FR2666813A1 - Procede microbiologique de preparation de l'apolipoproteine aiv humaine ou de derives de celle-ci. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé microbiologigue de préparation de l'apolipoprotéine AIV ou de dérivés par culture d'une bactérie capable d'assurer le maintien d'un plasmide contenant un promoteur, un site de fixation des ribosomes et un gène de structure codant pour ladite protéine précédé d'un codon de démarrage de la traduction. L'invention concerne également les plasmides et cellules hôtes utilisés dans le procédé.
Description
La présente invention concerne un nouveau procédé de synthèse protéique. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé mettant en oeuvre les techniques de manipulations génétiques in vitro, pour obtenir un arrangement de séquences d'acides déoxyribonucléiques permettant la biosynthèse de l'apolipoprotéine AIV humaine ou de ses dérivés par une bactérie.
L'apolipoprotéine AIV (apoAIV) est une protéine constituée de 376 acides aminés, ayant une masse moléculaire de 46 000 daltons. Elle est un composant majeur des chylomicrons sécrétés dans la lymphe, mais elle présente la particularité d'être majoritairement sous forme non associée avec des lipoprotéines dans le plasma (R.B. Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24 52-59). Par ailleurs, l'apoAIV plasmatique est polymorphe, bien que la nature de ce polymorphisme soit encore inconnue (G. Utermann et
Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257 : 501-507). Le rôle physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lecithin-cholesterol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol.Chem., 260 : 2258-2264) et qu'elle peut, comme l'apolipoprotéine AI, interférer avec la fixation des particules de HDL sur les cellules endothéliales aortiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257 4171-4178). Ces deux activités semblent indiquer que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol. Dans ces conditions, l'étude et la caractérisation de cette apolipoprotéine apparaissent très intéressantes dans le but d'élucider les facteurs influençant le transport inverse du cholestérol, et ceci en vue de thérapies nouvelles.
Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257 : 501-507). Le rôle physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lecithin-cholesterol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol.Chem., 260 : 2258-2264) et qu'elle peut, comme l'apolipoprotéine AI, interférer avec la fixation des particules de HDL sur les cellules endothéliales aortiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257 4171-4178). Ces deux activités semblent indiquer que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol. Dans ces conditions, l'étude et la caractérisation de cette apolipoprotéine apparaissent très intéressantes dans le but d'élucider les facteurs influençant le transport inverse du cholestérol, et ceci en vue de thérapies nouvelles.
Dans cette perspective, la possibilité de produire en quantités importantes l'apoAIV constitue une nécessité. Par ailleurs, l'étude et l'obtention de molécules dérivées de l'apoAIV, ayant par exemple une activité stimulatrice de l'afflux du cholestérol cellulaire, prennent tout leur intérêt, notamment si ces molécules peuvent permettre par exemple de ralentir la formation des plaques d'athérome, et donc de diminuer le risque d'incidence d'accidents coronariens.
Jusqu'à présent, l'apolipoprotéine AIV était obtenue par purification à partir de fractions de plasma ou de sérum sanguin (EP 329 605). L'inconvénient de cette méthode réside dans la présence de contaminants et dans l'impossibilité d'obtenir des quantités suffisamment élevées de protéine.
Les recherches en biologie moléculaire, la mise au point des techniques de séquençage de l'ADN (F. Sanger et Coll. 1975, J.
Mol. Biol. 94 : 441 ; A.M. Maxam et W. Gilbert 1977 Prod. Natl.
Acad. Sci. (USA) 74 : 560) qui ont permis de préciser l'organisation fonctionnelle et moléculaire des gènes, et les progrès effectués dans les techniques de construction génétique in vitro, offrent à présent la possibilité de faire synthétiser par un microorganisme, et en particulier une bactérie, une chaîne polypeptidique (voir par exemple F. Gros et Coll. 1979, Sciences de la Vie et Société, Documentation française Ed.).
Aussi, dans le but de remédier à la faible efficacité des systèmes de préparation de l'art antérieur, plusieurs équipes ont cherché à isoler, classer et séquencer le gène de l'apolipoprotéine
AIV. Voir en particulier les travaux de Bogouski et Coll. (Proc.
AIV. Voir en particulier les travaux de Bogouski et Coll. (Proc.
Natl. Acad. Sci 81 : 5021 (1984)).
Pourtant, en dépit de ces travaux et contrairement à d'autres apolipoprotéines telles que l'apoE ou l'apoAII, l'expression de l'apoAIV n'a jamais pu être réalisée par voie recombinante.
Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui constitue l'objet de la présente invention, qu'il est possible de préparer par voie microbiologique des quantités relativement élevées d'apolipoprotéine AIV.
Selon l'invention, il est donc possible de préparer d'importantes quantités d'apoAIV ou de molécules dérivées de l'apoAIV. On entend par molécules dérivées de l'apoAIV, des molécules obtenues à partir de l'apoAIV par modifications structurales, et notamment par mutagénèse dérigée, introduisant des mutations, des délétions ou des substitutions de résidus.
Toujours selon l'invention, il est possible de préparer une protéine dépourvue des contaminants sériques que l'on obtient par purification.
Encore selon l'invention, on obtient une protéine soluble qu'il est possible de purifier sans aucune étape de dénaturation préalable, et sans recours à des extractions par affinité, par exemple vis à vis d'intralipides.
la présente invention a donc pour objet un procédé microbiologique de préparation de l'apolipoprotéine AIV ou de dérivés de celle-ci, selon lequel on cultive une bactérie capable d'assurer le maintien d'un plasmide contenant un promoteur, le site de fixation des ribosomes d'un gène traduit avec efficacité, et la séquence codant pour l'apolipoprotéine AIV humaine ou un de ses dérivés, précédée d'un codon de démarrage de la traduction.
Bien que différents promoteurs connus de l'homme du métier puissent être employés, on préfère utiliser des promoteurs inductibles, et notamment des promoteurs inductibles reconnus par une ARN polymérase spécifique, qui diffère par sa structure et/ou ses propriétés de celle de lthôte choisi. Dans ce cas, la bactérie hôte utilisée contient en outre un gène hétérologue codant pour ladite ARN polymérase spécifique, que ce soit par l'intermédiaire d'un bactériophage défectif intégré, ou directement sur le plasmide utilisé. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, on peut utiliser le système T7, c'est-à- dire un promoteur dérivé d'un gène du bactériophage T7, qui est reconnu spécifiquement par 1'ARN polymérase du bactériophage T7. Le promoteur du gène 10 du bactériophage T7 donne notamment de très bons résultats.
Avantageusement, lorsque ce type de promoteur est utilisé, on ajoute au milieu de culture, peu après l'induction de l'expression, un inhibiteur spécifique du complexe de démarrage de la transcription de la bactérie hôte choisie. Ceci permet de transcrire, à l'exclusion de tout autre, le gène qui est placé sous le contrôle du promoteur ne dépendant pas de la RNA polymérase de l'hôte. Dans ces conditions, la production de protéines de stress, parmi lesquelles la protéase du produit du gène lon, qui pourraient être induites par l'expression d'un gène hétérologue, est empêchée durant toute la phase de production de cette protéine hétérologue.
Parmi les inhibiteurs spécifiques utilisables dans la présente invention, on peut citer certains antibiotiques, et notamment la rifampicine.
