FR3005421A1 - Proteine d'aedes aegypti utilisable comme cible pour prevenir ou traiter une infection de dengue - Google Patents

Abstract

La présente invention a trait à une protéine de salive d'Aèdes Agypti utile en tant que cible pour lutter contre la réplication du virus de la dengue chez des hôtes mammifères et à des compositions pharmaceutiques comprenant cette protéine.

Description

Protéine d'Aedes aegypti utile en tant que cible pour prévenir ou traiter une infection par la dengue La présente invention a trait à une protéine de salive d"Aedes aegypti utile en tant que cible pour lutter contre la réplication du virus de la dengue (désigné par l'abréviation « DENV ») chez des hôtes mammifères. La dengue est la maladie virale transmise par les moustiques la plus répandue et elle est provoquée par le virus de la dengue (DENV), virus enveloppé à ARN simple brin de polarité positive de la famille des flaviviridés. Aedes (Ae.) aegypti et Ae. albopictus sont devenus des vecteurs de cette maladie et ces espèces de moustiques sont devenues très répandues sous les latitudes tropicales et subtropicales. Ces deux vecteurs transmettent la maladie en injectant le DENV dans la peau des vertébrés, avec leur salive, lorsqu'ils se nourrissent. Différentes protéines présentes dans la salive (Pile. aegypti aident le moustique à prendre son repas sanguin en neutralisant les réponses physiologiques élaborées par l'hôte vertébré pour prévenir la perte de sang et combattre l'infection. Cependant, la salive contient également de nombreuses protéines, connues ou encore à déterminer, essentielles pour une transmission optimale du DENV et d'autres arbovirus, grâce à leur capacité à moduler la réponse immunitaire de l'hôte.

Certains des co-inventeurs ont récemment démontré que la salive d'Ac. aegypti active la réplication du DENV dans les kératinocytes humains (1: Surasombatpattana et al., 2011) en 'inhibant la sécrétion de peptides antimicrobiens (AMP), S100A7, Elafin, ainsi que d'interférons (IFN) aux tout premiers stades de l'infection (2 : Surasombatpattana et al., 2012). 25 Après une analyse génomique et protéomique fonctionnelle de glandes salivaires de moustiques Ae. aegypti femelles, quatre protéines supplémentaires qui sont abondamment présentes dans la salive de moustique (3 Wasinpiyamongkol et al., 2010; 4: Luplertlop et al., 2011) ont été identifiées et ont ensuite été caractérisées selon la présente invention, 30 pour leur capacité à moduler l'infection par le DENV des kératinocytes humains. Chacune de ces molécules, la protéine analogue à la serpine anticoagulante dirigée contre le .Fxa (AT : numéro d'enregistrement Genbank Q1HRTV7_AEDAE), l'adénosine-désaminase (AD: Q179D4 AEDAE), une protéine salivaire putative sécrétée de la famille des protéines de 34 kDa (34 kDa : Q1HRWO_AEDAE) et une protéine putative sécrétée (VA: Q8T9U5 AEDAE), a été produite sous forme de protéine recombinante dans un système d'expression baculovirus et purifiée sur une résine Ni-SepharoseTM 6 Fast Flow (figure 1-a).

Le DENV a été inoculé dans des kératinocytes épidermiques humains primaires en présence ou en l'absence de chacune des quatre protéines et les taux intracellulaires d'ARNin viral ont été quantifiés par PCR en temps réel 24 heures après l'infection. En inoculant le DENV dans des kératinocytes épidermiques humains primaires en présence ou en l'absence de chacune des quatre protéines, les inventeurs ont observé une augmentation significative de l'expression de transcrits du DENV dans les kératinocytes infectés par le DENV en présence des protéines, par rapport aux cellules infectées avec le DENV seul. De manière inattendue, l'une des protéines a induit la plus forte augmentation de la réplication virale à seulement 1 lag,/mL.

Ainsi, un but de la présente invention est de fournir une nouvelle cible permettant de prévenir ou de traiter la dengue. Selon un autre bu,t, la présente invention a également trait à des compositions 20 pharmaceutiques comprenant la protéine utilisée en tant que cible. Elle a également trait à un procédé de prévention ou de traitement de la dengue consistant à utiliser ladite protéine. 25 La présente invention a donc trait à une nouvelle cible permettant de prévenir ou de traiter la dengue, constituée d'une protéine salivaire putative sécrétée de la famille des protéines de 34 kDa (Q1HRWO_AEDAE) d'Aedes aegypti. Le terme « protéine de 34 kDa » tel qu'utilisé ci-après désigne la forme native ou une protéine 30 recombinante. Ladite protéine inhibe fortement l'expression de transcrits des facteurs IRF3 et IRF7 dans les kératinocytes infectés par le DENV, comme le montrent les résultats expérimentaux divulgués ci-après.

