FR2777007A1 - Mutants de glycoproteines d'enveloppes de retrovirus et leurs applications biologiques - Google Patents

Abstract

L'invention vise des mutants de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus, caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines capables de se lier spécifiquement avec les récepteurs chemokines et possédant une activité inhibitrice vis-à-vis d'une infection rétrovirale.

Description

Mutants de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus et leurs applications

biologiques L'invention a pour objet des mutants de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus et leurs applications biologiques. On sait que, chez VIH-1, l'infection des cellules cibles (monocytes ou lymphocytes) est médiée par les glycoprotéines d'enveloppe, la gpl20 et la gp41, avec une liaison de très forte affinité de la gpl20 au récepteur CD4. La gpl20 a été soumise à diverses délétions et mutations ponctuelles afin d'identifier les sites

participant à l'association au CD4.

Il est apparu, sur la base des différents travaux, que l'acide aminé en position 432, situé dans la 4ième région

constante C4, est critique pour la liaison au CD4.

La liaison de la gpl20 au CD4 induit des changements conformationnels dans les glycoprotéines d'enveloppe de VIH-1 qui doivent favoriser des étapes ultérieures pour

l'entrée du virus.

Récemment, des co-récepteurs fusogènes ont été identifiés. Ainsi, on a rapporté le rôle important joué par des récepteurs appartenant à la famille des chemokines à plusieurs passages transmembranaires vis-à- vis de VIH-1,

VIH-2 et VIS.

Il est apparu que des tropismes distincts de diverses souches de VIH résultent du ciblage de différents récepteurs de type chemokine et des études effectuées avec des glycoprotéines recombinantes de VIH-l ont montré le rôle central joué par la boucle V3 de la gpl20 de VIH-l vis-à-vis du tropisme à l'égard de macrophages et de la formation de syncytium ou de la fusion dans des cultures de lymphocytes CD4- positives. Le récepteur CXCR4, à savoir la fusine, fonctionne comme un co-récepteur de souches de VIH présentant un tropisme vis-à-vis des cellules T ou des TCLA (T-cell line adapted). Un changement de conformation de la gpl20 serait nécessaire pour obtenir une liaison correcte de VIH aux chemokines et conduirait à la formation d'une association

de 3 molécules, avec CXCR4 et le complexe gpl20/CD4.

Dans leur étude sur les interactions entre VIH-l et les cellules cibles, l'attention des inventeurs a été retenue par les régions fortement conservées parmi les gpl20 de différentes souches de VIH-l, et également dans la famille des rétrovirus, comprenant en plus de VIH-l, VIH-2, VIS, HTLV-l, VISNA, VAIE, VLB et VSR. Ces structures conservées montrent souvent la structure d'une hélice a (en

abrégé HXa).

Le criblage, à faible stringence, avec un anticorps, d'une banque de peptides combinatoire a permis de confirmer que le domaine Cl de la gpl20 contient une hélice a, désignée HXa-l. Cette hélice a-1 correspond à la structure en hélice la plus importante, comparée aux autres structures hélice a dans la gpl20. Elle est localisée à l'interface entre des molécules de gpl20 adjacentes dans un

complexe oligomère.

Prenant en compte ces différents enseignements, les inventeurs ont cherché à étudier les effets qui pouvaient résulter de la délétion de ces structures en hélice, et en particulier de HXa-1, et ont élaboré des glycoprotéines délétées correspondantes. Les travaux qu'ils ont effectués ont montré que de telles délétions modifient les propriétés de liaisons aux récepteur(s) et co-récepteur(s) des glycoprotéines sur les cellules cibles, et leur conférent des propriétés de grand

intérêt pour lutter contre une infection par un rétrovirus.

Avantageusement, les résultats obtenus avec des glycoprotéines d'enveloppe de VIH peuvent être vérifiés avec d'autres glycoprotéines rétrovirales et permettent donc l'élaboration d'outils d'importance majeure pour

prévenir et traiter des infections rétrovirales.

L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux mutants de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus, capables notamment d'interagir de manière spécifique à des récepteurs de type chemokine et d'exercer un effet

inhibiteur vis-à-vis d'une infection virale.

Elle vise également les applications biologiques de

ces mutants.

Les mutants de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines capables d'interagir spécifiquement avec les récepteurs chemokines et possédant une activité inhibitrice vis-à- vis d'une infection rétrovirale. Ces mutants chemokines spécifiques sont caractérisés en ce que leurs activités notamment leur activité

inhibitrice sont indépendantes du CD4.

Des mutants de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus, dépourvues d'au moins une structure en hélice a, telle que

présente dans les glycoprotéines d'enveloppe natives.

L'invention vise en particulier les mutants dans lesquels les glycoprotéines sont dépourvues de la structure en hélice a-l, telle que présente dans la région C1 de la

gpl20 de VIH.

La séquence en acides aminés de ces mutants correspond donc, à l'exception de la structure hélice délétée, à celle d'une glycoprotéine d'enveloppe native soit complète, soit partielle, comprenant, dans ce dernier cas, au moins les régions impliquées dans la reconnaissance de co-récepteurs

chemokines sur les cellules cibles.

En variante, la séquence en acides aminés des mutants correspond, à l'exception de la structure hélice délétée, à une séquence homologue d'une telle séquence complète ou partielle de glycoprotéine d'enveloppe native. De manière classique, l'homologie est définie à environ au moins 70% de similitude entre séquences, les modifications, délétions ou mutations, n'affectant pas les propriétés observées avec

la séquence de référence.

