FI94876B - Menetelmä aprotiniinin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja menetelmään soveltuva DNA, ilmentämisplasmidi ja isäntäsolu - Google Patents

Description

1 94876

Menetelmä aprotiniinin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tek-niikalla ja menetelmään soveltuva DNA, ilmentämisplasmidi ja isäntäsolu 5 Tämä keksintö koskee aprotiniinin tai sen funktio- naalisesti vastaavan homologin tuottamista yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla.

Tässä esitetään edelleen kemiallisesti syntetisoituja DNA-molekyylejä jotka koodittavat uusia aprotiniini-10 polypeptidejä tai aprotiniinin homologeja, joilla on aprotiniinin tai aprotiniinin homologien biologinen aktiivisuus. Keksintö koskee edelleen tätä DNA:ta sisältäviä il-mentämisplasmideja ja niillä transformoituja bakteeri-isän-täsoluja.

15 Aprotiniini on tunnettu peptidi, joka sisältää 58 aminohappoa ja jolla on trypsiiniä, kymotrypsiiniä, plas-miinia ja kallikreiinia inhiboiva vaikutus. Se on naudan elimistä peräisin oleva tärkeä proteinaasien inhibiittori,

A

ja siitä on tullut arvokas lääke, nimeltä Trasylol , eri-20 laisten sairauksien, kuten esimerkiksi hyperfibrinolyytti-sen verenvuodon ja loukkautumisverenvuotosokin hoidossa (katso katsausjulkaisusta H. Fritz ja G. Wunderer, 1983, Drug. Res., 33, 479-494).

Jokin aika sitten on osoitettu, että aprotiniinin 25 homologit, joilla on asemassa 15 lysiinin asemesta muita aminohappoja, ovat arvokkaita proteinaasien inhibiittorei-ta, joilla on muuttuneita vaikutuksia ja tehokkuuksia verrattuna aprotiniiniin (DE-OS 3 339 693; H.R. Wenzel et ai. 1985 teoksessa Chemistry of Peptides and Proteins, osa 3). 30 Näillä aprotiniinin homologeilla on voimakkaita inhiboivia vaikutuksia haimasta ja leukosyyteistä peräisin oleviin elastaaseihin ja katepsiini G:hen.

Tällaisia aprotiniinin homologeja voidaan käyttää sairauksien hoidossa, kun vapautuu ylenmäärin haiman elas-35 taasia (haimatulehdus), seerumin elastaasia (valtimonkove-tustauti), leukosyyttien elastaasia äkillisissä ja pitkä-. aikaisissa tulehduksissa, joihin liittyy sidekudoksen vau- 2 94876 rioituminen, verisuonten seinämien vaurioissa, kuoliosai-rauksissa ja keuhkokudoksen rappeutumisessa. Yhtä tärkeää osaa esittävät lysosomaaliset entsyymit, erityisesti leukosyyttien elastaasi, tulehdusreaktioissa, jotka johtuvat im-5 munologisista prosesseista, esimerkiksi nivelreumassa.

Vaikka aprotiniinia ja aprotiniinin homologeja voidaan saada naudan elimistä ja muuttamalla puolisynteettisestä naudasta peräisin olevaa trypsiinin inhibiittoria (Tschesche, M., Wenzel, M., Schmuck, R., Schnabel, E., 10 Offenlegungsschrift DE 3 339 693 AI vom 15.5.85), ovat saannot suhteellisen pieniä.

Tajuttiin, että yhdistelmä-DNA:n ja asiaankuuluvien tekniikkojen käyttö olisi tehokas tapa tuottaa tarvittavia suuria määriä korkealaatuisia aprotiniinin homologeja. Pää-15 määränä oli tuottaa biologisesti aktiivisia aprotiniinin homologeja yhdistelmä-DNA-tekniikan tuotteina isäntäorga-nismin avulla.

Nyt tunnetaan menetelmiä vieraslajisen DNA:n ilmentämiseksi mikro-organismissa.

20 DNA, joka koodittaa tunnetun aminohappojärjestyksen omaavia polypeptidejä, voidaan valmistaa käyttämällä geno-min DNA-sekvenssiä, cDNA-sekvenssiä, joka on komplementaarinen mRNArlle, tai valitsemalla kodonit geneettisen koodin mukaan ja valmistamalla synteettinen geeni.

25 Naudan haiman trypsiini-inhibiittorin geenin naudan genomi-kloonin osittaisen DNA-sekvenssin ovat kloonanneet S. Anderson ja I. B. Kingston, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 6838-6842, luonnehtiakseen BPTI:n genomiperäistä kloonia.

30 Suurempi kappale naudan genomista, joka koodittaa ! BPTI:n ja naudan pernan inhibiittorin II, on jokin aika sitten sekvenssoitu ja julkaistu Kingstonin, I.B. ja Andersonin, S. toimesta, 1986, Biochem. J. 233, 443-450.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota uutta ap-35 rotiniinia tai aprotiniinihomologeja koodittavia nukleiinihappoja, nukleiinihapot sisältäviä vektoreita ja soluja, . jotka on transformoitu niillä, ja menetelmä uuden aproti niinin tai aprotiniinihomologien saamiseksi.

3 94876 Tätä tarkoitusta varten oli edullisinta valita ko-donit oikean rakenteen omaavien synteettisten geenien valmistamiseksi, joiden laaja käyttö vaikuttaa mahdolliselta.

Näin on asianlaita etenkin, kun rakennetaan syn-5 teettinen perusgeeni, joka sisältää restriktioentsyymien ainoihin tunnistuskohtiin päättyviä DNA-lohkoja tai kasetteja. Tällainen geenin rakenne mahdollistaa kaikkien sellaisiin DNA-lohkoihin sisältyvien DNA-sekvenssien helpon muuntelun tai mutatoinnin.

10 Valmistettiin aprotiniinin homologeja yhdistelmä- DNA-teknologian avulla. Keksinnön mukaiselle menetelmälle aprotiniinin tai sen funktionaalisesti vastaavan aprotinii-nihomologin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 7 esitetään. Sellaisten aprotiniinin 15 homologien kuin esimerkiksi Val-15-, Ile-15-, Leu-15-, Phe-15- ja Ala-15-, Arg-15-, Gly-15-, Ser-15-, Trp-15-,

Tyr-15-aprotiniinin omaten lisäksi asemassa 52 Glu-substi-tuution, on todettu vastaavan tunnettua protiniinia ja sen homologeja, joilla on asemassa 52 Met, ja ne esitellään sa-20 moin kuin niiden tuottaminen. Met-52:n substituointi mahdollistaa aprotiniinin ja aprotiniinin homologien tuottamisen, jossa geeniteknologian avulla aikaansaatu fuusioitu polypeptidi katkaistaan syaanibromidin avulla fuusioitujen polypeptidien Met-kohdasta.

25 Esitellään myös synteettinen DNA, joka koodittaa tällaisia homologeja, yhdistelmäplasmideja, jotka sisältävät rakennegeenejä homologien ilmentämistä varten, ja E. coli transformoituna yhdistelmäplasmideilla. Keksinnön mukaiselle DNA:lie, ilmentämisvektorille ja bakteeri-isäntä-30 solulle on tunnusomaista, mitä patenttivaatimuksista 1, 5 ja 6 esitetään.

Seuraavassa esitetään strategia aprotiniinin ja aprotiniinin homologeja koodittavien DNA-palasten kokoonpa-nemista ja valikoimista varten.

35 Aprotiniinin ja aprotiniinin homologien tunnettua proteiinisekvenssiä ja geneettistä koodia käytettiin täl-. laisia polypeptidejä koodittavien DNA-sekvenssien määrää miseen.

4 94876

Geneettisen koodin degeneraatio sallii melkoisen vapauden valittaessa kodoneja mitä tahansa määrättyä aminohapposekvenssiä varten.

Määritettiin kaikki mahdolliset emässubstituutiot 5 kodoneissa, jotka määräävät tämän proteiinin aminohappo- sekvenssin. Tämän mukaan määritettiin kaikki potentiaali- . set restriktiokohdat, jotka sijaitsivat mahdollisissa DNA-sekvensseissä.

Kodonien valintaa perusgeenejä varten ohjasivat 10 seuraavat näkökohdat:

Ensin valittiin kodonit ja palaset ja suunniteltiin palasten kokoaminen siten, että vältettiin palasten sopimaton komplementaarisuus.

Toiseksi vältettiin alueita, joilla esiintyy runsaas-15 ti A-T-emäspareja, jotta päästäisiin transkription ennenai kaisen päättymisen ongelmista.

Kolmanneksi valittiin restriktiokohtia, jotka ovat tarpeellisia transformanttien tai emässubstituutioiden toteennäytön helpottamiseksi, korvaamalla sopivia palasia 20 toisilla palasilla, jolloin voidaan helposti saada aikaan aprotiniinin muunnoksia ja tutkia rakenteiden ja niiden aktiivisuuksien välistä yhteyttä.

Neljänneksi on suurin osa valituista kodoneista niitä, jotka ovat etusijalla mikrobien genomien ilmentymises-25 sä (katso H. Grosjean ja W. Fiers, Gene, 18 (1982) 192-209; M. Goy ja C. Gautier, Nucleic Acids Research, 10 (1982) 7055-7074).

Synteettisten aprotiniinigeenien ja niiden homologien pääasiallinen rakenne on esitetty kuviossa 1.

30 Synteettisen perusgeenin rakenne, joka muodostuu neljästä restriktioendonukleaasien tunnistuskohtien ympä-• röimästä lohkosta (nimeltäOi' ,.5, V'<f> , mahdollistaa lisäk si DNA-sekvenssien helpon modifioinnin ja muuttamisen (kodonikäytön, mutaatiot, proteiinitekniikan, geenien laa-35 jentamisen) fuusioimatonta ja fuusioitua ilmentämistä varten.

