60:73-80 (1996) e DE-4435 789-C1) sulle perle di lattice da 1,8 μιη, è stata preparata una soluzione allo 0,5% di perle di lattice in un tampone di rivestimento. Dopo tre lavaggi delle perle in un tampone di rivestimento comprendenti tre stadi di centrifugazione per 20 minuti a 4000 rpm, le perle sono state risospese in CB ad una concentrazione finale dell'1%. La proteina ricombinante CM2 è stata preparata in un tampone di rivestimento ad una concentrazione finale di 20 μg/ml. La proteina ricombinante è stata combinata, goccia a goccia, con perle di lattice da 1,8 μπι. Il rivestimento idrofobico delle perle di lattice con proteina CM2 è stato effettuato durante 1 ora di incubazione a temperatura ambiente su un rullo a tamburo. Le perle di lattice rivestite sono state lavate in OB mediante centrifugazione per 20 minuti a 4000 rpm. Le perle di lattice rivestite da 1,8 μιη sono state risospese in OB ad una concentrazione dell'1%. Il post-rivestimento in OB è stato effettuato per l ora a temperatura ambiente ed in un rullo a tamburo. Dopo centrifugazione per 20 minuti a 4000 rpm, le perle sono state risospese in OB ad una concentrazione finale di 0,5% (p/v) ed immagazzinate a 4°C fino ad ulteriore utilizzo.

Allo scopo di rivestire le perle di lattice da 1,7 μm con p52, è stata preparata una soluzione al-1 '1% di tali perle in un tampone di rivestimento. Dopo tre fasi di lavaggio in CB, le perle di lattice da 1,7 μm sono state risospese in CB ad una concentrazione finale del 2%.

Allo scopo di ottenere p52, è stato isolato il gene p52 mediante PCR, utilizzando i seguenti primers :

5 'GACTGGATCCGATCGCAAGACGCGCCTC 3' forward primer 5 'GACTAAGCTTCGCGCTCTAGCCGCACTT 3' reverse primer Il prodotto della PCR è stato inserito in pET30 (Kan R) (Novagen, Stati Uniti) con una coda His al terminale N. Il plasmide risultante è stato utilizzato per trasformare cellule di E.coli BL21 e la proteina eterologa è stata ottenuta dopo 3 ore di induzione. La pasta cellulare è stata trattata come segue: il pellet di p52 ottenuta da 125 ml di coltura è stata risospesa in 5 mi di Tris 50 mM, pH 8, aggiungendo 50 μl di benzonase (Benzon-nuclease, da Merck, Germania) e 50 μl di MgCl20,1 M. Dopo incubazione a 37°C per 3 ore, il campione è stato fatto ruotare a 10°C per 30 minuti, 11000 rpm in un rotore JA20.

Il pellet risultante è stata risospesa in 3 mi di Tris 50 mM, urea 8 M, β-ΟΗ 10 mM pH 9,4 (tampone A) , disciolta e sottoposta a sonicazione cinque volte per 30 secondi. Il lisato ottenuto è stato scosso per 1 ora a temperatura ambiente e poi riscaldato a 70°C per 10 minuti e fatto ruotare a 4°C per 30 minuti, 11000 rpm. Il surnatante di urea 8 M è stato sottoposto a gel-filtrazione con un tampone A e la proteina raccolta è stato dializzata fino al giorno successivo a temperatura ambiente contro 1,5 1 di tampone Tris 50 mM, urea 6 M, NaCl 500 mM pH 8,8. La proteina è stata purificata mediante cromatografia di chelazione (cod.: 17040901 PHARMACIA, Svezia), sfruttando la proprietà della coda His.

E' stata preparata una soluzione da 100 μg /mi di proteina p52 in un tampone di rivestimento, è stato aggiunto SDS fino ad una concentrazione finale dello 0,1% alla soluzione di proteina ricombinante e mantenuta in incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo questa incubazione, le perle di lattice da 1,7 μm sono state combinate, goccia a goccia, con la soluzione di proteina ricombinante p52. Il rivestimento idrofobico delle perle di lattice con p52 è stato effettuato mediante incubazione per 2,5 ore a temperatura ambiente su un rullo a tamburo. Le perle sono state lavate due volte in OB ed è stato effettuato il post-rivestimento per 1 ora a temperatura ambiente in OB. Dopo un ulteriore stadio di centrifugazione a 4000 rpm per 20 minuti, le perle di lattice da 1,7 μπι rivestite con p52 sono state risospese in OB ad una concentrazione finale dell'1% (p/v) ed immagazzinate a 4°C fino ad ulteriore utilizzo.

