DE69034052T2

DE69034052T2 - Rekombinante vectoren , die für selbstzusammengesetzte, defekte, sich nichtselbstvermehrende viruspartikel kodieren

Info

Publication number: DE69034052T2
Application number: DE69034052T
Authority: DE
Inventors: P. Mazzara; L. Panicali; Brian Roberts
Original assignee: Applied Bio Technology Inc
Current assignee: Therion Biologics Corp
Priority date: 1989-06-01
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 2003-09-25
Anticipated expiration: 2010-06-02
Also published as: AU5848390A; EP0431128A1; JP3034025B2; ES2198400T3; DE69034052D1; WO1990015141A2; JPH04500312A; ATE235554T1; EP1288304A3; CA2033175C; EP0431128B1; EP1288304A2; WO1990015141A3; DK0431128T3; CA2033175A1

Description

Grundlagen

Die Impfung hat eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung von Virus- Krankheiten in den letzten 30 Jahren gespielt. Die Impfung beruht auf einem einfachen Grundsatz der Immunität: einmal einem infektiösem Agens ausgesetzt, erlangt ein Tier eine Immunabwehr, die vor einer Infektion desselben Agens schützt. Das Ziel einer Impfung ist nun, das Tier in die Lage zu versetzen, die Abwehr schon vor der Infektion zu erlangen. Herkömmlicherweise ist dies durch Verwendung von lebenden attenuierten oder abgetöteten Formen des Virus als Immunogene erreicht worden. Der Erfolg dieser Verfahren in der Vergangenheit beruhte zum Teil der Präsentation des nativen Antigens und der Fähigkeit des attenuierten Virus, das ganze Spektrum von bei natürlichen Infektionen erfolgenden Immunantworten auszulösen. Allerdings haben die herkömmlichen Impfmethoden immer einer Reihe möglicher Beschränkungen unterlegen. Attenuierte Stämme können zu virulenteren oder nicht-immunogenen Stämmen mutieren; unvollständig inaktivierte Impfstoffe können die Krankheit auslösen, für deren Prävention sie entwickelt wurden.
Die rekombinante DNA-Technologie bietet die Möglichkeit, einige Beschränkungen herkömmlicher Impfstoffe zu beseitigen, indem diese die Entwicklung von Impfstoffen ermöglicht, die mehr auf der Verwendung definierter Antigene als dem intakten infektiösen Agens als Immunogen beruhen. Diese umfassen Peptid-Impfstoffe, bestehend aus chemisch synthetisierten, immunreaktiven Epitopen; Spaltimpfstoffe, die durch Expression viraler Proteine in rekombinanten heterologen Zellen produziert sind; und die Verwendung lebender viraler Vektoren für die Präsentation eines oder mehrer definierter Antigene.
Sowohl Peptid- als auch Spaltimpfstoffe unterliegen mehreren möglichen Beschränkungen. Ein Hauptproblem ist die Schwierigkeit, sicherzustellen dass die Konformation der künstlich hergestellten Proteine die Konformation der Antigene in ihrer natürlichen Umgebung imitiert. Geeignete Adjuvanzien und, im Falle von Peptiden, Carrier-Proteine müssen verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken. Zusätzlich lösen diese Impfstoffe primär humorale Antworten aus und können folglich möglicherweise keine wirksame Immunität hervorrufen.
Einige der mit der Verwendung von Peptiden und. Spaltimpfstoffen verbundenen Probleme lassen sich durch die Verwendung von lebenden viralen Vektoren zur Präsentation heterologer Antigene lösen. Mehrere virale Vektoren, einschließlich Retro-, Adeno-, Herpes- und Pockenviren (Cepko et al., 1984, Cell 37: 1053-1062; Morin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630; Lowe et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3896-3900; Panicali & Paoletti, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931; Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419) sind entwickelt worden; die größten Anstrengungen sind auf die Entwicklung von Vacciniavirus, ein Orthopoxvirus, als ein infektiöser eukaryotischer Klonierungsvektor für diesen Zweck gerichtet worden (Paoletti und Panicali, U. S. Patent Nr. 4.603.112). Heterologe Gene, einschließlich solcher, die Antigene von verschiedenen Pathogenen codieren, sind in dem Vaccinia-Vektorsystem exprimiert worden. In allen Fällen war das von dem rekombinanten Vacciniavirus exprimierte fremde Genprodukt ähnlich oder identisch mit dem unter nativen Bedingungen synthetisierten Genprodukt. In manchen Fällen hat eine Impfung von Versuchstieren mit rekombinanten Vacciniaviren diese Tiere vor einer Infektion mit den entsprechenden Pathogenen geschützt (Paoletti et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 193-197; Kieney et al., 1984, Nature 312: 163-166; Alizon et al., 1984, Nature 312: 757-760; Boyle et al., 1985, Gene 35: 169-177; Yilma et al., 1988, Science 242: 1058-1061.
Rekombinante Verfahren sind bei den Bemühungen zur Entwicklung von Impfstoffen gegen Krankheiten angewandt worden, gegen die es gegenwärtig keinen Impfstoff gibt oder gegen die herkömmliche Impfverfahren weniger erwünscht sind. Zum Beispiel als das humane Immundefizienz-Virus (HIV) zunächst als das ätiologische Agens des erworbenen Immundefizienz- Syndroms (AIDS) indentifiziert war (Barre-Sinoussi et al., 1983, Science 220: 868; Levey et al., 1984; Science 225: 840; Gallo et al., 1984, Science 224: 500), sind beträchtliche Anstrengungen zur Entwicklung eines sicheren und wirksamen Impfstoffes unternommen worden. Diese Anstrengungen beruhten auf weit gefächerten Strategien, die von der Verwendung kleiner synthetischer Peptide bis hin zum ganzen inaktivierten Virus als Immunogen reichten.
Das Auftreten der AIDS-Pandemie kann eine der ernstesten Bedrohungen für das Gesundheitswesen des 20. Jahrhunderts darstellen. Seit der Erkennung von AIDS 1981 hat eine intensive Forschung zu wesentlichen Fortschritten beim Verständnis dieser Krankheit geführt. Das auslösende Virus (HIV) ist identifiziert worden und als die wesentlichen Übertragungspfade sind sexuelle Kontakte sowie Austausch von Blutprodukten erkannt worden (Curran et al., 1985, Science 229: 1352). Die Nucleotid-Sequenzen der Genome von vielen. HIV-Isolaten sind bestimmt worden und die Molekularbiologie des Virus wird intensiv erforscht. Allerdings ist noch viel zu tun, um die Virus-Replikation in infizierten Individuen und ihre Rolle bei der Pathogenese der Krankheit aufzuklären.
Die humanen Immundefizienz-Viren, HIV-1 und HIV-2, sind Vertreter der Lentiviren, eine Unterklasse der Retroviren (Gonda et al., 1985, Science 227: 173; Sonigo et al 1985, Ceil 42: 369). Zu dieser Unterklasse gehören ebenfalls die verwandten simianen Immundefizienz-Viren (SIV; Daniel et al., 1985, Science 228: 1201). Die humanen und simianen Immundefizienz-Viren zeigen eine ähnliche Morphologie. Die viralen Partikel enthalten einen inneren Kern, der aus Capsid-Proteinen (vom viralen gag Gen codiert) besteht, die das virale RNA-Genom umschließen (Rabson & Martin, 1985, Cell 40: 477). Der Zentralkern ist von einer Lipidhülle umgeben, die die viralcodierten Hüllglycoproteine enthält. Die für eine effiziente Replikation erforderlichen viralcodierten Enzyme, wie beispielsweise die reverse Transcriptase und Integrase (vom pol Gen codiert), sind ebenfalls in dem Viruspartikel verpackt.
Die Nucleotid-Sequenz-Analyse von HIV- und SIV-Genomen hat ergeben, dass diese Viren ebenfalls eine unterscheidbare Genom- Organisation (Fig. 1) wie auch eine beträchtliche DNA-Sequenzhomologie besitzen (Chakrabarti, et al., 1987, Nature 328: 543; Franchini et al., 1987, Nature 328: 539). Das etwa 10 kB Genom umfasst die flankierenden langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR), die die regulatorische Abschnitte für die virale Replikation enthalten, wie auch die gag, pol und env Gene, die für die Kernproteine codieren, die reverse Transcriptase-Protease-Endonuclease beziehungsweise die Hüllglycoproteine. Diese Viren enthalten ebenfalls mindestens sechs zusätzliche Gene, wovon einige bekannte regulatorische Funktionen besitzen.
Schließlich besitzen der humane und simiane Immundeffizienz-Virus die selben allgemeinen biologischen Eigenschaften, einschließlich cytopathischer Effekt, Tropismus für CD4-tragende Zellen und, äußerst wichtig, die Fähigkeit, eine lang andauernde Infektions- und chronische Immundeffizienz- Krankheit in Menschen (HIV-1 und HIV-2) oder nicht humanen Primaten (SIV) auszulösen. Die Ähnlichkeiten zwischen HIV und SIV haben die Entwicklung von SIV-Infektionen bei Rhesus-Makaken als ein Modellsystem zur Untersuchung von Pathogenese und Prävention der Immundefizienz- Krankheit ermöglicht.
Bei der Verwendung des ganzen Virus für einen HIV-Impfstoff treten eindeutig Schwierigkeiten auf. Das Risiko, dass ein attenuiertes Virus wieder virulent werden könnte, und die Gefahr einer unvollständigen Inaktivierung der abgetöteten Virus-Präparate, sowie das Unbehagen, das HIV-Genom in seronegative Individuen einzuführen, haben gegen die Verwendung von lebenden attenuierten oder abgetöteten HIV-Impfstoffen zur Prävention einer Infektion gesprochen.
Die heute in Betracht kommenden AIDS-Impfstoffe umfassen das ganze Spektrum möglicher rekombinanter Verfahren; viele, wenn nicht gar alle, beruhen auf der Verwendung des gesamten oder eines Teils des Hüllglyocoproteins als Immunogen, Allerdings haben viele der bis heute getesteten Impfstoffe enttäuschende Resultate erzielt. Wenn zum Beispiel ein Spaltimpfstoff, bestehend aus Hüllglycoprotein gp120, zur Immunisierung von Schimpansen verwendet war, wurden spezifische humorale Antworten auf HIV ausgelöst, die in der Lage waren, das Virus in vitro zu neutralisieren; allerdings schützte die Immunisierung die Tiere nicht vor einer HIV-Infektion (Berman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200-5204). Ebenfalls ist die Verwendung des lebenden rekombinanten Vacciniavirus, das die HIV- Hüllglycoproteine als ein Impfstoff zur Prävention einer HIV-Infektion in Schimpansen exprimiert, nicht erfolgreich gewesen. Eine Infektion von Zelten, die für diese Rekombinanten anfällig sind, führt zu einer normalen Synthese, Glycosylierung, Verarbeitung und Membrantransport des Hüllpolypeptids (Chakrabarti et al., 1986, Nature 320: 535; Hu et al., 1986, Nature 320: 537). Das Genprodukt kann von Serum-Antikörpern aus Patienten mit AIDS erkannt werden und es konnte gezeigt werden, dass es die Synzytien-Bildung mit Zellen, die das CD4-Zelloberflächenepitop exprimieren, vermittelt (Lifson et al., 1986, Nature 323: 725). Die Impfung mehrerer Species mit diesen Rekombinanten hat Stamm-spezifische humorale Immunantworten wie auch zellvermittelte Antworten ausgelöst (Hu et al., 1986, Nature 320: 537; Chakrabarti et al., 1986, Nature 320: 535; Kieny et al., 1986, Biotechnology 4: 790; Zarling et al., 1986, Nature 323: 344; Hu et al., 1987, Nature 328: 721; Zagury et al., 1987, Nature 326: 249; Zagury et al., 1988, Nature 322: 728). Trotz dieser Immunantworten, schützten diese Impfstoffe Schimpansen dennoch nicht vor einer Infektion mit HIV (Hu et al., 1987, Nature 328: 721).
Das Versagen dieser ersten auf Vaccinia beruhenden Impfstoffe kann auf verschiedene Faktoren zurückgeführt werden. Die Immunogenität der Vaccinia-Rekombinanten mag nicht optimal gewesen sein; in der Tat riefen die Rekombinanten geringe Antikörper-Titer in Schimpansen hervor. Gewiss die Tatsache, dass diese Impfstoffe die Expression von nur einem einzigen HIV-1 Polypeptid induzieren, lässt vermuten, dass sie nicht das maximal mögliche Potenzial zur Stimulierung schützender Immunantworten besitzen. Außerdem ist der Einsatz von Schimpansen zur Bewertung von AIDS- Impfstoffen selbst fragwürdig, da Schimpansen AIDS nicht bekommen, obwohl sie infiziert werden können (Alter et al., 1984, Science 226: 549; Fultz et al., 1986, J. Virol. 58: 116).
Der mögliche Rückgriff auf eines der rekombinanten Verfahren zur Entwicklung von AIDS-Impfstoffen ist, dass sie auf der Verwendung von einem einzigen HIV-Antigen beruht haben, meistens dem Hüllglycoprotein als Immunogen. Der Erfolg der herkömmlichen Impfverfahren in der Vergangenheit bei anderen Krankheiten (wie beispielsweise Polio, Masern, Mumps und Tollwut), die auf der Verwendung des ganzen Virus, entweder lebend attenuiert oder abgetötet, als Immunogen beruhen, lässt vermuten, dass die Antigen-Präsentation von allergrößter Bedeutung für das Auslösen schützender Immunantworten ist.
Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie ermöglichen die Verwendung heterologer Expressionssysteme für die Synthese nicht nur einzelner Antigene sondern außerdem von defekten, nicht selbstvermehrenden Virus-ähnlichen Partikeln. Es ist gezeigt worden, dass Capsid- Proteine bestimmter Viren sich zu Partikeln zusammensetzen können, die dem entsprechenden Virus hinsichtlich Morphologie und Immunologie ähnlich sind. Zum Beispiel kann der P1-Vorläufer von einigen Picornaviren zu einzelnen Capsid-Proteinen in vitro zerlegt werden, die sich dann zu immunreaktiven Virion-ähnlichen Partikeln zusammensetzen (Nicklin et al., 1986, Biotechnology 4: 33; Palmenberg et al., 1979; J. Virol. 32: 770; Shih et al., 1978; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5807; Hanecak et al., 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3973; Grubman et al., 1985; J. Virol. 56: 120). Über ein Selbstzusammensetzen von Capsid-Proteinen, die in verschiedenen rekombinanten Expressionssystemen in vivo exprimiert sind, ist ebenfalls berichtet worden. Zum Beispiel, wenn ein humanes Hepatitis B Oberflächenantigen in Hefezellen exprimiert ist, setzt sich das Polypeptid zu Partikeln zusammen, die sich den aus menschlichem Plasma isolierten Partikeln im Erscheinungsbild ähneln (Valenzuela et al., 1982; Nature 298: 347); diese Partikel stimulieren eine anti-Hepatitis B Antikörperproduktion in einigen Species und können Schimpansen vor einer Virus-Challerige schützen (McAleer et al., 1984; Nature 307: 178). In einem anderen Beispiel wurde gezeigt, dass eine Coexpression von canine Parvovirus (CPV) Capsid- Proteinen VP1 und VP2 in murinen Zellen, die mit einem bovinen Papillomavirus/CPV rekombinanten Plasmid transformiert waren, zu einer Bitdung von sich selbst zusammensetzenden Virus-ähnlichen Partikeln führte (Mazzara et al., 1986; in Modern Approaches to Vaccines Cold Spring Harbor Laboratory; N. Y., R M Chanock und R. A. Lerner, eds, Seiten 419-424; Mazzara et al., U. S. Patentanmeldung Nr. 905.299, eingereicht am 8. September 1986); wenn diese zur Impfung von anfälligen Hunden verwendet sind, lösen diese leeren Capside Immunantworten aus, die vor einer CPV-Challenge schützen können. Schließlich ist gezeigt worden, dass das HIV-1 p55gag Vorläuferpolypeptid, das in Spodoptera frugiperda Zellen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors exprimiert wird, sich zu Virus-ähnlichen Partikeln zusammensetzt, die in das Zellkulturmedium sezerniert werden (Gheysen et al., 1988; Modern Approaches to New Vaccines Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. 14.-18. September, Zusammenfassung Nr. 72).

