FR2655660A1 - Nouveaux polypeptides, sequences d'adn permettant leur expression, procede de preparation et leur utilisation. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une activité amidase énantiosélective.
Description
I La présente invention concerne des polypeptides possédant une activité
amidase énantiosélective Elle concerne également le matériel génétique impliqué dans leur expression ainsi qu'un procédé microbiologique pour leur préparation Enfin, l'invention concerne l'utilisation de ces polypeptides et des microorganismes transformés pour la synthèse énantiosélective d'acides à partir d'amides racémiques, notamment d'acides propioniques, et plus particulièrement d'acides aryl-2-propioniques S, et
d'acides aryloxy-2 propioniques.
En relation avec leur structure (présence d'un carbone
asymétrique) de nombreuses molécules possèdent deux formes stéréo-
isomériques distinctes, la forme R et la forme S, l'une étant l'image de
l'autre dans un miroir C'est le cas, en particulier, des acides aryl-2-
propioniques La plupart du temps, ces molécules se présentent sous forme racémique, c'est-à-dire que les deux isomères sont mélangés dans des proportions à peu près égales Or, il peut être important, dans certains cas, de disposer uniquement de l'une de ces formes et il convient alors de disposer de moyens pour séparer les deux isomères ou pour synthétiser
stéréospécifiquement l'isomère désiré.
La présente invention concerne le domaine des polypeptides capables d'hydrolyser énantiosélectivement les amides, et en particulier les aryl2-propionamides racémiques en acides aryl-2-propioniques de forme S
et les aryloxy-2 propionamides racémiques, en acides aryloxy-2-propioni-
ques R. Parmi les microorganismes chez lesquels on a pu démontrer l'existence de cette activité enzymatique, on peut citer notamment les souches appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium (brevet
européen n 89 400197 3) Plus particulièrement, on peut citer Brevi-
bacterium R 312 (CBS 717 73) D'autres souches telles que Rhodococcus
présentent également ce type d'activité.
La présente invention résulte de la caractérisation et de la purification de ces activités amidases énantiosélectives, ainsi que du clonage et du séquençage du matériel génétique responsable de leur expression. La présente invention a plus particulièrement pour objet d'obtenir l'expression de ces amidases énantiosélectives dans différents hôtes et avec des taux d'expression élevés et en utilisant la technique des
ADN recombinants.
L'un des objets de l'invention concerne donc des séquences
d'ADN codant pour des polypeptides ayant une activité amidase énantio-
sélective, notamment vis-à-vis des aryl-2-propionamides racémiques Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet la séquence nucléotidique codant pour I'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 telle qu'elle est représentée à la figure 9, ainsi que les séquences analogues résultant de la dégénérescence du code génétique et codant pour le même polypeptide L'invention concerne également les séquences qui hybrident avec ces séquences d'ADN ou avec des fragments de celles-ci et
qui codent pour des polypeptides ayant une activité amidase énantiosélective.
L'invention concerne aussi les gènes contenant ces séquences d'ADN.
Ces séquences peuvent être obtenues de diverses façons La stratégie générale consistant à cloner, à l'aide de sondes nucléotidiques élaborées à partir du polypeptide purifié, le fragment d'ADN génomique codant pour le polypeptide recherché A l'aide de différentes méthodes, telles que l'élongation d'amorces, la restriction, l'insertion d'adaptateurs ou la ligature avec des oligonucléotides de raccord, on construit un insert nucléotidique contenant la séquence d'ADN désirée Celle-ci peut alors être
cartographiée et séquencée par les techniques connues.
D'autres techniques peuvent être également envisagées comme l'utilisation d'ADN et/ou de la synthèse chimique partielle ou totale Ces techniques sont connues et la structure décrite à la figure 9 permet à
l'homme de métier d'isoler une séquence équivalente, dans tout microorga-
nisme, avec les moyens connus en la matière.
Un autre objet de l'invention concerne les polypeptides nouveaux, dont la structure se déduit de ces séquences d'ADN, et qui possèdent une activité amidase énantiosélective Ces polypeptides sont obtenus par extraction et purification à partir de cultures de micro organismes naturels ou recombinants La purification est réalisée par une succession d'étapes consistant à préparer un extrait enzymatique brut à partir de la culture cellulaire, à fractionner cet extrait au sulfate d'ammonium, et à le purifier par différentes chromatographies et filtrations sur gel Les détails de ces étapes sont donnés dans les exemples. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'amidase
énantiosélective de Brevibacterium R 312.