Il rivestimento delle perle di lattice da 1,6 μm con particelle virali (VP) è stato effettuato lavando le perle di lattice da 1,6 μιη tre volte in un tampone di rivestimento. Dopo l'ultimo stadio di lavaggio, è stata preparata una soluzione al 2% di perle di lattice da 1,6 μπι in OB. 80 μΐ di soluzione all'1% di SDS sono state aggiunti ad 1 μg di particelle virali (VP) (da ABI Stati Uniti) ed incubate per 30 minuti a temperatura ambiente. La soluzione di particelle virali è stata preparata ad una concentrazione di 160 μg/ml nel tampone di rivestimento. Gli stessi volumi di soluzione di particelle virali e di soluzione di perle di lattice da 1,6 μπι sono state combinate, goccia a goccia, ed incubate per 1 ora a temperatura ambiente su un rullo a tamburo. Dopo due stadi di lavaggio in OB, le perle di lattice sono state risospese in OB ed è stato effettuato il post-rivestimento per 1 ora a temperatura ambiente su un rullo a tamburo. Dopo ulteriori stadi di centrifugazione a 4000 rpm per 20 minuti, le perle sono state risospese in OB ad una concentrazione finale dell'1% (p/v) ed immagazzinate a 4°C fino ad ulteriore utilizzo.

Procedura di saggio

Per le procedure di saggio durante una prova Copalis I, 20 μl di perle di lattice da 1,6 μπι rivestite con particelle virali, 5 μΐ di perle di lattice da 1,7 μm rivestite con p52, 15 μl di perle di lattice da 1,8 μm rivestiste con CM2 e 3 μΐ di irp (parziale di riferimento interno di 1,1 μm) sono state miscelate e fatte ruotare per 20 minuti a 4000 rpm. Dopo lo stadio di centrifugazione, 23 μΐ di surnatante sono stati scartati e le perle sono state risospese in 20 μΐ di tampone OB per contenitore di reazione. I contenitori di reazione sono stati essiccati per 75 minuti, riscaldando a 37°C sotto controllo di umidità relativa (10%) ed è stato aggiunto un agitatore a barra per ciascun pozzetto. I pozzetti sono stati immagazzinati 4°C fino ad ulteriore utilizzo.

La miscela di perle di lattice essiccata è stata risospesa in 180 μΐ di tampone di reazione (comprendente 0,5 M KBr, 0,1% BSA, 0,15% PEG-8000, 0,002% di detergente zwitterionico, 1 mM EDTA e glieina 0,1 M a pH 9,0) e sono stati aggiunti 20 μΐ di campione di prova. Dopo un'incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente, il campione è stato misurato sotto procedure standard di Copalis I (Copalis® System, Procedure Manual 1997, Sienna Biotech) .

La misura in Copalis I è basata su un monitoraggio della luce diffusa da singole particelle o aggregati di particelle ed appartiene alla classe dei Flow Particle Analyzer (Hansen (WO92/21024)). Perle di lattice e microlarticelle n-meriche possono essere discriminate nella loro dimensione mediante l'energia fotonica diffusa. Se il rivestimento sulle perle di lattice ha causato un'agglutinazione delle microparticelle in presenza di IgG o IgM nel campione, le perle di lattice cambiano la loro distribuzione dimensionale. Un campione è stato impoverito in relazione al numero di perle di lattice monomeriche, mentre è stato incrementato il numero di particelle n-meriche. Si effettua un confronto tra il numero di perle di lattice monomerico, quando esposto ad un campione non reattivo, con lo stesso numero monomerico, quando esposto ad un campione reattivo. Per definire la presenza di uno specifico componente reattivo ed il grado di reazione, il Risultato della Prova Copalis (CTR) può essere matematicamente definito come cento volte il rapporto tra il numero di microparticelle monomeriche contate in presenza di un campione non reattivo (controllo negativo) e la stessa entità in presenza di un campione che reagisce (CTR = 100 x (controllo negativo)/(campione sottoposto al saggio)). Durante la conduzione di prove con sieri negativi, sono stati definiti valori di soglia analitici o clinici, ove i valori di soglia analitici sono stati definiti come il Segnale (CTR) che induceva il 99,5% di un riferimento interno di una popolazione di controllo normale negativo ed i valori di soglia clinici come il Segnale (CTR) che permetteva una sensibilità dell'80% sulla predizione di una recente infezione come valutata su di una popolazione di riferimento positiva. Allo scopo di valutare se un campione era negativo o positivo, è stato definito un rapporto S/CO. S è stato definito come il Segnale-CTR e CO come il valore di soglia CTR. I campioni negativi hanno mostrato un rapporto S/CO < 1,00, mentre i campioni positivi hanno mostrato un rapporto S/CO > 1,00. Risultati delle prove con perle di lattiae rivestite con CM2, p52, particelle virali e con sieri diversi

Si è supposto che le perle di lattice rivestite con CM2 reagissero con IgM durante la fase acuta e post-acuta di un'infezione da HCMV e si è supposto che le perle di lattice rivestite con p52 reagissero,con IgM della fase acuta di un'infezione da HCMV e che le perle di lattice rivestite con VP avessero un'alta sensibilità per IgG dopo infezione da HCMV. Si è pertanto sottoposta a prova la specificità e la sensibilità delle perle di lattice dotate di diversi rivestimenti. Questi dati rilevanti sono riassunti nelle tabelle 1 a 5. Si è testata la specificità e la sensibilità delle perle di lattice rivestite con antigene HCMV, utilizzando sieri negativi IgG anti-CMV e IgM anti-CMV. Come è illustrato nella tabella 1, tutti i venticinque sieri testati sono risultati negativi e non hanno causato agglutinazione delle perle di lattice rivestite con CM2, rivestite con p52 e nemmeno con VP. Non si sono verificate reazioni false positive.

