FR2587720A2 - Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires immunogeniques pour la preparation de ce vaccin et pour des dosages immunologiques de depistage de ce syndrome - Google Patents

Abstract

VACCIN CONTRE LE SYNDROME IMMUNODEFICITAIRE ACQUIS ET INTERMEDIAIRES POUR LA PREPARATION DE CE VACCIN. L'INVENTION CONCERNE DES VIRUS RECOMBINANTS QUI DIRIGENT L'EXPRESSION DE PEPTIDES OU PROTEINES APPARENTES A DES EPITOPES DU VIRUS DE L'ADENOPATHIE (LAV) ET VIRUS DE LA LEUCEMIE A LYMPHOCYTES T-HUMAINS (HTLV III), QUI EST L'AGENT RESPONSABLE DU SYNDROME IMMUNODEFICITAIRE ACQUIS (SIDA). ON PEUT FORMULER CES VIRUS SOUS FORME DE VACCINS A VIRUS VIVANTS OU INACTIVES OU DANS DES VACCINS MULTIVALENTS POUR LA PROTECTION CONTRE UNE INFECTION DUE A LAVHTLV III. ON DECRIT EGALEMENT DES PEPTIDES ET PROTEINES APPARENTES A DES EPITOPES DE CE VIRUS, ET LEUR PREPARATION. APPLICATION : VACCINS ET DOSAGES DE DEPISTAGE DU SYNDROME.

Description

La présente invention concerne des perfectionnements

et compléments apportés à la préparation, décrite dans le bre-

vet principal, de vaccins contre le syndrome immunodéficitaire acquis 'SIDA), ainsi que des vaccins obtenus et, également, des divers intermédiaires servant à cette obtention. Ainsi, la présente invention concerne des virus qui expriment des peptides et protéines apparentés A des épitopes du virus associé à l'adénopathie L Lymphadenopathy Associated Virus (LAV)] /virus de la leucémie des cellules T humaines

[Human T-Cell Leukemia Virus (HTLV-III)), l'agent étiologi-

que du syndrome d'adénopathie C Lymphadenopathy Syndrome (LAS) 2 et du syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA); L Acqui'red Immune Deficiency Syndrome (AIDS)J. Les virus

de la présente invention qui expriment des peptides appa-

rentés à LAV/HTLV-III induisant une réponse d'immuno-protec-

tion peuvent servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins A base de virus pour le syndrome d'adénopathie (LAS)

ou le SIDA ou dans des formulations de vaccins multivalents.

En fait, les virus infectieux de la présente invention, qui peuvent se multiplier dans un hôte sans provoquer de maladie, peuvent servir dans des formulations de vaccins à base de

virus vivants qui procurent une stimulation immunogène pro-

longée et peuvent donner naissance à une forte immunité.

La présente invention vise également des peptides

et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III, pou-

vant servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins - sous-unité(s) pour LAS ou le SIDA, ou dans des formulations de vaccins multivalents, ou comme antigènes dans des dosages immunologiques pour le diagnostic de LAS ou du SIDA. Ces pestides et protéines peuvent être produits en utilisant des

techniques mettant en oeuvre de l'ADN recombinant dans n'im-

porte quel système vecteur-hôte, ou bien ils peuvent être synthétisés par des méthodes chimiques. Donc, l'invention vise aussi la construction de nouvelles séquences de ADN et de vecteurs comprenant de l'ADN de plasmide, et de l'ADN viral comme des virus infectant les êtres humains, des virus infectant les animaux, des virus infectant les insectes ou des bactériophages pouvant servir pour diriger l'expression de peptides et protéines apparentés à LVA/HTLV dans des cellules d'un hôte approprié à Dartir desquelles on peut purifier les peptides et protéines. Des méthodes chimiques pour la synthèse de peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III sont également décrites. Dans une forme spécifique de mise en oeuvre de la

présente invention, on a utilisé desvirus de vaccine recom-

binants pour produire des protéines apparentées a l'enveloppe ou à la partie centrale (noyau) de LAV/HTLV III. Pour cela, on a inséré des séquences d'ADN d'enveloppe ou de gaq codant pour les glycoprotéines de l'enveloppe

ou les protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III, res-

pectivement, dans des vecteurs de vaccine capables de diriger

l'expression des gènes de LAV/HTLV III dans un hôte approprié.

On a trouvé que les protéines apparentêes à l'enveloppe de LAV/HTLV III, oroduites par lesvirus de vaccine recombinants, sont antigéniques et immunogênes et capables de susciter chez des primates sub-humains une immunité a médiation humorale et cellulaire. Les protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III,

produites par le virus.de vaccine recombinant, sont des pro-

téines immunoréactives qui contiennent les épitopes majeurs

des authentiques protéines de noyau.

Les virus de vaccine recombinants, qui expriment

les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, peu-

vent servir isolément ou de concert avec les recombinants de vaccine qui expriment d'autres protéines apparentées à LAV/HTLV III (comme les protéines de structure de noyau) dans des formulations de vaccins à base de virus. En variante, les protéines apparentées à LAV/HTL7 III, produites par les virus recombinants, peuvent être purifiées ou chimiquement synthétisées, et utilisées à titre d'immunogènes dans des formulations de vaccins à sous-unitéfs). Puisque la ou les glycoprotéines apparentées à LAV/HTLV III risquent d'être reconnues comme "étrangères" dans l'hôte animal, une réponse immunitaire à médiation humorale et/ou cellulaire va être déclenchée contre cette protéine ou cette combinaison de protéines. Dans une formulation de vaccin préparée de manière appropriée, cela doit protéger l'hôte contre des infections

subséquentes Dar LAV/HTLV III.

Dans une autre forme spécifique de réalisation de la pré-

sente invention, on a utilisé des bacculovirus recombinants (Autographa Californica, virus de polyédrose nucléaire ou ANCPV) pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe et au noyau de LAV/HTLV III. Pour cela, on a inséré des séquences de ADN d'enveloppe ou de gag, qui codent pour des protéines de structure d'enveloppe ou de noyau, respectivement, dans des vecteurs du type bacculovirus qui sont capables de diriger l'expression des gènes de LAV/HTLV III dans un hôte approprié. On a trouvé que les protéines de LAV/HTLV III,

produites par les bacculovirus recombinants, sont antigéni-

ques, d'après la mesure faite par radioimmunoprécipitation

et ELISA.

La présente invention prévoit également la produc-

tion d'antigènes de LAV/HTLV III, qui ont une importance générale en médecine humaine. Cela comprend l'utilisation des peptides et protéines de la présente invention comme réactifs dans des dosages immunologiques comme les essais

de dosage immunoenzymatique et ELISA (Enzyme linked immuno-

sorbent assay) et les dosages radioimmuologiques qui sont utiles comme des outils diagnostiques pour la détection d'anticorps spécifiques de LAV/HTLV.dans les échantillons de sang, les fluides corporels, les tissus, etc. En outre,

ce réactif sera un outil intéressant pour élucider le méca-

nisme de la pathogénèse de LAV/HTLV III.

Le SIDA (Syndrome ImmunoDéficitaire Acquis) est une maladie caractérisée par une déficience immunitaire grave due principalement à des troubles de la réponse immunitaire à médiation cellulaire du patient (M. Gottlieb et col., 1981,

N. Engl. J. Med. 305:1425; J Masur et col., 1981, N. Engl.

J. Med. 305:431). Deux présentations cliniques de la maladie sont reconnues: (a) une phase de prodrome, appelée syndrome

d'adénopathie Lymphadenopathy Syndrome (LAS) 7, caracté-

risée par une adénopathie chronique, de la leucopénie et une diminution quantitative des cellules auxiliaires du sang périphérique (cellules OKT4) , conduisant à une inversion du

rapport normal entre les lymphocytes auxiliaires et les lym-

phocytes T suppresseurs (OKT4:OKT8),qui se déplace de 2 vers 0,1 ou moins a mesure que la maladie progresse; et (b) un état immunodéficitaire caractérisé par une diminution des cellules OKT4 et l'inversion du rapport normal OKT4:OKT8, la lymphopénie absolue, et des infections répétitives dues principalement à Pneumocystis carnii; cette dernière phase

est finalement associée à la mort dans la majorité des cas.

Certains sous-groupes de patients présentent une incidence accrue de lymphome et de sarcome de Kaposi. Il n'existe actuellement pas de traitement ni de thérapie pour cette maladie.

Les données épidémiologiques ainsi que les rensei-

gnements concernant les types de patients qui on-t contracté la maladie suggèrent qu'un agent infectieux transmis par contact intime pourrait être la cause de la maladie. Par la suite, trois groupes de chercheurs ont présenté de fortes preuves indiquant que l'agent provoquant le SIDA est un

rétrovirus présentant un tropisme le dirigeant vers les lym-

phocytes T auxiliaires. Ces groupes sont: (a) R.C. Gallo et ses collaborateurs au National Institute of Health ont pu isoler un rétrovirus cytopathe

(HTLV III) sur des patients présentant le SIDA et du pré-

SIDA (R.C. Gallo et col., 1984, Science 224:500; M. Popovic et col., 1984 (Science 224:497). Ils ont aussi décelé des anticorps contre HTLV III dans le sérum de patients atteints

de SIDA.

(b) L. Montagnier et ses.collaborateurs ont isolé à l'Institut Pasteur un rétrovirus lymphotrope (LAV/HTLV III) - - - sur un---patient-qui présentait une adénopathie cervicale et présentait aussi un risque de SIDA (Barre-Sinoussi, F. et col., 1983, Science 220:868). Ce groupe a pu aussi montrer l'existence d'anticorps contre LAV/HTLV III dans du sérum provenant de patients atteints de SIDA (V.S. Kalyansraman et col., 1984, Science 225:321). En outre, ils ont pu isoler LAV/HTLV III à partir des lymphocytes d'un patient qui avait développé du SIDA apres avoir reçu du sang d'un donneur atteint de SIDA

(P.M. Feorino et col., 1984, Science 225:69).

(c) J. Levy et ses collaborateurs ont isolé des rétrovirus infectieux (appelés rétrovirus associés au SIDA (AIDS-associated retrovirus, ou ARV) à partir des cellules mononucléaires périphériques de patients présentant le SIDA

(J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840).

Ces trois virus ont tous été isolés indépendamment, mais ils appartiennent probablement tous au même sous-groupe des rétrovirus (J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840)

et ils seront collectivement appelés ici LAV/HTLV III.

La structure générale des rétrovirus est celle d'un

noyau de ribonucléoprotéines entouré par une enveloppe conte-

nant des lipides que le virus acquiert au cours du bourgeon-

nement cellulaire. Les glycoprotéines à codage viral sont

enfouies au sein de l'enveloppe et font saillie vers l'exté-

rieur. Elles déterminent les virus connus de l'hôte et réa-

gissent avec des récepteurs spécifiques situés à la surface

de cellules sensibles. On pense que des anticorps neutra-

lisants se fixent sur les glycoprotéines de l'enveloppe et en bloquent l'interaction avec des récepteurs situés à la

surface des cellules (pages 534-535 dans "The Molecular Bio-

logy of Tumor Viruses" (biologie moléculaire des virus de tumeur), publié par John Tooze, 1973, Cold Spring Harbor Laboratory; pages 226-277 et 236237 dans "RNA Tumor Viruses" (virus de tumeur a ARN (acide ribonucléique), publié par R. Weiss, N. Teich, H. Varmus et J. Coffin, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory). Dans le cas spécifique de LAV/HTLV III, il existe des preuves selon lesquelles l'antigène T4, présent dans un sous-groupe de lymphocytes T, est le récepteur ou un composant du récepteur du virus (A. G. Dalgleish et col., 1984, Nature 312:763; D. Kltazmann et col., 1984, Nature

312:767).

Le génome de ARN de LAV/HTLV III est schématisé sur la figure 1. Trois gènes sont généralement reconnus: le gène gag code pour les protéines structurelles internes (protéines de noyau) du virus et définit les antigènes spécifiques du Zj 7720

groupe de virus. Le gêne pol code pour la transcriptase in-

verse associée au virion. Le gêne env code pour les glycopro-

téines virales. D'autres régions, marquées sor et 3'-orf, désignent des zones du génome contenant des cadres à lecture libre; la fonction de ces régions n'est pas actuellement connue. On utilise actuellement un certain nombre de méthodes

pour la prévention et le traitement des infections virales.

Elles comprennent des vaccins qui déclenchent une réponse

immunitaire active, le traitement par des agents de chimio-

thérapie et le traitement par l'interféron.

Les voies traditionnelles de préparation des vaccins

comprennent l'utilisation de virus inactivés ou atténués.

L'atténuation désigne la production de souches de virus qui ont essentiellement perdu leur aptitude & provoquer des maladies. Une voie pour y parvenir consiste à soumettre le virus à des conditions inhabituelles de croissance et/ou à un passage fréquent en culture cellulaire. On choisit ensuite des mutants de virus qui ont perdu de la virulence

mais sont encore capables de déclencher une réponse immuni-

taire. Les virus atténués constituent généralement de bons immunogénes, car ils se répliquent dans la cellule de l'h6te et déclenchent une immunité de longue durée. Cependant, on rencontre plusieurs problèmes lors de l'utilisation de vaccins

vivants, dont le plus gênant est une atténuation insuffisante.

Au lieu des méthodes ci-dessus, on peut utiliser ce que l'on appelle les vaccins de sous-unités, ou sous-unités de vaccins. Cela implique une immunisation obtenue seulement à l'aide des protéines contenant le matériel immunologique

concerné. Pour de nombreux virus à enveloppe, la glycopro-

téine à codage viral contient les épitopes capables de déclen-

cher la production d'anticorps neutralisants. Un avantage des

vaccins de sous-unités est que le matériel viral non-inté-

ressant est exclu.

Les vaccins sont souvent administrés en association avec divers adjuvants. Les adjuvants aident à atteindre un niveau plus durable et plus élevé d'immunité,en utilisant de plus faibles quantités d'antigènes en de plus faibles

doses que si l'immunogène était administré seul.

L'utilisation de la technologie de l'ADN recombi-

nant pour la production de vaccins de sous-unités implique

le clonage moléculaire et l'expression dans un vecteur appro-

prié de l'information génétique virale codant pour les pro-

téines pouvant déclencher une réponse neutralisante dans l'animal hôte. Tous les autres renseignements génétiques du virus sont exclus et seules les protéines nécessaires pour établir une réponse neutralisante sont présentées à l'animal hôte. L'hôte n'est jamais exposé à la totalité du virus et

il ne risque pas de devenir infecté.

Récemment, une approche a été décrite, qui est

potentiellement utile pour la production de vaccins de sous-

unités (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. 79, 7415-7419; M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864; D. Ranicali et E. Paoletti, 1982, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 4927-4931). Cette approche implique l'utilisation du virus de la vaccine comme vecteur

pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome.

Quand il est introduit dans des hôtes animaux, le virus de

vaccine recombinant exprime le gène étranger inséré et déclen-

che ainsi une réponse immunitaire de l'hôte à de tels gènes.

Puisque le virus virant de vaccine recombinant peut servir de vaccin, une telle approche combine l'avantage des vaccins

de sous-unité(s) et des vaccins vivants.

Le virus de la vaccine contient un génome de ADN

(acide désoxyribonucléique) linéaire à double brin compor-

tant environ 167 kilopaires de bases et il se réplique au sein cytoplasme de cellules infectées. Ces virus contiennent un système complet d'enzymes de transcription (ce qui comprend

les enzymes de coiffage, de méthylation et de polyadényla-

tion) au sein du noyau du virus, qui sont nécessaires pour

l'infectivité du virus. Les séquences de régulation de trans-

cription du virus de la vaccine (promoteurs) permettent

l'amorçage de la transcription par l'ARN polymérase de vac-

cine, mais non pas par i'ARN polymérase des cellules de l'h6te. L'expression de l'ADN étranger dans des virus de vaccine recombinants exige la ligation des promoteurs de vaccine sur des séquences de ADN codant pour des protéines du gène étranger. Des vecteurs de plasmide, appelés également vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes chimères dans des virus de vaccine. Un type de vecteur

d'insertion est composé: (a) d'un promoteur de virus de vac-

cine comprenant le site d'initiation de transcription;

(b) de plusieurs sites de clonage par endonucléase de res-

triction unique, situés en aval du site de début de trans-

cription pour l'insertion de fragments de ADN étrangers; (c) de ADN non essentiel de virus de vaccine (comme le gène

TK) entourant les sites du promoteur et de clonage qui diri-

gent l'insertion du gène chimérique dans la région homologue non essentielle du génome de virus; et (d) d'un marqueur d'origine bactérienne de réplication et de résistance à des

antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E.coli.

Des exemples de tels vecteurs sont décrits par Mackett

(M. Mackett, J.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-

864). Des virus de vaccine recombinants sont produits

par transfection de plasmides d'insertion de bactéries recom-

binantes, contenant le gène étranger, à des cellules précé-

demment infectées par le virus de la vaccine. Une recombinai-

son homologue se produit au sein des cellules infectées et

produit l'insertion du gène étranger dans le génome viral.

Les cellules infectées peuvent être dépistées à l'aide de techniques immunologiques, d'hybridation sur plaque de ADN, ou de choix génétique de virus recombinants que l'on peut isoler par la suite. Ces recombinants de vaccine conservent

leurs fonctions essentielles et leur infectivité et ils peu-

vent être construits de manière à comporter environ 35 kilo-

bases de ADN étranger.

L'expression de gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunlogiques (par exemple par immunoprécipitation, dosage radioimmunologique ou immuno- coagulation). Les glycoprotéines naturelles de membrane

produites par des cellules infectées par de la vaccine recom-

binante sont glycosylées et peuvent être transportées vers la surface des cellules. On peut obtenir des taux élevés d'expression en utilisant des promoteurs forts ou en obtenant

par clonage des copies multiples d'un seul gène.

Récemment, on a décrit une approche qui est poten-

tiellement utile pour la production de protéines recombinantes (Pennock et al., 1984, mol. cel. biol. 4:399, Smith et al. 1983, J. Virol. 46:584). Cette approche implique l'utilisation d'un vecteur de type baculovirus pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. Après introduction dans une cellule d'un hôte approprié, le baculovirus recombinant

exprime le gène étranger.

Le prototype de la famille des baculovirus est Auto-

grapha californica, virus de polyédrose nucléaire (AcNPV).

Le génome de AcNPV consiste en une espèce de ADN circulaire à double brin de 128 paires de kilobases,dont on a dressé

la carte par rapport à plusieurs sites de restriction (G.E.

Smith et M.D. Summers, 1978, Virology 89:517). Le virus se

réplique dans le noyau de cellules d'insectes infectées.

Deux formes de virus sont produites par suite de l'infection,

par AcNPV de type sauvage, de cellules sensibles, des parti-

cules de virus à occlusion et sans occlusion. Des particules de virus à occlusion sont entourées par une protéine appelée polyèdre dont le codage est dû au gène de polyédrine (voir Virol. 131:561-565, 1983). Dans des cellules infectées, les

particules virales à occlusion peuvent être facilement visua-

lisées à l'aide d'un microscope optique.

L'expression de l'ADN étranger dans des baculovirus recombinants exige la ligation des promoteurs de baculovirus sur des protéines codant pour des séquences d'ADN du gène

étranger. Des vecteurs du type plasmide, appelés aussi vec-

teurs d'insertion, ont été construits afin d'insérer des gènes chimères dans AcNPV. Un type de vecteur d'insertion est composé de: (a) un promoteur de AcNPV comprenant le site d'initiation de transcription; (b) plusieurs sites de clona- ge d'endonucléase à restriction unique, situés en aval du site de début de transcription pour l'insertion de fragments d'ADN étrangers; (c) de l'ADN de AcNPV non essentiel (comme le gène de polyédrine) flanquant le promoteur et ies sites de clonage qui dirigent l'insertion du gène chimère dans la région homologue non essentielle du génome de virus; et (d) une origine bactérienne de réplication et un marqueur de résistance aux antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E. coli. Des exemples de tels vecteurs sont

décrits par Miyamota et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860).

On reproduit des baculovirus recombinants par co-

transfection de cellules avec insertion bactérienne recom-

binante de plasmides contenant le gène, avec l'ADN de baculo-

virus. Une recombinaison homologue se produit au sein des cellules infectées et provoque l'insertion du gène étranger dans le génome viral. Une fois un gêne étranger inséré dans le gène de polyédrine, les particules de virus à occlusion ne peuvent plus être produites et les plaques recombinantes résultantes peuvent être examinées visuellement pour y déceler

l'absence des corps à occlusion. Les cellules infectées peu-

vent également être dépistées à l'aide de techniques immuno-

logiques, d'une hybridation de plaques de ADN, ou d'une sélection génétique donnant des virus recombinants que l'on

peut isoler par la suite. Ces baculovirus recombinants con-

servent leurs fonctions et infectivité essentielles.

L'expression des gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunologiques (par exemple

par immunoprécipitation, dosage radio-immunologique ou immu-

nocoagulation). On peut obtenir des niveaux élevés d'expres-

sion en utilisant des promoteurs forts ou en clonant des

copies multiples d'un gène unique.

On va décrire des virus qui dirigent l'exDression de peptides ou protéines apparentés à des épitopes de LAV/ HTLV III. Les virus recombinants de la présente invention,

qui expriment des épitopes apparentés à LAV/HTLV III susci-

tant une réponse d'immunoprotection, peuvent être formulés sous forme de vaccins contenant des virus pour protéger les êtres humains contre l'infection due à LAV/HTLV III. Dans une forme particulière de mise en oeuvre de la présente invention, on peut préparer des formulations de vaccins à

virus vivants, en utilisant des virus infectieux qui expri-

ment de tels épitopes apparentés à LAV/HTLV III dans un hôte infecté, mais ne provoquent pas une telle maladie chez cet hôte. L'invention vise également des peptides ou protéines apparents aux épitopes de LAV/HTLV III. On peut formuler les

peptides ou protéines qui suscitent une réponse d'immuno-

protection, en des vaccins de sous-unités ou en des vaccins

multivalents pour protéger les êtres humains contre une infec-

tion par LAV/HTLV III. En variante,, on peut utiliser les peptides ou protéines de l'invention pour des essais et dosages diagnostiques de dépistage du SIDA ou de LAS. On peut produire les peptides ou protéines de la présente invention dans n'importe quel système de vecteur d'expression dans des cellules d'hôtes et les isoler à partir de ce système; cela comprend, par exemple, des cultures de cellules animales ou d'insectes infectées par du virus recombinant approprié; des microorganismes comme des bactéries transfectées par des plasmides recombinants, des cosmides ou des phages; et de

la levure transformée à l'aide de plasmides recombinants.

La présente invention propose également des méthodes, des modes opératoires et des constructions de ADN servant à

l'expression de l'information génétique codant pour les épi-

topes de LAV/HTLV III. En variante, on peut.effectuer la syn-

thèse chimique des peptides et protéines de la présente invention. Dans des formes spécifiques de mise en oeuvre de la présente invention, on insère dans des plasmides les

séquences de gènes codant pour les glycoprotéines d'enve-

loppe ou les protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III (c'est-àdire les séquences de gène de env ou gag de LAV/ HTLV III, respectivement) , de manière qu'un promoteur de virus de vaccine antérieur soit placé en 5' par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) des séquences de gène

LAV/HTLV III, ce qui donne la construction de gènes chimè-

res flanqués ou entourés par des séquences de thymidine

kinase (TK) de ADN de vaccine. Ces plasmides ont été trans-

fectés dans des cellules qui ont été au préalable infectées par du virus de vaccine de type sauvage, en laissant ainsi le gène env ou gag chimère de LAV/HTLV III, flanqué par les séquences de TK, se recombiner dans le gène TK du virus de vaccine. On laisse les cellules se lyser et l'on cultive les virus résultants sur des plaques de cellules de TK-. On choisit les virus recombinants d'après leur aptitude à se fixer sur des cultures de ces cellules en plaques en présence

de la 5-bromo-désoxyuridine ainsi que par hybridation ADN-

ADN sur une sonde radiomarquée appropriée comprenant des

séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III ou de gag LAV/HTLV III.

On a purifié des plaques positives pour l'hybridation, on

en a provoqué l'expansion et l'on a soumis les virus recom-

binants résultants à des essais de détermination de leur aptitude à produire des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/ HTLV III ou des protéines de structure de.noyau de LAV/HTLV III. Les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III,

exprimées par les virus de vaccine recombinants se sont avé-

rées être antigéniques et immunogènes, et capables de susci-

ter chez des primates sub-humains une immunité à médiation aussi bien humorale que cellulaire. Les protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III, exprimées par les virus de vaccine recombinants, ont été des protéines immuno-réactives qui contenaient les épitopes majeurs des protéines de noyaux authentiques. Dans d'autres formes spécifiques de réalisation de la présente invention, on a inséré des séquences env ou gag de LAV/HTLV III dans un plasmide de façon qu'un promoteur de polyêdrine de baculovirus soit placé en position 5' par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) du gène de LAV/HTLV III suivie par des séquences d'ADN de polyédrine & l'extrémité 3'. On a ensuite co- transfecté ces plasmides

dans des cellules avec de l'ADN de baculovirus de type sauva-

ge, en laissant le gène chimère de LAV/HTLV III flanqué par des séquences additionnelles de AcNPV se recombiner dans

le gène de polyédrine du baculovirus. On a laissé les cellu-

les subir une lyse et l'on a cultivé les virus résultants sur des plaques. Par examen visuel pour déceler le manque de corps à occlusion ou par hybridation de ADN-ADN sur des sondes radiomarquées env/HTLV III ou gag de LAV/HTLV III,

on a effectué la sélection de virus recombinants. On a puri-

fié des plaques recombinantes et l'on en a provoqué la propa-

gation, et l'on a soumis les virus recombLnants résultants à des dépistages de détermination de leur aptitude à produire

des protéines apparentées à LAV/HTLV III par immunoprécipita-

tion suivie d'une analyse sur des gels de SDS (dodécylsulfate de sodium)polyacrylamide. On a soumis des lysats de cellules infectées à des essais de détermination de leur aptitude à

déceler des anticorps de LAV/HTLV III dans du sérum par ELISA.

