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ES2198400T3 - Vector que codifica particulas virales no autopropagantes, defectuosas, auto-ensambladas. - Google Patents

Vector que codifica particulas virales no autopropagantes, defectuosas, auto-ensambladas.

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ES2198400T3
ES2198400T3 ES90909861T ES90909861T ES2198400T3 ES 2198400 T3 ES2198400 T3 ES 2198400T3 ES 90909861 T ES90909861 T ES 90909861T ES 90909861 T ES90909861 T ES 90909861T ES 2198400 T3 ES2198400 T3 ES 2198400T3
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ES
Spain
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vaccinia
gene
hiv
recombinant
gag
Prior art date
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Expired - Lifetime
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ES90909861T
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English (en)
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Gail P. Mazzara
Brian Roberts
Dennis L. Panicali
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Applied Bio Technology Inc
Original Assignee
Applied Bio Technology Inc
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Publication date
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Application filed by Applied Bio Technology Inc filed Critical Applied Bio Technology Inc
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Abstract

SE HAN DESCUBIERTO LOS VECTORES VIRICOS RECOMBINANTES DE LOS QUE LOS POLIPEPTIDOS HETEROLOGOS COEXPRESAN CAPACIDADES DE ENSAMBLARSE EN PARTICULAS VIRICAS DEFECTIVAS NO-AUTO-PROPAGANTES. LAS PARTICULAS VIRICAS PUEDEN UTILIZARSE COMO INMUNOGENOS Y SER OBJETIVO DE DESCARGAS DE DROGAS.

Description

Vector que codifica partículas virales no autopropagantes, defectuosas, auto-ensambladas.
Antecedentes
La vacunación ha desempeñado un papel clave en el control de las enfermedades virales durante los últimos 30 años. La vacunación está basada en un sencillo principio de inmunidad: una vez expuesto a un agente infeccioso, un animal levanta una defensa inmune que le protege frente a la infección por el mismo agente. El objetivo de la vacunación es inducir al animal a levantar la defensa antes de la infección. Convencionalmente, esto se ha conseguido mediante el uso de formas vivas atenuadas o muertas del virus como inmunógenos. El éxito de estos enfoques en el pasado se ha debido en parte a la presentación del antígeno nativo y a la capacidad de los virus atenuados de desencadenar el intervalo completo de respuestas inmunes obtenido en la infección natural. Sin embargo, las metodologías convencionales de vacuna han estado siempre sujetas a una serie de limitaciones potenciales. Las cepas atenuadas pueden mutar convirtiéndose en más virulentas o no inmunogénicas; las vacunas inadecuadamente inactivadas pueden causar la enfermedad que están diseñadas para prevenir.
La tecnología de ADN recombinante ofrece el potencial de eliminar algunas de las limitaciones de las vacunas convencionales, al hacer posible el desarrollo de vacunas basadas en el uso de antígenos definidos, en lugar de en el agente infeccioso intacto, como inmunógenos. Éstas incluyen vacunas de péptidos, constituidas por epítopos inmunorreactivos sintetizados químicamente; vacunas de subunidades, producidas mediante la expresión de proteínas virales en células heterólogas recombinantes; y el uso de vectores virales vivos para la presentación de uno o una serie de antígenos definidos.
Tanto las vacunas de péptidos como de subunidades están sujetas a una serie de limitaciones potenciales. Un problema importante es la dificultad de asegurar que la conformación de las proteínas modificadas por ingeniería genética imita la de los antígenos en su entorno natural. Deben utilizarse coadyuvantes adecuados y, en el caso de péptidos, proteínas vehículo, para reforzar la respuesta inmune. Además, estas vacunas desencadenan principalmente respuestas humorales, y por tanto pueden no conseguir provocar una inmunidad eficaz.
Algunos de los problemas asociados al uso de vacunas de péptidos y de subunidades pueden superarse mediante el uso de vectores virales vivos para presentar antígenos heterólogos. Se han desarrollado una serie de vectores virales, incluyendo retro-, adeno-, herpes- y poxvirus (Cepko et al., 1984, Cell 37: 1053-1062; Morin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630; Lowe et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3896-3900; Panicali & Paoletti, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931; Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419); se ha concentrado el esfuerzo mayor en el desarrollo de virus Vaccinia, un ortopoxvirus, como vector de clonación eucariótico infeccioso con este fin (Paoletti y Panicali, patente de EE.UU. nº 4.603.112). Se han expresado genes heterólogos, incluyendo aquellos que codifican antígenos de una variedad de patógenos, en el sistema de vector Vaccinia. En todos los casos, el producto del gen extraño expresado por el virus Vaccinia recombinante fue similar o idéntico al producto génico sintetizado en condiciones nativas. En algunos casos, la vacunación de animales de laboratorio con virus Vaccinia recombinantes ha protegido a estos animales frente a la exposición a los patógenos correlacionados (Paoletti et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 193-197; Kieny et al., 1984, Nature 312: 163-166; Alizon et al., 1984, Nature 312: 757-760; Boyle et al., 1985, Gene 35: 169-177; Yilma et al., 1988, Science 242: 1058-1061).
Los enfoques recombinantes se han utilizado en intentos de desarrollar vacunas frente a enfermedades para las que no existe actualmente ninguna vacuna, o para las que los enfoques de vacuna convencionales son menos deseables. Por ejemplo, desde que el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se identificó por primera vez como el agente etiológico del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), (Barre-Sinoussi et al., 1983, Science 220: 868; Levey et al., 1984, Science 225: 840; Gallo et al., 1984, Science 224: 500), se ha dirigido un esfuerzo considerable hacia el desarrollo de una vacuna segura y eficaz. Estos esfuerzos se han basado en una amplio espectro de estrategias, en el intervalo del uso de péptidos sintéticos pequeños al virus entero inactivado como inmunógeno.
La emergencia de la pandemia del SIDA puede representar la amenaza para la salud pública más grave del siglo XX. Desde el reconocimiento del SIDA en 1981, la extensa investigación ha dado como resultado sustanciales avances en la comprensión de la enfermedad. El virus causante, (VIH), se ha identificado y se ha mostrado que las rutas principales de transmisión son el contacto sexual y el intercambio de productos sanguíneos (Curran et al., 1985, Science 229: 1352). Se han determinado las secuencias nucleotídicas de los genomas de muchos aislamientos de VIH, y la biología molecular del virus está bajo intensa investigación. Sin embargo, queda mucho trabajo por realizar en la elucidación de la replicación viral en individuos infectados y su papel en la patogénesis de la enfermedad.
Los virus de la inmunodeficiencia humana, VIH-1 y VIH-2, son miembros de la subclase lentivirus de los retrovirus (Gonda et al., 1985, Science 227: 173; Sonigo et al., 1985, Cell 42: 369). También en esta subclase están los virus de inmunodeficiencia de simio relacionados (VIS; Daniel et al., 1985, Science 228: 1201). Los virus de la inmunodeficiencia humana y de simio comparten una morfología similar. Las partículas virales contienen un núcleo interno que comprende proteínas de cápsida (codificadas por el gen viral gag) que encierran el genoma de ARN viral (Rabson & Martin, 1985, Cell 40: 477). El núcleo central está rodeado por una cubierta lipídica que contiene las glucoproteínas de cubierta codificadas viralmente. Las enzimas codificadas por el virus necesarias para la replicación eficaz, tales como la transcriptasa inversa y la integrasa (codificadas por el gen pol), están también incorporadas a la partícula viral.
