FR2839310A1 - Nouveau procede de preparation d' alpha-glycosylceramides, nouveaux derives alpha-glycosylceramide et leurs applications - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne de nouveaux dérivés α -glycosylcéramide répondant à la formule générale (S-I), un procédé pour leur préparation ainsi que les compositions pharmaceutiques les comprenant et leurs utilisations.
Description
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L'invention se rapporte à de nouveaux composés a-glycosylcéramide et en particulier à de nouveaux composés a-galactosylcéramide, à un nouveau procédé de préparation de dérivés a-glycosylcéramide, à des compositions pharmaceutiques et à des réactifs biologiques les comprenant, ainsi qu'à l'utilisation de ces dérivés comme régulateurs de l'activité des cellules NKT ("Natural Killer T cells").
Il a été démontré que les cellules NKT sont des effecteurs importants dans les mécanismes de contrôle des métastases des tumeurs hépatiques et pulmonaires chez la souris (Hashimoto, W. et al., J Immunol., 154, 4333 (1995)) ; Anzai R. et al., Immunol., 88,82 (1996)). Ces données suggèrent que les cellules NKT sont susceptibles de jouer un rôle important dans l'éradication des cancers. Outre cette activité, on pense aussi qu'elles sont susceptibles de jouer un rôle dans l'éradication des parasites, des protozoaires et des infections bactériennes intracellulaires telles que Listeria monocytogenes et Mycobacterium tuberculosis (Seki S. et al., Clin. Immunol., 28,1069(1996)).
On sait également que les cellules NKT sont étroitement associées au rejet dans les transplantations de moelle osseuse (Yankelevich, B. et al., J Immunol., 142, 3423 (1989)) et au contrôle de la production des anticorps IgE par le contrôle de la différenciation des cellules T en Thl et Th2 (Yoshimoto, T. et al., J.
Exp. Med., 179, 1285 (1994)).
Les cellules NKT Va 14+ constituent une sous catégorie des cellules NKT. Il a été démontré qu'elles étaient étroitement associées à l'apparition de maladies auto-immunes chez la souris (Mieza, M.A. et al. ;J. Immunol., 156, 4035 (1996) ; Makino, Y. et al., Clin. Immunol., 28,1487 (1996)). Chez l'homme, il a été montré que les cellules Va24JaQa, homologues des cellules NKTVal4+ de la souris, sont impliquées dans différentes maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, le lupus érythémateux (Sumida, T. et al., J Exp. Med., 182, 1163 (1995) ou le diabète auto-immun (SHARIF S. et al., Nature Medecine, 2001,7, 1057-1062). Ces données confirment le rôle de pivot joué par ces cellules dans l'homéostase du système immunitaire.
Des composés extraits d'éponges (famille des agélasphines) ont été isolés en 1993 par une équipe japonaise puis testés. Certains de ces dérivés ont été
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sélectionnés pour leurs activités antitumorales et immunorégulatrices (T. Natori, Y.
Koezuka; T. Higa, Tetrahedron Lett., 1993, 34, 5591 ; EP-0 609 437). Des analogues ont ensuite été synthétisés et testés par ces auteurs (M. Morita, K. Motoki, K.
Koezuka; T. Higa, Tetrahedron Lett., 1993, 34, 5591 ; EP-0 609 437). Des analogues ont ensuite été synthétisés et testés par ces auteurs (M. Morita, K. Motoki, K.
Akimoto, T. Natori, T. Sakai, E. Sawa, K. Yamaji, Y. Koezuka. E. Kobayashi, H.
Kukushima, J Med. Chem., 1995,38, 2176 ; H. IIjima, K. Kimura, T. Sakai, A.
Ichimura, T. Shimizu, H. Ueno, T. Natori, Y. Koezuka, Bioorg. Pied. Chem., 1998,6,
1905 ; US-5,849,716 ; US-5,780,441 ; EP-0 666 268 ; US-5,936,076 ; EP-0 694 558).
1905 ; US-5,849,716 ; US-5,780,441 ; EP-0 666 268 ; US-5,936,076 ; EP-0 694 558).
Des propriétés anti-tumorales, immunostimulantes ont été décrites pour ces composés.
Certains ont été testés pour leurs propriétés radio-protectrices, et pour le traitement des maladies dues à la destruction ou à l'affaiblissement des cellules de la moelle osseuse .et pour le traitement de la thrombocytopénie (EP-650-0 650 732 ; US-6,017,892 ; US-6,071,884).
Ces molécules de type a-galactosylcéramide interagissent avec un complexe majeur d'histocompatibilité de type CDld permettant le recrutement et la prolifération de lymphocytes NKT (Z.H. Zeng, A.R. Castano, B.W. Segelke, E.A.
Stura, P.A. Peterson, LA. Wilson, Science, 1997,277, 339). Ils sont remarquables par leur qualité d'outils biologiques potentiels permettant de décrypter et contrôler les réponses immunitaires.
Des dérivés de type a-galactosylcéramide ont été synthétisés et décrits, notamment dans, EP-0 988 860, et il a été démontré qu'ils stimulaient l'activité cytotoxique anti-cancéreuse des cellules NKT, qu'ils prévenaient l'apparition de l'encéphalomyélite auto-immune chez la souris et du diabète chez la souris Nod.
Certains dérivés de type a-galactosylcéramide ont un effet thérapeutique sur les maladies virales, notamment le SIDA, l'hépatite B, les infections à cytomégalovirus (voir notamment la demande de brevet EP-A-0 957 161).
Toutefois, les composés décrits dans l'art antérieur ont été obtenus par des voies de synthèse longues et difficiles. L'obtention de molécules optiquement actives comportant plusieurs carbones asymétriques et plusieurs fonctionnalités réactives sur la même molécule rend la synthèse de ces composés compliquée et difficilement rationalisable.
Les auteurs de la présente invention se sont donnés pour objectif la conception et la mise au point d'une nouvelle voie de synthèse de dérivés
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a-glycosylcéramide, en particulier de dérivés a-galactosylcéramide, cette voie de synthèse permettant, à partir d'un même intermédiaire, d'aboutir à des molécules aux fonctionnalités variées, notamment des molécules susceptibles de servir de marqueur dans des tests d'activité biologique. Cet intermédiaire possède la structure de base caractéristique des a-glycosylcéramides, en particulier des a-galactosylcéramides et il est en outre doté d'un résidu amine sur lequel peuvent être greffés des fragments fonctionnels variés. La voie de synthèse proposée permet donc de préparer, par un seul procédé, un intermédiaire a-glycosylcéramide aminé, en particulier agalactosylcéramide aminé, et de le décliner ensuite en de multiples molécules à l'issue d'une ou de deux étapes de synthèse supplémentaire. Cette voie de synthèse présente donc l'avantage d'être extrêmement rationnelle, et donc plus facilement extrapolable à une grande échelle, économique. En outre, elle permet d'accéder à des molécules nouvelles, susceptibles d'être utilisées pour leurs propriétés immunorégulatrices, antiinfectieuses, anti-tumorales, anti-diabétiques. Cette voie de synthèse permet d'utiliser tout sucre dans la partie glycosidique de la molécule, tel que par exemple l'agalactose, l'a-glucose, l'a-mannose et leurs dérivés. De plus, cette voie de synthèse permet de réaliser des mono- ou des di-a-glycosylcéramides, les sucres utilisés pour un di-glycosylcéramide étant identiques ou différents.
La présente Invention a pour objet de nouveaux dérivés a-glycosylcéramide répondant à la formule générale (S-I) :
(S-I) dans laquelle :
(S-I) dans laquelle :
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- Su représente un résidu glycoside qui peut, par exemple, être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose et certains dérivés de glycoside ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un résidu glycoside qui peut, par exemple, être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose et leurs dérivés ; R peut être identique ou différent du radical Su ; - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ;
B peut également représenter une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C1-C30, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements-OH, -NH2, halogène,-COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; peut être un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; peut aussi représenter une chaîne peptidique ou pseudopeptidique comprenant par exemple de 2 à 20 acides aminés, de préférence de 2 à 10 acides aminés ; - K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection et l'évaluation quantitative du produit répondant à la formule (I) dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique.
B peut également représenter une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C1-C30, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements-OH, -NH2, halogène,-COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; peut être un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; peut aussi représenter une chaîne peptidique ou pseudopeptidique comprenant par exemple de 2 à 20 acides aminés, de préférence de 2 à 10 acides aminés ; - K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection et l'évaluation quantitative du produit répondant à la formule (I) dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique.
Parmi les dérivés de glycoside représentés par le symbole Su, on désigne en particulier les glycosides, tels que par exemple le galactose, le glucose, le mannose, dont les fonctions hydroxyles sont protégées, notamment par des groupements protecteurs des sucres traditionnellement employées tels que les résidus
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acétyle, benzyle etc...On désigne également les composés di-glycoside et polyglycoside, protégés ou non sur leurs fonctions hydroxyle. Préférentiellement, les glycoside et dérivés de glycoside employés dans la présente invention sont des molécules de configuration a.
Dans une mise en #uvre préférée, la présente Invention a pour objet de nouveaux dérivés a-galactosylcéramide répondant à la formule générale (I) :
(I) dans laquelle : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosaccharide qui peut par exemple être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose, le fucose, la glucosamine et la galactosamine ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :
(I) dans laquelle : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosaccharide qui peut par exemple être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose, le fucose, la glucosamine et la galactosamine ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :
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dans laquelle Y1, Y2, Y3, Y4 ont les mêmes définitions que celles indiquées ci- dessus dans la formule (I) ; - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ;
B peut également représenter une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C1-C30, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements-OH, -NHz, halogène, -COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; peut être un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; peut aussi représenter une chaîne peptidique ou pseudopeptidique comprenant, par exemple, de 2 à 20 acides aminés, de préférence de 2 à 10 acides aminés ;
K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection et l'évaluation quantitative du produit répondant à la formule (I) dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique.