L'invention concerne également des microorganismes transfor-
més contenant au moins une cassette d'expression desdites séquences d'ADN Ces cassettes seront de préférence constituées par une séquence d'ADN selon la présente invention sous la dépendance de séquences d'ADN assurant son expression dans l'hôte considéré Il pourra s'agir d'une cassette intégrée directement dans le génome de l'hôte, ou d'une cassette insérée dans un plasmide qui comporte, en outre, une origine de réplication
plasmidique active dans l'hôte et un moyen de sélection.
Les séquences d'ADN assurant l'expression des séquences d'ADN selon la présente invention comporteront de préférence une région
d'initiation de la transcription et de la traduction.
Selon ce procédé, les régions de démarrage de la transcrip-
tion et de la traduction contiennent un promoteur et un site de fixation des ribosomes Ces régions peuvent être homologues ou hétérologues du
polypeptide produit.
Le choix de ces régions dépend notamment de l'hôte utilisé.
En particulier, lorsqu'il s'agit de microorganismes hôtes procaryotes, le promoteur hétérologue peut être choisi parmi les promoteurs bactériens forts, tels que le promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp, le promoteur de l'opéron lactose Plac, le promoteur droit du phage lambda P Re le promoteur gauche du phage lambda PL' les promoteurs forts de phages de
corynébactéries, ou encore les promoteurs homologues de corynébactéries.
Plus particulièrement, dans le cas du promoteur droit du phage lambda, la forme thermosensible pourra être préférée P RC Its Dans le cas de microorganismes eucaryotes, telles les levures, les promoteurs pourront être issus de gènes glycolytiques de levure, tels les gènes codant pour la
phosphoglycérate kinase (PGK), la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydro-
génase (GPD), la lactase (LAC 4), l'énolase (ENO).
Concernant les sites de fixation des ribosomes, celui dérivé du gène CII de lambda ainsi que ceux dérivés de gènes homologues de
corynébactéries seront utilisés préférentiellement lorsque le microorganis-
me hôte est procaryote.
Une région permettant une terminaison de la traduction et de la transcription fonctionnelle dans l'hôte envisagé pourra être positionnée en 3 ' de la séquence codante Le plasmide comprendra également un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombinant Les marqueurs préférés sont des marqueurs dominants, c'est-à-dire conférant une résistance à des antibiotiques comme l'ampicilline ou la streptomycine
ou à d'autres produits toxiques.
Parmi les microorganismes hôtes utilisés, on peut citer
notamment les entérobactéries telles que E Coli, les bactéries corynéfor-
mes telles que celles appartenant aux genres Corynebacterium, Brevi-
bacterium, ou Rhodococcus.
Bien entendu, sur le même principe on peut utiliser d'autres
types cellulaires.
L'invention a également pour objet les plasmides décrits précédemment contenant une région de démarrage de la transcription et de la traduction, une séquence d'ADN codant pour le polypeptide désiré et un
marqueur de sélection au moins.
L'invention concerne également les microorganismes trans-
formés tels que décrits précédemment dans leur application à la prépa-
ration des amidases énantiosélectives et également leur utilisation pour la
synthèse énantiosélective d'acides à partir d'amides racémiques.
Il s'agit notamment d'un procédé de préparation d'une
amidase énantiosélective, caractérisé en ce qu'on cultive un microorga-
nisme tel que décrit précédemment dans des conditions d'expression de la séquence codant pour l'amidase énantiosélective, on sépare les microorganismes, et on en récupère l'amidase produite. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation des microorganismes recombinants ou des polypeptides déjà décrits pour la synthèse énantiosélective d'acides aryl-2-propioniques à partir des
aryl-2-propionamides racémiques correspondants.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on préconise un procédé de préparation d'un stéréoisomère d'un acide organique à partir de l'amide racémique correspondant, caractérisé en
ce qu'on met l'amide racémique en présence d'un microorganisme trans-
formé tel que décrit précédemment ou d'un polypeptide obtenu par le
procédé précédent, et que l'on récupère le stéréoisomère obtenu.
Parmi les amides qui peuvent être traités par ce procédé, il faut citer l'amide racémique du kétoprofène qui permet de préparer
le S(+)kétoprofène utilisable dans l'industrie pharmaceutique.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples et figures qui suivent,
qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Table décrivant les différentes étapes de la purification de
l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312.
a à partir de 40 g de cellule humide, après précipita-
tion au sulfate de streptomycine; b une unité (u) est le nombre 1 Ipmole acid HPPA formé
par heure dans les conditions décrites ci-après.