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft rekombinante virale Vektoren, die in der Lage sind, SIV oder HIV Hüll- und SIV oder HIV gag Polypeptide mit der Fähigkeit sich selbst zu defekten nichtselbstvermehrenden Viruspartikeln in vivo oder in vitro zusammenzusetzen, zu exprimieren und betrifft Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Virus. Diese Erfindung betrifft ebenfalls intermediäre DNA-Vektoren, die mit einem Ausgangsvirus in vivo oder in vitro rekombinieren, um den rekombinanten Vektor herzustellen, und betrifft Verfahren zur Impfung eines Wirts mit dem rekombinanten viralen Vektor, um eine schützende Immunität gegen den entsprechenden heterologen pathogenen Virus hervorzurufen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Ähnlichkeiten in der Genom-Organisation von simianem Immundefizienz-Virus (SIV) und humanem Immundefizienz-Virus (HfV).
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von pAbT4592, ein Plasmid-Vektor zur Insertion und Expression von SIVmac251 gag und protease in Vacciniavirus. pAbT4592 enthält das gag-prot Gen unter der Kontrolle eines Vaccinia 40K Promotors, flankiert von Vaccinia-DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia HindIII M Region. Die Vektor-DNA enthält das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion von pAbT4593, ein Plasmid-Vektor zur Insertion und Expression von SIVmac251 env in Vacciniavirus. pAbT4593 enthält das env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, flankiert von Vaccinia-DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia Hindill M Region. Die Vektor-DNA enthält das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion von pAbT4597, ein Plasmid-Vektor zur Insertion und Expression von SIVmac251 env und gag-prot in Vacciniavirus. pAbT4573 enthält das gag-prot Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 30K Promotors und das env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors. Diese Gene sind von Vaccinia-DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia Hindill M Region flankiert. Die Vektor-DNA enthält das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion von pAbT164, ein Plasmid-Vektor zur Insertion und Expression von HIV-1 gab in Vaccinia. pAbT164 enthält das HIV gag Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 7,5K Promotors, wobei DNA- Regionen das Vaccinia TK-Gen zur Steuerung der Rekombination in Vaccinia flankieren, das lacZ-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia BamF-Promotors zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion von pAbT4603, ein Plasmid-Vektor zur Insertion und Expression von HIV-1 env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, flankiert von Vaccinia-DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia HindIII M Region. Die Vektor-DNA enthält das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
Fig. 7 zeigt die Konstruktion von pAbT621, ein Plasmid-Vektor zur Insertion und Expression von HIV-1 env und gag-prot in Vaccinia. pAbT621 enthält das HIV env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors und das HIV gag-prot Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 30K Prormotors. Diese Gene sind von Vaccinia-DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia HindIII M Region flankiert. Die Vektor-DNA enthält das 29K Wirtsbereichs-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.