La tabella 2 illustra i risultati per venticinque sieri di prova che erano IgM anti-CMV negativi ed IgG anti-CMV positivi. Soltanto un siero (# 23208) ha mostrato reattività con perle di lattice rivestite con CM2 e p52 (probabilmente a causa di anticorpi anti-lattice nel siero), mentre tutti i campioni testati hanno mostrato reattività con perle di lattice rivestite con VP, il che documenta l'alta sensibilità delle perle rivestite con VP per IgG anti-HCMV.

Le tabelle 3, 4 e 5 documentano l'alta sensibilità di perle di lattice rivestite con CM2 e p52 per anticorpi IgM anti-CMV. Per i risultati documentati, sono stati utilizzati diversi sieri IgM anti-CMV positivi di basso (tabella 3), medio (tabella 4) o alto (tabella 5) titolo.

Allo scopo di valutare la sieroconversione anti-HCMV nei pazienti, sono stati analizzati diversi campioni di sangue di nove pazienti (tutte donne incinte). Il giorno dell'infezione da HCMV è stato valutato utilizzando un test standard dell'ospedale di Pavia (corredo di Sorin Diagnostics: ETI-CYTOK-G (# 2860) ed ETI-CYTOK-M-inverso (# 3238)) e mediante informazione clinica ottenuta da ciascun paziente.

La tabella 6 illustra per ciascun paziente i risultati del test che sono stati ottenuti a diversi giorni di post-infezione, utilizzando perle di lattice rivestite con CM2, p52 e VP in Copalis I.

I dati ottenuti con perle rivestite con CM2 dimostrano che questa proteina a di fusione è in grado di rivelare tutti gli anticorpi IgM anti-HCMV fino alla fine della fase post-acuta (sei-sette mesi dopo l'infezione). I risultati ottenuti con perle rivestite con p52 dimostrano (vedasi ad esempio la sieroconversione # 20675) che p52 è altamente specifico per la fase acuta dell'infezione da HCMV: il segnale generato dalle perle di lattice rivestite con p52 aumentava durate il mese di infezione e diminuiva durante il secondo mese post-infezione. Questa diminuzione del segnale p52 poteva essere correlato alla fine della fase acuta di infezione da HCMV.

I risultati ottenuti con perle di lattice rivestite con VP hanno dimostrato la comparsa di anticorpi IgG anti-HCMV nei sieri testati durante la progressione dell'infezione da HCMV.

I dati di sieroconversione ottenuti da questi nove campioni di pazienti sono riassunti nei grafici delle figg.la, lb, 2a e 2b. Questi dati dimostrano che le perle di lattice rivestite con CM2 hanno rivelato tutti gli anticorpi IgM anti-HCMV fino alla fine dalla fase post-acuta dell'infezione, mentre l'immunoreattività per IgM anti-HCMV con p52 è prominente durante le fasi iniziale/acuta dell'infezione da HCMV.

Come dimostrato in questo esempio, gli immunosaggi di multianaliti per immunoglobuline di diversi sottotipi possono essere effettuati simultaneamente, utilizzando microparticelle di diverse dimensioni rivestite con antigene specifico, ciascuna delle microparticelle essendo reattiva verso una diversa classe di anticorpi in un fluido biologico.

Questi dati mostrano un'alta specificità (98%) e sensibilità (94%) delle perle di lattice rivestite con CM2 e p52 per 1'isotipo di anticorpo IgM anti-HCMV ed un'alta specificità (98%) e sensibilità (98%) delle perle di lattice rivestite con VP per l'isotipo di anticorpo IgG antl-HCMV. In conclusione, è possibile determinare lo stadio di un'infezione da HCMV (fase acuta o post-acuta) combinando i dati che possono essere ottenuti con perle rivestite con CM2 e p52 una fase acuta di infezione è identificata da alti valori p52 ed alti valori CM2, mentre la fase post-acuta è definita da basse letture di p52 ed alte letture di CM2.

Esempio 2

Epatite B, differenziazione della fase acuta dalla fase di remissione dell'infezione

Allo scopo di fornire anticorpi che possono essere utilizzati come sistemi marcanti per la discriminazione tra la fase acuta e la fase di remissione di un'infezione da epatite B (HBV) e che possano essere usati per la rivelazione di IgM anti-HBV e IgG anti-HBV in sieri di pazienti, sono stati eseguiti diversi Western blots indiretti.

La proteina ricombinante preS2-HBsAg (Samanta e Youn, Vaccine 7:69-76 (1989))(sottotipo ay), detta proteina media è stata espressa in cellule 293 di rene umano. (ATCC, Maryland, Stati Uniti) usando un vettore BK (Gallina et al., J. of General Virology, 73:139-148 (1992)).