La référence aux glycoprotéines d'enveloppe d'un rétrovirus ou aux glycoprotéines natives, dans la

description et les revendications englobe donc les

séquences homologues. Elle englobe également les glycoprotéines recombinantes telles qu'exprimées par des vecteurs ou des systèmes d'expression comme baculovirus, à

la surface de cellules transfectées.

L'invention vise spécialement des mutants dans lesquels les glycoprotéines sont dépourvues du fragment correspondant à la séquence E61 à S85, telle que présente

dans la région C1 de la gpl20 de VIH.

De manière avantageuse, les mutants de l'invention constituent des enveloppes virales prototypes pour la recherche de leur pouvoir immunogène chez des mammifères,

en particulier chez les primates.

L'invention vise ainsi également les anticorps formés

contre les mutants de l'invention.

Les mutants de l'invention présentent en outre un intérêt comme compétiteurs de drogues pouvant utiliser le CXCR4 comme cible cellulaire, en permettant de sélectionner

des drogues antivirales.

Ils sont également utilisables pour rechercher des anticorps qui reconnaissent le même récepteur cellulaire,

dans le but d'inhiber une infection virale par compétition.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 8, - la figure 1 donnant une représentation schématique d'un procédé d'obtention d'un mutant de gpl20 selon l'invention. - la figure 2, des photos de co-cultures de HeLa-Tat et de HeLa-P4 comportant des gènes CD4 et Lac-Z, les cultures de HeLa-Tat étant transfectées avec une gpl20 de type sauvage (gp 120 wt), ou un mutant selon l'invention, des cultures de cellules non transfectées étant utilisées à titre de témoin, - la figure 3, les résultats de mesure de fluorescence obtenus avec des cellules HeLa-Tat co-transfectées par un plasmide exprimant une molécule membranaire et un plasmide exprimant soit gpl20 wt, soit un mutant de gpl20 selon l'invention. - la figure 4, les gpl20 recombinantes wt et mutante séparées par SDS-PAGE,

- la figure 5, les résultats d'analyses FACS c'est-à-

dire avec un trieur de cellules par fluorescence et cellule-ELISA concernant les effets de gpl20 wt et d'un mutant selon l'invention sur la liaison à la surface de cellules CEM d'anticorps monoclonaux anti-CD4, la figure 6, les résultats d'analyses FACS et cellule-ELISA se rapportant à l'étude de la liaison de SDFl-a au CXCR4 en présence de gpl20 wt ou d'un mutant de gpl20 selon l'invention, - la figure 7, les résultats de l'analyse FACS concernant la liaison des gpl20 wt et d'un mutant de gpl20 selon l'invention à des cellules CHO-K1 CD4-négatives, exprimant un récepteur CXCR4 recombinant, et - la figure 8, des résultats d'essais d'infection par VIH-1 de cellules HeLa-P4 en présence de gpl20 wt et de

mutant de gpl20 selon l'invention.

MATERIEL UTILISE DANS LES EXPERIENCES

Lignées cellulaires Les lignées cellulaires sont maintenues à 37 C dans

une atmosphère humide renfermant 5% de CO2.

On utilise des cellules HeLa-P4 exprimant de manière stable le gène LacZ sous le contrôle de VIH-1 LTR (Cellules HeLa CD4 LTR LacZ) (P. Charneau, Institut Pasteur). Ces cellules sont cultivées en milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF, Biomedia), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline, de la

streptomycine, et 400 gg/ml de généticine (G418).

La lignée cellulaire HeLa-Tat (O. Schwartz, Institut Pasteur) est transfectée pour exprimer l'enveloppe de VIH-1 et cultivée dans un milieu DMEM complet avec 2 mM de méthotrexate. La lignée cellulaire CEM CD4+, obtenue auprès de 1'ATCC est cultivée dans un milieu RPMI 1640 supplémenté

avec 10% de SVF.

La lignée cellulaire recombinante CHO-K1 (M.

Parmentier, Euroscreen, Co. Bruxelles) est cultivée dans un milieu HamF12 (Life Technologies), supplémenté avec 10% de SVF et 400 gg/ml de G418. Le plasmide pHXB2R est un clone dérivé de VIH-1 IIIB (NIH, Bethesda, Aids Research and Reference Reagent Program, E.U.A.), et la souche VIH-1 LAI (H. Holmes, MRC, Aids Reagent Project, NIBSC, GB) est

cultivée dans les lignées cellulaires CEM et HeLa-CD4.

anticorps L'anticorps monoclonal 12G5 anti-CXCR4 (J. Hoxie, Université de Pensylvannie, Philadelphie, E.U.A.) réagit spécifiquement avec la protéine CXCR4 humaine et reconnaît un épitope conformationnel, vraisemblablement localisé sur

la troisième boucle extramembranaire de la molécule.

Les échantillons de pools d'immunoglobulines VIH-

immunes utilisés proviennent du N.I.H. (AIDS Reagent Repository). Il s'agit de mélanges d'Ig de sérums

sélectionnés provenant de personnes séropositives.

L'anticorps polyclonal de mouton D7324 est un anticorps anti- gpl20 élaboré contre un peptide contenant les acides aminés allant des positions 497 à 511 de la

gpl20 (Aalto BioReagents, Irlande).

L'anticorps monoclonal 110.4 anti-gpl20 est dirigé contre la séquence GPGR de la boucle V3 (Genetic Systems, E.U.A.) et l'anticorps monoclonal 110-K anti-gpl20 est

dirigé contre un épitope qui sert à la liaison au CD4.