Genaue Beschreibung der Erfindung

1. Virale Antigene codierende Gene

Gene, die virale Polypeptide SIV oder HIV gag und env codieren, die in der Lage sind, sich selbst zu defekten, nichtselbstvermehrenden Viruspartikeln zusammenzusetzen, können von der genomischen DNA eines RNA- Virus oder von verfügbaren subgenomischen Klonen, die die Gene enthalten, erhalten sein.
Die Genomstruktur von Picornaviren ist sehr gut charakterisiert worden und die Vorgänge bei der Proteinsynthese, die zum Zusammensetzen des Virions führen, sind geklärt (Rueckert, R. in Virology (1985), B. N. Fields et al., eds. Raven Press, New York, Seiten 705-738). In Picornaviren sind die viralen Capsid-Proteine von einem RNA-Genom codiert, das einen einzigen langen Leserahmen enthält, und sind als Teil eines Polyproteins synthetisiert, das zur Gewinnung der reifen Capsid-Proteine von einer Kombination aus zellulären und viralen Proteasen prozessiert ist. Folglich umfassen die für ein Selbstzusammensetzen des Capsids erforderlichen Picornavirus-Gene sowohl die Capsid-Strukturgene als auch die für ihre Reifung erforderlichen viralen Proteasen.
Die Genomstrukturen dieser Viren sind sehr gut beschrieben worden und sind diagrammartig in Fig. 1 dargestellt. Die Genorganisation der beiden Viren ist auffallend ähnlich und Homologe der jeweiligen HIV Strukturgene sind in SIV vorhanden.
Die HIV und SIV gag, Gene codieren die Capsid-Proteine. Ähnlich wie die Picornavirus Capsid-Proteine sind die HIV und SIV gag Proteine als ein Vorläufer-Polypeptid synthetisiert, das anschließend von einer viralen Protease zu reifen Capsid-Polypeptiden prozessiert ist. Allerdings kann das gag Vorläufer-Polypeptid ohne Protein-Prozessing sich selbst zu Virusähnlichen Partikeln zusammensetzen (Gheysen et al., 1988, Modern Approaches to New Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 14.-18. September, Zusammenfassung Nr. 72). Anders als die Picornavirus-Capside sind die HIV und SIV Capside von einer losen membranartigen Hülle umgeben, die die viralen Glycoproteine enthält. Diese sind von dem viralen env Gen codiert.
Die vorliegende Erfindung zeigt die Verwendung von SIV und HIV Genen, die für eine Expression in rekombinanten Viren dieser Erfindung ausgewählt sind. Diese Gene und ihre Protein-Produkte sind in Tabelle 1 grobangegeben. Die drei wichtigsten Virion-Komponenten, die sich von den env, pol und gag Genen ableiten, sind als Vorläufer Polyproteine synthetisiert, die anschließend geschnitten werden, um die reifen Polypeptide zu gewinnen, wie sie in Tabelle 1 angegeben sind. Tabelle 1 SIV und HIV-Gene zur Rekombination im Pockenvirus
a Angegebene Größen gelten für HIV-Proteine; Größen der SIV- Polypeptide dürften geringfügig unterschiedlich sein.
b Teil des gag-pol Produkts.

2. Ausgangsvirus

Mehrere Viren, einschließlich Retroviren, Adenoviren, Herpesviren und Pockenviren sind als lebende virale Vektoren zur Expression von heterologen Antigenen entwickelt worden (Cepko et al., 1984, Cell 37: 1053-1062; Morin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630; Lowe et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3896-3900; Panicali & Paoletti, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931; Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419). Die angeführten Beispiele verdeutlichen die Verwendung der Pockenvirus-Familie. Der bevorzugte Pockenvirus ist das Vacciniavirus, ein relativ harmloses Virus, das jahrelang als Impfstoff gegen Pocken Verwendung fand. Das Vacciniavirus ist zu einem infektiösen eukaryotischen Klonierungsvektor entwickelt worden (Paoletti und Panicali, U. S. Patent, Nr. 4.603.112) und ein rekombinantes Vacciniavirus ist als ein Impfstoff in verschiedenen Versuchssystemen erfolgreich angewandt worden. Das Virus ist als nichtonkogen eingeschätzt, besitzt ein gut untersuchtes Genom und kann große Mengen fremder DNA tragen, ohne an Infektiosität zu verlieren (Mackett, M. und G. L. Smith, 1986, J. Gen. Virol. 67: 2067).

3. DNA-Vektoren für in vivo Rekombination mit einem Ausgangsvirus

Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung werden virale Gene, die Polypeptide codieren, die in der Lage sind, sich zu Viruspartikeln zusammenzusetzen, in das Genom eines Ausgangsvirus derart inseriert, dass sie von diesem Virus gemeinsam mit der normalen Proteinausstattung der Ausgangsviren exprimiert werden. Dies kann zunächst durch Konstruktion eines DNA- Donor-Vektors zur in vivo Rekombination mit einem Ausgangsvirus erreicht werden.
Im Allgemeinen enthält der DNA-Donor-Vektor die folgenden Elemente:
i) einen prokaryotischen Replikationsursprung, so dass der Vektor in einem prokaryotischen Wirt amplifiziert werden kann;
ii) ein Gen, das einen Marker codiert, der eine Selektion prokaryotischer Wirtszellen erlaubt, die den Vektor enthalten (z. B. eine Antibioticaresistenz codierendes Gen);
iii) zwei heterologe virale Gene (d. h. SIV, HIV, env und gag), wobei jedes Gen angrenzend an einen Transcriptionspromotor liegt, der in der Lage ist, die Expression des Gens zu steuern; und
iv) DNA-Sequenzen, die zu der Region des Ausgangsvirus-Genoms homolog sind, wo das/die fremde(n) Gen(e) inseriert wird/werden, die das Konstrukt von Element iii flankieren.
Verfahren zur Konstruktion von Donor-Plasmiden zur Einführung mehrerer Fremdgene in Pockenviren sind in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 910,501, eingereicht am 23. September 1986, mit dem Titel "Pseudorabies Vaccine", beschrieben worden, wobei diese Verfahren hier durch Quellenangabe als eingefügt gelten. Im Allgemeinen können sämtliche viralen DNA- Fragmente zur Konstruktion des Donor-Vektors, einschließlich Fragmente, die Transcriptionspromotoren enthalten, und Fragmente, die zu der Region des Ausgangsvirusgenoms homologe Sequenzen enthalten, in das die Fremdgene inseriert werden sollen, aus genomischer DNA oder klonierten DNA-Fragmenten erhalten werden. Die Donor-Plasmide können mono-, di- oder multivalent sein (d. h. können ein oder mehrere inserierte Fremdgen- Sequenzen enthalten).
Der Donor-Vektor enthält bevorzugt ein zusätzliches Gen, das einen Markier codiert, der eine Identifizierung von rekombinanten Viren mit inserierter fremder DNA erlaubt. Verschiedene Typen Markergene können verwendet sein, die die Identifizierung und Isolierung von rekombinanten Viren erlauben. Diese Marker umfassen Gene, die eine antibiotische oder chemische Resistenz codieren (z. B. siehe Spyropoulos et al., 1988, J. Virol. 62: 1046; Falkner und Moss., 1988, J. Virol. 62: 1849; Franke et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1918) wie auch Gene: wie beispielsweise das E. coli lacZ Gen, das eine Identifizierung von Virus-Plaques mittels kolorimetrischer Messung erlaubt (Panicali et al., 1986, Gene 47: 193-199).
Ein Verfahren zur Selektion von rekombinanten Vacciniaviren beruht auf einer einzigen Vaccinia-codierten Funktion, nämlich dem 29K Wirtsspektrum- Genprodukt (Gillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5573). Dieses Verfahren wurde in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.189, mit dem Titel "Methods of Selecting for Recombinant Pox Viruses", eingereicht am 20. Juni 1988, beschrieben, wobei der Inhalt hier durch Quellenangabe als eingefügt gilt. Zusammengefasst: ein Vacciniavirus, das eine Mutation in dem 29K Gen enthält, das sich in den HindIII K/M Regionen des viralen Genoms befindet, wird als Wirtsvirus für eine in vivo Rekombination verwendet. Die 29K Mutation verhindert das Wachstum auf bestimmten Wirtszellen, zum Beispiel RK13 (Kaninchennieren)-Zellen. Das Donor-Plasmid zur Insertion fremder Gene enthält Vaccinia DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, die mutierte Genfunktion wiederherzustellen; diese Sequenzen steuern ebenfalls die Rekombination an die Stelle des mutierten Gens in der HindIII M Region. Folglich erlangen die rekombinanten Vacciniavirert wieder die Fähigkeit, auf RK13 zu wachsen, und können auf dieser Grundlage von nicht-rekombinanten Ausgangsviren isoliert werden, die nicht auf diesen Zellen wachsen können.
Ein bevorzugter DNA-Vektor zur Rekombination mit dem bevorzugten Vacciniavirus umfasst:
a. einen oder mehrere Transcriptionspromotoren (z. B. die Vaccinia 7,5K, 30K, 40K, 11K oder BamF-Promotoren oder modifizierte Versionen dieser Promotoren), die in der Lage sind, eine Expression angrenzender Gene im Vacciniavirus zu steuern, wobei jeder verknüpft ist mit;
b. einem oder mehreren Strukturgenen, die ein virales Antigen von Interesse codieren, wobei jedes unter der Kontrolle eines Transcriptionspromotors steht;
c. einen Marker zur Selektion des rekombinanten Ausgangsvirus, der umfassen kann:
(1) einen Transcriptionspromotor (z. B. den BamF-Promotor von Vacciniavirus), verknüpft mit einem Gen, das einen selektierbaren Marker codiert (z. B. das E. coli lacZ Gen); oder
(2) Strukturgen-Sequenzen des Ausgangsvirus, die ein virales Wirtsspektrum oder eine andere Viruswachstumsförderungsfunktion wiederherstellen (z. B. das 29K Polypeptid von Vaccinia);
d. DNA-Sequenzen, die zu einer Region des Ausgangsvirus homolog sind und das Konstrukt aus den Elementen a-c flankieren (z. B. die Vaccinia TK oder HindIII M Sequenzen);
e. ein Vektor-Rückgrat zur Replikation in einem prokoryotischen Wirt, einschließlich eines Markers zur Selektion von mit dem Plasmid transformierten Bakterienzellen (z. B. ein Gen, das eine Antibioticaresistenz codiert).