Figure 2: a Séquences peptidiques (N-terminale et interne) obte-
nues à partir de la solution purifiée de Brevibacterium R 312 b Sonde oligonucléotidique réalisée à partir du fragment interne. Figure 3: aStratégie d'élaboration de la sonde sq 918, à partir du fragment Nterminal
b Sonde sq 918 obtenue.
Figure 4 a Profil d'hybridation de la sonde sq 918 avec l'ADN génomique total de Brevibacterium R 312 digéré par les enzymes Eco RI, Hind III, Kpn I, Pst I et Sph I b Profil d'hybridation de la sonde sq 762 avec l'ADN génomique
total de Brevibacterium R 312 digéré avec les mêmes enzymes que (a).
Figure 5 Cartes de restriction des plasmides p XL 1650 et p XLI 651.
Figure 6 Carte de restriction du fragment Pst I de 5,4 kb contenant le
gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312.
Figure 7: Stratégie de séquençage du fragment Bam HI-Pst I contenant le
gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312.
Figure 8 Analyse des phases ouvertes du fragment séquencé.
Figure 9: Séquences nucléotidique et peptidique de l'amidase énantio-
sélective de Brevibacterium R 312.
Figure 10: Carte de restriction du plasmide p XL 1724.
Figure Il: Carte de restriction du plasmide p XLI 751.
Figure 12: Carte de restriction du plasmide p XL 1752.
Figure 13 Gel de polyacrylamide-SDS à 12,5 % après coloration au bleu de Coomassie démontrant l'expression de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 à partir des souches coli B et E 103 S Chaque piste correspond à une quantité de protéine équivalente à 60 pl de la culture à une densité optique à 610 nm de 2,1 (E 103 S) et 0,7 (coli B) T), fraction soniquée; S), fraction soluble; C), fraction insoluble Les plasmides témoins (p XL 1029 et p XL 906) contiennent respectivement le gène de
l'IL Ibéta sous le contrôle du promoteur PRC Its et Ptrp.
Figure 14: Tableau de l'activité spécifique des souches d'E coli qui synthétisent l'amidase de Brevibacterium R 312 vis-à-vis de l'HPP Am, du PP Am et du K Am racémiques, et excès énantiomérique des acides chiraux produits.
PLASMIDES DE DEPART
Le plasmide p XL 534 dérive de p XL 276 (qui contient Ptrp-
RB Sc II/ât RI-HSA: brevet européen n 86 400617 6) par délétion à l'aide de l'enzyme Bal 31 à partir du site Eco RV, d'un fragment de 2,1 kb, et ligature sur linker Bam HI. Le plasmide p XL 820 dérive du plasmide p XL 534 par excision du fragment Eco RI-Nde I portant le Ptrp et le RB Sc II At RI, et insertion d'un fragment Eco RI-Nde I contenant le promoteur PRC Its et le site RBS c II& t RI Ce dernier est issu du plasmide p RK 248 c Its (Bernard et al, Gene 5, 59-76) grâce aux étapes suivantes: Excision d'un fragment Bg II-Bg II de p RK 248 c Its contenant
P Rc Its.
Insertion de ce fragment au site Bam HI du plasmide p UCI 9.
Linéarisation de p UCI 9 ainsi obtenu, par Cla I, et les
extrêmités sont remplies avec l'ADN polymérase de Klenow.
Digestion supplémentaire par Sma I, et ligature.
De cette nouvelle construction est excisé un fragment Eco RI-Sali contenant P Rc Its, qui est inséré dans p XL 534
ouvert par ces deux enzymes.
Le fragment Eco RI-Nde I est ensuite excisé de ce plasmide et
il contient P Rc Its-RBS c II t RI.
EXEMPLE 1 Identification et purification de l'amidase énantiosélective de
Brevibacterium R 312.
1 1 Identification
Le R,S-(hydroxy-4 phénoxy)-2 propionamide, dérivé aryloxy-
2 propionamide, est meilleur substrat de l'amidase énantiosélective que les dérivés aryl-2 propionamides, notamment le phényl-2 propionamide et le (benzoyl-3 phényl)-2 propionamide De plus, la sélectivité de l'amidase vis-à-vis de l'énantiomère R de l'HPP Amide est représentative de la
sélectivité vis-à-vis de l'énantiomère S des dérivés aryl-2 propionamide.