El análisis de las secuencias nucleotídicas de los genomas de VIH y VIS ha mostrado que estos virus comparten también una organización del genoma distintiva (Figura 1), así como una considerable homología de secuencia del ADN (Chakrabarti et al., 1987, Nature 328: 543; Franchini et al., 1987, Nature 328: 539). El genoma de aproximadamente 10 kb comprende las secuencias de repetición terminal larga (LTR) flanqueantes que contienen segmentos reguladores para la replicación viral, así como los genes gag, pol y env que codifican las proteínas del núcleo, la proteasa-endonucleasa transcriptasa inversa y las glucoproteínas de cubierta, respectivamente. Estos virus contienen también al menos seis genes adicionales, algunos de los cuales tienen funciones reguladoras conocidas.
Finalmente, los virus de la inmunodeficiencia humana y de simio comparten propiedades biológicas comunes, incluyendo el efecto citopático, el tropismo por las células que llevan CD4 y, lo más importante, la capacidad de inducir infección persistente a largo plazo y enfermedad de inmunodeficiencia crónica en seres humanos (VIH-1 y VIH-2) o primates no humanos (VIS). Las similitudes entre VIH y VIS ha conducido al desarrollo de la infección por VIS de monos macacos Rhesus como sistema modelo para el estudio de la patogénesis y la prevención de la enfermedad de la inmunodeficiencia.
Existen dificultades obvias con el uso de virus enteros para una vacuna de VIH. El miedo de que un virus atenuado pudiera revertir a la virulencia, y el peligro de una inactivación incompleta de las preparaciones de virus muertos, junto con la reluctancia a introducir el genoma de VIH en individuos seronegativos, se han argumentado contra los usos de vacunas de VIH vivos atenuados o muertos para la prevención de la infección.
Las vacunas del SIDA actualmente en consideración cubren el intervalo de posibles enfoques recombinantes; muchas, no todas, se basan en el uso de toda o parte de la glucoproteína de cubierta como inmunógeno. Sin embargo, muchas de las vacunas recombinantes ensayadas hasta la fecha han proporcionado resultados decepcionantes. Por ejemplo, cuando se utilizó una vacuna de subunidades constituida por la glucoproteína de cubierta gp120 para inmunizar chimpancés, se desencadenaron respuestas inmunes humorales específicas ante el VIH capaces de neutralizar el virus in vitro; sin embargo, la inmunización no consiguió proteger a los animales de infección por VIH (Berman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200-5204). El uso de virus Vaccinia vivos recombinantes que expresan las glucoproteínas de cubierta de VIH como vacuna para la prevención de la infección por VIH en chimpancés ha sido también un fracaso. La infección de células sensibles con estos recombinantes da como resultado la síntesis, la glucosilación, el procesamiento y el transporte de membrana normales del polipéptido de cubierta (Chakrabarti et al., 1986, Nature 320: 535; Hu et al., 1986, Nature 320: 537). El producto génico puede reconocerse por anticuerpos séricos de pacientes con SIDA, y se ha mostrado que media la formación de sincitios con células que expresan el epítopo de superficie celular CD4 (Lifson et al., 1986, Nature 323: 725). La vacunación de varias especies con estos recombinantes ha desencadenado respuestas inmunes humorales específicas de cepa así como respuestas mediadas por células (Hu et al., 1986, Nature 320: 537; Chakrabarti et al., 1986, Nature 320: 535; Kieny et al., 1986, Biotechnology 4: 790; Zarling et al., 1986, Nature 323: 344; Hu et al., 1987, Nature 328: 721; Zagury et al., 1987, Nature 326: 249; Zagury et al., 1988, Nature 322: 728). Sin embargo, a pesar de estas respuestas inmunes, estas vacunas no consiguieron proteger a chimpancés de la infección por VIH (Hu et al., 1987, Nature 328: 721). La incapacidad de estas vacunas iniciales basadas en Vaccinia puede ser atribuida a una serie de factores. La inmunogenicidad de los recombinantes Vaccinia puede no haber sido óptima; de hecho, los recombinantes desencadenaron bajas titulaciones de anticuerpos en chimpancés. Ciertamente, el hecho de que estas vacunas induzcan la expresión de sólo un polipéptido de VIH-1 único sugiere que pueden no tener el potencial máximo para estimular las respuestas inmunes protectoras de chimpancés. Además, el uso de chimpancés para evaluar las vacunas del SIDA es en sí mismo cuestionable, ya que los chimpancés, aunque pueden infectarse con el VIH, no desarrollan el SIDA (Alter et al., 1984, Science 226: 549; Fultz et al., 1986, J. Virol. 58: 116).
La desventaja potencial de cualquiera de los enfoques recombinantes para el desarrollo de una vacuna del SIDA es que se han basado en el uso de un solo antígeno de VIH, lo más habitualmente en la glucoproteína de cubierta, como inmunógeno. El éxito en el pasado de enfoques de vacuna tradicionales para otras enfermedades (tales como poliomelitis, sarampión, paperas y rabia), que están basadas en el uso de virus enteros, vivos atenuados o muertos como inmunógenos, sugiere que la presentación del antígeno es de importancia capital en el desencadenamiento de las respuestas inmunes protectoras.
Los avances en la tecnología de ADN recombinante pueden hacer posible utilizar sistemas de expresión heteróloga para la síntesis no sólo de antígenos individuales, sino también de partículas de tipo virus defectuosas no autopropagantes. Se ha demostrado que las proteínas de cápsida de ciertos virus pueden ensamblarse en partículas morfológica e inmunológicamente similares a los correspondientes virus. Por ejemplo, el precursor P1 de varios picornavirus sintetizado in vitro puede procesarse en proteínas individuales de cápsida que se ensamblan después en partículas de tipo virión inmunorreactivas (Nicklin et al., 1986, Biotechnology 4: 33; Palmenberg et al., 1979, J. Virol. 32: 770: Shih et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5807; Hanecak et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3973; Grubman et al., 1985, J. Virol. 56: 120). Se ha reseñado también el autoensamblaje de las proteínas de cápsida expresadas in vivo en diversos sistemas de expresión recombinante. Por ejemplo, cuando el antígeno de superficie de la hepatitis B humana se expresa en células de levadura, el polipéptido se ensambla en partículas similares en apariencia a las aisladas de plasma humano (Valenzuela et al., 1982, Nature 298: 347); estas partículas estimulan la producción de anticuerpo anti-hepatitis B en diversas especies y pueden proteger a chimpancés de la exposición a virus (McAleer et al., 1984, Nature 307: 178). En otro ejemplo, se mostró que la coexpresión de las proteínas de cápsida VP1 y VP2 de parvovirus canino (CPV) en células de múrido transformadas con un plásmido recombinante de papilomavirus bovino/CPV daba como resultado la formación de partículas de tipo virus autoensamblables (Mazzara et al., 1986, en ``Modern Approaches to Vaccines'', Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; R.M. Chanock y R.A. Lerner, Eds., pág. 419-424; Mazzara et al. solicitud de patente de EE.UU. nº 905.299, presentada el 8 de septiembre de 1986); y que cuando se utilizaban para vacunar perros sensibles, estas cápsidas vacías desencadenaban respuestas inmunes capaces de proteger frente a la exposición a CPV. Finalmente, se ha mostrado que el polipéptido precursor p55gag de VIH-1 expresado en células de Spodoptera frugiperda utilizando un vector de expresión de baculovirus se ensambla en partículas de tipo virus que se secretan en el medio de cultivo celular (Gheysen et al., 1988, ``Modern Approaches to New Vaccines'', Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 14-18 de septiembre, resumen nº 72).