4. Integration fremder DNA-Sequenzen in das Virusgenom und Isolierung der Rekombinanten

Homologe Rekombination zwischen Donor-Plasmid-DNA und viraler DNA in einer infizierten Zelte führt zur Bildung rekombinanter Viren, die die gewünschten Elemente inkorporieren. Geeignete Wirtszellen für in vivo Rekombination sind im Allgemeinen eukaryotische Zellen, die von dem Virus infiziert und vom Plasmid-Vektor transfiziert werden können. Beispiele derartiger Zellen, die für eine Verwendung mit Pockenviren geeignet sind, sind Hühnerembryo-fibroblasten, HuTK143 (humane) Zellen und CV-1 und BSC-40 (beides Affennieren) Zellen. Infektion der Zellen mit Pockenvirus und Transfektion dieser Zeilen mit Plasmid-Vektoren erfolgt mit Verfahren nach Stand der Technik (Panicali und Paoletti, U. S. Patent, Nr. 4.603.112).
Im Anschluss an die in vivo Rekombination können die viralen Nachkommen mit Hilfe verschiedener Verfahren identifiziert werden. Zum Beispiel, falls der DNA-Vektor so gestaltet ist, dass er fremde Gene in das Thymidinkinase (TK) Gen des Ausgangsvirus inseriert, sind die Viren, die integrierte DNA enthalten, TIC und können auf dieser Grundlage selektiert werden (Mackett et al., 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415). Alternativ kann eine Cointegration eines Gens, das ein Marker- oder Indikatorgen codiert, mit dem/den fremden Gen(en) von Interesse, wie es oben beschrieben ist, zur Identifizierung rekombinanter Nachkommen verwendet sein. Ein bevorzugtes Indikatorgen ist das E.coli lacZ Gen: rekombinante Viren, die beta-Galactosidase exprimieren, können unter Verwendung eines chromogenen Substrats für das Enzym selektiert werden (Panicali et al., 1986, Gene 47: 193). Ein zweites bevorzugtes Indikatorgen zur Verwendung mit rekombinantem Vacciniavirus ist das Vaccinia 29K Gen: rekombinante Viren, die die Wildtyp 29K Gen-codierte Funktion exprimieren, können durch Anzucht auf RK13-Zellen selektiert werden.
Wie in den Beispielen noch ausführlich beschrieben, sind monovalente und divaiente Donor-Plasmide, die HIV oder SIV Gene enthalten, entweder in das TK&supmin; Gen oder in der Hindill M Region in Vaccinia rekombiniert worden und rekombinante Viren wurden selektiert, wie oben beschrieben.

5. Charakterisierung der von rekombinanten Viren exprimierten viralen Antigene

Sobald ein rekombinantes Virus identifiziert worden ist, können verschiedene Verfahren zum Testen der Expression des vom inserierten Gen codierten Polypetids verwendet werden. Diese Verfahren umfassen das Schwarze-Plaque-Assay (ein auf viralen Plaques durchgeführtes in situ Enzym-Immungssay), Western Blot Analyse, Radioimmunpräzipitation (RIPA) und Enzym-Immungssay (EIA). Antikörper gegen Antigene, die von viralen Pathogenen exprimiert sind, sind ohne weiteres erhältlich oder können gemäß bekannten Verfahren in der Technik hergestellt sein. Zum Beispiel können Antikörper für humane oder simiane Immundefizienz-Viren (a) für Ausgangsvirus/SIV Rekombinante, Seren von SIV-infizierten Makaken sein; und (b) für Ausgangsvirus/HIV, entweder Seren von HIV-infizierten Humanpatienten oder kommerziell erhältliche monoklonale Antikörper sein, die gegen spezifische HIV-Polypeptide gerichtet sind.