On va maintenant brièvement décrire les figures annexées.

La figure 1 représente la structure de génome provi- ral intégré de LAV/HTLV III. Les zones hachurées indiquent des régions de

cadres 'à lecture ouverte. Les régions codant

pour l'antigène spécifique du groupe, la transcriptase inver-

se et les protéines d'enveloppe sont désignées respectivement par gag (groupe-spécifique antigène), pol et env. Les cadres à lecture ouverte qui se chevauchent sont représentés par

des zones à hachurage croisé. Les nombres désignent les nom-

bres de paires de base en aval du site de coiffage (site de "cap"), o démarre la transcription virale. Les sites de restriction sont marqués comme suit: Bg, BglII; Ec, EcoRI;

Hn, HindIII; kp, kpnI; Ss, SstI.

Les figures 2A et 2B représentent la séquence des nucléotides de la région spécifique de LAV/HTLV III (EcoRi à SstI) présentes dans le plasmide pRS-3 ADN; la totalité du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III (nucléotide 5766 à 8349) est contenue dans l'insertion LAV/HTLV III. Les sites de restriction utilisés dans la construction de pv-envl, pv-env2 et pv-env5 sont indiqués. La totalité de la séquence des amino acides du gène de l'enveloppe, telle que déduite des données des séquences de nucléotides, est

également indiquée.

La figure 3 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant une portion de la séquence codant pour des protéines d'enveloppe LAV/HTLV III, séquence insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. La séquence codant pour l'enveloppe de LAV/HTLV III est représentée par la barre libre et le promoteur de vaccine par la barre ombrée ou hachurée. La séquence des nucléotides à la jonction de la région de promoteur de vaccine et de la séquence codant pour l'enveloppe LAV/HTL\I III est indiquée à la partie inférieure de la figure. Les séquences soulignées indiquent les codons

présumés d'amorçage et le cadre de lecture pour le gène chimé-

rique. On notera que les troisième et quatrième amino-acides de la séquence translatée (Pro-Val) du pv-env2 recombinant correspondent aux aminoacides numéro 43 et 44 de la séquence

de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III.

La figure 4 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant la totalité de la séquence de codage des protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III

insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le promo-

teur de virus de vaccine est représenté par la barre hachurée ou ombrée. Le plasmide pv-env5 contenant la totalité de la région de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III a été construit en deux étapes. Les portions 5' et 3' de la région de codage ont été tout d'abord clonées séparément dans pGS20 pour former pv-envl qui contient l'extrémité amino de codage du gène de

l'enveloppe de LAV/HTLV III et pv-env2 qui contient l'extré-

mité carboxyle de codage du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Ces deux portions sont regroupées au site StuI comme

représenté.

La figure 5 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant la séquence de codage des protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III, sans la séquence transmembrane (ancrage), insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le plasmide pv-env7 a été construit en deux étapes. La partie 5' de pv-env 5 a été insérée dans p26 pour former un plasmide intermédiaire, pv-env5/26, qui a fourni une séquence de terminaison par translation dans le cadre (TAA) donnant un géne env tronqué. On a ensuite inséré la séquence env tronquée, terminée par TAA, dans pG20 afin de construire pv-env7 dans lequel le gène env tronqué est flanqué

par des séquences de gène de TK de vaccine.

La figure 6 représente la construction et le choix

du virus de vaccine recombinant. Les barres pleines repré-

sentent le gène de thymidine kinase (TK) du virus de la vaccine. Ce gène TK est aussi présent dans le plasmide pv-env5 ADN, mais dans le plasmide le gène TK est interrompu par le gène chimère consistant en le promoteur à 7,5K de la

vaccine (barre hachurée) et par la région de codage d'enve-

loppe de LAV/HTLV III (barre ouverte). Après infection des cellules par la vaccine, le plasmide recombinant contenant le gène TK interrompu par le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III est introduit dans les cellules infectées. Les recombinaisons qui se produisent dans les séquences TK entourant le gène chimique introduisent la séquence de gène d'enveloppe de LAV/ HTLV III dans le génome de virus de la vaccine. Le virus recombinant résultant, contenant le gène d'enveloppe de LAV/

HTLV III,est TK.

Les figures 7A et 7B représentent une caractérisation des struc-

* tures de génome des virus de vaccine recombinants contenant le gène env d'un LAV/HTLV III. La figure 7A représente une

analyse, A l'aide d'une enzyme de restriction, des recombi-

nants de vaccine v-env5 et v-env5NY ainsi que leurs souches

de vaccine parentale respectives (WR et v-NY, respectivement).

Des fragments de ADN engendrés par des produits de digestion

par l'enzyme de restriction HindIII ont été résolus par élec-

trophorèse sur un gel d'agarose et colorés par du bromure

d'éthidium afin de visualiser les bandes. La figure 7B repré-

sente le caillot du Sud (Southern) obtenu après transfert

des fragments résolus par restriction sur de la nitrocellu-

lose et hybridation sur une sonde à translation par étrangle-

ment, spécifique des séquences d'enveloppe LAV/HTLV III.

La figure 8A représente une analyse par immunocoa-

gulation de Western ("ouest") des protéines produites par les recombinants de env-LAV/HTLV III de vaccine. Les protéines provenant

des sources suivantes ont été résolues sur un gel de polyacryl-

amide à gradient de 7 à 15 % de SDS et électrotransférées sur du papier nitrocellulosique: protéines de virion de' LAV/HTLV III (LAV/HTLV III); cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage ("WTvv"); ("Wild-type vaccinia

virus"); cellules non infectées ("mock"); cellules infec-

tées par des virus recombinants v-env2 (v-env2) ou v-env5 (v-env5). Des protéines immunoréatives A l'égard du sérum d'un patient atteint de SIDA ont été décelées par l'action

d'une peroxydase conjugée à des anticorps de IgG anti-humaines.

Les gènes LAV/env produits sont indiqués par gp150, gpllO et gp41. Les étalons de poids moléculaire sont exprimés en

kilodaltons (kd).

La figure 8B représente une analyse d'un immunocoa-

gulat de Western de protéines produites par des recombinants de vaccine LAV-env dans deux types de cellules. Les protéines provenant de cellules BSC-40 ou de cellules HeLa ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide

(SDS-PAGE) et électrotransférées sur du papier nitrocellulo-

sique,puis mises en réaction avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif pour LAV/HTLV-III; les pistes 1 et 5 représentent les cellules infectées par "mock"; les pistes 2 et 6 représentent des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage; les pistes 3 et 7 représentent des cellules infectées par v-env5; et les pistes 4 et 8 représentent des cellules infectées par v-env2. On a décelé des protéines immunoréactives en utilisant de la protéine A marquée par 125I. Les produits de type gène de

LAV-env sont indiqués par gp150, gpll0 et gp41.

La figure 9A représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines synthétisées dans des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage ("WTvv") ou par du virus de vaccine recombinant (v-env2 et v-env5). Les protéines ont été marquées par de la 35S-méthionine de 10 à 12 heures après l'infection. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (N) ou avec du sérum

de patient atteint de SIDA (I) et l'on a provoqué la précipi-

tation des immun complexes par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 15 % de SDS et détectées par fluorographie. Les poids moléculaires sont

indiqués en kilodaltons (kd).

La figure 9B représente les résultats d'une analyse

par radioimmunoprécipitation de protéines marquées par 3H-

glucosamine Droduites par effet d'expression des recombinants de vaccineLAV/HTLV III de l'invention. Les cellules Hela ont été soit

"infectées" par des cellules non infectieuses ("mock"; non-

infection) (pistes 1 et 5),soit infectées par des virus de vaccine de type sauvage (pistes 2 et 6), v-env5 (pistes 3

et 7) ou v-env2 (pistes 4 et 8) et marquées par de la 3H-

glucosamine. Les lysats de cellules ont été immunoprécipités avec du sérum humain normal (pistes 1-4) ou avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III (pistes 5-8) et de la protéine A. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur

gel de SDS-polyacrylamide.

La figure 9C représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation "par impulsions de chasse" des

protéines d'enveloppe LAV/HTLV III produites par les recom-

binants de vaccine LAV/HTLV III. On a infecté des cellules HeLa avec du virus de vaccine de type sauvage, v-env5 ou v-env2 comme indiqué, marqué par 35S-méthionine, et on a lavé avec un milieu de chasse. Aux intervalles suivants de

temps, on a lavé les cellules, on les a lysées et immuno-

précipitées avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III et l'on a résolu par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide): 0 heure (pistes 1, 7, 13); une demi-heure (pistes 2, 8, 14); 1 heure (pistes 3, 9, 15); 2 heures (pistes 4, 10, 16); 6 heures (pistes 5, 11, 17) et 12 heures (pistes 6, 12, 18). La piste M représente des marqueurs comprenant des étalons de poids moléculaire marqués par 14C. La figure 9D représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III que l'on trouve dans les cellules et dans des milieux provenant de cellules infectées par les

virus de vaccine-LAV/HTLV III recombinants de l'invention.

Des cellules HeLa ont été soit "infectées" par des virus non infectés (c'est-à-dire non infectées; piste 1 "mock"), soit infectés par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2)

v-env5 (piste 3) ou v-env2 (piste 4) et marquées par 35S-

méthionine. Les cellules ont été séparées du milieu et lysées.

Les lysats de cellules (culot) et le milieu supérieur surnageant ont été chacun immunoprécipités à l'aide de sérum groupe provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par

électrophorése sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).

La figure 9E représente le résultat d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules et dans des

milieux provenant de cellules infectées par des virus recom-

binants de vaccine-LAV/HTLVL III de l'invention. v-env5 recombinant contient la totalité de la séquence de codage de l'enveloppe de LAV/HTLV III, alors que v-env7 contient la séquence de codage d'envelopee de LAV/HTLV III sauf la région de transmembrane (ancrage). Les cellules Hela ont été soit "infectées" par des virus non infectés (c'est-à-dire non infectés; piste 1 "mock"), soit infectées par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2), v-env5 (piste 3) ou v-env7 (piste 4), et marquées par 35S-méthionine. Les cellules ont été séparées du milieu et lysées. Les lysats de cellules

(culot) et le milieu (surnageant) ont été chacun immunopréci-

pités à l'aide de sérum groupé provenant de personnes a sérum

positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunopré-

cipitées ont été résolues par électrophorèse sur gel de poly-

acrylamide (SDS-PAGE).

La figure 10 représente une analyse par immunocoa-

gulation de type Western d'échantillons de sérum provenant de souris immunisées par des virus recombinants da vaccine-LAV/ HTLV III. Las souris avaient été immunisées avec du virus da vaccine recombinant v-env5 ou v-env2. Au bout de 8 semainas, on a fait réagir las échantillons de sérum avac des protéines de virion LAV/HTLV III qui avaient été résolues par électrophorèse sur SDS-PAGE (gel de polyacrylamida) at électrotransférées

sur du papier nitrocellulosique. On a utilisé una immunoglo-

buline anti-souris de chèvre conjuguée & de la phosphatasa alcalina pour déceler les protéines LAV/HTLV III qui ont été reconnues par les sérums de souris. Les pistes a & e représentent les échantillons de sérum de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-anv5, et las pistes f à k représentent des échantillons de sérum provenant de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-env2. Les sérums groupés provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III (SIDA) et de souris non immunisées C57B16J- (NMS) ont servi de témoins

positif et négatif, respectivament. Les positions des glyco-

protéines d'enveloppe LAV/HTLV III gpl50, gpll0 et gp43 sont indiquées.

La figure 1i est un histogramms'rêprésentant la sêro-

conversion de singes màcaques vaccinés par du virus de vaccine recombinant, v-env5. On a inoculé a 4 singes macaques, par scarification de la peau, 2 x 10 unités de formation de plaque et à 4 singes 2 x 107 unités de formation de plaque

de v-env-5. On a inoculé à 1 animal 2 x 107 unités de forma-

tion de plaque de recombinant témoin vaccine-herpès simplex gD (v-HSVgD1). Dix semaines après la première inoculation, on a administré a tous les animaux, sauf la numéro 81, une seconde inoculation de 2 x 108 unités de formation de plaque du même virus. On a collecté des échantillons de sérum avant inoculation (barres ouvertes); 4 semaines après la première inoculation (barres hachurées; et 4 semaines après la seconde

inoculation (barres pleines). On a vérifié et titré la séro-

conversion par ELISA, en utilisant des virions purifiés de

LAV/HTLV III comme antigène cible.

La figure 12 représente une analyse par immunocoagu-

lation de Western, d'échantillons de sérum provenant de singes macaques immunisés par des virus recombinants de vaccine- LAV/HTLV III, v-env5, comme décrit pour la figure 11. On a

collecté des échantillons de virus avant la première inocula-

tion (piste pré) et au bout de 4 semaines après la seconde inoculation. On a dilué des parties aliquotes du sérum 50 fois et on l'a fait réagir avec de la protéine de virion de LAV/HTLV V qui a été résolue par chromatographie sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immobilisée sur des filtres en

nitrocellulose, par électrotransfert en utilisant un proto-

cole qui permet la détection optimale des deux glycoprotéines d'enveloppe, gpllO (figure 12A) et gp41 (figure 12B). Les protéines de LAV/HTLV III reconnues par les sérums de macaques ont été décelées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline. On a utilisé

comme témoin positif des sérums regroupés provenant de per-

sonnes Aru positifpourla recherche de LAV/HTLV III (SIDA). On a utilisé comme témoin des virions authentiques

de LAV/HTLV III (SIDA).

La figure 13 représente une analyse par immunocoa-

gulation de Western de ces échantillons de sérum provenant de chimpanzés immunisés par des virusrecombinants de vaccine NY-LAV/HTLV III, v-env5NY. A deux chimpanzés, on a inoculé par voie intradermique 5 x 108 unités de formation de plaque de v-env5NY, cependant qu'on a inoculé à un animal la même dose de v-HSVgD1NY, un recombinant de vaccine-virus d'herpès simplex gD construit à partir de la même souche de vaccine

parentale-NY. Tous les animaux ont reçu une seconde inocula-

tion 8 semaines après la première inoculation. On a collecté des échantillons de sérum avant immunisation (piste 1), 8 semaines après l'immunisation primaire (piste 2) et 2 semaines après la seconde immunisation (piste 3). On a dilué fois des parties aliquotes de sérum et on les a fait réagir avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui ont été

résolues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-

PAGE) et immobilisées sur des filtres nitrocellulosiques par électrotransfert, en utilisant un protocole qui permet la meilleure détection possible de gp 41. Les protéines de LAV/ HTLV III reconnues par les sérums de chimpanzés ont été déce-

lées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conju-

guée à de la phosphatase alcaline. On a utilisé comme témoin positif des sérums groupés provenant de personnes dont le

sérum était positif a la recherche de LAV/HTLV III (SIDA).

Les figures 14A à 14D représentent la séquence des nucléotides

de la région spécifique de LAV/HTLV III (SstI à KpnI) pré-

sentes dans l'ADN de plasmide pKS-5; la totalité du gène gag LAV/HTLV III (nucléotides 340 à 1835) est contenue dans la partie insérée de LAV/HTLV III. Les sites de restriction utilisés pour la construction de pAc-gagl sont indiqués. La totalité des séquences des amino-acides du gène gag, telle que déduite des renseignements concernant la séquence des

nucléotides, est également indiquée.

La figure 15 est une représentation schématique de la construction du plasmide pAc-gagl contenant la séquence de codage des protéines gag LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur AcNPV. Le vecteur de clonage pAc610 contient des séquences de nucléotides correspondant au promoteur de gène de polyédrine et il comprend les séquences de tête en 5' et les séquences de polyédrine en 3' interrompues par des sites

de clonage situés en aval du site de début de transcription.

Les sites de clonage à la position -8 sont EcoRI, SstI, SmaI (XmaI), BamHI, XbaI et PstI. SalI, AccI et HincII ne sont

pas uniques. I1 n'y a présence de sites pour KnpI ou BglII.

La figure 16 représente schématiquement la construc-

tion et la sélection du recombinant AcNPV (Ac-gagl). La barre hachurée indique les séquences de promoteur de polyédrine et de tête en 5'. Les barres pleines représentent le gène de polyédrine de baculovirus. Les parties de ce gène sont présentes dans le plasmide pAc-gagl ADN, interrompues par la région de codage de LAV/HTLV III gag (barre ouverte). Des

cellules sont co-transfectées avec de l'ADN de plasmide recom-

binant contenant des portions du gène de polyédrine interrom-

pues par le gène LAV/HTLV III gag (pAc-gagl) avec de l'ADN

de AcNPV de type sauvage. Des recombinaisons qui se produi-

sent dans les séquences de polyédrine flanquant le gêne chimère introduisent la séquence de gène LAV/HTLV III gag

dans le génome de AcNPV.

La figure 17 représente une analyse de coagulation de Northern (Nord) de l'ARN extrait de cellules de Spodoptera frugiperda infectées par AcPNV de type sauvage et Ac-gagl,

en utilisant des ondes spécifiques pour LAV/HTLV III gag.

La figure 18 représente le résultat d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines exprimées dans

des cellules infectées par du baculovirus Ac-gagl recombinant.

Les protéines ont été marquées par la (35S) méthionine,pendant 2 heures, à 24 heures (pistes 1, 2), 48 heures (pistes 3, 4)

et 72 heures (pistes 5, 6) après l'infection. On a fait réa-

gir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (pistes 1, 3, 5) ou avec le sérum d'un patient atteint de SIDA (pistes 2, 4, 6), et les immun-complexes ont été précipités par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide

à 10 % de SDS et détectées par fluorographie. Les poids molé-

culaires sont indiqués en kilodaltons.

La figure 19 représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation "par impulsions de chasse" des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag que l'on trouve dans

des cellules infectées par l'AcNPV recombinant de l'invention.

On a infecté des cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) avec Ac-gagl et on les marquées par impulsions durant 5 minutes à 24 heures après l'infection. On a ensuite lavé les cellules avec un milieu complet et on les fait incuber avec du milieu complet durant 0 heure (pistes 1, 2), 2 heures (pistes 3, 4), 4 heures (pistes 5, 6) et 8 heures (pistes 7, 8). Aux moments indiqués, on a lavé les cellules, on les a lysées

et immunoprécipitées avec du sérum groupé provenant de per-

sonnes séropositives pour LAV/HTLV III (pistes 2, 4, 6, 8) ou du sérum humain normal (pistes 1, 3, 5, 7). Les protéines

ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacry-

lamide.

La figure 20 représente schématiquement la construc-

tion de cinq plasmides, pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 contenant le promoteur de virus de vaccine 7,5K fixé par ligature sur diverses longueurs du génome de LAV/ HTLV III contenant des séquences de codage de gag. Le vecteur de clonage pGS62 que l'on utilise dans ces constructions est identique à pGS20 (voir figure 3), sauf qu'il comporte un

site unique EcoRI situé en aval du site unique SmaI de pGS20.

La figure 21 représente les résultats d'une analyse d'immunocoagulation de type. Western (Ouest) des protéines exprimées dans des cellules infectées par des virus LAV/HTLV III de vaccine recombinants (v-gaglNY, v- gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY et v-gag5NY), le virus de vaccine de départ (v- NY) et des cellules "infectées" par des cellules non infectieuses ("MOCK") . Des échantillons de virions LAV/HTLV III purifiés ("LAV/HTLV III") ont été inclus comme témoins positifs. Des cellules BSC-40 confluentes ont été infectées à un indice de multiplicité d'infection de 10. On a laissé l'infection

se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récol-

té les cellules et on les a lysées. Les protéines cellulaires

totales ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-

PAGE et immobilisées par électrotransfert sur de la nitro-

cellulose. On a fait réagir les filtres avec (1) du sérum de patient atteint de SIDA (figure 21B) qui a été décelé à l'aide d'une immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline; (2) anticorps monoclonaux de souris qui définissent des protéines gag p25 et p18 (figures 21A et 21C), que l'on a ensuite décelées en utilisant de l'immunoglobuline anti-souris de chèvre conjuguées & de la

phosphatase alcaline.

La figure 22 représente schématiquement l-a construc-

tion du plasmide pAc-env5 contenant la totalité de la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur de polyédrine AcNPV. Le vecteur de clonage pAc610

est décrit sur la figure 15 ci-dessus.

La figure 23 représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines exprimées dans

des cellules infectées par du baculovirus recombinant Ac-

env5. Des cellules "infectées" par des virus non infectieux ("MOCK") et la souche de baculovirus de départ (AcNPV) sont incluses à titre de témoins. Les protéines exprimées par des cellules Sf9 infectées ont été marquées, 28 heures après l'infection, durant 2 heures par 35S-méthionine. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum de patient atteint de SIDA ou avec des anticorps monoclonaux de souris qui définissent gpll0 ou gp41, et les immun- complexes ont été précipités à l'aide de la protéine A de Staphylococcus aureus. On a résolu, par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, et l'on a décèle par

fluorographie les protéines immunoprécipitées.

On va maintenant présenter une description plus

détaillée de l'invention.

La présente invention vise l'obtention de virus qui

produisent les peptides; et protéines apparentés à des épi-

topes de LAV/HTLV III. L'invention vise également des peptides et protéines apparentés a des épitopes de LAV/HTLV III, que l'on peut produire en utilisant des méthodes faisant appel à de l'ADN recombinant ou par synthèse chimique. Les virus ou peptides et protéines de la présente invention qui peuvent

susciter une réponse de protection immunitaire peuvent ser-

vir d'immunogènes dans diverses formulations de vaccins, ce qui comprend des formulations de vaccins multilvalents, pour protéger contre une infection par LAV/HTLV III, qui est l'agent responsable de LAS (syndrome d'adénopathie) et du

SIDA. En variante, on peut utiliser comme antigènes les pep-

tides ou protéines de l'invention, dans des essais ou dosages immunologiques diagnostiques pour la détection, chez un patient, d'anticorps spécifiques de LAV/HTLV III. Les peptides

ou protéines que l'on utilise dans les essais ou dosages immu-

nologiques de l'invention doivent etre antigéniques (c'est-

a-dire capables de réagir avec des anticorps d'un patient concernant LAV/HTLV III), mais ils n'ont pas besoin d'être immunogènes (c'est-à-dire capables de susciter une réponse

immunitaire). En outre, il n'est pas nécessaire que les anti-

gènes utilisés dans l'essai ou dosage immunologique de dia-

gnostic suscitent in vivo une réponse de protection immuni- taire. Selon une forme de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise des techniques faisant appel à de l'ADN recombinant pour insérer des séquences de nucléotides codant des épitopes de LAV/HTLV III dans des vecteurs d'expression qui vont diriger l'expression de séquences de LAV/HTLV III dans des cellules d'hôtes appropriés. Ces systèmes vecteurs d'expression-cellules d'hôtes peuvent servir à produire in vitro des peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III et, dans ce cas, les gènes produits peuvent être purifiés à partir des cellules an culture. Les peptides ou protéines pouvant susciter une réponse de protection immunitaire et

servir d'immunogène dans des formulations de vaccins à sous-

unités. En variante, on peut utiliser des peptides et proté-

ines, immunogènes ou tout simplement antigéniques, de l'inven-

tion à titre d'antigènes dans des essais et dosages immunolo-

giques conçus pour déceler des anticorps de patients spécifi-

ques de LAV/HTLV III. Dans une autre approche pour la produc-

tion des peptides et protéines de l'invention, les séquences des aminoacides de ces peptides et protéines peuvent être

déduites des séquences des nucléotides de LAV/HTLV III conte-

nues dans les recombinants qui expriment des peptides et pro-

téines antigéniques et/ou immunogènes apparentés à LAV/HTLV III. Ces peptides et protéines peuvent ensuite faire l'objet de synthèses chimiques et servir dans des formulations de vaccins à sous unités synthétiques (s'ils sont immunogènes)

ou à titre d'antigènes dans des essais ou dosages immunolo-

giques pour diagnostics (s'ils sont antigéniques et/ou immu-

nogènes). Quand le vecteur d'expression est un virus qui dirige l'expression d'un immunogène relié à un épitope de LAV/HTLV III capable desusciter une réponse de protection immunitaire, le virus lui-même peut être formulé à titre de vaccin. Des virus recombinants infectieux, qui ne déclenchent pas une maladie dans l'hôte, peuvent servir dans des préparations

de vaccins à virus pour conférer une immunité importante.

En variante, on peut préparer des vaccins contenant des virus inactivés, quand on utilise des virus "tués". En outre, on peut préparer des vaccins multivalents contenant des épitopes de LAV/HTLV III ainsi que ceux d'autres agents provoquant

des maladies.

A seule fin de présenter une description claire,

le procédé de l'invention peut être divisé en les étapes sui-

vantes: (a) isolement d'un gène, ou fragment de gène, codant des protéines de virus LAV/HTLV III; (b) insertion du gène, ou du fragment de gène, dans des-vecteurs d'expression; (c) identification et croissance du vecteur d'expression recombinant dans un système hôte qui est capable d'assurer la réplication et l'expression du gène; (d) identification et purification du produit obtenu à l'aide du gène; (e) détermination du pouvoir immunitaire du produit, et

(f) formulation d'un vaccin.

Dans des formes spécifiques de mise en oeuvre de l'invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants et de baculovirus contenant le gène d'enveloppe

de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immuno-

logiquement liées aux protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules en culture tissulaire infectées par les virus recombinants. Dans d'autres formes de réalisation de la présente invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants et de baculovirus contenant le gène gag de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immunologiquement apparentées aux protéines de structure de noyaux de LAV/HTLV III dans des cellules de culture de ces tissus infectées par les virus recombinants. Cependant, les compositions et procédés que l'on décrit ici ne se limitent pas à la construction de virus recombinants exprimant des protéines apparentées à l'enveloppe ou à gag de LAV/HTLV III, et ils peuvent servir à construire des recombinants dans

n'importe quel système de vecteurs d'expression pour la produc-

tion de polypeptides apparentés à des antigènes de n'importe

quel agent éthiliogique du SIDA.