Parmi les groupements pharmacophores utilisables au sens de la présente invention, on peut notamment citer : le composé fluorescent connu sous le nom commercial de BODIPY# (Boron Dipyrromethene difluoride ou dipyrrométhène difluorure de bore, vendu par la société Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), le nitrobenzoxadiazole (NBD, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs ainsi que les groupements dansyle.
Par halogène, on entend au sens de la présente invention un atome choisi de préférence parmi le fluor, le chlore, le brome, J'iode.
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Par aryle, on entend au sens de la présente invention un dérivé hydrogénocarboné cyclique insaturé, tel qu'un radical phényle par exemple, ce dérivé étant éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyle, alcényle, alcynyle en C,-C6, halogénoalkyle en C1-C6, halogène, -OH. -NH2,-COOH ou-CONH2.
Parmi les groupements hétéroaryles utilisables au sens de la présente invention, on peut citer par exemple les groupements pyridine, pyrimidine, imidazole, indole, thiazole, thiophène, oxazole, carboline et quinoline.
Parmi les hétérocycles comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S, utilisables dans la présente invention, on peut citer par exemple les groupements pipérazine, morpholine, oxazolidine, thiazolidine et quinolizidine.
Selon une première variante de l'invention, la molécule répondant à la formule (S-I) ou à la formule (I) se caractérise en ce que : x=y=0 et B=H.
La molécule ainsi obtenue, et dans laquelle les autres paramètres ont la même définition que ci-dessus peut être représentée par la formule (S-Ia) ou respectivement par la formule (la) ci-dessous :
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(la)
Conformément à l'invention, les molécules répondant à la formule (S-I) ou plus particulièrement (I) dans laquelle x=l ou y=1, et BH sont obtenues par un procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir le composé (S-Ia), respectivement (la), avec un composé répondant à la formule (Ib) ci-dessous :
(Ib) suivant le schéma S-E, respectivement E, ci-dessous :
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Schéma E
Dans la formule (Ib), x, y, B et K ont la même définition que cidessus et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction amine libre de (S-Ia), respectivement (la).
Dans la formule (Ib), x, y, B et K ont la même définition que cidessus et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction amine libre de (S-Ia), respectivement (la).
De telles réactions sont bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où x=l, on peut notamment se reporter à J. March, Advanced Organic Chemistry, Third Edition, 1985, 370-377. L'acylation de la fonction amine de (la) peut de façon connue être faite par réaction avec un acide activé sous forme de chlorure d'acide, d'amide, d'ester activé ou d'anhydride. Des exemples de réalisation seront donnés ultérieurement dans la description. Dans le cas où x=0, on peut se reporter à J. March, pré-cité, pages 798-800 (alkylation réductrice d'amines).
De préférence, dans la formule (S-I), respectivement (I), et dans les formules (S-Ia) et (la) ci-dessus l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène - X représente un radical alcane di-yle en C6-CI5, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle en C4-CI5, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente-CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle :
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B représente un groupement choisi parmi : l'atome d'hydrogène, et alors x=y=0, ou
B représente un groupement alkyle ou alcényle en Ci -Ci 2, linéaire ou ramifié,
K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué choisi parmi : le BODIPY, le NBD, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs ainsi que les groupements dansyle.
B représente un groupement alkyle ou alcényle en Ci -Ci 2, linéaire ou ramifié,
K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué choisi parmi : le BODIPY, le NBD, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs ainsi que les groupements dansyle.
De manière particulièrement préférée dans la formule (S-I), respectivement (I), ou la formule (S-Ia), respectivement (la) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène - X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle en C4-CI5, linéaire ou ramifié ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH-; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle :
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B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle en CI-CI2, linéaire ou ramifié ; lorsque B H, K représente un groupement BODIPY.
Encore plus préférentiellement, au sens de la présente invention, les produits de formule (S-I), respectivement (I), ou (S-Ia) ou (la), se caractérisent en ce que l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène, - X représente un radical alcane diyle linéaire en C6-C15 ; - x est égal à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente un groupement alkyle linéaire en C10-C15 ; - Z représente -CH2-CH2- ; - R représente un atome d'hydrogène ; - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0, un groupement alkyle linéaire en C1-C6 ; - lorsque B # H, K représente un groupement BODIPY.
Dans le cas où K représente un groupement BODIPY, celui-ci est couplé à (S-Ia) ou à (la) en faisant réagir un ester activé de BODIPY avec (S-Ia) ou (la), notamment l'ester de N-hydroxysuccinimide.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des molécules répondant à la formule (S-I), respectivement (I).
Le procédé selon l'invention se décompose en plusieurs étapes distinctes, l'une de ces étapes consistant à préparer un produit selon la formule (la), ce procédé comportant au moins une étape (étape de couplage dans le schéma S-D ou D) au cours de laquelle on fait réagir un glycoside (S-III), respectivement un [alpha]- galactoside (III), avec un céramide (IV) puis une étape de déprotection des groupements fonctionnels :
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Schéma S-D
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Schéma D
Dans la formule (III) : - Y'1, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement protecteur des hydroxyle ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés de façon à ce que les hydroxyle du galactoside (III) n'interviennent pas dans la réaction de couplage avec le céramide (IV). De façon connue, Y'1, Y'2, Y'3, Y'4 peuvent être choisis parmi les groupements benzyle, acétyle ou les monosaccharides benzylés, acétylés ....La même stratégie peut être envisagée pour le résidu glycosyle désigné Su dans la formule (S-III).
Dans la formule (III) : - Y'1, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement protecteur des hydroxyle ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés de façon à ce que les hydroxyle du galactoside (III) n'interviennent pas dans la réaction de couplage avec le céramide (IV). De façon connue, Y'1, Y'2, Y'3, Y'4 peuvent être choisis parmi les groupements benzyle, acétyle ou les monosaccharides benzylés, acétylés ....La même stratégie peut être envisagée pour le résidu glycosyle désigné Su dans la formule (S-III).
Dans la formule (IV) : - Y'5 représente un groupement protecteur des amines de façon à ce que l'amine du céramide (IV) n'intervienne pas dans la réaction de couplage avec le glycoside (S-III), respectivement le galactoside (III). De façon connue, Y'5 peut être choisi parmi les groupements benzyloxycarbonyle, terbutyloxycarbonyle.....; - Z représente le groupement-CH=CH- ou -CH2-CH2- ;
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- X et A ont la même définition que dans la formule (S-I), respectivement (I). Lorsque X ou A comportent un groupe fonctionnel susceptible de réagir au cours de la réaction de couplage du galactoside avec le céramide, celui-ci est protégé par un groupe protecteur approprié.
De préférence les groupes protecteurs du galactoside, Y',, Y'2, Y'3, Y'4, et du céramide, Y'5, sont choisis de façon à pouvoir être ôtés simultanément en une seule étape. Lorsque la molécule (IV) ne comporte pas d'insaturations, on choisit de préférence des groupes protecteurs susceptibles d'être ôtés par hydrogénation en présence d'un catalyseur approprié, comme les groupements benzyle et benzyloxycarbonyle. Lorsque la molécule (IV) comporte une ou plusieurs insaturations que l'on désire conserver dans le composé final (S-I) ou (I), on choisit des groupes protecteurs qui peuvent être ôtés sans porter atteinte à l'intégrité de la molécule, tels que par exemple : le groupement acétyle.
Dans les formules (S-V) et (V) : - Z représente le groupement-CH=CH- ou -CH2=CH2-; - X, R et A ont la même définition que dans les formules (S-I) et (I) ci-dessus ; - Y'1, Y'2, Y'3, Y'4, représentent, comme dans la formule (III), un groupement protecteur des hydroxyles ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés ; - Y'5 représente, comme dans la formule (IV) ci-dessus un groupement protecteur des amines.
Lorsque R=H, on réalise le couplage du galactoside (III) (ou du glycoside (S-III)) et du céramide (IV) avec un mélange en quantités équimolaires du galactoside (III) (ou du glycoside (S-III)) et du céramide (IV). Lorsque R représente un radical a-galactosyle, la réaction est faite en introduisant une quantité molaire au moins double de galactoside (III) par rapport au céramide (IV).
De façon avantageuse, le couplage du glycoside (S-III) ou du galactoside (III) avec le céramide (IV) est fait dans des conditions décrites par Mukayama et al., Chem. Lett., 1981, 431-432, en présence de AgClO4 et SnCl2. De façon préférentielle, la réaction se fait dans un mélange de tétrahydrofurane (THF) et
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d'éther diéthylique. On constate par analyse RMN que la configuration du cycle glycosidique est conforme à ce qui était attendu.
Dans les formules (S-Ia) et (la) : les groupements Su, Y1, Y2, Y3, Y4, X, R, Z et A ont la même définition que dans les formules (S-I), respectivement (I).
Les composés répondant à la formule (III) sont connus dans l'art antérieur, leur mode de préparation a été décrit, notamment par K. L. Nicolaou, R. E.
Dolle, P. P. Papahatjis, (J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 4189 et références citées).
Dans le cas où Y'1, Y'2, Y'3 et Y'4représentent un groupement benzyle, le schéma de synthèse est le suivant (schéma C) :
Schéma C
Dans ce schéma, les abréviations DAST et NBS signifient respectivement DiethylAminoSulfurTrifluoride et N-BromoSuccinimide (Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, Ed : Paquette,1995, JohnWiley & sons, Ltd, p.1787 et 768). Dans le cas où l'on souhaite obtenir le composé ocgalactoside 6-fluoré peracétylé, on procède de la même façon que ci-dessus en supprimant les étapes de désacétylation et de benzylation.
Dans ce schéma, les abréviations DAST et NBS signifient respectivement DiethylAminoSulfurTrifluoride et N-BromoSuccinimide (Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, Ed : Paquette,1995, JohnWiley & sons, Ltd, p.1787 et 768). Dans le cas où l'on souhaite obtenir le composé ocgalactoside 6-fluoré peracétylé, on procède de la même façon que ci-dessus en supprimant les étapes de désacétylation et de benzylation.
Dans le cas des produits de formule (S-I), l'homme du métier saura adapter la préparation du dérivé fluoré au cycle glycosidique concerné.