D'une manière avantageuse, le procédé de l'invention est mis en oeuvre au moyen d'un bactérie choisie parmi les souches d'E. coli.
L'invention a également pour objet les plasmides contenant un promoteur, le site de fixation des ribosomes d'un gène traduit avec efficacité, et la séquence codant pour l'apolipoprotéine AIV humaine ou un dérivé de celle-ci, précédée d'un codon de démarrage de la traduction. Plus particulièrement, les plasmides selon l'invention contiennent en outre le gène codant pour la RNA polymérase spécifique du promoteur choisi.
Un autre objet de l'invention concerne les bactéries qui contiennent un plasmide de l'invention, et en particulier les bactéries du genre E. coli.
La séquence de l'apoAIV humaine utilisée dans l'invention a été obtenue à partir d'un clone génomique contenant le fragment
KpnI-HindIII de la séquence du gène humain de l'apoAIV, qui contient la fin de l'intron 2, la totalité de l'exon 3 ainsi que la séquence 3' non traduite. Ce clone ne contenait donc pas, en particulier, les deux premiers exons du gène de l'apoAIV humaine (Elshourbagy et coll. J.B.C. (1987) 262:7973).
KpnI-HindIII de la séquence du gène humain de l'apoAIV, qui contient la fin de l'intron 2, la totalité de l'exon 3 ainsi que la séquence 3' non traduite. Ce clone ne contenait donc pas, en particulier, les deux premiers exons du gène de l'apoAIV humaine (Elshourbagy et coll. J.B.C. (1987) 262:7973).
L'invention résulte notamment de la synthèse chimique de l'extrémité 5' de la séquence de l'apoAIV, de sorte que ce fragment synthétique contienne les codons correspondant à la partie de la protéine mature codée par les deux premiers exons du gène humain, et également les premiers nucléotides de la région 5' de l'exon 3 s'étendant jusqu'au site BstEII. L'invention résulte également de la liaison de ce fragment synthétique à un fragment d'ADN contenant le restant de la séquence du gène de l'apolipoprotéine AIV située après le site BstEII, utilisé pour effectuer la jonction au nucléotide près, puis enfin, de la liaison de cette séquence codante à des signaux permettant une expression importante et régulée chez une bactérie.
Une bactérie hôte, telle que E. coli, contenant ces séquences peut conduire, après induction dans des conditions définies, à la production d'un taux d'apolipoprotéine AIV important. Les différentes approches méthodologiques décrites dans cette invention démontrent clairement que le niveau de production de l'apoAIV peut varier de façon considérable selon le procédé utilisé.
L'invention consiste également en la description d'un procédé permettant d'obtenir une accumulation dans la bactérie de quantités très importantes de l'apolipoprotéine AIV sous une forme soluble. Il a en effet été rapporté (R.G. Schoner et Coll. (1985)
Biotechnology 3 : 151-154) que les protéines hétérologues synthétisées à haut niveau chez E. coli se trouvent dans la cellule sous forme d'agrégats insolubles. Selon la présente invention, l'apoAIV est produite sous une forme non agrégée. La demanderesse a également mis au point un procédé permettant de purifier l'apolipoprotéine AIV humaine synthétisée chez E. coli, en utilisant des méthodes rapides et applicables à l'échelle industrielle.
Biotechnology 3 : 151-154) que les protéines hétérologues synthétisées à haut niveau chez E. coli se trouvent dans la cellule sous forme d'agrégats insolubles. Selon la présente invention, l'apoAIV est produite sous une forme non agrégée. La demanderesse a également mis au point un procédé permettant de purifier l'apolipoprotéine AIV humaine synthétisée chez E. coli, en utilisant des méthodes rapides et applicables à l'échelle industrielle.
La présente invention concerne donc également un procédé permettant de purifier dans les conditions natives, c'est à dire sans aucune étape de dénaturation, l'apolipoprotéine AIV humaine produite par voie microbiologique, afin que la protéine ainsi produite possède une structure tridimentionnelle identique à celle de la protéine native d'origine naturelle.
Les étapes de ce procédé sont décrites plus en détail dans la partie D.
Par ailleurs, l'intérêt d'un système d'expression d'une protéine recombinante est, outre les possibilités de pouvoir produire des quantités importantes de la protéine, également de pouvoir créer, exprimer et produire en quantité importante des dérivés de cette protéine, correspondant soit à des variants naturels de la protéine que l'on a pu identifier et caractériser à partir de sérum humain provenant de diverses études cliniques, soit encore à des dérivés totalement originaux. Tous ces dérivés peuvent alors être utilisés directement pour mimer ou antagoniser l'effet de la protéine d'intérêt. Ils peuvent également permettre, par l'étude comparative de leurs propriétés biologiques intrinsèques, de définir et localiser dans la protéine les différents domaines ou segments polypeptiques portant une activité biologique caractéristique de la protéine étudiée.
La présente invention est donc parfaitement applicable à la production de dérivés de l'apoAIV.
Dans ce qui suit seront décrits successivement les constructions et les conditions d'expression du gène de l'apolipoprotéine AIV ainsi que les procédés de purification sous forme active de l'apolipoprotéine AIV produite.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Séquence nucléotidique de l'apoAIV réalisée dans le cadre de la présente invention.
Figure 1 : Séquence nucléotidique de l'apoAIV réalisée dans le cadre de la présente invention.
Figure 2 : Séquence des oligonucléotides utilisée pour préparer la séquence de l'apoAIV.
Figure 3 : Structure et construction du plasmide pXL1697.
Figure 4 : Structure du plasmide pXL1872.
Figure 5 : Structure du plasmide pXL534.
Figure 6 : Structure des plasmides pXL1698 et pXL1699.
Figure 7 : Structure des plasmides pXL1734 et pXL1735.
Figure 8 : Structure du plasmide pXL1867.
TECHNIQUES GENERALES
les techniques classiques de purification de plasmides, de préparation des cellules compétentes pour la transformation par la méthode au CaCl2, sont décrites dans le manuel de laboratoire
T. Maniatis et Coll., Molecular cloning, 1982, Cold Spring Harbor
Laboratory. Les séquences d'ADN ont été déterminées par la méthode de Sanger (Smith A.J.H., 1980, Methods in Enzymol. 65 : 499-559).
les techniques classiques de purification de plasmides, de préparation des cellules compétentes pour la transformation par la méthode au CaCl2, sont décrites dans le manuel de laboratoire
T. Maniatis et Coll., Molecular cloning, 1982, Cold Spring Harbor
Laboratory. Les séquences d'ADN ont été déterminées par la méthode de Sanger (Smith A.J.H., 1980, Methods in Enzymol. 65 : 499-559).
Les protocoles de clonage dans M13 sont décrits (Messing et Coll.
1981, Nucleic Acid Res. 9 : 309-321). Les endonucléases de restriction (New England Biolabs) ont été utilisées selon les conseils du fabricant. Le tampon utilisé pour les ligatures a la composition suivante ; Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 15 mM,
ATP 1 mM, pH 7,5. Le tampon de phosphorylation des oligonucléotides a la composition suivante : Tris-HCl 5 mM, MgCl2 1 mM, DTT 0,6 mM, pH 7,5.