PreS2-HBsAg ·è una proteina di superficie di epatite B (Heermann, J. Virol. 52:396-402 (1984)), che utilizza tre diversi codoni di inizio in fase (Gallina et al., J. of General Virology, 73:139-148 (1992)). L'inizio al terzo codone AUG genera la proteina maggiore (HBsAg, p24 e p27 nella sua forma glicosilata); l'inizio al secondo codone AUG genera la proteina preS2-HBsAg (proteina media p30 e le sue forme mono- e diglicosilate, gp33 e gp36, rispettivamente) e l'inizio al primo codone AUG aggiunge un'ulteriore estensione da 108 a 119 amminoacidi (regione presi) al terminale N della proteina media generando quella che viene detta proteina grande (p39).

Allo scopo di purificare preS2-HBsAg, il surnatante della coltura cellulare è stato neutralizzato con una soluzione contenente NaCl 0,15 M, NaH2P04 0,01M, MgCl21 mM a pH 7,8. Sono stati aggiunti endonucleasi (445 U/μΙ, SIGMA) e PMSF 0,05 mM, aprotinina 1 μg/ml, leupeptina 1 pg/ml (miscela di antiproteasi) . E' stata effettuata una prima precipitazione mediante lenta addizione di PEG (polietilenglicole) fino ad una concentrazione finale del 6%. Dopo un'incubazione per 30 minuti a 37°C in un agitatore a scossa, la soluzione è stata scartata ed è stata effettuata una seconda precipitazione con PEG (concentrazione finale del 14%). Dopo incubazione a 37°C per 30 minuti in un agitatore a scossa, la soluzione è stata centrifugata a 10000 rpm per 25 minuti a temperatura ambiente. Il pellet risultante è stato risospeso in un volume iniziale di 1/34 in PBS/ 0,05% di NaN3 a pH 7,4 ed arricchita con la miscela di antiproteasi. 100 ml del campione sono stati dializzati per 1 ora a temperatura ambiente con SpectraPor MWCO 50000 contro tampone citrato 0,05 M a pH 2,4. Dopo una centrifugazione a 10000 rpm per 15 minuti, i campioni dializzati sono stati neutralizzati con NaHC030,03 M. Il pellet è stato nuovamente dializzato con SpectraPor MWCO 50000 contro PBS, 0,05% di NaN3 a pH 7,4 e miscela di antiproteasi. La soluzione è stata filtrata (porosità del filtro: 0,2 μΜ) e dispensata in aliquote fino ad ulteriore utilizzo.

Due aliquote di HBsAg purificato (140 μΐ) sono state analizzate mediante SDS-PAGE e possono essere rivelate quattro bande: gp36, gp33, gp27 e p24 (Meisel et al., Intervirology, 37:330-339 (1994)). Il polipeptide gp36 era la forma deglicosilata della proteina preS2-HBsAQ (Asn-123 all'interno della regione preS2 e Asn-320 all'interno della regione S), gp33 era la forma monoglicosilata della regione preS2 (Asn-123), gp27 era la forma glicosilata della regione S (Asn-320), p24 rappresentava la forma non glicosilata della regione S (Meisel et al., Intervirology, 37:330-339 {1994)).

E' stata deglicosilata un'aliquota della proteina ricombinante preS2-HBsAg: sono state aggiunte al campione di proteina tampone Na2HP04 a pH 7,7 ed una soluzione contenente 2% di SDS e 2-mercaptoetanolo 1 M. Dopo riscaldamento del campione a 100°C per 5 minuti e raffreddamento immediato con ghiaccio per 5 minuti, sono stati aggiunti 12 μΐ di Nonidet P-40 (99%) e 5 μΐ di enzima PNGasiF (BioRad, 2,5 Ul/ml) a 37°C per 2,5 ore. La proteina p30 ottenuta era la forma non glicosilata della proteina preS2-HBsAg.

Le due aliquote (non trattata e deglicosilata) sono state divise in quattro parti (campioni 1, 2, 3, 4), separate su SDS-PAGE (gel di poliacrilammide al 15%) e trasferite su una membrana di PVDF (IM-MOBILON P, Millipore) allo scopo di eseguire un'analisi per Western blot. I campioni trasferiti 1 e 2 sono stati incubati con una diluizione 1:50 di siero PHM 907-09, un marcante di sieroconversione per infezione da HVB (fornito da Boston Biomedica, Inc.) in latte liofilizzato a basso contenuto di grasso in PBS a pH 7,4. I campioni 3 e 4 sono stati incubati con un siero rappresentativo della fase di remissione (da AALTO, Irlanda) diluito 1:50 in latte liofilizzato scremato in PBS a pH 7,4. Dopo incubazione a 37°C per 1 ora, la membrana è stata completamente lavata con PBS a pH 7,4.

I campioni 1 e 3 sono stati ulteriormente incubati con una diluizione 1:200 di anticorpi monoclonali anti-IgM umane, marcati con HRP (perossidasi di rafano) (da CSL, Australia).