Sumario de la invención
Esta invención está relacionada con vectores virales recombinantes capaces de expresar polipéptidos de cubierta de VIS o VIH y gag de VIS o VIH capaces de autoensamblaje, in vivo o in vitro, en partículas virales defectuosas no autopropagantes, y a métodos de producción del virus recombinante. Esta invención está relacionada también con vectores de ADN intermedios que se recombinan con un virus progenitor in vivo o in vitro produciendo un vector viral recombinante, y a métodos de vacunación de un hospedador con el vector viral recombinante para desencadenar inmunidad protectora frente al virus patogénico heterólogo correlacionado.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la organización genómica similar del virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
La Figura 2 muestra la construcción de pAbT4592, un vector plasmídico para la inserción y la expresión de gag y proteasa de SIVmac251 en virus Vaccinia. El pAbT4592 contiene el gen gag-prot bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de los recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
La Figura 3 muestra la construcción de pAbT4593, un vector plasmídico para la inserción y la expresión de env de SIVmac251 en virus Vaccinia. El pAbT4593 contiene el gen env bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
La Figura 4 muestra la construcción de pAbT4597, un vector plasmídico para la inserción y expresión de env y gag-prot de SIVmac251 en virus Vaccinia. El pAbT4573 contiene el gen gag-prot bajo el control del promotor 30K de Vaccinia y el gen env bajo el control del promotor 40K de Vaccinia. Estos genes están flanqueados por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
La Figura 5 muestra la construcción de pAbT164, un vector plasmídico para la inserción y la expresión de gag de VIH-1 en Vaccinia. El pAbT164 contiene el gen gag de VIH bajo el control del promotor 7,5K de Vaccinia, las regiones de ADN que flanquean el gen TK de Vaccinia para dirigir la recombinación en Vaccinia, el gen lacZ bajo el control del promotor BamF de Vaccinia para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
La Figura 6 muestra la construcción de pAbT4603, un vector plasmídico para la inserción y la expresión del gen env de VIH-1 bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
La Figura 7 muestra la construcción de pAbT621, un vector plasmídico para la inserción y la expresión de env y gag-prot de VIH-1 en Vaccinia. El pAbT621 contiene el gen env de VIH bajo el control del promotor 40K de Vaccinia y el gen gag-prot bajo el control del promotor 30K de Vaccinia. Estos genes están flanqueados por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
Descripción detallada de la invención 1. Genes que codifican antígenos virales
Los genes que codifican los polipéptidos virales gag y env de VIS o VIH capaces de autoensamblaje en partículas virales defectuosas no autopropagantes pueden obtenerse del ADN genómico de un virus de ARN o de clones subgenómicos asequibles que contienen los genes.
La estructura genómica de los picornavirus ha sido bien caracterizada, y los patrones de síntesis de proteína que conducen al ensamblaje del virión son claros (Rueckert, R., en Virology (1985), B.N. Fields et al., Eds. Raven Press, Nueva York, pág. 705-738). En picornavirus, las proteínas de cápsida viral se codifican por un genoma de ARN que contiene un único marco de lectura largo, y se sintetizan como parte de una poliproteína, que se procesa proporcionando las proteínas maduras de cápsida mediante una combinación de proteasas celulares y virales. Por tanto, los genes de picornavirus necesarios para el autoensamblado de la cápsida incluyen tanto los genes estructurales de cápsida como las proteasas virales necesarias para su maduración.
Las estructuras genómicas de estos virus han sido bien caracterizadas, y se representan en forma de diagrama en la Figura 1. La organización génica de los dos virus es notablemente similar, y están presentes en VIS homólogos de cada uno de los genes estructurales de VIH.
Los genes gag de VIH y VIS codifican las proteínas de cápsida. Como las proteínas de cápsida de picornavirus, las proteínas gag de VIH y VIS se sintetizan en forma de un polipéptido precursor que se procesa posteriormente, mediante una proteasa viral, a los polipéptidos de cápsida maduros. Sin embargo, el polipéptido precursor de gag puede autoensamblarse en partículas de tipo virus en ausencia de procesamiento de proteínas (Gheysen et al., 1988, ``Modern Approaches to New Vaccines'', Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 14-18 de septiembre, resumen nº 72). Al contrario que las cápsidas de picornavirus, las cápsidas de VIH y VIS están rodeadas por una cubierta membranosa suelta que contiene las glucoproteínas virales. Éstas están codificadas por el gen env viral.
La presente invención demuestra el uso de genes de VIS y VIH seleccionados para expresión en virus recombinantes de esta invención. Estos genes y sus productos proteínicos se describen en la Tabla 1. Los tres componentes mayoritarios del virión derivados de los genes env, gag y pol se sintetizan en forma de poliproteínas precursoras que se escinden posteriormente, formando polipéptidos maduros como se describe en la Tabla 1.
TABLA 1 Genes VIS y VIH para recombinación en poxvirus
Gen Producto génico^{a} Péptidos procesados
env gp160 gp120 Proteína de membrana extracelular
gp41 Proteína transmembrana
gag p55 p24
p17 Proteínas de cápsida
p15
pol p160^{b} p10 Proteasa
p66/p51 Transcriptasa inversa
p31 Endonucleasa
a. Los tamaños dados son para proteínas de VIH; el tamaño de los polipéptidos de VIS pueden ser ligeramente diferente
b. Parte del producto gag-pol
2. Virus progenitores
Se han desarrollado una serie de virus, incluyendo retrovirus, adenovirus, herpesvirus y poxvirus, como vectores virales vivos para la expresión de antígenos heterólogos (Cepko et al., 1984, Cell 37: 1053-1062; Morin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630; Lowe et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3896-3900; Panicali & Paoletti, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931; Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419). Los ejemplos dados ilustran el uso de la familia de poxvirus. El poxvirus preferido es el virus Vaccinia, un virus relativamente benigno que se ha utilizado durante años como vacuna contra la viruela. El virus Vaccinia se ha desarrollado como un vector de clonación eucariótica infecciosa (Paoletti y Panicali, patente de Estados Unidos nº 4.603.112) y se ha utilizado virus Vaccinia recombinante con éxito como vacuna en diversos sistemas experimentales. El virus se considera no oncogénico, tiene un genoma bien caracterizado y puede llevar grandes cantidades de ADN extraño sin pérdida de infectividad (Mackett, M. y G.L. Smith, 1986, J. Gen. Virol. 67: 2067).
3. Vectores de ADN para recombinación in vivo con un virus progenitor
Según el método de esta invención, los genes virales que codifican polipéptidos capaces de ensamblarse en partículas virales se insertan en el genoma de un virus progenitor de tal manera que les permita expresarse por ese virus junto con la expresión del complemento normal de las proteínas del virus progenitor. Esto puede conseguirse construyendo en primer lugar un vector donante de ADN para recombinación in vivo con un virus progenitor.
En general, el vector donante de ADN contiene los siguientes elementos:
i)
un origen de replicación procariótico, de modo que el vector pueda amplificase en un hospedador procariótico;
ii)
un gen que codifica un marcador que permite la selección de células de hospedador procariótico que contienen el vector (por ejemplo un gen que codifica resistencia a antibióticos);
iii)
dos genes virales heterólogos, concretamente env y gag de VIS o VIH, localizado cada gen adyacente a un promotor transcripcional capaz de dirigir la expresión del gen; y
iv)
secuencias de ADN homólogas con la región del genoma del virus progenitor en las que el gen o genes extraños se insertarán flanqueando el constructo del elemento iii.
Los métodos para construir plásmidos donantes para la introducción de múltiples genes extraños en poxvirus se describen en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 910.501, presentada el 23 de septiembre de 1986, titulada ``Pseudorrabies Vaccine'', cuyas técnicas se incorporan a la presente memoria como referencia. En general, todos los fragmentos de ADN viral para la construcción del vector donante, incluyendo los fragmentos que contienen promotores transcripcionales y los fragmentos que contienen secuencias homólogas con la región del genoma del virus progenitor en la que los genes extraños se van a insertar, pueden obtenerse a partir de ADN genómico o fragmentos de ADN clonado. Los plásmidos donantes pueden ser mono-, di- o multivalentes (concretamente pueden contener una o más secuencias génicas extrañas insertadas).