En conséquence, l'activité enzymatique énantiosélective a été détectée en utilisant comme substrat l'(hydroxy-4 phénoxy)-2 propionamide (HPP Amide) La réaction est conduite à 25 C sous agitation dans un tampon phosphate sodium 50 m M, p H 7,0, en présence de Brevibacterium R 312 et est arrêtée par addition d'un mélange acide phosphorique 0,05 M, acétonitrile et HCI IN 55/40/5 (v/v) La culture est ensuite centrifugée et le surnageant est analysé en CLHP en phase inverse (Hibar-Merck RP-18; 5 pm) L'élution est effectuée avec une solution 85/15 (v/v) d'acide phosphorique 0,005 et d'acétonitrile et les concentrations respectives de HPP Amide et HPP Acide sont mesurées grâce à la position des pics d'élution et comparativement à un standard L'excès énantiomérique, défini comme le rapport (R-S)/(R+S) x 100 dans lequel R et S sont respectivement des concentrations en énantiomère R et S de l'HPP Acide, se déduit soit de mesures polarimétriques (utilisant l'absorption à 589 nm du sodium) soit de
l'analyse CLHP sur colone chirale.
Les activités obtenues avec les cellules entières et un extrait soluble sont respectivement de 15 U/mg et 24 U/mg de protéine ( 1 U = liimole d'HPP Acide formée par heure) L'excès énantiomérique de l'HPP Acide R formé est de 95 % Ces résultats montrent que Brevibacterium R 312 possède une activité amidase énantiosélective capable d'hydrolyser les aryl-2 propionamides racémiques en acides S correspondants Cela a été vérifié avec les hydrolyses du phényl-2 propionamide racémique, et du (benzoyl-3 phényl)-2 propionamide racémique qui donnent respectivement les acides S correspondants avec des excès énantiomériques supérieurs
93 %.
1.2 Purification
La purification est réalisée à 4 C.
Les cellules ( 40 g poids sec de Brevibacterium R 312) sont décongelées et reprises dans 300 ml de tampon A (Phosphate de sodium m M, p H 7, 3 mercaptoéthanol 5 m M) Les cellules sont ensuite cassées par ultrasons et les débris membranaires sont éliminés par centrifugation à 20000 g pendant 30 minutes 25 ml d'une solution de sulfate de streptomycine 10 % sont ajoutés lentement sous agitation à mi de surnageant Après 45 minutes, la solution est clarifiée comme
ci-dessus et le surnageant est traité au sulfate d'ammonium La frac-
tion protéique précipitant entre 30,8 % et 56,6 % de saturation au sulfa-
te d'ammonium est récupérée par centrifugation et dissoute dans 35 ml du tampon A, avant d'être dialysée plus longuement contre ce même
tampon La solution ainsi obtenue est alors ajustée à 20 % de la satu-
ration en sulfate d'ammonium, de nouveau centrifugée et appliquée sur une colonne phényl-Sépharose CL-4 B (Pharmacia) équilibrée avec du tampon A à 20 % de la saturation en sulfate d'ammonium Les fractions protéiques contenant l'activité enzymatique sont ensuite éluées avec le même tampon, puis concentrées par ultrafiltration avec une cellule AMICON DIAFLO PM 10 jusqu'à un volume de 18 mi Du glycérol 10 % est ensuite ajouté à la fraction concentrée et la solution obtenue est chargée sur une colonne Ultrogel Acd 44 (IBF-biotechnics France) préalablement équilibrée en TrisHCI 50 m M, p H 7,0, Na Cl 100 m M. Les fractions protéiques contenant la plus grande activité spécifique
(environ 32 % de l'activité totale chargée sur la colonne) sont collec-
tées, concentrées et soumises à une étape de filtration supplémentaire sur le même gel De la même façon, les fractions présentant la plus grande activité spécifique (environ 30 % des protéines appliquées sur la
colonne) ont été analysées en SDS-PAGE et stockées L'énantiosélectivi-
té de la protéine ainsi purifiée a également été déterminée.
Ces étapes de purification ont permis d'obtenir une enzyme pure à plus de 80 % avec une activité spécifique de 815 U/mg A ce stade, une bande majoritaire d'un poids moléculaire apparent de 59 + 5 KD, correspondant à au moins 80 % des protéines totales, est visible en SDS-PAGE De plus, l'activité amidase éluée de l'Ultrogel Ac A 44 correspond également à un poids moléculaire de 63 + 5 KD, indiquant
que l'enzyme se présente apparemment sous forme monomérique.
