FR2773561A1 - Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond : - soit à la séquence riche en proline. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, ou. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF,. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV10A1,. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un (-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

Description

UTILISATION D'UNE SEQUENCE RICHE EN
PROLINE POUR AUGMENTER LE CARACTERE
FUSOGENIQUE D'ENVELOPPES DE RETROVIRUS
L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proline pour augmenter le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.

L'entrée d'un rétrovirus dans une cellule cible dépend de la reconnaissance d'une protéine de surface spécifique, appelé récepteur, par la sous unité de surface (SU) de l'enveloppe virale, suivi par la fusion des membranes qui est médiée par le peptide fusion localisé à l'extrémité amino terminale de la sous unité transmembranaire (TM) (29). Une voie d'entrée dépendante du pH et une voie d'entrée indépendante ont l'une et l'autre été décrites pour les rétrovirus (13), mais les déterminants et le processus impliqués dans l'activation de la fusion suite à la reconnaissance du récepteur restent inconnus. L'identification des ces étapes est essentielle pour la compréhension du mécanisme qui module l'infection ainsi que transfert de gènes par les rétrovirus.

Les glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales qui s'assemblent en trimère, sont un complexe comprenant une sous unité de surface (SU) et une composante transmembranaire (TM) (10). Pour tous les virus enveloppés, les interactions initiales de cette glycoprotéine avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s) conduisent à des réarrangements conformationnels de l'enveloppe nécessaires à l'exposition du peptide fusion (30). Les déterminants de l'enveloppe et la séquence des événements causant ces changements conformationnels sont bien détaillés pour les orthomyxovirus qui nécessitent l'environnement acide des vésicules d'endocytose pour leur entrée (24).

Pour les rétrovirus, pour lesquels une voie indépendante du pH a aussi été décrite, les déterminants précis et les étapes, menant de la reconnaissance du récepteur à l'activation de la fusion, restent non élucidés. Le récepteur Pit-2 de l'enveloppe amphotrope des virus de leucémie murine (14, 28) est présent dans la plupart des espèces incluant l'homme, alors que les récepteurs fonctionnels des enveloppes écotropes sont limités aux cellules de rat et de souris (19). La reconnaissance de l'un ou l'autre de ces récepteurs influence l'efficacité de fusion, mais l'enveloppe écotrope induit plus facilement la fusion cellule-cellule et la formation de syncytia, comme testé avec les cellules de rat XC, que les enveloppes amphotropes (17).

Les domaines structuraux partagés par l'enveloppe écotrope de Moloney (MoMLV) et l'enveloppe amphotrope (MLV4070A) comprennent : (i) un domaine amino-terminal de liaison au récepteur (noté BD) d'approximativement 200 acides aminés (a.a.) (3, 7); (ii) la région riche en proline de 45 à 59 a.a. de long, identifiée par PRO dans les constructions chimériques décrites ci-après (27); (iii) une séquence carboxy-terminale de la SU (noté C) de 160 a.a. impliquée dans l'interaction avec la
TM; (iv) un ectodomaine de la TM de 134 a.a. désigné ici par TM, portant un peptide fusion amino-terminal potentiel identifié par analogie de séquences aux peptides fusions d'autres protéines d'enveloppe de virus enveloppés (11) ; (v) un peptide d'ancrage à la membrane de 28 a.a. et (vi) une queue cytoplasmique contenant le petit peptide R carboxy-terminal dont le clivage tardif dans les virions, augmente la fusogénicité de l'enveloppe (20). Alors que les domaines amino-terminal BD et PRR de l'enveloppe écotrope et amphotrope ne partagent que 33% et 43% a.a. d'homologie, respectivement, tous les autres domaines ont plus de 80% de similitude (Fig. 1A).

L'un des objets de l'invention est de fournir des séquences riches en prolines qui augmentent le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.

L'un des objets de l'invention est de fournir des protéines chimères ou mutées dont le caractère fusogénique est amélioré.

L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV,
laquelle séquence riche en proline correspond
- soit à la séquence riche en proline
de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, ou
de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF,
de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAt,
de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou
- de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope, ou
de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV,
et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ssturn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,
- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

On a constaté de façon inattendue qu'il y a une augmentation du caractère fusogénique d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou d'un MLV MCF ou d'un MLV lOAt ou d'un GALV ou d'un MLV xénotrope ou d'un FeLV dans les cas suivants:
- soit par remplacement de leur séquence riche en proline par la séquence riche en proline homologue d'un MLV écotrope,
- soit par mutation ponctuelle de la séquence riche en proline dudit MLV amphotrope ou dudit MLV MCF ou dudit MLV 10A1 ou dudit GALV ou dudit
MLV xénotrope ou dudit FeLV telle qu'il y ait suppression d'au moins un ss- turn.

La région riche en proline s'organise probablement en hélice poly-proline, une structure secondaire constituée de béta-turns > qui sont des repliements de la chaîne peptique de 180 , incluant le plus souvent une proline. Ces courbures sont agencées différemment entre les régions PRO (région riche en proline) des enveloppes écotrope et amphotrope. Cette dernière contient 11 béta-turns agencés régulièrement, dont 4 dans son extrémité N-terminale et 7 dans son extrémité C-terminale. La région PRO de l'enveloppe écotrope ne contient que 7 beta-turns , dont 2 seulement dans son extrémité N-terminale.

L'expression mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ss-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline signifie
- délétion des 4 acides aminés formant le p-turn, ou
- mutations ponctuelles d'un ou plusieurs de ces 4 acides aminés, notamment mutation de la proline responsable du repliement à 1800 de la chaîne polypeptidique, telles que la probabilité d'avoir un p-turn est inférieure à 0.8 selon l'algorithme de Chou et Fassman.

A titre d'exemple, la proline est avantageusement remplacée par l'isoleucine, la valine ou l'alanine.

Comme souches appropriées de MLV écotrope, on peut citer la souche
Moloney MLV, Friend MLV (23).

Comme souches appropriées de MLV amphotrope, on peut citer la souche 4070A (16).

Comme souches appropriées de MLV MCF, on peut citer la souche MLF
MCF 247 (9).