El vector donante contiene preferiblemente un gen adicional que codifica un marcador que permitirá la identificación de los virus recombinantes que contienen ADN extraño insertado. Pueden utilizarse varios tipos de genes marcadores para permitir la identificación y el aislamiento de virus recombinantes. Estos incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos o química (por ejemplo, véanse Spyropoulos et al., 1988, J. Virol. 62: 1046; Falkner y Moss., 1988, J. Virol. 62: 1849; Franke et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1918), así como genes, tales como el gen lacZ de E. coli, que permiten la identificación de placas virales recombinantes mediante ensayo colorimétrico (Panicali et al., 1986, Gene 47: 193-199).
Un método para la selección de virus Vaccinia recombinantes se basa en una sola función codificada por Vaccinia, a saber el producto génico 29K del intervalo del hospedador (Gillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5573). Este método se describió en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.189, presentada el 20 de junio de 1988, titulada ``Methods of Selecting for Recombinant Pox Viruses'', cuyas enseñanzas se incorporan a la presente memoria como referencia. Resumiendo, se utiliza un virus Vaccinia que contiene una mutación en el gen 29K, que está localizado en las regiones K/M HindIII del genoma viral, como virus hospedador para la recombinación in vivo. La mutación 29K evita el crecimiento de este virus en ciertas células hospedadoras, por ejemplo células RK13 (riñón de conejo). El plásmido donante para la inserción de genes extraños contiene secuencias de ADN de Vaccinia capaces de restaurar la función génica mutante; estas secuencias dirigen también la recombinación al sitio del gen mutante en la región M HindIII. Por tanto, los virus Vaccinia recombinantes recuperan la capacidad de crecer en células RK13, y pueden aislarse basándose en esto de los virus progenitores no recombinantes, que son incapaces de crecer en estas células.
Un vector de ADN preferido para recombinación con el virus Vaccinia preferido comprende:
a.
uno o más promotores transcripcionales (por ejemplo, los promotores 7,5K, 30K, 40K, 11K o BamF de Vaccinia o versiones modificadas de estos promotores), capaces de dirigir la expresión de genes adyacentes en virus Vaccinia, cada uno unido a;
b.
uno o más genes estructurales que codifican antígenos virales de interés, cada uno bajo el control de un promotor transcripcional;
c.
un marcador para la selección del virus progenitor recombinante, que puede comprender:
(1)
un promotor transcripcional (por ejemplo el promotor BamF de virus Vaccinia) ligado a un gen que codifica un marcador selectivo (por ejemplo el gen lacZ de E. coli); o
(2)
secuencias génicas estructurales del virus progenitor que restauran una función del intervalo del hospedador viral u otra función promotora del crecimiento del virus (por ejemplo el polipéptido 29K de Vaccinia);
d.
secuencias de ADN homólogas con una región del virus progenitor que flanquean el constructo de los elementos a-c (por ejemplo las secuencias TK o M HindIII de Vaccinia);
e.
una cadena principal vectorial para replicación en un hospedador procariótico que incluye un marcador para la selección de células bacterianas transformadas con el plásmido (por ejemplo un gen que codifica resistencia a antibióticos).
4. Integración de secuencias de ADN extraño en el genoma viral y aislamiento de recombinantes
La recombinación homóloga entre ADN del plásmido donante y ADN viral en una célula infectada da como resultado la formación de virus recombinantes que incorporan los elementos deseados. Las células hospedadoras apropiadas para recombinación in vitro son generalmente células eucarióticas que pueden infectarse por el virus y transfectarse por el vector plasmídico. Los ejemplos de dichas células adecuadas para uso con un poxvirus son fibroblastos de embrión de pollo, células HuTK143 (humanas) y células CV-1 y BSC-40 (ambas de riñón de mono). La infección de células con poxvirus y la transfección de estas células con vectores plasmídicos se consigue mediante técnicas estándar en la técnica (Panicali y Paoletti, patente de Estados Unidos Nº 4.603.112).
Después de la recombinación in vivo, la progenie viral recombinante puede identificarse mediante cualquiera de diversas técnicas. Por ejemplo, si el vector donante de ADN está diseñado para insertar genes extraños en el gen timidina quinasa (TK) del virus progenitor, los virus que contienen el ADN integrado serán TK^{-} y pueden seleccionarse basándose en esto (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415). Como alternativa, la cointegración de un gen que codifica un gen marcador o indicador con el gen o genes de interés, como se describe anteriormente, puede utilizarse para identificar la progenie recombinante. Un gen indicador preferido es el gen lacZ de E. coli: los virus recombinantes que expresan beta-galactosidasa pueden seleccionarse utilizando un sustrato cromogénico para la enzima (Panicali et al., 1986, Gene 47: 193). Un segundo gen indicador preferido para uso con el virus Vaccinia recombinante es el gen 29K de Vaccinia: los virus recombinantes que expresan la función codificada por el gen 29K de tipo natural pueden seleccionarse mediante crecimiento en células RK13.
Como se describe con más detalle en los ejemplos, se recombinaron plásmidos donantes monovalentes y divalentes que contenían genes de VIH y VIS en Vaccinia en el gen TK o la región M HindIII, y los virus recombinantes se seleccionaron como se describe anteriormente.
5. Caracterización de los antígenos virales expresados mediante virus recombinantes
Una vez se ha identificado un virus recombinante, pueden utilizarse una variedad de métodos para ensayar la expresión del polipéptido codificado por el gen insertado. Estos métodos incluyen el ensayo en placa negra (un enzimoinmunoensayo in situ realizado en placas virales), el análisis de transferencia Western, la radioinmunoprecipitación (RIPA), y el enzimoinmunoensayo (EIA). Los anticuerpos frente a antígenos expresados por patógenos virales son fácilmente asequibles o pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para virus de la inmunodeficiencia humana o de simio, los anticuerpos pueden ser (a) para recombinantes virus progenitor/SIV, sueros de monos macacos infectados con VIS; y (b) para recombinantes virus progenitor/VIH, sueros de pacientes humanos infectados con VIH o anticuerpos monoclonales comercialmente asequibles dirigidos contra polipéptidos específicos de VIH.
6. Formación de partícula viral
El análisis de expresión descrito en la sección precedente puede utilizarse para confirmar la síntesis de los polipéptidos codificados por los genes virales heterólogos insertados, pero no se dirige a la pregunta de si esos polipéptidos se autoensamblan, in vivo o in vitro, en partículas virales defectuosas. Pueden utilizarse dos enfoques experimentales para examinar este tema.
El primer enfoque es examinar visualmente mediante microscopía electrónica lisados de células infectadas con virus recombinantes que expresan uno o más polipéptidos virales. En los experimentos reseñados a continuación, los recombinantes Vaccinia que expresan genes gag, env + gag o env + gag + pol de VIS y/o VIH dan lugar a la formación de partículas retrovirales defectuosas; en células infectadas con los recombinantes que coexpresan los polipéptidos gag y env, la cubierta de la partícula contenía las glucoproteínas de cubierta como muestra la presencia de ``puntas'' de glucoproteína en la superficie de las partículas. La presencia de glucoproteínas de cubierta retrovirales en la superficie de las partículas puede demostrarse con microscopía electrónica ImmunoGold, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido hacia una de las glucoproteínas de cubierta.
Para caracterizar adicionalmente las partículas virales defectuosas producidas por virus recombinantes que expresan polipéptidos virales, estas partículas pueden aislarse mediante centrifugación a alta velocidad a partir del medio de cultivo de células infectadas con los virus recombinantes en presencia de [^{35}S]-metionina. El pelet resultante de la centrifugación del medio de cultivo puede resuspenderse, y tanto el pelet como el sobrenadante pueden inmunoprecipitarse con un antisuero apropiado para analizar los polipéptidos virales presentes en cada fracción. Por ejemplo, en el caso de recombinantes que expresan polipéptidos VIH o VIS, pueden utilizarse tanto antisueros anti-VIH (para recombinantes Vaccinia/VIH) como antisueros anti-VIS (para recombinantes Vaccinia/VIS) para estos análisis.