Exemple 2 Clonage de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 2. 1 Obtention de séquences protéiques Les séquences peptidiques correspondant respectivement à l'extrémité N-terminale ( 27 résidus) et à un fragment trypsique interne ( 21 résidus) de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 ont été déterminées à partir de l'enzyme ainsi purifiée. Pour cela, 3 nmol de la préparation d'amidase ont été réduites et carboxyméthylées Le composé protéique majoritaire est ensuite déssalé, et purifié jusqu'à homogénéité par chromatographie CLHP en phase inverse La séquence N-terminale est ensuite déterminée selon la méthode de dégradation séquentielle automatique d'Edman, en
utilisant un appareil "Applied Biosystems Model 470 A" De cette maniè-
re, la séquence présentée figure 2 a est obtenue Afin d'obtenir une séquence supplémentaire interne, la même quantité de protéine est
soumise à une digestion trypsique Les fragments réduits et carbo-
xyméthylés sont ensuite séparés par chromatographie CLHP en phase inverse ( 2,1 xl O O mm; débit: 0,2 ml/min), en utilisant le tampon d'élution
suivant: gradient de 0 à 50 % d'acétonitrile dans 0,07 % d'acide tri-
fluoroacétique Un peptide élué dans un pic bien séparé (à 40,8 %
d'acétonitrile) est séquencé (Figure 2 a).
2.2 Elaboration des sondes nucléotidiques Deux types de stratégies ont été poursuivies pour la
construction des sondes nucléotidiques.
Dans la première stratégie, une sonde 29-mer ( 59 % d'ho-
mologie minimale) a été construite, tenant compte de l'usage des codons dans l'opéron tryptophane de Brevibacterium lactofermentum
(séquence de 7,7 kb contenant 6 cistrons: Matsui et al Mol Gen.
Genet 209 p 299, 1987) et d'après la séquence IDGALGSYDV du frag-
ment interne (présentant une dégénérescence moyenne moins impor-
tante) Le brin non-codant a été synthétisé en considérant la relative neutralité thermodynamique d'appariements G = T et en introduisant
quelques dégénérescences pour maximiser la fréquence théorique moyen-
ne des codons considérés ( 88 % par rapport à l'usage des codons choisis).
Les considérations conduisent à porter le GC % de la sonde à environ
69 % La sonde obtenue (sq 762) est donnée à la figure 2 b.
Dans un deuxième type de stratégie, on a mis en oeuvre la méthode PCR décrite par Girgès et al (Nucleic Acids Res 16, p.10371, 1988) pour obtenir une sonde nucléotidique exacte à partir d'un peptide correspondant à des codons hautement dégénérés Pour cela, des oligonucléotides synthétiques 25-mer (voir séquence soulignée sur la figure 3) correspondant à toutes les possibilités de clonage des
cinq premiers ou cinq derniers codons de la séquence peptidique N-ter-
minale et comportant des sites de restriction à leurs extrémités 5 ' (respectivement Eco RI et Hind II) ont été utilisés pour amorcer une
amplification enzymatique de l'ADN génomique de Brevibacterium R 312.
Après 30 cycles d'amplification le fragment candidat est purifié sur gel
puis inséré entre les sites Hind III et Eco RI du bactériophage M 13 mp 19.
Un certain nombre de clones, obtenus après clonage du fragment obtenu à deux températures différentes d'hybridation des amorces ( 45 C et
48 C), ont ensuite été séquences et comparés Les résultats sont indi-
qués sur la figure 3 Cette figure montre que, à part les dégénérescen-
ces introduites par les amorces, on a bien amplifié un fragment d'ADN (unique entre les amorces) codant pour l'extrémité N-terminale de l'amidase Un oligonucléotide synthétique 40-mer correspondant à ce fragment interne a donc été utilisé pour la suite du clonage, comme sonde exacte de l'extrêmité N-terminale de l'amidase La séquence de
ce fragment sq 918 est indiquée figure 3.
Les deux sondes ainsi obtenues ont été marquées au 32 p
selon la méthode de phosphorylation en 5 '.