ATP 1 mM, pH 7,5. Le tampon de phosphorylation des oligonucléotides a la composition suivante : Tris-HCl 5 mM, MgCl2 1 mM, DTT 0,6 mM, pH 7,5.
A - SYNTHESE ET ASSEMBLAGE DE LA SEQUENCE CODANTE DE L'APOLIPO
PROTEINE AIV
la séquence nucléotidique du gène de l'apolipoprotéine
AIV décrite dans la présente invention diffère des séquences de cDNA publiées précédemment (voir en particulier la liste des séquences cDNA publiée par C-Y. Yang, Z-W. Gu, I. Chong, W. Xiong,
M. Rosseneue, H. Yang, B. Lee, A.M. Gotto et L. Chan, 1989, B.B.A., 1002 : 231-237). Notamment, la séquence codant pour le peptide signal de la protéine est absente, et, en ammont du premier codon de la protéine mature a été placé un codon de démarrage de la traduction ATG (Figure 1). Celui-ci introduit donc une méthionine surnuméraire en amont de la séquence de la protéine mature, et permet ainsi d'exprimer le gène codant uniquement pour la partie mature de la protéine.
PROTEINE AIV
la séquence nucléotidique du gène de l'apolipoprotéine
AIV décrite dans la présente invention diffère des séquences de cDNA publiées précédemment (voir en particulier la liste des séquences cDNA publiée par C-Y. Yang, Z-W. Gu, I. Chong, W. Xiong,
M. Rosseneue, H. Yang, B. Lee, A.M. Gotto et L. Chan, 1989, B.B.A., 1002 : 231-237). Notamment, la séquence codant pour le peptide signal de la protéine est absente, et, en ammont du premier codon de la protéine mature a été placé un codon de démarrage de la traduction ATG (Figure 1). Celui-ci introduit donc une méthionine surnuméraire en amont de la séquence de la protéine mature, et permet ainsi d'exprimer le gène codant uniquement pour la partie mature de la protéine.
D'autre part, cette séquence nucléotidique de l'apolipoprotéine AIV a été obtenue d'une manière originale par l'assemblage de quatre oligonucléotides, représentés sur la figure 2, qui ont été synthétisés par voie chimique et dont la taille est comprise entre 86 et 107 mer. De plus, on peut remarquer sur la figure 2 que des extrémités cohésives XbaI et EcoRI ont été définies afin de permettre un assemblage en deux étapes de la séquence complète de l'apolipoprotéine AIV.
a - Synthèse des oligonucléotides
Les quatres oligodeoxynucléotides qui ont servi à l'assemblage du gène de l'apolipoprotéine AIV, ont été synthétisés par la méthode des phosphoramidites (L.J. Bride et M.H. Caruthers (1983) Tetrahedron Lett. 24 : 245) au moyen du synthétiseur
Bioresearch (Modèle 8600) selon les conseils des fabricants. Les oligonucléotides ont été purifiés sur gel d'acrylamide 15 %. Leur séquence est donnée à la figure 2.
Les quatres oligodeoxynucléotides qui ont servi à l'assemblage du gène de l'apolipoprotéine AIV, ont été synthétisés par la méthode des phosphoramidites (L.J. Bride et M.H. Caruthers (1983) Tetrahedron Lett. 24 : 245) au moyen du synthétiseur
Bioresearch (Modèle 8600) selon les conseils des fabricants. Les oligonucléotides ont été purifiés sur gel d'acrylamide 15 %. Leur séquence est donnée à la figure 2.
b - Première étape d'assemblage
Les oligonucléotides ont été phosphorylés par traitement avec la T4 DNA kinase. Les oligonucléotides A et C ont été appariés respectivement avec les oligonucléotides B et D dans des conditions stoechiomètriques. L'hybridation des oligonucléotides a été réalisée dans des tubes Eppendorf immergés dans un bécher contenant environ 100 mL d'eau portée à 800C que l'on laisse revenir à la température du laboratoire.
Les oligonucléotides ont été phosphorylés par traitement avec la T4 DNA kinase. Les oligonucléotides A et C ont été appariés respectivement avec les oligonucléotides B et D dans des conditions stoechiomètriques. L'hybridation des oligonucléotides a été réalisée dans des tubes Eppendorf immergés dans un bécher contenant environ 100 mL d'eau portée à 800C que l'on laisse revenir à la température du laboratoire.
Les fragments A-B et C-D ont été ligaturés en présence de
T4 DNA ligase avec la forme réplicative du phage M13mp10 au préalable digérée par les enzymes XbaI et EcoRI.
T4 DNA ligase avec la forme réplicative du phage M13mp10 au préalable digérée par les enzymes XbaI et EcoRI.
La forme réplicative du bactériophage recombinant obtenu appellé pXL1695 (M13mp10ABCD) a servi à transfecter des bactéries TG1 rendues compétentes par la méthode au CaCl2.
Ce réplicon pXL1695 a été purifié, soit sous sa forme d'ADN simple brin et sa séquence a été vérifiée, soit sous sa forme d'ADN double brin réplicative pour la suite des constructions.
c - Deuxième étape d'assemblage
la forme réplicative de pXL1695 (M13mp1OABCD) et un plasmide appellé pXL1694 portant un fragment KnpI-HindIII d'environ 3 kb contenant la totalité du troisième exon du gène de l'apoAIV (N.A. Elhourbagy, J. Biol. Chem., 1987, 262 : 7973-7981) ont été respectivement digérés par XbaI et BstEII d'une part et EcoRI et
BstEII d'autre part. Dans le cas de pXL1695, un fragment de 167 paires de bases a été purifié sur gel d'acrylamide. La forme réplicative du vecteur M13mp18amIV a été digérée par XbaI et EcoRI et un fragment d'environ 7 kb a été purifié sur gel d'agarose.
la forme réplicative de pXL1695 (M13mp1OABCD) et un plasmide appellé pXL1694 portant un fragment KnpI-HindIII d'environ 3 kb contenant la totalité du troisième exon du gène de l'apoAIV (N.A. Elhourbagy, J. Biol. Chem., 1987, 262 : 7973-7981) ont été respectivement digérés par XbaI et BstEII d'une part et EcoRI et
BstEII d'autre part. Dans le cas de pXL1695, un fragment de 167 paires de bases a été purifié sur gel d'acrylamide. La forme réplicative du vecteur M13mp18amIV a été digérée par XbaI et EcoRI et un fragment d'environ 7 kb a été purifié sur gel d'agarose.
Les trois fragments on été rassemblés et ligaturés en présence de T4 DNA ligase.
Après transfection de TG1, des clones contenant la forme réplicative appellée pXL1696 ont été obtenus. La séquence codante complète du fragment XbaI-EcoRI ainsi cloné dans pXL1696 a été vérifiée. Ce fragment a ensuite été re-extrait de pXL1696 et ligaturé en présence d'un fragment EcoRI-HindîlI, d'environ 3 kb provenant de pXL1694 et portant en particulier la fin de l'exon 3 du gène de l'apoAIV humaine, et en présence également du vecteur M13mpl9, coupé par les enzymes XbaI et HindIII.
Le vecteur recombinant ainsi obtenu, pXL1697, porte la totalité de la séquence codante de l'apoAIV (1132 bp) ainsi qu'un fragment génomique d'environ 2 kb correspondant à l'intron 3 du gène de l'apoAIV (figure 3).
