FR2913499A1 - Dispositif de lecture de fluorescence. - Google Patents

Abstract

Dispositif de lecture de la fluorescence émise par des éléments chromophores associés à des composants biologiques ou chimiques à la surface d'un objet (10), comprenant des moyens (12) d'éclairage des éléments chromophores par une lumière d'excitation produite par une source laser (16) et passant dans un guide d'onde formé par une fibre optique ou par un barreau (18) de matière transparente, et des moyens (14) de collecte et de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores, ces moyens (14) comprenant un système optique (34) à grand champ.

Description

Dispositif de lecture de fluorescence

L'invention concerne un dispositif de lecture de la fluorescence émise par des éléments chromophores associés à des composants biologiques ou chimiques, pour l'identification de ces composants et la mesure des quantités présentes de ces composants. Les biopuces à ADN ou à protéines et les lames de microscope ayant un revêtement de surface approprié sont des exemples connus de supports sur lesquels des composants biologiques sont immobilisés après hybridation et sont détectables grâce à des marqueurs qui leur sont associés et qui émettent une fluorescence dans une bande étroite de longueurs d'onde en réponse à une excitation lumineuse dans une autre bande étroite de longueurs d'onde. D'autres exemples de senseurs utilisant le principe de fluorescence sont les détecteurs sensibles au glucose et au pH. La collecte et la mesure de la fluorescence émise par les marqueurs permettent de détecter et de dénombrer les composants associés à ces marqueurs. On a proposé d'utiliser pour cette détection un microscope confocal à balayage, dont les inconvénients sont bien connus : lenteur des mesures, nécessité de déplacer la biopuce ou le microscope dans deux dimensions de façon rapide et précise, ce qui requiert une robotisation lourde, encombrante et coûteuse, etc. Certains inconvénients de cette technique pourraient être évités en utilisant un système optique à grand champ pour la collecte de la fluorescence, mais il se pose alors le problème d'un éclairage suffisamment efficace de la surface observée, qui ne peut être résolu par l'utilisation d'une source classique de lumière blanche, dont la brillance est trop faible dans la bande de longueurs d'onde d'excitation des chromophores, ce qui oblige à n'éclairer que de très petites surfaces, inférieures à 1 cm2, ou à allonger excessivement le temps de pose (plus de 30 minutes), et qui ne peut non plus être résolu par l'utilisation d'un faisceau laser conventionnel, en raison de sa cohérence temporelle et de sa section en général circulaire ou ovale, qui produisent respectivement des tavelures ( speckle ) à la traversée des optiques utilisées et une non uniformité de l'éclairage, ce qui oblige à ne retenir que le centre de la tâche d'éclairage, 90% de l'énergie d'excitation étant perdus. La présente invention a pour objet une technique nouvelle d'acquisition de la fluorescence émise par des composants du type précité, permettant une identification et un dénombrement rapide et précis des marqueurs fluorescents présents dans une zone donnée, grâce à la combinaison d'un éclairage efficace et exempt de tavelures ( speckle ) et d'une imagerie à grand champ. Elle propose à cet effet un dispositif de lecture de la fluorescence émise par des éléments chromophores associés à des composants biologiques ou chimiques à la surface d'un objet, comprenant des moyens d'éclairage des éléments chromophores par une lumière d'excitation et des moyens de collecte et de captation d'une fluorescence émise par les éléments chromophores en réponse à leur excitation lumineuse, caractérisé en ce que les moyens d'éclairage comprennent au moins un guide d'onde interposé entre une source de lumière d'excitation et les éléments chromophores et formé par une fibre optique ou par un barreau (18) de matière transparente à la lumière d'excitation, ce guide d'onde ayant une section de sortie adaptée à la forme et aux dimensions de l'image des moyens de captation formée sur la surface de l'objet par les moyens de collecte. Le dispositif selon l'invention permet d'utiliser une source lumineuse intense, telle par exemple qu'une diode laser, qui est spectralement fine et compacte et dont le faisceau lumineux mis en forme par la fibre optique ou par le barreau de matière transparente fournit un éclairage uniforme à section par exemple rectangulaire ou carrée, adaptée à la forme d'un capteur matriciel du type CCD ou CMOS par exemple faisant partie des moyens de captation de la fluorescence. Ce dispositif d'éclairage est avantageusement combiné à des moyens de collecte et de captation de la fluorescence comprenant un 5 système optique à grand champ, c'est-à-dire ayant un angle de champ supérieur à 1 dans au moins une direction d'un capteur matriciel sur lequel est formée l'image de la zone