I campioni 2 e 4 sono stati incubati con una diluizione 1:350 di anticorpi di capra anti-IgG umane (Atlantic Antibodies, Maine, Stati Uniti), marcati con HRP. Dopo un periodo di incubazione di l ora a 37°C in un agitatore a scossa, le membrane sono state lavate ed è stata effettuata una procedura di rivelazione, utilizzando 9-etilammino-carbazolo (AEC, Sigma).

Come illustrato nelle tabelle 7 e 8, durante la fase acuta di un'infezione da HBV, due forme glicosilate di preS2, gp36 e gp33 erano altamente reattive con anticorpi IgG/IgM umane, mentre non fu riscontrata reattività verso la regione S, i polipeptidi gp27 e p 24. Nel campione 2, poteva essere rivelata una reattività molto elevata con gp36 e p30 con anticorpi anti-IgG limane. Nessuna reattività contro gp27 e p24 poteva essere rivelata con anticorpi anti-IgG umane.

Durante la fase di remissione di un'infezione da HBV (vedere tabelle 9 e 10), non poteva essere rivelata alcuna reattività di qualsiasi degli antigeni HBV specifici testati con anticorpi anti-IgM umane. Al contrario, poteva essere mostrata una reattività molto elevata verso gp27 e p24, ma nessuna reattività contro gp27, p30 e p24 con coniugati anti-IgG umane.

In conclusione, il siero PHM907-09 (positivo al DNA di HBV, positivo a HBsAg e positivo a HBeAG), essendo diagnostico di una fase acuta dell'infezione da HBV, reagiva molto fortemente con gli antigeni gp36 e gp33, mostrando immunoreattività del paziente nei confronti delle forme glicosilate della regione preS2. Al contrario, il siero rappresentativo della fase di remissione (positivo anti-HBs, positivo anti-HBc, positivo anti-Hbe) reagiva principalmente con gp27 e p24, mostrando elevata immunoreattività nei confronti della proteina maggiore (regione S).

Quindi, in analogia con l'esempio 1, gp36, gp33 e p30 possono essere utilizzati come antigeni specifici per la rivelazione di una fase acuta di un'infezione da HBV, mentre gp27 e p24 possono essere utilizzati come antigeni per la fase di remissione di un'infezione da HBV.

Esempio 3

Differenziazione di isotipi di anticorpi contro Toxoplasma gondii e preparazione di perle rivestite con antigeni isotipo specifici

Allo scopo di preparare perle di lattice che sono rivestite con antigeni specifici di Toxoplasma gondii (Tg) per la rivelazione di IgM anti-Tg, perle di lattice da 1,8 μm (1% p/v) sono state lavate tre volte in tampone di lavaggio (glieina 0,1 M, NaCl 0,17 M, NaN39,15 mM a pH 9,2, diluito in 1:15 di acqua deionizzata). Dopo un'ultima fase di centrifugazione a 13 krpm per 4 minuti, sono stati aggiunti 620 μl di lisato di Toxoplasma gondii (T. gondii ottenuto da Ospedale Gaslini Genova, Italia, lisato preparato secondo le procedure convenzionali) in NP40 (concentrazione di 5,11 mg/ml, lotto 176, Pharmacia, Stati Uniti) al pellet di perle di lattice, fino ad una concentrazione finale di antigene di 1,5 mg/ml. Dopo l'aggiunta di 200 μΐ di soluzione salina tamponata con glieina (GBS: 0,1 M di glieina, 0,17 M di NaCl, 9,15 mM di NaN3 a pH 9,2) e di 180 μl di acqua deionizzata, le perle sono state incubate con lisato di Toxoplasma gondii per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo centrifugazione a 13 krpm per 4 minuti, le perle sono state lavate due volte in GBS (diluito 1:15 con acqua deionizzata) ed una volta in GBS contenente 10 g/1 di BSA (sieroalbumina bovina). Le peri pellettizzate sono state risospese in 1 mi di tampone GBS-BSA e sottoposte a sonicazione per 15 secondi a 150 W.

Le perle sono state pellettizzate mediante centrifugazione a 13 krpm per 4 minuti e sono state lavate tre volte in tampone TRIS (0,1 M di TRIS, 20 mM di CaCl2 a pH 7,5). Dopo l'ultimo lavaggio, le perle sono state risospese in un 1 ml di tampone TRIS contenente 200 μm/ml di proteinasi K. Dopo un'incubazione di 2 ore a 37°C in un agitatore orbitale, la reazione della proteinasi K è stata bloccata con l'aggiunta di 10 μΐ di PMSF 0,1 M (Sigma, Stati Uniti) ed un'ulteriore incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo centrifugazione a 13 krpm per 4 minuti, le perle rivestite sono state lavate tre volte in 1 mi di tampone GBS-BSA e le perle sono stata essiccate secondo l'esempio 1 ed immagazzinate a 4°C fino ad ulteriore utilizzo. Prima del loro utilizzo nei saggi, le perle sono state risospese in un tampone di reazione (come descritto nell'esempio 1) e sottoposte a sonicazione a 150 W per 15 secondi.