Comme souches appropriées de GALV, on peut citer la souche Seato (Delassus et al., 1989, Virology 173 :205-213).

Comme souches appropriées de MLV xénotrope, on peut citer la souche
NZB.IU.6 (15).

Comme souches appropriées de FeLV, on peut citer FeLV-C-SARMA
FSC (21).

Comme souches appropriées de MLV 10A1, on peut citer (Ott et al., 1990 (16)).

L'expression "améliorer le caractère fusogénique" signifie que l'enveloppe rétrovirale améliorée de l'invention possède une capacité mesurable, par rapport à l'enveloppe parentale, à mieux accomplir les étapes post-liaison du processus d'entrée viral et consistant in fine à la fusion moléculaire des membranes virales et cellulaires.

L'amélioration du caractère fusogénique peut se mesurer selon l'un ou l'autre des deux tests suivants
- test de formation de syncytia après coculture entre des cellules cibles, exprimant le récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison de la glycoprotéine mutée ou chimère, et des lignées cellulaires préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines,
- test d'infection de cellules cibles, exprimant le récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison de la glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ces récepteurs (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale non mutée et par moins de 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale chimère ou mutée ; ces valeurs étant données comparativement au titre infectieux des virus comportant les enveloppes parentales et parentale chimère ou mutée sur des cellules XC dans des conditions définies dans le tableau IB de l'exemple.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope est celle représentée à la figure 7.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope est celle représentée à la figure 8.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF est celle représentée à la figure 9.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un GALV est celle représentée à la figure 10.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 est celle représentée à la figure 11.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope est celle représentée à la figure 12.

La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un FeLV est celle représentée à la figure 13.

Par séquence riche en proline d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, on entend également celle comportant des mutations, suppression ou addition d'acides aminés telle qu'il n'y ait pas modification de l'enchaînement des B-burn
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation telle que définie ci-dessus d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.

Par domaine fonctionnel , on définit toute séquence polypeptidique individualisée sur le plan structural et capable d'accomplir une fonction biologique déterminée.

Par domaine de liaison , on définit le domaine fonctionnel porté par la partie N-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable de se lier au récepteur rétroviral. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 31 à 237 de la séquence peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope.

Par domaine C , on définit on définit le domaine fonctionnel porté par la partie C-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d'interagir avec la sous-unité TM. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 300 à 458 de la séquence peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope.

Par domaine TM , on définit le domaine porté par l'ectodomaine de la sous-unité TM de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d'interagir avec la sous-unité SU et d'accomplir la fusion entre membranes virales et cellulaires lors du processus d'entrée rétroviral. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 459 à 592 de la séquence peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope.

Le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous-unité transmembranaire peuvent être modifiés de manière à altérer leurs capacités fonctionnelles en vue
- d'interagir avec d'autres molécules, telles que des molécules de surface (antigènes, récepteurs de facteurs de croissance, etc.), par le biais de l'insertion de peptides ou de domaines protéiques présentant une affinité pour ces molécules,
- de renforcer la stabilité de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale,
- d'augmenter la capacité fusiogène de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale.

L'invention concerne notamment l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un
MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV,
laquelle séquence riche en proline correspond
- soit à la séquence riche en proline
de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope,
et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un p-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,
- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

L'invention concerne également, à titre de produit nouveau, une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un
MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 p-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

On définit par partie C-terminale la séquence d'acides aminés correspondant à la deuxième moitié de la région riche en proline.

L'invention concerne également une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie
N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 ss-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

On définit par partie N-terminale la séquence d'acides aminés correspondant à la première moitié de la région riche en proline.

L'invention concerne également les protéines mutées contenant une séquence riche en proline et dans l'enchaînement desquelles la séquence riche en proline est mutée de telle sorte qu'il y a suppression d'au moins un p-turn.

Plus précisément, l'invention concerne une protéine mutée correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un p-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

Cette protéine mutée présente par rapport à la protéine non mutée correspondante la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.

L'invention concerne également les protéines chimères contenant une séquence riche en proline dans l'enchaînement desquelles la séquence riche en proline est remplacée par la séquence riche en proline homologue de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV écotrope.

Plus précisément, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

Cette protéine chimère présente par rapport à la protéine d'origine correspondante la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.

Dans les groupes respectifs des protéines mutées ou chimères telles que définies ci-dessus, il peut également y avoir remplacement de l'un au moins de leurs domaines fonctionnels par le domaine fonctionnel homologue de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un
MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle:
* le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope,
* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.

Cette protéine chimère présente la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un
MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle
* le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un p-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline),
* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.

Cette protéine chimère présente la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.

Les protéines mutées ou chimères de l'invention présentent avantageusement l'une au moins des propriétés suivantes
- il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules cibles exprimant une molécule de surface servant de récepteur rétroviral par interaction avec le domaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de
MLV (ou de rétrovirus de mammifères de type C ou des lentivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines de l'invention,
- il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère de l'invention, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur (c'est-àdire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère ou mutée de l'invention, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC, dans les conditions d'infection telles que définies dans les exemples et notamment à propos du tableau 1B ci-après.

On dispose donc notamment de deux tests permettant de caractériser les protéines mutées ou chimères de l'invention.

L'un de ces tests est la formation de syncytia entre des cellules cibles et des lignées cellulaires préalablement transfectées par un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines chimères ou mutées de l'invention (et susceptibles de reconnaître un récepteur rétroviral situé sur lesdites cellules cibles).

Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de souris SC1, Mus
Duni, les cellules humaines TE671, ainsi que les cellules de rat XC.

Les lignées cellulaires utilisées peuvent produire ou non des particules
Gag-Pol de MLV.

Les lignées cellulaires peuvent produire ou non des particules Gal-Pol de
MLV ou d'autres rétrovirus de mammiferes de type C, notamment le virus MLV de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des lentivirus, par exemple HIV-1.