observée. Cette technique permet une acquisition rapide des informations de fluorescence, les dimensions de la zone observée étant par exemple de 10 l'ordre de 15x15mm2 ou de 15x25mm2 selon les réalisations, avec une résolution de l'ordre de 101am et une limite de détection de 1 à 10 chromophores/ m2 selon les réalisations. Le dispositif d'éclairage selon l'invention présente d'autres caractéristiques avantageuses parmi lesquelles : 15 - les faces du barreau précité sont polies pour réduire les pertes de puissance optique, et notamment sa face de sortie pour obtenir une figure d'illumination sans défaut et parfaitement uniforme, -la source de lumière est reliée par une fibre optique à une extrémité du barreau, ce qui permet de déporter la source de lumière pour réduire 20 l'encombrement et favoriser l'évacuation de chaleur, et permet également de multiplexer les moyens d'éclairage, soit en connectant la source de lumière à plusieurs barreaux en parallèle, soit en connectant plusieurs sources de lumière en parallèle à un même barreau, - la source de lumière comprend un laser ou une diode laser à 25 grande cohérence temporelle et la fibre optique reliant cette source au barreau est associée à un moyen vibrant qui a un effet de décohérence temporelle, par moyennage dans le temps et dans l'espace des tavelures aléatoires ( speckle ) générées par le faisceau laser, - la fibre optique est une fibre multimode, ce qui favorise la 30 décohérence temporelle de la lumière émise par la source laser, - l'axe d'éclairage et l'axe optique des moyens de collecte de la fluorescence font entre eux un angle compris entre 0 et 180 . Lorsque cet angle est différent de 0 et de 180 , la surface éclairée de l'objet a une forme différente de la forme de la section de sortie du guide d'onde (la surface éclairée est par exemple trapézoïdale alors que la section de sortie a une forme carrée). Pour limiter ce phénomène, l'extrémité de sortie du guide d'onde peut être taillée pour que sa face de sortie s'étende sensiblement parallèlement à la surface éclairée de l'objet. Il est également possible d'anticiper ce phénomène pour l'annuler, en choisissant par exemple un guide d'onde à section de sortie trapézoïdale alors que la zone observée a une forme rectangulaire ou carrée. L'angle entre l'axe optique et l'axe d'éclairage est par exemple d'environ 30 à 50 , ce qui permet un éclairage de l'objet en champ sombre , la lumière d'excitation des chromophores ne pénétrant pas directement dans les moyens de collecte de la fluorescence. On évite ainsi l'utilisation d'un élément filtrant tel qu'une lame dichroïque, le système optique est plus compact et les contraintes de réjection de la lumière d'excitation par les filtres traversés par la fluorescence collectée sont beaucoup plus faibles. Avantageusement, la zone de l'objet couverte par l'éclairage est exactement adaptée à celle qui est imagée sur le capteur d'acquisition de la fluorescence, ce qui permet une efficacité maximale de l'éclairage. En effet, lorsque la zone éclairée est trop grande, une certaine quantité de lumière est perdue en dehors de la zone imagée, qui est éclairée moins efficacement. Inversement, si la zone éclairée est trop petite, seule une partie de la zone imagée est éclairée et les moyens optiques de collecte sont inutilement surdimensionnés. Lorsque la zone éclairée et imagée est plus petite que la surface utile de l'objet étudié, on peut prévoir des moyens de déplacement de l'objet par rapport aux axes d'éclairage et de collecte de la fluorescence, et/ou prévoir des moyens, par exemple à miroir mobile, de balayage de la surface de l'objet par la lumière d'éclairage. Il est également possible de prévoir plusieurs moyens d'éclairage indépendants les uns des autres, ces moyens éclairant chacun une surface ou zone d'intérêt de l'objet. Ces zones d'intérêt peuvent être distinctes ou bien peuvent se recouvrir ou se chevaucher au moins partiellement, le dispositif comprenant en outre des moyens de collecte et de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores de chacune des zones d'intérêt de l'objet. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le système optique de formation d'image des moyens de collecte comprend deux objectifs photographiques montés tête-bêche sur un module déplaçable le long de l'axe optique de collecte. Ces deux objectifs, lorsqu'ils sont identiques, assurent un grandissement égal à 1 de l'image de la zone éclairée formée sur le capteur d'acquisition de la fluorescence, la résolution du dispositif imageur étant alors égal à la taille des pixels du capteur, soit par exemple 9 m.

L'un des objectifs est placé directement au dessus de l'objet étudié et le module portant les objectifs comprend une caméra de détection et un filtre d'arrêt de la lumière d'excitation, ce module étant guidé avec précision en translation le long d'un axe vertical qui est l'axe optique commun des deux objectifs.