Une mutagénèse dirigée effectuée avec le kit de mutagénèse Amersham (RPN 1523) à l'aide de l'oligodeoxynucléotide synthétique Su1087 : 5' -GCCCCTTTGGAGAGCTGAGGATCCCCTGGTGCACTGG
CCCCA-3' a permis d'introduire sur pXL1697 un site BamHI immédiatement après le codon Stop (TGA) du gène de l'apoAIV. Le vecteur obtenu, pXL1866, a été coupé par les enzymes XbaI et bamHI et un fragment de 1,15 kb contenant la totalité de la séquence codante de l'apoAIV a été purifié sur gel d'agarose et religaturé dans M13mp18amIV pour donner le vecteur pXL1872 (figure 4).
CCCCA-3' a permis d'introduire sur pXL1697 un site BamHI immédiatement après le codon Stop (TGA) du gène de l'apoAIV. Le vecteur obtenu, pXL1866, a été coupé par les enzymes XbaI et bamHI et un fragment de 1,15 kb contenant la totalité de la séquence codante de l'apoAIV a été purifié sur gel d'agarose et religaturé dans M13mp18amIV pour donner le vecteur pXL1872 (figure 4).
B - CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION DE L'APOLIPOPROTEINE AIV 1 - Isolement des signaux d'expression a - Système Ptrp : ce système comprend
- la région opérateur/promoteur de l'opéron trpLEDCBA d'Escherichia coli qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant modulable par la concentration en tryptophane dans le milieu de culture,
- le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda qui permet un demarrage de la traduction efficace de l'ARN messager, et
- les terminateurs T1 et T2 de l'opéron rrnB qui permettent un arrêt de la transcription du gène situé en amont.
- la région opérateur/promoteur de l'opéron trpLEDCBA d'Escherichia coli qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant modulable par la concentration en tryptophane dans le milieu de culture,
- le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda qui permet un demarrage de la traduction efficace de l'ARN messager, et
- les terminateurs T1 et T2 de l'opéron rrnB qui permettent un arrêt de la transcription du gène situé en amont.
On note que les plasmides contenant le promoteur Ptrp doivent être propagés dans des souches de E. coli contenant le gène répresseur sauvage trpR afin que le promoteur Ptrp ne s'exprime pas de façon constitutive.
b - Système cIts-O/PR : ce système comprend
- la région opérateur/promoteur droite (O/PR) du bactériophage lambda qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant modulable par la présence du produit du gène répresseur cI du bactériophage lambda,
- l'allèle cIts du gène répresseur cI du bactériophage lambda, qui conduit à l'expression d'une protéine thermosensible, permettant donc de produire en fonction de la température une protéine cl fonctionnelle (par exemple à 300C) ou non (par exemple à 420C),
- le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda qui permet un demarrage de la traduction efficace de l'ARN messager, et
- les terminateurs T1 et T2 de l'opéron rrnB qui permettent un arrêt de la transcription du gène situé en amont.
- la région opérateur/promoteur droite (O/PR) du bactériophage lambda qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant modulable par la présence du produit du gène répresseur cI du bactériophage lambda,
- l'allèle cIts du gène répresseur cI du bactériophage lambda, qui conduit à l'expression d'une protéine thermosensible, permettant donc de produire en fonction de la température une protéine cl fonctionnelle (par exemple à 300C) ou non (par exemple à 420C),
- le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda qui permet un demarrage de la traduction efficace de l'ARN messager, et
- les terminateurs T1 et T2 de l'opéron rrnB qui permettent un arrêt de la transcription du gène situé en amont.
Dans ce système, l'expression d'un gène placé sous le contrôle du promoteur O/PR est donc réprimée à basse température (par exemple 300C) et totalement déréprimée à haute température (par exemple à 420C).
c - Système T7 : Ce système comprend
- la région promoteur (PT7) du gène 10 du bactériophage
T7 qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant spécifiquement assurée par l'ARN polymérase du bactériophage T7,
- le gène 1 codant pour l'ARN polymérase du bactériophage
T7 sous contôle du promoteur lacUV5, cloné dans le site BamHI du bactériophage lambda D69, lui même inséré dans le génome de la souche d'E. coli BL21 (F.W. Studier et B.A. Moffat, J. Mol, Biol.
- la région promoteur (PT7) du gène 10 du bactériophage
T7 qui permet une transcription efficace de l'ADN distal en ARN messager, cette transcription étant spécifiquement assurée par l'ARN polymérase du bactériophage T7,
- le gène 1 codant pour l'ARN polymérase du bactériophage
T7 sous contôle du promoteur lacUV5, cloné dans le site BamHI du bactériophage lambda D69, lui même inséré dans le génome de la souche d'E. coli BL21 (F.W. Studier et B.A. Moffat, J. Mol, Biol.
(1986) 189 : 113-130),
- le site de fixation des ribosomes du gène 10 du bactériophage T7 qui permet un demarrage de la traduction efficace de l'ARN messager, et
- le terminateur du bactériophage T7 qui permet un arrêt de la transcription du gène situé en amont.
- le site de fixation des ribosomes du gène 10 du bactériophage T7 qui permet un demarrage de la traduction efficace de l'ARN messager, et
- le terminateur du bactériophage T7 qui permet un arrêt de la transcription du gène situé en amont.
Dans ce système, un gène placé sous le contrôle du promoteur PT7 est donc transcrit en présence de l'ARN polymérase de
T7, qui est elle même exprimée en présence d'un inducteur du promoteur lacUV5, par exemple l'IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside). La présence d'un plasmide (pLysS ou pLysE) codant pour le lysozyme du bactériophage T7 permet en outre de maintenir une meilleure répression du système en absence d'IPTG, par inhibition de l'ARN polymérase de T7.
T7, qui est elle même exprimée en présence d'un inducteur du promoteur lacUV5, par exemple l'IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside). La présence d'un plasmide (pLysS ou pLysE) codant pour le lysozyme du bactériophage T7 permet en outre de maintenir une meilleure répression du système en absence d'IPTG, par inhibition de l'ARN polymérase de T7.
La présente invention concerne également un système d'expression bactérien original en ce sens que l'on ajoute un antibiotique (de la rifampicine) peu de temps après l'induction de l'expression de la protéine d'intérêt. Cet antibiotique inhibe spécifiquement l'ARN polymérase de l'hôte sans affecter l'activité de l'ARN polymérase de T7, et permet donc de transcrire à l'exclusion de tout autre, le gène qui est placé sous contrôle d'un promoteur dépendant de l'ARN polymérase de T7.
2 - Construction des vecteurs d'expression a - exemple 1 : système O/Ptrp
Le plasmide utilisé pour la construction du vecteur d'expression de l'apoAIV est le plasmide "pXL276", utilisé pour la production chez E. coli de la sérum-albumine humaine recombinante (voir brevet EP 198 745).
Le plasmide utilisé pour la construction du vecteur d'expression de l'apoAIV est le plasmide "pXL276", utilisé pour la production chez E. coli de la sérum-albumine humaine recombinante (voir brevet EP 198 745).