Un autre test de caractérisation des protéines mutées ou chimères de l'invention consiste à infecter des cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral susceptible d'être reconnu par une protéine chimère ou mutée de l'invention, par l'intermédiaire de particules virales contenant ces protéines chimères ou mutées.

Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de rat XC et XC-A-ST, ces dernières étant dérivées des cellules XC par transfection d'un plasmide exprimant le domaine de liaison de l'enveloppe rétrovirale amphotrope capable d'occuper le récepteur rétroviral amphotrope.

Comme particules virales, on peut utiliser celles produites par les rétrovirus MLV ou autres rétrovirus de mammifères de type C, notamment le virus MLV de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des lentivirus, par exemple HIV-1.

Cette infection est effectuée dans des conditions limitantes, c'est-àZire telles que la densité du récepteur (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une glycoprotéine d'enveloppe ni mutée, ni chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe mutée ou chimère de l'invention correspondant à la susdite enveloppe ni mutée, ni chimère.

La comparaison est effectuée par rapport au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non chimère et non mutée ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles telles que des cellules XC.

Cette infection est comparativement effectuée sur deux types cellulaires, le deuxième étant directement dérivé du premier et a pour effet de réduire le nombre de récepteurs rétroviraux disponibles, c'est à dire telle que la diminution de l'expression de surface du récepteur diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale ni mutée, ni chimère.

On compare alors cette valeur à celle obtenue pour des virus comportant l'enveloppe chimère ou mutée. Une diminution de moins de 100 des titres infectieux des virus comportant la susdite enveloppe chimère ou mutée entre les deux types cellulaires indique donc une amélioration du caractère fusogénique de cette dernière.

Des séquences riches en proline avantageuses selon l'invention correspondent à l'une des séquences suivantes
A2
A3
A3Mo
A4
C2
C3
C4
C5
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence A2 comporte la suppression du deuxième p-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test de syncytia.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence A3 comporte la suppression du troisième p-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test de syncytia.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence A3Mo comporte la suppression du troisième ss- turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence A4 comporte la suppression du quatrième ss-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence C2 comporte la délétion des p-turns 9 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence C3 comporte la délétion des ss-turns 1 1 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence C4 comporte la délétion du dernier p-turn (13 ) qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.

Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence C5 comporte la délétion des 11" et 12" p-turns qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.

Des protéines chimères avantageuses selon l'invention, correspondent à ltune des séquences suivantes
- PROMO
- PROFR
- BD PRO MO
- PROCMO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO
La séquence PROMO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope (souche Moloney).

La séquence PRO FR correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope (souche Friend).

La séquence BD PRO MO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine de liaison a été remplacé par le domaine de liaison homologue du MLV écotrope.

La séquence PRO CMO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine C a été remplacé par le domaine C homologue du MLV écotrope.

La séquence PRO TM MO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine TM a été remplacé par le domaine TM homologue du MLV écotrope.

La séquence PRO CTM MO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle les domaines respect

Des protéines chimères avantageuses selon l'invention comportent l'une des séquences riches en proline correspondant à l'une des séquences suivantes
A2
A3
A3Mo
A4
C2
C3
C4
C5 et sont telles que l'un au moins de leurs domaines fonctionnels suivants: domaine de liaison, domaine C, domaine transmembranaire, est remplacé par le domaine homologue de MLV écotrope.

On montre dans le cadre de la présente invention que la région riche en proline (PRR) de l'enveloppe des virus de leucémie murine (MLV), localisée entre le domaine de liaison au récepteur de la partie amino terminale de la SU et le domaine d'interaction avec la TM de la partie carboxy-terminale de la SU, sert d'intermédiaire dans les changements de conformation de l'enveloppe et dans l'activation de la fusion. De plus, on montre que les beta-turn potentiels de la région riche en proline déterminent la stabilité de l'association SU-TM et le seuil d'activation de la fusion cellulecellule et de la fusion virus-cellule.

Afin d'identifier la (ou les) région(s) responsable(s) de la plus grande fusogénicité de l'enveloppe écotrope des MLVs, on a généré une série d'enveloppes chimères dans lesquelles les domaines d'enveloppes amphotropes
BD, PRO, C et TM sont échangés avec leur homologue de l'enveloppe écotrope (Fig 1B). Les enveloppes résultantes sont alors identifiées selon le(s) domaine(s) écotrope(s) substitué(s). La fusion cellule à cellule est évaluée par la formation de syncytia après une coculture de 24 heures entre différentes cellules cibles (indicatrices) et des lignées cellulaires, produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (5), préalablement transfectées avec l'une ou l'autre des enveloppes.

Bien que le niveau d'expression à la surface cellulaire des enveloppes parentales et chimères soient similaires (Fig. 4A), deux phénotypes différents de fusion cellules-cellules sont observés. Les enveloppes CMO et TMMO, tout comme l'enveloppe sauvage MLV4070A, induisent faiblement des syncytia.

Cependant, les enveloppes BDMO, PROMO et PROFR induisent fortement la formation de syncytia, similaires à ceux induits par l'enveloppe écotrope. (Fig 2). La formation de syncytia n'est pas affectée par la présence ou le manque de particules Gag-Pol (données non montrées), montrant que la fusion mesurée dans ce test se produit par des contacts directs cellulescellules plutôt que des contacts cellulaires médiés par les particules virales. Des comptes rendus antérieurs indiquent que la fusogénicité élevée de l'enveloppe BDMO est due principalement à sa capacité à interagir avec le récepteur écotrope (18).

Cependant, une importante fusogénicité est également observée avec les chimères portant le domaine BD amphotrope (Figs. 1 et 2) avec tous les types cellulaires utilisés, incluant les cellules cibles de rat, de souris et d'homme, présentant en plus ou non le récepteur écotrope (données non montrées). Ainsi, les différences observées, lors de la formation de syncytia, entre les enveloppes amphotropes parentales et chimériques sont dues à des nouvelles propriétés, différentes de l'interaction du BD avec le récepteur.