Per la procedura del saggio durante una prova di Copalis I (Copalis® System, Procedure Manual 1997, Sienna Biotech), i 180 μl risospesi di perle di lattice rivestite con Tg/proteinasi K sono stati combinati con 20 μl di campione di prova. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, il campione è stato misurato secondo le procedure standard Copalis I, come brevemente evidenziato e descritto nell'esempio 1.

Allo scopo di analizzare la specificità delle perle rivestite con Tg/proteinasi K per la determinazione in siero di IgM anti-Tg, le perle rivestite con Tg/proteinasi K sono state testate utilizzando sieri di controllo negativi per IgM anti-Tg e IgG anti-Tg (sieri di controllo doppiamente negativi). Inoltre, le perle sono state testate su sieri, che erano negativi a IgM anti-Tg e positivi a IgG anti-Tg. I risultati dei test sono illustrati nella fig.

3 .

Su 93 sieri di controllo doppiamente negativi, soltanto tre campioni hanno mostrato valori al disopra del CTR di soglia (123). In 24 campioni che erano positivi a IgG anti-Tg, ma negativi a IgM anti-Tg, non si è potuto rilevare alcun segale falso positivo. Non si è potuto misurare alcuna reattività crociata delle perle trattate con proteinasi K con IgG anti-Tg. Tutti i CTR misurati erano al disotto del CTR di soglia di 123.

Come illustrato nella fig.4, quando venivano utilizzati sieri positivi a IgM anti-Tg nell'analisi Copalis delle perle rivestite con Tg/proteinasi K, soltanto 1 su 96 campioni era risultato falso positivo, dimostrando l'elevata sensibilità delle perle rivestite con Tg trattate con proteinasi K per la rivelazione di anticorpi IgM anti-Tg. I risultati delle figg.3 e 4 sono riassunti nelle tabelle 11 e 12.

Allo scopo di fornire specifiche perle di lattice che sono state rivestite con antigeni Tg specifici per la reazione delle IgG anti-Tg, sono stati eseguiti i seguenti esperimenti.

Poiché era stato confermato che la reattività delle IgM anti-Tg era localizzata sulle parti glicosidiche di specifiche proteine del patogeno (vedere la sezione precedente), è stato dedotto che la rimozione di queste parti glicosidiche dovrebbe portare ad antigeni modificati che sono specifici per la rivelazione di IgG anti-Tg.

La rimozione o distruzione della parte glicosidica delle principali proteine di Toxoplasma g. è stata eseguita secondo due metodi su diversi estratti del protozoo:

1. rimozione enzimatica mediante un corredo enzimatico di deglicosilazione (170.6500 BioRad, Stati Uniti) ,

2. distruzione chimica: ossidazione mediante NaIO4.

Il corredo di deglicosilazione enzimatica rimuove enzimaticamente dalle glicoproteine gli oligosaccaridi legati a N e gli oligosaccaridi Gal (bl-3) GalNac (al) sostituti con acido sialico legati a O. La deglicosilazione enzimatica è stata meno severa dei metodi chimici ed ha fornito glicoproteine deglicosilate che erano adatte ad ulteriori analisi delle proteine e dei carboidrati. Inoltre, si può determinare il ruolo della glicosilazione sulla bioattività proteica e sul legame degli anticorpi. La reazione di deglicosilazione è stata condotta secondo le raccomandazioni del produttore.

L'efficienza della reazione di deglicosilazione è stata confermata facendo correre i campioni (prima e dopo la deglicosilazione) su gel per SDS-PAGE e su Western blots. Con queste tecniche, è stata osservata una riduzione dei pesi molecolari degli antigeni principali, che è risultata in una distruzione della reattività dell'IgM anti-Tg, mentre la reattività dell'IgG anti-Tg era completamente mantenuta .

La miscela di proteina deglicosilata è stata rivestita su particelle di polistirene di dimensione appropriata, in misura da 1,6 a 1,9 μm. E' stato aggiunto un surfattante allo scopo di stabilizzare il rivestimento ed è stato utilizzato un tampone di post-rivestimento (tampone di sovrarivestimento come descritto nell'esempio 1) per ridurre le reazioni non specifiche. Le perle rivestite sono state trattate con la miscela deglicosilante per 2,5 ore a 37°C ed immagazzinate a 4°C fino ad ulteriore utilizzo .

Dopo l'essiccazione delle perle, le perle sono state risospese in tampone di reazione e mescolate con campioni di prova (come descritto nell'esempio 1). Dopo un'incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente, i campioni sono stati misurati secondo le procedure standard Copalis I (Copalis® System, Procedure Manual 1997, Sienna Biotech). Le scoperte di questi esperimenti hanno confermato i risultati ottenuti mediante analisi con Western blot: è stata ridotta la reattività di IgM anti-Tg, mentre la reattività di IgG anti-Tg è stata mantenuta.