L'antisérum de lapin anti-gpl20 a été obtenu par les inventeurs après immunisation avec une gpl20 recombinante de VIH-1 IIIB d'Intracel Corp. (E.U.A.) L'anticorps monoclonal Leu3a anti-CD4 est un produit

commercialisé par Beckton et Dickinson (San Jose, Canada).

Les anticorps monoclonaux 13B8.2/1OKT4A et BL4/lOKT4 anti-CD4 sont des produits commercialisés par Immunotech

S.A. (Marseille, France).

Les anticorps monoclonaux ST4/F101.69 anti-CD4, ST40/F142.63 anti-CD4, BF5 anti-CD4, F93,7G2 anti-CD100 et F145.GF3 anti-CD5 proviennent de Sanofi (Montpellier, France). L'anticorps monoclonal OKT4 anti-CD4 est un produit commercialisé par Ortho Diagnostic Systems, Inc

(E.U.A.).

Les anticorps anti-SDFl-a sont des produits

commercialisés par R & D Systems (Grande-Bretagne).

Exemple 1: Procédé d'obtention d'un mutant de gpl20; clonage et expression de gp120 de type sauvage et du mutant

de gp120 AHXa-1.

On rapporte sur la figure 1 un schéma illustrant les étapes du procédé mis en oeuvre pour supprimer la structure hélice a-1 de la région Cl de la gp 120. Sur ce schéma, on a indiqué le peptide signal (ps), les régions conservées

(Cl à C5) et les régions variables (Vi à VS).

Les astérisques désignent les sites de N-glycosylation

et cystéine conservés dans l'hélice a-1.

15. obtention de pBSml On amplifie par PCR un fragment de 1414 pb codant pour la gpl20 (de l'acide aminé V12 à R481), en utilisant le plasmide pHXB2R comme matrice et les 2 amorces suivantes: amorce sens: 5'GCAGGATCCGGTACCTGTGTGGAAGGAAGC 3' amorce anti-sens: 5'GCACTGCAGTTAGCGTTTCTCTCTCTGCACCACTC 3' Le fragment généré contient un site BamHI en amont du site KpnI de la gpl20 (V12) et un codon stop à l'extrémité

de la séquence de la gp120 suivi par un site Pstl.

Le fragment BamHI-Pstl est alors cloné dans un vecteur Bluescript (pBS) (Stratagène), dans lequel le site KpnI est éliminé par digestion avec Kpnl, suivie d'une réparation avec la T4- ADN polymérase et d'une religation,

ce qui conduit au sous-clone de gpl20 pBSml.

élaboration de pBSm2 On ajoute ensuite la séquence codant pour la partie N-terminale de la gpl20 (T1 à G11) et une nouvelle séquence de peptide signal, isolées du gène ecdystéroide glycosyl transférase du baculovirus de Autographa californica. Pour ce faire, on utilise des oligonucléotides se chevauchant et insérés dans les sites BamHI-KpnI de pBSml. Le plasmide

résultant est appelé pBSm2.

élaboration de pBSm3 On introduit 2 sites uniques de restriction adjacents à la séquence HXa-1, en utilisant des oligonucléotides qui modifient les codons V57- N58 et K91-L92, sans modifier

leur capacité à coder.

Selon la première modification, le codon GTA de V57 est remplacé par GTT et le codon AAT de N58 par AAC. En ce qui concerne la deuxième modification, le codon AAA de K91 est remplacé par AAG et le codon TTA de L92 par CTT, ce qui

crée respectivement des sites HpaI et HindIII.

On introduit ensuite la séquence dans pBSm2, ce qui

conduit à l'obtention du plasmide pBSm3.

élaboration de pBSm4

Pour supprimer la séquence HXx-1, le fragment HpaI-

HindIII de type sauvage est excisé du plasmide pBSm3 et

remplacé par un fragment muté HpaI-HindIII.

Ce fragment est reconstitué en utilisant 2 oligonucléotides se chevauchant ' AACGTGACACTTAAGCCATGTGTAA 3', et

5' AGCTTTACACATGGCTTAAGTGTCACGTT 3'

et un site AfIII est également introduit dans le codon L86 en changeant CTA en CTT afin d'identifier le

fragment muté, ce qui conduit au plasmide pBSm4.

15. clonage et expression de la gpl20 de type sauvage et du mutant AHXa- 1 On procède ensuite à l'excision, à partir de pBSm3 ou de pBSm3, pBSm4, du fragment BamHI-Pstl, comprenant la séquence codante complète de gpl20. Ce fragment est cloné dans les sites BgIII-Pstl du vecteur de transfert pll9P du

baculovirus P10 (M.H. Ogliastro).

Des cellules SF9 sont co-transfectées avec de l'ADN viral purifié provenant du baculovirus modifié AcSLP10 et

de l'ADN provenant du vecteur recombinant de gpl20 pll9P.

Les baculovirus recombinants sont purifiés sur

plaques, en utilisant les méthodes standards.

Les cellules SF9 sont infectées à une densité de 5x105 cellules /ml et à une multiplicité d'infection de UFP/cellule. On récupère le surnageant 6 jours après l'infection. La gpl20 de type sauvage, ou gpl20 wt, et la gp120 déletée, ou gpl20 AHXa-1, sont concentrées et immunopurifiées avec l'anticorps anti-gpl20 D7324, prélablement insolubilisé, sur du bromacétyl-Sépharose . Afin de vérifier la pureté des produits, les protéines sont séparées en appliquant un gradient de 4 à 15% de Phastgel dodécyl sulfate de sodium, dans un système tampon

discontinu (PhastSystem, Pharmacia).