En el caso de virus recombinantes que coexpresan los polipéptidos env y gag de VIH o VIS, el pelet contendrá tanto proteínas de cubierta como de núcleo si se forman partículas retrovirales. Como se describe en los ejemplos, cuando este experimento se realizó utilizando recombinantes Vaccinia que coexpresan polipéptidos env y gag de VIH o VIS, el pelet contenía ambos polipéptidos env y gag, como sería de esperar si estos polipéptidos se ensamblaran en partículas retrovirales defectuosas. En contraste, el sobrenadante contenía sólo la glucoproteína de cubierta gp120.
Para caracterizar adicionalmente el material en el pelet resultante de la centrifugación del medio de cultivo, el pelet puede resuspenderse y analizarse en un gradiente de sacarosa. El gradiente puede fraccionarse después y las fracciones inmunoprecipitarse con el antisuero apropiado. Estos experimentos muestran si el pelet contiene material en bandas a la densidad esperada para partículas virales defectuosas.
Estos métodos pueden utilizarse también para determinar si la expresión de polipéptidos virales dirigidos por dos virus diferentes presentes en la misma célula infectada da lugar a la producción de partículas virales defectuosas. Por ejemplo, estos experimentos pueden realizarse utilizando células coinfectadas in vitro con un recombinante que expresa gag y un segundo recombinante que expresa env. La expresión simultánea en una sola célula de ambos polipéptidos env y gag, tanto dirigidos por un solo virus recombinante divalente como por dos virus monovalentes diferentes, se esperaría que diera como resultado la formación de partículas defectuosas retrovirales que contienen un núcleo de proteína que comprende los polipéptidos gag rodeados por una cubierta que contiene las glucoproteínas de cubierta codificadas viralmente.
7. Uso terapéutico de virus recombinantes que expresan antígenos virales capaces de ensamblarse en partículas virales defectuosas; uso terapéutico de las partículas virales defectuosas producidas mediante estos virus recombinantes
Incluso si la inmunización no puede proteger frente a la infección, la inmunización de un individuo anteriormente infectado podría prolongar el periodo de latencia de ese virus en el individuo. Esto puede ser particularmente importante en el caso de infecciones virales caracterizadas por largos periodos de latencia, tales como la infección por VIH. El largo tiempo de incubación entre la infección por VIH y el desarrollo de SIDA clínico puede ser debido a una respuesta inmune a la infección inicial que persiste con la salud y disminuye con la enfermedad. Si es ese el caso, reforzar la respuesta inmune mediante la inmunización con recombinantes antígeno de VIH/virus progenitor que producen partículas de tipo retroviral, o como alternativa, con las partículas purificadas mismas, puede evitar el desarrollo de la enfermedad y reducir la contagiosidad (Salk, 1987, Nature 327: 473).
Ejemplos Materiales y métodos Células y virus
Se utilizó la cepa MC1061 de E. coli (Casadaban y Cohen, 1980, J. Mol. Biol. 138: 179) como hospedador para el crecimiento de todos los plásmidos. Se utilizaron la línea celular BSC-40 de riñón de mono (Brockman & Nathans, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 942), la línea celular humana deficiente en timidina quinasa (TK^{-}) Hu143TK^{-} (Bacchetti y Graham, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 1590) y la línea celular de riñón de conejo RK13 (nº ATCC CCL37; Beale et al., 1963, Lancet 2: 640) para infecciones y transfecciones de Vaccinia.
Se utilizaron la cepa NYCBH (Nº ATCC VR-325) y la cepa 29K^{-}lacZ^{+} vABT33 de virus Vaccinia (véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.189, presentada el 10 de junio de 1988, cuyas enseñanzas se incorporan a la presente memoria como referencia) como virus progenitores para recombinación in vivo.
Enzimas
Las enzimas de restricción se obtuvieron de New England Biolabs o Boehringer Mannheim. El fragmento grande de ADN polimerasa (Klenow) se obtuvo de United States Biochemical Corp., la ADN polimerasa T4 se obtuvo de New England BioLabs, y la ADN ligasa T4 se obtuvo de Boehringer-Mannheim.
Procedimientos de clonación molecular
Las digestiones con enzima de restricción, la purificación de fragmentos de ADN y plásmidos, el tratamiento de ADN con Klenow, ADN polimerasa T4, ligasa o engarces y la transformación de E. coli se realizaron esencialmente como se describe en (Maniatis et al., ``Molecular Cloning: A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, incorporado a la presente memoria como referencia).
La mutagénesis de oligonucleótidos se realizó utilizando oligonucleótidos sintéticos obtenidos del Biology Department, Brandeis University, con los reactivos suministrados por Amersham y utilizados según las instrucciones del fabricante.
Preparación de recombinantes de virus Vaccinia
La infección viral, las transfecciones, la purificación de placa y la amplificación de virus se realizaron esencialmente como se describe en (Spyropoulos et al., 1988, J. Virol. 62: 1046). Los recombinantes 29K^{+} se seleccionaron y purificaron en células RK13 (véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.189, presentada el 10 de junio de 1988, cuyas enseñanzas se incorporan como referencia a la presente memoria). Los recombinantes TK^{-} se seleccionaron y purificaron en presencia de bromodesoxiuridina 50 \mum.
Análisis genómico del virus Vaccinia
Se extrajo ADN de células infectadas por virus Vaccinia como se describe en Esposito et al., 1981, J. Virol. Methods 2: 175 y se analizó mediante digestiones con enzimas de restricción e hibridación Southern como se describe en (Maniatis et al., ``Molecular Cloning: A Laboratory Manual'', Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Análisis de proteína
Se realizaron el ensayo de placa negra y el análisis de inmunoprecipitación esencialmente como se describen en (Smith et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7155 y Wittek et al., 1984, J. Virol. 49: 371); véase también la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 910.501, presentada el 23 de septiembre de 1986, e incorporada como referencia a la presente memoria. Para los ensayos de placa negra e inmunoprecipitación, se utilizaron antisuero policlonal de macaco frente a VIS entero antisuero humano frente a VIH entero. Para el análisis de inmunoprecipitación, se marcaron células infectadas por Vaccinia con [^{3}H]-glucosamina o [^{35}S]-metionina.
Análisis bioquímico de la formación de partículas retrovirales dirigida por Vaccinia recombinante
Se marcaron células BSC-40 infectadas por virus Vaccinia de tipo natural o recombinantes con [^{35}S]-metionina, utilizando el mismo procedimiento de marcaje utilizado para el análisis de inmunoprecipitación. Después de 16-18 horas, el medio de las células infectadas se recogió y clarificó mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante resultante se centrifugó a 24K durante 90 minutos en un rotor SW28. El sobrenadante se eliminó, y el pelet resultante se resuspendió en 3 ml de tampón PBS (NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM). Se sometieron muestras del sobrenadante y el pelet a análisis de inmunoprecipitación, utilizando antisuero anti-VIS de macaco o antisuero anti-VIH humano como se describe en la sección precedente.
Análisis de la formación de partículas retrovirales dirigida por Vaccinia recombinante mediante microscopía electrónica
Se infectaron células BSC-40 con virus Vaccinia de tipo natural o recombinante a una multiplicidad de 10 durante 16-18 horas como se describió anteriormente. El medio se eliminó después, y las células infectadas se lavaron dos veces con gelatina al 0,2% en tampón PBS.