I I - atf.t MU liitti 5 94876

Synteettiset geenit laadittiin seuraavasti:

Synteettiset geenit aprotiniinia ja aprotiniinin homologeja varten rakennettiin perusgeenin kautta liittämällä yhteen 15 puhdistettua oligonukleotidia, joilla on 5 päällekkäin menevät päätealueet (katso kuvio 1). Tämä rakentaminen suoritettiin kahdessa vaiheessa. Ensin valmistettiin geenin osa A ja osa B hybridisoimalla, yhdistämällä ligoiden ja puhdistamalla DNA-palaset 1, 2, 3, 4 ja 6 osaa A varten ja DNA-palaset 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 10 14 ja 16 osaa B varten (kuvio 2). Toiseksi geenin osat A ja B yhdistettiin ligoimalla ja puhdistettiin. Tässä rakentamisessa käytimme materiaaleja ja menetelmiä, jotka on kuvattu jäljempänä. Perusgeenin DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 3. Se sisältää aloituskodonin ATG, kaksi päätösko-15 donia, TAG:n ja TAA:n, 5'-päässä olevan Eco RI:n restrik-tiokohdan ja 3'-päässä olevat restriktiokohdat Hind III:a ja Bam HI:tä varten ja myös sisäiset restriktiokohdat Apa I:tä, Stu I:tä, Sac II:ta (SSt II:ta) varten. Nämä kohdat, erityisesti sisäiset, helpottavat koodittavan sek-20 venssin kloonausta, perusgeenin muuntamista vaihtamalla siihen DNA-palasia, jotka koodittavat muita aminohappoja tai joilla on toinen kodonikäyttö. Geenin laajentaminen voidaan helposti suorittaa lisäämällä sopivia liitäntäkoh-talinkkerisekvensssejä. Tällaisen rakenteen yhteydessä voi-25 daan käyttää hyväksi kaikkia proteiinitekniikan mahdollisuuksia.

Haluttaessa rakentaa aprotiniinin homologien geenejä tarvitsee ainoastaan vaihtaa restriktiopalanen, jossa on sopiva DNA-sekvenssi. Kuviossa 2b on annettu sekvensse-30 jä sellaisia palasia varten, jotka koodittavat aminohappo-muutoksia käsittäen asemat 15 ja 52.

Yhdistelmäplasmidit rakennettiin seuraavasti:

Kokeellista aprotiniinin kloonausta varten valittiin plasmidiksi pUC 8 (J. Vieira ja J. Messing, 1982 35 Gene, 19, 259). Tämän kloonausvektorin muodostaa pBR

322:sta peräisin oleva ampisillinaasigeeni ja DNA:n repii- • · 6 94876 kaation aloituskohta yhdistettynä lac Z -geenin osaan, joka sisältää sarjan restriktioentsyymien ainoita tunnis-tuskohtia. Kun tämä vektori viedään lac E. coliin, synnyttävät transformantit sinisiä kolonioita sopivilla indikaat-5 torilevyillä. DNA-palasten kloonaaminen mihin tahansa monista restriktiokohdista, esimerkiksi Eco Rl:n ja Bam HI:n väliin, inaktivoi lac-geenin, jollon muodostuu vaikeita kolonioita. Plasmidi pUC 8 on kaupallisesti saatavissa toi-minimeltä P-L Biochemicals.

10 Ilmentämisplasmidit rakennettiin seuraavasti:

Aprotiniinin ja aprotiniinin homologien ilmentämiseksi fuusioproteiinina rakennettiin plasmidi, jossa sopiva geeni fuusioitiin ^-galaktosidaasigeenin karboksipäähän, kuten ovat osoittaneet samankaltaisissa kokeissa U. Riither 15 ja B. Muller-Hill 1983. EMBO Journal, 2, s. 1791-1794. Kan-taplasmidissa pUR 278 on yhtenä kappaleena esiintyvät kloo-nauskohdat Bam HI, Sal I, Pst I, Xba I ja Hind III lac Z -geenin 3'-päässä (katso myös saksalainen patenttihakemus P 3 309 501.9). Lisättäessä koodittava DNA-sekvenssi oikei-20 siin kloonauskohtiin ja siten, että oikea lukuraami säilyy, saadaan muodostumaan fuusioproteiini, jossa aktiivinen -galaktosidaasi on yhdistettynä DNA:n koodittamaan peptidiin.

Ilmentämisvektorin pUR 278 restriktiokohdat Bam HI ja Hind III valittiin aprotiniinin ja aprotiniinin homolo-25 gien synteettisten geenien kloonaamista varten ilmentämis- vektoriin. Sen vuoksi oli tarpeellista muuntaa aprotiniinin geeniä lisäämällä Bam HI -kohta geenin 5'-Eco Rl -päähän ja käyttämällä 3'-päässä olevaa Hind III -kohtaa (katso myös kuvio 6).

30 Käytettiin seuraavia yhdistelmä-DNA-työskentelyn standardimateriaaleja ja -menetelmiä: Tässä kuvatut synteettiset geenit, yhdistelmäplasmi-dit ja ilmentämisvektorit, jotka sisältävät näitä geenejä, voidaan valmistaa ja luonnehtia seuraavien materiaalien 35 ja menetelmien avulla.

:l IM li lii» 1(10 5 • « 7 94876

Materiaali

Entsyymit

Polynukleotidikinaasi (PNK), 5,5 yksikköä/^ul; Boehringer-Mannheim nro 633 542; 5 DNA-polymeraasi; Klenow, Boehringer-Mannheim nro 104 523; T4-DNA-ligaasi, 0,9 yksikköä/^.ul; Boehringer-Mannheim nro 481 220; restriktioentsyymit hankittiin toiminimeltä Bethesda Research Labs, Boehringer Mannheim, BioLabs; 10 vasikan suolen alkaalinen fosfataasi (CIP); Boehringer Mannheim; lysotsyymi; RNaasi A; Boehringer Mannheim Reagenssit gamma-32 P -ATP; Amersham nro PB 10168 15 alfa-32 P -dTTP; Amersham 167 ATP; Sigma nro A-6144 bisakryyliamidi; Serva 29195 akryyliamidi; Serva ja Bio-Rad 161-0103 TEMED; Serva 35925 20 ammoniumpersulfaatti; Serva 13375

virtsa-aine; BRL ultrapuhdas 5505 UA

DE 52 (esiturvotettu dietyyliaminoetyyliselluloosa);

Whatman, kat. 4057-050 DTE; Serva 20697 25 isopropyyli- /J-D -tiogalaktosidi (IPTG); Sigma I 5502 5-bromi-4-kloori-indolyyli- p-D -galaktosidi (X gal); Boehringer 651745

N,N'-dimetyyliformamidi; Merck 2 203 034 EGTA

30 sakkaroosi; BRL 5503 UA

diaminopimeliinihappo; Sigma D 1377 M 13 -dideoksinukleotidi-sekvenssointisysteemi; New England

Biolabs, Beverly, MA USA j^408, ^409 kloroformi 35 isoamyylialkoholi f · 8 94876 tymidiini; Serva 18600 glukoosi D (+); Merck 8337 Tris; Merck 8382 kaliumhydroksidi; Merck 5033 5 kalsiumkloridi; Merck 2382 rubidiumkloridi; Sigma R 2252 mangaanikloridi; Sigma M 3634 DMSO; Sigma D 5879 EDTA; 10 kaliumasetaatti; SDS;

DNA

plasmidi pUC 8; Pharmacia P-L Biochemicals 27-4916-xx Bam HI -liitäntäkohta (-linkkeri) 15 Elatusaineet ja antibiootit

Bacto-tryptoni; Difco 0123-01 Bacto-hiivauute; Difco 0127-01 Bacto-agar; 0140-01 LB-elatusaine: (1 litraa varten) 10 g Bacto-tryptonia, 20 5 g Bacto-hiivauutetta, 10 g NaCl, pH säädetään 7,5:ksi

NaOHrn avulla) kappa 1776 -elatusaine: (1 litraa varten) 25 g Bacto-tryptonia, 7,5 g Bacto-hiivauutetta, 1 M Tris-HCl (pH 7,5) 20 ml, täytetään 950 ml:ksi, autoklavoidaan ja jäähdytetään, li-25 sätään steriilinä: 5 ml 1 MgC^» 10 ml 1 % diaminopimelii- nihappoa, 10 ml 0,4 % tymidiiniä, 25 ml 20 % glukoosia YT-elatusaine: (1 litraa varten) 8 g Bacto-tryptonia, 5 g

Bacto-hiivauutetta, 5 g NaCl

Agar-maljat valmistettiin lisäämällä 15 g Bacto-agaria 30 1 litraan asiaankuuluvaa elatusainetta.

Indikaattorimal jät: 1 litraan autoklavoitua YT-elatusainetta , joka sisälsi 1,5 % agaria, lisättiin seuraavat liuokset: 2 ml 0,1 M IPTG, 2 ml 2 % X-gal N,N'-dimetyyliformamidissa ja 2 ml väkevyydeltään 100 mg/ml olevaa ampisilliinia.