Ce plasmide a été digéré par l'enzyme EcoRV puis une délétion a été obtenue par action de l'exonucléase Bal31. Cette délétion couvre une région comprise entre les nucléotides 2442 et 4577 de la séquence de "PXL276", cette région n'étant pas essentielle dans l'expression de l'albumine. Dans cette délétion a été inséré un raccord BamHI (5'-CGCGGATCCGCG-3'). Le plasmide résultant a été appellé "pXL534", représenté sur la figure 5
A partir du plasmide "pXL534" un fragment de 124 paires de bases EcoRI-NdeI portant la séquence O/Ptrp et le site de fixation des ribosomes du gène cII, ainsi qu'un fragment de 3125 paires de bases EcoRI-HindIII portant des régions essentielles à la survie du plasmide et les terminateurs T1 et T2, ont été purifiés.
A partir du plasmide "pXL534" un fragment de 124 paires de bases EcoRI-NdeI portant la séquence O/Ptrp et le site de fixation des ribosomes du gène cII, ainsi qu'un fragment de 3125 paires de bases EcoRI-HindIII portant des régions essentielles à la survie du plasmide et les terminateurs T1 et T2, ont été purifiés.
A partir du plasmide "pXL1697", un fragment d'environ 3 kb NdeI-HindIII portant en particulier la séquence codante de l'apoAIV a également été purifié.
Ces trois fragments ont été ligaturés en présence de T4
DNA ligase. Le plasmide ainsi construit, apellé "pXL1699" est représenté sur la figure 6. Sur ce plasmide, il a été vérifié que la séquence nucléotidique du gène codant pour l'apoAIV est identique à celle attendue.
DNA ligase. Le plasmide ainsi construit, apellé "pXL1699" est représenté sur la figure 6. Sur ce plasmide, il a été vérifié que la séquence nucléotidique du gène codant pour l'apoAIV est identique à celle attendue.
b - exemple 2 : système cIts-O/PR
le plasmide utilisé pour la construction est le vecteur pXL1029, utilisé par ailleurs pour la production de l'IL-1B humaine recombinante et dont la construction a été décrite (G. Jung, P.
le plasmide utilisé pour la construction est le vecteur pXL1029, utilisé par ailleurs pour la production de l'IL-1B humaine recombinante et dont la construction a été décrite (G. Jung, P.
Denèf le, J. Becquart and F.F. Mayaux, Ann. Inst. Pasteur/
Microbiol. (1988) 139 : 129-146). Un fragment EcoRI-NdeI de 1226 bp ainsi qu'un fragment EcoRI-HindIII de 3125 paires de bases provenant tous deux du plasmide pXL1029 ont été ligaturés avec le fragment d'environ 3 kb NdeI-HindIII portant en particulier la séquence codante de l'apoAIV et provenant de pXL1697. Le vecteur obtenu est appellé pXL1698 (figure 6).
Microbiol. (1988) 139 : 129-146). Un fragment EcoRI-NdeI de 1226 bp ainsi qu'un fragment EcoRI-HindIII de 3125 paires de bases provenant tous deux du plasmide pXL1029 ont été ligaturés avec le fragment d'environ 3 kb NdeI-HindIII portant en particulier la séquence codante de l'apoAIV et provenant de pXL1697. Le vecteur obtenu est appellé pXL1698 (figure 6).
c - exemple 3 : système T7
A partir du vecteur pET3a (A.H. Rosenberg et al., Gene (1987) 56 : 125-135) trois différents vecteurs d'expression de l'apoAIV mature ont été construits.
A partir du vecteur pET3a (A.H. Rosenberg et al., Gene (1987) 56 : 125-135) trois différents vecteurs d'expression de l'apoAIV mature ont été construits.
- pXL1734 (figure 7) : Le vecteur pXL1697 a été linéarisé par HindIII, puis ses extrémités cohésives ont été remplies par le fragment de Klenow de la DNA polymérase I d'E. coli (PolIK), le fragment obtenu a de nouveau été coupé par NdeI et un fragment de 3 kb a été purifié puis inséré dans pET3a, lui même coupé par
BamHI, rempli par PoIIK, et recoupé par NdeI. Le vecteur d'expression résultant, pXL1734, contient donc, outre la séquence codante de l'apolipoprotéine AIV, la totalité de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV.
BamHI, rempli par PoIIK, et recoupé par NdeI. Le vecteur d'expression résultant, pXL1734, contient donc, outre la séquence codante de l'apolipoprotéine AIV, la totalité de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV.
- pXL1735 (figure 7) : Le vecteur pXL1697 a été linéarisé par FokI, puis ses extrémités cohésives ont été remplies par le fragment Klenow de la DNA polymérase I d'E. coli (PoIIK), le fragment obtenu a de nouveau été coupé par NdeI et un fragment de 1,3 kb a été purifié puis inséré dans pET3a, lui même coupé par
BamHI, rempli par PoIIK, et recoupé par NdeI. Le vecteur d'expression résultant, pXL1735, contient donc, outre la séquence codante de l'apolipoprotéine AIV, les 160 premières paires de bases de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV.
BamHI, rempli par PoIIK, et recoupé par NdeI. Le vecteur d'expression résultant, pXL1735, contient donc, outre la séquence codante de l'apolipoprotéine AIV, les 160 premières paires de bases de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV.
- pXL1867 (figure 8) : Le vecteur pXL1866 a été coupé par
NdeI et BamHI et un fragment de 1,2 kb a été purifié puis inséré dans pET3a, lui même coupé par BamHI et NdeI. le vecteur d'expression résultant, pXL1867, contient donc la séquence codante de l'apolipoproteine AIV sans aucun fragment résiduel de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV.
NdeI et BamHI et un fragment de 1,2 kb a été purifié puis inséré dans pET3a, lui même coupé par BamHI et NdeI. le vecteur d'expression résultant, pXL1867, contient donc la séquence codante de l'apolipoproteine AIV sans aucun fragment résiduel de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV.
C - PRODUCTION DE L'APOLIPOPROTEINE AIV CHEZ E. COLI 1 - Expression de l'apAIV a - exemple 1 : système O/Ptrp
On utilise par exemple la souche qui dérive de la souche
E. coli B 54125 (collection de l'Institut Pasteur) par transformation avec le plasmide "pXL1699".
On utilise par exemple la souche qui dérive de la souche
E. coli B 54125 (collection de l'Institut Pasteur) par transformation avec le plasmide "pXL1699".
Ce plamide contient le gène fonctionnel de l'apolipoprotéine AIV sous contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane O/Ptrp. l'expression de l'apolipoprotéine AIV est donc déréprimée lorsque la bactérie est cultivée en absence de tryptophane ou en présence d'un analogue tel que l'acide 3-B-indolacrylique (Nichols B.P. et Yanofsky C. (1983) methods in Enzymol.
101 : 155).
On peut procéder de la façon suivante. A partir d'un réisolement récent de la souche E. ColiB (pXL1699) sur milieu solide LB-Ap (Bactotryptone (Difco) : 10 g/l, Extrait de levure (Difco) : 5 g/l, NaCl : 5 g/l, ampicilline : 100 mg/l), on prépare une préculture en milieu liquide synthétique contenant du tryptophane à la concentration de 100 mg/l. Le milieu synthétique est par exemple du milieu M9 contenant du glucose à 0,4 %, des casaminoacides à 0,4 t et de l'ampicilline à 100 mg/l selon Miller
J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour laboratory, New York. La préculture est agitée pendant 16 heures à 370C. Cette préculture est ensuite utilisée pour inoculer au 1/100 un litre du même milieu synthétique ne contenant cette fois plus de tryptophane.La culture de production est agitée dans un erlenmeyer à 370C avec un suivi de la multiplication cellulaire durant le temps nécessaire pour atteindre la fin de la phase exponentielle de croissance (environ 6 heures). La turbidité de la culture est alors comprise entre 3 et 4 unités de densité optique à 610 nm.