Comme décrite pour les virus de leucémie féline (8) et comme suggérée par l'étroite apparenté avec les MLV, la répétition régulière de proline dans la PRR entraine peut-être son repli en hélice poly-proline à "beta-turn (27), une structure secondaire qui exerce des forces "élastomériques", pouvant remplir la fonction de "ressort moléculaire" (26). A cause de la localisation critique de la PRR, entre les domaines BD et C qui influencent tous deux la fusion, son rôle dans la fusion a été évalué directement. Des différences dans le nombre et l'arrangement des "beta-turn" prédits dans la PRR des enveloppes 4070A, par rapport à celle du MoMLV, laissent prévoir un ressort plus réactif pour ce dernier ce qui pourrait expliquer la fusogénicité accrue du PROMO. Les mutants ponctuels ou de délétion, C2, C3, C4 et C5, conçus pour supprimer certains des sept "beta-turn" carboxy-terminaux de la PRR amphotrope, ont été testés dans le test de fusion cellulecellule XC. Ils se sont avérés faiblement fusogéniques comme l'enveloppe parentale amphotrope (Fig. 3B). Les "beta-turn" induits par les prolines de la PRR sont moins entremêlés dans la partie amino-terminale que dans l'extrémité carboxy terminale. Ainsi, chacun des quatre "beta-turn" potentiel de l'enveloppe 4070A ont pu être supprimés individuellement par substitution d'une proline par une valine, une alanine ou une isoleucine, donnant les mutants Al, A2, A3, A3MO et A4 (Fig. 3C). Un second acide aminé a été substitué dans les mutants A2 et A3 afin d'éviter la formation d'hélice alpha ou de feuillet beta potentiels, absent à l'origine dans les prédictions de structure de la PRR des MLV (non montré). Les enveloppes Al et A4, pour lesquelles, respectivement, le premier ou le quatrième "beta-turn" amino terminal a été muté, conservent une répétition régulière de trois "beta-turn" contigus et elles n' induisent pas une formation de syncytia augmentée (Table 1). Par opposition, les enveloppes A2 et A3 dans lesquelles la continuité de ces "beta-turn" est interrompue (Figs. 3C et 3D), sont très fusogéniques (Tableau 1), démontrant ainsi l'importance critique des "beta-turn" contigus de la PRR dans la "médiation" de la fusion suite à la reconnaissance du récepteur. Dans le but de tester si cette fusogénicité accrue était due à un besoin inférieur en molécule Pit-2, on a comparé la fusion cellulecellule en utilisant des cellules XC ou XC-A-ST. Dans ces dernières, l'expression constitutive de BD amphotrope réduit la quantité de récepteur Pit-2 fonctionnel (Tableau 1).

L'interférence est efficace envers l'enveloppe MLV4070A alors qu'une fusogénicité élevée est toujours observée avec les enveloppes PROMO, PROPR, A2 et A3.

Néanmoins, la fusion est toujours dépendante de Pit-2 puisque des cellules CHO n'exprimant pas Pit-2 fusionnent seulement après l'expression de novo de Pit-2 (non montré). Ainsi, des mutations dans les "beta-turn" de la PRR semblent abaisser le seuil d'activation de la fusion prenant part après la reconnaissance du récepteur.

Après la fusion cellulecellule, on a examiné la fusion cellule-virus en comparant l'infectivité des virions portant l'enveloppe parentale ou chimère. Les titres sont équivalents sur les cellules de rat XC (Tableau 1), de souris, d'homme et sur les
CHO transfectées avec le gène d'expression du récepteur Pit-2. De manière surprenante, les chimères hautement fusogéniques PROMO et PROFR, ainsi que les mutants ponctuels A2 et A3 ont conduit à des titres indétectables ou significativement réduits sur toutes les cellules testées. Les autres enveloppes, confèrent des titres dans une gamme de 10e6-10e7 unités infectieuses par ml (u.i./ml) sur les cellules XC, similaires à ceux obtenus avec les deux enveloppes parentales 4070A et MO. Bien que l'infectivité des virions générés avec l'enveloppe amphotrope parentale soit dramatiquement réduite sur les cellules XC-A-ST, tous les mutants de la PRR infectieux, à l'exception du Al, sont significativement moins sensibles à l'interférence (Tableau 1). Le fait que les mutants de la partie carboxy-terminal de la PRR n'exhibent pas de modification dans la fusogénicité cellule-cellule mais montrent néanmoins une augmentation de l'infectivité (fusion virus-cellule), démontre que les motifs amino, mais aussi carboxy terminaux, influencent la fusogénicité. Les tests de liaisons aux récepteurs, effectués en utilisant un anticorps dirigé contre la SU, montrent que l'affinité Pit-2/SU n'est pas significativement altérée pour ces enveloppes (non montré). L'infection de CHO transfectées exprimant Pit-2, par opposition au défaut d'infection des CHO parentales, confirme la nécessité de Pit-2 pour l'entrée des virions.

Puisque la faible infectivité des virions portant les enveloppes mutantes fusogènes en tests cellulescellules est due à une perte de SU accrue (Fig. 4), la PRR paraît jouer un rôle critique dans l'association SU/TM et la conformation de l'enveloppe. Le relargage accru de SU, pour les mutants PROMO, PROFR, A2 et A3, suggère que la PRR exerce sa fonction de régulation de la fusion en interagissant avec des régions adjacentes, et que la destruction de ces interactions stimule la fusion. La combinaison de PRR écotropique avec des régions homologues avales, comme dans les chimères PROCMO, PROTMMO et PROCTMMO, ou avec le domaine amont
BD, comme pour l'enveloppe BDPROMO (Fig. 1C), augmente la stabilité, comme estimé avec la perte de SU (non montré) (Fig. 1).

Finalement, on démontre qu'après la reconnaissance du récepteur, PRR est un déterminant clef des changements de conformation de l'enveloppe et de la fusion membranaire. De plus, l'arrangement caractéristique des "beta-turn" de la PRR en association avec les domaines avals C et TM, confere des propriétés distinctes entre ces enveloppes MLV.