2.3 Clonage du gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 La stratégie suivie a consisté tout d'abord à vérifier la
spécificité des sondes synthétisées et à déterminer la nature du frag-
ment d'ADN génomique à cloner par Southern Blot Brièvement, de l'ADN génomique de Brevibacterium R 312 a été digéré alternativement
par plusieurs enzymes de restriction correspondant à des sites utilisa-
bles pour le clonage, en particulier, à des sites présents dans le multi-
site de clonage des plasmides de la série p UC Notamment, l'enzyme Pst I a été utilisé Après électrophorèse sur gel d'agarose et transfert sur membrane de nylon, les diverses digestions ont été hydridées aux sondes sq 762 et sq 918 Les résultats présentés figure 4 montrent que les deux sondes sont caractérisées par une spécificité suffisante dans des conditions d'hybridation (au plus un fragment hydridant pour chaque digestion) De plus, dans la mesure o les deux sondes permettent d'obtenir à peu près le même profil d'hybridation, on peut penser que les signaux d'hybridation sont bien spécifiques du gène recherché, et que le peptide interne obtenu après hydrolyse trypsique est très proche de l'extrêmité N-terminale Les empreintes d'hybridation montrent en particulier l'existence d'un fragment unique Pst I de 5,4 kpb environ qui hybride très fortement avec les deux sondes Il a alors été décidé de cloner ce fragment Pour cela, tous les fragments de taille comprise entre 4,6 et 5 kpb et 6 à 6,5 kpb environ, résultant d'une digestion génomique totale de Brevibacterium R 312 par Pstl ont été purifiés sur agarose, électroélués, puis ligaturés au vecteur p CUI 9, préalablement digéré par Pst I Ap?ès transformation dans la souche d'DH 5 d d'E coli,
500 colonies blanches, correspondant théoriquement à des microorganis-
mes recombinants, ont été obtenus sur milieu X-gal Ces colonies ont été repiquées individuellement, transférées sur membrane de nylon, puis analysées par hydridation avec la sonde sp 918 marquée au 32 p Deux clones ont ainsi été repérés comme hybridant très fortement avec la
sonde, et ont été isolés et retenus pour la poursuite du clonage.
Les deux plasmides recombinants p XL 1650 et p XL 1651
isolés à partir de ces deux clones ont été analysés par diverses métho-
des: cartographie de restriction, séquençage partiel en utilisant les sondes comme amorce de séquençage et Southern Blot Les résultats présentés à la figure 5 montrent que les deux plasmides contiennent le même insert Pstl de 5,4 kpb environ, dans les deux orientations La figure 6 présente une carte de restriction de ce fragment Ces deux plasmides contiennent bien les séquences codant pour les peptides caractérisés, le fragment trypsique jouxtant l'extrémité N-terminale (figure 9) De plus, ces résultats montrent que le gène codant pour l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 est localisé sur un fragment Bam HI-Pstl de 2,4 kpb environ, et orienté dans le sens Bam HI vers Pst I Etant donné la position de l'extrêmité 5 ' de la séquence codante et sachant que l'enzyme est codée par, au maximum, 2 kpb (monomère de 57-63 KD suivant les estimations), il était donc certain que le gène entier était contenu dans le fragment Bam HI-Pst I que l'on
a donc entrepris de séquencer.
Exemple 3 Séquence du fragment Bam HI-Pst I contenant le gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 La stratégie de séquençage du fragment Bam HI-Pst I est indiquée sur la figure 7 Les diverses séquences ont toutes été obtenues par la méthode de terminaison de chaînes (Kit séquenase en présence de 7-deaza d GTP; ( 535)d ATP) soit sur des matrices simple brin de M 13
recombinant portant des sous-fragments, soit directement sur le plasmi-
de p XL 1650 Plusieurs amorces spécifiques ont également été synthéti-
sées dans ce but le GC% moyen de la séquence obtenue est de 61,5 %.
Une analyse des phases ouvertes obtenues est présentée sur la figure 8.
Cette figure montre que la phase ouverte correspondant au N-terminal de l'amidase code pour 521 acides aminés correspondant à un poids moléculaire de 54671 On constate sur cette phase ouverte que le GC% est respectivement de 65,8, 52,5 et 70 % pour la première, deuxième et troisième position de codons, ce qui est une répartition caractéristique dans les séquences codantes de microorganismes riches en GC La
séquence complète du fragment Bam HI-Pst I est donnée à la figure 9.
Exemple 4 Expression du gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 dans E coli 4.1 Construction des plasmides Plusieurs constructions ont été réalisées dans lesquelles le
gène structural de l'amidase, contenant un site de fixation des riboso-
mes homologue ou dérivé du gène CII du phase lambda, est placé sous
contrôle de son propre promoteur, du promoteur de l'opéron tryptopha-
ne ou du promoteur droit du phage lambda thermosensible Le plasmide p XL 1650 (figure 5) a été obtenu par insertion dans l'unique site Pst I du plasmide p UCI 9, du fragment de 5,4 kpb résultant de la digestion par PstI de l'ADN génomique total de Brevibacterium R 312 Ce plasmide contient donc le promoteur de l'opéron lactose Plac, suivi du site de
fixation des ribosomes et du gène structural de l'amidase énantiosélec-
tive de Brevibacterium R 312, ainsi qu'un gène de résistance à l'ampi-
cilline. Le plasmide p XL 1724 (figure 10) a été obtenu en insérant dans un vecteur contenant le promoteur de l'opéron tryptophane, le fragment Bam HI-Pst I de 2,26 kpb, excisé par traitement à l'enzyme Bam HI du fragment de 5,4 kpb Ce fragment contient le gène complet de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312, précédé des 58 paires de bases en amont du codon ATG, portant le site de fixation
des ribosomes.