Les bandes de protéines résolues sont transférées électrophorétiquement sur nitrocellulose. Après saturation, les empreintes sont mises à incuber avec les anticorps

marqués appropriés.

Les séquences complètes de gpl20 wt ou gpl20 AHXa-1 sont clonées dans le vecteur d'expression d'enveloppe de

VIH-1 pCEL/E160 sous le contrôle du promoteur CMV.

pCEL/E160 (Y. Boublik et M. Sitbon) dérive d'un vecteur d'expression d'enveloppe rétroviral par insertion

de l'enveloppe de VIH-1 LAI.

Pour obtenir l'expression de l'enveloppe avec la gpl20 désirée, le fragment KpnI-NheI,en utilisant un deuxième site de restriction NheI localisé en amont du codon stop dérivé soit de pBSm3, soit de pBSm4, est substitué dans la

séquence correspondante originale de pCEL/E160.

Exemple 2: Etude de la fusion cellulaire entre des protéines d'enveloppe de VIH-l et des cellules cibles 5. Utilisation de l'expression du gène LacZ pour la mise en évidence d'une fusion On dépose sur des plaques à 6 puits, à fond plat, des

cellules HeLa-Tat, à une concentration de 8x104 puits.

Après 24 heures, on transfecte les cellules avec 1 g du vecteur d'expression pCEL/E160 en utilisant le réactif Lipofectamine (Gibco Life Sciences, E.U.A.), en suivant les

recommandations du fabricant.

On évalue l'aptitude des différentes glycoprotéines d'enveloppe à induire la fusion et la formation de syncytia. Pour ce faire, on procède à une co-culture avec des cellules HeLa-P4 comportant des gènes CD4 et LacZ sous

le contrôle LTR de VIH-l.

Après 24h, les co-cultures confluentes sont lavées avec un tampon phosphate salin (PBS), fixées avec du glutaraldéhyde à 0,5% pendant 10 mn à température ambiante,

et lavées à 2 reprises avec du PBS.

Les mono-couches cellulaires sont colorées par

incubation avec une solution de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-

P-D-galactopyranoside (X-gal), pendant 2h à 37 C, et lavées

à 2 reprises avec PBS.

Des évènements de fusion entre les cellules de HeLa-

P4 et les cellules effectrices exprimant l'enveloppe de VIH-l et le transactivateur Tat se traduisent par l'induction de l'expression in situ du promoteur du gène reporter lacZ. Pour chaque glycoprotéine d'enveloppe testée, on effectue le comptage du nombre total de foci

colorés en bleu par puits.

On rapporte sur la figure 2, les résultats obtenus avec A) des cellules HeLa-Tat exprimant l'enveloppe wt (contenant la gpl20 wt), B) des cellules Hela-Tat exprimant l'enveloppe sans hélice a-1 (contenant la gpl20 AHXa-1) et C) des cellules HeLa-Tat non transfectées. La présence de

syncitium bleu est indiquée par une flèche.

La transfection avec l'enveloppe de type sauvage conduit à un grand nombre de syncytia avec expression de P-galactosidase (1000 à 2000 foci/puits). Au contraire, on n'observe aucun foci après infection avec l'enveloppe du mutant AHXa-1 (figure 2) ou avec l'enveloppe du virus de leucémie murine écotropique de Friend (F-MuLv) qui n'est

fusogène que pour les cellules de souris ou de rats.

Analyse par cytométrie en flux de l'expression en surface des cellules d'enveloppe L'absence de propriétés fusogènes observées avec la gpl20 AHXa-1 a amené à vérifier si l'expression de

l'enveloppe à la surface des cellules était modifiée.

Des expériences ont donc été réalisées pour contrôler les taux de gpl20 à la surface de cellules HeLa-Tat transfectées, par cytométrie en flux, en procédant comme suit: Le vecteur d'expression pCEL/E160, portant soit la gpl20 wt (Sugpl20: Sous unité de gpl20 en surface) ou la gpl20 AHXa-1, est co-transfecté dans des cellules HeLa-Tat avec le plasmide pMACS-Kk, qui exprime une molécule

membranaire tronquée murine H-2Kk (Miltenyl Biotech Inc).

On effectue la transfection par bombardement de particules en utilisant un appareil biolistique PDS/1000/He (BioRad). En résumé, sur 3 mg de billes d'or de 1,6.m, on dépose un revêtement avec 2,5 ig d'ADN mixte, contenant 0,5 gg de pMACSKk et 2pg de pCEL/E160. Après bombardement 24h de culture, les cellules transfectées sont détachées, lavées, mises à incuber, pendant lh, à 4 C avec 80 gl de microbilles magnétiques revêtues de l'anticorps monoclonal anti-H2Kk. On procède à une sélection positive des cellules exprimant la protéine H2Kk à l'aide de colonnes RS+ par séparation sur le système magnétique Vario-MACS, en suivant les recommandations du fabricant(Miltenyl Biotec Inc, Auburn, Canada). Les cellules sélectionnées sont mises à incuber, pendant lh, à 40C, avec 100 lg/ml d'IgG

polyclonales humaines anti-VIH (VIH-IgG).

Les cellules sont ensuite lavées, colorées avec des IgG anti- humaines de chèvre, conjuguées à de la phycoérythrine (PE) (50 4l d'une dilution au 1/50;

Immunotech, Marseille, France), pendant lh, à 40C.