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Dans les cas où l'un ou plusieurs des substituants Y'1, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement monosaccharide benzylé ou acétylé, on procède de la même façon.
Les produits répondant à la formule (IV) ont été préparés par un procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé activé (VI) avec un analogue ou un dérivé de la D-érythro-sphingosine (VII) ou avec la D-érythro-sphingosine ellemême suivant le schéma B ci-dessous :
Schéma B
Dans la molécule (VI), le groupement X a la même signification que dans la formule (I). Y'5 a la même signification que dans la formule (IV) et représente un groupement protecteur des amines de façon à ce que l'amine de (VI) ne réagisse pas dans la réaction avec le composé (VII) et que l'amine du céramide (IV) n'intervienne pas dans la réaction de couplage avec le galactoside (III). Y'5 peut être choisie parmi les groupements benzyloxycarbonyle, terbutyloxycarbonyle.....
Dans la molécule (VI), le groupement X a la même signification que dans la formule (I). Y'5 a la même signification que dans la formule (IV) et représente un groupement protecteur des amines de façon à ce que l'amine de (VI) ne réagisse pas dans la réaction avec le composé (VII) et que l'amine du céramide (IV) n'intervienne pas dans la réaction de couplage avec le galactoside (III). Y'5 peut être choisie parmi les groupements benzyloxycarbonyle, terbutyloxycarbonyle.....
Le dérivé activé (VI) peut être un chlorure d'acide, un ester ou un amide. Préférentiellement, c'est un ester activé, tel que par exemple un ester de paranitrophényl. W représente tout groupe activateur tel que décrit par exemple dans Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Green, P.G.M., Wuts, 3ème Ed., 1999, JohnWiley & sons, Ltd. De préférence, W est choisi parmi les groupements nitrophényle et les esters activés de succinimidyle. Des composés répondant à la formule (VI) peuvent être aisément préparés par des méthodes bien connues de l'homme du métier, ce sont des composés comprenant une fonction amine protégée et une fonction acide activée, ainsi qu'éventuellement une ou plusieurs autres fonctions
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qui ne doivent pas intervenir dans la réaction de couplage avec (VII). Pour la préparation de telles molécules, on pourra se référer aux ouvrages concernant la chimie des acides aminés, notamment aux chapitres concernant la protection, la déprotection et l'activation des groupes fonctionnels. La préparation de composés répondant à la formule (VI) est illustrée plus loin dans la description.
Dans la molécule (VII), A a la même définition que dans la formule (I), Z représente le groupement-CH=CH-.
Le composé répondant à la formule (IV) ci-dessous, dans laquelle Z et A ont la même définition que dans la formule (I) et Y'5 représente un groupement choisi parmi l'atome d'hydrogène et les groupements protecteurs des amines, constitue un autre objet de l'invention :
Selon l'invention : - A représente : un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
X représente un radical alcane di-yle, en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle, un groupement ter butyloxycarbonyle.
Selon l'invention : - A représente : un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
X représente un radical alcane di-yle, en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle, un groupement ter butyloxycarbonyle.
De préférence : - A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; - X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle.
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Encore plus préférentiellement :
A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ; - X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle.
A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ; - X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle.
Avantageusement : - A représente : un groupement alkyle linéaire en C10-C15 ;
X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-C15 ; - Z représente -CH=CH- ;
Y'5 représente un groupement benzyloxycarbonyle.
X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-C15 ; - Z représente -CH=CH- ;
Y'5 représente un groupement benzyloxycarbonyle.
Le composé (Vlla) (composé (VII) avec Z =-CH=CH-) est obtenu par une voie de synthèse qui est décrite dans le schéma A ci-dessous :
Schéma A
Dans ce schéma A, R' représente un radical éthyle et R" représente un radical éthyle ou isopropyle.
Dans ce schéma A, R' représente un radical éthyle et R" représente un radical éthyle ou isopropyle.
L'iminoester (VIII) dérivant de la (+) -hydroxypinanone est condensé avec l'aldéhyde (IX) via une réaction d'aldolisation pour donner le composé (X). En fonction du réactif employé pour la réaction d'aldolisation (Solladié-Cavallo et al., J. Org. Chem., 1994,59, 3240-3242), on peut obtenir un mélange d'esters, ce qui est
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sans importance pour la suite puisque la fonction acide est déprotégée deux étapes plus loin.
De façon préférentielle, on a utilisé le réactif ClTi(OiPr)3 associé à de la triéthylamine, système qui donne de meilleurs rendements que le CITi(OEt)3 et donne le mélange d'esters éthylique et propylique (X) dans un ratio 7/3.
L'imine (X) est ensuite hydrolysée en amine (XI) et la fonction ester de (XI) est réduite en alcool (VII). La réaction d'hydrolyse est faite de façon connue en milieu acide, de préférence en milieu acide dilué.
La réaction de réduction de l'ester (XI) en alcool (VII) se fait en présence d'un hydrure mixte, de préférence de lithium et de bore.
Le composé répondant à la formule (VIII) est préparé suivant un procédé résumé dans le schéma de synthèse F ci-dessous et dans lequel R' a la même signification que celle indiquée ci-dessus dans le schéma A :
H3C H3C COOL' ?3''<C NH2CH2C02R' Hs ' H 3 C / COOR' CH3 BF3Et2O CH3 HsCr"'. HC H3c EH H3c H oh H 16 14 (VIII) Schéma F
La (+) -hydroxypinanone est un produit commercial, de même que l'amino-2 acétate d'éthyle. La réaction est effectuée en présence de BF3Et20 dans un solvant aromatique, tel que le benzène ou le toluène par exemple, de préférence au reflux du solvant.
H3C H3C COOL' ?3''<C NH2CH2C02R' Hs ' H 3 C / COOR' CH3 BF3Et2O CH3 HsCr"'. HC H3c EH H3c H oh H 16 14 (VIII) Schéma F
La (+) -hydroxypinanone est un produit commercial, de même que l'amino-2 acétate d'éthyle. La réaction est effectuée en présence de BF3Et20 dans un solvant aromatique, tel que le benzène ou le toluène par exemple, de préférence au reflux du solvant.
Le composé de formule (IX) peut être aisément préparé par des moyens bien connus de l'homme du métier, notamment en suivant le schéma de synthèse G décrit ci-dessous :
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Schéma G
Le composé (XII) est traité par du triéthylphosphonoacétate d'éthyle en présence d'un hydrure mixte, de préférence un hydrure de lithium et de bore, dans un solvant anhydre, pour donner l'ester (XIII). La conversion en oléfine de configuration trans est quasi totale.
Le composé (XII) est traité par du triéthylphosphonoacétate d'éthyle en présence d'un hydrure mixte, de préférence un hydrure de lithium et de bore, dans un solvant anhydre, pour donner l'ester (XIII). La conversion en oléfine de configuration trans est quasi totale.
Le composé (XIII) est ensuite soumis à un double traitement : a) une réduction en alcool par traitement au DIBAH (di-isobutyl aluminium hydride), puis b) oxydation en aldéhyde par le chlorochromate de pyridinium.
L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé répondant à la formule (S-I) ou (I) décrite ci-dessus. Une molécule de formule (S-I) ou (I) selon l'invention, qui est dotée d'une activité de régulation de l'activité des lymphocytes NKT (orientation TH1 ou TH2, cytotoxicité, libération de cytokines), peut être utilisée pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie qui peut être choisie parmi les maladies auto-immunes, le cancer et en particulier les métastases de mélanomes localisées dans les poumons ou le foie, les maladies infectieuses, notamment les infections par des parasites, des protozoaires, des virus et les infections bactériennes intracellulaires, le diabète, notamment le diabète de type 1, les maladies inflammatoires chroniques et aiguës.
Parmi les maladies auto-immunes on peut citer en particulier l'uvéite, l'arthrite, l'athérosclérose, le lupus érythémateux, la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques et le diabète auto-immun. Ces composés peuvent en outre être utilisés comme agent radioprotecteur, pour prévenir ou traiter les effets pathologiques d'irradiations, telles que les irradiations par les rayons a, ss, y les irradiations ultraviolettes ou les irradiations par rayons X, les irradiations par des protons, des neutrons ou des
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faisceaux d'électrons qui sont couramment utilisés dans le traitement des cancers. Ces composés peuvent être également utilisés pour prévenir ou traiter les dégradations de la moelle osseuse, comme accélérateur de la prolifération des cellules médullaires.
Parmi les maladies infectieuses susceptibles d'être traitées par le produit selon l'invention, on peut citer notamment le SIDA, l'hépatite B et les infections à cytomégalovirus.
Parmi les maladies infectieuses susceptibles d'être traitées par le produit selon l'invention, on peut citer notamment le SIDA, l'hépatite B et les infections à cytomégalovirus.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également comprendre d'autres agents actifs thérapeutiques.
Les composés selon l'invention sont généralement formulés sous forme d'une composition stérile, pharmaceutiquement acceptable. Cette composition pharmaceutique peut être sous n'importe quelle forme, pourvu qu'elle soit appropriée au mode d'administration choisi. Une telle composition peut par exemple être administrée par voie parentérale, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée ; elle peut être donnée oralement ou par voie nasale au moyen d'un spray, sous forme de gouttes ou de suppositoires etc.... Elle peut être formulée sous forme de solutions dans l'eau ou dans l'huile ou sous forme d'émulsions. Parmi les excipients utilisables, on peut citer : l'eau, l'alcool, les polyols, la glycérine, les huiles végétales, les agents conservateurs, les agents stabilisants, les agents solubilisants, les agents mouillants, les émulsionnants, les colorants, les sels, les tampons, les agents antioxydants.
Le dosage du composé (S-I) ou (I) selon l'invention varie en fonction de différents facteurs tels que la maladie à traiter, la voie d'administration, l'age et le poids de l'individu à traiter.
L'invention a en outre pour objet un réactif pour l'évaluation in vitro de l'activité des lymphocytes NKT, caractérisé en ce qu'il renferme au moins un composé de formule (S-I) ou (I) telle que décrite précédemment.