Para tinción ImmunoGold, las muestras se preincubaron en suero de cabra al 10% en PBS/gelatina durante 30 minutos a 4ºC, después se incubaron en el anticuerpo monoclonal apropiado diluido en PBS/gelatina durante 60 minutos. Las muestras se lavaron después en PBS/gelatina dos veces y se incubaron con una dilución 1:20 de IgG de cabra anti-ratón conjugada con oro (5 nM) en PBS con suero de ternera fetal al 1%, azida de sodio al 0,1% y suero de anticuerpo humano al 5% durante 60 minutos. Las células se lavaron de nuevo con PBS/gelatina.
Las células no tratadas o teñidas por ImmunoGold se fijaron con glutaraldehído al 0,25% en tampón cacodilato de sodio 0,1M (pH 7,2) durante una noche, después se lavaron con tampón cacodilato de sodio 0,1M (pH 7,2) dos veces. Las muestras se fijaron después con OsO_{4} al 1%/tampón cacodilato 0,1M (pH 7,2) durante 1,5 horas y después se lavaron dos veces en tampón cacodilato de sodio 0,1M (pH 7,2). Las muestras se deshidrataron después en los siguientes alcoholes graduados durante 10 minutos cada uno: 50, 70, 80, 95, 100 (3x). La muestras se trataron después con óxido de propileno dos veces durante 5 minutos cada una, después durante una noche en viales destapados con óxido de propileno (4 partes)/epox12 (6 partes). Las muestras se embebieron después en epox812 y se curaron durante 36 horas.
Las secciones se cortaron en un ultramicrótomo Sorval Porter Blum MT-2 a 1000 \ring{A}, se tiñeron con acetato de uranilo alcohólico y tinción de plomo Sato (Sato, T., 1968, J. Elect. Mic. (Japan) 17: 158-159) y se observaron en un microscopio electrónico JEOL.
Ejemplo 1 Construcción de plásmidos recombinantes que contienen genes de VIS
Este ejemplo ilustra la construcción de plásmidos recombinantes que contienen genes de VIS para recombinación in vivo con virus Vaccinia (vectores de recombinación in vivo (IVR)). La construcción y la estructura de los plásmidos pAbT4532B, pAbT4533, pAbT4536, pAbT4537, pAbT4574, pAbT4578, pAbT4582B, pAbT4583 y pAbT4589 se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.454, presentada el 10 de junio de 1988. La construcción y la estructura del plásmido pAbT4027 se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 910.501, presentada el 23 de septiembre de 1986. La construcción y la estructura del plásmido pAbT4587 se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 229.343, presentada el 5 de agosto de 1988. Las enseñanzas de las solicitudes de patente anteriormente citadas se incorporan como referencia a la presente memoria.
pAbT4592 (Figura 2)
El pAbT4578 (véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.454, presentada el 10 de junio de 1988) se digirió con KpnI y EcoRI, y se aisló un fragmento de 2221 pares de bases (pb). Este fragmento se ligó a pAbT4587, que se había digerido con KpnI y EcoRI, proporcionando el plásmido pAbT4592. El pAbT4592 es un vector para la inserción y la expresión de gag y proteasa de SIVmac251 en virus Vaccinia. El pAbT4592 contiene el gen gag-prot bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes de Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
pAbT4593 (Figura 3)
El pAbT4574 (solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.454) se digirió con BamHI, y se aisló un fragmento de 2589 pb. Este fragmento se ligó a pAbT4587, que se había digerido con BamHI, y se trató con fosfatasa alcalina de ternero (CIP), proporcionando el plásmido pABT4593. El pAbT4593 es un vector para la inserción y la expresión de env de SIVmac251 en virus Vaccinia. El pAbT4593 contiene el gen env bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
pAbT4597 (Figura 4)
El pAbT4578 (solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.454) se digirió con SacI, y el ADN digerido se trató primero con ADN polimerasa T4, y después con CIP. El pAbT4589 se digirió con SphI, después se trató con ADN polimerasa T4, y finalmente se digirió con SmaI. Se aisló un fragmento de 2750 pb del pAbT4589 digerido; este fragmento se ligó al pAbT4578 digerido con SacI, proporcionando pAbT4597. El pAbT4597 es un vector para la inserción y la expresión de env y gag-prot de SIVmac251 en virus Vaccinia. El pAbT4573 contiene el gen gag-prot bajo el control del promotor 30K de Vaccinia y el gen env bajo el control del promotor 40K de Vaccinia. Estos genes están flanqueados por ADN de Vaccinia para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes de Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
Ejemplo 2 Construcción de plásmidos recombinantes que contienen genes de VIH
pSVHenv y pBF128 son plásmidos que contienen porciones de la cepa B10 del genoma de VIH-1; estos se obtuvieron de E.I. Dupont de Nemours and Company. El pHXBc2 es un plásmido que contiene porciones de la cepa HSB2 del genoma de VIH-1, que se obtuvo del Dr. Joseph Sodroski de la Harvard Medical School. La construcción y la estructura de los plásmidos pAbT4532B y pAbT4554 se describieron en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.454, presentada el 10 de junio de 1998. La construcción y la estructura del plásmido pAbT4007 se describen en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 910.501, presentada el 23 de septiembre de 1986. Las enseñanzas de las solicitudes de patente anteriormente citadas se incorporan como referencia a la presente memoria.
pAbT164 (Figura 5)
El plásmido pBF128 se digirió con NcoI y BamHI y se trató con el fragmento Klenow de ADN polimerasa; se aisló un fragmento de 1700 pb que contenía el gen gag de VIH-1 a partir de esta digestión. Este fragmento se ligó al plásmido pAbT4532B, que se había digerido con SmaI, y se trató con CIP, proporcionando el plásmido pAbT164.
El pAbT164 es un vector para la inserción y la expresión de gag de VIH-1 en Vaccinia. El pAbT164 contiene el gen gag bajo el control del promotor 7,5K de Vaccinia, las regiones de ADN que flanquean el gen TK de Vaccinia para dirigir la recombinación en Vaccinia, el gen lacZ bajo el control del promotor BamF de Vaccinia para la selección de recombinantes de Vaccinia y un replición bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
pAbT4603 (Figura 6)
El plásmido pSVHenv se digirió con XbaI y XhoI y se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa; se aisló un fragmento de 2700 pb que contenía el gen env de VIH-1 de esta digestión. Este fragmento se ligó al plásmido pAbT4007, que se había digerido con SmaI, y se trató con CIP, proporcionando el plásmido pAbT167.
El pAbT167 se digirió con KpnI y XbaI y se aisló un fragmento de 225 pb que contenía el extremo 5' del gen env de VIH-1 de esta digestión. Este fragmento se ligó a ADN del bacteriófago m13mp18 (New England BioLabs), que se había digerido con XbaI y KpnI, y se trató con CIP, creando el pAbT220. El extremo 5' del gen env se modificó para eliminar la mayoría de las secuencias no codificantes 5' mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido, como se describe en Materiales y Métodos. Utilizando el oligonucleótido 5'-GAAAGAGCAGTAGACAGTGG-3' (Biology Department, Brandeis University), se insertó un sitio AccI aproximadamente 10 pb cadena arriba del cordón de iniciación ATG de la secuencia codificante de env, creando el pAbT221. El pAbT221 se digirió con EcoRI y HindIII, y se aisló un fragmento de aproximadamente 230 pb. Éste se ligó al plásmido pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11: 1645), que se había digerido con EcoRI y HindIII, y se trató con CIP, proporcionando el plásmido pAbT8536.
El pAbT8536 se digirió con AccI, se trató con el fragmento Klenow de ADN polimerasa, y después se digirió con KpnI. Se aisló un fragmento de 138 pb que contenía la región no codificante 5' mutagenizada del gen env de esta digestión. El plásmido pAbT167 se digirió con KpnI y SacI, y se aisló un fragmento de 2461 pb que contenía la mayoría de la secuencia del gen env. El fragmento de 138 pb de pAbT8536 y el fragmento de 2461 pb de pAbT167 se ligaron a pAbT4554, que se había digerido con SmaI y SacI, y se trató con CIP, proporcionando el plásmido pAbT8539.