Les applications potentielles de l'invention sont les suivantes
- thérapie génique ex vivo ou in vivo pour le transfert de gène dans des cellules exprimant un nombre limité de récepteurs rétroviraux, par les vecteurs rétroviraux dérivés des rétrovirus de type C, mammifères ou des lentivirus comportant:
des glycoprotéines d'enveloppe mutées ou chimères comme décrites
dans l'invention,
des glycoprotéines d'enveloppe mutées ou chimères comme décrites
dans l'invention, ainsi qu'un peptide ou un domaine protéique capable de
rediriger la liaison du vecteur rétroviral vers une cible moléculaire
spécifique.

I. Légendes des figures
Figs. 1A, 1B, 1C et 1D : Représentation schématique des enveloppes chimères et de leurs propriétés.

Fig. 1A. Les boites vides sont des séquences dérivées du MLV amphotrope, les boites remplies sont des séquences issus du MLV écotrope de Moloney (noire) ou
MLV écotrope de Friend (grise) et les boites hachurées sont des séquences communes à ces deux MLV. BD, domaine de liaison au récepteur; PRO, région riche en proline;
C, domaine carboxy terminal de la SU; TM, ectodomaine et domaine d'ancrage de la sous unité TM. Pour chaque domaine, leur pourcentage d'identité, ainsi que les quatre premiers acides aminés N-terminaux, sont indiqués. Un codon stop prématuré (flèche verticale) est introduit dans la queue cytoplasmique de la sous unité TM du MLV amphotrope pour générer la glycoprotéine d'enveloppe mutante fusogénic ARless.

Fig. 1B. Les mutants de simple substitution.

Fig. 1C. Les mutants de substitution combinés.

Fig. 1D. Les résultats des tests de fusion cellulecellule: (-), absence de syncytia; (+), présence de syncytia seulement dans une coculture avec les cellules
XC; (+ +), présence de syncytia à la fois dans une coculture avec des cellules de rat
XC mais aussi avec des cellules interférentes XC A-ST. Les résultats des tests d'infection: (-), moins de 10e2 lacZ u.i./ml; (+) et (+ +), plus de 10e2 lacZ u.i./ml; (+ +); enveloppes avec un seuil d'activation de la fusion réduit, capables d'efficacement infecter les cellules interférentes XC-A-ST avec un titre supérieur à 10e2 lacZ u.i./ml.

Fig. 2: Tests de fusion des mutants de simple substitution avec des cellules XC.

Des cellules TE671 transfectées avec les vecteurs d'expression des glycoprotéines d'enveloppe chimères indiquées (Fig 1) sont cocultivées avec des cellules indicatrices XC pendant 24 heures. Grossissement x250.

Figs. 3A, 3B, 3C et 3D : Mutagenèse de la région riche en proline amphotrope 4070A.

Fig. 3A : Alignement de la PRR du MLV de Moloney (Mo), de Friend (Fr) et 4070A (A).

Fig. 3B : Mutants ponctuels (acides aminés en petits caractères gras) ou de délétion (tirets) de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV 4070A.

Fig. 3C : Mutants ponctuels de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV 4070A. Les acides aminés changés ou insérés sont mis en évidence en petits caractères gras.

Fig. 3D : Profils de probabilité des "beta-turn" des PRR des MLV 4070A (4070A), Moloney (Moloney) et des mutants ponctuels de la PRR du MLV 4070A dont le deuxième (A2) ou troisième (A3) bêta turn a été supprimé. Les valeurs de l'axe y représente la probabilité de beta-turn p(turn)*10e4 pour chaque résidus du peptide (sur l'axe x). L'analyse des beta-turn a été effectué grâce au logiciel PC/Gene (Version 6.26, IntelliGenetics, Belgium).

Fig. 4 : Immunoblots des glycoprotéines d'enveloppe amphotrope dont la fusogénicité est augmentée. Les cellules ont été transfectées avec les enveloppes indiquées dans les Figs 1 et 3 et l'expression de leur SU et de leur précurseur d'enveloppe (PR) est estimée (cell lysates). L'instabilité de l'enveloppe est montrée par l'expression de surface diminuée de la SU relativement au PR (préparations de membrane), son relargage de la SU (shedding) accru dans le milieu de culture (surnageant) et dans les virions. Les transferts de protéine (western blots) ont été révélés avec les anticorps indiqués.

Fig. 5 : elle représente la séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV écotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche Moloney).

Fig. 6 : elle représente la séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV amphotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche 4070A).

Fig. 7 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de Mo MLV (Moloney MLV).

Fig. 8 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de 1 'enveloppe rétrovirale de MLV4070A.

Fig. 9 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-MCF (souche 247).

Fig. 10 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de GALV, souche Seato.

Fig. il : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV 10A1.

Fig. 12 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV xénotrope, souche NZB.1.V6.

Fig. 13 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de FeLV A.

Fig. 14 : elle représente la séquence de A2.

Fig. 15 : elle représente la séquence de A3.

Fig. 16 : elle représente la séquence de A3Mo.

Fig. 17 : elle représente la séquence de A4.

Fig. 18 : elle représente la séquence de C2.

Fig. 19 : elle représente la séquence de c3.

Fig. 20 : elle représente la séquence de C4.

Fig. 21 : elle représente la séquence de C5.

Fig. 22 : elle représente la séquence de PROMO.

Fig. 23 : elle représente la séquence de PRO FR.

Fig. 24 : elle représente la séquence de BD PRO CMO.

Fig. 25 : elle représente la séquence de PRO CMO.

Fig. 26 : elle représente la séquence de PRO CTM MO.

Fig. 27 : elle représente la séquence de PRO TM MO.

Tableau 1:
A. Résultats des tests de fusion cellule-cellule.
enveloppe index de fusionaexprimée
à la surface XC XC-A-ST
b 0,02#0,01 0,02#0
MOC 1512 1411
Ad 0,2#0,1 0,05#0,02
ARLesse 74+4 0,8510,03
PROMOC 17+3 16#3
PROFRC 1813 23+6
A2c 13i1 17+1
A3c 1411 17+3
a : index de fusion calculé selon la formule
(N-S)/T (N, nombre de noyaux dans les syncytia ; S, nombre de syncytia
T nombre total de noyaux)
b : cellules non transfectée.
c: syncytia contenant plus de 20 noyaux
d : syncytia contenant moins de 4 noyaux
e: syncytia contenant plus de 40 noyaux avec les cellules XC et moins de 10 noyaux avec les cellules XC A-ST.