Deux autres constructions ont été réalisées dans lesquelles le gène structural de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 est placé sous le contrôle de promoteurs hétérologues et de sites de
fixation des ribosomes hétérologues.
Ces plasmides (p XLI 751 et p XL 1752) ont été obtenus de la manière suivante:
Le plasmide p XL 1724 a été mutagénisé par PCR de maniè-
re à introduire, à la place du codon ATG situé en amont du gène
structural de l'amidase, un site de coupure Nde I: CATATG L'amplifi-
cation a été réalisée en utilisant une amorce correspondant au site de coupure Nde I hybridant avec le codon d'initiation ATG et une amorce correspondant au site de coupure Xho I situé quelques paires de bases en aval du codon ATG Le fragment amplifié a ensuite été excisé par coupure avec les deux enzymes Nde I et Xho I. Utilisation du promoteur Ptrp: Un fragment Eco RI-Nde I contenant le promoteur Ptrp et le site de fixation des ribosomes du gène CII de lambda, ne contenant pas la séquence de terminaison t R 1 et la région 5 ' du gène structural de l'amidase a été inséré dans le plasmide p XL 1724 ouvert par Eco RI et
Xho I, pour générer le plasmide p XLI 751 (figure 11).
Utilisation du promoteur PRC Its La même stratégie a été employée en utilisant cette fois le fragment Eco RI-Nde I du plasmide p XL 820 contenant le promoteur PRC Its et le site de fixation des ribosomes du gène CII de lambda ne contenant pas
la séquence t Rl Le plasmide p XL 1752 a ainsi été obtenu (figure 12).
4.2 Expression de l'amidase de Brevibacterium R 312 dans coli B et
E 1035
Les plasmides p XL 1751 et p XL 1752 ont été utilisés pour transformer les souches de coli B et E 103 S respectivement selon la méthode du chlorure de calcium La sélection des microorganismes
recombinants se fait sur milieu ampicilline.
L'expression de l'amidase énantiosélective de Brevibacte-
rium R 312 a été mesurée après sonication des cellules en gel SDS-
PAGE, dans la fraction brute ou, après centrifugation, dans le culot et dans le surnageant Les résultats sont présentés à la figure 13 et montrent un niveau élevé d'expression de l'amidase qui représente
jusqu'à 20 % des protéines totales.
Exemple 5 Utilisation de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium
R 312 pour la synthèse énantiosélective d'acides aryl-2 propioniques.
Les souches suivantes ont été utilisées dans ce qui suit E coli (p XL 1751) l'amidase est produite par élévation
de la température de 30 à 42 C en fin de phase expo-
nentielle (promoteur PR de phage lambda sous le contrô-
le du represseur thermosensible C Its.
E coli (p XL 1752) La séquence codant pour l'amidase est placée sous le contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane. Deux autres souches témoins ont également été fournies E coli (p XL 906) équivalent à E coli (p XL 1751) avec le
gène de l'amidase substitué par un autre gène, (IL 1).
E coli (p XL 1029) équivalent à E coli (p XL 1752) avec
le gène de l'amidase substitué par un autre gène (ILI j 1).
Afin de tester l'activité de ces microorganismes, on opère de la façon suivante: Une suspension cellulaire cultivée dans des conditions inductrices est ajoutée à une solution contenant: de l'hydroxy-4-phénoxy2-propionamide, le phényl-2-propionamide, ou
l'amide du kétoprofène, par exemple.
Le mélange réactionnel est ensuite dilué dans un tampon acétonitrileacide chlorhydrique N ( 90:10 en volumes), et les bactéries
sont éliminées par centrifugation A partir de la composition du mélan-
ge, déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP), l'activité amidase est calculée Les résultats présentés figure
14 témoignent de l'efficacité de ce système.
Toutes les souches d'E coli qui possèdent le gène de l'amidase de Brevibacterium R 312 (génotype Amd+) et qui sont cultivées dans des conditions d'induction de ce gène hydrolysent effectivement les trois amides suivants (phénotype AMD+): hydroxy-4-phénoxy-2-propionamide (HPP Am), phényl-2-propionamide (PP Am)
amide du kétoprofène (K Amr).