Pour la clarté de l'exposé, la totalité du procédé sera étudiée en termes de gènes d'enveloppe et gag de LAV/ HTLV III. La même technique, cependant, peut être appliquée de façon analogue pour construire des vecteurs d'expression recombinants et pour produire des polypeptides apparentés à n'importe laquelle des protéines de LAV/HTLV III ainsi que 101 ceux de virus apparentés. De telles protéines comprennent, sans que ce soit limitatif, les produits des gènes de LAV/

HTLV III, comme gag, pol et env et au moins quatre gènes sup-

plémentaires appelés à ce jour: sor, tat, 3'-orf et un gène diversement appelé art ou trs (voir Fisher et al, 1986,

Science 233:655-659).

ISOLEMENT DE GENES, OU DE FRAGMENTS DE GENE, CODANT DES

PROTEINES VIRALES LAV/HTLV III

L'isolement des gènes de LAV/HTLV III implique tout

d'abord l'isolement de fragments de ADN contenant les séquen-

ces de gènes d'enveloppe. Comme précédemment expliqué, LAV/ HTLV III possède un génome de ARN et, donc, on peut obtenir

l'ADN correspondant qui code le gène LAV/HTLV III (a) en clo-

nant par ADNc l'ARN isolé de virions purifiés de LAV/HTLV III, ou (b) en clonant par ADNc de l'ARN contenant du polylAI que l'on obtient à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III, ou (c) en clonant de l'ADN de génome purifié à partir

de cellules infectées par LAV/HTLV III. Ci-après, on appelle-

ra l'ADN codant les gènes de LAV/HTLV III de'l'ADN de LAV/

HTLV III.

Afin d'engendrer des fragments de ADN de LAV/HTLV

III, on peut cliver l'ADN de LAV/HTLV III en des sites spéci-

fiques, en utilisant diverses enzymes de restriction. En

variante, on peut utiliser de l'ADN ase en présence de man-

ganèse pour fragmenter l'ADN, ou bien l'on peut cisailler

physiquement l'ADN, par exemple par traitement aux ultrasons.

On peut ensuite séparer les fragments linéairea de ADN, selon

leurs dimensions, par des techniques classiques, ce qui com-

prend, sans que ce soit limitatif, une électrophorése sur gélose et gel de polyacrylamlide et une chromatographie sur colonne.

On peut utiliser n'importe quelle enzyme de restric-

tion ou n'importe quelle combinaison d'enzymes de restriction pour engendrer un ou des fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences gag ou d'enveloppe, à la condition que les enzymes ne détruisent pas l'antigénicité du produit protéinique de gène. Par exemple, le site antigénique d'une

protéine peut consister en environ 7 à environ 14 aminoacides.

Ainsi, une protéine de la dimension du peptide précurseur

d'enveloppe (environ 97 000 daltons) peut comporter de nom-

breux sites antigéniques séparés, peut-être des milliers en considérant les séquences en recouvrement, des considérations de structures secondaires et tertiaires et des possibilités de traitement comme l'acétylation, la glycosylation ou la phosphorylation. Donc, de nombreuses séquences partielles de gènes polypeptidiques d'enveloppes risquent de coder pour

un site antigénique. Par conséquent, on peut utiliser de nom-

breuses combinaisons d'enzymes de restriction pour engendrer

des fragments de ADN qui, quand ils sont insérés dans un vec-

teur approprié, sont capables de diriger la production de séquences d'aminoacides spécifiques d'enveloppe comprenant

différents déterminants antigéniques.

Une fois les fragments d'ADN engendrés,on peut réa-

liser d'un certain nombre de façons une identification du fragment spécifique d'ADN contenant le gène d'enveloppe LAV/ HTLV III. En premier lieu, il est possible de séquencer les fragments d'ADN correspondant à la totalité du génome de LAV/ HTLV III,puis d'identifier les fragments contenant la séquence de gènes protéiniques d'enveloppe ou de gène gag en se fondant sur une comparaison de la séquence des aminoacides prédite et de la séquence des aminoacides de la protéine d'enveloppe

ou des protéines de noyau gag. En second lieu, une fois déter-

minée la totalité de la séquence de génome, on peut ordonner

de 5' à 3' les grands cadres à lecture ouverte. Comme l'orga-

nisation de génome de tous les rétrovirus examinés jusqu'à présent est 5'gag-pol-env-3', le grand cadre a lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 3' risque très probablement de coder pour le gène d'enveloppe, alors que le grand cadre à lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 5' risque très probablement de coder pour le gène gag. En troisième lieu, on peut effectuer une identification probable d'un gène spécifique par reconnaissance de l'homologie avec d'autres gènes de rétrovirus connus, par des analyses d'hybridation d'acides nucléiques ou des comparaisons de séquences si les

séquences sont connues.

En variante, le fragment contenant le gène protéi-

nique d'enveloppe peut être identifié par sélection de ARNm.

Dans ce mode opératoire, on utilise les fragments de ADN LAV/

HTLV III pour isoler, par hybridation, les ARNm complémen-

taires. Une analyse par immunoprécipitation des produits de translation in vitro des ARNm isolés identifie l'ARNm et donc,

les fragments d'ADN LAV/HTLV III complémentaire qui contien-

nent les séquences des protéines d'enveloppe. Enfin, on peut choisir des ARNm spécifiques de protéines d'enveloppe par

adsorption de polysomes isolés à partir de cellules infec-

tées par LAV/HTLV III sur des anticorps immobilisés dirigés

contre les protéines d'enveloppe ou de gag. On peut synthéti-

ser une ADN d'enveloppe radiomarquée, ADNc (ADN complémen-

taire) en utilisant comme gabarit l'ARNm choisi (provenant

des polysomes adsorbés). L'ARNm radiomarqué ou l'ADNc radio-

marqué peuvent alors servir de sonde pour identifier les fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant des séquences de

gènes d'enveloppe ou de gag. Au lieu d'isoler le gène d'enve-

loppe ou de gag, on peut, sans que cette liste soit limi-

tative, effectuer la synthèse chimique de la séquence de gène elle-même (à la condition que la séquence soit connue) ou transformer ADNc en ARNm qui code le gène d'enveloppe ou gag Une fois identifié et isolé, le fragment d'ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences intéressantes peut être

tout d'abord inséré dans un vecteur de clonage, tel un sec-

teur de clonage de plasmide, qui sert à transformer des cel-

lules hôtes appropriées afin de provoquer la réplication de l'ADN de manière à engendrer de nombreuses copies des séquences intéressantes de LAV/HTLV III. On peut y parvenir en provoquant la ligation du fragment de ADN de LAV/HTLV III dans un vecteur de clonage comportant des terminaisons cohé- sives complémentaires. Cependant, si les sites de restriction complémentaires servant à fragmenter l'ADN de LAV/HTLV III

ne sont pas présents dans le vecteur de clonage, les extré-

mités des molécules de ADN risquent d'être modifiées. De telles modifications comprennant la production d'extrémités émoussées par digestion des terminaisons de ADN à simple brin ou par garnissage des terminaisons à simple brin de manière que les extrémités puissent subir une ligation d'extrémité émoussée. En variante, on peut produire n'importe quel site voulu en fixant par ligation des séquences de nucléotides (agents de liaison) sur les terminaisons d'ADN; ces agents de liaison ligaturés peuvent comprendre des oligonucléotides spécifiques, synthétisés par voie chimique, et codant des séquences de reconnaissance de sites de restriction. Selon

d'autres procédés, on peut modifier, par terminaison homo-

polymère, le vecteur clivé et le fragment de ADN de LAV/HTLV III.

La transformation de cellules hôtes par des molé-

cules de ADN recombinants qui incorporent le gène isolé, par ADNc ou une séquence de ADN obtenue par synthèse, permet d'engendrer de multiples copies du gène. Ainsi, le gène peut

être obtenu en grandes quantités par la croissance de trans-

* formants, l'isolement des molécules de ADN recombinant à partir des transformants et, quand cela est nécessaire, la récupération du gène inséré,à partir de l'ADN recombinant isolé. Si le but ultime consiste à insérer le gène dans des vecteurs d'expression de virus, comme le virus de la vaccine ou l'adénovirus, la molécule de ADN recombinant qui incorpore le gène LAV/HTLV III peut être modifiée de manière que le gène soit entouré par des séquences de virus permettant la recombinaison génétique dans des cellules infectées par le virus, de sorte que le gène puisse être inséré dans le

génome viral.

La totalité du génome de LAV/HTLV III a été clonée et séquencée par WainHobson et col. (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9). Un clone, appelé lambda J19, a contenu un fragment de ADN de 9,2 kilopaires de bases d'une séquence de génome de LAV insérée dans le site Hind III de lambda

L 47.1.

Un sous-clone particulièrement utile de lambda J19, contenant le gène d'enveloppe LAV/HTLV III, est pRS-3 qui

consiste en un fragment, à 3840 paires de bases EcoRI vers SstI.

de la séquence de nucléotides de LAV/HTLV III insérée, dans le site EcoRi et SstI de pUC18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pRS-3 se situe entre le site EcoRI placé au nucléotide 5289 et le site SstI placé au nucléotide 9129 sur le génome de LAV/HTLV III (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9); voir la figure 2 qui montre la séquence de nucléotides de LAV/HTLV III contenue dans pRS-3. Cependant, en raison de la dégénérescence des séquences codant pour les nucléotides, on peut utiliser dans la pratique de la présente invention, pour le clonage du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III, d'autres séquences de ADN qui codent pratiquement la même séquence des aminoacides que celle présentée sur- la figure 2. Cela comprend, sans qẻ 6ela soi.t limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de la séquence des nucléotides d'enveloppe représentées sur

la figure 2, qui sont modifiées par remplacement de diffé-

rents codons qui codent le même reste aminoacide ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent au sein de la séquence (par exemple un aminoacide de même polarité), en produisant

un changement silencieux.

Des sous-clones particulièrement utiles de lambda

J19 contenant le gène gag de LAV/HTLV III sont pKS-5 et pSS5.

Le plasmide pKS5 consiste en un fragment de LAV/HTLV III com-

portant 3148 paires de base de SstI vers KpnI dans pUC18.

L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pKS-5 va du site SstI situé sur le nucléotide 224 au site KpnI situé au nucleotide 3372 sur le génome LAV/HTLV III. Le plasmide pSS-5 consiste en un fragment de 5,1 kbp de SstI vers SalI de LAV/

HTLV III dans pUC 18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III conte-

nu dans pSS-5 provient du site SstI situé au nucléotide 224 jusqu'au site SalI situé au nucléotide 5331 sur le génome de LAV/HTLV III. (Wain-Hobson, S. et col., 1985, Cell 40:9), voir figure 14, qui décrit la séquence des nucléotides de

LAV/HTLV III contenue dans pKS-5 et PSS-5. Cependant, en rai-

son de la dégénerescence des séquences de codage des nucléo-

tides, on peut utiliser la pratique de la présente invention,

pour le clonage du gène gag de LAV/HTLV III, d'autres séquen-

ces de ADN qui codent sensiblement la même séquence des amino-

acides que celle représentée sur la figure 14. Cela comprend, sans que cela soit limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de ia séquence des

nucléotides gag représentée sur la figure 14, qui sont modi-

fiés par substitution de codons différents qui codent le même reste aminoacide, ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent, dans la séquence (par exemple un amioacide de

même polarité), en produisant ainsi un changement silencieux.

INSERTION DES SEQUENCES DE CODAGE DE PROTEINES DE LAV/HTLV

III DANS DES VECTEURS D'EXPRESSION

On insère la séquence des nucléotides codant pour la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou une partie de

cette séquence, dans un vecteur d'expression approprié, c'est-

&-dire un vecteur qui contient les éléments nécessaires pour la transcription et la translation de la séquence de codage

de protéines insérées. On peut utiliser divers systèmes hôtes-

vecteurs pour exprimer la séquence de codage des protéines.

Cela comprend, sans que ce soit limitatif, des systèmes de cellules de mammifères infectées par des virus (par exemple le virus de la vaccine, de l'adénovirus, etc.); des systèmes de cellules d'insectes infectées par des virus (par exemple du baculovirus); des micro-organismes comme de la levure contenant des vecteurs ou bactéries de levure transformés par de l'ADN de bactériophage, de l'ADN de plasmide ou de l'ADN de cosmide. Les éléments d'expression de ces vecteurs varient en force et spécificité. Selon le système hôte-vecteur

que l'on utilise, on peut utiliser n'importe lequel d'un cer-

tain nombre d'éléments convenables de transcription et de translation. Par exemple, quand on effectue un clonage dans des systèmes de cellules de mammifères, on peut utiliser des

promoteurs isolés à partir du génome des cellules de mammi-

fères (par exemple un promoteur de type métallothioniène de souris) ou isolés à partir de virus dont la croissance s'effectue dans ces cellules (par exemple le promoteur 7,5K de virus de vaccine). On peut aussi utiliser des promoteurs

produits par de l'ADN recombinant ou par des techniques syn-

thétiques, pour assurer la transcription des séquences insé-

rées. Il faut aussi des signaux spécifiques d'amorçage pour une translation efficace des séquences insérées de codage de protéines. Ces signaux comprennent le codon d'amorçage ATG et les séquences adjacentes. Quand on insère dans les

vecteurs d'expression appropriés la totalité du gène d'enve-

loppe ou gag de de LAV/HTLV III, y compris son propre codon d'amorçage et les séquences adjacentes, des signaux témoins

supplémentaires pour la translation peuvent ne pas être néces-

saires. Cependant, quand on insère une partie seulement de la séquence de codage d'enveloppe, ou gag, il faut fournir

des signaux exogènes de commande de translation, ce qui com-

prend le codon d'amorçage ou initiation de traduction ATG.

Le codon d'amorçage ou initiation doit en outre être en phase avec le cadre de lecture des séquences de codage de

protéines d'enveloppe pour garantir la translation de la tota-

lité de la séquence insérée. Ces signaux exogènes de commande de translation et ces codons d'iniation ou amorçage de

traduction peuvent avoir diverses origines, aussi bien natu-

relles que synthétiques.

On peut utiliser n'importe laquelle des méthodes antérieurement décrites pour l'insertion de fragments de ADN dans un vecteur pour construire des vecteurs d'expression

contenant un gène chimère consistant en des signaux appro-

priés de commande de transcription/translation et les

2587720'

séquences de codage de protéines. Ces procédés peuvent com-

prendre des techniques utilisant de l'ADN recombinant "in vitro" et des techniques synthétiques et une recombinaison

"in vivo" (recombinaison génétique).

Dans les formes particulières de réalisation décri- tes en détail dans les exemples de la présente invention, le virus de la vaccine et le baculovirus ont été choisis comme vecteurs d'expression. Cependant, l'invention ne se

limite pas à l'utilisation du virus de la vaccine ou du bacu-

lovirus. Comme précédemment expliqué, les vecteurs d'expres-

sion utilisables comprennent, sans qu'on doive se limiter

aux vecteurs suivants ou à leurs dérivés: des virus infec-

tant les êtres humains ou les animaux comme le virus de la vaccine ou les adénovirus; les virus infectant les insectes comme des baculovirus; des vecteurs de type levure; des cturs de type bactériophage, et des vecteurs de type ADN

de plasmide et de cosmide,pour n'en citer que quelques-uns.

Quand on utilise un adénovirus comme vecteur d'expression, le gène de LAV/HTLV III est fixé par ligation sur un complexe de commande de transcription/translation d'adénovirus, par exemple la dernière séquence de promoteur et les séquences tripartites de tête. Ce gène chimère est

ensuite inséré dans le génome de l'adénovirus par recombinai-

son "in vitro" ou "in vivo". L'insertion dans une région non essentielle du génome de virus (par exemple la région El ou E3) va donner un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer, dans les hôtes infectés, la protéine apparentée

à LAV/HTLV III. Actuellement, il existe deux souches d'adéno-

virus (types 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccins pour le personnel militaire. Elles constituent les premiers candidats à utiliser comme vecteurs pour exprimer des gènes

de LAV/HTLV III.

En outre, on peut choisir une souche de cellules

hôtes qui module l'expression des séquences insérées,ou modi-

fie et traite le gène chimique produit de la façon spécifique voulue. On peut augmenter l'expression de certains promoteurs en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc

2587720',

et cadmium pour des promoteurs de métallothionéine). Donc, on peut régler l'expression de la protéine de LAV/HTLV III obtenue par génie génétique. Cela est important si le produit

protéinique du gène étranger cloné est mortel pour les cellu-

les hôtes. En outre, des modifications (par exemple une gly- cosylation) et un traitement (par exemple un clivage) des produits protéiniques sont importants pour le fonctionnement

de la protéine. Des cellules hôtes différentes ont des méca-

nismes caractéristiques et spécifiques de traitement post-

translation et de modification des protéines. On peut choisir des lignées de cellules appropriées ou des systèmes d'hôtes appropriés pour garantir'la modification et le traitement

corrects de la protéine étrangère exprimée.

Dans deux formes particulières de réalisation décri-

tes en détail dans les exemples de la présente invention, on a fait la ligation des séquences codant l'enveloppe de LAV/HTLV III chimères, aussi bien dans leur forme complète que dans leurs portions, ou des séquences de codage gag de LAV/HTLV III sur le promoteur à 7,5K du virus de vaccine pour former des gènes chimères dans divers plasmides. On a entouré les

gènes chimères de ces plasmides par des séquences supplémen-

taires du virus de la vaccine homologues du gène TK de virus de la vaccine. La construction du gène chimère a impliqué

l'utilisation de nucléotides, aussi bien naturels que syn-

thétiques, codant des signaux de commande pour la transcrip-

tion et la translation des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV

III ou les séquences gag de LAV/HTLV III. On a ensuite intro-

duit ces gènes chimères dans les vecteurs d'expression de virus de vaccine par recombinaison ' in vivo" entre la région TK homologue présente sur le vecteur de plasmide et le génome de virus de vaccine. On a utilisé ces virus recombinants, contenant le gène chimère, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III ou produire des protéines apparentées à gag de LAV/HTLV

III.

Dans d'autres modes particuliers de réalisation détaillés dans les exemples de la présente invention, on a effectué la ligation des séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des séquences de codage de gag de LAV/HTLV III sur le promoteur de polyédrine du virus de polyédrose nucléaire Autographa Californica (AcNPV) pour'former des gènes chimères dans divers plasmides. Les gènes chimères dans ces plasmides ont été entourés par des séquences additionnelles de AcNPV. La construction des gènes chimères a impliqué l'utilisation de signaux de commande de codage des nucléotides naturels pour la transcription et la translation des séquences de gag ou enveloppe de LAV/HTLV III. On a ensuite introduit les gènes chimères dans les vecteurs d'expression de AcNPV, par recombinaison in vivo entre les ADN homologues présents sur le vecteur plasmide et le génome de AcNPV. On a utilisé ces virus recombinants, contenant les gènes chimères, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III ou des protéines apparentées

à gag de LAV/HTLV III.

IDENTIFICATION DE VECTEURS D'EXPRESSION RECOMBINANTS

CAPABLES DE REPLICATION ET D'EXPRESSION DU GENE INSERE

On peut identifier par trois approches générales les vecteurs d'expression contenant des séquences insérées de gènes étrangers: (a) hybridation ADN-ADN; (b) présence ou absence de fonctions de gène "marqueur", et (c) expression

de séquences insérées.

Une fois une molécule particulière de ADN recombinant identifiée et isolée, on peut utiliser plusieurs procédés pour en provoquer la propagation, selon qu'un tel recombinant

constitue ou non une unité à autoréplication (un réplicon).

Une unité à autoréplication, par exemple des plasmides, des

virus, des cellules, etc., peut se multiplier dans l'environ-

nement cellulaire approprié et dans des conditions appro-

priées de croissance. Des recombinants manquant d'une unité

d'autoréplication devront être intégrés à une molécule com-

portant une telle unité pour que la propagation puisse avoir lieu. Par exemple, certains vecteurs d'expression de plasmide doivent, lors de leur introduction dans une cellule hôte,

être intégrés au chromosome cellulaire Dour qarantir la Dro-

pagation et une expression stable du gène recombinant. Une fois établis un système d'hôtes convenables et des conditions convenables de croissance, on peut provoquer la propagation des vecteurs d'expression recombinants et les préparer en quantité. Dans des formes particulières de mise en oeuvre de l'invention décrites en détail dans les exemples, on a inséré des gènes chimères contenant la séquence codant l'enveloppe ou gag de LAV/HTLV III dans le gène TK du génome de virus

de la vaccine, en transformant ainsi le virus en TK-, c'est-

à-dire en détruisant l'aptitude du virus à fabriquer de la thymidine kinase. On a choisi de tels recombinants d'après

leur aptitude à croître dans des milieux contenant de la 5-

bromo-désoxy-uridine, qui est un nucléoside analogue à celui mortel pour les cellules TK mais non pas pour les cellules TK-. On a en outre identifié des recombinants par hybridation ADN-ADN, en utilisant des sondes spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III ou des sondes spécifiques de gag de LAV/HTLV

III On -a- isolé- l -virus recombinant TK _par purification _.

sur plaque et l'on a préparé des stocks de réserve-à partir

de cellules de cultures tissulaires infectées.

Dans d'autres fodrmes particulières de mise en oeuvre de l'invention, décrites en détail dans les exemples, on a inséré des gènes chimères contenant la séquence de codage enveloppe ou gag de LAV/HTLV III dans le gène de polyhédrine du génome de AcNPV, en transformant ainsi le virus en un phénotype de non-occlusion. On a choisi visuellement de tels recombinants d'après leur absence de particules de virus occlus. On a encore identifié les recombinants par analyse de coagulation de type Northern (Nord) en utilisant des sondes

spécifiques d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des sondes spéci-

fiques de type gag de LAV/HTLV III. On a isolé les virus recombinants par purification de plaques et l'on a préparé

des stocks de réserve à partir de cellules de cultures tissu-

laires infectées.

IDENTIFICATION ET PURIFICATION DU PRODUIT DU GENE EXPRIME

Une fois identifié un recombinant qui exprime le

gène LAV/HTLV III, il convient d'analyser le produit du gène.

On peut y parvenir par des analyses et dosages se fondant

sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnel-

les du produit. Une analyse immunologique est particulièrement importante lorsque le but final consiste à utiliser les produits de gènes ou virus recombinants qui expriment de tels

produits dans des formulations de vaccins et/ou à titre d'an-

tigènes dans des dosages immunologiques pour diagnostics.

Divers antisérums sont disponibles pour analyser l'immunoréactivité du produit, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, du sérum provenant de patients atteints de LAS (syndrome d'adénopathie) ou de SIDA et des anti-sérums polyvalents dirigés contre le virus LAV/HTLV, la protéine d'enveloppe virale ou des protéines de noyau codées par le gène gag. Les molécules immunogènes comprennent des analogues

produits dans des systèmes bactériens, ou des peptides syn-

-hétiques contenant des déterminants antigéniques de l'enve-

loppe de LAV/HTLV III ou des antigènes de noyau LAV/HTLV III. L'identification des peptides et protéines décrits dans la présente

invention se fonde sur deux exigences. En premier lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être produite seulement dans des cellules infectées par du virus recombinant. En second lieu, la protéine apparentée LAV/HTLV III doit être capable d'une réaction immunologique avec le sérum de patients atteints de SIDA ou avec divers anticorps dirigés contre les protéines d'enveloppe ou de

noyau de LAV/HTLV III ou leurs analogues et dérivés.

-La protéine doit être immunoréactive, qu'elle résulte de l'expression de la totalité de la séquence entière de gènes, d'une partie de séquence de gènes ou de deux ou plusieurs séquences de gènes qui sont liées par ligation pour diriger la production de protéines de fusion. Cette réactivité peut

être mise en évidence par des techniques immunologiques clas-

siques, comme une radio-immunoprécipitation, une compétition

radio-immunologique ou des immunocaillots.

Une fois identifiée la protéine apparentée à LAV/ HTLV III, on peut isoler et purifier cette protéine par des méthodes classiques comprenant la chromatographie (par exemple la chromatographie par échange d'ions, par affinité et dans une colonne de classement par dimensions), par centrifugation, par différence de solubilité, ou par n'importe quelle autre technique classique pour la purification de protéines.

En variante, une fois identifiée une protéine immu-

no-réactive apparentée à LAV/HTLV III et produite par un recombinant, on peut déduire la séquence des-aminoacides de la protéine immunoréactive d'après la séquence des nucléotides du gène chimère contenu dans le recombinant. Par suite, la protéine peut être synthétisée par des méthodes chimiques classiques connues en pratique (voir, par exemple,

M. Hunkapiller et col., 1984, Nature 310:105-111).

Dans des formes particulières de réalisation de la présente invention, de tels peptides, qu'ils soient produits par des techniques utilisant de l'ADN recombinant ou par des méthodes de synthèse chimique, Comprennent, sans que cette liste soit limitative, la totalité ou une partie des séquences des aminoacides essentiellement comme représenté sur la figure 2 ou sur la figure 14, ce qui comprend des séquences altérées dans lesquelles des restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplacent des restes au sein de la séquence, ce qui crée une variation silencieuse. Par exemple, un ou plusieurs restes d'aminoacides de la séquence peuvent être remplacés par un autre aminoacide de polarité semblable, qui joue le rôle d'un équivalent fonctionnel, en donnant une altération silencieuse. On peut choisir, parmi

d'autres membres de la classe à laquelle l'aminoacide appar-

tient, des éléments pour remplacer un aminoacide au sein de

la séquence. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydro-

phobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophanne et la méthionine. Les aminoacides neutres polaires comprennent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine. Les aminoacides (basiques) à

charge positive comprennent l'arginine, la lysine et l'histi-

dine. Les aminoacides (acides) à charge négative comprennent 4 n

l'acide aspartique et l'acide glutamique.