B. Résultats des tests d'infection. enveloppe Titres infectieuxa exprimée sur niveau les virions XCXC-A-ST d'interférence
MO 7.1x106 6.1x106 1
A 1x107 6.4x103 1,369
PROMO 2.2x101 1x10 na
PROFR < 1x10' < 1x10' na
A1 8.4x106 2.3x10 3,138
A2 < 1x10' < 1x10' na
A3 7.8x10' 3x10' na
A3MO 1.2x107 3.3x104 302
A4 5.7x106 8.1x10 605
C2 7.6x106 5.7x105 11
C3 5 4x106 4.7x16 10
C4 2.4x106 1.7x16 12
C5 9.4x106 2.7x104 299 a : lacZ unités infectieuses par ml (u.i./ml) b : les niveaux d'interférence sont calculés selon la formule
(titre[XC]/titre[XC-A-ST]) X (titre MO [XC-A-ST]/titre MO[xc]) na : non applicable
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. Lignées cellulaires.

Les cellules TELacZ contiennent le vecteur rétroviral MFGnlsLacZ (25) responsable de l'expression d'une Beta-galactosidase nucléaire. La lignée cellulaire
TELCeB6 (5) dérive de la lignée TELacZ et a été obtenue par transfection d'un plasmide exprimant les protéines gag et pol de MoMLV. Ces cellules produisent donc des particules rétrovirales non infectieuses, car dépourvues d'enveloppes, véhiculant le gène marqueur nlsLacZ.

Les cellules TELCEB6, XC, RD et CEAR13 (12) sont cultivées en milieu
DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS,
Life-Technologies). Le milieu de culture des CEAR13 est de plus supplémenté avec de la proline (Sigma) à 10 ,ug/,ul. La lignée NIH3T3 (ATCC CRL 1658) est cultivée en milieu DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveauné (Life-Technologies).

Les cellules XC-A-ST ont été obtenues par transfection stable dans les cellules XC du plasmide pA-ST (5) exprimant le fragment N-terminal de la SU du virus MLV4070A capable de lier et bloquer le récepteur amphotrope.

II.2. Plasmides et construction des mutants.

Les plasmides codant pour les enveloppes amphotrope 4070A (FBASALF) (5), écotrope de Moloney (FBMOSALF) et écotrope de Friend C57 (FB3) permettent l'expression de l'enveloppe. Les gènes d'enveloppe sont sous le contrôle du LTR (5) du MLV de Friend FB29. De plus ces plasmides contiennent le gène marqueur phléo, permettant la sélection par la phléomycine.

Pour générer les diverses constructions d'enveloppes mutantes, une technique de mutagenèse par PCR a été utilisé.

Pour la construction Rless (20), un fragment d'ADN a été obtenu par PCR (amplification par polymérase en chaîne) sur l'enveloppe MOMLV (23) au moyen des oligonucléotides OURLess 5'-TTC TAT GCG GAC CAC ACA GGA et OLRLess 5'
ATC TCA GTA GTC CAG GCT TTA TGA TAG TCG ACA TGC AT. Après digestion par les enzymes SpeI et AccI, ce fragment a été sous-cloné entre les sites
SpeI et ClaI du plasmide FBMOSALF. Un fragment NdeI/ClaI a alors été retiré de ce dernier plasmide, et a été remplacé par NdeI/ClaI provenant du vecteur FBASALF. Il en résulte un vecteur d'expression pour une enveloppe amphotrope contenant un codon stop prématuré quelques nucléotide en amont du codon stop normal. Cette modification réduit la longueur de la partie cytoplasmique de la glycoprotéine amphotrope et suffit à la rendre très fusogénique et inductrice de syncytia en culture cellulaire (20).

Pour la construction des enveloppes chimères PROMO et PROFR, un fragment PCR correspondant à la région riche en proline des enveloppes des virus
Moloney-MLV (MO) et Friend-MLV (FR), avec un site ApaI et un site KpnI créés au début et à la fin de cette région ont été généré grâce aux nucléotides : Up MO ApaI 5'-CCA ATA GGG CCC AAC CCC GTT CTG et Low MO KpnI 5'-AAC GTG GTA
CCC GCC GGT GGA AGT TGG G pour la PCR sur le plasmide FBMOSALF; Up
FRA paI GTC CCG ATA GGG CCC AAC CCC GTC CTG et Low FR KpnI GAA TGC GGT ACC TGC TGG CGG GGG CTG AGT GGG pour la PCR sur le plasmide
FB3. Les fragments digérés ApaI/KpnI sont clonés entre les sites ApaI (position 653) et BarnHI (position 802) de l'enveloppe 4070A à l'aide d'un fragment adaptateur KpnI/BamHI généré par PCR sur le plasmide FBASALF à l'aide des oligonucléotides
Up A KpnI 5'-TATGCGGTACCGGAGATAGACTACTAGCTC et Low A BamHI 5'-GGTAGTAGGATCCTGAGCCGG. Les autres enveloppes chimères ont été générées à l'aide des enveloppes décrites ci dessus par sous clonage de différents fragments. Le plasmide FBASALF a été ouvert en XhoI-ClaI et cet ADN a été utilisé pour cloner les fragments : (i) XhoI-Draffl de l'enveloppe PROMO et le fragment Draffi-Clal de l'enveloppe MO, générant l'enveloppe PROCTMMO; (ii) NcoI-ClaI de l'enveloppe MO, co-ligué avec un fragment adaptateur XhoI-NcoI de l'enveloppe A, générant l'enveloppe TM MO; (iii) XhoI-NcoI de l'enveloppe MO grâce à un fragment NcoI-ClaI de l'enveloppe A, générant la chimère PROCMO. La construction
PROTMMO a été obtenue en sous clonant le fragment XhoI-BamHI de l'enveloppe
PROMO dans le vecteur portant l'enveloppe TMMO digéré par les mêmes enzymes.