L'Invention a également pour objet l'utilisation d'un tel réactif pour la réalisation, in vitro, d'un test d'évaluation de l'activité des lymphocytes NKT, ainsi que le kit mis en #uvre au cours de cette utilisation et comportant au moins un composé de formule (S-I) ou (I) telle que définie précédemment.
Ledit test d'évaluation comprend généralement les étapes suivantes :
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- la préparation de suspensions cellulaires hépatiques ou spléniques à partir d'un mammifère, tel que par exemple des souris, - l'introduction d'un composé de formule (S-I) ou (I) telles que décrites précédemment dans cet échantillon de cellules, - l'évaluation de l'activité des composés de formule (S-I) ou (I) par mesure de l'apoptose des lymphocytes NKT hépatiques ou spléniques.
L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit de formule (S-I) ou (I) pour effectuer le tri de produits actifs dans la modulation de l'activité lymphocytaire.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture du complément de description qui suit et qui se réfère à des exemples de préparation de quinoléines substituées entrant dans le cadre de l'invention et de démonstration de leur activité biologique, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : - la Figure 1 représente la structure du produit KRN 7000 1, - la Figure 2 représente le nombre de cellules NKT mesuré après injection de 1,5 ou 10 g d'a-galactosylcéramide fluorescente 4 ou de NKR 7000 1, - la Figure 3 représente la distribution cellulaire et sub-cellulaire du composé a-galactosylcéramide fluorescent 4 dans les macrophages du péritoine chez la souris, - la Figure 4 représente la cytométrie d'image de cellules de rate et de foie adhérentes fluorescentes après injection intraveineuse du composé agalactosylcéramide fluorescent 4 chez la souris, - la Figure 5 représente la localisation histologique de cellules fluorescentes sur des sections de foie de souris après injection intraveineuse du composé a-galactosylcéramide fluorescent 4 ou du composé KRN 7000 1 chez la souris.
Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'invention et n'en constituent nullement une limitation.
EXEMPLES
Les préparations détaillées ci-dessous reposent sur le principe du mode de synthèse convergent (Schéma 1). Par comparaison avec les travaux antérieurs
Les préparations détaillées ci-dessous reposent sur le principe du mode de synthèse convergent (Schéma 1). Par comparaison avec les travaux antérieurs
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de T. Sakai et al., (Org. Lett. 1999,1, 359) l'originalité du procédé décrit ci-dessous tient à l'approche synthétique convergente, aux formes de protection, d'activation et d'introduction du bras espaceur, aux variations apportées au mode de synthèse de la D-erythro-sphingosine 6 et aux optimisations avec modifications des protocoles expérimentaux dans l'ensemble du schéma synthétique.
Schéma 1
Dans le schéma 1 sont décrites les quatre grandes étapes A-D du procédé selon l'invention de préparation d'un composé particulier répondant à la formule (la). Le composé clé de ce projet, le glycolipide 3 peut ainsi être utilisé pour réaliser une extension moléculaire via la fonctionnalisation de l'amine primaire. La
Dans le schéma 1 sont décrites les quatre grandes étapes A-D du procédé selon l'invention de préparation d'un composé particulier répondant à la formule (la). Le composé clé de ce projet, le glycolipide 3 peut ainsi être utilisé pour réaliser une extension moléculaire via la fonctionnalisation de l'amine primaire. La
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transformation E est un exemple de dérivatisation destiné à fournir de nouvelles sondes biologiquement actives.
I - PRÉPARATION DE L'a-GALACTOSIDE CÉRAMIDE 3 ET DU GLYCOLIPIDE FLUORESCENT 4 :
1- Synthèse du glycolipide 4
La méthode de synthèse employée reprend certains modes de préparation déjà connus ((a) A. Solladié-Cavallo, J. L. Koessler, J. Org. Chem., 1994, 59, 3240; b) T. Sakai, 0. V. Naidenko, H. Iijima, M. Kronenberg, Y. Koezuka, J.
1- Synthèse du glycolipide 4
La méthode de synthèse employée reprend certains modes de préparation déjà connus ((a) A. Solladié-Cavallo, J. L. Koessler, J. Org. Chem., 1994, 59, 3240; b) T. Sakai, 0. V. Naidenko, H. Iijima, M. Kronenberg, Y. Koezuka, J.
Med. Chem., 1999,42, 1836). Ils ont été modifiés par souci de simplification ou d'amélioration du rendement.
1. 1- Séquence A : Préparation de la D-erythro-sphingosine 6
Elle s'effectue via une réaction d'aldolisation de l'iminoester 5 dérivant de la (+) -hydroxypinanone 13, avec le 2-(E)-hexadécénal 12 conformément à l'enseignement de A. Solladié-Cavallo, J. L. Koessler, (J. Org. Chem., 1994, 59, 3240) (Schémas 2 et 3). L'aldéhyde insaturé 12 est obtenu en 3 étapes à partir du tétradécanal 10 (Schéma 2). La formation de l'ester 11 est ici réalisée à température ambiante mais pourrait être réalisée à une température plus basse (on peut prévoir de faire cette réaction entre 0 C et 30 C, préférentiellement entre 10 C et 25 C). L'ajout du tétradécanal sur l'ylure dérivé du triéthylphosphonoacétate assure alors une conversion quasi instantanée et pratiquement totale en oléfine trans. Au cours de l'oxydation de l'alcool correspondant par le chlorochromate de pyridinium, l'addition de célite au milieu réactionnel permet d'améliorer significativement le rendement en facilitant le traitement. Le rendement global sur les 3 étapes est ainsi de 35%.
Elle s'effectue via une réaction d'aldolisation de l'iminoester 5 dérivant de la (+) -hydroxypinanone 13, avec le 2-(E)-hexadécénal 12 conformément à l'enseignement de A. Solladié-Cavallo, J. L. Koessler, (J. Org. Chem., 1994, 59, 3240) (Schémas 2 et 3). L'aldéhyde insaturé 12 est obtenu en 3 étapes à partir du tétradécanal 10 (Schéma 2). La formation de l'ester 11 est ici réalisée à température ambiante mais pourrait être réalisée à une température plus basse (on peut prévoir de faire cette réaction entre 0 C et 30 C, préférentiellement entre 10 C et 25 C). L'ajout du tétradécanal sur l'ylure dérivé du triéthylphosphonoacétate assure alors une conversion quasi instantanée et pratiquement totale en oléfine trans. Au cours de l'oxydation de l'alcool correspondant par le chlorochromate de pyridinium, l'addition de célite au milieu réactionnel permet d'améliorer significativement le rendement en facilitant le traitement. Le rendement global sur les 3 étapes est ainsi de 35%.
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Schéma 2 En ce qui concerne l'aldolisation de l'iminoester 5, la modification du protocole consiste à remplacer le chlorotriéthoxyde de titane par son équivalent isopropoxy, plus facile à préparer et à utiliser (Schéma 3).
Schéma 3
On obtient alors un mélange d'esters 14a,b, l'ester isopropylique 14a étant nettement majoritaire. La stéréochimie des 2 centres asymétriques créés est respectée et le mélange peut être traité de la même façon que l'ester éthylique 14b dans la suite du schéma réactionnel.
On obtient alors un mélange d'esters 14a,b, l'ester isopropylique 14a étant nettement majoritaire. La stéréochimie des 2 centres asymétriques créés est respectée et le mélange peut être traité de la même façon que l'ester éthylique 14b dans la suite du schéma réactionnel.
Une autre amélioration majeure, par rapport aux procédés de l'art antérieur, consiste à réduire le mélange d'aminoesters 15a,b résultant de l'hydrolyse des imines 14a,b par le borohydrure de lithium en suspension dans le THF (2M).
Comparativement à l'emploi du borohydrure de sodium, l'addition lente de l'hydrure est parfaitement contrôlée ce qui assure l'homogénéité du milieu réactionnel et la bonne reproductibilité des résultats.
Selon ce procédé, la D-érythro-sphingosine 6 est obtenue avec un rendement global de 28% par rapport à la (+)-2-hydroxy-3-pinanone commerciale 13 (Schéma 1).
1. 2- Séquence B : Préparation du céramide 7 à fonction carbamate
Le composé 7 est obtenu via la condensation de la sphingosine 6 avec un ester activé 18 (Schéma 4).
Le composé 7 est obtenu via la condensation de la sphingosine 6 avec un ester activé 18 (Schéma 4).
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Schéma 4
Selon un objectif synthétique proche, Sakai et al. (Org. Lett., 1999, 1, 359) a précédemment utilisé un dérivé trifluoroacétamide sous forme d'ester activé. Selon l'invention, la fonction amine du composé 18 est protégée sous forme de carbamate ; ce qui permet d'assurer en fin de synthèse et en une seule étape, toutes les 0- et N-déprotections, ainsi que la réduction de la double liaison. L'amidification de la sphingosine 6 et la purification du céramide résultant 7 sont effectuées dans des conditions classiques.
Selon un objectif synthétique proche, Sakai et al. (Org. Lett., 1999, 1, 359) a précédemment utilisé un dérivé trifluoroacétamide sous forme d'ester activé. Selon l'invention, la fonction amine du composé 18 est protégée sous forme de carbamate ; ce qui permet d'assurer en fin de synthèse et en une seule étape, toutes les 0- et N-déprotections, ainsi que la réduction de la double liaison. L'amidification de la sphingosine 6 et la purification du céramide résultant 7 sont effectuées dans des conditions classiques.
1. 3- Séquence C : Préparation du D-Galactose perbenzylé a-fluoré 9
La séquence réactionnelle décrite dans l'art antérieur par Nicolaou et al. (J. Am. Chem. Soc., 1984,106, 4189) a été modifiée ( Schéma 5).
La séquence réactionnelle décrite dans l'art antérieur par Nicolaou et al. (J. Am. Chem. Soc., 1984,106, 4189) a été modifiée ( Schéma 5).
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Schéma 5
L'ajout de résine amberlite acide au cours de la déprotection des acétates du dérivé 20 assure une conversion totale et permet un traitement basique successif direct pour l'O-benzylation de 21. Dans cette même réaction réalisée dans le diméthylformamide, l'addition d'une quantité substoechiométrique d'iodure de potassium améliore considérablement la réaction. Le rendement global de la transformation du D-galactose 8 en dérivé fluoré 9 conformément à ce procédé est de 14%.