DETERMINATION DU POUVOIR IMMUNITAIRE DU

PRODUIT RECOMBINANT

On peut déterminer le pouvoir immunitaire du produit apparenté à LAV/HTLV III en surveillant la réponse immuno- logique d'animaux d'essai après immunisation par injection de la protéine purifiée ou du peptide ou protéine de synthèse purifiée. Quand la protéine apparentée à LAV/HTLV III est

exprimée par un virus recombinant infectieux, on peut utili-

ser le virus recombinant lui-même pour immuniser les animaux d'essai. Les animaux d'essai peuvent comprendre des souris, des lapins, des chimpanzés, et l'on peut éventuellement aussi faire appel à des êtres humains. Des méthodes d'introduction de l'immunogène peuvent comprendre la voie intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, souscutanée,

intranasale ou n'importe quelle autre voie classique d'immu-

nisation. La réponse imnl=togique-des sujets-d-essai peut être analysée par trois approches: (a) la réactivité de

l'immun sérum résultant à l'égard d'antigènes viraux authen-

tiques de LAV/HTLV III, selon des dosages ou essais effectués

par des techniques connues, par exemple le dosage par immuno-

sorption avec enzyme liée (ELISA), les immunocoagulats, des

radio-immunoprécipitations, etc. (b) l'aptitude de l'immun-

sérum à neutraliser "in vitro" l'infectivité de LAV/HTLV III (M. RobertGuroff, 1985, Nature 316:72-74) (pour détection de l'anticorps antienveloppe), et (c) une protection contre

! infec-tion--A LAVr,/HTLV III et/ou une atténuation des symp-

tômes infectieux chez des animaux immunisés (D.P. Francis,

1984, Lancet 2:1276-1277 î D.C. Gujdusek, 1985, Lancet 1:55-56).

FORMULATION D'UN VACCIN

Le but de cette forme de réalisation de l'invention

est de formuler un vaccin dans lequel l'immunogène est appa-

renté à un épitope de LAV/HTLV III ou qui contient un virus recombinant qui exprime un tel immunogène qui protège contre les infections à virus de LAV/HTLV III pour la prévention de l'adénopathie (LAS) ou du SIDA. En outre, on peut préparer des formulations de vaccins multivalents qui contiennent plus d'un déterminant immunogène apparenté à LAV/HTLV III. De tels vaccins comprennent, mais n'y sont pas limités, ceux contenant

des épitopes apparentés à l'enveloppe de LAV/HTLV III for-

mulés isolément ou en combinaison avec d'autres épitopes de LAV/HTLV III, comme les épitopes apparentés à gag. De tels vaccins multivalents, contenant à la fois des épitopes codés

enveloppe et codés gag, peuvent être importants pour la pré-

vention du développement du SIDA. Des personnes ne présentant pas de symptômes semblent fabriquer des anticorps anti-gag plus souvent que des patients malades, alors que les deux groupes de patients fabriquent des anticorps dirigés contre des déterminants d'enveloppe (Science 1986, 233:419). Des études ont également montré que des patients atteints de SIDA fabriquent, aux stades précoces sans symptômes, des anticorps contre les protéines d'enveloppe et de noyau (gag). Lorsque la maladie progresse et que des symptômes apparaissent, les anticorps anti-gag sont réduits, cependant que les anticorps anti-enveloppe demeurent (Science, 1986, 233282). Ainsi, 1...l'inclusion d'éRitopes apparentés aa formulation de vaccins, dont la production est décrite a titre d'un aspect spécifique de réalisation de la présente invention, peut être importante pour l'immunoprophylaxie ou l'immunothérapie dans

le cas d'une maladie apparentée.à LAV/HTLV III.

On peut formuler des vaccins multivalents de manière qu'ils contiennent les produits de gène de LAV/HTLV III et/ ou des virus recombinants exprimant les produits de gènes chimères. On peut aussi les utiliser en combinaison avec

d'autres immunogènes pour la prévention du syndrome d'adéno-

pathie (LAS) ou du SIDA et d'.autres maladies. Des exemples

de diverses formulations sont présentés ci-après.

FORMULATIONS DE VACCINS A VIRUS

On peut formuler un vaccin à virus recombinant vivant ou un vaccin à virus recombinant inactive. Le choix dépend de la nature du virus recombinant que l'on utilise pour exprimer les épitopes apparentées à LAV/HTLV III. Quand le virus recombinant est infectieux pour l'hôte à immuniser

mais ne suscite pas de:maladie, un vaccin vivant est préfé-

rable parce qu'une multiplication chez l'hôte conduit A une stimulation prolongée d'un genre et d'une amplitude semblables

à ce qui se produit dans des infections subcliniques natu-

relles et, donc, cela confère une forte immunité de longue durée. Lors de son introduction dans un animal hôte, le virus

recombinant infectieux peut exprimer les protéines apparen-

tées à LAV/HTLV III à partir de son gène chimère et stimuler ainsi une réponse immunologique contre des antigènes de LAV/ HTLV III. Quand une telle réponse immunologique constitue une protection à l'encontre d'une attaque ultérieure par LAV/ HTLV III, le virus recombinant vivant peut servir lui-même

de vaccin préventif contre une infection par le virus du SIDA.

La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces formulations peut impliquer des systèmes aussi bien "in vitro" (par exemple des cellules de culture tissulaires) qu'"in vivo" (par exemple un animai hôte naturel comme une vache). On peut adapter des méthodes classiques pour la préparation et la formulation de vaccins contre la variole à la formulation d'un vaccin à virus recombinant (par exempIe, voir tVaccinria Viruses and Factors for Vaccine Antigens, publié sous la

direction de G.V. Quinnan chez Elsevier, 1985, pages 109-116).

On peut préparer des vaccins multivalents à virus vivants, à partir d'un seul ou d'un petit nombre de virus

recombinants infectieux qui expriment plusieurs épitopes appa-

rentes à LAV/HTLV III/HTLV. Le vaccin peut inclure aussi des virus qui expriment des épitopes d'organismes provoquant d'autres maladies, en plus des épitopes de LAV/HTLV III. Par exemple, on peut traiter par génie génétique un virus de vaccine (qui peut recevoir environ 35 kp de base de ADN étranger) de manière qu'il contienne des séquences de codage

d'épitoges de LAV/HTLV III apparentés à l'enveloppe et à gag.

Le virus peut aussi coder d'autres épitopes en plus de ceux concernant LAV/HTLV III. Un tel virus recombinant lui-même peut servir d'immunogène dans un vaccin multivalent. En variante, on peut formuler, dans un vaccin multivalent, un mélange de virus de vaccine ou d'autres virus, capables chacun de diriger l'expression d'un gène différent codant

pour différents épitopes de LAV/HTLV III et/ou d'autres orga-

nismes capables de provoquer une maladie.

Que le virus recombinant soit ou-non infectieux pour l'hôte à immuniser, on peut preparer une formulation de vaccin inactive. Les vaccins inactivés sont "morts" en ce 'sens qua leur infectivité a été détruite, habituellement par traitement du formaldéhyde. En principe, l'infectivité du virus est

détruite sans affecter les protéines de la capside ou d'en-

veloppe qui portent le caractère immunogène du virus. Afin de préparer des vaccins inactivés, il faut faire croître en culture de grandes quantités de virus recombinant pour fournir

la quantité nécessaire d'antigènes apparentés. On peut utili-

ser un mélange de virus inactivés qui expriment différents

épitopes pour formuler des vaccins "multivalents". Dans cer-

tains cas, cela peut être préférable à des formulations de vaccins vivants, en raison de difficultés potentielles dues

à une interférence mutuelle de virus vivants administrés - -

ensemble. Dans l'un ou l'autre cas, il convient de formuler le virus recombinant inactive, ou le mélange de tels virus,

avec un adjuvant convenable afin d'amplifier la réponse immu-

nologique à leurs antigènes. Des adjuvants convenables com-

prennent, sans que cette liste soit limitative, des gels

minéraux, par exemple de l'hydroxyde d'aluminium; des subs-

tances tensioactives comme de la lysolécithine, des polyois "Pluronic"; des polyanions; des peptides; des émulsions dans de l'huile et des adjuvants potentiellement utiles pour les êtres humains, comme le BCG (bacille de Calmette Guerin)

et corynebacterium parvum.

On peut utiliser de nombreuses méthodes pour intro-

duire les formulations de vaccins décrites ci-dessus; elles

comprennent, sans que ce soit limitatif, les voies intrader-

mique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-

cutanée et intranasale. Quand on utilise une formulation de vaccins à virus recombinants vivants, ce vaccin peut être introduit par la voie naturelle d'infection du virus de type sauvage apparenté que l'on a utilisé pour obtenir le virus

recombinant dans la formulation du vaccin.

FORMULATION DE VACCINS A SOUS-UNITES

Au lieu de vaccins à base de virus, on peut utiliser

la protéine apparentée à LAV/HTLV III elle-même comme immu-

nogène dans des formulations de vaccins à sous-unités qui peuvent être multivalents. Comme précédemment expliqué, des

vaccins à sous-unités comprennent seulement le matériel immu-

nogène en cause, nécessaire pour immuniser un hôte. Donc, la ou les protéines apparentées LAV/HTLV III peut ou peuvent être purifiées à partir de recombinants qui expriment les épitopes de LAV/HTLV III. De tels recombinants comprennent n'importe lesquelles des cellules cultivées infectées par le virus, des transformants bactériens, des transformants

de levure ou des insectes infectés par des virus qui expri-

ment les épitopes de LAV/HTLV III (on peut se reporter à ce qui a été dit ci-dessus à propos de l'insertion des séquences de codage de protéines, de l'identification des vecteurs recombinants d'expression, et à propos de l'identification et de la purification du produit de gène exprimé). Dans une autre forme de mise en oeuvre de la présente invention, les peptides ou protéines apparentés à LAV/HTLV III peuvent être obtenus par synthèse chimique. Pour cela, on peut déduire la séquence des aminoacides d'un tel peptide ou d'une telle protéine à partir de la séquence des nucleotides du gène chimère qui en dirige l'expression (voir, par exemple, ce qui a été indiqué ci-dessus à propos de l'identification et

de la purification du produit de gène exprimé).

Que les immunogênes soient purifiés à partir de recombinants ou obtenus par synthèse chimique, le produit

final peut être ajusté à une concentration appropriée et for-

mulé avec n'importe quel adjuvant convenable pour vaccin,

puis emballé en vue de son utilisation. Des adjuvants conve-

nables comprennent, sans que cette liste soit limitative, des gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium, les substances tensioactives comme la lysolécithine, des polyols "Pluronic"; des polyanions; des peptides; des émulsions dans de l'huile et des adjuvants potentiellement utiles pour les êtres humains, comme le BCG (Bacille de Calmette Guerin) et corynebactérium parvum. L'immunogène peut également être incorporé à des liposomes, ou conjugué & des polysaccharides et/ou à d'autres polymères pour servir dans une formulation

de vaccin.

Quand le peptide ou la protéine apparenté à LAV/HTLV

III est un haptène, c'est-a-dire une molécule qui est anti-

génique du fait qu'elle peut réagir sélectivement avec des anticorps reconnus, mais qui n'est pas antigénique du fait qu'elle ne peut déclencher une réponse immunitaire, l'haptène peut être lié par covalence à un support ou une molécule immunogène; par exemple, une grosse protéine comme de la

sérum albumine protéinique va conférer un caractère immuno-

gène à l'haptène qui lui est couplé. On peut formuler l'en-

semble haptène-support pour l'utiliser à titre de vaccin.

IMMUNITE PASSIVE ET ANTICORPS ANTI-IDIOTYPIQUES

Au lieu d'une immunisation active à l'aide de vaccins à virus ou à sousunités, il est possible de confArer une protection à court terme à un hôte en lui administrant de l'anticorps préformé dirigé contre un ou des épitopes de LAV/ HTLV III. Donc, on peut utiliser les formulations de vaccins décrites ci-dessus pour produire des anticorps destinés à servir à une immunothérapie passive. On préfère en médecine

humaine de l'immunoglobuline humaine, car de l'immunoglobu-

* line hétérologue risque de provoquer une réponse immunitaire

à ses composants immunogènes étrangers. Une telle immunisa-

tion passive pourrait servir en cas d'urgence pour une protec-

tion immédiate de personnes non immunisées et exposées a des risques spéciaux, par exemple les personnes exposées à un contact avec des patients'atteints de SIDA, par exemple, dans des hôpitaux et autres installations de soins. En variante, on peut utiliser ces anticorps pour produire de l'anticorps antiidiotypique, que l'on peut utiliser à son tour à titre d'antigène pour stimuler une réponse immunologique contre

des épitopes de LAV/HTLV III.

DOSAGES IMMUNOLOGIQUES

On peut utiliser les peptides et protéines de la

présente invention, apparentés à LAV/HTLV III, comme anti-

Z587720

gènes dans des dosages et essais immunologiques pour la détec-

tion d'anticorps contre LAV/HTLV III dans divers tissus et fluides corporels de patients ainsi que pour le sang des banques de sang et des hôpitaux. Pour cela, on peut utiliser les antigènes de la présente invention dans n'importe quel système de dosage immunologique connu en pratique, ce qui

comprend, sans que ce soit limitatif, les dosages radioimmu-

nologiques, les dosages dits "ELISA", les dosages en "sandwich", les réactions de précipitation, les réactions

de précipitation par diffusion sur gel, les dosages d'immuno-

diffusion, les dosages par agglutination, les dosages par fixation de compléments, les dosages immunoradiométriques,

les dosages par immunofluorescence, les dosages immunologi-

ques de protéines A et les dosages par immunoélectrophorèse,

pour n'en nommer que quelques-uns.

Les essais et dosages immunologiques de la présente invention peuvent servir à effectuer des examens de dépistaqe sur le sang de banques de sang et chez des patients pour

déceler une exposition éventuelle à LAV/HTLV III et pour sur-

veiller des patients qui sont traités en raison de LAS ou

du SIDA. On peut utiliser, dans le dosage ou essai immuno-

logique selon l'invention, n'importe quel peptide ou n'importe

quelle protéine apparentée à un antigène de LAV/HTLV III.

De tels antigènes comprennent, sans que ce soit limitatif, les peptides et protéines apparentés aux produits des gènes de env, gag, pol et des quatre gènes supplémentaires désignés à ce jour: sor, tat, 3'-orf et art (ou trs). Dans une forme particulière de réalisation de la présente invention, on peut utiliser un ensemble d'antigènes dans un essai de dosage immunologique pour soumettre des patients à un dépistage de détermination d'un profil d'anticorps dirigé contre lesdits épitopes différents de LAV/HTLV III. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, on peut suivre des patients, qui ont été vaccinés à l'aide d'une formulation de vaccins

de la présente invention, pour déceler une exposition subsé-

quente à LAV/HTLV III. Dans de tels cas, l'antigène utilisé dans le dosage immunologique est de préférence un peptide ou une protéine de l'invention qui n'était pas un immunogène de la formulation de vaccin utilisée pour vacciner le patient, car de telles personnes vaccinées seront séropositives pour l'épitope particulier utilisé dans la formulation de vaccin et, par suite, donneront un résultat positif à des essais, qu'il y ait eu ou non exposition au virus. Par exemple, si

un patient a été vacciné avec un épitope de la présente inven-

tion apparenté à l'enveloppe de LAV/HTLV III, ce patient peut etre soumis, pour des essais de détection de l'infection par LAV/HTLV III, à des essais de dépistage utilisant n'importe quelle autre protéine non apparentée à l'enveloppe de LAV/ HTLV III, afin de déterminer la présence chez le patient d'anticorps spécifiques pour LAV/HTLV III. Ainsi, un patient vacciné avec un épitope apparenté à l'enveloppe peut Etre soumis à des essais de dépistage d'anticorps spécifiques des antigènes de noyaux de LAV/HTLV III, ou d'autres antigènes de LAV/HTLV III, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif,

les produits des gènes sor et 3'-orf et analogues.

Dans une autre forme de réalisation, on peut utili-

ser les peptides et protéines de l'invention, apparentés à LAV/HTLV III, dans des dosages immunologiques compétitifs, pour déceler et quantifier la présence de protéines codées par LAV/HTLV III-HTLV III, dans le sang, le sérum, etc., d'un patient.

EXEMPLE: RECOMBINANTS D'ENVELOPPE DE VACCINE

Dans les exemples suivants, on a construit divers vecteurs de plasmides contenant des gènes chimères comprenant des séquences de codage de l'enveloppe de LAV logées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription du

virus de la vaccine.

On a inséré dans le génome du virus de la vaccine, par recombinaison in vivo, ces gènes chimères, contenant le promoteur de vaccine et la séquence de codage de l'enveloppe de LAV/HTLV III. De tels virus recombinants ont été identifiés

et purifiés, et des stocks de réserve du virus ont été prépa-

rés à partir de cellules de culture tissulaire infectées.

Il a été montré que des protéines immunoréactives, apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, sont produites par ces virus

recombinants de la vaccine in vitro. On a soumis ces recom-

binants à des essais dans des animaux d'expérience pour en déterminer l'aptitude à déclencher des réponses immunologiques de neutralisation ou de protection et pour étudier leur uti-

lisation à titre de vaccins contre le SIDA. Une description

détaillée de chaque étape de cette forme de réalisation de

l'invention est présentée ci-après.

Voici quelques détails sur les modes opératoires

généraux.

CELLULES ET VIRUS

On a obtenu de R. Condit (Professeur associé, Dépar-

tement de Biochimie, Université de L'Etat de New-York, Buffalo, New-York, Etats-Unis d'Amérique) des cellules de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40, lignée continue de cellules de singe vert d'Afrique provenant de cellules BSC-1, n ATCC CCL26), et on en a provoqué la propagation dans du milieu de Eagle modifié selon Dulbecco (MEMD, Gibco, Grand Island, New-York) additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et de 100 unités de pénicilline et 100 unités de streptomycine

par millilitre. On a obtenu de M. Botchan (Professaur, Dépar-

tement de biologie moléculaire, Université de Californie, Berkley, Californie, Etats-Unis d'Amérique) des cellules humaines 143 TK (J.S. Rhim et col., 1975, Intl J. Cancer 15:23-29) et on en a provoqué la propagation dans le milieu ci-dessus, avec l'addition de 5-bromo-désoxyuridine (BUdR)

à 25 pg/ml.

On a obtenu de l'American Type Culture Collec-

tion (ATCC n CCL 171) une cellule diploïde humaine (MRC-5) dont on a assuré la propagation dans le même milieu que celui

utilisé pour BSC-40.

On a obtenu de R. Condit des virus de la vaccine (souche WR, n ATCC VR119) que l'on a cultivés dans des cellules BSC-40 dans MEMD + 5 % de sérum de veau sans gamma globuline + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine. On a choisi des recombinants TK parmi des cellules 143 TK dans le même milieu contenant 25 "g/ml de BUdR et on les a purifiées sur plaque sur la même lignée de cellules dans MEMD contenant 1 % de gélose Noble (DIFCO, Détroit, Michigan, Etats-Unis d'Amérique), 5 % de sérum de veau sans gamma globuline, 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine ainsi que 25,g/ml de BUDR. On a effectué des dilutions des stocks de virus dans une solution saline tamponnée par des phosphates et contenant par litre 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,5 g de NaH2PO4, 0,2g de K2HPO4, avec addition de 1 mM de MgC12 et de 0,01 % de

sérum albumine de bovin.

La souche de virus de la vaccine, provenant du "New-York City Board of Health" (Service de santé de

la ville de New-York) a été purifiée à partir d'une prépara-

tion commerciale de vaccins antivarioliques (" Dryvax")(R)', (lot 321-501 g) vendus par Viet Laboratories (Marietta, PA, Etats-Unis d'Amérique). Le vaccin antivariolique a été dilué par de la solution saline tamponnée par des phosphates avec divers adjuvants (voir ci-après) et, a été soumis trois fois successivement à une purification de plaque en utilisant des cellules de BSC-40. On a préparé un stock de réserve, appelé ci-après vNY, sur des cellules BSC-40, à partir d'un tel isolat purifié sur plaque, et il a servi à construire

des virus recombinants. On a assuré, dans des cellules MRT-

5000, la propagation de stocks de virus recombinants provenant

de v-NY.

On se reportera au brevet principal pour la descrip-

tion plus détaillée de la préparation, restriction et modifica-

tion de l'ADN, de la construction de vecteurs de plasmides contenant le virus de vaccine, promoteur, lié par ligation aux séquences de codage du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III et de la construction de vecteurs de plamnides contenant du virus de vaccine promoteur relié par ligation à la séquence

codant en 3' ou en 5' du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III.

CONSTRUCTION DES VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU VIRUS

DE VACCINE PROMOTEUR RELIE PAR LIGATION A LA TOTALITE DES

SEQUENCES DE CODAGE DU GENE D'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III

On a soumis 2 microgrammes d'ADN de plasmide pv-envl à digestion, jusqu'à achèvement, par l'enzyme de restriction StuI, PvuI et XhoI. On a résolu les fragments résultants sur un gel de gélose à 1 % à faible température de fusion. Le

clivage de Pv-envl à l'aide de StuI et PvuI donne deux frag-

ments de 4 pKb, l'un contenant la partie 5' de LAV/HTLV III et l'autre contenant pGS20; XhoI clive le fragment à 4 kpb contenant pGS 20 en des fragments plus petits qui, ainsi, permettent l'identification du fragment à 4 kpb StuI/PvuI contenant l'élément de commande de transcription du virus

de la vaccine et la partie 5' des séquences de codage d'enve-

loppe de LAV/HTLV III. On a isolé ce fragment, on l'a purifié et relié par ligation a un fragment à 6,5 kpb engendré par des produits de digestion par des enzymes de restriction StuI et PvuI de pv-env2. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche MC1000 de E. coli. On a choisi des transformants pouvant résister à l'ampicilline. On a soumis de l'ADN de plasmide provenant de transformants individuels à des essais de détermination de la régénération des sites de restriction StuI et PvuI et de la présence des fragments apparentés à 4 paires de kilobases (4 pKb) et 6,5 pKb. Le plasmide voulu, pv-env5, décrit sur la figure 4, contient la totalité du gène d'enveloppe de LAV correspondant aux nucléotides n 5766 à 8349 (comme représenté sur la figure 2), relié par ligation en aval des éléments de commande de

transcription du virus de la vaccine.

CONSTRUCTION DE VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU PROMOTEUR

DE VIRUS DE VACCINE RELIE PAR LIGATION AU GENE D'ENVELOPPE

DE LAV/HTLV III SANS LA SEQUENCE TRANSMEMBRANE (ANCRAGE)

On a provoqué la digestion de 10 pg d'ADN de plas-

mide Pv-env5 jusqu'à achèvement, par HIND-3, et l'on a résolu le fragment résultant sur un gel de gélose à 1 %, à bas point de fusion. On a purifié le fragment comportant 3 kilopaires

de base contenant le promoteur de vaccine 7,5 K et le promo-

teur 5' des séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III,

puis on les a traités par l'enzyme de Klenow pour complé-

ter les extrémités cohésives. On a ensuite relié par liga- tion ce fragment à un vecteur de clonage à sites multiples, P26, soumis au

préalable à digestion avec EcoRI, puis on a traité avec l'enzyme de Klenow et avec de la phosphatase

alcaline d'intestins de veau. Une ligation du site de HIND-

3 introduit, dans Pv-env5 et du site de EcoRI empli dans le plasmide P26 a créé un codon d'arrêt en phase avec la séquence de codage pour l'enveloppe. Cette construction intermédiaire

a été appelée Pv-env5/26.

On a utilisé l'ADN du plasmide pv-env5/26 pour trans-

former E. coli MC1000, l'amplifier et le purifier. On a ensuite soumis à digestion par BamHI et HpAI, et l'on a résolu sur un gel le gélose à 1 % les fragments résultant. On a isolé le fragment de 2,1 kilopaires de base contenant la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV, et on l'a ensuite soumise à fixation par ligation sur du plasmide pGS 20 soumis

au préalable à digestion avec BamHI et SmAI. Le plasmide Pv-

env 7 résultant contient le promoteur de virus de vaccine à 7,5 K fixé par ligation sur une séquence spécifique de LAV/ HTLV III à partir des 96 paires de bases en amont du codon d'amorçage d'enveloppe par rapport au site HIND 3 au numéro de nucléotide 6798 (figure 5). Ce plasmide ne comporte donc pas la séquence présumée d'ancrage du gène d'enveloppe de

LAV/HTLV III.

CONSTRUCTION ET CARACTERISATION DU VIRUS DE VACCINE

RECOMBINANT CONTENANT LE GENE CHIMERE D'ENVELOPPE LAV/

HTLV III

On a utilisé deux souches de départ de virus de vaccine pour la construction des virus recombinants: WR, la souche témoin de recherche, et v-NY, un dérivé de la souche provenant du "New-York City Board of Health" (Service de

la Santé Publique de la Ville de New-York).

L'insertion des séquences de gènes chimères corres-

pondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le génome du virus de la vaccine est obtenue par recombinaison "in vivo", rendue possible par le fait que les gènes chimériques sont entourés dans les plasmides pv-env2, pv-env5 et pv-env7 par des

séquences du virus de la vaccine codant pour le gène de thy-

midine kinase (TK). L'introduction de ces plasmides dans des cellules infectées par le virus de la vaccine a permis une recombinaison entre la séquence TK du plasmide et la séquence homologue du génome de virus de la vaccine. L'insertion du

gène chimère se produit par suite d'une double recombi-

naison dans les séquences d'entourage latéral. -De tels recom- binants comporteront le gène chimère inséré dans le gène

TK de la vaccine et, donc, leur phénotype correspondra & TK.

On peut choisir ces recombinants TK pour les faire croître dans un milieu auquel on a ajouté BUdR, qui est mortel pour

les cellules TK+ mais non pas pour les cellules TK-. Le prin-

cipe général de ce mode opératoire a été décrit (M. Mackett,

G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864).