La distruzione chimica è stata eseguita mediante trattamento della proteina principale di Toxoplasma g, con soluzione di NaIO4 a concentrazioni diverse (in misura da 0,01 a 40 mM). Le reazioni sono state effettuate a temperatura ambiente per 30 minuti ed a diversi valori di pH. Le reazioni sono state bloccate mediante trattamento con etilenglicole trattamento acido. I gruppi aldeidici residui sono stati bloccati mediante riduzione con NaCNBH3 in presenza di glicina o etanolammina 0,1 M a pH basico. L'efficienza delle reazioni è stata confermata facendo correre i campioni (prima e dopo la deglicosilazione) su gel per SDS-PAGE e su Western blots. Con queste tecniche si è osservato che la reattività di IgM anti-Tg è stata distrutta, mentre la reattività di IgG anti-Tg era completamente mantenuta. Le perle di polistirene rivestite con lisato di toxoplasma gondii sono state anche trattate con il periodato. Quando il saggio di agglutinazione è stato eseguito con le perle trattate con NaIO4, i risultati come descritti per i saggi su Western blot poterono essere confermati.

Esempio 4

Differenziazione delle fasi di infezione da Borrelia burgdorferi

All'inizio di un'infezione da Borrelia burgdorferi si osserva un incremento dei titoli di anticorpi IgM contro una proteina del flagello di 41 kDa (Coleman e Benach, J.of Infectious Diseases, 155, 756-765 (1987)). Successivamente, durante l'infezione, si sviluppa reattività IgG contro la stessa proteina. La reattività anti-antigene di 41 kDa è mantenuta sia per brevi periodi (da settimane a mesi), o per un lungo periodo (persino anni) e si ritiene sia dovuta alla continua presenza dello spirochete. La reattività contro la 41 kDa è considerata come un marcante per un'infezione recentemente contratta, ma non può essere utilizzata come marcante per un'infezione remota, in quanto sono descritte reazioni paziente-specifiche che variano da paziente a paziente. Inoltre, successivamente durante l'infezione, sono documentate reattività contro un ampio spettro di antigeni di Borrelia, il cui peso molecolare può variare da 14 a circa 97 kDa. Principalmente, si osserva un'immunoreattività contro due proteine diverse di membrana esterna di 31 kDa e 34 kDa, rispettivamente (Craft et al., J.

Clin.Invest ., 78, 934-939 (1986)). Queste due proteine possono essere utilizzate come marcanti per un'infezione latente. La reattività contro la coppia 31/34 kDa è principalmente sostenuta da IgG, ma può anche essere dovuta alla presenza di IgM.

Una differenziazione tra un'infezione recente e remota di Borrelia burgdorferi è basata sulla scoperta del fatto che durante le prime fasi di infezione non si rivela una reattività contro le proteine di 31/34 kDa.

Le tre proteine di Borrelia burgdorferi sono facilmente purificate mediante separazione della frazione di membrana esterna (antigeni di 31 kDa e 34 kDa) di Borrelia burgdorferi dai flagelli periplasmatici (proteina di 41 kDa) ed ulteriore separazione elettroforetica o elettroeluizione. Allo scopo di ottenere componenti di involucro esterno (OE) di Borrelia burgdorferi, sono state centrifugate colture di Borrelia burgdorferi (7000 g per 20 minuti a 20°C). Il pellet risultante è stato lavato e risospeso in soluzione salina. E' stato aggiunto SDS (0,03%) a temperatura ambiente per 15 minuti e la sospensione è stata centrifugata (25000 g per 90 minuti a 4°C). Il surnatante contenente la frazione OE è stato filtrato e dializzato per rimuovere SDS.

La frazione di pellet risultante dal trattamento con SDS è stata risospesa in soluzione salina e miscelata in un miscelatore Waring. La sospensione è stata centrifugata (26000 g per 6 minuti a 4°C) ed è stato raccolto il surnatante risultante. La procedura è stata ripetuta diverse volte sui pellet rimanenti ed i sum atanti raccolti sono stati riuniti e concentrati mediante TFDF (Tangential Flow Ultra Filtration, Millipore, Minitan System). Ciò ha portato ad ottenere una frazione di flagelli periplasmatici (PF). Un gel SDS-PAGE preparativo è stato caricato sia con la frazione OE sia con la frazione PF e condotto fino al giorno successivo a 30 mA. La posizione della proteina è stata identificata mediante colorazione con blu di Coomassie e successiva decolorazione con isopropanolo/acido acetico .

Le proteine desiderate sono state identificate per confronto del gel risultante con un SDS-PAGE analitico. La porzione di gel contenente le proteine è stata elettroeluita per 12 ore a 10 V in un BìoRad Transblot. Allo scopo di rimuovere SDS, si è poi effettuato uno stadio di dialisi.