6. Bildung von Viruspartikeln

Die im vorausgehenden Abschnitt beschriebene Expressionsanalyse kann zur Bestätigung der Synthese des von inserierten heterologen viralen Genen codierten Polypeptids eingesetzt sein, die Analyse beantwortet aber nicht die Frage, ob sich diese Polypeptide selbst, in vivo oder in vitro, zu defekten Viruspartikeln zusammensetzen. Zwei Versuchsansätze können zur Beantwortung dieser Sachverhalts durchgeführt werden.
Der erste Versuchsansatz ist die optische Prüfung mittels Elektronenmikroskopie von Lysaten von Zeilen, die mit rekombinanten Viren, die ein oder mehrere Polypeptide codieren, infiziert sind. In den unten angeführten Versuchen führten Vaccinia-Rekombinanten, die gag, env + gag oder env + gag + pol Gene von SIV und/oder HIV exprimieren, zu einer Bildung von defekten retroviralen Partikeln; in Zellen, die mit Rekombinanten infiziert waren, die gag und env Polypeptide coexprimieren, enthielt die Partikelhülle die Hüllglycoproteine, wie es durch das Vorhandensein von von Glycoprotein- "Antennen" auf der Partikeloberfläche gezeigt wurde. Das Vorhandensein retroviraler Hüllglycoproteine auf der Oberfläche der Partikel kann mit der Immunogold Elektronenmikroskopie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen eines der Hüllglycoproteine gerichtet ist, gezeigt werden.
Um die defekten Viruspartikel, die von den virale Polypeptide exprimierenden rekombinanten Viren gebildet sind, noch weiter zu charakterisieren, können diese Partikel mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitszentrifugation aus dem Kulturmedium von Zellen, die mit den rekombinanten Viren in Gegenwart von [³&sup5;S]-Methionin infiziert waren, isoliert werden. Das durch die Zentrifugation des Kulturmediums entstandene Pellet kann resuspendiert werden und sowohl das Pellet als auch der Überstand können mit einem geeigneten Antiserum immunpräzipitiert werden, um die in jeder Fraktion vorhandenen viralen Polypeptide zu analysieren. Zum Beispiel im Falle von HIV oder SIV Polypeptide exprimierenden Rekombinanten können entweder humane anti-HIV Antisera (für Vaccinia/HIV-Rekombinanten) oder Makaken anti-SIV Antisera (für Vaccinia/SIV-Rekombinanten) zur Durchführung dieser Analysen verwendet werden.
Im Falle von rekombinanten Viren, die HIV oder SIV env und gag Polypeptide coexprimieren, enthält das Pellet sowohl Hüll- als auch Kern- Proteine, falls retrovirale Partikel gebildet werden. Wie in den Beispielen beschrieben, enthielt das Pellet, wenn dieser Versuch unter Verwendung von Vaccinia-Rekombinanten durchgeführt wurde, die HIV oder SIV env und gag Polypeptide coexprimieren, sowohl env als auch gag Polypeptide, wie es auch zu erwarten wäre, wenn sich diese Polypeptide zu defekten retroviralen Partikeln zusammensetzen würden. Im Gegensatz dazu enthielt der Überstand nur das Hüllglycoprotein gp120.
Um das Material des durch Zentrifugation des Kulturmediums entstandenen Pellets noch weiter zu charakterisieren, kann das Pellet resuspendiert und in einem Sucrose-Gradienten analysiert werden. Der Gradient kann dann fraktioniert und die Fraktionen mit dem geeigneten Antiserum immunpräzipiert werden. Diese Versuche zeigen, ob das Pellet Material enthält, das bei der Dichte Banden bildet, die für defekte Viruspartikel zu erwarten ist.
Diese Verfahren können ebenfalls zur Bestimmung angewandt sein, ob eine Expression viraler Polypeptide, die von zwei verschiedenen Viren in ein und derselben infizierten Zelle gesteuert ist, zur Produktion von defekten Viruspartikel führt. Zum Beispiel können diese Versuche unter Verwendung von Zellen, die sowohl mit einem ersten gag exprimierenden Rekombinanten als auch einem zweiten env exprimierenden Rekombinanten coinfiziert sind, durchgeführt werden. Von der simultanen Expression von gag und env Polypeptiden in einer einzigen Zelle, gleich ob von einem einzigen divalenten rekombinanten Virus oder von zwei verschiedenen monovalenten Viren, wäre als Ergebnis die Bildung von defekten retroviralen Partikeln zu erwarten, die einen Proteinkern aus gag Polypeptiden enthalten, der von einer Hülle mit Viruscodierten Hüllglycoproteinen umgeben ist.

8. Therapeutische Anwendung von rekombinanten Viren, die virale Antigene mit der Fähigkeit exprimieren, sich zu defekten Viruspartikeln zusammenzusetzen; therapeutische Anwendung von defekten Viruspartikeln, die von diesen rekombinanten Viren gebildet sind

Selbst wenn eine Immunisierung nicht gegen eine Infektion schützen kann, könnte eine Immunisierung eines zuvor infizierten Individuums die Latenzzeit eines solchen Virus im Individuum verlängern. Dieses kann besonders im Falle von Virus-Infektionen wichtig sein, die durch lange Latenzzeiten wie beispielsweise HIV-Infektionen charakterisiert sind. Die lange Inkubationszeit zwischen HIV-Infektion und Ausbruch von klinischem AIDS kann in einer Immunantwort auf die Anfangsinfektion begründet sein, die bei Gesundheit andauert und mit der Krankheit schwindet. Wenn dies der Fall ist, kann eine Verstärkung der Immunantwort durch Immunisierung mit HIV-Antigen/Ausgangsvirus-Rekombinanten, die Retrovirus-ähnliche Partikel bilden, oder alternativ mit den gereinigten Partikeln selbst, den Ausbruch der Krankheit verhindern und die Infektiosität vermindern (Salk, 1987, Nature 327: 473).

BEISPIELE

MATERIAL UND METHODEN

Zellen und Viren

E. coli Stamm MC1061 (Casadaban und Cohen, 1980, J. Mol. Biol. 138: 179) wurde als Wirt für die Anzucht aller Plasmide verwendet. Die Affennieren-Zelllinie BSC-40 (Brockman & Nathans, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 942), die Thymidin-Kinase-defiziente (TK&supmin;) humane Zelllinie Hu143TK&supmin; (Bacchetti und Graham, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 1590) und die Kaninchennieren-Zelllinie RK13 (ATCC #CCL37; Beale et al., 1963, Lancet 2: 640) wurden für Vaccinia-Infektionen und Transfektionen verwendet.
Vacciniavirus Stamm NYCBH (ATCC #VR-325) und 29K&supmin; lacZ+ Stamm vABT33 (siehe U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.189, eingereicht am 10. Juni 1988, der Inhalt gilt hier durch Quellenangabe als eingefügt) wurden als Ausgangsviren zur in vivo Rekombination verwendet.

Enzyme

Restriktionsenzyme wurden von New England BioLabs oder Boehringer- Mannheim bezogen. Das große DNA-Polymerase-Fragment (Klenow) wurde von United States Biochenical Corp., T4 DNA-Polymerase wurde von New England BioLabs und T4 DNA-Ligase wurde von Boehringer-Mannheim bezogen.

Molekulare Klonierungsverfahren

Restriktionsenzymverdaue, Reinigung von DNA-Fragmenten und Plasmiden, Behandlung von DNA mit Klenow, T4 DNA-Polymerase, Ligase oder Linker und Transformation von E. coli wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ny, 1982, gilt hier durch Quellenangabe als eingefügt) durchgeführt.
Oligonucleotid-Mutagenese wurde unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide durchgeführt, die vom Biology Department, Brandeis University, erhalten wurden, mit Reagenzien von Amersham, die gemäß Herstellerangaben eingesetzt wurden.

Herstellung von Vacciniavirus-Rekombinanten

Virus-Infektion, Tranfektionen, Plaque-Reinigung und Virus-Vermehrung wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Spyropoulos et al., 1988, J. Virol. 62: 1046) durchgeführt. 29K+ Rekombinanten wurden auf RK13-Zellen selektiert und gereinigt (siehe U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.189, eingereicht am 10. Juni 1988, der Inhalt gilt hier durch Quellenangabe als eingefügt). TK&supmin; Rekombinanten wurden in Gegenwart von 50 uM Bromdesoxyuridin selektiert und gereinigt.

Genomische Analyse des Vacciniavirus

DNA wurde von Virus-infizierten Zellen extrahiert, wie beschrieben (Esposito et al., J. Virol. Methods 2: 175) und mittels Restriktionsenzymverdaus und Southern Hybridisierung analysiert, wie beschrieben (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ny, 1982).

Protein-Analyse

Schwarze-Plaque-Assay und Immunpräzipitationsanalyse wurden im Wesentlichen wie in (Smith et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7155 und Wittek et al., 1984, J. Virol. 49: 371); siehe ebenfalls U. S. Patentanmeldung, Nr. 910.501, eingereicht am 23. September 1986, gilt hier durch Quellenangabe als eingefügt, beschrieben, durchgeführt. Für Schwarze- Plaque-Assay und Immunpräzipitationsassay wurde polyklonales Makaken- Antiserum gegen ganzes SIV oder humanes Antiserum gegen ganzes HIV verwendet. Zur Immunpräzipitationsanalyse wurden Vaccinia-infizierte Zellen entweder mit [³H]-Glucosamin oder [³&sup5;S]-Methionin markiert.

Biochemische Analyse von rekombinantes Vaccinia-gesteuerter Retroviruspartikel-Bildung

BSC-40 Zellen, die mit Wildtyp oder rekombinantem Vacciniavirus infiziert waren, wurden mit [³&sup5;S]-Methionin unter Verwendung derselben Markierungsprozedur wie für die Immunpräzipitationsanalyse markiert. Nach 16-18 Stunden wurde das Medium von den infizierten Zelten gesammelt und mittels Zentrifugation mit 1000 UpM 5 Minuten geklärt. Der resultierende Überstand wurde bei 24K 90 Minuten in einem SW28 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das resultierende Pellet wurde in 3 ml PBS- Puffer (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;) resuspendiert. Proben von Überstand und Pellet wurden einer Immunpräzipitationsanalyse unter Verwendung von Makaken anti-SIV Antiserum oder humanem anti-HIV Antiserum unterzogen, wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist.