Les cellules sont lavées 3 fois dans PBS/0,3% de BSA avant de procéder à l'analyse en cytométrie à flux en utilisant un appareil FACSort (Beckton & Dickinson) pour

mesurer les taux de gpl20 à la surface des cellules.

Comme témoins négatifs, on utilise des cellules transfectées par le vecteur pMACS Kk (H2Kk) seul

(coloration avec IgG anti-VIH et conjugué IgG-PE anti-

humain) et des cellules HeLa-Tat co-transfectées avec un plasmide d'enveloppe wt et le vecteur pMACS Kk, mais coloré avec seulement l'anticorps secondaire anti-humain conjugué à PE. Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 3 qui donne le nombre de cellules en fonction de l'intensité de fluorescence pour les témoins et les cellules transfectées. On observe une population unimodale avec une faible intensité de fluorescence (intensité de fluorescence moyenne = 15,1) après la coloration des cellules HeLa-Tat témoins. Avec des cellules transfectées par un vecteur d'expression d'enveloppe de type sauvage ou de type délété, on note des distributions similaires des populations

négatives et positives.

Dans les deux cas, la population positive est détectée

à une intensité de fluorescence moyenne d'environ 170.

Exemple 3: Etudes de la liaison des protéines recombinantes gpl20 wt et gpl20 AHXa-1 aux cellules CEM méthode générale On réalise toutes les expériences de liaison avec 2x10 cellules CEM remises en suspension dans 50 g1 de PBS/3% de BSA contenant l'anticorps monoclonal désiré à la

concentration appropriée.

Après 1 h d'incubation sous agitation à 37 C, les cellules sont lavées 2 fois dans PBS/0,3% de BSA, puis on ajoute un anticorps IgG-FITC (Sigma) anti-souris, ou un conjugué IgG-PE anti-humain (Immunotech), ou un conjugué IgG-FITC anti-humain (Immunotech), ou un conjugué

streptavidine -PE (Sigma), à un dilution de 1/50.

Après lh supplémentaire d'incubation, sous agitation, à température ambiante, les cellules sont lavées 3 fois, remises en suspension dans PBS et analysées par cytométrie à flux (une couleur) en utiilisant un FACSort (Beckton & Dickinson) avec un logiciel Lysis II. Chaque point représente l'acquisition de 10 000 évènements pris en compte. liaison à des anticorps spécifiques La liaison des anticorps monoclonaux anti-CD4, Leu3a, F101.69, 1388.2, ST40, BL4, OKT4 et BF5, est également contrôlée après incubation des cellules CEM avec la gp wt

ou la gpl20 AHXc-l soluble (10 gg/ml) pendant 1 h, à 37 C.

Les cellules sont lavées (2 lavages dans PBS/0,3 % de

BSA) et colorées avec le conjugué FITC, anti-souris, IgG-

spécifique (100 gg/ml) avant d'effectuer l'analyse

cytométrique en flux, comme décrit dans l'exemple 2 ci-

dessus, en présence ou en l'absence d'azide de sodium à

0,02% dans les solutions de lavage et d'anticorps.

Dans ces essais, on utilise les gpl20 solubles (gpl20 wt ou gpl20 AHXal), dans un volume de 50 gl, selon

différentes concentrations.

Les glycoprotéines gpl20 recombinantes de baculovirus mises en oeuvre sont concentrées et immunopurifiées comme décrit ci-dessus. Les protéines sont résolues par SDS-PAGE

(gradient de 4 à 15%).

La figure 4 donne les photos des gels avec A) les protéines (4 Mg) colorées avec du nitrate d'argent ou transférées sur une membrane de nitrocellulose et

l'empreinte immunologique ensuite obtenue, B) avec un anti-

sérum polyclonal de lapin anti-gpl20, ou un antisérum polyclonal de lapin formé contre un surnageant de cellules

SF9 infectées par un baculorivus wt (SF9SNBwt).

Sur chaque plaque, on a indiqué les pistes correspondant aux gpl20 wt, gpl20 AHXc-1 et SF9SNBwt et les

marqueurs de poids moléculaire (PM).

Les positions des monomères(m), des dimères (d) et des

polymères (p) des gpl20 sont marquées par des flèches.

On a déterminé les réactivités des anticorps 110.4 (D) et 110.K(E) antigpl20 avec la gpl20 wt native (carrés noirs et la gp120 AHXa- l (carrés blancs). Tous les résultats ont été corrigés en tenant compte d'une absorption de base d'anticorps en l'absence de gpl20

(habituellement DO492 inférieure à 0,100).

L'examen de la figure 4A montre la présence de 2 bandes majeures correspondant à des monomères et à des dimères de la gpl20 wt et de la gpl20 AHXa-1 solubles, avec

un degré de pureté supérieur à 95%.

L'analyse des immunoblots des protéines produites par

le baculovirus, avec un antisérum polyclonal de lapin anti-

gpl20, confirme la présence de formes monomères et

oligomères de gpl20 (figure 4B).

La pureté des protéines de gpl20 est démontrée par l'absence de réactivité avec un anticorps de lapin dirigé contre le surnageant provenant de cellules SF9 infectées

avec un baculovirus de type sauvage (figure 4C).

On a ensuite vérifié si la protéine de gpl20 AHXc-l était reconnue par les anticorps monoclonaux 110.4 et 110.K, anti-gpl20, qui réagissent, respectivement, avec la boucle V3 et des structures conformationnelles impliquées

dans la reconnaissance du CD4.