Dans une application de l'invention à la détection et l'identification d'agents biologiques, l'objet étudié est une biopuce logée dans une chambre d'hybridation d'une cartouche mise en place sur un support fixe qui est équipé de moyens de connexion de la cartouche à un circuit fluidique et à un module électronique qui assure l'alimentation électrique générale du dispositif, la commande du dispositif et les communications avec la caméra d'acquisition de la fluorescence. Le dispositif constitue alors un système intégré capable de réaliser l'hybridation d'acides nucléiques injectés dans la chambre d'hybridation de la cartouche, la lecture de la fluorescence émise, ainsi que l'analyse des images acquises grâce à sa liaison avec un système de traitement de l'information tel qu'un micro-ordinateur portable, équipé d'un logiciel approprié d'analyse d'images. Dans une autre application de l'invention, l'objet étudié est un support en verre tel qu'une lame de microscope d'un type approprié disponible dans le commerce, sur laquelle sont fixés des brins d'ADN repérables par des marqueurs fluorescents. Cette lame a une surface utile de 23x73mm2 par exemple et est portée par un chariot déplaçable en translation par un moteur pas à pas. La zone éclairée sur la lame a par exemple des dimensions de 15x25mm2. La lame est déplaçable sous les moyens de collecte et de capture de fluorescence dans cinq positions différentes espacées de 15mm, pour l'acquisition d'une image complète de cette lame en quelques minutes. Le dispositif d'éclairage peut comprendre, dans cette application, deux sources lumineuses émettant par exemple à 645nm et à 532nm respectivement, qui sont reliées chacune par une fibre optique à un barreau de matière transparente du type précité. Dans tous les cas, le dispositif selon l'invention est entièrement capoté, pour assurer le noir complet à l'intérieur lors des lectures de fluorescence.

L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple non limitatif et en référence aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 est une vue schématique en perspective d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention ; - les figures 2 à 8 sont des vues schématiques en perspective d'autres modes de réalisation de l'invention ; - les figures 9 à 11 représentent schématiquement un dispositif intégré d'hybridation et de lecture de fluorescence ; - la figure 12 représente schématiquement les composants essentiels d'un dispositif de lecture de fluorescence selon l'invention ;

7 - la figure 13 est un graphe représentant l'évolution en fonction du temps de la fluorescence obtenue par des hybridations successives, sur un seul et même support, de plusieurs paires d'oligonucléotides avec des cibles biologiques différentes, ce support étant lavé après chaque hybridation. Le dispositif représenté en figure 1 est destiné à collecter et capter la fluorescence émise en réponse à une excitation lumineuse par des éléments chromophores se trouvant sur une surface S d'un objet 10. Il comprend des moyens 12 d'éclairage de la surface S par une lumière d'excitation des éléments chromophores et des moyens 14 de collecte et de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores en réponse à l'excitation lumineuse. Les moyens d'éclairage 12 comprennent une source lumineuse 16 émettant une lumière dans une bande étroite de longueurs d'onde, telle par exemple qu'une diode électroluminescente (LED) de grande brillance, émettant sur une largeur spectrale d'environ 20nm, que l'on peut coupler directement à l'extrémité arrière ou d'entrée d'un barreau 18 de matière transparente à ces longueurs d'onde, ou bien une diode laser que l'on peut coupler à l'extrémité arrière du barreau 18 par une fibre optique 20 comportant des boucles 22, cette fibre optique étant avantageusement une fibre multimode associée à un dispositif vibrant 24 tel qu'un vibreur de téléphone portable par exemple, susceptible de provoquer un déplacement de la fibre optique à une fréquence faible (typiquement comprise entre 10Hz et 1 kHz) avec une amplitude de quelques dixièmes de millimètre ou moins. Le barreau 18 de matière transparente est à section adaptée à la forme de la surface S à éclairer, cette section pouvant être rectangulaire, carrée ou trapézoïdale par exemple. Pour réduire les pertes de puissance optique, le barreau 18 est poli sur toutes ses faces et en particulier sur sa face de sortie 26 pour obtenir une figure d'illumination sans défaut et parfaitement uniforme.

En variante, on pourrait appliquer à la face de sortie 26 du barreau un traitement assurant une faible diffusion de la lumière (avec une indicatrice de diffusion d'angle inférieur à l'ouverture du faisceau) pour parfaire l'uniformité de l'éclairage.

Les moyens d'éclairage peuvent également comprendre une lentille 28 de formation d'une image de la face de sortie 26 du barreau sur l'objet 10, pour limiter l'encombrement au voisinage de l'objet et pour agrandir ou réduire la surface éclairée 30 sur l'objet. Cette lentille 28 peut être légèrement défocalisée de manière à lisser la figure d'illumination et d'en éliminer les fluctuations à hautes fréquences spatiales. Les moyens 14 de collecte et de captation de la fluorescence comprennent essentiellement une caméra à capteur matriciel 32 du type CCD, CMOS ou à photodiodes, un système optique à grand champ 34 et un filtre de fluorescence 36 arrêtant la lumière d'excitation.