L'ajout de résine amberlite acide au cours de la déprotection des acétates du dérivé 20 assure une conversion totale et permet un traitement basique successif direct pour l'O-benzylation de 21. Dans cette même réaction réalisée dans le diméthylformamide, l'addition d'une quantité substoechiométrique d'iodure de potassium améliore considérablement la réaction. Le rendement global de la transformation du D-galactose 8 en dérivé fluoré 9 conformément à ce procédé est de 14%.
1. 4- Séquence D : de l'a-galactocéramide 3
Pour la première étape de l'O-glycosylation, il est indispensable d'introduire dans le milieu réactionnel des microtamis pulvérulents préactivés. Un changement de solvant a du être opéré par rapport aux conditions déjà décrites sur ce type de couplage (T. Sakai, 0. V. Naidenko, H. Iijima, M. Kronenberg, Y. Koezuka, J. Med. Chem., 1999,42, 1836), (Schéma 6). Une étape de purification est nécessaire à ce stade (chromatographie sur silice).
Pour la première étape de l'O-glycosylation, il est indispensable d'introduire dans le milieu réactionnel des microtamis pulvérulents préactivés. Un changement de solvant a du être opéré par rapport aux conditions déjà décrites sur ce type de couplage (T. Sakai, 0. V. Naidenko, H. Iijima, M. Kronenberg, Y. Koezuka, J. Med. Chem., 1999,42, 1836), (Schéma 6). Une étape de purification est nécessaire à ce stade (chromatographie sur silice).
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Schéma 6
La deuxième réaction est conduite sous atmosphère d'hydrogène en présence d'un catalyseur palladié. Elle assure la conversion directe en glycolipide 3 cherché. Les problèmes de solubilité de ce dérivé nécessitent d'utiliser un gradient de mélange dichlorométhane / méthanol pour sa purification sur silice.
La deuxième réaction est conduite sous atmosphère d'hydrogène en présence d'un catalyseur palladié. Elle assure la conversion directe en glycolipide 3 cherché. Les problèmes de solubilité de ce dérivé nécessitent d'utiliser un gradient de mélange dichlorométhane / méthanol pour sa purification sur silice.
1. 5- Séquence E : du glycolipide fluorescent 4
Cette étape finale nécessite une simple agitation des deux composants 3 et 24 dans la diméthylformamide.
Cette étape finale nécessite une simple agitation des deux composants 3 et 24 dans la diméthylformamide.
Schéma 7
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Le produit final cherché 4 est directement purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC), (Colonne C18, gradient de solvant : (méthanol/eau).
2- Évaluation biologique de la sonde fluorescente 4
Testée dans des conditions expérimentales similaires à celles utilisées pour des a-galactosylcéramides, cette sonde montre une activité équivalente à celle du composé KRN 7000 décrite par Y. Osman, et al., Eur. J. Immunol., 2000,
30, 1919.
Testée dans des conditions expérimentales similaires à celles utilisées pour des a-galactosylcéramides, cette sonde montre une activité équivalente à celle du composé KRN 7000 décrite par Y. Osman, et al., Eur. J. Immunol., 2000,
30, 1919.
II- DONNÉES EXPÉRIMENTALES :
1- GENERALITES SUR LES METHODES DE SEPARATION ET
D'ANALYSE
Les solvants sont purifiés et séchés par distillation en présence de LiAIH4 pour le tétrahydrofurane (THF), de sodium et de benzophénone pour l'éther diéthylique (Et20), en présence de pentachlorure de phosphore pour le dichlorométhane (CH2CI2), en présence d'hydrure de calcium pour le méthanol, l'acétonitrile et le toluène.
1- GENERALITES SUR LES METHODES DE SEPARATION ET
D'ANALYSE
Les solvants sont purifiés et séchés par distillation en présence de LiAIH4 pour le tétrahydrofurane (THF), de sodium et de benzophénone pour l'éther diéthylique (Et20), en présence de pentachlorure de phosphore pour le dichlorométhane (CH2CI2), en présence d'hydrure de calcium pour le méthanol, l'acétonitrile et le toluène.
Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont réalisées sur plaques de silicagel de 0,2 mm d'épaisseur 60-F-254 (Merck, Art. 5554), puis observées sous la lumière U. V. et révélées par une solution de Dragendorff (en associant éventuellement un traitement acide pour les composés aminés) ou par une solution de permanganate de potassium.
Les séparations préparatives sont réalisées en suivant des techniques de chromatographie éclair, sous moyenne pression sur des colonnes de silice Kieselgel 60 (230-400 Mesh, Merck).
Les spectres infrarouges (IR) sont enregistrés sur un appareil Nicolet 205 à transformée de Fourier. Les échantillons sont déposés en film sur plaque de NaCl.
Les spectres de masse (SM) par ionisation chimique ont été obtenus à l'aide d'un spectromètre NERMAG R10-10, le gaz réactif étant l'ammoniac.
Les spectres RMN du 1H sont enregistrés sur un appareil BRUKER AC-300P (300,13 MHz). Les déplacements chimiques 8 sont exprimés par rapport au tétraméthylsilane (TMS).
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Les spectres RMN du 13C sont enregistrés sur le même appareil (75,43 MHz). Les déplacements chimiques 8 sont exprimés par rapport au chloroforme deutéré (77,14 ppm).
Les analyses et purifications par HPLC ont été réalisées sur des appareils Waters 2690 et 996 (séparation module et photodiode array detector).
2- MODES OPERATOIRES ET DONNEES SPECTRALES
L'ensemble des données spectrales correspondant à l'aldéhyde 12, à la D-erythrosphingosine 6, à l'alphafluorogalactose perbenzylé 9 et à leurs précurseurs sont similaires à celles décrites dans la littérature. Ne seront présentés ici que les composés entièrement originaux.
L'ensemble des données spectrales correspondant à l'aldéhyde 12, à la D-erythrosphingosine 6, à l'alphafluorogalactose perbenzylé 9 et à leurs précurseurs sont similaires à celles décrites dans la littérature. Ne seront présentés ici que les composés entièrement originaux.
2. 1- Préparation de l'aminoacide N-protégé 1
10 g (49,75 mmol) d'acide 11-amino-undécanoïque 16 et 4,25 g (25 mmol) de chloroformiate de benzyle sont ajoutés à 200 mL de dichlorométhane. Le mélange est laissé sous agitation à reflux du solvant pendant une nuit. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié sur colonne de silice (éluant : cyclohexane 50% - AcOEt 50%) pour conduire à 2.5g de carbamate 17 pur sous forme d'un solide blanc (rendement 15%).
10 g (49,75 mmol) d'acide 11-amino-undécanoïque 16 et 4,25 g (25 mmol) de chloroformiate de benzyle sont ajoutés à 200 mL de dichlorométhane. Le mélange est laissé sous agitation à reflux du solvant pendant une nuit. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié sur colonne de silice (éluant : cyclohexane 50% - AcOEt 50%) pour conduire à 2.5g de carbamate 17 pur sous forme d'un solide blanc (rendement 15%).
RMN 'H (8, CDC13) : 1,15-1,6 (m, 16H), 2,28 (t, J=7,5Hz, 2H, H-2), 3,12 (q, J=6,3Hz, 2H, H-11), 4,62 (s, 2H, OCH2Ph, 5,05 (s, 1H, NH), 7,20-7,45 (m, 5H, Ph).
RMN 13C (8, CDCl3) : 24,7 ; 26,7 ; 29,0 - 29,3 ; 29,8 ; 34,0 ; 41,2 ; 66,7 (CH2) ; 127,0 - 128,4 (CH) ; 136,5 (Cq) ; 156,5 (Cq) ; 178,1 (Cq).
2. 2- Préparation de l'ester activé 18
A une solution de 2,5g (7,46 mmol) de carbamate 17 dans 90 mL de dichlorométhane sont ajoutés 1g (7,46 mmol) de p-nitrophénol, 1,54 g (7,46 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide et 30 mg de diméthylaminopyridine. Le mélange est laissé sous agitation pendant 24 heures à température ambiante. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange cyclohexane/ acétate d'éthyle : 70/30) pour conduire à l'ester activé 18 pur sous forme de solide blanc (1,6 g, rendement 47 %).
A une solution de 2,5g (7,46 mmol) de carbamate 17 dans 90 mL de dichlorométhane sont ajoutés 1g (7,46 mmol) de p-nitrophénol, 1,54 g (7,46 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide et 30 mg de diméthylaminopyridine. Le mélange est laissé sous agitation pendant 24 heures à température ambiante. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange cyclohexane/ acétate d'éthyle : 70/30) pour conduire à l'ester activé 18 pur sous forme de solide blanc (1,6 g, rendement 47 %).
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RMN 'H (8, CDCb) : 1,15-1,60 (m, 16H), 2,55 (t, J=7,5 Hz, 2H, H- 2), 3,12 (q, J=6,3 Hz, 2H, H-11 ), 4,95 (s large, 1 H, NH), 5,10 (s, 2H, OCH2Ph), 7,20 (d, J=9,1Hz, 2H, arom.), 7,30 (m, 5H, arom. ), 8,20 (d, J=9,1 Hz, 2H, arom.).
RMN 13C (8, CDCl3) : 24,4 ; 26,6 ;28,9 - 29,3 ; 29,8 ; 34,2 ; 41,0 ; 66,4 (CH2) ; 122,3 ; 125,0, 127,9,128,4 (CH) ; 136,7 ; 145,1 ; 155,4 (Cq) ; 156,5 (Cq) ; 171,2 (Cq).
2. 3- Préparation du céramide 7
A une solution de 110 mg (0.37 mmol) de sphingosine 6 et 170 mg (0,37 mmol) d'ester activé 18 dans 15 mL de THF sont additionnés 5 mg de diméthylaminopyridine. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange dichlorométhane/méthanol 95 / 5) pour conduire au céramide 7 pur sous forme de cire blanche (160 mg, rendement 70%).