Les résultats obtenus montrent que la boucle V3 est reconnue de manière équivalente dans la gpl20 wt et la gpl20 AHXa-l (figure 4D). En revanche, l'anticorps monoclonal dirigé contre le site conformationnel de reconnaissance du CD4 n'apparaît pas capable de réagir avec

la gpl20 wt (FIG 4E).

effet des gp120 sur la liaison d'anticorps monoclonaux anti- CD4 à la surface cellulaire - analyse FACS On a évalué l'aptitude de la gpl20 AHXt-1 soluble à s'associer avec le CD4 en déterminant le taux de liaison

d'anticorps monoclonaux CD4-spécifiques, Leu 3a et F101.69-

PE, qui réagissent avec la boucle CDR2 dans le premier domaine Dl de CD4, après pré-incubation des cellules CEM avec la gpl20 de type sauvage ou gpl20 AHXx-i (10 gg/ml),

en présence de 0,02% d'azide de sodium.

On rapporte sur la figure 5A les résultats de l'analyse FACS. Sur cette figure a) à d) correspondent respectivement aux conditions suivantes: a) incubation des cellules CEM avec un conjugué IgG anti-souris de chèvre FITC, à titre de témoin négatif, b) liaison de l'anticorps Leu3a, après incubation avec gpl20 wt, c) liaison de l'anticorps Leu3a, après incubation avec le mutant gpl20 AHxa-1, et

d) liaison de l'anticorps Leu3a aux CEM.

On constate à l'examen de ces résultats que la gpl20 wt inhibe plus de 98% de liaison de Leu3a (graphe b de la figure 5A). Au contraire, la gpl20 AHXa-l ne modifie pas la

liaison de l'anticorps (<5,6%, graphe c de la figure 5A).

- Méthode cellule-ELISA On étudie l'effet des gpl20 sur la liaison des anticorps monoclonaux F101.69 par la méthode cellule-ELISA en procédant comme suit: Des plaques de microtitration (Nunc) en forme de U, Maxisorb sont saturées avec PBS/3% de BSA, pendant 30 minutes, à 37 C, et mises à incuber avec 25 gl d'un mélange 1:1 (10 ug/ml) d'un anticorps monoclonal anti-CD5 (F145,6F3) et anti-CD100 (F93, 7G2) pendant 16 heures, à 4 C.Après plusieurs lavages, 105 cellules de CEM sont distribuées dans chaque puits, avant centrifugation de la plaque à 900 g pendant 5 minutes, puis incubation pendant minutes à 37 C, et 2 lavages avec 200 tl de PBS/0,3% de BSA par puits. Des puits, en quatre exemplaires, sont mis à incuber avec des protéines de gpl20 solubles pendant 1 heure, à

37 C, et lavés deux fois dans PBS/0,3% de BSA.

Pour les expériences d'inhition du CD4, les cellules sont ensuite mises à incuber pendant 30 minutes, à 370C, avec une dilution de 1/1000 de l'anticorps monoclonal

F101.69 anti-CD4 couplé à la peroxydase.

En variante, après incubation avec les protéines de gpl20, on ajoute SDFlc à une concentration de 10 kg/ml, pendant 30 minutes, à 20 C. Les puits sont lavés deux fois avec PBS/0,3% de BSA, puis mis à incuber avec un anticorps biotinylé de chèvre, anti-SDF-lc dans PBS/3% de BSA/0,02% d'azide de sodium, puis révélés avec un complexe de streptavidinebiotine-peroxydase, à 200C, pendant 30

minutes.

On mesure la densité optique (DO) à 492 nm sur un spectrophotomètre Labsystème Multiscan RC. La plaque cellule-ELISA comprend deux standards internes, sans gpl20

et sans SDFla.

Les valeurs expérimentales sont exprimées en tant que pourcentage d'inhibition des valeurs de référence correspondantes.

Les DO de référence varient de 1,0 à 1,5.

Les puits sans cellules saturés avec PBS/3% de BSA, indiquent que la liaison non spécifique des protéines de

gpl20 recombinante est inférieure à 5%.

Des résultats similaires sont obtenus avec l'anticorps conjugué anti-CD4 F0ll.69-PE et confirmés par la méthode cellule-ELISA (figure 5B) avec des résultats similaires en

présence ou non d'azide de sodium.

- étude de l'effet de la gpl20 sur la liaison d'autres anticorps monoclonaux anti-CD4 par FACS Des études équivalentes effectuées avec différents anticorps monoclonaux anti-CD4 dirigés contre des sites distincts de la boucle CDR2 de Dl dans CD4, montrent que la gpl20 AHXa-l n'interfère pas avec l'aptitude de ces

anticorps à se lier au récepteur CD4.

Ces résultats sont donnés dans le tableau 1. Tous les anticorps anti-CD4 ont été détectés avec un antisérum de chèvre anti-souris marqué avec FITC, excepté l'anticorps

13B8.2 qui a été conjugué à PE.

TABLEAU 1

Effet des gpl20 sur la liaison des AcM anti-CD4 Intensité de Fluorescence moyenne Pré-incubation Anticorps Aucune gpl20 wt gpl20 AHXo-l

13B8.2 1054,78 73,13 940,74

ST40 416,00 87,73 360,16

BL4 489,38 93,40 418,96

OKT4 526,53 481,65 530,00

BF5 430,00 410,00 424,31

Il ressort de ces résultats que la gpl20 AHXa-l est

incapable de se lier au récepteur CD4.