Enfin, la chimère BDPROMO a été faite en co-ligant le fragment DraE-ClaI de l'enveloppe PROMO dans le plasmide FBMOSALF, digéré par les enzymes BamHI
ClaI, avec un fragment BamHI-DraE de l'enveloppe MO.

Les mutants de la région riche en proline amphotrope ont été générés par la méthode de mutagenèse par PCR. Un oligonucléotide codant ou sens ( upper ) 805 Fc (5'-TCC AAT TCC TTC CAA GGG GC), localisé juste en amont du site Xho
I de l'enveloppe 4070A (à la position 594) (16) a été utilisé en combinaison avec des oligonucléotides fournissant divers sites de restriction (précisés entre parenthèse et dont le site est souligné dans la séquence de l'oligonucléotide) et insérant la mutation souhaitée (les nucléotides ne s'appariant pas sont indiqués par une lettre minuscule)
A2 UpA2 5'-CGA GTC CCC ATA GGG ATC CAA CCG GTA TTA CCC GAC C (AgeI), A3MO LowA3MO 5'- GCCCAACCCAGTGCTAGCCGACCAAAGAC (NheI), A3 P249I/Q251V 5'-CCA GTA TTA atC GAC gtc AGA CTC CCT TC (Aat 11); A4 P254I 5'-GAC CAA AGA CTg ata TCC TCA CCA A (EcoRV); C5
P286I/P289L 5'-CTC AAC CTC Cat TAC tAG TCt AAG TGT CCC AC (SpeI). Les oligonucléotides complémentaires de ces amorces (LowA2 GGT CGG GTA ATA
CCG GTT GGA TCC CTA TGG GGA CTC G; Low A3 GAA GGG AGT CTg
TCG atT AAT ACT GG; LowA3MO GTC TTT GGT CGG CTA GCA CTG GGT
TGG GC; Low A4 TTG GTG AGG Ata tcA GTC TTT GGT C; Low C5 GGC TGT
GGG ACA CTT aGA CTa GTA atG GAG GTT GAG GGT G) ont été utilisés avec l'amorce Low ABamHI s'hybridant au niveau du site BamHI (position 802) de l'enveloppe 4070A. Les deux fragments générés pour chaque mutant sont digérés avec les enzymes adéquates et ils sont ligaturés dans le plasmide FBASALF, digéré en
XhoI-BamHI.

La même stratégie a été utilisé pour les mutants de délétion C2, C3 et C4.

L'oligonucléotide 805Fc, s'hybridant en amont du site XhoI, a eté utilisé avec les oligonucléotides LowA-C4 KpnI: ATC TCC GGT ACC GAC ACT TGG ACT TGT
AGG GGA GGT TGA GGG, LowA-C3 KpnI: ATC TCC GGT ACC TGG GGG AGG GGA GGT TGA GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG, et LowA-C2 KpnI:
ATC TCC GGT ACC TGG GGG GGG TGT ACT GGT AGT GCA AGG GGG GTA
ACT GGT générant, après digestion, des fragments XhoI-KpnI. Chaque fragment est co-ligué avec un fragment KpnI-BamHI, issu de l'enveloppe PROMO, dans le vecteur
FBASALF digéré en XhoI-BamHI.

Les plasmides exprimant les enveloppes sont transfectés par la méthode de précipité au phosphate de calcium (22) dans la lignée TELCeB6. Les cellules transfectées ont été sélectionnées avec de la phléomycine (50 ,ug/ml) et les clones résistants ont été trypsinés en masse. Les cellules à confluence ont été utilisées pour d'une part récupérer des surnageants viraux après une nuit d'incubation dans du milieu normal, et d'autre part pour faire des lysats cellulaires. Les surnageants viraux sont utilisés pour des tests d'infection, des tests de liaison au récepteur, et le reste est soumis à une ultracentrifugation pour obtenir des culots de virus analysés par immunoblot.

II.3. Immunoblot.

Les cellules productrices de virus sont lysées pendant 10 minutes à 4"C dans un tampon Tris-HCl (pH 7,5), contenant du TritonX100 1%, SDS 0,05%, deoxycholate Smg/ml, NaCl 150 mM et un cocktail d'inhibiteur de protéases (PMSF 1 mM, Leupeptin 6 mM, Aprotinin 0,3 mM). Ces lysats sont centrifugés 10 minutes à 10 000 g afin de culotter tous les organites, et les surnageants sont congelés à -80 C jusqu'à l'analyse. Les échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifugation de surnageants viraux (6 ml) dans un rotor SW41 Beckman (30000 rpm, 1 heure, 4"C).

Les culots sont resuspendus dans 80 l de PBS froid (Phosphate Buffered Saline) (tampon phosphate salin), Life-Technologies) et congelés à -80"C. Les échantillons (30 ,ug de lysats cellulaires ou 20 41 de virus purifiés) sont mélangés dans rapport de 5:1 (v/v) à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant 6% de SDS (sodium dodécyl sulfate), 30% beta-mercaptoéthanol, 10% glycérol et 0,06% de bleu de bromophénol, puis dénaturés 3 minutes à 95"C et analysés sur gel dénaturant d'acrylamide 10%/SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose, le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris Base Saline (tampon Tris), pH 7,4) en présence de lait écrémé (5%) et de Tween 0,1%. Les anticorps (Quality
Biotech Inc., U.S.A.) provenant d'antisérum de chèvre dirigés contre la gp70-SU de
Rausher Leukemia Virus (RLV) ou la p30-CA de RLV ont été utilisés aux dilutions de 1:2000 et 1:10000 respectivement. Un anticorps provenant d'un antisérum de lapin dirigé contre la pl5E-TM a été utilisé à la dilution de 1:1000. Les "blots" ont été révélés par utilisation d'un anticorps conjugué, couplé à la peroxydase, d'origine lapin ou chèvre dirigé contre les immunoglobulines de chèvre ou de lapin, respectivement (Dako, U.K.), grâce à un kit de chimioluminescence (Amersham Life Science).

II.4. Tests de liaison au récepteur.