J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour laboratory, New York. La préculture est agitée pendant 16 heures à 370C. Cette préculture est ensuite utilisée pour inoculer au 1/100 un litre du même milieu synthétique ne contenant cette fois plus de tryptophane.La culture de production est agitée dans un erlenmeyer à 370C avec un suivi de la multiplication cellulaire durant le temps nécessaire pour atteindre la fin de la phase exponentielle de croissance (environ 6 heures). La turbidité de la culture est alors comprise entre 3 et 4 unités de densité optique à 610 nm.
Une bande de mobilité 46.000 peut être mise en évidence dans les extraits bactériens après électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS par immunodétection avec un serum polyclonal de lapin dirigé contre l'apoAIV humaine, après électrotransfert de ce gel sur une membrane de nitrocellulose. Ce résultat indique que le plasmide pXL1699 permet bien d'exprimer spécifiquement l'apoAIV humaine.
b - exemple 2 : système cIts-O/PR
On utilise par exemple la souche E103S (G. Jung,
P. Denèfle, J. Becquart and J.F. Mayaux, Ann. Inst. Pasteur/
Microbiol. (1988) 139 : 129-146) transformée par le plasmide pXL1698.
On utilise par exemple la souche E103S (G. Jung,
P. Denèfle, J. Becquart and J.F. Mayaux, Ann. Inst. Pasteur/
Microbiol. (1988) 139 : 129-146) transformée par le plasmide pXL1698.
L'expression de l'apoAIV étant dans ce cas sous contrôle du promoteur O/PR, qui est réprimé par le produit du gène cIts qui est thermosensible, on peut donc dans un premier temps faire multiplier les bactéries à une température non permissive pour l'expression de la protéine d'intérêt et ensuite provoquer la dérépression de la production de cette protéine en élevant la température.
En pratique, les bactéries sont cultivées en milieu LB contenant un antibiotique, l'ampicilline, qui permet de sélectionner celles qui contiennent le plasmide d'expression. La culture est maintenue à 300C juqu'à ce que la densité optique atteigne la valeur de 0,5 unités à 610 nm. Les bactéries sont ensuite cultivées à 420C pendant 90 min. La turbidité de la culture est alors comprise entre 3 et 4 unités de densité optique à 610 nm.
Une bande de mobilité 46.000 peut être mise en évidence dans les extraits bactériens après électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS par immunodétection avec un serum polyclonal de lapin dirigé conte l'apoAIV humaine, après électrotransfert de ce gel sur une membrane de nitrocellulose. Ce résultat indique que le plasmide pXL1698 permet bien d'exprimer spécifiquement l'apoAIV humaine.
c - exemple 3 : système T7
On utilise par exemple la souche BL21 DE3 (pLysS) contenant un plasmide d'expression de l'apolipoprotéine AIV sous contrôle du promoteur du gène 10 du bactériophage T7.
On utilise par exemple la souche BL21 DE3 (pLysS) contenant un plasmide d'expression de l'apolipoprotéine AIV sous contrôle du promoteur du gène 10 du bactériophage T7.
Une préculture de nuit en milieu LB contenant de l'ampillicine (100 pg/ml) et du chloramphénicol (50 pg/ml), LBApCm, à 370C, sert à inoculer au 1/100ème la culture de production (même milieu). La culture est agitée à 370C jusqu'à une densité optique (mesurée à 610 nm) de 0,5. On ajoute alors de l'IPTG à la concentration finale de 1 mM et les cellules induites pour l'expression de la RNA polymérase de T7 sont incubées pendant 90 ou 180 min. L'analyse des extraits bactériens par gel d'électrophorèse coloré au bleu de coomassie révèle une accumulation très significative (10-20 % des protéines totales) dans les extraits des cultures de 90 min, d'un polypeptide de 46.000 daltons correspondant à l'apolipoprotéine AIV.En revanche cette protéine est très difficilement mise en évidence dans les échantillons correspondant à 180 min de culture ce qui semble indiquer que la protéine est effectivement produite dans ce système, qu'elle peut s'accumuler pendant la première phase de production mais que cette accumulation induit unie activité protéolytique dans la bactérie, capable alors de dégrader la protéine d'intérêt durant la seconde phase de production.
Pour remédier à ce problème il a été trouvé et c'est également l'objet de cette invention que l'on peut stabiliser la protéine par ajout de rifampicine durant la phase de production.
Les seuls ARNm pouvant alors être néosynthétisés sont ceux qui ne dépendent pas de l'ARN polymérase d'E. coli. On peut ajouter par exemple 20 min après l'ajout de l'IPTG de la rifampicine à des concentrations qui peuvent être comprises entre 50 et 200 pg/ml.
Les cellules qui ne produisent alors plus que le seul ARNm de l'apoAIV à l'exception de tous les autres sont incubées entre 90 et 180 min à 370C
Dans ce cas, l'apoAIV humaine recombinante produite représente de 20 à 30 % des protéines totales produites par la bactérie. De plus la protéine est ainsi accumulée sans dégradation dans la bactérie sous forme soluble.
Dans ce cas, l'apoAIV humaine recombinante produite représente de 20 à 30 % des protéines totales produites par la bactérie. De plus la protéine est ainsi accumulée sans dégradation dans la bactérie sous forme soluble.
2 - Lyse des cellules et récupération de l'apoAIV humaine recombinante
Après la culture de production, les cellules sont collectées puis lysées, par exemple par sonication. A l'échelle du laboratoire, il a été utilisé un sonicateur Branson (modèle B30,
Proscience, France) après avoir concentré 30 fois les cellules dans le tampon PBS (KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na2HPO4 1,25 g/l). Le cassage des cellules est effectué à 40C en mode continu (2 impulsions de 5 minutes). On peut également prétraiter la suspension cellulaire concentrée en présence de Triton X-100 à la température ambiante avant la sonication.
Après la culture de production, les cellules sont collectées puis lysées, par exemple par sonication. A l'échelle du laboratoire, il a été utilisé un sonicateur Branson (modèle B30,
Proscience, France) après avoir concentré 30 fois les cellules dans le tampon PBS (KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na2HPO4 1,25 g/l). Le cassage des cellules est effectué à 40C en mode continu (2 impulsions de 5 minutes). On peut également prétraiter la suspension cellulaire concentrée en présence de Triton X-100 à la température ambiante avant la sonication.
Les protéines hétérologues exprimées à haut niveau chez
E. coli se retrouvent très souvent sous la forme d'aggrégats insolubles dans le cytoplasme (R.G. Schoner et Coll. (1985)
Biotechnology, 3 : 151-154). Dans les conditions d'expression utilisées, ce n'est pas le cas pour l'apoAIV humaine recombinante.