A une solution de 110 mg (0.37 mmol) de sphingosine 6 et 170 mg (0,37 mmol) d'ester activé 18 dans 15 mL de THF sont additionnés 5 mg de diméthylaminopyridine. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange dichlorométhane/méthanol 95 / 5) pour conduire au céramide 7 pur sous forme de cire blanche (160 mg, rendement 70%).
SM (IC) : 617
RMN 'H (8, CDC13): 0,90 (t, J=6 Hz, 3H, Me), 1,2 - 1,65 (m, 30H), 1,80 (m, 1H, OH), 2,07 (q, J=7 Hz, 2H, H-6), 2,25 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,10 (m, 1H, OH), 3,18 (q, J=6,5 Hz, 2H), 3,7 (m, 1 H), 3,95 (m, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,80 (m, 1H, NH), 5,11 (s, 2H), 5,52 (dd, J=15,3 ; 6,4 Hz, 1H), 5,75 (dt, J=15,3 ; 6,6 Hz, 1H), 6,35 (d, J=7 Hz, 1H, NH), 7,35(m, 5H, arom.).
RMN 'H (8, CDC13): 0,90 (t, J=6 Hz, 3H, Me), 1,2 - 1,65 (m, 30H), 1,80 (m, 1H, OH), 2,07 (q, J=7 Hz, 2H, H-6), 2,25 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,10 (m, 1H, OH), 3,18 (q, J=6,5 Hz, 2H), 3,7 (m, 1 H), 3,95 (m, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,80 (m, 1H, NH), 5,11 (s, 2H), 5,52 (dd, J=15,3 ; 6,4 Hz, 1H), 5,75 (dt, J=15,3 ; 6,6 Hz, 1H), 6,35 (d, J=7 Hz, 1H, NH), 7,35(m, 5H, arom.).
RMN 13C (#, CDCl3): 14,2 (CH3) ; 22,8 ; 25,7 ; 26,7 ; 29,2 ; 29,7 ; 30,0 ; 32,0 ; 32,4 ; 36,9 ; 41,2 (CH2) ; 54,7 (CH) ; 62,6 (CH) ; 66,7 (CH2) ; 74,6 (CH2) ; 127,2 (CH) ; 128,6-128,9 (CH arom.) ;134,2 (CH) ; 156,5 (Cq) ; 174,1 (Cq).
Analyse élémentaire pour C37H64N2O5 ;
<tb>
<tb> % <SEP> C <SEP> H <SEP> N
<tb> Calculée <SEP> 72,04 <SEP> 10,46 <SEP> 4,54
<tb> Trouvée <SEP> 71,91 <SEP> 10,67 <SEP> 4,38
<tb>
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<tb> Calculée <SEP> 72,04 <SEP> 10,46 <SEP> 4,54
<tb> Trouvée <SEP> 71,91 <SEP> 10,67 <SEP> 4,38
<tb>
2. 4- Préparation de l' a-galactosyl-céramide protégé 23
A 3 ml d'éther diéthylique fraîchement distillés et placés sous argon sont ajoutés 80 mg (0,15 mmol) du glycoside fluoré 9 puis 350 mg de microtamis 4Â préalablement activés. Sont ensuite introduits 60,5 mg (0,30 mmol) de perchlorate
A 3 ml d'éther diéthylique fraîchement distillés et placés sous argon sont ajoutés 80 mg (0,15 mmol) du glycoside fluoré 9 puis 350 mg de microtamis 4Â préalablement activés. Sont ensuite introduits 60,5 mg (0,30 mmol) de perchlorate
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d'argent, 55,4 mg (0,30 mmol) de chlorure d'étain puis 60 mg (0,097 mmol) de céramide 7 dans 3,5 mL d'un mélange Et20 / THF (3/0,5). Le mélange est laissé sous agitation pendant 4 heures à température ambiante puis dilué avec 10 ml d'acétone.
Après 15 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est filtré sur célite. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange cyclohexane/acétate d'éthyle 80/20) pour conduire au composé 23 pur sous forme de cire blanche (30 mg, rendement 27%).
RMN 1H (#, CDC13) : 0,87 (t, J=6,8 Hz, 3H, Me), 1,20 - 1,60 (m, 42H), 1,95 (m, 2H), 2,12 (td, J=7,4 ; 2,4 Hz, 2H), 3,17 (q, J=6,6 Hz, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,68 (dd, J=10,5 ; Hz, 1H), 3,75 - 3,88 (m, 3H), 3,95 (m, 2H), 4,03 (dd, J=9,9 ; 3;6 Hz, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,35 ; 4,45 (2d, J=11,7 Hz, 2H), 4,55 ; (2d, J=11,4 Hz, 2H), 4,20 ; 4,85 (2d, J=11,1 Hz, 2H), 4,73 (m, 3H), 5,10 (s, 2H), 5,42 (dd, J=15,4 ; 5,4 Hz, 1H), 5,66 (dt, J=16,4 ; 6,7 Hz, 1H), 6,38 (d, J=8,1 Hz, 1H, NH), 7,30 (m, 5H, arom.).
RMN 13C (#, CDCl3) : 14,2 (Me) ; 22,8 ; 25,7 ; 26,7 ; 29,2-29,9 ; 31,9 ; 32,4 ; 36,7 ;41,1 (CH2) ; 52,8 (CH) ; 66,7 (CH2) ; 68,7 (CH2) ; 69,1 (CH2) ; 69,8 (CH) ; 72,7 ; 73,4 ; 74,0 ; 74,5 (CH2) ; 74,2 ; 74,8 (CH) ; 75,9 ; 79,3 ; 99,1 (CH) ; 127,4-128,5 (CH arom.) ; (CH ène) ; 133,0 (CH ène) ; 136,7 ; 137,7 ; 138,1 ; 138,4 ; 138,5 (Cq) ; 156,4 (Cq) ; 173,2 (Cq).
2. 5- Préparation de l' a-galactosyl-céramide 3
Une solution de l'a-galactosylcéramide 23 (30 mg, 0,046 mmol) est préparée à partir d'un mélange de 4 ml de méthanol et de 2 ml de tétrahydrofurane.
Une solution de l'a-galactosylcéramide 23 (30 mg, 0,046 mmol) est préparée à partir d'un mélange de 4 ml de méthanol et de 2 ml de tétrahydrofurane.
Après addition de 30 mg de palladium sur charbon à 5 %, le mélange est agité 3 jours à température ambiante sous atmosphère d'hydrogène. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur célite et le résidu solide lavé avec du chloroforme. Après distillation des solvants, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur silice (mélange dichlorométhane/méthanol 98/2 puis mélange 95/5). Le composé 3 est ainsi obtenu pur sous forme d'une cire blanche (16 mg, rendement 85 %).
MS (IC) 647
RMN 'H (#, CD30D) : 0,8 (t, 3H, Me), 1,11-1,61 (m, 44H), 2,05 (m, 2H), 2,70 (m, 2H), 3,5-3,85(m, 10H), 4,8 (d, J=3 Hz, 1H), 7,2 (d, J=8 Hz, 1H, NH).
RMN 'H (#, CD30D) : 0,8 (t, 3H, Me), 1,11-1,61 (m, 44H), 2,05 (m, 2H), 2,70 (m, 2H), 3,5-3,85(m, 10H), 4,8 (d, J=3 Hz, 1H), 7,2 (d, J=8 Hz, 1H, NH).
<Desc/Clms Page number 33>
RMN 13C (8, CD30D) : 24,2 (CH3) ; 27,0 - 32,4 ; (CH2) ; 37,7 (CH2) ; 41,2 (CH) ; 48,3 (CH2) ; 55,8 (CH) ; 63,2 (CH2) ; 68,7 (CH2) ; 70,7-72,8 ; 101,6 (CH) ; 176,6 (Cq).
2.6- Préparation de l'a-galactosyl-céramide-BODIPYOO 4
7 mg (0,011mmol) d' a-galactosyl-céramide 3 sont dissous dans 0,5 ml de diméthylformamide (DMF). Après introduction de l'ester activé 24 (5 mg, 0,011mmol dissous dans 0,2 m de DMF), le mélange est agité pendant 36 heures sous atmosphère inerte. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié directement par chromatographie liquide haute performance, (colonne Novapak C18, méthanol puis gradient méthanol/eau, 80/20). On isole ainsi 2,5 mg d'un solide rouge (rendement 25 %) qui doit être conservé au froid (-20 C) et à l'abri de la lumière.
7 mg (0,011mmol) d' a-galactosyl-céramide 3 sont dissous dans 0,5 ml de diméthylformamide (DMF). Après introduction de l'ester activé 24 (5 mg, 0,011mmol dissous dans 0,2 m de DMF), le mélange est agité pendant 36 heures sous atmosphère inerte. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié directement par chromatographie liquide haute performance, (colonne Novapak C18, méthanol puis gradient méthanol/eau, 80/20). On isole ainsi 2,5 mg d'un solide rouge (rendement 25 %) qui doit être conservé au froid (-20 C) et à l'abri de la lumière.
MS (FAB) M+23 : 943
Masse exacte, Analyse Haute Résolution 943,6107 pour C49H83O9N4F2BNa
RMN 1H (8, CD30D) : 0,8 (t, J=6 Hz, 3H, Me), 1,20-1,60 (3m, 44H), 2,15 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,60 (m, 2H), 3,05-3,15 (m, 2H), 3,40- 3,90 ( 5m, 8H), 6,20 (s large, 1H), 6,30 (s large, 1H), 7,0 (s large, 1H), 7,40 (s large, 1 H).
Masse exacte, Analyse Haute Résolution 943,6107 pour C49H83O9N4F2BNa
RMN 1H (8, CD30D) : 0,8 (t, J=6 Hz, 3H, Me), 1,20-1,60 (3m, 44H), 2,15 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,60 (m, 2H), 3,05-3,15 (m, 2H), 3,40- 3,90 ( 5m, 8H), 6,20 (s large, 1H), 6,30 (s large, 1H), 7,0 (s large, 1H), 7,40 (s large, 1 H).