La surface S correspond à l'image du capteur 32 dans l'espace objet et définit le champ du système optique. Ce système est à grand champ lorsque l'angle a que fait le rayon principal 38 (passant par le centre de la pupille d'entrée 40 et par l'extrémité de l'image du capteur 32 sur l'objet 10) avec l'axe optique 42 du système, est supérieur à un degré suivant au moins une direction de l'image du capteur 32. Le filtre de fluorescence :36 qui arrête la lumière d'excitation, peut indifféremment être situé devant ou derrière le système optique 34, à l'intérieur de ce système comme représenté en figure 1, ou bien directement sur le capteur matriciel 32.

Le dispositif de la figure 1 fonctionne de la façon suivante : - la lumière émise par la source 16 est guidée par le barreau 18 selon les lois de l'optique géométrique, les réflexions multiples sur chacune des faces du barreau créant autant d'images multiples de la source lumineuse formée par l'extrémité de la fibre optique 20 à l'extrémité avant du barreau 18, ces images venant se superposer sur la face de sortie 26 du barreau. II en résulte un moyennage spatial qui uniformise l'éclairage qui est également adapté à la forme de la section du barreau, ce qui permet d'avoir une figure d'illumination de forme correspondante, par exemple carrée ou rectangulaire et donc bien adaptée à la forme du capteur matriciel 32.

Lorsque la source 16 est une diode laser, la lumière émise est à forte cohérence temporelle, cette cohérence étant à l'origine de tavelures aléatoires ( speckle ) nuisibles à l'uniformité de l'éclairage. Lorsque la fibre optique multimode 20 est mise en vibration par le dispositif vibrant 24, cette vibration provoque un déplacement des tavelures et permet de les moyenner dans le temps et dans l'espace, cet effet de moyennage étant d'autant plus important que la fibre est très multimode. Dans le meilleur des cas, la zone éclairée 30 sur l'objet 10 correspond à la surface S qui est l'image du capteur matriciel 32 sur cet objet. On a alors un éclairage d'une efficacité maximale pour le système optique 34 utilisé. Typiquement, la surface S peut être de 15x25mm2. Dans encore une autre variante non représentée, le dispositif comprend un guide d'onde formé uniquement par une fibre optique qui est disposée entre la source lumineuse et l'objet 10 ou la lentille 28, et dont la section de sortie est adaptée à la forme de la surface S de l'objet. Dans le dispositif de la figure 1, l'éclairage est réalisé en champ sombre , c'est-à-dire que la lumière d'excitation ne pénètre pas directement dans le système optique de collecte de la fluorescence émise, l'axe optique des moyens d'éclairage 12 étant pour cela incliné par rapport à l'axe optique 42 des moyens de collecte 14. Dans la variante de la figure 2, l'éclairage est également réalisé en champ sombre bien que l'axe d'éclairage soit confondu avec l'axe 42 du système optique de collecte de la fluorescence. Les moyens d'éclairage 12 et les moyens de collecte sont de part et d'autre de l'objet 10 et, dans ce cas, c'est l'objet 10 lui-même qui, par sa structure, réalise la séparation entre la fluorescence émise par les éléments chromophores présents dans la surface S et la lumière d'excitation. Pour cela, l'objet 10 peut comprendre un ensemble de micro-trous dans lesquels le phénomène de fluorescence est concentré.

Dans la variante de la figure 3, l'éclairage est toujours réalisé en champ sombre . L'axe optique des moyens d'éclairage 12 est incliné par rapport à l'axe optique 42 des moyens de collecte 14, et l'extrémité avant ou de sortie du barreau 18 est taillée de sorte que sa face de sortie 26 soit parallèle à la surface éclairée 30 de l'objet. Cette surface éclairée a alors une forme (carrée, rectangulaire) identique à celle de la section de sortie du barreau 18. L'axe optique des moyens d'éclairage est dans ce cas brisé pour prendre en compte la réfraction de la lumière au niveau de la face de sortie 26 du barreau. La lentille 28 précitée peut être avantageusement remplacée par un miroir hors d'axe 29.