E. coli se retrouvent très souvent sous la forme d'aggrégats insolubles dans le cytoplasme (R.G. Schoner et Coll. (1985)
Biotechnology, 3 : 151-154). Dans les conditions d'expression utilisées, ce n'est pas le cas pour l'apoAIV humaine recombinante.
D - PURIFICATION DE L'APOLIPOPROTEINE AIV RECOMBINANTE
Dans ce qui suit est décrit un procédé entièrement original qui permet de purifier l'apoAIV humaine recombinante en conditions natives, sans avoir à dénaturer la protéine en présence d'urée (procédé généralement utilisé pour purifier l'apoAIV humaine plasmatique). Ce procédé ne requiert pas non plus d'étape faisant appel à l'affinité de cette protéine pour les lipides.
Dans ce qui suit est décrit un procédé entièrement original qui permet de purifier l'apoAIV humaine recombinante en conditions natives, sans avoir à dénaturer la protéine en présence d'urée (procédé généralement utilisé pour purifier l'apoAIV humaine plasmatique). Ce procédé ne requiert pas non plus d'étape faisant appel à l'affinité de cette protéine pour les lipides.
La culture bactérienne est centrifugée à 6.000 tr/min pendant 30 minutes et le culot est repris à raison de 3 ml par gramme de cellules humides dans le tampon A (Na2HPO4 81 mM, NaH2PO4 19 mM; EDTA, 2 mM; PMSF, 1 mM; pH 7,5; B-mercaptoéthanol 10 mM). La suspension est traitée par 8 cycles de 3 minutes d'ultrasons (modèle BRANSON règlé à 250W) à 40C. Les extraits sont centrifugés pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 40C. Le surnageant S1 est conservé et le culot est lavé dans le même volume de tampon A et recentrifugé dans les mêmes conditions. Le surnageant correspondant S1' est ajouté au surnageant SI.
Après un dosage des protéines de la fraction (S1 + S1') est ajoutée une solution aqueuse de sulfate de streptomycine à 10 % à raison de 10 ml de solution par gramme de protéine. Après 15 minutes d'incubation à 40C sous agitation douce, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 40C. Le surnageant (S2) est récupéré. A cette fraction S2 est ajouté du sulfate d'ammonium (concentration finale : 25 % de saturation).
Après 15 minutes d'incubation à 40C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 40C. Au surnageant S25 est ajouté du sulfate d'ammonium (concentration finale : 50% de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 40C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 min à 15.000 tr/min à 40C. Le culot (C50) est récupéré et repris dans le tampon B (Tris-HCl, 10 mM ; EDTA, 2 mM ; pH8.8) et dialysé contre 2 1 de tampon B que l'on change 5 fois durant 48 heures.
Le dialysat est injecté sur une colonne échangeuse d'ions de type QFF (Pharmacia) et élué avec un gradient de NaCl. La détermination des fractions contenant l'apolipoprotéine AIV est effectuée selon un test en Elisa décrit dans le paragraphe E. Les fractions intéressantes sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentra- tion finale : 80 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 40C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 40C. Le culot (C80) est récupéré et repris dans le tampon B et dialysé contre 2 1 de tampon B.
Le dialysat est injecté sur une colonne échangeuse d'ions de type Mono Q (Pharmacia) et élué avec un gradient de NaCl. Les fractions intéressantes, identifiées par le test Elisa (paragraphe
E) et gel SDS 15 % sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale : 80 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 40C sous agitation, la suspension est centrifugée et reprise dans le tampon D (sulfate d'ammonium, 1,7 M; Na2HPO4 8,1 mM, NaH2PO4 1,9 mM; EDTA, 2 mM; pH 7.4) et dialysé contre 2 l de tampon D.
E) et gel SDS 15 % sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale : 80 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 40C sous agitation, la suspension est centrifugée et reprise dans le tampon D (sulfate d'ammonium, 1,7 M; Na2HPO4 8,1 mM, NaH2PO4 1,9 mM; EDTA, 2 mM; pH 7.4) et dialysé contre 2 l de tampon D.
Le dialysat est injecté sur une colonne de chromatographie d'interactions hydrophobes Phényl-sépharose (Pharmacia) et élué avec le tampon E (Na2HPO4 8,1 mM; NaH2PO4 1,9 mM; EDTA, 2 mM; pH 7.4). Les fractions intéressantes, identifiées par le test Elisa (paragraphe E) et gel de polyacrylamide SDS sont rassemblées et dialysées contre le tampon F (sulfate d'ammonium, 40 % de saturation; Na2HPO4 8,1 mM; NaH2PO4 1,9 mM; EDTA, 2 mM; pH7.4) et conservées à 40C.
E - ETUDES ANALYTIQUES ET ACTIVITES BIOLOGIQUES DE L'APOAIV HUMAINE
RECOMBINANTE OBTENUE PAR VOIE MICROBIOLOGIQUE a - études analytiques
La pureté de la solution d'apoAIV humaine recombinante est estimée supérieure à 98 % sur gel de polyacrylamide-SDS. Le produit, de haute pureté, a pu être soumis au séquençage et la séquence des 5 premiers acides aminés a été déterminée. Cette séquence correspond à celle de l'apoAIV humaine contenant une méthionine surnuméraire à son extrémité N-terminale, ce qui confirme que le gène synthétique qui fait l'objet de la présente invention exprime correctement l'apoAIV humaine chez E. coli.
RECOMBINANTE OBTENUE PAR VOIE MICROBIOLOGIQUE a - études analytiques
La pureté de la solution d'apoAIV humaine recombinante est estimée supérieure à 98 % sur gel de polyacrylamide-SDS. Le produit, de haute pureté, a pu être soumis au séquençage et la séquence des 5 premiers acides aminés a été déterminée. Cette séquence correspond à celle de l'apoAIV humaine contenant une méthionine surnuméraire à son extrémité N-terminale, ce qui confirme que le gène synthétique qui fait l'objet de la présente invention exprime correctement l'apoAIV humaine chez E. coli.
La composition en acides aminés du produit obtenu a également été déterminée et confirme l'identité de la protéine purifiée avec l'apo AIV humaine.
La qualité de la protéine obtenue peut encore être appréciée par test ELISA. Brièvement, le test mis au point consiste à adsorber sur une plaque ELISA avec un sérum polyclonal de lapin dirigé contre l'apoAIV humaine (dilué au 1/1000éme), saturer cette plaque à la gélatine, incuber l'échantillon à tester et enfin, faire réagir un mélange équimolaire de deux anticorps monoclonaux dirigés contre l'apoAIV (MO3 et MOS, SERLIA, Institut Pasteur de
Lille), suivi d'une révélation immunoenzymatique à l'aide d'un sérum polyclonal anti-souris couplé à la peroxydase. Ce test est facilement étalonné avec une gamme de dilutions de l'apoAIV plasmatique.
Lille), suivi d'une révélation immunoenzymatique à l'aide d'un sérum polyclonal anti-souris couplé à la peroxydase. Ce test est facilement étalonné avec une gamme de dilutions de l'apoAIV plasmatique.
b - caractérisations biologiques
L'apoAIV humaine est connue pour avoir deux activités biologiques.
L'apoAIV humaine est connue pour avoir deux activités biologiques.
- C'est tout d'abord un cofacteur capable d'activer la lécithine-cholestérolacyl-transférase (LCAT).