CONSTRUCTION DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT CONTENANT LE

GENE CHIMERE CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III

On a infecté une boîte de 100 mm de diamètre com-

portant 80 % de cellules confluentes de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40) avec du virus de la vaccine (souche WR) A une multiplicité d'infections de 0,05. Apres 2 à 4

heures d'incubation à 37 C, on a recouvert les cellules in-

fectées par des copréciDités, à l'aide de phosphate de cal-

cium, de l'ADN de plasmide pv-env2 ou pv-env5. On a préparé

les précipités en ajoutant goutte à goutte 0,5 ml d'une solu-

tion de 2XADN-CaC12 à 0,5 ml de solution 2XHeBS (la solution de 2XADNCaC12 contient 20 pg de ADN de plasmide dans 0,5 ml de CaC12 0,25M; 2XHeBS contient, par ml, 16 mg de NaCl, 0,74 mg de KC1, 0,25 mg de Na2HPO4 2H20, 2 mg de dextrose, et 10 mg de HEPES, à un pH de 7,08). On a laissé se former à la température ambiante durant 30 minutes les coprécipités obtenus à l'aide de ADN-phosphate de calcium. Quatre heures après les avoir recouvertes de précipité, on a lavé les cellules une fois avec 1XHeBs, on a fait incuber à 37 C durant 3 minutes en présence de 2 ml de glycérol à 15 % dans 1XHeBs,

puis on a lavé une fois encore avec 10 ml de milieu de crois-

sance (MEMD + 10 % de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine). Deux jours plus tard, on a récolté les cellules infectées et on les a

collectées par centrifugation (40C, 10 minutes & 2010 x g).

25877zi0 On a préparé des stocks de virus en mettant ces cellules à

nouveau en suspension dans i ml d'une solution saline tampon-

née par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin, puis l'on a effectué deux cycles de congélation et décongélation et trois traitements durant 15 secondes par

des ultrasons.

On a choisi des recombinants en plaçant 0,1 ml de dilution à 10 3 des stocks de virus provenant des opérations ci-dessus sur des plaques circulaires dans des boîtes de 60 mm de cellules humaines confluentes 143 TK, surmontées de 5 ml/boite de gélose Nobel à 1 % (Difco, Détroit, Michigan) avec 5 % de sérum de veau, 25 pg/ml de BUdR dans MEMD. Deux jours plus tard, on a coloré les cellules en plaçant 2 ml/ boîte de milieu de gélose contenant les mêmes ingrédients que ci-dessus, plus 0,01 % de rouge neutre. On a prélevé les plaques individuelles un jour après coloration, on les a mises à nouveau en suspension dans 0,5 ml d'une solution saline physiologique tamponnée par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin (PBSAM), et l'on a utilisé des parties aliquotes (0,25 mi) des suspensions de virus pour infecter des cellules confluentes 143 TK placées dans des creux de 16. mm de diamètre sous un milieu sélectif (MEMD +

% de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de streptomy-

cine + 100 unités/ml de pénicilline + 25 pg/ml de BUdR). On a collecté par centrifugation les cellules infectées et on les a remises en suspension dans 100 pl de solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) contenant 0,5 mg/ml de trypsine et 0,2 mg/ml de EDTA (acide éthylène

diamine tétra acétique). On a lysé les cellules par incuba-

tion à 37 C durant 30 minutes, ce qui a été suivi de 3 cycles

de 20 secondes chacun de traitement aux ultrasons. On a col-

lecté sur des filtres de nitrocellulose les lysats de cellu-

les, en utilisant un manifold ou collecteur de filtration

à plusieurs creux (Schleicher et Schuell, Arlington, MA).

On a déterminé par hybridation ADN-ADN, comme décrit (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'l. Acad.

Sci. 79, 7415-7419), la présence des séquences de ADN spéci-

fiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III dans ces échantillons.

On a utilisé comme sonde d'hybridation de l'ADN de plasmide

pRS-3 marqué par 32p, préparé par translation appropriée.

On a encore purifié deux fois sur plaque des recombinants qui avaient donné une hybridation positive pour cette sonde, sur des cellules 143 TK dans des conditions sélectives (milieu contenant BUdR) et une fois sur des cellules BSC-40 dans des conditions non sélectives. Après confirmation finale par hybridation ADN-ADN, on a préparé des stocks de virus à partir des plaques trois fois purifiées sur des cellules

de BSC-40 et on les a utilisés pour la caractérisation subsé-

quente. Une représentation schématique de la construction des virus recombinants est montrée sur la figure 6, sur laquelle la séquence de gène correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III (env) située en aval du promoteur de vaccine 7,5 K (p- -) est entourée au sein du génome de la vaccine par des séquences de ADN TK. Les stocks de virus provenant de la recombinaison entre le génome de virus de la vaccine

et le plasmide pv-env,5 ont été appelés v-env5, et ils con-

tiennent la totalité du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III.

Dans la forme particulière de mise en oeuvre décrite dans

les exemples ici, v-env5 contient la totalité du gène d'enve-

loppe aussi bien que 96 paires de bases des séquences non translatées proches de 5' et 223. paires de bases des séquences non translatées proches de 3'. Les stocks de virus provenant

de pv-env2 ont été appelés v-env2 et ils contiennent la plu-

part du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III (c'est-à-dire le fragment KpnI), mais ils ne comportent pas la partie de la séquence codant pour les 42 premiers aminoacides de la protéine de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Puisque la séquence de signal supposée de la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III est située au sein des 49 premiers aminoacides de la protéine, v-env2 devrait produire une protéine ne comportant pas la séquence de signal; donc, on devrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV/HTLV III produite par ce virus

recombinant ne soit pas transportée vers la membrane. Au con-

traire, v-env5, qui contient la totalité de la séquence d'enveloppe de LAV/HTLV III doit produire une protéine qui

est transportée vers la membrane. Des stocks des virus prove-

nant de pv-env7 sont appelés v-ehv7 et ils contiennent la terminaison azotée complète du gène correspondant à l'enve- loppe de LAV/HTLV III, mais ne comportent pas la séquence

en aval du site HIND III. Puisque la séquence présumée trans-

membrane (ancrage) est manquante dans cette construction, on pourrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV/ HTLV III, produite par ce recombinant, soit secrétée dans le milieu de croissance. Cette propriété est avantageuse pour la purification de cette protéine en vue de son utilisation comme réactif diagnostique ou pour sa formulation comme vaccin

à sous-unités.

FORMATION DE FRAGMENTS DE RESTRICTION DE RECOMBINANTS

VACCINE-ENVELOPPE DE LAV/HTLV III

On a isolé, comme précédemment décrit (Esposito et al, 1981, J. Virol. Methods 2.2. 1975-180) l'ADN de souche de virus de vaccines de départ WR et v-NY, ainsi que leurs dérivés v-env5 et v-env5NY, respectivement. On les a soumis

à digestion par l'enzyme de restriction HIND III et les frag-

ments résultants ont été résolus sur un gel à 0,7 % de gélose.

l'ADN provenant de la souche de départ WR a présenté le modèle

typique de fragment de restriction (figure 2A) comme précé-

dement décrit (De Filippesy1982, J. Virol. 43:136-149). Le modèle de fragment de restriction pour v-NY a été semblable, mais distinct de celui obtenu avec WR. Les différences les plus évidentes se sont situées dans la longueur des fragments b et c obtenus avec HIND III (fragments HIND III b et c), qui sont des fragments terminaux du génome du virus de la vaccine. Les recombinants v-env5 et v-env5NY ne comportent pas de fragments HIND III J de leurs souches de départ ou parentales. On a observé à la place deux nouveaux fragments,

ayant pour taille 5,4 Kbp (kilopaires de bases)et 3,2 Kbp.

Cette observation concorde avec le résultat de la double recombinaison qui a inséré la séquence codant l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le gène TK de vaccine, qui est situé sur le fragment HIND III J. Deux fragments ont été engendrés par l'insertion, en raison de la présence d'un site HIND III dans la séquence LAV/HTLV III. Ce résultat confirme aussi l'orientation du fragment inséré LAV/HTLV III par rapport au gène TK de virus de la vaccine. ANALYSE PAR COAGULATION TYPE "SOUTHERN" (Sud) DE

RECOMBINANTS VACCINE-ENVELOPPE LAV/HTLV III

L'identité de deux nouveaux fragments HIND III dans les produits de digestion de restriction de génomes viraux recombinants a été confirmée par analyse de coagulation de type Southern. Des fragments de ADN, résolus sur un gel de

gélose comme celui présenté sur la figure 7A, ont été trans-

férés sur des filtres en nitrocellulose, et ont été hybridés sur une sonde obtenue par translation spécifique des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III. Comme représenté sur la figure 7B, l'hybridation a été décelée seulement dans les fragments de 5,4 et de 3,2 Kbp. Ce résultat confirme la structure du génome du virus recombinant telle que représentée sur la

figure 6.

EXPRESSION DES PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/

HTLV III DANS DES CELLULES DE CULTURE TISSULAIRE INFECTEES

PAR DES VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANTS

On a montré que les virus de vaccine recombinants, portant les gènes chimères d'enveloppe de LAV/HTLV III,sont capables d'exprimer les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III lors d'une infection de cellules dans une culture tissulaire. On a également trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du-sérum provenant de patients

atteints de SIDA.

On se reportera au brevet principal pour la descrip-

tion détaillée de l'identification, à l'aide de techniques

d'immunocoagulation ou d'immunoprécipitationde protéines ap-

parentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III exprimées dans des

cellules infectées par du virus de vaccine recombinant.

On note que les résultats obtenus sont représentés sur les figures 8A et 8B du présent expose, correspondant aux figures 6A et 6B du brevet principal (immunocoaqulation) et

figure 9A (immunoprécipitation).

J

MARQUAGE PAR 3H-GLUCOSAMINE DE PROTEINES APPARENTEES A

L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III PRODUITES PAR DES VIRUS

RECOMBINANTS DE VACCINE CORRESPONDANT A LAV/HTLV III

Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit dans le brevet principal a donné des résultats représentés sur la figure 9B(correspondant à la figure 7B du brevet principal),

cependant que les résultats de l'analyse par immunoprécipita-

tion, avec pulsions de chasse, de protéines apparentées à

l'enveloppe de LAV/HTLV III produites par des virus recombi-

nants de vaccine liées à LAV/HTLV III, décrite en détail dans le brevet principal, apparaissent à la figure 9C (correspondant

à la figure 7C du brevet principal).

PRESENCE D'UNE PROTEINE APPARENTEE A L'ENVELOPPE DE LAV/

HTLV III DANS LE MILIEU DE CROISSANCE DE CELLULES INFECTEES

PAR DES VIRUS DE VACCINE RECOMBINANTS-LAV/HTLV III

Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit ci-

après a montré que les protéines immunoréactives produites par le virus de vaccine recombinant de l'invention peuvent

être exprimées et traitées de façon semblable à la glycopro-

téine d'enveloppe de LAV/HTLV III authentique.

On a soumis des monocouches confluentes de cellules de HeLa à "infection" par du virus non infectieux (voir figure 9D, piste 1) ou séparément à infection par du virus de vaccine de type sauvage (piste 2), par v-env5 recombinant

(piste 3) ou v-env2 recombinant (piste 4), le tout à une mul-

tiplicité ou taux d'infection de 20 unités de formation de

plaque par cellule. On a marqué les cellules avec 35S-méthio-

nine (plus de 800 Ci/mmole, Amersham) à 100 >Ci/ml 10 à 12 heures après l'infection. A la fin de la période de marquage, on a retiré le milieu et on l'a clarifié par centrifugation

durant 2 minutes à 12 000 g avant de l'utiliser pour une immu-

noprécipitation avec du sérum groupé provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III. Les protéines provenant de cellules infectées ayant subi une immunoprécipitation par le même sérum sont présentées dans la partie marquée "culot" et les protéines provenant du milieu de croissance ou culture

sont présentées dans la partie marquée "Supe" (milieu supé-

rieur surnageant).

Comme on pouvait s'y attendre pour gpllO de LAV/ HTLV III, la protéine à 120 kd obtenue à l'aide du recombinant a également été décelée dans le milieu infecté (figure 9D,

piste 3). Ces résultats ont montré que v-env5 de virus recom-

binant était capable d'exprimer le gène correspondant à l'en-

veloppe de LAV et de produire des protéines immunoréactives qui ont été traitées de façon semblable à des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III authentique., Comme on pouvait s'y attendre pour des protéines ne comportant pas de peptides de signal, on n'a pas décelé de polypeptides liés à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le milieu de croissance de cellules infectées par v-env2 (figure

9D, piste 4).

Par ailleurs, les cellules infectées par v-env7 ont exprimé une protéine tronquée de 130 Kd. Cette protéine ne comporte pas les 217 aminoacides à carbone terminal contenant les séquences d'ancrage de la protéine d'enveloppe de LAV/ HTLV III. Cette protéine tronquée (gp130) a été sécrétée dans le milieu de croissance bien plus efficacement que gpllO ou son précurseur gpl50 (figure 9E). En même temps, gpl30 n'est pas efficacement transformé en gpllO0, bien que le site de

clivage soit encore présent sur la molécule tronquée.

POUVOIR IMMUNITAIRE DU VIRUS RECOMBINANT

CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV

Il a été montré que les virus recombinants, portant le gène chimère correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III, sont capables de déclencher une réponse par anticorps contre LAV/HTLV III dans deux souches de souris et une espèce de

primate sub-humain.

IMMUNOGENICITE DES RECOMBINANTS DE VACCINE PORTANT LE GENE

D'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III CHEZ LES SOURIS

On a examiné le caractère immunogène de protéines

exprimées par v-env5 et v-env2 de virus de la vaccine recom-

binants. Les expériences sont décrites en détail dans le brevet principal, qui indique également les résultats des

essais ELISA sur des échantillons de sérum de 6 semaines.

CARACTERE IMMUNOGENE DE V-ENV5 RECOMBINANT

DE VIRUS DE VACCINE-LAV/HTLV III CHEZ DES PRIMATES SUB-HUMAINS

On a étudié le caractère immunogène de vaccine-V-

env5 recombinant de LAV/HTLV III dans deux espèces de primates subhumains: Macaca Fasciculariès et des chimpanzés. Les résultats décrits ciaprès montrent que v-env5 est capable de susciter dans les deux espèces une immunité humorale et

à médiation cellulaire.

Réponse humorale chez les singes macaques immunisés par v-env5 On a utilisé neuf macaques à longue queue (Macaca Fascicularis), allant de la jeunesse a l'âge adulte, pour étudier le caractère immunogène de v-env5 recombinant de virus de vaccine. On a soumis tous les animaux à des essais de dépistage préliminaire pour constater l'absence d'anticorps contre des virus de vaccine et contre LAV/HTLV III et l'absence de virus T-lymphotropes de singe ou de virus de SIDA de singe ou d'anticorps contre ces virus. A quatre des singes,on a inoculé 2 x 108 unités de formation de plaque de v-env5 et à quatre singes on a inoculé 2 x 10 unités de formation de plaque du même virus. A un animal, on a inoculé 2 x 107 unités de formatin de plaque d'un virus de vaccine

recombinant témoin (v-HSgD1 de virus recombinant de vaccine-

herpès simplex gD1). Tous les animaux ont été inoculés par scarification de la peau. On a collecté des échantillons de sérum et de sang héparinisé, avant inoculation, et au bout de 4, 6 et 8 semaines après inoculation. Dix semaines après la première inoculation, on a administré à tous les

animaux une seconde inoculation de 2 x 108 unites de forma-

tion de plaque du même virus. Tous.-les animaux ont présenté

une autocicatrisation des lésions de peau, typique des infec-

tions par le virus de la vaccine, et des indications physio-

logiques normales pendant tout le cours de l'expérimentation.

La réponse humorale a été analysée par ELISA et par des essais

de dosage de coagulation de type Western.

Pour une analyse "ELISA", on a dilué les échantil-

lons de sérum de 50 fois dans PBS contenant 3 % de poudre

de lait non gras et 0,2 % de NP-40 (polyoxyêthylène(9)p-tert-

* octylphênol), et on les a fait réagir avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui avaient été immobilisées sur des creux de plaques pour microtitrage. Le mode opératoire pour ELISA a été identique & celui décrit ci-dessus, sauf que le second anticorps utilisé a été de l'anticorps anti-humain

de chèvre conjugué à de la péroxydase de raifort.

Les résultats obtenus, présentés sur la figure 11,

montrent que, si deux animaux seulement ont présenté une séro-

conversion après inoculation primaire, tous les animaux ont

présenté de la séroconversion après la seconde immunisation.

Pour déterminer quels anticorps ont été produits chez les animaux immunisés, on a analysé, par coagulation de type Western, des échantillons de sérum collectés au bout de-4 semaines après la seconde immunisation. On a utilisé

deux protocoles pour la détection optimale des deux glyco-

protéines d'enveloppe, gp41 et gpllO. Pour une détection optimale de gp41, on a dilué le sérum 50 fois dans PPS + 3 %

de lait non pasteurisé et 0,2 % de NP-40, et l'on a fait réa-

gir durant 1 heure à la température ambiante avec de la protéine de virion de LAV/HTLV III purifiée et immobilisée sur un filtre nitrocellulosique. On a lavé les filtres avec PBS (solution saline physiologique additionnée d'un tampon de phosphate) + 0,2 % de NP-40, et l'on a fait réagir avec

de l'anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre con-

juguée à de la phosphatase alcaline (Zymed, CA) à une dilution de 1:2000 dans du tampon PBS + 0,2 % de NP-40. Pour la détection de la glycoprotéine gpllO, on a dilué le sérum fois dans PBS + 3 %de lait non pasteurisé et l'on a fait réagir durant 1 heure à la température ambiante avec de la protéine de virion de LV/HTVL III purifiée et immobilisée sur un filtre en nitrocellulose. On a lavé les filtres dans PBS + 0,05 % de "Tween-20" puis on a fait réagir avec de

l'anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conju-

guée à de la phosphatase alcaline (Zymed, CA) b une dilu-

tion de 1 à 2000 dans du tampon PBS. Dans chaque mode opéra-

toire, le lavage final après la seconde réaction avec l'anti-

corps a été réalisé dans du TRIS 0,1 M (pH 9,5) avec NaCl 0,1M et 5 mM de MgCl2. On a décelé l'anticorps lié à des antigènes sur le filtre en faisant réagir le filtre avec une solution contenant du Tris 0,1M (pH 9,5) , du NaCl 0,1M, 5mM de MgCl2, 0,33 g/ml de phosphate de bromo-chloroindolyle et 0,17 mg/ml de bleu de nitrotétrazolium. Après avoir fait

réagir les filtres avec les chromogènes, on a rincé les fil-

tres dans de l'eau, on les a séchés à l'air et photographiés.

Comme représenté sur la figure 12B, tous les animaux qui ont reçu deux inoculations ont montré une forte réaction

d'anticorps à l'égard de gp41. En outre, quatre de ces ani-

maux ont également produit des anticorps qui ont fortement

réagi avec gpllO. Dans leur ensemble, les résultats repré-

sentés sur la figure 12A montrent que v-env5 recombinant est capable de susciter, chez les singes macaques, la production

d'anticorps spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III.

REPONSE IMMUNOLOGIQUE, A MEDIATION CELLULAIRE, CHEZ DES

MACAQUES IMMUNISES PAR V-ENV5

On a isolé des lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé de macaques, obtenu quatre semaines après une seconde immunisation intradermique par v-env5, ou

un virus recombinant de vaccine témoin exprimant la glycopro-

téine D de virus de herpès simplex (v-HSVgDl), par centrifu-

gation sur appareil "Ficoll Hypaque". On a également isolé des lymphocytes de sang périphérique provenant du macaque 81, qui a été vacciné une fois seulement avec v-env5, et provenant de macaques non immunisés. Les lymphocytes de sang périphérique ont été mis en suspension dans du milieu "RMPI 1640" (Gibco, Grand Island, New-York, Etats-Unis d'Amérique) additionné de 10 % de sérum humain normal inactivé par la

chaleur et l'on a placé 1 x 105 lymphocytes de sang périphé-

rique, dans un volume final de 0,1 ml du milieu, dans des creux de plaque comportant 96 creux à fond rond. Dans chaque

creux, on a introduit 0,1 ml de milieu contenant v-env5 inac-

tivé par la lumière (ultraviolette) (1 x 106 unités de forma-

tion de plaque/ml avant inactivation par l'ultraviolet) ou

LAV/HTLV III non rompu (1 mg/ml, environ 1 x 105 doses in-

fectieuses moyennes obtenues par culture sur tissu), que l'on a purifié par deux cycles de centrifugation avec gradient de saccharose pour séparer les liquides surnageants de cellules CEM infectées par LAV/HTLV III, qui est une lignée de cellules de leucémie T négative de type HLADR. Six jours après la stimulation, on a marqué chaque creux de lymphocytes de sang périphérique avec 1 yCi de 3H-TDR (3H-thydimine, New England Nuclear, Boston, MA, Etats-Unis d'Amérique) durant 6 heures, on a récolté les cellules, et l'on a déterminé les coups par minute (cpm) correspondant à 3H-TDR incorporé, comme étant la valeur moyenne obtenue pour quatre creux. On a calculé l'indice de stimulation an divisant le nombre de coups par minute correspondant à 3H-TDR incorporé à des

cellules stimulées, par le nombre de coups par minute corres-

pondant à l'incorporation à des cellules non stimulées.

TABLEAU I

Réponse, par prolifération induite par LAV/HTLV III, de lymphocytes de sang périphérique prélevé sur des macaques, après immunisation par un virus recombinant de vaccine exprimant les glycoprotéines d'enveloppe de

LAV/HTLV III

Inr unisation v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 venv5 V-HSVgD1 néant néant Néant, cpm* Virus utilisé pour

LAV/HTLV III

cprn* IS**

7465 4,7

9075 4,0

4732 3,0

8645 14,9

5987 2,5

13922 12,9

3985 4,1

8580 3,3

553 1,0-

1822 1,0-

1072 1,0-

la stimulation des lymphocytes v-env 5 cpmf IS** 38,1 12,8 13,6 14,1 14,8 23,0 42,0 18,1 91,9 1,0- 2,0 coups par minute correspondant à 3H-TdR Incorporé indice de stimulation ro Ln o -j. N1' Macaque no * cpm:

** IS:

0% %A Comme on le voit sur le tableau I, tous les macaques immunisés, y compris le numéro 81, qui ont reçu une seule inoculation de v-env5, ont produit des lymphocytes qui ont proliféré en réponse spécifique & la stimulation par LAV/ HTLV III in vitro. Au contraire, les lymphocytes provenant de l'animal 73, qui a reçu de la vaccine-v-HSVgDl recombinant de l'herpès simplex, n'a répondu qu'à la stimulation par le

virus de la vaccine, mais non pas à celle par LAV/HTLV III.

Des animaux témoins non immunisés n'ont pas produit de lympho-

cytes répondant à l'un ou l'autre antigène. En outre, la réponse pour des lymphocytes provenant de macaques immunisés par v-env-5 a été semblable en amplitude à celle obtenue pour la macaque 73, qui a été vacciné avec vHSVgD1. Ces résultats indiquent que l'expression du gène env de LAV/HTLV III par le virus recombinant n'a pas supprimé chez les singes macaques les réponses immunologiques, à médiation par des cellules

T, in vitro ou in vivo.

Pour déterminer le sous-groupe de lymphocytes prove-

nant de macaques immunisés qui a été stimulé par LAV/HTLV III, on a soumis les lymphocytes de sang périphérique stimulés à un examen par immunofluorescence en deux couleurs pour expression des récepteurs IL-2 qui sont présents sur des cellules T activées et sur des cellules -B. Les antigènes CD4 et CD8 sont présents sui les cellules T et l'antigène CD20 (Bp35) est présent sur les cellules B. Les résultats présentés au tableauIII montrent que presque tous les lymphocytes de sang périphérique stimulés par un virus, qui expriment des récepteurs IL-2, expriment aussi des antigènes CD4 ou CD8, alors que 1,5 à 2 % seulement coexpriment l'antigène CD20 (Bp35). Ce résultat indique que les lymphocytes stimulés sont des cellules T.

TABLEAU II

Expression de récepteurs IL-2 et d'antigènes CD4, CD8 ou CD20 (Bp35) sur des lymphocytes de sang périphérique obtenus sur des macaques vaccinés, après stimulation par

LAV/HTLV III ou par un virus de vaccine recombinant exprimant les glycoprotéines d'enve-

loppe de LAV/HTLV III Lymphocytes * stimulés par v-env5 % total de cellules

IL-2R+

27,7 v-env5 % de cellules IL-2R+ coexprimant CD4 48,6 ,6 62,4 CD9 CD20 (Bp35) 52,2 ,0 2,0 NT

LAV/HITLV III

14,7

LAV/HTLV III

,0 12,0 pas de virus 58,0 0,3 0,3- 59,0 38,0 0,3- 1,9 1,5 0,3- * lymphocytes: lymphocytes de sang périphérique * N T: pas d'essai On 0o 'J Macaque n G\ ln On a obtenu comme suit les résultats du tableau

II. On a coloré les lymphocytes de sang périphérique simul-

tanément avec de l'anticorps monoclonal 2A3 conjugué à de la phycoérythrine (Becton-Dickinson, Inc., Mountain View, CA, Etats-Unis d'Amérique), anticorps par rapport au récep-

teur d'interleucine-2 (IL-2R), et avec des anticorps mono-

clonaux IF5 conjugués à de la fluorescéine (Genetic Systems Corp., Seattle, WA, Etats-Unis d'Amérique) pour CD20, G10-1 (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) pour CD8 ou T4 (Ortho a

Diagnostics, Raritan, N.J.) pour CD4. On a utilisé les anti-

corps à des concentrations de saturation, déterminées au préalable par des titrages sur des lymphocytes analysés par microfluorométrie en écoulement avec un classificateur FACS

IV modifié (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). On a effec-

tué une analyse quantitative en deux couleurs comme indiqué précédemment (Ledbetter, J.A. et al., 1984, Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, 6, 119-129). On a réglé les portes de dispersion en avant et à angle droit de manière à inclure des lymphoblastes et un nombre important de petits lymphocytes. Les valeurs indiquées sont celles concernant le pourcentage total de cellules IL-2R+ et pour le pourcentage de cellules IL-2R+ coexprimant CD4, CD8, ou

CD20 (Bp35).