!i : Iitit nti. i t* -in ^ 94876

Antibiootit kloramfenikoli; Boehringer Mannheim 634 433 ampisilliini; Serva 13397 tetrasykliini; Serva 35865 5 Puskuriaineet ja liuokset 20 yUM ATP vedessä 10 mM ATP vedessä 10x PNK-seos: 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6); 0,1 M MgC^/

50 mM DTE; 1 mM EDTA

10 1Ox ligaasi-seos: 0,5 M Tris-HCl (ph 7,4); 0,1 M MgCl2;

0,1 M DTE; 10 mM ATP

10x SP-50: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5); 100 mM MgCl2;

500 mM NaCl; 10 mM DTT

10x SP-100: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5); 100 mM MgCl2;

15 1 M NaCl; 10 mM DTT

1Ox SP-0: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5); 100 mM MgCl2;

10 mM DTT

1 M TBE: 1 M Tris; 0,83 M boorihappo; 10 mM EDTA; pH 8,3 3x formamidiväriaineseos: 70 % formamidia, 20 % glysero-20 lia; 1 mM EDTA; 0,33 mg/ml bromfenoli-sinistä; 0,66 mg/ml ksyleenisyanolia FE; 0,66 mg/ml oranssi G:tä 20x E-puskuriliuos; 0,8 M Tris; 0,4 M natriumasetaatti; 40 mM EDTA; pH 8,3 1Ox CIP-puskuriliuos: 0,5 M Tris-HCl (pH 9,0), 10 mM 25 MgCl2, 1 mM ZnCl2, 10 mM spermidiini transformaatiopuskuriliuos: valmistettu seuraavasti, 15 g sakkaroosia, 1 ml 3,5 M KOH, 1 ml CaCl2, 2 ml 5,0 m RbCl täytetään 50 ml:ksi kahdesti tislatulla vedellä, säädetään pH 6,2:ksi 10 % etikkahapon avulla, lisätään 1 ml 4,5 M 30 MnCl2, säädetään pH 5,8:ksi 10 % etikkahapon avulla, täy tetään 100 ml:ksi kahdesti tislatulla vedellä ja suodate-• taan steriiliksi.

TE-puskuriliuos: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA 1Ox NT-puskuriliuos; 35 lysotsyymiseos: 50 mM glukoosia, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 94876 fenoli/sevag -seos, jossa on 1 tilavuus 80 % fenolia ja 1 tilavuus sevagia (kloroformi:isoamyylialkoholi 24:1).

Standardimenetelmät Käytettiin yhdistelmä-DNA-tyÖskentelyn 5 standardimenetelmiä, kuten ne on kuvattu teoksessa

Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA, tehden joitakin muunnoksia, kuten on kuvattu jäljempänä.

Normaalietanolisaostus 10 Pallomaiset DNA-sakat liuotettiin tai niiden liuok set säädettiin 0,3 M natriumasetaattiliuoksiksi, lisättiin kaksi tilavuusosaa etanolia, inkuboitiin -70°C:ssa 15 minuutin ajan ja sentrifugoitiin. Sakkanapit pestiin kaksi kertaa 80 % etanolilla ja kuivattiin tyhjössä.

15 Normaalifenoliuutto

Liuokset sekoitettiin huolellisesti fenoli/sevag-liuoksen kanssa tilavuussuhteessa 1:1, sentrifugoitiin, fenolifaasi uutettiin uudelleen 1/10 tilavuudella puskuriliuosta tai vettä, vesifaasit yhdistettiin.

20 Normaali DNA-palasten eristys polyakryyliamidigee- lielektroforeesin jälkeen

Pienet DNA-palaset (250 nukleotidiin saakka) eroteltiin geelielektroforeesin avulla ja vyöhykkeet tehtiin näkyviksi autoradiografiän tai UV-valon avulla (esipääl-25 lystetyt ohutkerroskromatografialevyt Silgur-25, Macherey-

Nagel & Co.). Vyöhykkeet leikattiin irti, murskattiin si-likonoidulla lasisauvalla, eluoitiin noin 400 ^ulilla TE-puskuriliuosta, pH 8,0, 42°C:ssa 18 tunnin ajan. Materiaali senttrifugoitiin ja sakkanappia eluoitiin uudel-30 leen 42°C:ssa 4 tunnin ajan ja sentrifugoitiin. Kummatkin supernatantit yhdistettiin ja puhdistettiin anioninvaih-tokromatografiän avulla pienissä DE-52-pasteur-pipettipyl-väissä käyttäen 1 M TEABC-puskuriliuosta. Lyofilisoinnin jälkeen DNA liuotettiin veteen ja lyofilisoitiin, kaksi 35 kertaa.

94876

Noritiaaliligoimalla yhdistäminen Normaalissa ligoimalla yhdistämisessä (palanen pienempi kuin vektori) käytettiin vektori:palanen-suhtee-na molaarista suhdetta 1:5. Lopullinen DNA-konsentraatio 5 oli 25 ^ug/ml. DNA liuotettiin pieneen määrään TE-puskuri- liuosta, lisättiin 1Ox-ligaasiseosta, T4-DNA-ligaasia, säätäen 1x ligaasiseos -konsentraatioksi (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgC^, 10 mM DTE, 1 mM ATP; normaalitilavuus 30 ^ul). Reaktion annettiin tapahtua 14°C:ssa 16 tunnin 10 ajan.

Normaali DNA-palasten 5'-pään merkitseminen DNA, josta oli poistettu fosforia (lopullinen kon-sentraatio noin 0,2 yUM), liuotettiin 1x kinaasi-puskuri-liuokseen I (50 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCL2» 5 mM DTE, 15 0,1 mM EDTA). Lisättiin yhdessä merkitsemättömän ATPtn kanssa gamma-32 P -ATP:tä (3000 Ci/mmooli). ATP:n lopullinen konsentraatio oli aina suurempi kuin 1 ^uM. Reaktio suoritettiin käyttäen 500-1000-kertaista ylimäärää polynukleotidikinaasia laskettuna yksikön määritelmän 20 ja DNA-konsentraation perusteella, 37°C:ssa 30 minuutin aikana. Reaktio pysäytettiin fenoliuuttoa varten. DNA saostettiin etanolilla, pestiin ja kuivattiin.

Normaali restriktioendonukleaasin avulla pilkkominen Restriktioendonukleaasin avulla pilkkomiset suori-25 tettiin pääasiallisesti valmistajien ohjeiden mukaisesti.

Puhdistettu suolaton DNA liuotettiin puskuriliuokseen (SP-C, SP-50 tai SP-100 käytetyn entsyymin mukaan) ja pilkottiin sopivan entsyymimäärän avulla. Lopuksi materiaali uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla.

30 Normaali DNA-palasten eristäminen agaroosigeeli- elektroforeesin jälkeen - DNA-palaset erotettiin agaroosigeelielektroforee- sin avulla (katso T. Maniatis et ai., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Molecular Cloning), värjättiin etidium-35 bromidilla ja leikattiin irti pitkäaaltoisessa UV-valossa.

12 94876

Palaset sijoitettiin dialyysiletkuun, täytettiin 0,5x E-puskuriliuokse11a (puskuriliuos:geelipala-tilavuussuhteeksi 1,5:1), ja palasten täytyi olla puskuriliuoksen kunnolla ympäröimiä. Suljettu letku, jossa ei ollut ilma-5 kuplia, sijoitettiin elektroforeesikammioon, joka oli täytetty 0,5x E-puskuriliuoksella. Elektroforeesin annettiin tapahtua 30 minuutin ajan jännitteen ollessa 200 V, sitten virran suunta käännettiin 30 sekunnin ajaksi, jotta saataisiin DNA irtoamaan dialyysiletkun seinäs-10 tä. Geelipalasta ympäröivä puskuriliuos poistettiin huo lellisesti ja puhdistettiin edelleen DEAE-selluloosa-tai DE 52 -pylväissä (katso ylempää).

Normaali fosforin poistaminen DNA:sta DNA, joka oli täysin katkottu ja puhdistettu, liuo-15 tettiin veteen ja liuotin säädettiin 1x CIP-puskuriliuok- seksi (normaali kokonaistilavuus 48 ^,ul) . Reaktio aloitettiin 37°C:ssa lisäämällä 1 ^ul (20 yksikköä) vasikan suolen fosfataasia (CIP) ja 30 minuutin kuluttua lisättiin jälleen 1 ^ul CIP:tä. Reaktio pysäytettiin 1 tunnin kulut-20 tua lisäämällä 5 ^,ul 50 mM EGTArta ja inkuboimalla 65°C:ssa 10 minuutin ajan. Fosforin poistamiseksi tylppäpäisestä DNA:sta, jossa on piiloon vetäytyneet 51-päät, suoritettiin toistuvia 15 minuuttia kestäviä inkuboninteja 37°C:ssa tai 56°C:ssa, vastaavasti. DNA uutettiin fenoli/sevagilla 25 ja saostettiin etanolilla.

Autoradiografia

Filmit: AGFA-Gevaert, Curix RP 1, 100 AFW, Kodak XAR 5, 165 1512 röntgenkuvakehite; AGFA G153, Kodak LX24 röntgenkuvakiinnite; AGFA G353; Kodak AL4.

30 Normaali transformointimenetelmä

Transformoinnit suoritettiin käyttäen D. Hanahanin menetelmää (1983, J. Mol. Biol., 166, 557-580).

Isäntäkannan yli yön kasvatetusta 20 ml:n viljelmästä, joka oli pantu alulle istuttamalla yksi ainoa ko-35 Ionia ja kasvatettu kappa-1776-elatusaineessa (37°C, ra- vistelukone, jonka nopeus 200 värähdystä minuutissa), 13 94876 istutettiin 1 ml 100 ml:aan esilämmitettyä (37°C) kappa-1776-elatusainetta.