- C'est également un agoniste naturel du récepteur HDL qui est donc capable de se fixer à ce récepteur et de stimuler un efflux du cholestérol intracellulaire.
Essai LCAT
La protéine recombinante purifiée permet de reconstituer des protéoliposomes avec du DMPC dont la structure apparait identique, au vu du comportement en chromatographie d'exclusion, à celle des protéoliposomes reconstitués avec de l'apolipoprotéine
AIV extraite à partir du plasma humain.
La protéine recombinante purifiée permet de reconstituer des protéoliposomes avec du DMPC dont la structure apparait identique, au vu du comportement en chromatographie d'exclusion, à celle des protéoliposomes reconstitués avec de l'apolipoprotéine
AIV extraite à partir du plasma humain.
Ces protéoliposomes reconstitués sont capables de stimuler l'activation de la Lecithine-Cholestérol-Acyl-Transférase (LCAT), dans un essai effectué sur un extrait purifié de la protéine LCAT humaine. Dans ce même essai, les protéoliposomes reconstitués soit avec la protéine plasmatique soit avec la protéine recombinante ont des activités spécifiques identiques.
Affinité pour le récepteur HDL
Ces protéoliposomes reconstitués sont capables de se fixer à des adipocytes murins (lignée ob17) selon un protocole déjà décrit avec des constantes de liaison très voisines pour les DMPC-apoAIV humaine : Kd = 0,26 pM et Bmax = 143 ng/mg pour les DMPC-apoAIV recombinants : Kd = 0,28 uM et Bmax = 140 ng/mg Ex flux du cholestérol
L'efflux du cholestérol provoqué par les protéoliposomes
DMPC-AIV recombinants est, après 4 heures d'incubation, de 46 % du cholestérol initialement chargé avec un maximum atteint dès 2 heures. Cet efflux est donc identique à celui que l'on peut obtenir avec des protéoliposomes DMPC-AIV plasmatique.
Ces protéoliposomes reconstitués sont capables de se fixer à des adipocytes murins (lignée ob17) selon un protocole déjà décrit avec des constantes de liaison très voisines pour les DMPC-apoAIV humaine : Kd = 0,26 pM et Bmax = 143 ng/mg pour les DMPC-apoAIV recombinants : Kd = 0,28 uM et Bmax = 140 ng/mg Ex flux du cholestérol
L'efflux du cholestérol provoqué par les protéoliposomes
DMPC-AIV recombinants est, après 4 heures d'incubation, de 46 % du cholestérol initialement chargé avec un maximum atteint dès 2 heures. Cet efflux est donc identique à celui que l'on peut obtenir avec des protéoliposomes DMPC-AIV plasmatique.
En conclusion, l'apolipoprotéine produite par voie microbiologique est identique du point de vue de ses activités biologiques à la protéine purifiée à partir de plasma humain.
Claims (14)
1 - Procédé microbiologique de préparation de l'apolipoprotéine AIV humaine ou de dérivés de celle-ci caractérisé en ce que l'on cultive une bactérie capable d'assurer le maintien d'un plasmide contenant un promoteur, le site de fixation des ribosomes d'un gène traduit avec efficacité, et la séquence codant pour l'apolipoprotéine AIV humaine ou un dérivé de celle-ci, précédée d'un codon de démarrage de la traduction.
2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible.
3 - procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le promoteur est reconnu par une ARN polymérase spécifique, différente de celle de l'hôte utilise.
4 - Procédé selon les revendications 1 et 3 caractérisé en ce -que la bactérie utilisée contient en outre un gène hétérologue codant pour ladite ARN polymérase spécifique du promoteur.
5 - Procédé selon les revendications 3 et 4 caractérisé en ce que le promoteur dérive d'un gène du bactériophage T7.
6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le promoteur est celui du gène 10 du bactériophage T7.
7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le plasmide contient le promoteur et le site de fixation des ribosomes du gène 10 du bactériophage
T7, et la séquence codant pour l'apolipoprotéine AIV ou un dérivé de celle-ci, précédée d'un codon de démarrage de la traduction.
8 - Procédé selon les revendications 3 à 7 caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu de culture, après l'induction de l'expression, un inhibiteur spécifique du complexe de démarrage de la transcription de l'hôte utilisé.
9 - Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'inhibiteur est un antibiotique, et de préférence, la rifampicine.
10 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la bactérie est choisie parmi les souches d'E. coli.
11 - Plasmide caractérisé en ce qu'il contient un promoteur, le site de fixation des ribosomes d'un gène traduit avec efficacité, et la séquence codant pour l'apolipoprotéine AIV ou un dérivé de celle-ci, précédée d'un codon de démarrage de la traduction.
12 - Bactérie contenant un plasmide selon la revendication 11.
13 - Bactérie selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche d'E. coli.
14 - Procédé de préparation d'apolipoprotéine AIV humaine ou de dérivés de celle-ci sous forme soluble, caractérisé en ce que l'on soumet les produits obtenus par le procédé selon les revendications 1 à 10 à une extraction et une purification dans les conditions natives.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| FR9011490A FR2666813A1 (fr) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | Procede microbiologique de preparation de l'apolipoproteine aiv humaine ou de derives de celle-ci. |
| PCT/FR1991/000732 WO1992005253A1 (fr) | 1990-09-18 | 1991-09-17 | Procede microbiologique de preparation de l'apolipoproteine aiv humaine ou de derives de celle-ci |
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| FR9011490A FR2666813A1 (fr) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | Procede microbiologique de preparation de l'apolipoproteine aiv humaine ou de derives de celle-ci. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2666813A1 true FR2666813A1 (fr) | 1992-03-20 |
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ID=9400403
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|---|---|---|---|
| FR9011490A Withdrawn FR2666813A1 (fr) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | Procede microbiologique de preparation de l'apolipoproteine aiv humaine ou de derives de celle-ci. |
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| WO (1) | WO1992005253A1 (fr) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2704556B1 (fr) * | 1993-04-30 | 1995-07-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique. |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| EP0178863A1 (fr) * | 1984-10-15 | 1986-04-23 | Schering Corporation | Systèmes d'expression utilisant des promoteurs de bactériophage T7 et des séquences de gènes |
| WO1987002062A1 (fr) * | 1985-10-04 | 1987-04-09 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apolipoproteines recombinantes et procedes |
-
1990
- 1990-09-18 FR FR9011490A patent/FR2666813A1/fr not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-09-17 WO PCT/FR1991/000732 patent/WO1992005253A1/fr not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0178863A1 (fr) * | 1984-10-15 | 1986-04-23 | Schering Corporation | Systèmes d'expression utilisant des promoteurs de bactériophage T7 et des séquences de gènes |
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| Title |
|---|
| GENE, vol. 56, 1987, pages 125-135, Amsterdam, NL; A.H. ROSENBERG et al.: "Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase" * |
| J. BIOL. CHEM., vol. 262, no. 17, 1987, pages 7973-7981, Tokyo, JP; N.A. ELSHOURBAGY et al.: "Structure and expression of the human apolipoprotein A-IV gene" * |
| PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 1074-1078, Washington, DC, US; J. TABOR et al.: "A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes" * |
Also Published As
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|---|---|
| WO1992005253A1 (fr) | 1992-04-02 |
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