Il est bien établi que des cellules T, après simu-

lation par antigène, produisent des lymphokines comprenant

IL-2, pouvant promouvoir une différenciation et/ou une proli-

fération des cellules T et B et pouvant activer des cellules ou globules lytiques naturels capables de lyser des cellules

infectées par divers virus, ce qui comprend le virus du SIDA.

On s'est donc demandé si les globules ou cellules T provenant de macaques vaccinés produisent IL-2 après stimulation par

LAV/HTLV III.

Pour répondre à cette question, on a conduit deux expériences. Pour l'expérience 1, on a isolé les lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé de macaques quatre semaine après une seconde injection intradermique d'immunisation par v-env5 ou v-HSVgDl construit avec la souche WR du virus de la vaccine. Pour l'expérience 2, on a isolé des lymphocytes de sang périphérique sur des macaques 4

semaines après une première injection intradermique d'immu-

nisation par 2 x 105 unités de formation de plaques de v-env5, v-HSVgDl ou d'un virus recombinant v-env5 construit avec la souche de virus de vaccin du "New York City Board of Health" (service de santé de la Ville de New-York) (v-env5NY). On a mis les lymphocytes de sang périphérique en suspension dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum humain normal inactivé par la chaleur et l'on a placé 2 x 105 lymphocytes de sang périphérique dans des creux de plaque comportant 96 creux & fond rond. On a ensuite

ajouté dans les creux v-env5 inactivé par la lumière ultra-

violette (1 x 106 unités de formation de plaque/ml avant inactivation par la lumière ultraviolette) ou LAV/HTLV III purifié (1 ug/ml). Deux jours après la stimulation, on a récolté les liquides surnageants sur des creux utilisés par paires et l'on a soumis & des essais de détermination de la capacité & entretenir une prolifération de cellules CTLL-2 dépendant de IL-2 (cellules fournies par le Dr S. Gillis, Immunex Corp. Seattle, WA, Etats-Unis d'Amérique), qui ont été lavées durant 24 heures, avant l'essai, pour les débarrasser IL-2. Au cours des six dernières heures d'incubation avec le liquide surnageant, on a marqué les cellules avec 3HTdR, et l'on a déterminé la quantité de 3H-TdR incorporée aux cellules. On a calculé les unités d'activité de IL-2 présent dans le liquide surnageant, comme décrit, & partir de courbes de référence obtenues par des essais de l'effet de IL-2 humain recombinant (fourni par le Dr Gillis) sur la prolifération de cellules CTLL-2. Les

résultats obtenus sont présentés au tableau III.

TABLEAU III

Production de IL-2 par les lymphocytes de sang périphérique provenant de macaques vaccinés, après stimulation par LAV/HTLV III ou par des virus de vaccine recombinants exprimant de la glycoprotéine d'enveloppe de virus de SIDA Expérience 1 IL-2 (unités/ml) Macaque no Immnunisation Liquides surnageants de lymphocytes* stimulés par pas de virus LAV/HTLV III v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-HSVgDl néant o o o O o 28,0 16,0 9,0 o 96,0 124,0 52,0 108,0 o Expérience 2: v-env5 v-env5NY v-env5NY v-env5NY v-HSVgDl néant néant 14,4 16,8 7,1 2,4 o o o ,8 33,3 26,7 27,6 27,6 o o 27:,

26-..,

oe CD ru o -4 rO> c>

Les résultats de l'expérience 1 du tableau III mon-

trent que les cellules surnageantes provenant de lymphocytes de sang périphérique stimulés par v-env5 ou par LAV/HTLV III obtenus sur des macaques immunisés deux fois par v-env5, contiennent IL-2, comme le montre leur aptitude à induire une prolifération de cellules CTLL-2, qui est une lignée de cellules dépendant de IL-2. De même, comme montré dans l'expérience 2 du tableau IV, on a décelé IL-2 dans ce qui surnage des lymphocytes de sang périphérique stimulés par LAV/HTLV III ou par v-env5 provenant du macaque 03, qui a été immunisé une fois avec v-env5, et provenant de l'ensemble des trois macaques qui ont été immunisés une fois par la souche de "vaccins" du même recombinant (v-env5NY,

voir ci-dessus l'exposé sur la construction et la caractéri-

sation du virus de vaccine recombinant contenant le gène

d'enveloppe chimère de LAV/HTLV III). Au contraire, les lym-

phocytes de sang périphérique provenant des macaques 73 et 59, qui ont subi des inoculations d'immunisation par des virus recombinants de vaccine-HSV gD-1, ont produit IL-2 après

stimulation par v-env5iseulement, et non pas après stimula-

tion par LAV/HTLV III. Les macaques 26 et 27, non immunisés, n'ont pas produit de IL-2 décelable après stimulation par LAV/HTLV III ou par le virus de vaccine recombinant. Puisque des cellules ou lymphocytes T, présentant de l'activité d'auxiliaires/inducteurs produisent IL-2 après stimulation antigénique, ces résultats montrent la présence des cellules ou globules T auxiliaires, qui reconnaissent LAV/HTLV III, chez des macaques immunisés par les virus recombinants. En

plus de leur rôle probable dans la différenciation des cellu-

les ou lymphocytes B pour produire des anticorps contre des

antigènes d'enveloppe LAV/HTLV III, les cellules ou lympho-

cytes T producteurs de IL-2 peuvent être impliqués dans la différenciation et/ou l'expansion de cellules effectrices,

comme des lymphocytes T cytotoxiques ou des cellules lyti-

ques naturelles qui peuvent tuer des cellules infectées par

des virus.

REPONSES HUMORALES CHEZ LES CHIMPANZES IMMUNISES PAR

V-ENV5NY

A deux chimpanzés d'age juvénile, on a inoculé par voie intradermique 5 x 108 unités de formation de plaque de v-env5NY, la souche de "vaccin" de venv5. A un animal, on

a inoculé par voie intradermique le même titre d'un recom-

binant de vaccine-herpès simplex gD, v-HSVgDlNY construit à partir de la même souche parentale de vaccine (v-NY) que

v-env5NY. On a administré à tous les animaux une seconde ino-

culation de la même dose 8 semaines après la première immuni-

sation. On a collecté deux fois par semaine les échantillons de sérum après immunisation et on les a soumis à des dosages, par ELISA et par coagulation de type Western, pour chercher des anticorps spécifiques de LAV/HTLV III. Tous les animaux ont présenté une autocicatrisation des lésions de la peau, typique d'une infection par virus de la vaccine et ils ont eu des résultats physiologiques normaux pendant tout le cours

de l'expérience.

Les méthodes pour un examen de type ELISA sur des sérums de chimpanzés ont été identiques à celui utilisé pour des sérums de macaques. Les résultats présentés au tableau V indiquent que les deux animaux d'expérience (124 et 149) ont subi une séro-conversion au bout de 8 semaines après première immunisation et que les taux d'anticorps ont continué

à augmenter après la seconde injection d'immunisation. L'ani-

mal témoin (134) est resté séronégatif.

TABLEAUIV

dosage ELISA d'échantillons de sérum provenant de chimpanzés immunisés par des virus de vaccine recombinants Lecture ELISA pour des anticorps de sérum spécifiques de LAV/HTLV III Temps du prélèvement Chimpanzé n 134 vHSVgDINY Chimpanzé n 124 v-env5NY Chimpanzé n 149 v-env5NY Avant saignée 8 semaines apres la première injection d'immunisation 2 semaines après la seconde injection d'immunisation

0,084 + 0,015

0,085 + 0,010

0,075 + 0,012

0,100 + 0,005

0,185 + 0,020

0,237 + 0,017

0,123 + 0,025

0,403 + 0,027

0,523 + 0,073

ro N o -J

Pour montrer que les anticorps spécifiques de LAV/ -

HTLV III décelés chez les animaux immunisés étaient dirigés contre les glycoprotéines d'enveloppe, on a analysé les

mêmes sérums par coagulation de type Western. Le mode opéra-

toire utilisé a été optimisé pour la détection de l'anti- corps gp41, et il a été identique à celui utilisé pour l'analyse des sérums de macaques. Les résultats présentés sur la figure 13 montrent que les anticorps spécifiques de LAV/HTLV III, fabriqués dans les deux animaux vaccinés,

agissent bien entendu à l'encontre des glycoprotéines d'en-

veloppe, et que le taux au niveau de ces anticorps a augmenté

après la seconde injection d'immunisation.

REPONSES IMMUNOLOGIQUES, A MEDIATION PAR LES CELLULES,

CHEZ DES CHIMPANZES IMMUNISES PAR V-ENV5NY

On a utilisé des lymphocytes de sang périphérique, isolées à partir des mêmes animaux que ceux décrits ci-dessus,

pour montrer les réponses immunologiques, à médiation cel-

lulaire, chez ces animaux. On a isolé les lymphocytes de

sang périphérique à partir de sang héparinisé, par centri-

fugation de type Ficolli-hypaque 4 semaines après l'inocula-

tion intradermique initiale des virus de vaccine recombinant.

On a ensemencé ces lymphocytes à raison de 1 x 105 cellules par creux dans des plaques de microtitrage comportant 96 creux, dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum humain normal inactivé par la chaleur et de pénicilline/

streptomycine. On a ensuite ajouté dans les creux les glyco-

protéines de LAV/HTLV III (5,ug/ml) ou des glycoprotéines

d'enveloppe de LAV/HTLV III (1 ug/ml), isolées par chromato-

graphie de lectine sur LAV/HTLV III purifié. Six jours plus tard, on a déterminé, par comptage de scintillation en

milieu liquide, H3-thymidine incorporée aux cellules.

Comme montré sur le tableau V, les lymphocytes provenant des deux animaux (n S 124 et 149) immunisés par v-env5NY, ont proliféré en réponse à une stimulation par le virion LAV/HTLV III ou par des protéines d'enveloppe purifiées (env). Au contraire, l'animal 134, qui a reçu de la vaccine, herpès simplex recombinant v-HSgD1NY, n'a pas

produit de lymphocytes reconnaissant LAV/HTLV III.

TABLEAU V

Réponse immunologique, à médiation cellulaire, chez des chimpanzés vaccinés par des recombinants de vaccine 3H-thymidine incorporée dans des lymphocytes* stimulés par Chimpanzé n Irmunisation pas d'antigène LAV/HTLV III env 124 v-env5NY 2842 37 132 26 370 149 v-env5NY 375 20 292 27 115 134 v-HSVgD1NY 367 1 987 367 64 néant 452 567 222 72 néant 737 2 417 905 * lymphocytes de sang périphérique Les lymphocytes de sang périphérique provenant de

tous les chimpanzés ont présenté des titres élevés d'incor-

poration de 3H-thymidine (38 870 à 109 790 cpm) après stimu-

lation par de la phytohémagglutinine (PHA, 2,ug/ml) et des taux élevés d'incorporation de 3H-thymidine (42 172 à 12 067 cpm) après stimulation par des lymphocytes de sang

périphérique humain xénogène, groupé, ayant subi une irra-

diation par des rayons X. Les lymphocytes de sang périphé-

rique provenant de chimpanzés immunisés par v-env5 et aussi le chimpanzé immunisé par v-HSVgDlNY, ont montré de fortes réponses de prolifération à des virus de la vaccine, alors

que des lymphocytes de sang périphérique provenant de chim-

panzés non immunisés n'ont pas proliféré en réponse à une

stimulation par du virus de la vaccine.

Dans l'ensemble, les résultats présentés au tableau I du brevet principal, sur les:.tableaux I à V et sbr les figures 11 à 13 indiquent que (a) le virus de vaccine recombinant v-env5 et sa contrepartie dans la souche de vaccin> v-env5NY, ont été capables de susciter des réponses immunologiques à médiation humorale et cellulaire spécifiques de LAV/HTLV III dans deux espèces de primates sub-humains, les macaques et les chimpanzés, et (b) que les virus recombinants n'ont pas supprimé les réponses immunologiques & médiation par les cellules ou

lymphocytes T, in vitro ou in vivo.

DIMINUTION DE LA NEUROTOXICITE DE RECOMBINANTS CONSTRUITS

AVEC LA SOUCHE V-NY DU VIRUS DE LA VACCINE

On a injecté dans le cerveau de groupes de cinq souris (souche ICR) des parties aliquotes de virus, contenant x 107 unités de formation de plaques dans 25 & 50 "l. On a coté le rapporté le rapport de mortalité 10 jours après

inoculation.

TABLEAU VI

Mortalité de souris ayant subi une cérébrale par des recombinants

inoculation intra-

de la vaccine Inoculation v-NY v-env5NY v-env2NY; v-epv7NY vaccin antivariolique (Wyeth) v-env5 v-env2 v-env7 Animaux morts/ animaux traités par injection 0/5 0/5 0/5 0/5 3/5 /5 /5 /5 solution saline 0/5 Les résultats présentés au tableau VI indiquent

que le virus de la vaccine provenant d'une culture tissu-

laire, purifié sur plaque (souche v-NY) et ses dérivés v-env5NY, v-env2NY et v-env7NY, ont une neurotoxicité réduite en comparaison de la souche WR et de ses dérivés. Puisque la souche du "New York City Board of Health"(service de

santé de la ville de New-York) a servi de vaccin anti-vario-

lique, des recombinants basés sur cette souche devraient mieux convenir pour le développement d'un vaccin pour usage humain.

EXEMPLE 2-: RECOMBINANTS GAG DE BACULOVIRUS

Dans l'exemple suivant, on a construit divers vec-

teurs de plasmides contenant des gènes chimères comprenant des séquences de codage de gag LAV/HTLV III situées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription de AcNPV.

On a inséré ces gènes chimères, contenant le promo-

teur de polyédrine AcNPV et la séquence de codage gag de LAV/HTLV III, dans le génome de AcNPV, par recombinaison in vivo. De tels virus recombinants ont été identifiés et purifiés, et on a préparé des stocks de virus à partir de cellules de cultures tissulaires infectées. On a montré que des protéines immunoréactives, apparentées à gag de LAV/HTLV III, sont produites in vitro par le recombinant AcNPV. On

a montré que les cellules infectées par des virus recombi-

nants présentent une immunofluorescence positive. Enfin, des lysats de cellules infectées par AcNPV recombinant ont été positifs dans le dosage ELISA quand des essais ont été effectués avec du sérum provenant de patients atteints de

SIDA. Une description détaillée de chaque étape de cette

forme de réalisation de l'invention est présentée ci-après.

MODES OPERATOIRES GENERAUX

Cellules et virus On a obtenu des cellules de Spodoptera frugiperda, clone Sf9, à l'American Type Culture Collection (ATCC n CRL 1711) et l'on en a effectué la propagation dans du milieu Antheraea de Grace (Gibco, KC Biologicals) contenant 3,3 g/l d'un hydrolysat de levure (de Difco) et 3, 3 g/l d'un hydrolysat de lactalbumine (Difco), 10 % de sérum de foetus de bovin et 0,06 g/l de pénicilline ainsi que 0,1 g/1 de streptomycine (milieu TNM-FH). On a cultivé les cellules à 28 C. On a obtenu le virus de polyhédrose nucléaire Autographa californica du Dr Lois Miller (Department of Genetics and Entomology, University de Géorgie, Athènes, GA 30602, Etats-Unis d'Amérique) et l'on a purifié ce virus par plaque sur des cellules Sf9 contenant i % de gélose et

0,8 x TNM-FH. Les dilutions de stocks de virus ont été réa-

lisées dans TNM-FH.

PREPARATION, RESTRICTION ET MODIFICATIONS DE ADN

Les enzymes de restriction ont été achetées au Bethesda Research Laboratories Inc., et les conditions pour les digestions de restriction ont été celles suggérées par le fournisseur. On a utilisé le fragment de Kenow de l'ADN polymérisage de E. coli à 200 unités/ml dans du Tris-HCl mM (pH 7,4), 6 mM de MgC12, 10 mM 2-mercaptoéthanol à

37 C durant 30 minutes.

On a préparé de l'ADN viral pour transfection à partir de stocks de virus non occlus (VNO) de virus de type sauvage, an utilisant le mode opératoire suivant de Miller,

L.K; Miller D.W. et Safer, P.: on a obtenu un culot de cen-

trifugation des particules de VNO pour les séparer du liquide surnageant à travers un coussin de 25 % de saccharose, mM de NaCl et 10 mM de EDTA, par centrifugation à 90 000g durant 1 heure à 5 C. On a enlevé le liquide surnageant et l'on a remis en suspension le culot de virus dans 0,5 ml 2O-dê-tampon de lyste (10 iM de Tris, pH 7,6, 10 mM de EDTA, 0,25 % de SDS). Apres remise an suspension du culot des virus, on a ajouté de la protéinase K jusqu'à une concentration finale de 500 ug/ml et l'on a fait incuber durant la nuit

(environ 16 heures) à 37 C avec agitation occasionnelle.

On a extrait l'ADN avec un égal volume de phénol: chloro-

forme: alcool isoamylique (25:24:1). On a ensuite précipité __ 'ADN à 20 C par l'addition d'1/10 de volume d'acétate de sodium 3M à pH 5 et de 2 volumes d'éthanol froid. Apres obention d'un culot de centrifugation, on a lavé l'ADN avec de l'éthanol à 70 %, on l'a séché et ramis en suspension

dans TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 7,5) avant de l'uti-

liser pour une transfection ou par analyse par enzyme de restriction. On a préparé de l'ADN de plasmide an utilisant le mode opératoire de Summers, M.D. et Smith, G.E. comme suit: On a inoculé une seule colonie de cellules bactériennes, provenant d'une plaque fraîchement préparée, à 1 ml de

bouillon Luria (BL) additionné d'un antibiotique approprié.

Après incubation à 37 C durant 12 à 18 heures,on a transféré

le ml de culture dans 200 ml de bouillon Luria plus des anti-

biotiques dans un ballon de 500 à 1000 ml, et l'on a fait incuber dans un incubateur à secousses (37 C) durant la nuit (12 à 18 heures). On a transféré les cultures, de 200 ml chacune, dans des bouteilles pour centrifugeuses, et l'on

a centrifugé à 2500 t/min durant 10 minutes. Après enlève-

ment du liquide surnageant, on a remis en suspension chaque

culot de cellules dans 30 ml de tampon STET (8 % de saccha-

rose, 0,5 % de Triton X-100, 50 mM de EDTA (pH 8,0), 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0) à la température ambiante et l'on a transféré dans un ballon de 125 ml. Puis l'on a ajouté dans chaque ballon 3 ml de 10 mg/ml de lysozyme (préparé frais dans du tampon STET), et l'on a fait tourbillonner chaque ballon pour mélanger, puis l'on a fait incuber durant 5 minutes environ à la température ambiante. On a ensuite fait doucement tourbillonner chaque ballon (environ 1 fois toutes les 5 secondes) directement au-dessus d'une flamme jusqu'à ce que les cellules commencent à coaguler et à virer au blanc. Au moment o des bulles se sont formées, on a transféré les ballons dans un bain d'eau bouillante durant secondes, après quoi on a refroidi les ballons dans un bain d'eau glacée durant 2 minutes ou davantage. On a versé

lentement les mélanges visqueux dans des tubes de centri-

fugeuses à fond rond, de 50 ml, et l'on a centrifugé durant minutes à 16000 t/min en utilisant un rotor SW 28 (Beckman, CA) dans une centrifugeuse pour préparation. On a soigneusement versé le liquide surnageant de chaque tube dans un tube de centrifugeuse an polypropylène, à jeter après usage, et auquel on a ajouté un volume d'isopropanol ou deux volumes d'éthanol, et l'on a précipité l'ADN à -80 C durant 20 minutes (ou -20 C durant 2 heures ou davantage),

et l'on a centrifugé à 2500 g durant 15 minutes ou davantage.

Après enlèvement de l'alcool, on a ajouté 2,5 ml de tampon pour extraction (par litre: 12,1 g de Tris, 33,6 g de Na2EDTA, 2H20, 14,9 g de KC1, pH 7,5) au culot, que l'on a ensuite

fait tourbillonner pour détacher le lysat du fond du tube.

On a ajouté 100 el de 10 mg/ml de RNase A (dissous dans 0,1X TE et prétraité par 10 minutes d'ébullition) et l'on a fait incuber durant 30 minutes & 37 C. On a ajouté dans chaque tube environ 200,ug de protéinase K et l'on a ensuite fait incuber à 40-50 C durant 30 minutes environ, au bout desquelles on a ajouté 250,ul de Sarkosyl à 10 % et l'on a poursuivi l'incubation durant 3 heures au moins. Afin de préparer des gradients de CsCl, on a ajouté dans chaque tube 80 ul de 10 mg/ml de bromure d'éthidium par ml de solution de ADN. Puis l'on a ajouté dans chaque tube 1,04 g de CsCl

par ml de solution de ADN et l'on a fait doucement tourbil-

lonner pour dissoudre. Après transfert dans des tubes "Quick Seal"(R), on a centrifugé les gradients jusqu'& équilibre à 55 O00 t/min durant 16 heures dans un rotor à angle fixe 70.1 Ti, ce qui a donné deux bandes visiblement bien séparées de ADN dans lesquelles la bande supérieure comprend l'ADN linéaire et entaillé alors que la bande inférieure comprend de l'ADN circulaire fermé par covalence. La bande inférieure (ADN circulaire fermé par covalence) a été collectée et

versée dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, en polypropy-

lène, dans lequel on a ajouté de l'eau pour porter dans chaque tube le volume à environ 6 ml. On a extrait de l'ADN le bromure d'éthidium, en utilisant un volume égal d'alcool

isoamylique, et l'on a enlevé et jeté la phase rose (supé-

rieure). On a répété l'extraction jusqu'à ce que la phase supérieure soit incolore, et que la phase inférieure (ADN) soit limpide et incolore. Il doit rester dans chaque tube environ 5 ml de solution de ADN (sinon, on ajoute de l'eau jusqu'à un volume final de 5 ml) auquel on a ajouté 2 volumes d'éthanol absolu. On a précipité l'ADN à -20 C durant la nuit ou à -80 C durant 10 minutes, et l!on a formé un culot

par centrifugation à 2500 g durant 20 minutes. Après enlè-

vement de la totalité de l'alcool, on a ajouté à chaque culot

500 ul de 0,1X TE, et l'on a mis le culot à nouveau en sus-

pension à 65 C durant 10 minutes au moins. On peut conserver

l'ADN à 4 C.

On a aussi préparé de l'ADN de plasmide comme décrit dans Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (page 8696). L'ADN-ligase a été achetée chez New England Biolabs, et on l'a utilisée à 10 000 unités/ml dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgC12, 20 mM de DTT, 1 mM de ATP. L'analyse de ADN sur des gels de gélose a été comme décrit dans Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning,

Cold Spring Harbor Laboratory.

CONSTRUCTION DE VECTEURS PLASMIDES CONTENANT DU PROMOTEUR

AcNPV RELIE PAR LIGATION A DES SEQUENCES DE CODAGE DE GENE GAG DE LAV/HTLV III (pAc-gagl) On décrit ci-après la construction et les vecteurs plasmides contenant des séquences codantes du gène de LAV/

HTLV III gag, ce qui est précédé par des séquences de com-

mande de transcription de AcNPV et suivies de l'ADN poly-

* hédrine. Ces vecteurs plasmides recombinants ont servi ensuite à insérer les séquences de codage de LAV/HTLV III gag dans

le génome du baculovirus par recombinaison in vivo.

On a purifié la séquence de codage de LAV/HTLV III gag (figure 14) à partir de pKS-5, un sous-clone de lambda J19 (Wain-Hobson, S, et al., 1985, Cell 40:9) et on l'a

inséré dans le plasmide Ac610 en aval par rapport au promo-

teur de polyédrine de baculovirus contenu dans pAc610, afin de construire pAc-gagl (figure 15). Dans cette construction, la séquence de nucléotides spécifiques de LAV/HTLV III est précédée par le promoteur de polyédrine formant un gène

chimère suivi de la séquence du gène de pdlyédrine.

Comme précédemment expliqué, pKS-5 consiste en un fragment de 3148 paires de bases SStI à KpnI de la partie insérée de ADN de LAV/HTLV III contenue dans lambda J19 cloné dans le site de SstI et de KpnI de pUc18. On l'a obtenu en clonant le fragment de restriction de SstI de J19 dans le site SStI de pUC18 pour créer pBT-1, que l'on a ensuite soumis à digestion avec KpnI et soumis à nouvelle ligation. On a utilisé cet ADN pour transformer E. coli, et l'on a isolé le plasmide pKS-5. L'ADN spécifique de LAV/

HTLV III contenu dans pKS-5 va du site SstI logé au nucléo-

g0 tide 224 jusqu'au site KpnI logé au nucléotide 3372 sur le génome LAV/HTLV III (Wain-Hobson, S et al., 1985, Cell 40:9;

voir aussi la figure 14).

On a soumis 10 >g de pKS-5 & digestion jusqu'à achèvement par HincII et SStI, et l'on a résolu les fragments résultant sur un gel de gélose à 1 % a faible température de fusion. On a excisé du gel le fragment comportant 1818 paires de base (environ 0,20 ug). Ce fragment contenait des séquences spécifiques de LAV/HTLV III allant du nucléotide n 224 au n 2042, comme présenté sur la figure 14. Il contient

la région de codage pour la totalité du gène gag.

On a soumis cinq microgrammes de pAc610 à digestion jusqu'à achèvement avec SmaI et SstI, et l'on a effectué le fractionnement sur un gel de gélose à 1 % & bas point de fusion; on a excisé du gel la bande de ADN (environ

0,4 pg) (figure 15).