111- Mise en évidence de l'activité biologique du produit fluorescent [alpha]-galactosylc ramide 4
3. 1 Matériel et méthodes
Les souris C57BL/6 utilisées sont âgées de 6 à 8 semaines et sont fournies par IFFA-Credo (L'Arbresle, France).
3. 1 Matériel et méthodes
Les souris C57BL/6 utilisées sont âgées de 6 à 8 semaines et sont fournies par IFFA-Credo (L'Arbresle, France).
La sonde fluorescente a-galactosylcéramide 4 (1,5, 10 ou 50 g dans 150 ml d'une solution PBS 0,025% Tween 20) ou le véhicule seul (PBS 0,025% Tween 20) sont injectés par voie intrapéritonéale. Les souris sont sacrifiées 15 heures après l'injection.
Préparation des suspensions cellulaires :
<Desc/Clms Page number 34>
Elles sont préparées à partir du foie des souris injectées. Les cellules du foie sont resuspendues dans une solution isotonique de Percoll à 80 % (Pharmacia,
Uppsala, Suède) puis sont recouvertes avec une solution isotonique de Percoll à 40 %.
Uppsala, Suède) puis sont recouvertes avec une solution isotonique de Percoll à 40 %.
Une centrifugation pendant 20 minutes à 3000 tours/min permet de concentrer les cellules mononucléées à l'interface 40-80 %. Les cellules collectées sont enfin lavées une fois avec une solution de PBS.
Marquage et analyse en cytométrie de flux :
Les anticorps sont fournis par PharMingen (San Diego, CA, USA).
Les anticorps sont fournis par PharMingen (San Diego, CA, USA).
Les cellules sont pré-incubées pendant 10 minutes avec des anticorps anti-FCyIII/II (Fcblock, 2. 4G2), puis elles sont exposées pendant 15 minutes aux anticorps anti- TCRap-FITC (H57-597) et NK1.1-PE (PK136). Après un lavage les cellules sont resuspendues dans une solution de PBS et analysées par cytométrie de flux au moyen d'un appareil FACS Calibur@ BD Becton Dickinson 5San Jose, CA, USA).
Résultats :
La proportion relative de lymphocytes NK1.1+ et TCR[alpha][alpha]+ du foie est évaluée par analyse en cytométrie de flux : # souris témoin : 23,65 10,26 # souris traitée : 1,13 0,54
Aucune différence significative n'est trouvée entre les proportions relatives de ces lymphocytes (NKI.I+ et TCR[alpha]ss+) préparées à partir des souris traitées par 1,5 ou 10 g de la sonde fluorescente 4.
La proportion relative de lymphocytes NK1.1+ et TCR[alpha][alpha]+ du foie est évaluée par analyse en cytométrie de flux : # souris témoin : 23,65 10,26 # souris traitée : 1,13 0,54
Aucune différence significative n'est trouvée entre les proportions relatives de ces lymphocytes (NKI.I+ et TCR[alpha]ss+) préparées à partir des souris traitées par 1,5 ou 10 g de la sonde fluorescente 4.
Tout d'abord, l'activité biologique de la molécule a-galactosylcéramide~4 a été testée in vivo et comparée à celle du produit KRN 7000 1 dont la structure est représentée sur la Figure 1. En tant que réactif pour l'activation in vivo des cellules NKT, le témoin (KRN 7000 1) est habituellement injecté intrapéritonéalement sous forme d'une suspension dans 0,5% de Tween@ 20 (polysorbate) dans le PBS. Ce test est fondé sur la propriété qu'ont les a-galactosylcéramides à induire l'apoptose des cellules NKT de foie et de rate, restreintes par la molécule CDldl, dans les heures qui suivent l'injection intrapéritonéale.
3. 2 Influence du KRN 7000 1 et du a-galactosylcéramide BODIPY 4 sur le nombre des cellules NKT
<Desc/Clms Page number 35>
1,5 ou 10 g du dérivé a-galactosylcéramide fluorescent 4 a été injecté intrapéritonéalement, tandis que des concentrations identiques de KRN 7000 1 ont été injectées à titre de contrôle. Les monocytes du foie ont été isolés selon la méthode décrite ci-dessus et analysés à la recherche de cellules NK1.1+ TCR [alpha]ss int+ par analyse en cytométrie de flux.
Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 2 annexée sur laquelle le nombre de cellules NKT est exprimé en fonction de la concentration d'agalactosylcéramide fluorescent 4 ou de KRN 7000 1 injectée en g.
Ces résultats montrent qu'une quantité injectée aussi faible que 1 g de la molécule a-galactosylcéramide fluorescente 4 est capable d'induire la disparition de presque toutes les cellules NKT du foie, tout comme le témoin KRN 7000 1. Il est remarquable que les cellules restantes NK1.1+ TCR [alpha]ss int+ ne sont pas restreintes à la molécule CDldl et ne répondent donc pas à la définition originale des cellules NKT. La molécule a-galactosylcéramide fluorescente 4 conforme à l'Invention possède donc une activité comparable à celle de KRN 7000 1 dans le test d'apoptose in vivo et dans cette gamme de concentrations.
3. 3 Capture des cellules après injection intra-péritonéale
Dans un second temps, on a recherché les premières cellules ayant capturé le composé fluorescent après injection intra-péritonéale de 10 g du composé a-galactosylcéramide fluorescent 4. Les cellules du péritoine ont été récupérées par lavage de la cavité péritonéale et la recherche du composé marqué fluorescent a été effectuée.
Dans un second temps, on a recherché les premières cellules ayant capturé le composé fluorescent après injection intra-péritonéale de 10 g du composé a-galactosylcéramide fluorescent 4. Les cellules du péritoine ont été récupérées par lavage de la cavité péritonéale et la recherche du composé marqué fluorescent a été effectuée.
Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 3 annexée sur laquelle est représentée la distribution cellulaire et sub-cellulaire du composé agalactosylcéramide fluorescent 4 dans les macrophages du péritoine.
Ces résultats montrent qu'une heure après l'injection presque tous les macrophages ont fourni une réponse positive à la recherche de fluorescence ; le marquage étant soit constitué de taches discrètes le long de la membrane soit situé dans des vésicules dans le cytoplasme. Ces résultats montrent également que le marqueur se lie à un récepteur, et que le complexe migre ensuite vers la membrane où il est absorbé.
<Desc/Clms Page number 36>
Des monocytes ont été récupérés du foie et de la rate des souris auxquelles on avait administré le marqueur a-galactosylcéramide fluorescent 4 de façon intra-péritonéale. Les cellules adhérentes et non-adhérentes ont été récupérées séparément et analysées à la recherche d'un marquage. Aucune cellule marquée n'a pu être détectée dans aucun des deux organes. Ceci montre que la molécule a-galactosylcéramide fluorescente 4 a été majoritairement capturée par les macrophages du péritoine. On peut formuler deux hypothèses expliquant l'activité biologique observée sur le foie soit par le fait qu'une quantité indétectable de cette molécule échappe à la capture par le péritoine et migre jusqu'au foie et aux organes périphériques, soit par le fait que des macrophages ayant absorbé la molécule migrent jusqu'au 'foie où ils libèrent le composé a-galactosylcéramide fluorescent 4. Cette hypothèse est soutenue par l'observation qui a pu être faite que des macrophages du péritoine lavés et réinjectés par voie intraveineuse peuvent induire une activation dans ces organes.
3. 4 Etude de la capture cellulaire après injection par voie intraveineuse
Dans un troisième temps, on a recherché quelles étaient les cellules susceptibles de capturer le composé a-galactosylcéramide fluorescent 4 après injection intraveineuse de 50 ug de ce produit chez des souris. Les monocytes du foie et de la rate ont été isolés une heure après l'injection et les cellules adhérentes ont été séparées des cellules non-adhérentes. La fraction des cellules répondant positivement a été déterminée par cytométrie d'image. Les résultats sont exposés sur la Figure 4.
Dans un troisième temps, on a recherché quelles étaient les cellules susceptibles de capturer le composé a-galactosylcéramide fluorescent 4 après injection intraveineuse de 50 ug de ce produit chez des souris. Les monocytes du foie et de la rate ont été isolés une heure après l'injection et les cellules adhérentes ont été séparées des cellules non-adhérentes. La fraction des cellules répondant positivement a été déterminée par cytométrie d'image. Les résultats sont exposés sur la Figure 4.
Ces résultats montrent qu'environ 10 % des cellules adhérentes ont donné une réponse positive dans les deux organes avec une localisation sub-cellulaire similaire à celle observée dans les macrophages du péritoine. Les cellules nonadhérentes (NK, NKT et les lymphocytes) ont donné une réponse négative : elles n'avaient pas absorbé de quantité significative de la molécule marquée. La localisation du marqueur fluorescent dans le foie a été examinée à l'aide d'un microscope à fluorescence et de sections congelées contre-marquées à l'aide de bleu d'Evans, et également par microscopie confocale en utilisant un contre-marquage à la rhodaminephalloidine-PI. Les résultats de ces essais sont exposés sur la Figure 5.
<Desc/Clms Page number 37>
Ces résultats montrent qu'aucun marquage des hépatocytes n'a pu être noté, de même qu'aucun marquage des cellules endothéliales bordant les vaisseaux sanguins. Par leur apparence et leur localisation dans les sinusoïdes, les cellules marquées sont assimilées à des macrophages ou à des cellules adhérentes, pouvant être des cellules de Kupffer. Le marqueur fluorescent est stocké dans des vésicules, de la même façon que dans les macrophages du péritoine, certaines des particules étant situées près du noyau.
Par conséquent, on peut en déduire que le composé agalactosylcéramide fluorescent 4 conforme à l'Invention ne se comporte pas de la même façon en fonction du mode d'injection employé. Bien qu'une fraction des molécules injectées dans le péritoine atteignent le foie (directement ou indirectement par l'intermédiaire des macrophages), ce qui explique l'activité biologique observée, la plus grande partie du produit injecté dans le péritoine reste stockée dans les macrophages du péritoine.