Analyse von rekombinantes Vaccinia-gesteuerter Retroviruspartikel-Bildung mittels Elektronenmikroskopie

BSC-40 Zellen wurden 16-18 Stunden mit Wildtyp oder rekombinantem Vacciniavirus mit einer Multiplizität von 10 infiziert, wie oben beschrieben. Das Medium wurde dann entfernt und die infizierten Zellen wurden zweimal in 0,2% Gelatine haltigem PBS-Puffer gewaschen.
Für die Immunogold-Färbung wurden die Proben in 10% Ziegenserum in PBS/Gelatine 30 Minuten bei 4ºC vorinkubiert, dann mit dem geeigneten, in PBS/Gelatine verdünnten Antikörper 60 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann zweimal in PBS/Gelatine gewaschen und mit einer 1 : 20 Verdünnung von mit Gold (5 nm) konjugiertem Ziege anti-Maus IgG in PBS mit 1% fötalem Kälberserum, 0,1% Natriumazid und 5% humanem Antikörperserum 60 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden erneut in PBS/Gelatine gewaschen.
Unbehandelte oder Immunogold-gefärbte Zellen wurden in 0,25% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer (pH 7,2) übernacht fixiert, dann in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer (7,2) zweimal gewaschen. Die Proben wurden dann in 1% OsO&sub4;/0,1 M Kakodylat-Puffer (pH 7,2) 1¹/&sub2; Stunden fixiert und dann zweimal in 0,1 M Kakodylat-Puffer (pH 7,2) gewaschen. Die Proben wurden dann in den folgend konzentrierten Alkohollösungen jeweils 10 Minuten dehydriert: 50. 70. 80, 95, 100 (3X). Die Proben wurden dann zweimal für je 5 Minuten mit Propylenoxid, dann übernacht in nicht verschlossenen Gefäßen in Propylenoxid (4 Teile)/Epox812 (6 Teile) behandelt. Die Proben wurden dann in Epox812 eingebettet und 36 Stunden aushärten gelassen.
Schnitte wurden mit einem Sorval Porter Blum MT-2 Ultramikrotom mit 1000 Å hergestellt, mit alkoholischem Uranylacetat und Satos Bleifärbung (Sato, T., 1968, J. Elect. Mic. (Japan) 17: 158-159) gefärbt und auf einem JEOL Elektronenmikroskop betrachtet.

BEISPIEL 1: Konstruktion von SIV-Gene enthaltenden rekombinanten Plasmiden

Dieses Beispiel illustriert die Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, die SIV-Gene enthalten, zur in vivo Rekombination mit Vacciniavirus (in vivo Rekombinationsvektoren (IVR)). Die Konstruktion und Struktur der Plasmide pAbT4532B, pAbT4533, pAbT4536, pAbT4537, pAbT4574, pAbT4578, pAbT4582B, pAbT4583 und pAbT4589 sind in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.454, eingereicht am 10. Juni 1988, beschrieben. Die Konstruktion und Struktur von Plasmid pAbT4027 ist in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 910.501, eingereicht am 23. September 1986, beschrieben. Die Konstruktion und Struktur von Plasmid pAbT4587 ist in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 229.343, eingereicht am 5. August 1988, beschrieben. Die Inhalte der oben erwähnten Patentanmeldungen gelten durch Quellenangabe als hier eingefügt.
pAbT4592 (Fig. 2): pAbT4578 (siehe U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.454, eingereicht am 10. Juni 1988) wurde mit KpnI und EcoRI verdaut, und ein 2221 Basenpaar (bp) Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde an pAbT4587 ligiert, das zuvor mit KpnI und EcoRI verdaut worden war, um das Plasmid pAbT4592 zu ergeben. pAbT4592 ist ein Vektor für die Insertion und Expression von SIVmac251 gag und Protease in Vacciniavirus. pAbT4592 enthält das gag-Brot Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, flankiert von Vaccinia HindIII M-Region. Die Vektor-DNA umfasst das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und ein Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
pAbT4593 (Fig. 3): pAbT4574 (U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.454) wurde mit BamHI verdaut und ein 2589 bp Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde an pAbT4587 ligiert, das zuvor mit BamHI verdaut und mit Kälber alkalischer Phosphatase (CIP) behandelt worden war, um das Plasmid pAbT4593 zu ergeben. pAbT4593 ist ein Vektor für die Insertion und Expression von SIVmac251 env in Vacciniavirus. pAbT4593 enthält das env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, flankiert von Vaccinia- DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia Hindill M-Region. Die Vektor-DNA umfasst das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia- Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und ein Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.
pAbT4593 (Fig. 4): pAbT4578 (U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.454) wurde mit SacI verdaut und die verdaute DNA wurde zunächst mit T4 DNA- Polymerase und dann mit CIP behandelt. pabT4589 wurde mit SphI verdaut und dann mit T4 DNA-Polymerase behandelt und schließlich mit SmaI verdaut. Ein 2750 bp Fragment wurde von dem verdauten pAbT4589 isoliert; dieses Fragment wurde an das SacI verdaute pAbt4578 ligiert, um pAbT4597 zu erhalten. pAbT4597 ist ein Vektor für die Insertion und Expression von SIVmac251 env und gag-prot in Vacciniavirus. pAbT4597 enthält das gag- prot Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 30K Promotors und das env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors. Diese Gene sind von Vaccinia-DNA zur Steuerung der Rekombination in die Vaccinia HindIII M- Region flankiert. Die Vektor-DNA umfasst das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und ein Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.

BEISPIEL 2: Konstruktion von HIV-Gene enthaltenden rekombinanten Plasmiden

pSVHenv und pBF128 sind Plasmide, die Teile des HIV-1 Stamm B10- Genoms enthalten; diese wurden von E. I. DuPont de Nemours and Company erhalten, pHXBc2 ist ein Plasmid, das Teile des HIV-1 Stamm HSB2-Genoms enthält, dieses Plasmid wurde von Dr. Joseph Sodroski von der Harvard Medicin School erhalten. Die Konstruktion und Struktur der Plasmide pAbT4532B und pAbT4554 sind in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.454, eingereicht am 10. Juni 1988, beschrieben. Die Konstruktion und Struktur von Plasmid pAbT4007 ist in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 910.501, eingereicht am 23. September 1986, beschrieben. Die Inhalte der oben erwähnten Patentanmeldungen gelten durch Quellenangabe als hier eingefügt.
PAbT164 (Fig. 5): Plasmid pBF128 wurde mit NcoI und BamHI verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt; ein das HIV- 1 gag Gen enthaltendes 1700 bp Fragment wurde aus diesem Verdau isoliert.
Dieses Fragment wurde an Plasmid pAbT4532B ligiert, das mit SmaI verdaut und CIP behandelt worden war, um das Plasmid pAbT164 zu ergeben.
pAbT164 ist ein Vektor für die Insertion und Expression von HIV-1 gag, in Vaccinia. pAbT164 enthält das HIV gag Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 7,5K Promotors, die Vaccinia TK-Gen flankierenden DNA-Regionen zur Steuerung der Rekombination in Vaccinia, das lacZ Gen unter der Kontrolle des Vaccinia BamF Promotors zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.

pApT4603 (Fig. 6)

Plasmid pSVHenv wurde mit XbaI und XhoI verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt; ein das HIV-1 env Gen enthaltendes 2700 bp Fragment wurde aus diesem Verdau isoliert. Dieses Fragment wurde an Plasmid pAbT4007 ligiert, das zuvor mit SmaI verdaut und mit CIP behandelt worden war, um das Plasmid pAbT167 zu ergeben.
pAbT167 wurde mit KpnI und XbaI verdaut und ein das 5'-Ende des HIV-1 env Gens enthaltendes 225 bp Fragment wurde aus diesem Verdau isoliert. Dieses Fragment wurde an m13mp18 Bakteriophagen DNA (New England BioLabs) ligiert, die zuvor mit XbaI und KpnI verdaut und mit CIP behandelt worden war, um pAbT220 herzustellen. Das 5'-Ende des env Gens wurde modifiziert, um den größten Teil der 5' nicht-codierenden Sequenzen durch eine Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese zu entfernen, wie es in Material und Methoden beschrieben ist. Unter Verwendung des Oligonucleotids 5'-GAAAGAGCAGTAGACAGTGG-3' (Biology Department, Brandeis University) wurde eine AccI-Stelle ungefähr 10 bp stromaufwärts vom ATG Initiationscodon der env codierenden Sequenz eingefügt, um pAbT221 zu konstruieren. pAbT221 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und ein ungefähr 230 bp Fragment wurde isoliert. Dieses wurde an das Plasmid pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11: 1645) ligiert, das zuvor mit EcoRI und HindIII verdaut und mit CIP behandelt worden war, um das Plasmid pAbT8536 zu ergeben.
pAbT8536 wurde mit AccI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase behandelt und dann mit KpnI verdaut. Ein 138 bp Fragment, das die mutagenisierte 5' nicht-codierende Region des env Gens enthielt, wurde aus dem Verdau isoliert. Das Plasmid pAbT167 wurde mit KpnI und SacI verdaut und ein 2461 bp Fragment, das den größten Teil der env Gen- Sequenz enthielt, wurde isoliert. Das 138 bp Fragment von pAbT8536 und das 2461 Fragment von pAbt167 wurden an pAbT4554 ligiert, das zuvor mit SmaI und SacI verdaut und mit CIP behandelt worden war, um das Plasmid pAbT8539 zu ergeben.
pAbT8539 wurde mit EcoRI verdaut und ein das env Gen enthaltendes 2682 bp Fragment wurde isoliert. Dieses wurde an pAbT4587 ligiert, das zuvor mit EcoRI verdaut und mit CIP behandelt worden war, um das Plasmid pAbT4603 zu gewinnen.
pAbT4603 ist ein Vektor für die Insertion und Expression von HIV-1 env in Vacciniavirus. pAbT4603 enthält das env Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, flankiert von Vaccinia-DNA für die Steuerung der Rekombination in die Vaccinia HindIII M Region. Die Vektor-DNA umfasst das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia-Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und ein Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.

pAbT621 (Fig. 7)

7A. Konstruktion von Plasmid pAbT598 (Fig. 7a).