On a fait fondre les deux tranches de gel à 65 C durant 10 minutes et l'on a effectué la ligation de 3 1ul de fragment spécifique de LAV/HTLV III comportant 1818

paires de base (digestion avec HincII et SstI) sur un-micro-

litre de pAc 610 (digestion avec SmaI et SstI) dans un volume total de 40 jul. L'incubation a eu lieu à 23 C (température ambiante) durant 16 heures. On a ensuite chauffé le mélange de ligation durant 10 minutes à 65 C et on l'a utilisé pour transformer la souche HB101 de E. coli. On a testé de l'ADN plasmide provenant de transformants capables de résister

à l'ampicilline, pour déceler la présence de la partie insé-

rée correspondant à LAV/HTLV III. La structure de ce plas-

mide, pAc-gagl, est montrée sur la figure 15.

CONSTRUCTION DU BACULOVIRUS RECOMBINANT CONTENANT LE GENE

CHIMERE LAV/HTLV IOI GAG (Ac-gagl) On a purifié par plaques AcNPV et l'on en a effec-

tué la propagation sur des cellules Sf9. On a isolé de l'ADN de AcNPV de type sauvage et l'on a purifié pAc-gagl comme

précédemment décrit (voir ci-dessus).

On a réalisé l'insertion des séquences chimères

de LAV/HTLV III gag dans le génome de AcNPV, par recombi-

25877'20

naison in vivo rendue possible par le fait que les séquences gag de pAcgagl sont entourées par des séquences AcNPV codantes. Une co-transfection de 1'ADN plasmide pAc-gagl

avec de l'ADN de AcNPV de type sauvage a permis à une recom-

naison de se produire entre les séquences de polyédrine sur le plasmide et les séquences homologues du génome de AcNPV. L'insertion du gène chimère se produit par suite de double recombinaisons dans les séquences entourantes ou de flanc. De tels recombinants vont avoir le gène chimère inséré

dans le gène de polyédrine de AcNPV et, donc, seront inca-

pables de produire des corps à occlusion. On peut choisir les plaques de recombinants en effectuant un examen visuel

pour déceler l'absence de virus à occlusion.

On a mélangé 1,g d'ADN de AcNPV, 5 ug de pAc-gagl, et 15 >ug d'ADN de thymus de veau, et l'on a précipité par de l'éthanol. On a lavé le précipité avec de l'éthanol à %, on a laissé sécher à l'air sous une hotte pour culture

de tissus, et l'on a remis en suspension dans 437.1 de H20.

On a ajouté CaCl2 jusqu'à 0,25 M (63 ul de CaCl2 2M pour 437 ul de ADN dans H2Oi. Tout en faisant barboter de l'air

dans 500 ul de 2XHEBS, on a ajouté goutte à goutte la solu-

tion d'ADN (1 goutte/4 secondes). 2XHEBS contient, par ml, 16 mg de NaCl, 2 mg de D-glucose, 0,75 mg de KC1, 0,5 mg de Na2HPO4.12H2O, 9,5 mg pH 7,1. On a fait incuber le mélange à la température ambiante durant 30 minutes et on l'a ajouté à une boîte pour culture sur tissu, de 60 mm,

contenant 3 x 106 cellules Sf9 dans 2 ml de milieu d'insec-

tes de Grace contenant 10 % de sérum de foetus de veau et

des antibiotiques (pas d'hydrolysat de levure ni d'hydroly-

sat de lactalbumine). On a ajouté goutte à goutte la solu-

tion de ADN aux cellules, et l'on a fait incuber la boîte durant 4 heures à 28 C. On a rincé la boîte avec 4 ml de milieu de Grace + FBS + des antibiotiques, et l'on a fait incuber durant 90 minutes avec du milieu de Grace + FBS +

des antibiotiques + 20 % de diméthylsulfoxyde.

On a rincé la plaque 3 fois avec du milieu complet et on l'a soumise à incubation à 28 C avec 4 ml de milieu complet. Au bout de 5 jours, on a collecté ce qui surnage et l'on a clarifié & 1000 g durant 5 minutes. On a titré le stock du virus sur des cellules Sf9 et l'on a identifié par examen visuel les plaques sans occlusion. On a prélevé les plaques sans occlusion et l'on a effectué deux fois encore un traitement sur plaque. On a provoqué l'expansion de ces plaques sur des cellules Sf9 et l'on a préparé des stocks du virus que l'on a utilisés pour une caractérisation

subséquente. Une représentation schématique de la construc-

tion du recombinant est présentée sur la figure 16.

EXPRESSION DE LA PROTEINE APPARENTEE A LAV/HTLV III GAG

DANS DES CELLULES DE CULTURES TISSULAIRES INFECTEES PAR

DES BACULOVIRUS RECOMBINANTS

On a montré que l'AcNPV recombinant, portant le gène chimère LAV/HTLV III gag est capable d'exprimer, après infection des cellules dans une culture sur tissu, de l'ARN et des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag. On a aussi trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum

provenant de patients atteints de SIDA.

L'identification de l'ARN spécifique de LAV/HTLV III gag dans des cellules infectées par Ac-gagl On a infecté dix boites de 100 ml de cellules Sf9 (environ 107 cellules/boite) par AcPNV de type sauvage ou

son recombinant, Ac-gagl, à un taux de multiplicité d'infec-

tion de 4. 24 heures après l'infection, on a récolté les cellules et on les a lavées deux fois dans NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,2. On a isolé de l'ARN polyadénylé,

comme décrit (Purchio, A.F. et Fareed, G.C, 1979, J. Virol.

29:763-769). On a fractionné l'ARN sur un gel à 1 % de géloseformaldéhyde (H. Lehrach et al., 1977, Biochemistry 16:4743-4251), on a transféré sur un filtre en "Nylon"

("Hybond") et l'on a irradié par de la lumière ultraviolette.

On a provoqué l'hybridation du filtre sur de l'ADN de pKS-5 marqué par 3 P dans NaCl 0,9 M, phosphate de sodium 50 mM (pH 7,0), EDTA 5 mM, SDS 0,1 %, 4 XDenhardts, RNAt 0,4 mg/ml, ADN de thymus de veau_0,25 mqiml, formamide à 50 % durant 16 heures à 42 C. On a lavé les filtres quatre fois dans SDS, 0,1 %, 0,25XSSC durant 30 minutes à 65 C et l'on a exposé à un film "Cronex 4" pour rayons X, en utilisant des écrans d'intensification "Lightening Plus". La figure 17 montre qu'une bande majeure de 2,2 kilopaires de base est décelée dans des cellules infectées par AcNPV recombinant,

mais non dans des cellules infectées par un type sauvage.

IDENTIFICATION DE PROTEINES APPARENTEES A LAV/HTLV III GAG

EXPRIMEES DANS DES CELLULES INFECTEES PAR DU BACULOVIRUS

RECOMBINANT, EN UTILISANT DES TECHNIQUES D'IMMUNOPRECI-

PITATION

L'essai de dosage par immunoprécipitation, décrit

ci-après, montre que les cellules infectées par le baculo-

virus recombinant de la présente invention-synthétisent des protéines qui sont spécifiquement immunoréactives avec du

sérum provenant de patients atteints de SIDA.

On a ensemencé des cellules Sf9 sur des boites de ml (5 x 106 cellules/botte) et l'on a infecté par AcNPV de type sauvage dans Ac-gagl. A 24,.48 et 72 heures après l'infection, on a remplacé les milieux par des milieux sans méthionine, et l'on a fait incuber les cellules durant 30

minutes à 28 C. Au bout de ce temps, on a remplacé les mi-

lieux par des milieux sans méthionine contenant 100 iCi/ml

de 5sI méthionine et l'on a laissé le marquage se pour-

suivre durant 2 heures à 28 C.

A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules deux fois avec Tris-HCl 0,01 M (pH 7,2), NaCl 0,15M

et l'on a collecté par centrifugation. On a remis en sus-

pension les culots de cellules, provenant de chaque botte

de 60 mm, dans 1 ml de tampon de lyse: 1 % de NP-40 (poly-

oxyéthylène(9) p-tert-octylphénol), 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0, 1M de NaCl, 0,01M de Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM de EDTA, et l'on a clarifié le lysat par centrifugation

durant 30 minutes à 100 000 g.

On a effectué une immunoprécipitation en ajoutant 4,l de sérum humain, inactivé par chauffage, provenant d'une population témoin ou de patients atteints de SIDA,

à 500 ml de lysat de cellules. Après une demi-heure d'incu-

bation à 4 C, on a ajouté 80 ul de cellules de Staphylococcus aureus activées (cellules "Pansorbin", Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA, Etats-Unis d'Amérique) et on a laissé

l'incubation se poursuivre durant 1 demi-heure supplémen-

taire à 4 C. On a collecté les comples d'immunoprécipitation, par 5 minutes de centrifugation à 5000 t/min. dans un rotor Sorvall A384 à 4 C, et on a lavé une fois dans 1M NaCl + 0,1 % de NP-40 + 0,01 M de Tris-HCl, pH 7,4, et trois fois dans du tampon RIPA (10 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0, 15 M de NaCl, 1 % de désoxycholate de sodium, 1 % de lauryl sulfate

de sodium, 1 % de "Triton X-100"). On a remis les immuno-

précipités, ainsi lavés, en suspension dans 80,ul de tampon pour échantillons de Laemmli, on a fait bouillir durant 1 minute et centrifugé durant 5 minutes à 5000 t/min. dans un rotor Sorvall A384. On a analysé, par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide à 10 % de SDS, les protéines immunoprécipitées présentes dans le liquide surnageant. Apres l'électrophorèse, on a coloré les gels avec du colorant bleu

Coomassie, on a traité par du salicylate de sodium (30 minu-

tes à la température ambiante dans du salicylate de sodium

1M) et l'on a séché pour fluorographie.

Il a été suggéré que les protéines gag matures (34 000 daltons, p24; 16000 daltons, p16; 14 000 daltons,

p14) sont obtenues à partir d'une plus grosse protéine pré-

curseur de 55 000 daltons. La figure 14 montre que des protéines ayant des poids moléculaires de 67 000 daltons, 000 daltons, 40 000 daltons, 34 000 daltons, 32 000 daltons et 24 000 daltons ont été spécifiquement immunoprécipitées

par du sérum provenant de patients atteints de SIDA.

Afin de déterminer s'il existe une relation quel-

conque précurseur/produit parmi des protéines immunoréac-

tives quelconques décrites dans la figure 18, on a effectué des expériences par impulsions de chasse. 24 heures après l'infection, on a marqué durant 5 minutes les cellules avec [5SI méthionine; on a ensuite lavé les cellules avec du milieu complet et on les a faites incuber avec du milieu complet 2, 4 et 8 heures. On a alors récolté les cellules et on les a soumises & immunoprécipitation. On a soumis les protéines immunoprécipitées à fractionnement dans des gels

de polyacrylamide à 10 % de SDS, comme décrit ci-dessus.

La figure 19 montre un fluorogramme de cette expérience.

Les données suggèrent que p67, p55, p40, p34 et p32 incor- porent le marqueur au bout de 5 minutes. Après une chasse de 8 heures, le marqueur diminue dans p67 et p55 et augmente

dans p34. La quantité de radiomarqueur dans p40 reste rela-

tivement constante.

IDENTIFICATION PAR ELISA DE PROTEINES APPARENTEES A LAV/

HTLV III GAG

On a infecté par Ac-gagl dix boites de 100 ml, con-

tenant chacune 10 cellules Sf9. 24 heures après l'infection, on a récolté les cellules, on les a lavées deux fois dans du Tris-HC1 0,01M (pH 7,2), NaCl 0,15M et on les a congelées et décongelées trois fois. On a provoqué la rupture des cellules à l'aide de 2 ml de solution saline tamponnée par des phosphates et contenant 0,5 % de NP-40 sur de la glace durant 5 minutes. On a centrifugé les lysat à 1000 x g

durant 10 minutes et l":'on a enlevé le liquide surnageant.

On a ajouté 4 ml de tampon de carbonate (50 mM de carbonate de sodium, pH 9,6) et l'on a fait tourner lae mélange dans une centrifugeuse Eppendorf durant 20 minutes. On a enlevé

le liquide surnageant et on l'a dilué dans du tampon de car-

bonate comme présenté au tableau III. On a utilisé ces lysats pour revêtir durant la nuit à 4 C des plaques de microtitrage comportant 96 creux (50 ul/creux). On a ajouté 300,ul d'un réactif de blocage (5 % de poudre de lait non grasse, 0,01% de thimerosol, 0,1 % d'antimousse A dans 10 X solution saline tamponnée par des phosphates), et l'on a fait incuber durant

minutes à la température ambiante. On a enlevé par aspi-

ration le réactif de blocage, et l'on a ajouté dans chaque creux 50,ul d'une dilution a 1:100 de sérum humain dans du réactif de blocage. Avant l'addition aux creux, on a fait incuber les sérums dilués (sérums provenant de patients atteints de SIDA ou sérum humain normal) à 37 C durant 45 minutes. On a laissé chaque creux réagir & 37 C durant 1

heure. On a ensuite lavé les creux trois fois avec du chlo-

rure de sodium + "Tween 20" (monolaurate de polyoxyéthylène sorbitanne). On a ajouté dans chaque creux 100 >xl de conjugué de péroxydase de raifort anti-humain de chèvre (une dilu- tion à 1:100 dans du sérum normal de chèvre contenant 0,01%

de thimérosol) et on a laissé réagir durant 1 heure à 37 C.

On a lavé les plaques et l'on a ajouté 100 >l/creux de subs-

trat tamponné plus du réactif chromogène: le substrat tam-

ponné est du péroxyde d'hydrogène, de l'acide citrique et

du tampon au phosphate; le réactif chromogène est la tétra-

méthylbenzidine dans du diméthylsulfoxyde. On a fait incuber

les plaques durant 30 minutes à la température ambiante.

On a arr6té la réaction en ajoutant 100,ul/creux d'acide sulfurique 3N. On a mesuré à 400 nm, avec une absorptance de référence à 630 nm, l'absorptance optique du mélange

réactionnel. Les résultats sont présentés au tableau VIII.

TR1, Y-1, CF22C et CF9 correspondent a du sérum provenant de patients atteints de SIDA; 2, 16, 21 et 48 sont du sérum

humain normal.

TABLEAU VII

VALEURS D'ABSORPTANCE LORS D'UN DOSAGE

Antisérum Dilution du lysat de -1 SIDA TR1 Y-1 2,619 2,504 2,502 2,305 2, 486 2,319 2,303 2,209 CF22C CF9

SERUM NORMAL:

0,221 0,229 0,176 0,165 0,193 0,205 0,200 0,249 - 2,471 2,479 2,354 2,306 2,317 2,241 2,110 2,012 È,204 0,187 0,175 0,135 0,190 0,176 0,185 0,169

1 400-1

2,235 2,216 2,046 2,006 1,924 1,838 1,339 1,305

0,-312

0,176 0,217 0,139 0,216 0,170 0,217

0,163,

2,076 2,119 1,564 1,595 1,393 1,331 0,855 0,850 0,199 0,227 0,131 0,210 0, 189

0, 199

0,177 0,175

"EL I SA"

Ac-gag 1

1000 1

1,499 1,500 1,014 1,078

0,8 11

0,848 0,512 0,455

800- 1

1,786 1,877 1,298 1,282 1,009 1,068 0,636 0,659 0,228 0,208 0,144 0,175 0, 237 0,197 0,190 0,173 CD -4 0,222 0,210 0,129 0,145 0,165 0,224 0,134 0, 143 r%3 oo Po on uA.I 0c 1-' Dans l'ensemble, les résultats représentés sur les figures 17 à 19 et sur le tableau VII indiquent que les baculovirus recombinants que l'on décrit ici ont été capables (a) d'exprimer le gène inséré LAV/HTLV III gag; (b) de modifier ou traiter de tels produits de géne; et (c) de

produire des protéines antigéniques spécifiquement immuno-

réactives avec du sérum de patients atteints de SIDA.

EXEMPLE: RECOMBINANTS GAG-VACCINE

Dans l'exemple qui suit, on a construit des vec-

teurs de plasmides qui contenaient des gènes chimères com-

prenant des séquences de codage de LAV/HTLV III gag situées en aval par rapport aux régions de commande de transcription du virus de la vaccine. On a inséré le gène chimère contenant le virus de vaccine 7,5 K promoteur et la séquence LAV/HTLV

III gag dans le génome du virus de la vaccine, par recombi-

naison in vivo. On a identifié et purifié de tels virus recombinants, et l'on a préparé des stocks de virus à partir de cellules obtenues par culture sur tissu infecté. On a montré que des protéines immunoréactives apparentées à LAV/ HTLV III gag, sont produites in vitro par les virus de

vaccine recombinants. Une description détaillée de chaque

étape dans cette forme de réalisation de l'invention est présentée ciaprès. Les modes opératoires généraux utilisés pour cette forme de réalisation ont été décrits ci-dessus

à propos des recombinants d'enveloppe de vaccine.

Construction de plasmides vecteurs contenant un promoteur de virus de vaccine, relié par ligation aux séquences de codage du gène LAV/HTLV III gag

On a construit cinq.plasmides vecteurs qui conte-

naient le promoteur 7,5K de virus de vaccine relié par liga-

tion à diverses longueurs du génome de LAV/HTLV III conte-

nant des séquences de codage de gag. La source des séquences

de codage de LAV/HTLV III gag a été deux sous-clones appa-

rentés de lambda J19 (Wain-Hobson et al, Cell 40: 1985), pKS- et pSS-5. Le plasmide pKS-5 contient un fragment de 3148 paires de base allant de SStI à KpnI (nucléotide n 224 à n 3372) de l'ADN de LAV/HTLV III inséré aux sites

correspondants de pUC18. Le plasmide pSS-5 contient un frag-

ment de 5107 paires de base de SstI à SalI (nucléotide n 224

à 5221) de l'ADN de LAV/HTLV III inséré aux sites correspon-

dants de pUC18. On a inséré diverses longueurs de séquences de codage de gag, provenant de pKS-5 ou de pSS-5, dans le plasmide pGS62, qui est identique à PGS20 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864), sauf qu'il comporte un unique site EcoRI situé en aval de l'unique site SmaI (voir figure ). Les séquences spécifiques de LAV/HTLV III, insérées dans pGS62, commencent toutes avec un site ThaI (FnuDII) situé à 76 paires de base en amont du codon d'amorçage du gène gag. Les plasmides pv-gagl, pv- gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 contiennent des séquences spécifiques de LAV/HTLV III allant de ce site ThaI jusqu'aux sites EcoRI (à 4194), KpnI (à 3372), EcoRv (à 2523), BclI (à 1975) ou BglII (à

1642), respectivement. La description de la construction

de chaque plasmide, effectuée ci-après, est facilitée quand

on se réfère à la figure 20.

Construction de pv-gagl: on a fait digérer jusqu'a achèvement 5 ug de l'ADN de plasmide pSS-5 par des enzymes de restriction ThaI EcoRI. Les fragments résultants ont été

résolus sur un gel à 1 % de gélose LMP. On a isolé un frag-

ment de 3,9 kbp, contenant les séquences de codage de LAV/ HTLV III gag et on l'a fixé par ligation sur de l'ADN de

pGS62 précédemment soumis à digestion avec SmaI et EcoRI.

On a utilisé le mélange de ligation pour transformer E. coli HB101 et l'on a choisi des clones capables de résister à

l'ampicilline. On a soumis des plasmides provenant de colo-

nies individuelles à des essais pour déterminer la présence

du fragment inséré de 3,9 kilopaires de base (kbp), par ana-

lyse de restriction et par la régénération du site EcoRI

à la jonction de ligation. La construction résultante con-

tient la totalité de la séquence de codage des gènes gag

et de protéase (prt), et une majeure partie du cadre de lec-

ture ouverte pol, jusqu'au site EcoRI au nucléotide 4194.

Construction de pv-gag2: on a fait digérer 5,ug du plasmide pKS-5, jusqu'à achèvement, avec des enzymes de restriction ThaI et SmaI. Le site SmaI de pKS-5 est situé près du site KpnI, qui est la jonction entre la séquence insérée en provenance de LAV/HTLV III et les sites de clonage

multiples du plasmide pUC18. On a résolu les fragments résul-

tants sur un gel à 1 % de gélose LMP, et l'on a isolé un fragment de 3,2 kbp contenant des séquences correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a effectué la ligation sur de l'ADN de pGS 62, soumis au préalable à digestion par SmaI et traité par CIAP. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer E. coli HB101 et l'on a choisi des clones capables

de résister à l'ampicilline. On a soumis des plasmides, pro-

venant de colonies individuelles, à des essais de présence du fragment comportant 3,1 kilopaires de bases, et l'on a déterminé par analyse par restriction l'orientation de l'insertion. La construction résultante pvgag2, contient la totalité du gène gag, le gène prt et une partie du cadre

de lecture ouvert pol jusqu'au site KpnI au nucléotide 3372.

La construction de pv-gag3 a été semblable à celle de pv-gag2, sauf que l'on a utilisé un fragment de 2,3 kbp, engendré par des digestions par ThaI et EcoRV de pKS-5, pour l'insertion au site SmaI de pGS62. La construction finale, pv-gag3, contient la totalité des gènes gag et prt et une petite partie de pol fusionnée sur la- partie 3' du gène TK

de virus de vaccine.

Construction de pv-gag4: on a soumis à digestion, jusqu'à achèvement, par SStI et BclI 5 ug de ADN de plasmide pSS-5. On a purifié le fragment résultant, contenant la séquence correspondant à LAV/HTLV III gag. On a relié par ligation ce fragment à un plasmide vecteur pIC19R (Marsh et al., 1984, gène 32:481-485) préalablement découpé avec

SstI et BamHI pour construire un plasmide intermédiaire.

L'insertion de la séquence gag au site BamHI de pIC19R abou-

tit la juxtaposition du site BclI dans la séquence LAV/HTLV III sur le site EcoRI dans ce vecteur de clonage à sites multiples. La digestion de cette construction intermédiaire par les enzymes de restriction ThaI et EcoRI a engendré un

fragment de 1,72 kilopaires debases (kbp) que l'on a pu faci-

lement insérer dans le plasmide pGS62 aux sites SmaI et EcoRI.

La construction finale, pv-gag4, contient la totalité du gène LAV/HTLV III gag et une partie du gène prt fusionnée

sur la partie 3' du gène TK de virus de vaccine.

La construction du plasmide pv-gag5 a utilisé la même stratégie en deux étapes que pour pv-gag4. On a fait digérer 5 ug de pSS-5 avec des enzymes de restriction SstI et BglII. On a isolé un fragment de 1,42 kbp, contenant la séquence correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a purifié ce fragment sur un gel à 1% de gélose LMP et on l'a inséré dans le plasmide pIC19R aux sites SstI et BglII. Une ligation de la séquence gag au site BglII sur son site correspondant dans pIC19R permet (a) la formation d'un codon d'arrêt en

phase avec le cadre de lecture ouverte gag, et (b) ia juxta-

position du site BglII sur le site adjacent EcoRI sur le plasmide à sites multiples de clonage. Cette construction intermédiaire a été ensuite soumise à digestion avec ThaI et EcoRI. On a purifié un fragment, de 1,39 kilopaires de bases contenant les séquences correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a fixé pat ligation ce fragment,aux sites SmaI et EcoRI, sur le plasmide pGS62. Le plasmide résultant, pv-gagS, contient la plupart, mais non pas la totalité, de la séquence de codage de gag (jusqu'au site BglII) fixd par ligation sur une séquence d'arrêt de translation dans le

cadre.

Construction des virus de vaccine recombinants contenant des gènes chimères LAV/HTLV III gag L'insertion de gènes chimères LAV/HTLV III gag provenant de plasmides vecteurs pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pvgag5, dans le génome du virus de vaccine, a été réalisée par le même protocole que celui utilisé pour la construction de v-env5 et v-env2 (voir ci-dessus). Dans les exemples qui suivent, tous les virus recombinants ont été construits a l'aide de la souche, purifiée par plaques, provenant du "New York City Board of Health" (service de

la santé de la ville de New York) (v-NY, voir ci-dessus).

On a choisi des recombinants TK et on les a purifiés sur plaque trois fois avant d'effectuer l'expansion en des stocks de virus que l'on a utilisés pour des caractérisations subséquentes. Les virus recombinants provenant de pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 ont été appelés v-gaglNY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY et v-gag5NY, respectivement. Expression de protéines apparentées à LAV/HTLV III GAG dans des cellules de culture sur tissu infectées par des virus de vaccine recombinants les virus de vaccine recombinants, porteurs du gène chimère LAV/HTLV III gag, décrits ci-dessus, sont capables d'exprimer des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag, quand on les introduit par infection dans des cellules de

culture de tissu. Certains de ces recombinants ont été capa-

bles de faire passer la protéine correspondant à gag précur-

seur, p55, à l'état des protéines matures p25 et pl8. On a constaté que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum de patients atteints de SIDA et/ou avec des anticorps

monoclonaux contre des protéines gag p25 ou p18.

On a infecté, à un taux d'infection de 10, des cel-

lules BSC-40 confluents, dans une boîte de 60 mm, par du virus de vaccine de type parental (v-NY) ou par ses dérivés recombinants, v-gaglNY, vgag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY ou v-gag5NY. On a laissé l'infection se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récolté les cellules, on les a lavées une fois avec de la solution saline tamponnée

par des phosphates et on les a collectées par centrifugation.

On a remis les culots de centrifugation de cellules infec-

tées en suspension dans 0,3 ml d'un tampon pour échantillons

de Laemmli et l'on a effectué la lyse par 4 minutes d'ébulli-

tion. On a résolu la totalité de la protéine cellulaire dans ,ul de lysat de cellules par électrophorèse sur un gel à 15 % de polyacrylamide-SDS. On a inclus, à titre de-témoins, un échantillon de virion purifié LAV/HTLV III et une partie aliquote d'un lysat de cellules infectées par des éléments

non infectieux ("mock").