Tätä viljelmää kasvatettiin samoissa olosuhteissa. Solujen kasvu pysäytettiin, kun optinen tiheys (OD) oli 5 500 nm:n aallonpituudella 0,2. Sen jälkeen kun oli jääh- o dytetty 4 C:een ja sentrifugoitu, suspendoitiin solunap-pi huolellisesti uudelleen 20 ml:aan jääkylmää transfor-maatiopuskuriliuosta ja inkuboitiin 0°C:ssa 5 minuutin ajan. Suspensio sentrifugoitiin jälleen (3000 kierrosta 10 minuutissa, 4°C, 15 minuuttia) ja suspendoitiin uudelleen 4 ml:aan jääkylmää transformaatiopuskuriliuosta. Sen jälkeen kun oli lisätty 7 ^ul DMSO:ta 200 ^ul:n osiin solususpensiota, inkuboitiin soluja lisäksi jäävesihau-teessa 15-60 minuutin ajan. Tällaiseen osaan kompetentte-15 ja soluja lisättiin DNA:ta, joka oli liuotettu 20 ^ul:aan TE:tä, ja seosta inkuboitiin jäävedessä 20 minuutin ajan ja 42°C:ssa 3 minuutin ajan. Tällainen osa soluja istutettiin 1 ml:aan esilämmitettyä (37°C) kappa-1776-elatus-ainetta ja viljelmää kasvatettiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan.

20 Maljaviljelmien tekemiseksi transformanteista solut sent rifugoitiin (3000 kierrosta minuutissa, 15 minuuttia, 4°C), suspendoitiin uudelleen YT-elatusaineeseen ja niistä tehtiin viljelmät indikaattorimaljoille. Odotetun transfor-manttien lukumäärän mukaan käytettiin tietty määrä suspen-25 siota levyviljelmän tekoon.

Normaali nopea analyyttinen plasmidin eristys Tämä menetelmä on muunnelma Birnboimin ja Dolyn menetelmästä, 1979 (katso myös T. Maniatis et ai., 1982). Kustakin transformantista, joka pitäisi analysoida, val-30 mistetaan 2 ml:n yli yön kasvatettu viljelmä (puinen ham mastikku, 37°C, 16 tuntia, pyörivä pyörä). 1,5 ml yli yön kasvatetusta viljelmästä sentrifugoitiin 1 minuutin ajan nopeudella 12 000 g (Eppendorf-sentrifugi). Sakkanappi liuotettiin uudelleen juuri valmistettuun liuokseen, jos-35 sa oli 2 mg lysotsyymiä ml:ssa lysotsyymiseosta ja inku- 14 94876 boitiin sitten 20°C:ssa 5 minuutin ajan. Näytettä inku-boitiin 5 minuuttia jäissä sen jälkeen kun oli lisätty juuri valmistettua jääkylmää 0,2 M NaOH:ia, joka sisälsi 1 % SDS:ä. Kromosomaalisen DNA:n ja proteiinien saosta-5 miseksi lisättiin 150 ^ul jääkylmää kaliumasetaattia, jonka pH oli 4,8. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 5 minuuttia 0°C:ssa ja sentrifugoitu 10 minuutin ajan nopeudella 12 000 g, siirrettiin plasmidin sisältävä supernatantti uuteen putkeen ja uutettiin kloroformi/isoamyylialkoholil-10 la (24:1). Vesifaasiin lisättiin 500 ^ul isopropanolia.

Seosta inkuboitiin -20°C:ssa 30 minuutin ajan. Sentrifu-goinnin jälkeen (10 minuuttia, 12 000 g) pestiin sakka 80 % etanolilla ja kuivattiin lyhyen aikaa tyhjiössä.

Tämä materiaali riittää 5-6 erilaiseen geelielektroforee-15 sin avulla suoritettavaan restriktioanalyysiin.

Normaali oligonukleotidien puhdistus polyakryyli-amidigeelielektroforeesin avulla

Oligonukleotidit (opt. tih. OD noin 20 aallonpituudella 260 nm) liuotettiin puskuroituun formamidiin 20 (0,1 M TBE) ja eroteltiin elektroforeesin avulla 7 M virt sa-ainetta sisältävässä, 20 % polyakryyliamidigeeleis-sä (Maxam ja Gilbert, Meth. Enzymol. 65, 500-560, 1980). Geelit pantiin fluoroiduille ohutkerroslevyille ja DNA tehtiin näkyväksi UV-valon avulla. Eristäminen ja puhdistami-25 nen suoritettiin kuten on esitetty pääpiirteittäin stan- dardiprotokollassa DNA:n eristämistä varten polyakryyli-amidigeelielektroforeesin jälkeen (katso ylempää). Tämän menetelmän laatu tarkistettiin rutiininomaisesti analyyttisen gamma-32 P -ATP:llä suoritetun 5'-fosforyloinnin 30 ja polyakryyliamidigeelieketroforeesin avulla.

Glu-52-aprotiniinin valmistus jl -galaktosidaasi-Lys-15-Glu-52-aprotiniini-fuusioproteiinista

Monet proteiinit, joita syntetisoituu bakteereissa suuria määriä, kasautuvat liukenemattomassa muodossa (D.C. 35 Williams, R. M. Van Frank, J. B. Burnett, W. L. Muth 1982, Science 215, 687). Näitä liukenemattomia proteiineja kut- 15 94876 sutaan inkluusiokappaleiksi. Ne voidaan yleensä tehdä liukoisiksi vain denaturoivien aineiden avulla ja voitaisiin sen vuoksi helposti puhdistaa muista solun proteiineista.

5 E. coli -kanta RR1 delta M15 (ATCC 35102) transfor moitiin plasmidilla pRK 48.1.1., joka koodittaa Glu-52-aprotiniini-^-galaktosidaasigeenin myötävirtaan E. colin promoottori-, operaattori- ja ribosomin sitoutumiskohdasta. Glu-52-aprotiniini-|$-galaktosidaasi-fuusioproteiinin 10 maksimaalinen kasautuminen oli 20 % solun kaikesta proteiinista. Inkluusiot sijoittuivat yleensä polaarisille tai subpolaarisille alueille ja suurella osalla normaalin-pituisista soluista oli yksi inkluusio lähellä kumpaakin napaa.

15 E. coli -kannan RR1 delta M15 yli yön kasvatettu viljelmä sentrifugoitiin ja solunappi suspendoitiin uudelleen rikkomispuskuriliuokseen. Sonikoinnin jälkeen soluly-saatti sentrifugoitiin inkuusiokappaleiden talteen saamiseksi. Inkluusiokappaleet pestiin 2 M guanidiniumhydro-20 kloridilla. Puhdistusvaiheet tarkastettiin SDS-polyakryyli- amidielektroforeesin avulla Laemmlin mukaan (U.K. Laemmli 1970, Nature 227, 680-685), kuvio 8.

Vahingoittumattoman Lys-15-Glu-52-aprotiniinin saamiseksi täytyy inkluusiokappaleet liuottaa, lohkaista syaa-25 nibromidilla ja laskostumaton Glu-52-aprotiniini täytyy ·. saada laskostumaan oikeaan muotoon.

Inkluusiokappaleet voitiin saada liukenemaan 6 M guanidiniumhydrokloridiin, joka sisälsi riittävän määrän DTT:tä. Liukenemattomien osien erottamisen jälkeen fuusio-30 proteiini saostettiin dialysoimalla vettä vastaan, joka sisälsi 10 mM merkaptoetanolia. Märkä fuusioproteiini liuotettiin 70 % muurahaishappoon ja jaettiin syaanibro-midilla Grossin mukaan (E. Gross, B. Witkop 1961. Amer. Chem. Soc. 83, 1510-1511).

16 94876

Glu-52-aprotiniini erotettiin syaanibromidilla saaduista |J-galaktosidaasin palasista ioninvaihtokroma-tografian avulla ja saatettiin samalla laskostumaan Creightonin menetelmän mukaan (T.E. Creighton, Proceedings 5 of Genex-UCLA Symposium 1985, Kingstones; painossa) (kuvio 9). Aktiivinen inhibiittori voitiin osoittaa Westernbot-analyysin avulla (kuvio 10).

Aktiiviset fraktiot konsentroitiin haihduttamalla ja niitä dialysoitiin sitten 0,1 M NH^HCO^a vastaan. Lyo-10 filisoinnin jälkeen inhibiittori puhdistettiin HPLC:n avulla runsashuokoisessa RP-18-pylväässä käyttäen gradient-tia, jonka muodostivat 0,1 % TFA puskuriliuoksessa A ja 0,1 % TFA 60 % CH3CN puskuriliuoksessa B.

Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja inhibiittori 15 luonnehdittiin mikrosekvenssoimalla kaasufaasisekvenssorin avulla Hewickin mukaan (R. M. Hewick, M. W. Hunkapiller, L. E. Hood, W. I. Dreyer 1981, J. Biol. Chem. 256, 7990 -7997). N-pään 20 ensimmäistä jäännöstä ovat täysin samoja kuin odotetussa inhibiittorissa (taulukko 2). Aminohappo-20 analyysit osoittavat, että inhibiittorilla on odotettu aminohappokoostumus (taulukko 1).

Verrattaessa aprotiniinin ja Glu-52-aprotiniinin trypsiiniä inhiboivaa aktiivisuutta saadaan identtiset annos-vastauskäyrät (kuvio 11).

25 Kaikki nämä kokeet osoittavat, että on mahdollista tuottaa Glu-52-aprotiniinia fuusioproteiinina E. colissa ja eristää se katkaisemisen ja renaturoivissa olosuhteissa erottamisen jälkeen.