Ein von pHXBc2 (Sodroski et al., Nature 322: 470 (1986)) abstammendes Plasmid wurde mit BgII und SacI verdaut, wobei ein Fragment, das den Nucleotid-Positionen 715-6002 entspricht, freigesetzt wurde. Diese DNA wurde dann mit T4 DNA-Polymerase behandelt. Das die HIV-1 gag, und pol Gene enthaltende 5287 bp Fragment wurde aus diesem Verdau isoliert und an pAbT4536 ligiert, das zuvor mit SmaI verdaut und mit CIP behandelt worden war, um das Plasmid pAbT599 zu gewinnen.
pAbT599 wurde mit NdeI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase behandelt, dann weiter mit BgIII verdaut und ein 3027 bp Fragment wurde aus diesem Verdau isoliert. Dieses Fragment wurde an ein 8864 bp Fragment ligiert, das nach Verdau von pAbT164 mit KpnI isoliert wurde, mit T4 DNA-Polymerase behandelt urd weiter mit BgIII verdaut, um Plasmid pAbT598 zu gewinnen.

B. Konstruktion von pAbT629 (Fig. 7b)

pAbT4603 wurde mit PstI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase behandelt, und weiter mit SalI verdaut und ein aus diesem Verdau resultierendes 6326 bp Fragment würde isoliert. pAbT598 wurde mit BamHI und Ball verdaut und ein 1838 bp Fragment wurde isoliert. pAbT4554 wurde mit SalI und BamHI verdaut und ein 420 bp Fragment wurde isoliert. Diese drei Fragmente wurden zusammen ligiert, um pAbT621 zu bilden
pAbT621 ist ein Vektor für die Insertion und Expression von HIV-1 env undarot in Vaccinia. pAbT621 enthält das HIV env Gen unter der-Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors und das SIV gag-prot Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 30K Promotors. Diese Gene sind von Vaccinia-DNA für die Steuerung der Rekombination in die Hindill M Region flankiert. Die Vektor-DNA umfasst das 29K Wirtsspektrum-Gen zur Selektion von Vaccinia- Rekombinanten und ein bakterielles Replikon und ein Ampicillinresistenz-Gen zur Anzucht und Selektion in E. coli.

BEISPIEL 3: Konstruktion von rekombinanten Vacciniaviren, die HIV-1 oder SIVmac251 Gene unter der Kontrolle von Vaccinia-Promotoren enthalten

Die in vivo Rekombination ist ein Verfahren, mit dem rekombinante Vacciniaviren erzeugt werden (Nankano et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1593; Paoletti und Panicali, US. Patent, Nr. 4.603.112). Diese rekombinanten Viren sind durch Transfizieren von Zeilen, die mit Vacciniavirus infiziert worden sind, mit DNA, die die Gene von Interesse enthält, gebildet. Ein kleiner Prozentsatz der Virus-Nachkommen enthält das Gen von Interesse in einer bestimmten Stelle im Vaccinia-Genom integriert. Diese rekombinanten Viren können Gene fremden Ursprungs exprimieren (Paoletti und Panicali, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927; Panicali et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5364).
Um SIVmac251 oder HIV-1 Gene in das Vacciniavirus-Genom in der HindIII M Region zu inserieren, wurde ein auf dem 29K Wirtsspektrum-Gen, das sich in dieser Region befindet, basierendes Selektionsschema angewandt (Gillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5573). Rekombinantes Vacciniavirus vAbT33 enthält das lacZ Gen anstatt eines Teils des 29K Gens. Diese lacZ Insertion zerstört die Funktion des 29K Gens; deshalb kann vAbT33 nicht auf RK13-Zellen wachsen, die das 29K Genprodukt benötigen. Außerdem bildet vAbT33 blaue Plaques auf permissiven Zellen bei Vorhandensein des chromogenen Substrats für beta-Galactosidase, Bluogal, auf Grund des Vorhandenseins des lacZ Gens. Siehe U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.189, eingereicht am 10. Juni 1988.
IVR-Vektoren pAbT4592, pAbT4593, pAbT4597, pAbT4603 und pAbT621 wurden in BSC-40-Zellen transfiziert, die mit Vacciniavirus vAbT33 infiziert worden waren (siehe Material und Methoden). Rekombinante Viren wurden als weiße Plaques bei Vorhandensein von Bluogal auf RK13-Zellen selektiert. Plaques wurden gepickt und gereinigt und es wurde mittels Southern-Analyse gezeigt, dass sie das/die geeignete(n) SIVmac251 oder HIV-1 Gen(e) enthalten: vAbT252 enthält SIV gag-prot; vAbT271 enthält HIV- 1 env; vAbT253 enthält SIV env; vAbT264 enthält sowohl SIV env als auch SIV gag-prot; und vAbT344 enthält HIV-1 env und gag-rot.
Um SIVmac251 oder HIV-1 Gene in das Vacciniavirus-Genom in den TK-Locus zu inserieren, der sich in der HindIII J Region befindet, wurde ein Selektionsschema angewandt, das auf der Empfindlichkeit der TK&spplus; Viren auf Bromdesoxyuridin (BudR) basiert. Bromdesoxyuridin wirkt auf TK&spplus; Viren letal, erlaubt aber TK&supmin; Viren das Wachstum. Plasmide für eine in vivo Rekombination werden deshalb in Hu143TK&supmin; Zellen, die mit einem TK&spplus; Vacciniavirus infiziert worden sind, transfiziert (siehe Material und Methoden).
Zusätzlich enthalten die Plasmid-Vektoren zur Insertion in TK das E. coli lacZ Gen unter der Kontrolle des Vaccinia BamF-Promotors; rekombinante Viren, die das/die gewünschte(n) Fremdgen(e) enthalten, enthalten ebenfalls das lacZ Gen und bilden deshalb blaue Plaques, wenn sie in Gegenwart des chromogenen Substrats für beta-Galactosidase, Bluogal, vermehrt werden. Folglich werden rekombinante Viren in BudR selektiert und bleiben weiterhin als blaue Plaques in Gegenwart von Bluogal identifizierbar.
Um ein rekombinantes Vacciniavirus zu konstruieren, das das HIV-1 gag Gen in dem TK-Locus inseriert enthält, wurde das Wildtyp NYCBH-Virus als Ausgangsvirus für eine in vivo Rekombination mit Vektor pAbT164 verwendet, um das rekombinante Virus vAbT141 zu bilden.
Um ein rekombinantes Vacciniavirus zu konstruieren, das die SIVmac251 env, gag-prot und ool Gene enthält, wurde vAbT264 als Ausgangsvirus für eine in vivo Rekombination mit pAbT4583 verwendet, ein IVR-Vektor, der das SIVmac251 pol Gen unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, flankiert von zum Vaccinia TK-Gen homologer DNA, enthält. Dieser Vektor ist in der U. S. Patentanmeldung, Nr. 205.454, eingereicht am 10. Juni 1988, beschrieben. Dies ergab den rekombinanten Virus vAbT277, der das SIVmac251301 Gen, inseriert im TK-Locus unter der Kontrolle des Vaccinia 40K Promotors, und die SIVmac251 env und gag-prot Gene unter der Kontrolle der 40K beziehungsweise 30K Vaccinia-Promotoren in dem HindIII M Locus inseriert enthält.

BEISPIEL 4: Schwarze-Plaque-Assay auf Expression von SIV oder HIV-1 Antigenen in rekombinantem Vacciniavirus.

Das Schwarze-Plaque-Assay, das bereits in Material und Methoden beschrieben ist, ist ein in situ Enzym-basiertes Immunoassay, das von Vaccinia-infizierten Zellen exprimiertes, Protein detektieren kann. Dieses Assay wurde mit Vaccinia-Rekombinanten vAbT252, vAbT253, vAbT264 und vAbT277 unter Verwendung von Serum von SIV-infizierten Makaken, das von Ronald C. Desrosiers (New England Regional Primate Research Center, Southborough, MA) zur Verfügung gestellt wurde, und mit vAbT141 und vAbT344 unter Verwendung von Serum von HIV 1 infizierten Humanpatienten, das von John Sullivan (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) zur Verfügung gestellt wurde, durchgeführt.
Plaques, die von den negativen Kontrollviren NYCBH oder vAbT33 gebildet wurden, zeigten nur eine Hintergrundfärbung, die mit dem Hintergrund der Zellmonolayer selbst übereinstimmte. Plaques, die von Vaccinia-Rekombinanten vAbT252, vAbT253, vAbT264, vAbT277, vAbT141, vAbT271 und vAbT344 zeigten eine deutlich dunkel purpurne Färbung, die wesentlich dunkler als der Hintergrund der Zellmonolayer war, was zeigt, dass diese Rekombinanten SIVmac251 oder HIV-1 Antigene stark exprimieren.