On a transféré par électrophorèse le contenu du gel sur une feuille d'un filtre en nitrocellulose. On a tout d'abord fait réagir le filtre avec du sérum de patients

atteints de SIDA, ou avec une combinaison d'anticorps mono-

clonaux contre les protéines gag p25 et pl8. Après des lavages poussés, on a ensuite fait réagir le filtre avec des anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre con- jugués sur de la phosphatase alcaline (à conjugaison AP) dans les cas o l'on a utilisé du sérum de patient, ou avec

des anticorps d'immunoglobuline anti-souris de chèvre à con-

jugaison AP, dans les cas o l'on a utilisé des anticorps monoclonaux de souris. Les conditions pour les premières et secondes réactions avec les anticorps ainsi que pour les

lavages ont été comme décrit ci-dessus à propos de l'identi-

fication des protéines apparentées dans l'enveloppe de LAV/

HTLV III. Le lavage final après la seconde réaction des anti-

corps a été effectué dans du Tris 0,1M (pH 9,5) avec 0,1M NaCl et 5 mM de MgC12. On a décelé de l'anticorps lié à des antigènes sur le filtre en faisant réagir le filtre avec une solution contenant 0,1M de Tris (pH 9,5) , 0,1M de NaCl, mM de MgC12, 0,33 mg/ml de phosphate de bromo-chloro-indo-

lyle, et 0,17 mg/ml deibleu de nitrotétrazolium. Après réac-

tion des filtres avec les chromogènes, on a lavé les filtres

à l'eau, on les a séchés à l'air et photographiés.

Les résultats de cette analyse sont présentés sur

la figure 21. Les recombinants v-gagiNY et v-gag2NY contien-

nent la totalité des gènes gag et prt. Ces recombinants expriment une famille de protéines apparentées à LAV/HTLV III qui ont co-migré avec les protéines majeures gag de LAV/

HTLV III, p55, p40, p25 et pl8. Ces protéines ont été immuno-

réactives aussi bien avec du sérum de patients atteints de SIDA (figure 21B) qu'avec des anticorps monoclonaux de souris contre p25 et p18 (figure 21A). Le recombinant v-gag3NY contient les gènes gag et prt, mais son cadre de lecture ouverte pol est relié par ligation en phase avec la partie terminale carboxy du gène TK de vaccine. V-gag3NY a été capable aussi d'exprimer le produit primaire de gène gag, p55. Cependant, le traitement de p55 semble avoir été moins efficace que dans le cas de vgaglNY et v-gag2NY, puisqu'il y a eu beaucoup moins de p25 et de pl8, par rapport A p55,

dans des lysats de cellules infectés par v-gag3NY. Le recom-

binant v-gag4NY contient la totalité du gène gag, mais seule-

ment une partie du gène prt. Il a synthétisé une protéine apparentée à LAV/HTLV III semblable en dimensions à p55. Le recombinant v-gag5NY contient une partie seulement du gène gag et a exprimé une protéine tronquée de 43 kD (figure 21C). Bien que v-gag4NY et v-gag5NY ne semblent pas avoir

traité efficacement leurs protéines apparentées à gag pri-

maire, leurs produits ont été immunoréactifs à l'égard d'anticorps monoclonaux contre p25 et p18. En somme, malgré

les différences de capacité de traitement, les cinq recom-

binants ont tous été capables d'exprimer des protéines immu-

noréactives qui contenaient les épitopes majeurs des proté-

ines de noyau de LAV/HTLV III. -

EXEMPLE: RECOMBINANTS D'ENVELOPPE DE BACULOVIRUS

Dans l'exemple suivant, on a construit un plasmide vecteur contenant un gène chimère comprenant les séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III logées en aval par

* rapport aux séquences de commande de transcription de AcNPV. Le gène chimère a contenu le promoteur de polyédrine AcNPV et la séquence

de codage de LAV/HTLV III env a été insérée, par recombinaison in vivo, dans le génome de AcNPV. Le virus recombinant a été identifié et purifié, et l'on a préparé

des stocks de virus à partir de cellules surnageantes infec-

tées. Il a été montré que de la protéine immunoréactive apparentée à LAV/HTLV III env est produite in vitro

par le baculovirus recombinant. Une description détaillée

de chaque étape de cette forme de réalisation de l'invention

est présentée ci-après. Les modes opératoires généraux utili-

sés pour cette forme de réalisation sont tels que décrits

ci-dessus pour les recombinants de baculovirus.

Construction de plasmides vecteurs contenant le promoteur AcNPV relié par ligation aux séquences codantes du gène LAV/HTLV III env On a purifié la séquence codante (ou de codage) du gène LAV/HTLV III env à partir de pvenv5 (voir ci-dessus,

dans la partie concernant la construction et la caractérisa-

tion du virus de vaccine recombinant contenant le gène chimère d'enveloppe de LAV/HTLV III), que l'on a utilisé pour la construction du virus de vaccine recombinant v-env5, dont on a montré qu'il exprime des protéines apparentées & env. La région de codage env dans pv-env, ainsi que les séquences non translatées de 96 paires de bases voisines de 5' et de 223 paires de bases voisines de 3', a été entourée

aux deux extrémités par des sites BamHI. Une digestion par-

tielle de ce plasmide, qui a également contenu un site interne BamHI) à l'aide de l'enzyme de restriction BamHI a engendré un fragment de 2,9 kbp ne contenant que des

séquences spécifiques de LAV/HTLV III. On a résolu ce frag-

ment (environ 0,5 ug) et on l'a purifié à- partir d'un gel à 1 % de gélose LMP, et on en a effectué la ligation sur 0,5,ug du plasmide vecteur pAc610, qui avait été au préalable linéarisé à l'aide de BamHI et traité par CIAP. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche MC1000

de E coli et l'on a choisi les colonies résistantes à 1'am-

picilline. On a soumisil'ADN de plasmide de transformants individuels à des essais de détermination de la présence

des séquences correspondant à LAV/HTLV III env (c'est-à-

dire la formation, par digestion par BamHI, des fragments de 2,3 Kbp et de 0,54 Kbp) et pour déterminer l'orientation de la partie insérée. Le plasmide comportant la séquence correspondant à LAV/HTLV III env. insérée dans-l'orientation correcte, a été purifié et appelé pAc-env5; Sa structure

est représentée sur la figure 22.

Construction du baculovirus recombinant contenant le gène chimère LAV/HTLV III env On réalise l'insertion du gène chimère':LAV/HTLV III env dans le génome de AcNPV par recombinaison in:.vivo, comme expliqué ci- dessus (construction du baculovirus-recombinant contenant le gène chimère LAV/HTLV III gag). L'introduction

par transfection de 1 mg d'ADN de AcNPV, 5 mg d'ADN de pAc-

env5 et 15 mg d'ADN de thymus de veau dans les cellules Sf9 a été réalisée comme décrit dans les mêmes paragraphes précités. Apres 5 jours d'incubation à 28 C avec 4 mi de milieu complet, on a collecté les parties surnageantes et on les a clarifiées par centrifugation & 1000 g durant minutes. On a titré le stock de virus sur les cellules Sf9, et l'on a d'abord identifié, par l'essai d'hybridation de plaque de M.D. Summers et G.E. Smith, comme suit, le virus recombinant: On a ensemencé des cellules Sf9 sur des plaques de culture de 60 x 15 mm à une densité de 2,5 x 106 cellules par plaque dans un milieu TNM-FH sans sérum. Apres fixation des cellules, on a enlevé le milieu et l'on a ajouté à chaque plaque 1 ml d'un inoculum-de virus dilué. Au bout d'l heure d'incubation a 27 C, on a enlevé la totalité de l'inoculum de chaque-piaque etai'on a lentement ajouté au bord de chaque plaque 4 ml d'une couche supérieure de gélose LMP. Une fois la couche supérieure solidifiée, on a fait incuber les plaques dans un environnement humide durant 4 A 6 jours,

ou jusqu'à bonne formation des colonies ou plaques de cellu-

les. On a ensuite laissé sécher les plaques de gélose durant

la nuit ou plus longtemps, en les abandonnant dans un envi-

ronnement non humidifié. Quand elles ont été suffisamment sèches, on a enlevé les couches supérieures de gélose et l'on a placé un filtre en nitrocellulose sèche par-dessus

les cellules demeurant dans la plaque de culture. On a satu-

ré avec une solution A (0,05 M de Tris-HCl, pH 7,4 et 0,15M de NaCl) un cercle de 47 mm de papier 3 MM Whatman et l'on a placé ce papier pardessus la filtre en nitrocellulose

dans la plaque de culture. Après absorption, on a soigneuse-

ment enlevé le filtre en nitrocellulose et on l'a placé

(le côté des cellules par-dessus) sur un papier filtre What-

man saturé d'une solution a (0,5N de NaOH, 1,5M de NaCl).

Apres 2 & 3 minutes, on a séché à l'air le filtre en nitro-

cellulose sur des serviettes en papier et on l'a transféré sur un papier filtre Whatman saturé d'une solution C (1,OM de Tris-HCl, pH 7,4; 1,5 M de NaCl). Au bout de 2 à 3 minutes, on a séché à l'air sur des serviettes en papier le filtre en nitrocellulose, et on l'a lavé par immersion ménagée dans une boite de Pétri emplie d'une solution D (0,3M en NaCl, 0, 03 M de citrate de sodium). On a ensuite enlevé le filtre et on l'a séché sur des serviettes en papier, et on l'a chauffé & 80 C durant 2 heures sous vide. On a fixé par hybridation le filtre sur pRS-3 marqué par 32p, comme sonde. On a prélevé des virus recombinants et on les a titrés & nouveau sur des cellules Sf9. On a identifié,

par examen visuel, des plaques de cellules sans occlusion.

On les a purifiées trois fois encore et on les a utilisées

pour préparer des stocks de virus pour des études subsé-

quentes. Expression de protéines apparentées à LAV/HTLV III env dans des cellules de culture tissulaire infectées Dar du baculovirus recombinant Ac-env5 Il a été montré que AcNPV recombinant, portant le gène chimère LAV/HTLV III env, est capable d'exprimer les protéines apparentées à LAV/HTLV III env, par infection de cellules dans une culture sur tissu. On a trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum provenant de

patients atteints de SIDA ainsi qu'avec des anticorps mono-

clonaux qui définissent des glycoprotéines gpllO et gp41

apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III.

On a infecté des cellules Sf9 (1 x 107) ensemencées sur une boîte de 100 mm, avec AcNPV de type sauvage, ou son recombinant Ac-env5, à un indice d'infection de 5. 28 heures après l'infection, on a remplacé le milieu par du milieu sans méthionine ne comportant pas de sérums supplémentaires, et l'on a fait incuber durant 30 minutes. Après cette période, on a remplacé le milieu par 2 ml d'un milieu sans méthionine contenant 100 uCi/ml de E35SI méthionine, et on a laissé le marquage se poursuivre durant 2 heures à 28 C. A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée par du phosphate et on les a remises en suspension dans 1 ml de tampon de lyse, comme décrit ci-dessus à propos de l'identification de

protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, expri-

mées dans des cellules infectées par du virus de vaccine

recombinant, an utilisant des techniques d'nimmunoprécipitation).

On a effectué l'immunoprécipitation comme décrit dans les paragraphes précités, en utilisant du sérum de patients atteints de SIDA aussi bien que des anticorps monoclonaux de souris contre gpllO ou gp41. Les résultats de cette analyse, tels que présentés sur la figure 23, indiquent que le virus recombinant Ac-env5 a synthétisé surtout une protéine de 150 kD, apparentée & l'enveloppe de LAV/HTLV III. Puisqu'elle comigre avec gp150 synthétisée par le recombinant de vaccine v-env5 et qu'elle a été immunoréactive avec du sérum de patient atteint de SIDA ainsi qu'avec des anticorps monoclonaux contre gpllO et gp41, cette protéine représente le précurseur glycosylé

de la protéine d'enveloppe gp150. Le traitement de trans-

formation de cette molécule n'a pas été efficace, puisque l'on n'a pas décelé de gpllO ni gp41 au cours de la période des 2 heures de marquage. Cependant, puisque les épitopes majeurs de gpllO et gp41 sont présents sur le précurseur, cette protéine est potentiellement intéressante aussi bien

comme réactif pour diagnostic que comme immunogène.

DEPOT DE MICRO-ORGANISMES

Les souches suivants de E. coli, portant les plas-

mides énumérés, ont été déposées au service appelé "Agricul-

tural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (Etats-Unis d'Amérique) et ont reçu les numéros suivants d'inscription: E. coli Souche Plasmide Numéro d'inscription K12 MC1000 pv-envl NRRL B-18003 K12 MC1000 pv-env2 NRRL B-18004 K12 MC1000 pv-env5 NRRL B-18005 K12 MC1000 pv- env7 NRRL B-18110 K12 HB101 pv-gagl NRRL B-18111 K12 HB101 pAc-gagl NRRL B-18105 K12 NF1829 pAc-env5 NRRL B-18109 Les virus recombinants suivants ont été déposés

t'-American --T-ype- Culture Collection, Rockville, MD, Etats-

Unis d'Amérique, et ont reçu les numéros suivants de dépôt Virus recombinant Numéro de dépôt v-env2 ATCC VR 2114 v-env5 ATCC VR 2213 venv7 ATCC VR 2148 v-env5NY ATCC VR 2149 v-gaglNY ATCC VR 2150 Ac-gagl ATCC VR 2147 Ac-env5 ATCC VR 2151

On ne doit pas considérer que le cadre de la pré-

sente invention sa limite seulement aux micro-organismes et virus déposés, puisque ce qui est déposé constitue une simple illustration d'un aspect de l'invention et que tous les micro-organismes ou virus fonctionnellement équivalents entrent dans le cadre de la présente invention. I1 va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux virus recombinants, à leurs génomes chimères et protéines ou peptides et aux

formulations de vaccins, décrits et représentés.

Il va également de soi que toutes les dimensions données pour les paires de bases des nucleotides constituent des renseignements approximatifs fournis à titre surtout descriptif.

253 7720

Claims (37)

REVENDICATIONS

1. Virus recombinant, selon l'une quelconque des reven-

dications 1, 2, 4 et 6 du brevet principal, dont le génome comprend une séquence de nucléotides codant pour un épitopé de virus associé à l'adénopathie (LAV)/virus de leucémie de

cellules ou lymphocytes T-humains (HTLV-III). ou d'une por-

tion antigénique de cette séquence de nucléotides qui régule

l'expression du gène de manière qu'un peptide, ou une proté-

ine apparenté(e) à l'épitode de LAV/HTLV III soit exprimé(e)

dans un hôte infecté par le virus, ce virus étant caractéri-

sé en ce que la séquence des nucléotides codant l'épitode de LAV/HTLV III comprend la séquence du gène gag de LAV/HTLV III ou n'importe quelle partie de ce gène codant pour un peptide

antigénique ou une protéine antigénique.

2. Virus recombinant selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que la séquence des nucléotides de gène gag comprend la séquence des nucléotides sensiblement comme représenté sur la figure 14 à partir du nucléotide n 340 au numéro 1835, ou n'importe quelle partie de cette séquence codant pour un peptide antigènique ou une protéine antigénique.

3. Virus recombinant selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que le peptide ou la protéine exprimé(e) dans l'hô-

te infecté est apparenté(e) à un épitode de protéine de noyau de LAV/HTLV III ou à n'importe quelle partie antigénique de

cet épitode.

4. Virus recombinant selon la revendication 3, caracté-

risé en ce que l'épitode comprend un peptide ou une protéine

ayant une séquence d'aminoacides sensiblement comme représen-

té sur la figure 14 à partir du reste d'aminoacides n 1 à

500, ou n'importe quelle partie antigénique de cette séquence.

5. Virus recombinant selon la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'il est le Baculovirus recombinant Ac-gagl, tel que déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et qui

y a reçu le numéro d'entrée VR-2147 ou un mutant, un recombi-

nant ou un dérivé de ce virus obtenu par génie génétique.

6. Séquence v-env 7 de virus de vaccine recombinant se-

lon la revendication 7 du brevet principal, tel que ce virus est déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y

101 '2587720,

l11 a reçu le numéro d'entrée R 2148, ou un mutant, recombinant

ou dérivé de ce virus obtenu par génie génétique.

7. Séquence v-env5NY de virus de vaccine recombinant

tel que ce virus a été déposé à l'American Type Culture Col-

lection (ATCC) et y a reçu le numéro d'entrée VR 2149, ou un mutant, recombinant ou dérivé de ce virus obtenu par génie génétique. 8. Séquence Ac-env5 de baculovirus recombinant, tel que ce virus est déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y a reçu le numéro d'entrée VR 2151, ou un mutant,

recombinant ou dérivé de ce virus obtenu par génie génétique.

9. Séquence v-gaglNY de virus de vaccine recombinant,

tel que ce virus a été déposé à l'American Type Culture Col-

lection (ATCC), et y a reçu le numéro d'entrée VR 2150, ou un mutant, unurecombinant ou un dérivé de ce virus obtenu

par génie génétique.

10. Peptide ou protéine selon les revendications 18

et 22 du brevet principal, ce peptide ou cette protéine ayant été purifié(e) à partir d'une ou plusieurs cellules faisant

partie d'une lignée de cellules animales contenant une séquen-

ce de nucléotides codant pour le peptide ou la protéine qui

est sous la commande d'une seconde séquence de nucléotides ré-

gulant l'expression des gènes. de sorte que le peptide ou la protéine est exprimé(e) par la ou les cellules ainsi cultivées, peptide ou protéine caractérisé(e) en ce qu'il ou elle a été produit(e) par des cellules animales infectées par v-env5 de virus de vaccine recombinant, tel que ce virus a été déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y a reçu le numéro d'entrée VR 2113, ou un mutant, recombinant ou dérivé

de ce virus obtenu par génie génétique. -

11. Peptide ou protéine selon les revendications 18,

et 22 du brevet principa!1caractérisé(e) en ce qu'il ou elle

a été produit(e) par des cellules infectées par v-env2 de vi-

rus de vaccine recombinant, tel que ce virus a été déposé à

l'American Type Culture Collestion (ATCC) et y a reçu le nu-

méro d'entrée R 2114 ou un mutant, recombinant ou dérivé de

ce virus obtenu par génie génétique.

12. Peptide ou protéine selon les revendications 18

et 22 du brevet principal caractérisé(e) en ce qu'il ou elle a été produit(e) par des cellules animales infectées par v-env7 de virus de vaccine recombinant, tel que ce virus a été déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y a reçu le numéro d'entrée VR2148, ou un mutant, un recombinant ou un dérivé de ce virus obtenu par génie génétique.

13. Peptide ou protéine selon les revendications 18

et 22 du brevet principal1caractérisé(e) en ce qu'il ou elle

a été produit(e) par des cellules animales infectées par v-

env5NY de virus de vaccine recombinant, tel que ce virus a été déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y

a reçu le numéro d'entrée VR 2149, ou un mutant, un recombi-

nant ou un dérivé de ce virus obtenu par génie génétique.

i4. ept--de--u pr-ot-ine selon les revendications 18

et 22 du brevet principal,'caractérisé(e) en ce que la cel-

lule cultivée est ou comprend une lignée de cellules d'insec-

tes, et en ce que le peptide ou la protéine a été produit(e)

par des cellules d'insectes infectées par Ac-env5 de baculo-

virus recombinant, tel que ce baculovirus a été déposé à

l'American Type Culture Collection (ATCC) et y a reçu le nu-

méro d'entrée VR 2151, ou un mutant, un recombinant ou dérivé

de ce virus obtenu par génie génétique.

15. Peptide ou protéine selon la revendication 15 du brevet principal, caractérisé en ce que son épitope comprend

un épitope de protéine de noyau de LAV/HTLV III.

16. Peptide ou protéine selon la revendication 15, ca-

ractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'aminoacides com-

prenant la séquence des aminoacides sensiblement tels que re-

présentés sur la figure 14 à partir d'un reste d'aminoacide numéro 1 à 500 ou n'importe quelle partie antigénique de cette

séquence.

17. Peptide ou protéine, selon les revendications 18

et 22 du brevet principal, caractérisée) en ce qu'il ou elle

a été produit(e) par des cellules animales infectées par v-

gaglNY de virus de vaccine recombinant, tel que ce virus a été déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y a reçu le numéro d'entrée VR 2150, ou un mutant, un recombinant

ou un dérivé de ce virus obtenu par génie génétique.

18. Peptide ou protéine selon les revendications 18 et

22 du brevet principal, caractérisé en ce que la cellule cul-

tivée est ou comprend une lignée de cellules d'insectes et en

ce que le peptide ou la protéine a été produit(e) par des cel-

lules d'insectes infectées par Ac-gagl de baculovirus recom-

binant tel que ce baculovirus est déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) et y a reçu le numéro d'entrée VR

2147, ou un mutant, un recombinant ou un dérivé de ce baculo-

virus obtenu par génie génétique.

19. Peptide ou protéine selon l'une des revendications

ou 16, caractérisé(e) en ce que le peptide ou la protéine

a été obtenu(e) par synthèse chimique.

20. Formulation de vaccin à virus vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse de la séquence

de gène v-env7 de virus de vaccine selon la revendication 6.

21. Formulation de vaccin à virus vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse de v-env5NY de

virus de vaccine selon la revendication 7.

22. Formulation de vaccin multivalent à virus vivants, caractérisée en ce qu'elle comprend un virus recombinant selon

l'une quelconque des revendications 2 à 5 du brevet principal

et un virus recombinant selon l'une quelconque des revendications

1 à 11 du présent Certificat d'Addition, les deux virus recom-

binants étant infectieux sans provoquer de maladie pour l'hôte

à vacciner.

23. Vaccin multivalent selon la revendication 22, carae-

térisé en ce que chaque virus recombinant comprend un virus

à enveloppe.

24. Vaccin multivalent à virus vivant selon la revendi-

cation 23, caractérisé en ce que chaque virus à enveloppe est

ou comprend un virus de vaccine.

25. Formulation de vaccin multivalent, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse de: (a) v-env5 du virus de vaccine selon la revendication 8, v-env2 selon la revendication 9, du brevet principal, venv7 selon la revendication 6 du présent Certificat d'addition ou

v-env5NY selon la revendication 7 du présent Certificat d'ad-

dition, et (b) v-gaglNY du virus de vaccine selon la revendication

9 du présent Certificat d'addition.

26. Formulation de vaccin à virus inactive, caractérisée

104 2587720

en ce qu'elle comprend une dose efficace de la séquence v-env7 du virus de vaccine selon la revendication 6, à un état non

infectieux. en mélange avec un excipient pharmaceutiques.

27. Formulation de vaccin à virus inactivé, caractéri-

sée en ce qu'elle comprend une dose efficace de la séquence v-env5NY de virus de vaccine selon la revendication 7, à un

état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceuti.

que.. 28. Formulation de vaccin multivalent à virus inactivés, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de: (a) le virus recombinant selon l'une quelconque des

revendications 2 à 5 du brevet principal, qui exprime l'épi-

tope apparenté à l'enveloppe de LAV/HTLV III; et (b) le virus recombinant selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4 du présent Certificat d'addition, qui

exprime l'épitope, apparenté au noyau de LAV/HTLV III, chaque virus recombinant étant à un état non infectieux, en

mélange avec un excipient pharmaceutiques.

29. Formulation de vaccin multivalent à virus inactivés, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de: (a) v-env5 du virus de vaccine de la revendication 8 du brevet principal, v-env2 de la revendication 9 du brevet principal, v-env7 de la revendication 6 du présent Certificat d'addition, ou v-env5NY de la revendication 7 du présent Certificat d'addition, et (b) v-gaglNY de virus de vaccine de la revendication

9 du présent Certificat d'addition.

30. Formulation de vaccin à sous-unités, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide

ou de la protéine selon l'une quelconque des revendications

à 22 du brevet principal ou 10 È 14 du présent Certificat

d'addition, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

31. Formulation de vaccin multivalent à sous-unités, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de: (a) un premier peptide ou une première protéine selon la revendication 16 ou 17 du brevet principal; et (b) un second peptide ou une seconde protéine selon

l'une quelconque des revendications 19 à 22 du brevet princi-

pal ou 14 à 18 du présent Certificat d'addition en mélange

avec un excipient pharmaceutique.

32. Vecteur de ADN (acide désoxyrobonucléique) recombi-

nant, caractérisé en ce qu'il est ou comprend pv-env7.

33. Vecteur de ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il est ou comprend pv-gag1. 34. Vecteur de ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il

est ou comprend pAc-gagl.

35. Vecteur de ADN recombinant, caractérisée en ce qu'il

est ou comprend pAc-env5.

36. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il con-

tient le vecteur de ADN recombinant de l'une quelconque des

revendications 32 à 35.

37. Bactérie contenant le vecteur de ADN recombinant se-

lon l'une quelconque des revendications 32 à 35

38. Bactérie selon les revendications 37 et 32, caracté-

risé en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRRL et qui a reçu le numéro d'entrée B-18110, ou un mutant,

un recombinant ou un dérivé obtenu par génie génétaique.

39. Bactérie selon les revendications 37 et 33, caracúé-

risée en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRRL et qui a reçu le numéro d'entrée B-18111, ou un mutant, un recombinant ou un dérivé de cette bactérie obtenue par

génie génétique.

40. Bactérie selon les revendications 37 et 34, caracté-

risée en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRRL et qui a reçu le numéro d'entrée B-18105, ou un mutant, un recombinant ou un dérivé de cette bactérie obtenu par génie génétique.

41. Bactérie selon les revendications 37 et 35, caracté-

risée en ce qu'elle est ou comprend Escherichia coli déposée à NRRL et qui a reçu le numéro d'entrée B-18109, ou est un mutant, un recombinant ou un dérivé de cette bactérie obtenu

par génie génétique.