L'excès énantiomérique des acides obtenus est toujours
supérieur à 93 %.
Claims (18)
1) Séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une
activité amidase énantiosélective.
2) Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: La séquence codant pour l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 représentée à la figure 9;
un analogue de cette séquence résultant de la dégéné-
rescence du code génétique; un ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un polypeptide
ayant une activité amidase énantiosélective.
3) ADN caractérisé en ce qu'il contient la séquence décrite
à la figure 9.
4) Gène contenant les séquences d'ADN selon l'une des
revendications 1 à 3.
) Polypeptides nouveaux résultant de l'expression d'une
séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 à 4 et possédant une
activité amidase énantiosélective.
6) Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé par la
séquence représentée à la figure 9.
7) Microorganisme transformé contenant au moins une
cassette d'expression d'une séquence selon l'une des revendications 1 à
4 sous la dépendance de séquences d'ADN assurant l'expression de cette
séquence dans le microorganisme hôte.
8) Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en ce que les séquences d'ADN assurant l'expression de la séquence selon
l'une des revendications 1 à 4 contiennent une région de démarrage de
la transcription et de la traduction.
9) Microorganisme selon la revendication 8, caractérisé en ce que la région de démarrage de la transcription et de la traduction
contient une séquence promotrice et un site de fixation des ribosomes.
) Microorganisme selon la revendication 9, caractérisé en ce que les séquences promotrices et de fixation des ribosomes peuvent
être homologues ou hétérologues du peptide produit.
11) Microorganisme selon la revendication 10, caractérisé en ce que les séquences promotrices peuvent être choisies parmi les
promoteur forts de phages de corynébactéries, les promoteurs homolo-
gues de corynébactéries, les promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp, le promoteur de l'opéron lactose Plac, le promoteur gauche du phage
lambda PL, ou le promoteur droit du phage lambda PR.
12) Microorganisme selon la revendication 11, caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur de l'opéron
tryptophane Ptrp et le promoteur droit du phage lambda PRC Its.
13) Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en ce que le site de fixation des ribosomes est dérivé du gène CII du
phage lambda, ou de gènes homologues des corynébactéries.
14) Microorganisme selon l'une des revendications 7 à 13,
caractérisé en ce que la cassette d'expression est portée par un plasmi-
de comportant un moyen de sélection.
) Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en ce que le moyen de sélection est un marqueur de sélection, marqueur
conférant la résistance à un antibiotique.
16) Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en ce que le plasmide contient le promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp, le site de fixation des ribosomes du gène CII de lambda ne contenant pas la séquence de terminaison de la transcription t RI, l'ADN codant pour l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 et un gène de
résistance à l'ampicilline.
17) Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en
ce que le plasmide contient le promoteur droit du phage lambda ther-
mosensible PRC Its, le site de fixation des ribosomes du gène CII de lambda ne contenant pas la séquence de terminaison de la transcription t RI, l'ADN codant pour l'amidase énantiosélective de Brevibacterium
R 312 et un gène de résistance à l'ampicilline.
18) Microorganisme selon l'une des revendications 7 à 17,
caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les souches E coli, Brevibacte-
rium, Corynebacterium, Rhodococcus.
19) Microorganisme selon la revendication 18, caractérisé
en ce qu'il s'agit de E coli B ou E coli E 1035.
) Procédé de préparation d'une amidase énantiosélective, caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme selon l'une des
revendications 7 à 19 dans des conditions d'expression de la séquence
codant pour l'amidase, puis en ce qu'on sépare les microorganismes, et
on extrait l'amidase produite.
21) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'on réalise une sonication de la culture, un fractionnement en sulfate d'ammonium, une chromatographie phényl-sépharose et une
double filtration sur gel.
22) Procédé de préparation d'un stéréoisomère d'un acide organique à partir de l'amide racémique correspondant, caractérisé en ce qu'on met l'amide racémique en présence d'un microorganisme selon
l'une des revendications 7 à 19 ou d'un polypeptide selon l'une des
revendications 5 et 6 et en ce qu'après la réaction on récupère le
stéréoisomère. 23) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'amide est un aryl-2-propionamide racémique et l'acide est un acide S. 24) Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'aryl-2propionamide racémique est l'amide du kétoprofène et
l'acide est le kétoprofène S(+).
) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'amide est un aryloxy-2-propionamide racémique, et l'acide est le
stéréoisomère R correspondant.
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