Vai-15-Glu-52-aprotiniinin ja muiden aprotiniinin 30 johdannaisten valmistus

Val-15-Glu-52-aprotiniini voidaan valmistaa samalla tavalla Ji -galaktosidaasi-fuusioproteiinista kuin on kuvattu Glu-52-aprotiniinia varten (kuviot 12, 13). Inhi-biittoriaktiivisuus määritettiin elastaasin inhibointi-35 kokeessa.

= iä t uin l i s s# 17 94876

Inhibiittori luonnehdittiin aminohappoanalyysin ja N-pään sekvenssoinnin avulla (taulukot 1 ja 2).

Kaikki muut aprotiniinin johdannaiset voitiin valmistaa samalla tavalla kuin on kuvattu Glu-52-aprotiniinia 5 ja Vai-15-Glu-52-aprotiniinia varten.

Taulukko 1: Aprotiniinin, Glu-52-aprotiniinin ja Val-15-Glu-52-aprotiniinin aminohappoanalyysi

Apro-

Amino- tinii- Glu-52 Val-15-Glu-52 ]_g happo ni

Asp 4,75 (5) 4,92 (5) 5,10 (5)

Thr 2,90 (3) 2,91 (3) 2,85 (3)

Ser 0,98 (1) 1,01 (1) 0,95 (1) 15 Glu 2,90 (3) 4,30 (4) 4,30 (4)

Gly 5,92 (6) 5,91 (6) 6.30 (6)

Ala 6,00 (6) 6,00 (6) 6,00 (6)

Vai 1,04 (1) 1,02 (1) 2,06 (2)

Met 0,95 (1) 20 He 1,29 (2) 1,30 (2) 1,35 (2)

Lau 2,10 (2) 2,01 (2) 2,01 (2)

Tyr 3,92 (4) 3,70 (4) 3,81 (4)

Phe 3,86 (4) 4,08 (4) 4,05 (4)

Lys 3,99 (4) 3,80 (4) 3,10 (3) 25 Arg 5,82 (6) 5,75 (6) 6,00 (6)

Aminohapot määritettiin sen jälkeen kun niistä oli pylvään jälkeen tehty o-ftaalialdehydijohdannaisia. Aminohappoja Cys ja Pro ei määritetty.

18

Taulukko 2 94876

Glu-52- ja Val-15-Glu-52-aprotiniinin aminohapposekvens-sointi (N-terminaalinen) 5 1. Glu-52-aprotiniini; noin 1 nmoolia ainetta sekvenssoi- tiin 20 syklin verran: 1 14

Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-15 20 10 Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg- 2. Val-15-Glu-52-aprotiniini; noin 1 nmoolia ainetta sek-venssoitiin 20 syklin verran: 1 14

Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-15 15 20

Val-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-

Aprotiniini/Glu-52-aprotiniini-vertailu BrCN: 11a lohkaisemalla saadun Glu-52-aprotiniinin ja autenttisen aprotiniin inhiboivaa vaikutusta sian trypsii-20 niin verrattiin keskenään. Trypsiinin määrittämiseen käy tettiin kumpaakin substraattia Pyrglu-Gly-Arg-pNA ja bent-soyyli-Arg-pNA.

Aprotiniinin kantaliuoksen pitoisuus oli l^ug/ml ja Glu-52-aprotiniinin 0,6 /Ug/ml. 0 - 100 - 200 - 300 -25 400 - 500^ul näitä kantaliuoksia käytettiin kokeessa bentsoyyli-Arg-pNA:n kanssa. Kokeessa Pyrglu-Gly-Arg-pNA:n kanssa käytettiin 0-3-6-9-12-15 ^ul. Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 3.

» ' Mit lii 11 hila* : ‘ 19 94876

Taulukko 3

Aproti- Glu-52-aproti- niini niini 5 Substraatti Inhibiittorir ΔΕ/10 min. Inhibiitto- ΔΕ/10 min. määrä kokees- rin määrä sa__[kokeessa _ 0 ng 0.91 0 ng 0,91 100 0^76 60 0,77 200 0^57 120 0,68 bentsoyyli- 300 0.39 180 0,58 10 Arg-pNA 400 θ', 08 240 0?44 500 OjOO 300 0.30

Pyr-Glu- 0 ng 0t85 0 ng 0f84

Gly-Arg- 3 0^62 1,8 0,67 pNA 6 0.39 3.6 0,56 9 0.29 5.4 0.47 15 12 0.18 7,2 0.32 15 0,13__9^0_|0.28_ Nämä tulokset osoittavat, että aprotiniinilla ja Glu-52-aprotiniinilla saadaan identtiset annos-vastaus-käy-rät kummassakin trypsiiniinhibointikokeessa. Tämä ei osoita 20 ainoastaan sitä, että Glu-52-aprotiniini sisältää käytännöllisesti katsoen 100 % aktiivisia molekyylejä, vaan myös, että trypsiini-inhibiittori-kompleksien tasapainovakiot ovat samaa suuruusluokkaa.

Western-täpläkoe 25 Western-täpläkoe suoritettiin kuten on kuvannut

Towbin (H. Towbin, T. Staehelin), X. Gordon 1979, Proc.

Natl. Acad. Sei USA 76, 4350-4354). Selluloosanitraattitäp-lä tutkittiin käyttäen kaniinin polyklonaalisia antiapro-tiniinivasta-aineita primaarisina ja biotinyloituja aasissa 30 tuotettuja kaniinin vasta-aineiden vasta-aineita sekundaarisina vasta-aineina. Immuunikompleksien osoittaminen suoritettiin käyttäen streptavidiini-biotinyloitu—piparjuuriperok-sidaasi-kompleksia, 4-kloori-1-naftolin ollessa substraattina, kuten on kuvattu hankkijan ohjekirjassa (AMERSHAM 35 BUCHLER, Braunschweig).

20 94876

ELISA

Kiinteän faasin entsyymikytketty immunosorbentti-koe (ELISA) suoritettiin kilpailevan tyyppisenä käyttäen mikrotiitterivasta-ainelevyjä, kuten on kuvannut Miiller-5 Esteri (W. Miiller-Esterl, A. Oettl, E. Truscheit, H. Fritz, Fresenius Z. Anal. Chem. (1984), 317, 718-719).

Aminohappojärjestyksen määrittäminen

Noin 0,5 - 2 moolia proteiinia liuotettiin 30 ^uljaan TFA:ta. Näyte sijoitettiin lasikuitusuodattimelle, joka oli 10 esikäsitelty 3 mg :11a polybreeniä. Sekvenssianalyysi suoritettiin kaasufaasi-proteiinisekvenssoijan avulla, joka oli toiminimeltä APPLIED BIOSYSTEMS (Inc. USA), Hewickin mukaan (R. M. Hewick, M. W. Hunkapiller, L. E. Hood, W. Dreger 1981, I. Biol. Chem. 256, 7990-7997). Peräkkäin vuorollaan 15 vapautuneet aminohappofenyylitiohydantoiinijohdannaiset analysoitiin käyttäen syaano-HPLC-pylvästä (DU PONT) ja erottamissysteemiä, jonka on kuvannut Beyreuther (K. Beyreuther, B. Biesler, J. Bowens, R. Dildrop, K. Neufer, K. Stiiber, S. Zais, R. Ehring, P. Zabel 1983, Modern 20 Methods in Protein chemistry s. 303-325, Walter de Gruyter & Co Berling). Käytettiin WATERS'in HPLC-systeemiä, johon kuului M 510 -pumppu, WISP 710B -autoinjektori, nestekroma-tografiaspektrofotometri M 481, ja SHIMADZU'n integraatto-ri C-R3A.

25 Hapan hydrolyysi ja aminohappoanalyysi

Noin 1 nmooli proteiinia oli sijoitettu pyrex-putkeen ja siihen lisättiin 200 yUl 6 M HC1, joka muuttumatta kiehuva HC1 sisälsi 0,05 % 2-merkaptoetanolia (I. T. Potts Jr, 1969, Anal. Biochem. 131, 1-15). Putket suljettiin tyh-30 jiössä ja niitä inkuboitiin 110°C:ssa 22 tunnin ajan. Hyd-rolysaatit kuivattiin nopeasti, liuotettiin uudelleen 150 ^,ul:aan 0,2 M natriumsitraattipuskuriliuosta, jonka pH oli 2,2, ja suodatettiin. Aminohappoanalyysi suoritettiin BIOTRONIK LC 5000 -aminohappoanalysaattorilla, joka oli va-35 rustettu fluoresenssidetektorilla ja SHIMADZU C-R2AX

Il l IU I liiti i i i ui i 2i 94876 -integraattorilla. Aminohapot määritettiin kvantitatiivisesti sen jälkeen kun ne olivat reagoineet o-ftaali-aldehydin kanssa oleellisesti kuten on kuvannut Benson (J. R. Benson, P. E. Hare 1975, Proc. Natl. Acad. SCI.

5 USA 72, 619-622).

Normaali leukosyytin elastaasin määritys

Materiaalit

Ihmisen leukosyyttien elastaasia saatiin toiminimel-tä Elastin Products Company, Inc., P. 0. Box 147, Pacific, 10 Miss. 63069/USA:

Metoksisukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-prolyyli-L-valiini-p-nitroanilidia - K. Nakajima, J. C. Powers, M. J. Castillo, B. M. Ashe ja M. Zimmermann, J. Biol. Chem. 254, 4027 (1979) saatiin toiminimeltä Fa. Bachem, 15 Feinchemikalien AG, Hauptstr. 144, CH-4416 Bubendorf/-

Schweiz.