Compte tenu de ces résultats, on a vérifié l'aptitude des gp120 à se lier à la surface de cellules CEM en

fonction de leur concentration.

L'analyse FACS a été réalisée avec les cellules en présence d'azide de sodium (0,02%) pour empêcher une

internalisation possible des récepteurs cibles.

Dans ces conditions, comme le montre la figure 5C, la gpl20 AHXa-1 se lie à la surface des cellules CEM de manière dose-dépendante, mais à des niveaux plus faibles

que la gpl20 wt.

Lorsque ces dernières expériences sont réalisées en l'absence d'azide de sodium, on n'observe pas de liaison de la gpl20 AHXa-1 sur les cellules CEM. On notera avec intérêt que l'absence d'azide de sodium ne modifie pas l'aptitude de la gpl20 wt à inhiber la

liaison des anticorps monoclonaux anti-CD4.

- étude de l'inhibition de la liaison de SDFl-x au CXCR4 La liaison de la gpl20 AHXc-l aux cellules CEM a amené à déterminer si l'association avec le récepteur de chemokine CXCR4 pouvait être responsable du phénomène

rapporté ci-dessus.

A cet effet, on a examiné si la gpl20 wt ou la gpl20

AHXo-l pouvait inhiber la liaison de SDFl-a.

Les figures 6A et 6B donnent les résultats, respectivement, des analyses FACS et cellule-ELISA effectuées. La figure 6A concerne un essai avec coloration à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-SDFl-a biotinylé révélé avec un conjugué streptavidine-PE. Les cellules CEM sont mises à incuber avec SDFl-x seul (10 kg/ml) ou sont mises à incuber au préalable avec gpl20 wt ou AHxa-l, à des

concentrations, respectivement, de 10 gg/ml et 30 gg/ml.

A titre de témoin, on utilise des cellules CEM qui

n'ont pas été exposées à SDFl-a.

Les essais correspondant aux résultats de la figure 6B sont effectués en présence de différentes concentrations de gpl20 wt et de mutant AHxa-l en appliquant la méthode cellule-ELISA. On observe que la liaison de SDFl-x (10 gg/ml) diminue jusqu'à 44,4% et 36% de la valeur témoin en présence, respectivement, de 10 yg/ml et de 30 pg/ml de

*gpl20 wt (figure 6A).

Après pré-incubation avec la gpl20 AHXa-l à une concentration de 10 kg/ml et 30 kg/ml, on observe également des chutes significatives, respectivement jusqu'à 35,3% et

% par rapport au témoin.

Des résultats similaires sont obtenus en utilisant la méthode CelluleELISA comme représenté par les niveaux

respectifs d'inhibition (figure 6B).

On observe donc une interaction spécifique entre CXCR4

et les gpl20 wt et gp120 AHXc-l.

- étude de l'inhibition de la liaison d'anticorps anti-CXCR4 On a également évalué l'aptitude de la gp120 wt et de la gpl20 AHXc-l à, inhiber la liaison de l'anticorps

monoclonal 12G5, anti-CXCR4.

On utilise l'anticorps à raison de 10 gg/ml. Les mesures sont effectuées après pré-incubation avec la gpl20 wt ou le mutant AHxx-l, ou SDFl-x. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 et exprimés en % de la liaison

totale prise comme 100%.

TABLEAU 2

Effet des gp120 sur la capacité de liaison d'un AcM anti-CXCR4 Concentration (gg/ml) Pré-incubation 10 40 90 SDF-la 20,7 ND ND gpl20 wt 59,5 58 ND gpl20 AHXc-l 80,0 77,2 44,8 On observe que les gpl20 inhibent la liaison de l'anticorps avec une liaison d'environ 80% et 60% par rapport au témoin à des concentrations, respectivement de 10 et 40 gg/ml, et inférieures à 45% à une concentration de

gg/ml de gpl20 AHXa-l.

La liaison de l'anticorps monoclonal 12G5 après incubation avec SDF-l. fait chuter jusqu'à 20% la liaison

par rapport aux cellules CEM à celle du témoin.

étude de la liaison de la surface de cellules CD4 négatives On a ensuite vérifié si la gpl20 AHXa-l est capable de se lier à la surface de cellules CD4-négatives exprimant de

manière récente le récepteur CXCR4 (lignée cellulaire CHO-

Kl). Les glycoprotéines de gpl20 (2 lg/ml) sont incubées

pendant 4 h, à 4oC, avec des cellules CD4 négatives (CHO-

K1). Les cellules sont incubées avec des anticorps humains anti-gpl20 et sont ensuite lavées et colorées avec un conjugué anti-humain IgG-PE ou FITC et les cellules sont traitées par analyse en cytométrie de flux comme décrit

dans l'exemple 2 ci-dessus.

L'inhibition de la liaison de SDFl-a est déterminée après incubation des cellules CEM avec différentes concentrations de gpl20 wt et de gpl20 AHXa-l, pendant 1 h,

à 37oC, dans PBS/3% de BSA.

SDFl-a (10 Mg/ml) est alors ajouté dans PBS/3% de BSA pendant 30 minutes à 37 C. Les cellules sont colorées avec un anticorps polyclonal de chèvre biotinylé, anti-SDFl-a anti-humain, dans PBS/3% de BSA/0,02% d'azide de sodium

pendant 30 min à température ambiante.

On ajoute le conjugué de streptavidine-PE pendant 30 min à température ambiante dans PBS/3% de BSA/0,02% d'azide

de sodium avant l'analyse par cytométrie en flux.