L'utilisation d'une large gamme de concentrations a permis de découvrir que la protéine de 34 kDa exerce une activation, dépendante de la relation dose/effet, de la réplication du DENV, avec un effet maximal aux plus faibles doses utilisées. Comme expliqué dans les exemples, les données obtenues révèlent une corrélation inverse entre l'augmentation de la réplication virale et la diminution de l'expression de chacun des gènes de la réponse immunitaire innée testés. Une protéine non liée à la salive n'a pas influencé la réplication du DENV, confirmant ainsi la spécificité de la protéine de 34 kDa.

La forte activation de.la réplication du DENV par la protéine de 34 kDa dans les kératinocytes humains est liée à son fort effet inhibiteur sur la voie de signalisation des IRF, entraînant l'abrogation de la production d'IFN de type I. La présente invention tire également parti du rôle prépondérant que joue la protéine de 34 kDa 15 dans l'infection par le DENV des kératinocytes humains, pour fournir des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité efficace de protéine de 34 kDa en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. , Ainsi, lesdites compositions pharmaceutiques sont particulièrement utiles pour prévenir ou 20 traiter l'infection par le DENV des kératinocytes humains, en inhibant la réponse immunitaire antivirale aux tout premiers stades de l'infection. Lesdites compositions peuvent être utilisées sous des formes appropriées pour une administration par voie orale, par voie topique ou par injection. 25 La présente invention a également trait à un procédé de prévention ou de traitement d'une infection par le DENV chez un patient, ledit procédé consistant à administrer la protéine de 34 kDa au patient pour induire une réponse immunogène ou un composé capable d'inhiber l'effet de la protéine de 34 kDa pour au moins réduire la charge virale. 30 Elle a également trait à une composition vaccinale permettant de prévenir ou de traiter la dengue, comprenant une quantité efficace de la protéine de 34 kDa susmentionnée, éventuellement sous une forme recombinante, en association avec au moins un adjuvant.

Selon un autre but, la cible permettant de prévenir ou de traiter la dengue est la séquence de nucléotides codant la protéine de 34 kDa susmentionnée, Selon encore un autre but, la présente invention a trait à des constructions nucléotidiques 5 comprenant une séquence de nucléotides codant la protéine de 34 kDa susmentionnée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont présentés ci-après en référence aux figures 1 et 2 et à la figure complémentaire 1, qui illustrent respectivement : 10 Figure 1: Activation de la réplication du DENV par les protéines de salive d'Ae, aegypti dans 'les kératinocytes infectés. (a) On a fait passer des protéines salivaires recombinantes purifiées sur un gel d'acrylamide à 10 % et on les a révélées par coloration au nitrate d'argent. Bande MM : marqueurs de masse moléculaire ; bande 1 : AT ; bande 2: AD; bande 3: 34 kDa ; bande 4: VA et bande 5: 15 gp120 du VIH-1. (b) On a infecté des kératinocytes avec le DENV à une multiplicité d'infection de 1, en présence ou en l'absence de protéines salivaires. 24 h après l'infection, on a quantifié l'ARN viral intracellulaire par RT-PCR en temps réel. Les résultats sont exprimés en copies d'ARN viral par microlitre dans les kératinocytes infectés par le DENV. 20 On a utilisé le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour déterminer la différence statistique entre .les ensembles de données. On a considéré qu'une valeur P <0,05 était significative. *Valeurs P < 0,05. Figure 2: Expression de l'ARNm des IFN de type I, des IRF et des AMP dans les 25 kératinocytes infectés par le DENV, On a exposé les cellules au DENV à une multiplicité d'infection de 1, en présence ou en l'absence de protéines saliva.ires à 1 et 5 p.g/mL. On a analysé l'expression de l'ARNm des peptides (a) IFN-a, (b) IFN-13, (c) IRF3, (d) IRF7, (e) LL-37, (f) S100A7 et (g) RNase7, par RT-PCR quantitative en temps réel aux instants indiqués. 30 Les résultats sont exprimés en facteur de multiplication de l'induction de transcrits dans les ,kératinocytes infectés par le DENV, en présence ou en l'absence de protéines salivaires, par rapport à des cellules infectées par un leurre. On a utilisé le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour déterminer la différence statistique entre les ensembles de données. On a considéré qu'une valeur P <0,05 était significative. *Valeurs P <0,05, 'Figure complémentaire 1: La diminution, induite par la protéine de 34 kDa d'Ae. aegypti, de l'expression génique de la réponse immunitaire innée est inversement corrélée avec son effet d'activation de la réplication du DENV. On a infecté des kératinocytes avec le DENV à une multiplicité d'infection de I, en présence ou en l'absence de la protéine de 34 I(Da ou de la protéine gp120 du VIH en tant que protéine témoin. (a) 24 h après l'infection, on a quantifié l'ARN viral intracellulaire par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats sont exprimés en copies d'ARN viral par microlitre dans les kératinocytes infectés par le DENV. On a analysé l'expression de l'ARNm des peptides (b) IFN-a, (c) IFN-13, ,(d) IRF3, (e) IRF7, LL-37, (g) S100A7 et (h) RNase7, par RT-PCR quantitative en temps réel aux temps indiqués. Les résultats sont exprimés en facteur de multiplication de l'induction de transcrits dans les kératinocytes infectés par le DENV, en présence ou en l'absence de protéines salivaires, par rapport à des cellules infectées par un leurre. On a utilisé le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour déterminer la différence statistique entre les ensembles de données. On a considéré qu'une valeur P <0,05 était significative. *Valeurs P <0,05. 'Les interférons de type I sont connus pour combattre les virus pendant les infections virales, non seulement directement en inhibant la réplication virale dans les cellules, mais aussi indirectement en stimulant les réponses immunitaires innée et adaptative. Dans la présente étude, on a découvert que les protéines AD et VA inhibent fortement l'expression de transcrits de l'IFN-a et de l'IFN-13 dès 1 gg/mL, tandis que leur effet à 5 i.tg/mL, notamment sur l'expression de PARNm de l'IPN-f3, est moins prononcé (figure 2-a et b). Parmi les quatre protéines, c'est la protéine AT qui présente l'effet le plus faible.