Menetelmä 550 yUl:aan seosta, jossa oli 0,2 M Tris-puskuri-liuoksessa, pH 8,0, 0,05 % Tween 80:tä ja 0,05 M kalsium-20 kloridia ja inhibiittoriliuos, lisättiin 5 ^ul liuosta, joka oli saatu liuottamalla 1 mg entsyymiä 100 ml:aan 50 % etyleeniglykolia. Seosta inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten lisättiin sekoittaen 100 ^ul seosta, jonka muodostivat 6,5 ^ul liuosta, jossa oli 59 mg metok-25 sisukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-propyyli-L-valiini- p-nitroanilidia 1 ml:ssa dimetyylisulfoksidia, ja testi-puskuriliuos. Rekisteröitiin optisen tiheyden suureneminen aallonpituudella 405 nm; prosenttinen inhibitio määritettiin kertomalla inhibiittorin sisältävän näytteen ja 30 entsyymikontrollin optisten tiheyksien suurenemisen ker roin 100:11a.

Trypsiinin inhibitio (testit)

Trypsiinin inhibitio määritettiin käyttämällä joko substraattia bentsoyyli-DL-arginiini-p-nitroanilidi 35 (Merck 1670) tai pyroglutamyyli-glysyyli-arginiini-p-nit- roanilidia, joka oli syntetisoitu kaupallisesti saatavissa t 22 9 4 8 7 6 olevista pyroglutamyyli-glysiinistä (SENN 6886) ja argi-niini-p-nitroanilidi x HBr:sta (SENN 9123) disykloheksyy-likarbodi-imidi-kondensaatiomenetelmällä. Tätä substraattia myös myy KABI nimellä S-2444 urokinaasin substraattina.

5 Ensiksi mainitulla on se etu, että se antaa lineaa risen vastauksen näytteen aprotiniinimäärään, mutta sen herkkyys on vähäinen. Jälkimmäisen herkkyys on suuri, mutta johtuen aprotiniini-trypsiini-kompleksin dissosioitu-misesta tuollaisissa alhaisissa konsentraatioissa ei annos-10 vastaus-käyrä ole lineaarinen.

Trypsiinin ja trypsiinin inhibiittoreiden määrityksessä käytetty puskuriliuos on 0,2 M Tris, pH 8,0, joka sisältää 0,01 M CaCl2 ja 0,05 % Tween 80^1 Määritykset voidaan suorittaa missä tahansa spektro-15 fotometrissä, jossa on mahdollista lukea optiset tiheydet (OD) 400 nm:n aallonpituudella. Täysin automaattisia mittauksia varten täytyy fotometrien olla varustettuja mikroprosessorilla tai niiden täytyy olla liitettyjä sopivaan henkilökohtaiseen tietokoneeseen.

20 Kaikissa määrityksissä käytetään kertakäyttöisiä 1 cm:n muovisia puolimikrokyvettejä. Optinen tiheys luetaan 1 minuutin aikavälein 8 syklin aikana huoneen lämpötilassa. Optisen tiheyden keskimääräinen suureneminen minuutissa otetaan mielivaltaisesti aktiivisuusyksiköksi.

25 Inhibition määrityksiä varten sekoitetaan sian tryp siinin (Merck 8350) liuos (liuotettu 0,001 N HC1/50 % glyseroliin) inhibiittorinäytteen kanssa, säädetään 500 ^uliksi puskuriliuoksella ja inkuboidaan 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Reaktio aloitetaan lisäämällä 30 substraattiliuos. Yksityiskohtaisempia tietoja on annet tu seuraavassa taulukossa. Inhibiittoriaktiivisuudet arvioidaan tarkistuskäyrältä tai lasketaan automaattisesti käyttäen tietokoneohjelmia, jotka on kehitetty erityisesti tätä tarkoitusta varten.

I < *» *· liId l i ( M = J

23 94876 Määritys, jossa Määritys, jossa substraattina on substraattina on

_Pyrglu-Gly-Arg-pNA bentsoyyli-Arg-pNA

trypsiiniä 15 μΐ (1 pg/ml) 20 μΐ (100 μΐ/ml)

5 substraattia 50 μΐ (0,02 M 50 μΐ (0,012 M

10 % etanolissa) 10 % DMSOrssa)

Alan tietojen mukaan soveltuu suuri joukko erilaisia mikro-organismeja transformaatioon. Nimittäin sellai-10 set yksisoluiset organismit, joita voidaan kasvattaa viljelmissä tai fermentaatioviljelmissä. Erityisen hyvinä organismeina transformaatiota varten pidetään bakteereja, hiivoja ja sieniä.

Tässä esiteltyyn työhön valittu erityinen organis-15 mi oli E. coli RR1CAM15, joka on tallennettu kokoelmaan

American Type Culture Collection, ATCC nro 35102. Voidaan käyttää myös muita sopivia E. coli -kantoja.

E. coli -bakteerit, jotka oli transformoitu ilmen-tämisplasmideilla pRK 49.2.1 ja pRK 48.1.1, tallennettiin 20 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen,

Grisebachstr. 8, D-3400 Göttingen tallennusnumeroilla DSM 3678 ja DSM 3679.

Arg-15-homologit, kuten esim. esimerkin 7 mukainen homologi, ovat hyvin käyttökelpoisia akuuttien tulehdus-25 tilojen, kuten esim. nivelreuman, perinnöllisen angioneu-roottisen ödeeman, keuhkotulehduksen, haimatulehduksen ja shokin hoidossa. Arg-15-homologit ovat lisäksi käyttökelpoisia suoja-aineina dialyysimenetelmissä, joissa käytetään keinotekoisia membraaneja, ja järjestelmissä, jois-30 sa käytetään kehon ulkopuolista verenkiertosysteemiä.

t ♦ 24 9 4 8 7 6

Esimerkki 1

Glu-52- ja Val-15-Glu-52-aprotiniinia kooditta-vien DNA-palasten synteesi ja puhdistus

Oligonukleotidit, jotka sisältävät geenin, valmis-5 tettiin käyttäen kiinteä faasi -synteesimenetelmiä. Syntee- sikaavio oligomeereja varten oli pääpiirteittäin esitetyn mukainen, ja siinä käytettiin protoniaktivoituja suojattuja 2'-deoksiribonukleotidifosforiamidiitteja. Kaikki perättäiset vaiheet suoritettiin automaattisesti lait-10 teessä Applied Biosystems Model 380 DNA-syntetisoija käyttäen suojattuja nukleotideja, liuottimia, kemikaaleja ja reagensseja, jotka oli saatu tältä valmistajalta.

Kiinteä kantaja-aine, joka myös oli samalta valmistajalta, oli valvotun huokoista lasia, johon aloittava 3'-nuk-15 leotidi oli jo kiinnitetty. Eräitä muunnelmia tehtiin valmistajan käyttöohjeiden ja käyttäjälle tarkoitettujen tiedonantojen mukaiseen automatisoituun reaktiosykliin.

Kun synteesi oli suoritettu loppuun, oligomeereista poistettiin suojaus ja ne katkaistiin irti DNA-syntetisoijas-20 sa olevasta kiinteästä kantaja-aineesta valmistajan suo situsten mukaisesti.

Suojaavien ryhmien poistaminen suoritettiin loppuun kuumentamalla oligomeerin sisältävää vesiliuosta väkevän ammoniumhydroksidin kanssa 55°C:ssa 4-24 tunnin ajan sul-25 jetussa ampullissa. Saatu liuos haihdutettiin, jäännös liuotettiin 0,01 M trietyyliammoniumbikarbonaattipuskuri-liuokseen, pH 7,0 (TEAB-puskuriliuos). Tämä liuos kroma-tografoitiin käyttäen Sephadex-G 50^ -geelisuodatushart-sia. Tämä pylväs valmistettiin ja eluoitiin käyttäen sa-30 maa TEAB-puskuriliuosta. Välisijatilavuudessa eluoituva materiaali yhdistettiin ja liuos haihdutettiin.

Osa jäännöksestä (10-40 % absorbanssiyksiköistä 260 nm:n aallonpituudella), liuotettuna syöttöpuskuri-liuokseen (koostumus: 0,1 % bromifenoli-sinistä, 0,1 % 35 ksyleeni-syanolia, 10 mm dinatrium-EDTA:a, formamidissa) • ·* ' «U-l· Hilu I I ! s» 25 9 4 8 7 6 puhdistettiin lisäksi elektroforeesin avulla polyakryy-liamidigeeleissä. Geelin koko oli 18 x 32 cm ja paksuus 1,5 mm. Kutakin tällä tavalla puhdistettua oligomeeria varten oli syvennyksen leveys 2-5 cm ja yhtä geeliä käyt-5 täen puhdistettiin oligomeereja viiteen oligomeeriin saakka. Akryyliamidin konsentraatio geelissä vaihteli 14:sta 20teen %:iin, riippuen halutun tuotteen ketjunpi-tuudesta. Pitemmille oligomeereille pidetään parhaimpana 14 % akryyliamidigeeliä, kun taas lyhyemmät oligomeerit 10 puhdistettiin pitoisuudeltaan 20 %:iin saakka olevassa akryyliamidigeelissä. Geelit sisälsivät myös 7 M virtsa-ainetta ja Tris-boraatti-EDTA-puskuriliuosta (0,1 M Tris, 0,1 M boraatti, 2 mM EDTA, pH 8,3). Ajopuskuriliuoksena oli sama Tris-boraatti-EDTA-seos. Elektroforeesi suori-15 tettiin käyttäen 20-60 watin pysyvävoimaista virtaa 18-6 tunnin aikana. Tällaisia standardoituja tekniikkoja on esitetty erilaisissa toiminimeltä Applied Biosystems saatavissa käyttäjien tiedotusbulletiineissa.