On détermine l'inhibition de la liaison de l'anticorps monoclonal 12G5 anti-CXCR4 après incubation des cellules CEM avec différentes concentrations de gpl20 wt, gpl20

AHXa-1, ou 10 Mg/ml de SDF-la, pendant 30 min, à 37 C.

L'accessibilité du CXCR4 est contrôlée par addition de l'anticorps monoclonal 12G5 (10 gg/ml) en présence de 0,02%

d'azide de sodium, pendant 1 h, à 4 C.

Les cellules sont lavées à 2 reprises avec PBS/0,3% de BSA/0,02% d'azide de sodium, et colorées avec un anticorps IgG anti-souris, conjugué à FITC dans PBS/3% de BSA/O,02%

d'azide de sodium, avant l'analyse par cytométrie en flux.

Les résultats sont donnés sur la figure 7 o la courbe a) correspond au fond de fluorescence, la courbe b) se rapporte à la liaison de gp120 wt (2 Mg/ml) aux cellules et

la courbe c) à la liaison du mutant de gpl20.

La liaison de la gpl20 wt et de la gpl20 AHXa-l aux

cellules CHO-K1 a été déterminée en utilisant une IgG anti-

VIH-1 et révélée avec une IgG anti-humaine marquée avec PE.

On observe bien une liaison avec une intensité de fluorescence moyenne atteignant 11,92 et 13,92, respectivement pour la gpl20 wt et la gpl20 AHXa-l, alors que l'intensité du témoin, obtenue en l'absence de gpl20,

est de 3,35.

Exemple 4: Etude de l'inhibition de l'infectivité de VIH-1 par la gpl20 AHXa-1 recombinante soluble Pour étudier l'aptitude de la gpl20 AHXc-1 à inhiber l'infection par VIH-1, on fait pré-incuber des cellules HeLa P4 avec la protéine soluble, à 4 C, pendant 1 h, avant

de les exposer au virus VIH-1 LAI.

Les essais sont réalisés comme suit On provoque une infection 24 heures après

l'ensemencement de 10 cellules HeLa-P4 (CD4+, LTR-

LacZ)/puits, dans des plaques de microtitration à 96 puits.

Les cellules sont alors pré-incubées, sous agitation modérée, dans un milieu DMEM, dépourvu de sérum, en présence de différentes concentrations de gpl20 wt ou de gpl20 AHXL-1 recombinantes solubles, pendant 1 heure, à 4 C. Elles sont ensuite mises à incuber avec 25 j1 de particules infectieuses ultracentrifugées de VIH-1 LAI

produites à partir des cellules infectées de CEM.

L'induction d'une activité P-galactosidase, c'est-à-

dire du produit du gène LacZ des HeLa P4 reflète la transactivation Tat et, par conséquent, l'infection par

VIH-1.

Après 24 heures, l'activité P-galactosidase est mesurée dans les lysats cellulaires des puits utilisés en

quatre exemplaires.

A cet effet, les cellules sont lysées dans 100 il d'un tampon contenant 0,125% de NP40, 60 mM de Na2HPO4, 40 mM de NaH2PO4, 50 mM de gmercaptoéthanol, 25 mM d'EDTA, 10 mM de KC1, 10 mM de MgSO4, et 100 p1l de 80 mM de phosphate de sodium à pH 7,4, 10 mM de MgCl2, 10 mM,mercaptoéthanol avant l'addition de 6 mM de rouge de chlorophénol-sels

monosodiques de b-galactopyranoside.

Le mélange est incubé pendant 30 minutes à 37 C et on

mesure l'absorbance à 574 nm.

Les résultats obtenus montrent une inhibition virale de 50% (IC50) après pré-incubation avec l'une ou l'autre des gp 120 wt ou gpl20 AHXa-1 à une concentration de 100 nM

(Fig 8).

Ainsi, malgré son absence d'interaction de la gpl20 AHXx-1 avec CD4, cette molécule est capable d'inhiber une infection virale par VIH- 1, vraisemblablement par

interaction avec le récepteur secondaire CXCR4.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Mutants de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus, caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines capables d'interagir spécifiquement avec les récepteurs chemokines et possédant une activité inhibitrice

vis-à-vis d'une infection rétrovirale.

2. Mutants selon la revendication 1, caractérisés en ce que leurs activités, notamment leur activité

inhibitrice, sont indépendantes du CD4.

3. Mutants selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'il s'agit de glycoprotéines d'enveloppes de rétrovirus, dépourvues d'au moins une structure en hélice a, telle que présente dans les glycoprotéines d'enveloppe

natives.

4. Mutants selon l'une quelconque des revendications 1

à 3, caractérisés en ce que les glycoprotéines sont dépourvues de la structure en hélice a-l, telle que

présente dans la région Cl de la gpl20 de VIH.

5. Mutants selon la revendication 4, caractérisés en ce que les glycoprotéines sont dépourvues du fragment correspondant à la séquence E61 à S85, telle que présente

dans la région C1 de la gpl20 de VIH.

6. Mutants selon l'une quelconque des revendications 1

à 5, caractérisés en ce que les glycoprotéines sont recombinantes.

7. Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre les mutants selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6.

8. Application des mutants selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6, comme enveloppes virales prototypes

pour l'étude de leur pouvoir immunogène.

9. Application des mutants selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6, comme compétiteurs de drogues anti-

virales ou d'anticorps au niveau du récepteur du virus.