Dans la variante de la figure 4, l'éclairage est réalisé en champ clair , ce qui nécessite l'installation d'un élément filtrant supplémentaire, tel qu'une lame dichroïque 44, dans le système optique 34 de collecte de la fluorescence, cette lame dichroïque étant inclinée à 45 , par exemple, sur l'axe optique 42 et l'axe d'éclairage étant perpendiculaire à cet axe optique 42. La liaison de la source de lumière 16 au barreau 18 par une fibre optique 20 permet également de multiplexer les moyens d'éclairage, par exemple en connectant la même source 16 à plusieurs barreaux 18 en parallèle comme représenté en figure 5 ou en connectant le même barreau 18 à plusieurs sources 16 en parallèle comme représenté en figure 6, ces différentes sources 16 émettant sur des longueurs d'ondes différentes. Lorsque la surface imagée S est plus grande que la surface 30 éclairée sur l'objet 10 par les moyens d'éclairage 12, comme représenté en figure 7, on peut rendre mobile le faisceau d'éclairage, par exemple au moyen d'un miroir mobile 46 installé entre la lentille 28 et l'objet 10 et qui permet de balayer l'ensemble de la surface S, le miroir 46 étant monté

11 pivotant autour de deux axes perpendiculaires ou autour d'un centre de rotation. Lorsque la surface imagée S est plus grande que la surface 30, il est également possible d'utiliser plusieurs faisceaux d'éclairage, ces faisceaux étant obtenus par plusieurs moyens d'éclairage 12' indépendants les uns des autres, comme cela est visible en figure 8. La surface 30 éclairée sur l'objet 10 par chaque moyen d'éclairage 12' représente une zone d'intérêt Zi de l'objet, ces zones d'intérêt Zi étant distinctes et pouvant être toutes imagées à l'intérieur du même champ. Les moyens d'éclairage 12' sont adaptés à la taille de la zone Zi correspondante. Cela permet de maximiser l'énergie lumineuse utile en éclairant uniquement les zones d'intérêt Zi de l'objet, et aussi d'introduire la notion de multiplexage spatial, chaque zone Zi pouvant être adressée individuellement. Dans une autre variante représentée sur une partie de la figure 8, les zones d'intérêt Zi" se recouvrent au moins en partie mutuellement (et peuvent éventuellement être confondues), ces zones d'intérêt Zi" étant chacune éclairée par des moyens d'éclairage 12" indépendants et comportant chacune des marqueurs fluorescents propres différents des marqueurs des autres zones d'intérêt Zi". La longueur d'onde d'excitation de chacun des moyens d'éclairage est alors adaptée à chaque marqueur pour un multiplexage spectral. Ces zones Zi" sont également toutes imagées à l'intérieur du même champ. Une application de l'invention à la détection et l'identification d'agents biologiques est illustrée aux figures 9 à 11.

Dans cette application, l'objet 10 est une cartouche comportant une chambre d'hybridation dans laquelle est logée une biopuce à ADN comportant des sondes qui correspondent à un ou à des agents biologiques recherchés. Cette cartouche 10 est placée dans un logement ménagé dans un support fixe 50 du dispositif selon l'invention. Ce dispositif est subdivisé en trois modules M1, M2, M3, le premier module M1 étant fixe et comportant le support fixe 50 précité, le module M2 étant fixe et

12 comportant un bloc fluidique et un bloc électronique, le module M3 étant mobile et placé au-dessus du module MI et comprenant deux objectifs photographiques 52, 54 qui sont identiques et qui sont orientés tête-bêche le long d'un axe vertical, l'objectif inférieur 52 étant situé directement au dessus de la puce à ADN logée dans la cartouche 10. Le module M3 comporte en outre une caméra 56 comprenant le capteur matriciel 32 décrit en référence à la figure 1 et placée au-dessus de l'objectif supérieur 54. Le bloc fluidique du module M2 comprend une pompe, des électrovannes et des circuits de fluide reliés à la chambre d'hybridation de la cartouche 10 et à des flacons 58 contenant les liquides des réactifs nécessaires à l'hybridation des acides nucléiques recherchés sur les sondes de la puce à ADN. Le module mobile M3 comprend une plaquette 58 porte-filtre recevant le filtre de fluorescence 36 décrit en référence à la figure 1, et sur laquelle sont fixés l'extrémité inférieure de l'objectif supérieur 54 et l'extrémité supérieure de l'objectif inférieur 52, cette plaquette étant elle-même portée à ses extrémités par deux supports en ciseaux 60 qui sont orientés perpendiculairement l'un à l'autre et qui permettent de contraindre le déplacement du module M3 selon un axe vertical bien défini, qui est l'axe commun des objectifs 52 et 54. Le module fixe M1 comprend encore, outre les composants déjà cités, un dispositif d'alignement optique qui assure le parallélisme du plan image et du plan du capteur matriciel de la caméra 56, des moyens de chauffage et de régulation de température de la chambre d'hybridation, ainsi que les moyens d'éclairage 12 décrits en référence à la figure 1, et des moyens d'agitation comprenant un générateur d'ultrasons destiné à favoriser le mélange dans la chambre d'hybridation. Ce générateur d'ultrasons favorise également l'hybridation et/ou les lavages à l'intérieur de la cartouche. Le module M1 peut en outre comporter des moyens de renforcement optique d'excitation et/ou de fluorescence.