El pAbT8539 se digirió con EcoRI, y se aisló un fragmento de 2682 pb que contenía el gen env. Este se ligó a pAbT4587, que se había digerido con EcoRI, y se trató con CIP, proporcionando el plásmido pAbT4603.
El pAbT4603 es un vector para la inserción y la expresión de env de VIH-1 en virus Vaccinia. El pAbT4603 contiene el gen env bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por ADN para dirigir la recombinación en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
pAbT621 (Figura 7) 7A. Construcción del plásmido pAbT598 (Figura 7a)
Se digirió un plásmido derivado de pHXBc2 (Sodroski et al., Nature 322: 470 (1986)) con BglI y SacI, liberando un fragmento correspondiente a las posiciones nucleotídicas 715-6002. Este ADN se trató después con ADN polimerasa T4. El fragmento de 5287 pb que contenía los genes gag y pol de VIH-1 se aisló de esta digestión y se ligó a pAbT4536, que se había digerido con SmaI, y se trató con CIP, proporcionando el plásmido pAbT599.
El pAbT599 se digirió con NdeI, se trató con ADN polimerasa T4, después se digirió adicionalmente con BglII, y se aisló un fragmento de 3027 pb de esta digestión. Este fragmento se ligó a un fragmento de 8864 pb aislado después de la digestión de pAbT164 con KpnI, el tratamiento con ADN polimerasa T4 y la digestión adicional con BglII, proporcionando el plásmido pAbT598.
B. Construcción de pAbT621 (Figura 7b)
Se digirió pAb4603 con PstI, se trató con ADN polimerasa T4 y se digirió adicionalmente con SalI, y se aisló un fragmento de 6326 pb resultante de esta digestión. El pAbT598 se digirió con BamHI y BalI, y se aisló un fragmento de 1838 pb. El pAbT4554 se digirió con SalI y BamHI y se aisló un fragmento de 420 pb. Estos tres fragmentos se ligaron conjuntamente creando el pAbT621.
El pAbT621 es un vector para la inserción y la expresión de env y gag-prot de VIH-1 en Vaccinia. El pAbT621 contiene el gen gag de VIH-1 bajo el control del promotor 40K de Vaccinia y el gen gag-prot de VIS bajo el control del promotor 30K de Vaccinia. Estos genes están flanqueados por ADN de Vaccinia para la recombinación directa en la región M HindIII de Vaccinia. El ADN del vector incluye el gen 29K del intervalo del hospedador para la selección de recombinantes Vaccinia y un replicón bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento y la selección en E. coli.
Ejemplo 3 Construcción de virus Vaccinia recombinantes que contienen genes de VIH-1 o SIVmac251 bajo el control de promotores de Vaccinia
La recombinación in vivo es un método mediante el cual se crean virus Vaccinia recombinantes (Nankano et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1593; Paoletti y Panicali, patente de EE.UU. nº 4.603.112). Estos virus recombinantes se forman transfectando ADN que contiene un gen de interés en células que se han infectado con el virus Vaccinia. Un pequeño porcentaje del virus progenie contendrá el gen de interés ligado a un sitio específico en el genoma de Vaccinia. Estos virus recombinantes pueden expresar genes de origen extraño (Panicali y Paoletti, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927, Panicali et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5364).
Para insertar los genes de SIVmac251 o VIH-1 en el genoma de virus Vaccinia en la región M HindIII, se utilizó un esquema de selección basado en el gen 29K del intervalo del hospedador, que está localizado en esta región (Gillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5573). El virus Vaccinia recombinante vAbT33 contiene el gen lacZ en lugar de una porción del gen 29K. Esta inserción lacZ destruye la función del gen 29K; por lo tanto, vAbT33 no puede crecer en células RK13, que requieren el producto del gen 29K. Además, vAbT33 forma placas azules en células permisivas en presencia del sustrato cromogénico para la beta-galactosidasa, Bluogal, debido a la presencia del gen lacZ. Véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.189, presentada el 10 de junio de 1988.
Los vectores IVR pAbT4592, pAbT4593, pAbT4597, pAbT4603 y pAbT621 se transfectaron en células BSC-40 que se habían infectado con virus Vaccinia vAbT33 (véase Materiales y Métodos). Los virus recombinantes se seleccionaron en forma de placas blancas en presencia de Bluogal en células RK13. Las placas se recogieron y purificaron y se mostró, mediante análisis Southern, que contenían el gen o genes apropiados de SIVmac251 o VIH-1: vAbT252 contiene gag-prot de VIS; vAbT271 contiene env de VIH-1; vAbT253 contiene env de VIS; vAbT264 contiene tanto env de VIS como gag-prot de VIS; y vAbT344 contiene env y gag-prot de VIH-1.
Para insertar genes de SIVmac251 o VIH-1 en el genoma de virus Vaccinia en el sitio TK, que está localizado en la región J HindIII, se utilizó un esquema de selección basado en la sensibilidad de los virus TK^{+} a la bromodesoxiuridina (BUdR). La bromodesoxiuridina es letal para los virus TK^{+}, pero permite crecer los virus recombinantes TK^{-}. Los plásmidos para recombinación in vitro se transfectan por tanto en células Hu143TK^{-} que se han infectado con un virus Vaccinia TK^{+} (véase Materiales y Métodos).
Además, los vectores plasmídicos para la inserción en TK contienen el gen lacZ de E. coli bajo el control del promotor BamF de Vaccinia; los virus recombinantes que contienen el gen o genes deseados contienen también el gen lacZ, y por lo tanto producen placas azules cuando se propagan en presencia del sustrato cromogénico para la beta-glucosidasa, Bluogal. Por tanto, los virus recombinantes se seleccionan en BUdR y son adicionalmente identificables como placas azules en presencia de Bluogal.
Para construir un virus Vaccinia recombinante que contiene el gen gag de VIH-1 insertado en el locus TK, se utilizó el virus NYCBH de tipo natural como virus progenitor para recombinación in vitro con el vector pAbT164, produciendo el virus recombinante vAbT141.
Para construir el virus Vaccinia recombinante que contiene los genes env, gag-prot, y pol de SIVmac251, se utilizó vAbT264 como virus progenitor para recombinación in vivo con pAbT4583, un vector IVR que contiene el gen pol de SIVmac251 bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, flanqueado por ADN homólogo con el gen TK de Vaccinia. Este vector se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 205.454, presentada el 10 de junio de 1988. Esta proporcionaba el virus recombinante vAbT277, que contiene el gen pol de SIVmac251 insertado en el locus TK bajo el control del promotor 40K de Vaccinia, y los genes env y gag-prot de SIVmac251 bajo el control de los promotores 40K y 30K de Vaccinia, respectivamente, insertados en el locus de M HindIII.
Ejemplo 4 Ensayo de placa negra para la expresión de antígenos de VIS o VIH-1 en virus Vaccinia recombinantes
El ensayo de placa negra, descrito en Materiales y Métodos, es un inmunoensayo in situ basado en enzimas que puede detectar la proteína expresada por las células infectadas por Vaccinia. Este ensayo se realizó en los recombinantes Vaccinia vAbT252, vAbT253, vAbT264 y vAbT277 utilizando suero de macacos infectados por VIS, obtenido de Ronald C. Desrosiers (New England Regional Primate Research Center, Southborough, MA), y en vAbT141 y vAbT344 utilizando suero de pacientes humanos infectados por VIH-1, obtenido de John Sullivan (University of Massachussets Medical School, Worcester, MA).