Toutefois, aux deux concentrations, la protéine de 34 kDa inhibe complètement l'expression des IFN de type I. L'induction de la réponse des IFN de type I est activée par deux facteurs de transcription appartenant à la famille des facteurs de régulation des IFN (IRF), l'IRF-3 et l'IRF-7, par translocation d'IRF3 et d'IRF7 dimérisés dans le noyau, où ils amorcent la transcription des gèneus des IFN. Il a été rapporté que le complexe DENV/protéase inhibe la phosphorylation de l'IRF3, entraînant l'absence de production d'IFN de type I dans les cellules dendritiques humaines.

Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire qui sous-tend l'inhibition des IFN de type I par les protéines salivaires, on a analysé leur effet sur l'expression de l'ARNm de l'IRF3 et de l'IRF7. À l'instar de son effet sur l'expression génique des IFN de type I, la protéine de 34 kDa inhibe aussi fortement l'expression de transcrits de l'IRF3 et de l'IRF7 à chacune des 'concentrations utilisées (figure 2-c et d). Bien que les trois autres protéines n'aient aucun effet significatif sur la transcription de l'IRF3, elles inhibent l'expression de PARNm de l'IRF7 dans les kératinocytes infectés par le DENV. On a ensuite étudié le niveau d'expression des AMP. Comme le montre la figure complémentaire 1, l'utilisation d'une large gamme de concentrations a permis de découvrir que la protéine de 34 kDa exerce une activation, dépendante de la relation dose/effet, de la 20 réplication du DENV, avec un effet maximal aux plus faibles doses utilisées. Comme expliqué plus haut, on a observé une corrélation inverse entre l'augmentation de la réplication virale et la diminution de l'expression de chacun des gènes de la réponse immunitaire innée testés. Une protéine non liée à la salive n'a pas influencé la réplication du iDENV, confirmant ainsi la spécificité de la protéine de 34 kDa. 25 Les données indiquées ci-dessus permettent l'identification d'une protéine exprimée de façon proéminente dans la salive d'Ae. aegypti, à savoir la protéine de 34 kDa qui constitue donc une cible d'intérêt pour lutter contre la réplication du DENV chez des hôtes mammifères.

Références bibliographiques 1 - Surasombatpattana P, Hamel R, Patramool S et al. (2011) Dengue virus replication in infected human keratinocytes leads to activation of antiviral innate immune responses. Infect 5 'Genet Evol 11:1664-73. 2 - Surasombatpattana P, Patramool S, Luplertlop N et al. (2012) Aedes aegypti saliva enhances dengue virus infection of human keratinocytes by suppressing innate immune responses. J Invest Dennatol 132:2103-5. 10 3 - Wasinpiyarnongkol L, Patramool S, Luplertlop N et al. (2010) Blood-feeding and immunogenic Aedes aegypti saliva proteins. Proteomics 10:1906-16. 4- Luplertlop N, Surasombatpattana P, Patramool S et al. (2011) Induction of a peptide with 15 .activity against a broad spectrum of pathogens in the Aedes aegypti salivary gland, following Infection with Dengue Virus. PLoS Pathog e1001252.

Claims (4)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation pour prévenir ou traiter une infection par la dengue, constituée d'une protéine salivaire putative sécrétée de la famille des protéines de 34 Iffla (n° d'accès Genbank 5 Q1HRWO_AEDAE) d'Aecles aegypti.
2. 2. Compositions pharmaceutiques comprenant une quantité efficace de protéine de 34 kDa en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10
3. 3. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 2, permettant de prévenir ou de traiter l'infection par le DENV de kératinocytes humains en inhibant la réponse immunitaire antivirale aux tout premiers stades de l'infection.
4. 4. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 3, sous des formes appropriées 15 pour une administration par voie orale, par voie topique ou par injection.