Kun elektroforeesi on suoritettu loppuun, geeli 20 suljetaan muovipäällykseen ja oligomeerit tehdään näkyvik si varjostamalla ultraviolettivalolla. Tämä varjostaminen suoritetaan sijoittamalla päällystetty geeli fluoroi-valle ohutkerroskromatografialevylle ja tarkastelemalla geeliä käyttäen lyhyen aallonpituuden omaavan ultravio-25 lettivalon lähdettä. Haluttu tuote tulee tässä varjostus- tekniikassa esiin hitaimmin kulkevana, huomattavimpana sinisenä DNA-palasena. Haluttu vyöhyke leikataan irti geelistä. DNA-oligomeeri eluoidaan geelipalasesta jauhemaiseen dietyyliaminoetyyli (DEAE) -selluloosaan käyttäen (IT* 3 0 EpiGene D-Gel'--elektroforeesilaitetta. Oligomeeri saa daan talteen selluloosasta eluoimalla 1 M TEAB-puskuri-liuoksella. Oligomeerin sisältävä puskuriliuos haihdutetaan, jäännös liuotetaan 0,01 M TEAB-puskurilluokseen ja siitä poistetaan sitten suolat antamalla sen kulkea 35 aikaisemmin kuvatun kaltaisen Sephadex-G sd® -pylvään 26 9 4 8 7 6 läpi. Välisijatilavuudessa eluoituva materiaali yhdistetään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan lopullinen tuote.

Käyttäen yllä pääpiirteittäin esitettyjä menetelmiä saatiin noin 0,5 - 5,0 A260-yksikköä kutakin puhdistettua 5 oligomeeria.

Esimerkki 2

Synteettisten aprotiniini-perusgeenien rakentaminen Glu-52- ja Val-15-Glu-52-aprotiniinia varten Näiden erityisten synteettisten aprotiniinigeenien 10 rakentaminen käsitti 15 puhdistetun oligonukleotidin toisiinsa liittämisen (katso kuvio 14). Kuviossa 3 esitetty DNA-sekvenssi sisältää aloituskodonin ATG, kaksi päätösko-donia, TAG:n ja TAA:n, pääterestriktiokohdat Eco RI:n,

Hind III:n ja Bam HI:n ja sisäisiä restriktiokohtia. Näi-15 den kohtien valinta helpotti koodattavan sekvenssin kloo nausta ja sen muuntamista.

Tämän synteettisen geenin rakentamisessa käytettiin palasten lisäksi polynukleotidikinaasia, T4-DNA -ligaasia ja restriktioentsyymejä, jotka on kuvattu yksityiskohtai-20 sesti osassa materiaali ja menetelmät.

Viisitoista puhdistettua oligonukleotidipalasta liuotettiin 50 mM TEABC:hen (trietyyliammoniumbikarbonaat-tipuskuriliuos, pH 7,5) lopulliseksi konsentraatioksi 10 pmoolia/yUl. Kaikkien palasten fosforylointi suoritet-25 tiin neljässä erillisessä osassa (palaset 1,3; palaset 2,4,6; palaset 5,7,9,11,13; palaset 8,10,12,14,16). Valmis telutarkoituksessa liuotettiin 80 pmoolia kutakin palasta, vastaavasti seokseen, jossa oli 1x PNK-seos, 2 ^um ATP, 0,5 uCi 32 P-gamma-ATP:tä 10 pmoolia kohden palasta, 30 10 yksikköä PNK:ta pmoolia kohden palasta, niin että ko konaistilavuudet olivat palasille 1,3; 300 ^ul, palasille 2,4,6; 400 ^ul, palasille 5,7,9,11,13; ja palasille 8,10,12,14,16; 700 ^ul. Kunkin osan kohdalla annettiin reaktion tapahtua 37°C:ssa 30 minuutin ajan. Kaikki osat 35 käsiteltiin fenolilla, saostettiin etanolilla, pestiin ja kuivattiin.

il ' itt.i uni i;i i : . » 27 94876

Hybridisaatiota varten palaset 1,3 ja palaset 2,4,6 (lohko A) liuotettiin ja sekoitettiin 1x ligaasi-seokseen, kokonaistilavuudeksi 120 ^ul, inkuboitiin 5 minuutin ajan 70°C:ssa, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan 5 5 tunnin aikana. Muut palaset (lohko B) hybridisoitiin 240 ^ulissa saman menetelmän mukaan.

Ligoimalla yhdistämistä varten lisättiin lohkon A liuokseen 12 ^ul 10 mM ATP:tä, 12 ^ul T4-DNA-ligaasia ja lohkon B liuokseen kaksinkertainen määrä. Reaktion annet-10 tiin tapahtua 14°C:ssa 7 tunnin ajan. Tämän jälkeen lisät tiin 10 ^ul T4-DNA-ligaasia lohkoa A varten ja 20 ^ul lohkoa B varten ja inkuboitiin jälleen 14°C:ssa 45 minuutin ajan. Seokset käsiteltiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja kuivattiin.

15 Saatu lohko A liuotettiin 90 ^ul:aan 1x SP-100 ja 10 ^ul:aan Eco Rl (10 ^u/^ul), lohko B 90 ^ul:aan 1x SP-50 ja 10 ^ul:aan Bam HI ja inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan. Reaktiot pysäytettiin uuttamalla fenolilla ja saostamalla etanolilla, suoritettiin 6 % polyakryyliamidi-geeli-elektroforeesi ja DNA-lohkot otettiin talteen saman 20 menetelmän mukaan kuin on kuvattu edellä.

Yhtä suuret määrät radioaktiivisesti merkittyjä lohkoja A ja B liuotettiin veteen, säädettiin 1x ligaasi-seokseksi ja hybridisoitiin kuten yllä on kuvattu lopullista synteettiseksi geeniksi ligointia varten. Tätä var-25 ten lisättiin 22 ^ul:aan hybridisaatioseosta 3 ^,ul 10 mM

ATP:tä, 3 ^ul 100 mM DTE:tä, 3 ^ul T4-DNA -ligaasia ja inkuboitiin 14°C:ssa 7 tunnin ajan. Lisättiin jälleen 1 ^ul T4-DNA -ligaasia ja tämän reaktion annettiin tapahtua 14°C:ssa 45 minuutin ajan. Ligaatiotuote puhdistettiin 30 fenoliuuton ja etanolisaostuksen avulla. Suoritettiin normaali restriktioentsyymillä pilkkominen (Bam HI 1,5 ^ul, Eco Rl 1,5 ^ul, kaksoispilkkominen) SP-50:ssä. Materiaali uutettiin fenolilla ja ennen etanolilla saostamista säädettiin vesiliuos 3 mM:ksi MgCl2:n 0,3 M:ksi natriumasetaa-35 tin suhteen. Sitten suoritettiin 6 % polyakryyliamidigeeli- 28 9 4 8 7 6 elektroforeesi ja geeni otettiin talteen saman menetelmän mukaan kuin edellä on kuvattu.

Esimerkki 3

Yhdistelmäplasmidien pRK 63.1.1 ja pRK 54.1.1 val-5 mistaminen

Kokeellista aprotiniinin kloonausta varten valittiin plasmidiksi pUC 8 (J. Vieira ja J. Messing, 1982 Gene, 19, 259). Tämä kloonausvektori koostuu pBR 322:sta peräisin olevasta ampisillinaasigeenistä ja DNA:n repli-10 kaation aloituskohdasta ligoituna lac Z -geenin osaan, jossa on sarja yhtenä kappaleena esiintyviä restriktio-entsyymien tunnistuskohtia. Kun tämä vektori viedään lac E. coliin, synnyttävät transformantit sinisiä kolonioita sopivilla indikaattorilevyillä. DNA-palasten 15 kloonaaminen mihin tahansa monista restriktiokohdista, esimerkiksi Eco Rl:n ja Bam Hirn väliin, inaktivoi lac-geenin, jolloin muodostuu valkeita kolonioita.

Vektorin valmistus

Synteettisen aprotiniini -perusgeenin yhdistämi-20 seksi ligoimalla pUC 8:aan suoritettiin valmistava vek torin valmistaminen. Puhdistettua pUC 8 -DNA:ta (noin 30 pmoolia) pilkottiin kahdesti Eco Rlrllä ja Bam Hiillä normaaleissa restriktioendonukleaasilla pilkkomisen olosuhteissa, jotta saataisiin leikattua irti pieni sisäinen 25 Eco Rl - Bam HI -palanen. Tästä valmisteesta poistettiin fosforia vasikan suolen fosfataasin avulla kuten yllä on kuvattu, suoritettiin erottaminen agaroosigeelielektro-foreesin avulla ja puhdistettiin vektorin suuri Eco Rl -Bam HI -palanen (standardiolosuhteissa). Tämä menettely 30 helpottaa erittäin paljon lisätyöskentelyä vektorin kans sa, koska jää pois vektorimolekyylien itse-ligoituminen Eco Rl - ja Bam HI -päissä ja transformanttien tausta vähenee huomattavasti.

ίΙ ΙΚ-fc Mil I t I 01 . i 29 9 4 8 7 6

Ligointi pRK 63:n (katso kuvio 4) rakentaminen suoritettiin ligoimalla koko puhdistettu synteettisen aprotiniinigeenin määrä 1 pmoolin kanssa vektoria (1,8 yksikköä T4-DNA-li- 5 gaasia, 1x ligaasiseos, kokonaistilavuus 45 ^ul, inku- bointi 14°C:ssa 7 tunnin ajan, 1 yksikön T4-DNA-ligaasia o lisääminen ja uusi inkubointi 14 C:ssa 45 minuutin ajan).