13 De plus, les deux modules M1 et M3 sont capotés, pour assurer une obscurité totale en position fermée pour la mesure de fluorescence. La caméra 56 est par ailleurs reliée à un système de traitement de l'information tel qu'un ordinateur portable, équipé d'un logiciel d'analyse d'images qui permet d'identifier les acides nucléiques présents et d'estimer leurs quantités. Dans ce dispositif, les deux objectifs photographiques 52 et 54 alignés tête-bêche sont identiques, de sorte que le grandissement du système optique est égal à 1, sa résolution étant égale à la taille des pixels de la caméra 56, soit 9 m dans un exemple de réalisation. L'excitation des marqueurs fluorescents des sondes de la puce à ADN est réalisée autour de 640nm, la surface observée étant de 15x15mm2. Le barreau 18 des moyens d'éclairage 12 est réalisé en PMMA (poly-méthacrylate de méthyle) et a des dimensions de l'ordre de 20x2,5x2mm3 dans un exemple de réalisation. La diode laser utilisée émet une puissance de 40mW, ce qui permet un éclairement de la puce à ADN d'environ 10mW/cm2. La vitesse d'acquisition d'images de la zone observée est de trois images par minute.

Une autre application de l'invention a été illustrée schématiquement en figure 12. Dans cette application, le support des éléments chromophores est une lame de microscope 62 d'un type disponible dans le commerce, qui a été spécialement préparée pour l'hybridation de brins d'acides nucléiques sur sa surface supérieure. Cette lame 62, dont les dimensions sont par exemple de 26x76,5mm2 avec une surface utile de 23x73mm2, est placée sur un chariot 64 déplaçable en translation horizontale par un moteur pas à pas M sous l'ensemble des deux objectifs 52 et 54 précités, entre lesquels est montée une plaque 66 porte-filtre. La caméra 56 placée au-dessus des objectifs 52, 54 est raccordée à un ordinateur portable68.

Deux moyens d'éclairage 12 du type déjà décrit sont prévus pour éclairer la lame 62 à des longueurs d'onde de 645nm et 532nm respectivement. La surface éclairée de la lame 62 a des dimensions de 16x25mm2 de sorte que cinq translations de la lame 62 sous l'ensemble des objectifs 52 et 54 suffisent pour obtenir une image complète de la surface utile de la lame. La vitesse d'acquisition est par exemple d'une image complète de la lame en trois minutes. Dans tous les modes de réalisation de l'invention, l'angle d'incidence de l'axe d'éclairage sur la surface de l'objet 10 peut être déterminé pour produire une interférence constructive à la surface de l'objet, celui-ci comprenant une couche réfléchissante. Le dispositif selon l'invention permet de réaliser les procédures d'hybridation, de lavage et de fusion sur un seul et même support, et d'identifier et de quantifier en temps réel les composants biologiques ou chimiques présents sur ce support par l'intermédiaire des moyens précités de traitement de l'information. Ce dispositif permet en outre d'effectuer des hybridations conventionnelles en des temps relativement courts, de réaliser des hybridations successives sur un support sur lequel est fixée une matrice de sondes biologiques (telles que des acides nucléiques) organisées en spots pour effectuer un suivi ou monitoring d'échantillons sans altérer l'intensité des signaux ni la reproductibilité des résultats, afin de réduire de façon significative le coût de ce suivi. II permet également d'évaluer le comportement d'hybridation des cibles sur les sondesbiologiques fixées sur le support et ainsi d'étudier les cinétiques d'hybridation. Le dispositif selon l'invention présente de nombreux autres avantages : - un gain de temps. Habituellement, les hybridations d'acides nucléiques sur des surfaces solides sont réalisées en aveugle pendant plusieurs heures (généralement 16 à 20 h). Grâce à la mesure en temps réel, le dispositif permet à l'utilisateur d'arrêter la réaction d'hybridation à tout moment lorsqu'il considère que l'intensité d'hybridation est suffisamment élevée pour son application, ce qui entraîne un gain de temps important. Par exemple, une hybridation standard de produits issus d'amplification génique ou PCR (polymerase chain reaction) sur des lames comportant une matrice d'oligonucléotides organisés en spots peut être réalisée en une heure seulement au lieu d'une nuit comme c'est le cas dans la technique antérieure. De plus, la lecture étant concomitante avec l'hybridation, les résultats sont obtenus immédiatement. - une évaluation de l'efficacité d'hybridation des cibles sur les sondes biologiques. Les intensités des signaux sont généralement très variables pour des sondes présentant pourtant une longueur et un pourcentage de guanine (G) et cytosine (C) comparables, ce qui indique que l'intensité du signal généré par une hybridation ne dépend pas uniquement de la longueur et de la composition en bases de la sonde, mais également de sa température de fusion (Tm) qui dépend de la séquence nucléique de cette sonde. Le développement de matrice de sondes biologiques organisées en spots et contenant un très grand nombre de sondes aboutit à des différences importantes quant à la température de fusion (Tm) des différentes sondes présentes dans la matrice, et donne lieu à des écarts très importants dans les efficacités d'hybridation des cibles sur les sondes. Ceci est tout à fait critique à la fois pour la sensibilité et pour la spécificité des puces. En visualisant les propriétés d'hybridation de chaque cible sur chaque sonde immobilisée sous forme de spots sur une lame, le dispositif selon l'invention permet de valider rapidement le dessin des sondes pour une expérience donnée et de déterminer rapidement la température d'hybridation optimale pour la matrice de sondes complète, de sorte que chaque hybridation (cible sur sonde) donne lieu au meilleur compromis entre intensité et spécificité du signal. - une analyse du profil de fusion et de la cinétique d'hybridation sur un support solide. Il existe des différences significatives dans la cinétique d'hybridation d'une séquence donnée en solution et de la même séquence immobilisée sur un support solide. Il a par exemple été constaté que cette séquence n'a pas la même influence sur la réaction d'hybridation lorsque cette réaction a lieu sur un support solide et lorsqu'elle a lieu en solution.