Au contraire, le produit injecté par voie intraveineuse a été retrouvé massivement dans les cellules de type cellule de Kuppfer dans le foie et dans les APC ou "Antigen Presenting Cells" (cellules dendritiques et probablement macrophages) de la rate.
Finalement, toutes les cellules n'ayant pas été atteintes par le composé a-galactosylcéramide fluorescent 4, on peut conclure à l'existence d'une spécificité dans la capture des composés de type a-galactosylcéramides conduisant à leur intégration en quantités significatives dans les APC.
Claims (31)
- dans laquelle : - Su représente un résidu choisi parmi les glycosides et les dérivés de glycoside ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C,-C2o linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un résidu glycoside qui peut être identique ou différent du radical Su ; - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ; ou B représente un groupement choisi parmi : une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C1-C30, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements-OH, -NH2, halogène, -COOH,-CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou par un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; un groupement aryleREVENDICATIONS 1. Dérivé a-glycosylcéramide répondant à la formule générale (S-1)<Desc/Clms Page number 39>éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; unechaîne peptidique ou pseudopeptidique.- K représente un groupement pharmacophore.
- 2. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est un a- galactosylcéramide répondant à la formule générale (I) :(I) dans laquelle : - YI, Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosaccharide ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20 linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente-CH2-CH2- ou-CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :<Desc/Clms Page number 40>(II) dans laquelle Y[, Y2, Y3, Y4 ont les mêmes définitions que celles indiquées ci- dessus dans la formule (I), - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ; ou B représente un groupement choisi parmi : une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C1-C30, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements-OH, -NH2, halogène, -COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou par un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi 0, N, S ; chaîne peptidique ou pseudopeptidique.- K représente un groupement pharmacophore.
- 3. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que x=y=O et B=H et en ce qu'il répond à la formule (S-Ia) :<Desc/Clms Page number 41>Su représente un résidu choisi parmi les glycosides et les dérivés de glycoside ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20 linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un résidu glycoside qui peut être identique ou différent du radical Su.dans laquelle
- 4. Dérivé selon la revendication 2, caractérisé en ce que x=y=0 et B=H et en ce qu'il répond à la formule (la) :dans laquelle : Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosaccharide ;<Desc/Clms Page number 42>dans laquelle Y1, Y2, Y3, Y4 ont les mêmes significations que celles indiquées ci-dessus dans la formule (la).- X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20 linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente-CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :
- 5. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène ; - X représente un radical alcane di-yle, en C6-C15, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle :<Desc/Clms Page number 43>B représente un groupement alkyle ou alcényle en C1-C12, linéaire ou ramifié.- B représente un groupement choisi parmi : l'atome d'hydrogène, et alors x=y=0, ou
- 6. Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène ; - X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié; - x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH-; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical a-galactosyle ; - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié.
- 7. Dérivé selon la revendication 6, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène ; - X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-C15 ; - x est égal à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle linéaire en C10-C15; - Z représente -CH2-CH2- ; - R représente un atome d'hydrogène ;<Desc/Clms Page number 44>B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle linéaire en C1-C6.
- 8. Dérivé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) : - y=1 ; - K représente un groupement pharmacophore choisi parmi : le dipyrrométhène difluorure de bore, le nitrobenzoxadiazole, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs et les groupements dansyle.
- 9. Dérivé selon la revendication 8, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) : - y=1 ; - K représente un groupement dipyrrométhène difluorure de bore.
- 10. Procédé de préparation d'un dérivé répondant à la formule (S-I) selon la revendication 1 dans laquelle x=l ou y=l, et BH, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule (S-Ia) selon la revendication 3, dans laquelle les paramètres Su, X, Z et A ont la même signification que celle indiquée dans la formule (S-I), avec un composé répondant à la formule (Ib) ci-dessous :(Ib) dans laquelle x, y, B et K ont la même signification que celle indiquée dans la formule (S-I) et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction amine libre de (S-Ia), suivant le schéma S-E cidessous :<Desc/Clms Page number 45>Schéma E(Ib) dans laquelle x, y, B et K ont la même signification que celle indiquée dans la formule (I) et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction amine libre de (la), suivant le schéma E ci-dessous :
- 11. Procédé de préparation d'un dérivé répondant à la formule (I) selon la revendication 2 dans laquelle x=l ou y=l, et BH, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule (la) selon la revendication 2, dans laquelle les paramètres Y1, Y2, Y3, Y4, X, Z et A ont la même signification que celle indiquée dans la formule (I), avec un composé répondant à la formule (Ib) ci-dessous :Schéma S-E<Desc/Clms Page number 46>
- 12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (S-Ia), est préparé par un procédé comportant au moins une étape au cours de laquelle on fait réagir un a-glycoside répondant à la formule (S-III) dans laquelle Su a la même signification que dans la formule (S-I), avec un céramide répondant à la formule (IV) dans laquelle Y'5 représente un groupement protecteur des amines ; Z représente le groupement -CH=CH- ou-CH2CH2- ; X et A ont la même définition que dans la formule (S-I). cette étape de couplage étant suivie par une étape de déprotection des groupements fonctionnels selon le schéma S-D :
- 13. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (la), est préparé par un procédé comportant au moins une étape au cours de laquelle on fait réagir un a-galactoside répondant à la formule (III) dans laquelle Y'1, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement protecteur des hydroxyle ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés, avec un céramide répondant à la formule (IV) dans laquelle Y'5 représente unSchéma S-D<Desc/Clms Page number 47>groupement protecteur des amines ; Z représente le groupement-CH=CH- ou -CH2CH2- ; X et A ont la même définition que dans la formule (I), cette étape de couplage étant suivie par une étape de déprotection des groupements fonctionnels selon le schéma D :
- 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que Y'1, Y'2, Y'3, Y'4 et Y'5 sont choisis de façon à pouvoir être ôtés simultanément en une seule étape.Schéma D
- 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que Y'1, Y'2, Y'3, Y'4 et Y'5, sont choisis parmi les groupements benzyle et benzyloxycarbonyle.
- 16. Produit répondant à la formule (IV) :<Desc/Clms Page number 48>A représente : un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C20, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - X représente un radical alcane di-yle, en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ; - Y'5est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle, un groupement ter butyloxycarbonyle.dans laquelle :
- 17. Produit selon la revendication 16, caractérisé en ce que : - A représente : un groupement alkyle linéaire en C10-C15 ; - X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-C15 ; - Z représente-CH=CH-; - Y'5 représente un groupement benzyloxycarbonyle.
- 18. Procédé selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que le produit répondant à la formule (IV) est préparé par réaction d'un dérivé activé répondant à la formule (VI) dans laquelle W représente un groupe activateur avec un analogue ou un dérivé de la D-érythro-sphingosine répondant à la formule (VII) ou avec la D-érythro-sphingosine, suivant le schéma B ci-dessous :<Desc/Clms Page number 49>Schéma B dans lequel X, Y'5, Z et A ont la même définition que dans la formule (IV).
- 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (VIIa), est obtenu par réaction d'un iminoester répondant à la formule (VIII) dans laquelle le radical R' représente un radical éthyle et R" représente un radical éthyle ou isopropyle avec l'aldéhyde répondant à la formule (IX) via une réaction d'aldolisation pour donner le composé (X) puis que l'imine (X) est ensuite hydrolysée en amine (XI) et la fonction ester de (XI) est réduite en alcool (VII) suivant le schéma A ci-dessous :
- 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (VIII) est préparé par réaction de la (+)hydroxypinanone avec l'amino-2 acétate d'éthyle, en présence de BF3Et2O dans unSchéma A<Desc/Clms Page number 50>solvant aromatique, de préférence au reflux du solvant, conformément au schéma de synthèse F ci-dessous :Schéma F dans lequel R' représente un radical éthyle.
- 21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (IX) est préparé par réaction du composé (XII) par du triéthylphosphonoacétate d'éthyle en présence d'un hydrure mixte de lithium et de bore, dans un solvant anhydre, pour donner l'ester (XIII), qui est ensuite soumis à un double traitement : a) une réduction en alcool par traitement au DIBAH, puis b) oxydation en aldéhyde par le chlorochromate de pyridinium, suivant le schéma de synthèse G décrit ci-dessous :Schéma G
- 22. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé répondant à la formule (S-I) selon la revendication 1 dans un support pharmaceutiquement acceptable.
- 23. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé répondant à la formule (I) selon la revendication 2 dans un support pharmaceutiquement acceptable.<Desc/Clms Page number 51>
- 24. Utilisation d'un composé de formule (S-1) ou de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné à la régulation de l'activité des lymphocytes NKT.
- 25. Utilisation d'un composé de formule (S-1) ou de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie qui peut être choisie parmi les maladies auto-immunes, le cancer, les maladies infectieuses, le diabète, notamment le diabète de type 1, les maladies inflammatoires chroniques et aiguës.
- 26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement d'une maladie choisie parmi : l'arthrite, l'athérosclérose, le lupus érythémateux, la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques, et le diabète auto-immun.
- 27. Réactif pour l'évaluation in vitro de l'activité des lymphocytes NKT, caractérisé en qu'il renferme au moins un composé de formule (S-I) ou de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
- 28. Utilisation d'un réactif selon la revendication 27, pour la réalisation, in vitro, d'un test d'évaluation de l'activité des lymphocytes NKT.
- 29. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée par le fait que ledit test comprend les étapes suivantes : - la préparation de suspensions cellulaires hépatiques ou spléniques à partir d'un mammifère, - l'introduction d'un composé de formule (S-I) ou (I) dans cet échantillon de cellules, - l'évaluation de l'activité des composés de formule (S-I) ou (I) par mesure de l'apoptose des lymphocytes NKT hépatiques ou spléniques.
- 30. Utilisation selon la revendication 28 ou 29, pour effectuer le tri de produits actifs dans la modulation de l'activité lymphocytaire.
- 31. Kit pour la mise en #uvre d'un test in vitro d'évaluation de l'activité des lymphocytes NKT, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un composé de formule (S-1) ou (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
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