Las placas formadas por los virus de control negativos NYCBH o vAbT33 mostraron sólo un color de fondo que era consistente con el fondo de la monocapa celular misma. Las placas formadas por los recombinantes Vaccinia vAbT252, vAbT253, vAbT264, vAbT277, vAbT141, vAbT271 y vAbT344 se tiñeron con un color púrpura oscuro distintivo que era mucho más oscuro que el fondo de la monocapa celular, mostrando que estos recombinantes expresan fuertemente antígenos de SIVmac251 o VIH-1.
Ejemplo 5 Inmunoprecipitación de antígenos de SIVmac251 o VIH-1 de virus Vaccinia recombinantes
Se realizó el análisis de inmunoprecipitación en células infectadas con los virus Vaccinia recombinantes vAbT252, vAbT253, vAbT223, vAbT264, vAbT277, vAbT141, vAbT271 y vAbT344 como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados, que se resumen en la Tabla 1, muestran que cada uno de estos recombinantes de Vaccinia expresa el polipéptido o polipéptidos codificados.
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TABLA 1 Inmunoprecipitación de polipéptidos de SIVmac251 o VIH-1 a partir de virus Vaccinia recombinantes
Recombinantes Vaccinia Genes insertados Proteínas observadas
vAbT252 gag-prot de VIS p55, p40, p24, p15
vAbT253 env de VIS gp160, gp120, gp32
vAbT264 env, gag-prot de VIS gp160, gp120, gp32,
p55, p40, p24, p15
vAbT277 env, gag-prot, pol de VIS gp160, gp120, gp32,
p55, p40, p24, p15,
p64, p53, p10
vAbT141 gag de VIH p55
vAbT271 env de VIH gp160, gp120, gp41
vAbT344 env, gag-prot de VIH gp160, gp120, gp41,
p55, p40, p24, p17
Ejemplo 6 Detección bioquímica de partículas retrovirales producidas por recombinantes Vaccinia que expresan antígenos de VIS o VIH
El análisis de expresión descrito en el ejemplo 5 puede utilizarse para confirmar la síntesis de los polipéptidos codificados mediante genes de VIH o VIS insertados, pero no se dirige a la pregunta de si estos polipéptidos se autoensamblan in vivo en partículas virales defectuosas. Como un medio de determinar si los recombinantes Vaccinia que expresan env, gag-prot o tanto env como gag-prot producen partículas de tipo retroviral liberadas al medio de las células infectadas, se examinó en el medio la presencia de estructuras que contenían polipéptidos env y/o gag que pudieran sedimentarse mediante centrifugación. Las células BSC-40 se infectaron con recombinantes VIS/Vaccinia vAbT253 (env), vAbT252 (gag-prot) o vAbT264 (env y gag-prot) o con recombinantes VIH/Vaccinia vAbT141 (gag), vAb271 (env) o vAbT344 (env y gag-prot). Las células infectadas se marcaron con [^{35}S]-metionina como se describe en Materiales y Métodos. Después de 16-18 horas de infección, el medio se recogió y clarificó mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante resultante se extrajo y se sometió a centrifugación a 24K durante 90 minutos en un rotor 8W28. El sobrenadante se eliminó después y el pelet resultante se resuspendió en 1 ml de tampón PBS (NaCl 13 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM). Las muestras del sobrenadante y el pelet se sometieron a análisis de inmunoprecipitación utilizando antisuero anti-VIS de macaco para recombinantes VIS/Vaccinia, o antisuero anti-VIH humano para recombinantes VIH/Vaccinia, como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostraron que para los recombinantes env y gag-prot vAbT264 y vAbT344, mientras que el sobrenadante contenía sólo gp120, que se había segregado presumiblemente al medio de cultivo durante el crecimiento del recombinante VIS/Vaccinia (Kieny et al., 1986, Bio/Technology 4: 790), el pelet no sólo contenía gp120, sino también gp32 (para vAbT264) o gp41 (para vAbT344) codificadas por el gen env, así como p55, p40, p24 y p15 codificadas por el gen gag. Estos resultados sugieren fuertemente que las proteínas env y gag producidas por Vaccinia recombinante se autoensamblan en partículas o complejos.
Para vAbT141 y vAbT252, que expresan sólo las proteínas gag de VIH o gag-prot de VIS, respectivamente, el material sedimentado contenía proteínas gag, consistentemente con la formación de partículas virales inmaduras mediante autoensamblado de polipéptidos gag. En contraste, para vAbT253 y vAbT271, que expresan sólo las glucoproteínas env de VIS o VIH, respectivamente, no se encontraron polipéptidos inmunoprecipitables en el pelet, aunque se encontraron cantidades sustanciales de gp120 en el sobrenadante. Estos resultados fueron consistentes con la predicción de que la formación de partículas virales defectuosas ocurre sólo cuando los polipéptidos gag se expresan, solos o en combinación con otras proteínas estructurales virales tales como las glucoproteínas env.
Ejemplo 7 Demostración de la formación de partículas retrovirales mediante virus Vaccina recombinantes que expresan polipéptidos de VIS o VIH-1 utilizando microscopía electrónica
Como confirmación adicional de que los virus Vaccinia recombinantes que expresan polipéptidos gag, gag + env o gag + env + pol son capaces de ensamblarse en partículas de tipo retroviral, los lisados de células infectadas con estos virus Vaccinia recombinantes se examinaron visualmente mediante microscopía electrónica mediante los métodos detallados en la sección de Materiales y Métodos anterior.
Estos experimentos mostraron que los recombinantes Vaccinia que expresan los genes gag (vAbT141 y vAbT252), env + gag (vAbT223, vAbT264 o vAbT344) o env + gag + pol (vAbT277) dan lugar a la formación de partículas retrovirales recubiertas; en los recombinantes que coexpresan polipéptidos de gag y env, (vAbT223, vAbT264, vAbT344 y vAbT277), la cubierta de la partícula contiene las glucoproteínas de cubierta, como muestra la presencia de ``puntas'' de glucoproteína en la superficie de las partículas. Para el vAbT223 recombinante de VIS, la presencia de glucoproteínas de cubierta de VIS en la superficie de las partículas se demostró también con microscopía electrónica ImmunoGold, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido hacia una de las glucoproteínas de cubierta.
Depósitos de plásmido
Los plásmidos pAbT4597 de E. coli MC1061 y pAbT621 de E. coli MC1061 se depositaron, en las condiciones del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection en Rockville, MD, el 31 de mayo de 1989. A los plásmidos se les han asignado los números de acceso 67998 y 67999, respectivamente.
Equivalentes
Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de evaluar utilizando nada más que una experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Dichos equivalentes se pretende que estén incluidos en las siguientes reivindicaciones.

Claims (5)

1. Un vector poxvirus recombinante que coexpresa un gen que codifica un polipéptido de cubierta correspondiente a VIS o VIH y un gen que codifica un polipéptido gag mate correspondiente a VIS o VIH, por lo que los polipéptidos coexpresados se ensamblan en partículas lentivirales defectuosas no autopropagantes encerradas.
2. Un vector poxvirus recombinante que coexpresa un gen que codifica una porción suficiente del gen que codifica el polipéptido de cubierta de VIS o VIH y una porción suficiente de un gen que codifica un polipéptido gag de VIS o VIH para formar partículas lentivirales defectuosas no autopropagantes con puntas de glucoproteína en su superficie.
3. El vector de las reivindicaciones 1 ó 2, que coexpresa también un gen que codifica un polipéptido enzimático lentiviral con la cubierta y polipéptidos estructurales lentivirales.
4. El vector de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que es un virus Vaccinia.
5. Uso del vector de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para producir in vitro una partícula lentiviral defectuosa no autopropagante.
ES90909861T 1989-06-01 1990-06-01 Vector que codifica particulas virales no autopropagantes, defectuosas, auto-ensambladas. Expired - Lifetime ES2198400T3 (es)

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US36002789A 1989-06-01 1989-06-01
US360027 1989-06-01

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