L'analyse de données à partir de matrices de sondes biologiques commerciales a également suggéré que l'hybridation sur un support solide est thermodynamiquement défavorisée par rapport à l'hybridation de la même séquence en solution. Grâce à son système de contrôle de la température précis, le dispositif selon l'invention permet de mesurer la température de fusion (Tm) de sondes immobilisées sur un support solide, ainsi que leur cinétique d'hybridation. - une diminution du coût d'analyse. Avec une procédure adaptée permettant de déshybrider les échantillons cibles de leurs sondes spécifiques, une même lame peut être hybridée successivement à un grand nombre d'échantillons distincts. La figure 13 illustre un exemple d'hybridations successives, sur une seule et même lame, de plusieurs paires d'oligonucléotides (sondes) avec des cibles différentes, cette lame étant lavée après chaque hybridation. Dans cet exemple, onze paires d'oligonucléotides comportant chacun entre 19 et 24 nucléotides, sont immobilisées sur une lame AmpliSlideTM. Chaque paire est présente en douze exemplaires. Les deux oligonucléotides de chaque paire diffèrent l'un de l'autre par un seul nucléotide. Un contrôle positif formé par des oligonucléotides Gaba marqués par Cy5 est également immobilisé sur la lame, en vingt exemplaires. Le dispositif selon l'invention permet de mesurer la valeur du paramètre F-B qui est égal à la fluorescence (F) émise par le marqueur moins le bruit de fond (B). L'hybridation est réalisée avec onze cibles oligonucléotidiques marquées par Cy5, chacune de ces cibles comportant une séquence complémentaire de l'un des deux oligonucléotides de chaque paire précitée. La première de ces cibles est déposée sur la lame et va s'hybrider à un oligonucléotide d'une première paire. L'hybridation provoque une émission de fluorescence qui est représentée sur la figure 13 par une première courbe 70. Cette courbe présente une première partie (t = 1 à 41 min) pendant laquelle la fluorescence augmente progressivement, ce qui signifie que l'hybridation a lieu, et une deuxième partie (t = 41 à 61 min) pendant laquelle la fluorescence chute de façon très nette ce qui correspond au lavage de la lame. Les autres cibles sont ensuite déposées les unes après les autres sur la lame pour s'hybrider à un oligonucléotide de chaque paire, et la lame est lavée après chacune de ces hybridations, ce qui donne les courbes 72 à 90. Les deux dernières courbes 92 et 94 correspondent à deux dépôts successifs du mélange des onze cibles sur la lame pour entraîner l'hybridation simultanée des onze cibles avec les oligonucléotides correspondants. La courbe 96 correspond au contrôle positif précité.