BEISPIEL 5: Immunpräzipitation von SIVmac251 oder HIV-1 Antigenen von rekombinanten Vacciniaviren.

Immunpräzipitationsanalyse wurde mit Zellen, die mit rekombinanten Vacciniaviren vAbT252, vAbT253, vAbT223, vAbT264, vAbT277, vAbT141, vAbT271 und vAbT344 infiziert waren, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Die in Tabelle 1 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass jede dieser Vacciniarekombinante das/die codierte(n) Polypeptid(e) exprimiert. TABELLE 1 Immunpräzipitation von SIVmac251 oder HIV-1 Polypeptiden von rekombinanten Vacciniaviren

BEISPIEL 6: Biochemische Detektion von retroviralen Partikeln, die von SIV oder HIV-Antigene exprimierenden Vaccinia-Rekombinanten gebildet sind

Die in Beispiel 5 beschriebene Expressionsanalyse kann zur Bestätigung der Synthese von Polypeptiden, die von inserierten HIV oder SIV Genen codiert sind, herangezogen werden, die Analyse beantwortet aber nicht die Frage, ob sich diese Polypeptide sich in vivo zu defekten Viruspartikeln selbst zusammensetzen. Als eine Möglichkeit der Bestimmung, ob Vaccinia-Rekombinanten, die env oder gag-prot oder sowohl env als auch gag-prot, exprimieren, in das Medium infizierter Zellen freigesetzte Retrovirus-ähnliche Partikel bilden, wurde das Medium auf das Vorhandensein von Strukturen untersucht, die env und/oder gag Polypeptide enthalten, die durch Zentrifugation pelletiert werden können. BSC-40 Zellen wurden mit SIV/Vaccinia- Rekombinanten vAbT253 (env), vAbT252 (gag-prot) oder vAbT264 (env und gag-prot oder mit HIV/Vaccinia-Rekombinanten vAbT141 (gag), vAbT271 (env) oder vAbT344 (env und gag-prot) infiziert. Infizierte Zellen wurden mit [³²S]-Methionin markiert, wie in Material und Methoden beschrieben. Nach 16- 18 stündiger Infektion wurde das Medium gesammelt und mittels Zentrifugation mit 1000 UpM 5 Minuten geklärt. Der resultierende Überstand wurde entfernt und einer Zentrifugation bei 24K 90 Minuten in einem 8W28 Rotor unterzogen. Der Überstand wurde dann entfernt und das resultierende Pellet wurde in 1 ml PBS-Puffer (13 mM NaCl; 2,7 mM KCl, 8,1 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;) resuspendiert. Die Proben aus Überstand und Pellet wurden einer Immunpräzipitationsanalyse unter Verwendung von Makaken anti-SIV Antiserum für SIV/Vaccinia-Rekombinanten oder humanem anti-HIV Antiserum für HIV/Vaccinia-Rekombinanten unterzogen, wie es in Material und Methoden beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigten, dass bei env und gag-prot Rekombinanten vAbT264 und vAbT344, während der Überstand nur gp120 enthielt, das vermutlich in das Kulturmedium während des Wachstums der SIV/Vaccinia-Rekombinanten abgegeben worden war (Kieny et al., 1986, Bio/Technology, 4: 790), das Pellet nicht nur gp120, sondern ebenfalls das vom env Gen codierte gp32 (bei vAbT264) oder gp41 (bei vAbT344) wie auch die vom gag Gen codierten p55, p40, p24 und p15 enthielt. Diese Ergebnisse lassen überzeugend vermuten, dass die von rekombinanten Vaccinia produzierten env und gab Proteine sich selbst zu Partikeln oder Komplexen zusammensetzen.
Für vAbT141 und vAbT252, die nur die HIV gag oder beziehungsweise SIV gag-prot Proteine codieren, enthielt das pelletierte Material gag, Proteine, was mit der Bildung nichtreifer Viruspartikel durch die Selbstzusammensetzung von gag Polypeptiden übereinstimmt. Im Gegensatz dazu wurde bei vAbT253 und vAbT271, die nur die SIV oder beziehungsweise HIV env Glycoproteine exprimieren, keine immunpräzipierbaren Polypeptide im Pellet vorgefunden, obwohl wesentliche Mengen an gp120 im Überstand gefunden wurden. Die Ergebnisse stimmten mit der Vorhersage überein, dass die Bildung defekter Viruspartikel nur dann erfolgt, wenn die gag Polypeptide, allein oder gemeinsam mit weiteren viralen Strukturpolypeptiden, wie beispielsweise den env Glycoproteinen, exprimiert sind.

BEISPIEL 7: Demonstration der Bildung retroviraler Partikel von rekombinanten Vacciniaviren, die SIV oder HIV-1 Polypeptide exprimieren, mittels Elektronenmikroskopie

Als eine zusätzliche Bestätigung, dass die von rekombinanten Vacciniaviren exprimierten gag, gag + env oder gag + env + pol Polypeptide in der Lage sind, sich selbst zu Retrovirus-ähnlichen Partikeln zusammenzusetzen, wurden Lysate von Zellen, die mit diesen rekombinanten Vacciniaviren infiziert waren, optisch mittels Elektronenmikroskopie mit Hilfe von Methoden geprüft, die im obigen Abschnitt Material und Methoden detailliert beschrieben sind.
Diese Versuche zeigten, dass Vaccinia-Rekombinanten, die gag, (vAbT141 oder vAbT252), env + gag (vAbT223, vAbT264 oder vAbT344) oder env + gag + hol (vAbT277) Gene exprimieren, zur Bildung von Retroviruspartikeln mit Hülle führen; beiden Rekombinanten, die gag und env Polypeptide coexprimieren (vAbT223, vAbT264, vAbT344 und vAbT277), enthält die Partikelhülle die Hüllglycoproteine, wie es durch das Vorhandensein von Glycoprotein"antennen" auf der Partikeloberfläche gezeigt wurde. Bei der SIV-Rekombinante vAbT223 wurde das Vorhandensein von SIV- Hüllglycoproteinen auf der Partikeloberfläche mittels Immunogold Elektronenmikroskopie unter Verwendung eines gegen eines der Hüllglyoproteine gerichteten Antikörpers ebenfalls gezeigt.

Hinterlegung der Plasmide

Die Plasmide E. coli MC1061 pAbT4597 und E. coli MC1061 pAbT621 wurden unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection in Rockville, MD, am 31. Mai 1989 hinterlegt. Die Plasmide erhielten die Hinterlegungsnummer 67998 beziehungsweise 67999.

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt oder ist in der Lage, viele Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungsformen der hier beschriebenen Erfindung unter Anwendung ausschließlich von Routineexperimente festzustellen. Derartige Entsprechungen sind von den folgenden Ansprüchen beabsichtigterweise umfasst.

Anhang M3

Mikroorganismen

Mit Bezug auf die Bestimmungen, mit denen ein Europäisches Patent beantragt ist, informiert hiermit der Anmelder das Europäische Patentamt unter der Europäischen Regel 28(4), dass bis zur Veröffentlichung der Bekanntgabe der Erteilung des Europäischen Patents oder bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Europäische Patentanmeldung zurückgewiesen oder zurückgezogen worden ist oder als zurückgezogen gilt, die Verfügbarkeit des bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 67998 hinterlegten biologischen Materials nur durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt ist, der vom Antragsteller gemäß der Europäischen Regel 28(5) benannt ist.

Claims

1. Ein rekombinanter Pockenvirus-Vektor, der ein Gen, das ein SIV oder HIV reifes Hüllpolypeptid codiert, und ein Gen, das ein SIV oder HIV reifes gag Polypeptid codiert, coexprimiert, wodurch die coexprimierten Polypeptide sich selbst zu defekten sich nichtselbstvermehrenden Lentivirus-Partikeln mit Hülle zusammensetzen.

2. Ein rekombinanter Pockenvirus-Vektor, der ein Gen coexprimiert, das einen hinreichenden Teil des SIV oder HIV Hüllpolypeptid codierenden Gens und einen hinreichenden Teil eines ein SIV oder HIV gag Polypeptid codierenden Gens codiert, um ein defekten sich nichtselbstvermehrenden Lentivirus-Partikel mit Glycoprotein-Spitzen auf seiner Oberfläche zu bilden.

3. Der Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der ebenfalls ein Gen coexprimiert, das ein lentivirales Enzym-Polypeptid mit den lentiviralen Hüll- und Strukturpolypeptiden codiert.

4. Der Vektor nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, der ein Vaccinia-Virus ist.

5. Verwendung des Vektors nach einem der vorausgehenden Ansprüche, um ein defektes sich nichtselbstvermehrendes Lentivirus-Partikel in vitro herzustellen.