Le proteine purificate sono state rivestite su microparticelle di polistirene di dimensione appropriata, variante tra 1,6 e 1,9 μιη, in condizioni sia acide, sia basiche o neutre, utilizzando carbonato di sodio (pH 9,6), glicina (pH 4,0) o HEPES (pH 7,0) come sistemi tampone. Allo scopo di stabilizzare il rivestimento, è stato aggiunto un tensioattivo (SDS o Tween 20 a concentrazioni nel campo da 0,01 a 0,05). Allo stesso modo, un lisato di una coltura di Borrelia burgdorferi è stato rivestito su particelle di polistirene. Le perle di lattice rivestite sono poi bloccate mediante una soluzione neutra BSA-saccarosio (1% BSA, 5% saccarosio), concentrazione di BSA intorno all'1% e saccarosio .

I risultati del saggio di agglutinazione danno i seguenti modelli di reattività:

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la rivelazione di anticorpi/ isotipi di anticorpi specifici per almeno due diverse fasi di un'infezione, comprendente le fasi di: a) incubare un campione da un paziente simultaneamente con almeno due tipi di composti, ciascun tipo di composto comprendendo un diverso epitopo in condizioni che permettono il legame di detti anticorpi a detto epitopo, in cui ciascun epitopo è riconosciuto da anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo specifico per una di dette fasi di detta infezione, in cui inoltre nella reazione di incubazione sono presenti almeno due epitopi riconosciuti da anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo specifico per almeno due diverse fasi di detta infezione, in cui inoltre ciascun tipo di composto è/tutti i tipi di composti comprendenti epitopi riconosciuti da anticorpi/isotipi di anticorpi indicativi della stessa fase di infezione sono legati allo stesso tipo di supporto ed in cui ciascun tipo di supporto ha proprietà che permettono la distinzione fisica di detto tipo di composti da altri tipi di supporto mediante mezzi fisici ; b) distinguere fisicamente detti composti; e c) valutare se anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo sono legati a detti tipi di composti.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detti anticorpi sono anticorpi IgM.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detti anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo sono anticorpi IgM, IgG o igA.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui dette almeno due diverse fasi di un'infezione includono la fase acuta, la fase post-acuta, la fase cronica, la fase di remissione di un'infezione o una fase post-infezione.
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui detta infezione è un'infezione da virus, da batterio o da protozoo.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detto virus è Cytomegalovirus umano, virus di epatite C, virus di epatite A, virus di epatite B, virus di Epstein-Barr, HIV o virus di Herpes simplex.
7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detto batterio è Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum o Helicobacter pylori.
8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detto protozoo è Toxoplasma gondii o Trypanosoma cruzi.
9. 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, in cui detto campione da un paziente è sangue, siero o è da questi derivato.
10. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9, in cui detto composto è un antigene.
11. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui detto antigene è un (poli)peptide o DNA.
12. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 10 oppure 11, in cui detto antigene o (poli)peptide è una proteina di fusione CM2 (HCMV), p52 (HCMV) o una particella virale da HCMV, gp36, gp33, gp27, p30 o p24 (virus di epatite B), un lisato di Toxoplasma gondii, opzionalmente trattato con proteinasi K o deglicosilato, o una proteina di 41 kDa o una proteina 31/34 kDa da Borrelia burgdorferi.
13. 13 . Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12, in cui detto supporto è una perla.
14. 14. Procedimento secondo la rivendicazione '13, in cui detta perla è una perla di lattice, lina particella di metallo colloidale, preferibilmente una particella d'oro o una qualsiasi loro combinazione.
15. 15. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 14, in cui detta proprietà che permette la distinzione fisica di detti tipi di composto è la massa, la dimensione, l'indice di rifrazione, una proprietà magnetica, una proprietà elettrica o una loro combinazione.
16. 16. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 15, in cui la distinzione fisica di detto composto è effettuata misurando un cambiamento in detta proprietà, causato dall'agglutinazione di detti composti.
17. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, in cui detta agglutinazione è un'agglutinazione di due o tre composti.
18. 18. Procedimento secondo le rivendicazioni 16 o 17, in cui detta misura è la misura di diffusione di luce, variazione di campo magnetico o variazione di campo elettrico.
19. 19. Corredo comprendente diversi tipi di perle di proprietà fisiche distinguibili, in cui ciascun tipo di perla è rivestito con un composto diverso, comprendente un epitopo, in cui inoltre ciascun epitopo è riconosciuto da un anticorpo/anticorpo appartenente ad un particolare isotipo e ciascun anticorpo/anticorpo appartenente ad un particolare isotipo è specifico per la fase di una malattia ed in cui detti composti diversi ed epitopi, rispettivamente, sono anticorpi/anticorpi appartenenti ad un particolare isotipo specifico per almeno due diverse fasi di detta infezione.
20. 20. Corredo secondo la rivendicazione 19, in cui dette perle sono perle di lattice, particelle di metallo colloidale, quali particelle d'oro o qualsiasi loro combinazione.
21. 21. Corredo secondo le rivendicazioni 19 o 20, in cui detto composto è una proteina di fusione CM2 (HCMV), p52 (HCMV) o una particella virale da HCMV, gp36, gp33, gp27, p30 o p24 (virus di epatite B), un lisato di Toxoplasma gondii, opzionalmente trattato con proteinasi K o deglicosilato, una proteina di 41 kDa o proteina di 31/34 kDa da Borrelia burgdorferi .