Cette technique permet de réduire le coût d'une expérience grâce à la diminution significative du nombre de lames nécessaires, et, d'autre part, d'accélérer significativement les cycles d'hybridation en évitant la réalisation de nouvelles lames ainsi que les traitements nécessaires pour la préparation de ces lames, ce qui autorise un suivi d'échantillons continu avec des relevés très rapprochésä

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Dispositif de lecture de la fluorescence émise par des éléments chromophores associés à des composants biologiques ou chimiques à la surface d'un objet, comprenant des moyens (12) d'éclairage des éléments chromophores par une lumière d'excitation et des moyens (14) de collecte et de captation d'une fluorescence émise par les éléments chromophores en réponse à leur excitation lumineuse, caractérisé en ce que les moyens d'éclairage (12) comprennent au moins un guide d'onde interposé entre une source (16) de lumière d'excitation et les éléments chromophores et formé par une fibre optique ou par un barreau (18) de matière transparente à la lumière d'excitation, ce guide d'onde ayant une section de sortie adaptée à la forme et aux dimensions de l'image des moyens de captation (32) sur la surface de l'objet (10) éclairé.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens (14) de collecte et de captation de la fluorescence comprennent un système optique (34) à grand champ.

3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les moyens de captation comprennent une caméra à capteur matriciel du type 20 CCD ou CMOS ou à matrice de photodiodes.

4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les faces du barreau (18) des moyens d'éclairage sont polies.

5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le barreau (18) est à section rectangulaire, carrée ou 25 trapézoïdale.

6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le barreau (18) est en verre ou en matière plastique.

7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source de lumière (16) est reliée par une fibre optique 30 multimode (20) à une extrémité du barreau (18).

8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source de lumière (16) comprend une diode électroluminescente ou un laser, tel par exemple qu'une diode laser.

9. Dispositif selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la fibre optique (20) reliant la source de lumière (16) au barreau (18) est associée à un moyen vibrant (24) pour la décohérence de la lumière d'excitation.

10. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une lentille (28) de formation d'images est montée 10 entre le barreau (18) et la surface de l'objet (10).

11. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'axe d'éclairage et l'axe (42) des moyens de collecte et de captation de fluorescence font entre eux un angle compris entre 0 et 180 . 15

12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'axe des moyens d'éclairage (12) et l'axe (42) des moyens (14) de collecte et de captation de fluorescence sont confondus.

13. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la face de sortie (26) du guide d'onde s'étend sensiblement 20 parallèlement à la surface de l'objet (10) éclairé.

14. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (M) de déplacement pas à pas de l'objet par rapport aux axes optiques d'éclairage et de collecte.

15. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, 25 caractérisé en ce que les moyens d'éclairage (12) comprennent des moyens, par exemple à miroir mobile, de balayage de la surface de l'objet (10) portant les éléments chromophores.

16. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs moyens d'éclairage (12') 30 indépendants les uns des autres, ces moyens éclairant des surfaces ou zones distinctes (Zi) de l'objet (10), le dispositif comprenant en outre desmoyens (14) de collecte et de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores de chacune des zones de l'objet.

17. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs moyens d'éclairage (12") indépendants les uns des autres, ces moyens éclairant des surfaces ou zones (Zi") de l'objet (10) qui se recouvrent au moins en partie, le dispositif comprenant en outre des moyens (14) de collecte et de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores de chacune des zones de l'objet.

18. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens (14) de collecte de la fluorescence comprennent deux objectifs photographiques (52, 54) montés tête-bêche sur un module (M3) mobile le long de l'axe optique.

19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'un des objectifs (52) est placé au dessus de la surface de l'objet (10) portant les éléments chromophores, et le module mobile (M3) comporte une caméra (56) de détection et un filtre d'arrêt de la lumière d'excitation.

20. Dispositif selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que l'objet portant les éléments chromophores est une biopuce logée dans une chambre d'hybridation d'une cartouche mise en place sur un support fixe (50) équipé de moyens de connexion de la chambre d'hybridation de la cartouche à un circuit fluidique.

21. Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que la cartouche comprend des moyens de renforcement optique d'excitation 25 et/ou de fluorescence.

22. Dispositif selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que le support fixe comprend des moyens d'agitation favorisant le mélange du contenu de la chambre d'hybridation.

23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que les 30 moyens d'agitation comprennent un générateur d'ultrasons.

24. Dispositif selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que le support fixe porte des moyens (60) de guidage du module (113) portant les objectifs le long d'un axe vertical et des moyens de support des moyens d'éclairage (12), dont le barreau (18) formant guide de lumière est orienté en oblique par rapport à l'axe des objectifs (52, 54) des moyens de collecte.

25. Dispositif selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisé en ce que le support fixe comprend des moyens de contrôle et de régulation de la température dans la chambre d'hybridation de la cartouche.10