Les cellules cibles sont rincées au PBS et décollées par une incubation de 10 minutes à 37"C dans du versène 0,02% dans PBS. Les cellules sont rincées dans du
PBA (PBS contenant 2% de FCS (sérum de veau foetal) et 0,1% de sodium d'azide qui permet de bloquer l'endocytose membranaire). 106 cellules sont alors incubées pendant 1 heure à 37"C avec les différents surnageants viraux (2 ml) contenant la SU soluble. Ces surnageants sont déchargés des particules virales précipitées par ultracentrifugation ou non. Après deux rinçages par du PBA, les cellules sont incubées en présence d'anticorps monoclonal, de rat ou de souris, dirigés contre la SU (83A25) (6) ou contre la TM (MAb2), respectivement, pendant 45 minutes à 4"C. Les cellules subissent deux lavages dans du PBA puis sont incubées en présence d'anticorps conjugués, fluorescents, dirigés contre les immunoglobulines de rat (Cayla, F) ou de souris (Dako, U.K.), pendant 45 minutes à 4"C. Les cellules mortes sont ensuite contre colorées avec de l'iodure de propidium (20 ,ug/ml) 5 minutes à 4"C. Après deux rinçages dans du PBA, la fluorescenc de différentes dilutions du stock viral en présence de polybrène à 8 yg/ml (un polycation, inhibiteur des répulsions électrostatiques entre les particules virales et les cellules). Après 3 à 5 heures d'incubation à 37"C, les surnageants sont remplacés par du milieu frais et les cellules sont incubées 2 jours à 37"C. Une fois les cellules fixées avec une solution de glutaraldhéhyde, agent pontant, à 0,5% dans du PBS, elles sont colorées à l'aide d'un substrat, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Beta-D- galactopyranoside ou X-Gal, pendant 12 heures. Les titres viraux sont rapportés en nombre de colonies positives par ml de surnageant viral (LacZ i.u./ml).

II.7. Immunoprécipitation.

Une boite de cellules confluantes de diamètre 35 mm est rincé une fois avec du milieu DMEM (milieu de Eagle modifié par Dubelcco) sans méthionine, ni cystéine, supplémenté par 10% de sérum de veau foetal dialysé afin d'enlever les acides aminés, puis incubée 1 h 30 à 37"C dans ce même milieu. Après un marquage de 45 minutes grâce à la méthionine et la cystéine S35 (100 mCi/ml; TranS35-Label,
ICN Pharmaceuticals), les cellules sont lavées, puis incubées à 37"C dans du milieu de culture (chasse). Les cellules sont lysées à différents temps dans une solution à 0,5% NP40, 150 mM Nazi, 20 mM HEPES supplémenté avec 1 mM PMSF pendant 20 minutes à 4"C. Le lysat est centrifugé à 10 000 g et le surnageant congelé à -80"C.

Ces surnageants sont clarifiés grâce à du sérum de chèvre non immun (1/100) et de la
ProtéineA-Sepharose (6MB, Pharmacia) à 4"C pendant 2 heures ou sur la nuit. Après centrifugation, les surnageants sont incubés avec un antisérum de chèvre dirigé contre la gp70-SU de Rausher Leukemia Virus (RLV) à 1/100 ième pendant 1 heure à 4"C.

La protéine A-Sepharose 40% dans du tampon RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% Deoxycholate, 1% TritonlOOX, 0,1% SDS) est ajouté pour 1 heure à 4"C et les complexes sont précipités par centrifugation à 10 000 g pendant 5 minutes. Après trois lavages dans du tampon RIPA, les immunoprécipitats sont séparés sur gel d'acrylamide-12%/SDS. Les protéines sont fixées dans une solution à 25% d'isopropanol et 10% d'acide acétique dans de l'eau et la révélation se fait grâce à un écran P32 PhosphoImager (Biorad).

II.8. Tests de Fusion.

Deux jours après leur transfection, les cellules effectrices portant l'enveloppe sont ensemencées à 20% de confluence. Trois à quatre heures après, trois fois plus de cellules cibles sont ajoutées. La coculture est incubée 24 heures à 37"C puis fixée avec une solution de glutaraldhéhyde à 0,5% dans du PBS. Les noyaux sont tout d'abord colorés grâce à une solution de May-Grünwald (Sigma diagnostics, USA) puis les cytoplasmes avec du Giemsa (Merk, D) dilué au 1/20sème. Le nombre de syncytia sur un centimètre carré est rapporté ou relativisé entre les enveloppes.

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30. White, J. M. 1992. Membrane Fusion. Science. 258:917-924.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.

2. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV,

laquelle séquence riche en proline correspond

- soit à la séquence riche en proline

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV

amphotrope, ou

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF,

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLVlOA1,

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV

xénotrope, ou

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV,

et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un 9-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,

- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

3. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine

C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.

4. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline correspondant à la sequence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.

5. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV,

laquelle séquence riche en proline correspond

- soit à la séquence riche en proline

de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV

amphotrope,

et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un p-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,

- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

6. Séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAl ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un

GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 p-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

7. Séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un

GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie N-terrninale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 ss-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

8. Protéine mutée correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAl ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ss-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

9. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un

MLV écotrope.

10. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle

* le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope,

* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.

11. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle

* le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un p-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline),

* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.

12. Protéine mutée ou chimère selon l'une des revendications 8 à 11, possédant l'une au moins des propriétés suivantes

- il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules cibles exprimant une molécule de surface servant de récepteur rétroviral par interaction avec le domaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de

MLV (ou de rétrovirus de mammifères de type C ou de lentivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines,

- il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée ou non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère ou mutée, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe ni mutée, ni chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC.

13. Séquence riche en proline selon la revendication 6 ou 7, correspondant à ltune des séquences suivantes

A2

A3

A3Mo

A4

C2

C3

C4

C5

14. Protéines mutées en chimère selon l'une des revendications 8, 9, ou 10, correspondant à l'une des séquences suivantes

- PROMO

- PRO FR

- BD PRO MO

- PROCMO

- PRO TM MO

- PRO CTM MO