Transformaatio Käyttäen D. Hanahanin transformaatiomenetelmää 10 (katso yksityiskohdat normaalista transormaatiomenetel- mästä) käytettiin vastaanottajasoluna E. coli -kantaa RR1 delta M15 (A. Kalnins et ai. (1983), EMBO Journal 2, 593; ATCC 35102). Kun oli transformoitu 50 %:lla ligoinnin materiaalista saatiin 15 "valkeaa" transformanttia indikaat-15 torimaljoille, jotka sisälsivät ampisilliinia 200yug/ml.

Kaikki 15 transformanttia seulottiin käyttäen muunnelmaa Birnboimin ja Dolyn, 1979, nopeasta analyyttisestä plasmi-dineristysmenetelmästä (katso edeltä). Sen vuoksi liuotettiin 15 näytteen sakat uudelleen 30 ^ul:aan 1x SP-100:a, 20 joka sisälsi 1 ^ug:n RNaasi A:ta. Suoritettiin restriktio- pilkkominen Eco RI:llä ja Bam Hiillä.

Geelielektroforeesin jälkeen havaittiin neljän viidestätoista transformantista sisältävän plasmidi-DNA:ta, johon kuului suurin piirtein 200 emäsparia pitkä Eco Rl -25 Bam HI -palanen.

Kaikkia transformantteja, jotka sisälsivät tämän ECO Rl - Bam HI -palasen, kasvatettiin suuressa mitassa ja kaikista eristettiin plasmidit ja niitä analysoitiin lisää. Kaksi niistä sekvenssoitiin Maxamin ja Gilbertin 30 menetelmän mukaan ja kaikilla saatiin oikea sekvenssi, mikä osoitti kemiallisen synteesin ja rakentamisen erinomaisuuden.

30 94876

Plasmidi pRK 54.1.1 (Vai-15-Glu-52-aprotiniini) ra kennettiin vaihtamalla yksinkertaisesti synteettisen geenin beeta-lohko, joka on Apa I - Stu I -palanen, beeta-lohkoon, joka sisälsi asemassa 15 Väliin kodonin Lys:in ase-5 masta.

Noin 100 pmoolia synteettisiä yksisäikeisiä DNA-pa-lasia BEA 4A ja BEA 4B (katso kuvio 2B) liuotettiin 20 ^ul:aan vettä, kuumennettiin 5 minuutin ajan 95°C:ssa ja jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan (5 tuntia).

10 Hybridisoitunut fosforyloimaton palanen ligoitiin 1,5 pmoo-lin kanssa puhdistettua pRK 63.1.1:n DNA:ta, josta puuttui Apa I - Stu I -palanen. Suoritettiin normaali ligointi käyttäen 30 ^,ul ligointiseosta. E. coli RRIÄM15:n transformoin-ti suoritettiin 50 %:lla ligoinnin seoksesta. 1500 trans-15 formantista testattiin 24 analyyttisen plasmidin eristämi sen ja restriktioanalyysin avulla. Kaikki olivat positiivisia ja kaksi niistä sekvenssoitiin käyttäen M 13 -dideoksi-nukleotidisekvenssointisysteemiä, joka on hankittu toimini-meltä BioLabs, Beverly, MA USA. Transformantti-pRK 54.1.1:tä 20 käytettiin jatkokokeissa.

Esimerkki 4

Ilmentämisplasmidien pRK 48.1.1 ja pRK 49.2.1 rakentaminen

Aprotiniinin ilmentämiseksi fuusioproteiinina raken-25 nettiin plasmidi, jossa aprotiniinigeeni sijaitsi |?-galak- tosidaasigeenin karboksipäässä, kuten on osoitettu samankaltaisissa kokeissa, joita ovat suorittaneet U. Riither ja B. Muller-Hill 1983, EMBO Journal, 2, 1791-1794, ja patenttihakemuksessa DE-OS 33 09 501.9.

30 Synteettisen aprotiniinigeenin ilmentämisvektoriin

. pUR 278 kloonaamista varten valittiin kloonauskohdat Bam HI

*· ja Hind III. Sen vuoksi oli tarpeellista muuntaa aprotinii- nigeeniä lisäämällä Bam HI -kohta geenin 5'- Eco Rl -päähän ja käyttämällä 3'-päässä olevaa Hind III -kohtaa (katso 35 myös kuvio 6).

I· : aa i ani! ι i t m 31 94876 50 pmoolia pRK 63.1.1 -DNA:ta katkottiin täydellisesti yön aikana 37°C:ssa Eco Rlrllä (15 pmoolia hit/yUl) 120 ^ulissa 1x SP-100:a. Tämän DNA-materiaalin ulkonevat 5'- Eco Rl -päät täytettiin entsymaattisen 5 reaktion avulla käyttäen DNA-polymeraasi I:tä (Klenow-pa-lanen), dATPitä ja dTTP:tä (Maniatis et ai. 1982). 600 pmoolia kuivattua alfa- 32 P -ATP:tä (250 uCi) liuotettiin ja sekoitettiin 160 ^ul:n kanssa DNA:ta (50 pmoolia), 10 ^ul:n kanssa 1 mM dATP:tä (10 000 pmoolia), 20 ^ul:n 10 kanssa NT-puskuriliuosta. Sitten lisättiin 10 ^ul DNA- polymeraasi I:tä (Klenow, 50 ^u) ja inkuboitiin ensimmäisen kerran huoneen lämpötilassa. 30 minuutin kuluttua lisättiin 10 ^ul 1 mM dTTP:tä (10 000 pmoolia) yhdessä 5 ^ul:n kanssa polymeraasia (25 ^u) ja inkuboitiin toi-15 sen kerran huoneen lämpötilassa. Materiaali uutettiin fe-noli/sevagilla, radioaktiivisesti merkityt molekyylipaino-fraktiot yhdistettiin, saostettiin etanolilla, pestiin, liuotettiin 50 ^,ul:aan TE:tä ja pantiin säilytettäväksi 20°C:een.

20 20 yul tätä materiaalia, joka oli tasapäistä, käy tettiin ligointiin Bam HI -linkkerin kanssa. Siten 400 pmoolia 5' -Bam HI -linkkeriä, joka oli merkitty gamma-32 P -ATP:llä (normaali 5'-fosforylointimenetelmä) ligoi-tiin 40 pmooliin DNA-päitä (normaalit ligointiolosuhteet 25 4,5 T4-DNA-ligaasia, kokonaistilavuus 60 yul). Linkke rin ligoinnin laadun tarkistamiseksi suoritettiin analyyttinen geelielektroforeesi. Täydellinen ligoituminen saatiin aikaan, kun lisättiin 100 pmoolia Bam HI -linkkeriä, 1,8 yksikköä T4-DNA-ligaasia, inkuboitiin 20°C:ssa 1 tun-30 nin ajan ja lisättiin 1 yksikkö T4-DNA-ligaasia ja inkuboitiin 14°C:ssa 18 tunnin ajan. Reaktioseos uutettiin fenoli/sevagilla, saostettiin etanolilla, pestiin, kuivattiin ja liuotettiin 40 ^ul:aan TE:tä.

Synteettisen aprotiniinigeenin valmistamiseksi, jos-35 sa on Bam HI - ja Hind III -päät, katkaistiin linkkeriin yhdistetty lineaarinen plasmidi (10 pmoolia) ensin Hind 111:11a (10,5 pmoolia hit/^ul), 5 tuntia, 37°C) ja sit- 32 94876 ten Bam Hiillä (40 pmoolia hit/^ul, 20 tuntia, 37°C, normaaliolosuhteet). Palanen eristettiin kun oli suoritettu erottaminen 6 % polyakryyliamidigeeli-eletrofo-reesin avulla ja puhdistettiin huolellisesti (katso nor-5 maalia menetelmää).

Vektorin valmistus

Kantavektori pUR 278 (noin 5 pmoolia) katkaistiin ensin Hind 111:11a (normaaliolosuhteet), puhdistettiin fenoli/sevag-uuton ja etanolisaostuksen avulla, liuotet-10 tiin uudelleen ja pilkottiin sitten Bam HI:llä (normaali- olosuhteet) . Tämä materiaali lastattiin 1 % agaroosigee-liin, suoritettiin elektroforeesi, eristettiin ja puhdistettiin normaaliolosuhteiden mukaan, jotta päästäisiin eroon 18 emäsparin pituisesta Bam HI - Hind III -palases-15 ta, joka kilpailisi ligoinnissa synteettisen aprotiniini- geenin kanssa.

Ligaatio ja transformaatio

Ligointiin käytettiin 0,3 pmoolia vektoria, 1,5 pmoolia palasta (suurin piirtein), 2 yksikköä T4-DNA-ligaa-20 siä (normaaliolosuhteet, kokonaistilavuus 30 ^ul, inku- bointi 4 tuntia 14°C:ssa).

Transformaatio suoritettiin E. coli -kannan RR1 delta M 15 ollessa isäntänä, käyttäen yksi kolmasosa li-gointiseoksesta (normaaliolosuhteet). Saatiin kaikkiaan 25 173 "sinistä" koloniota indikaattorimaljoilla, jotka sisäl sivät ampisilliinia 200 ^ug/ml. Näistä analysoitiin 12 transformanttia lisäksi nopean analyyttisen plasmidineris-tyksen avulla (normaaliolosuhteet). 173 transformantis-ta pitäisi 30:n olla taustatransformantteja laskettuna 30 transformanttien prosenttimäärästä, joka saatiin uudel- leenligoimalla vektori. Tämän tuloksen varmisti kyseisten · 12 transofrmantin plasmidien restriktioanalyysi. 8 niistä oli positiivisia osoittaen omaavansa noin 200 emäsparin pituisen Bam HI - Hind III restriktiopalasen. Positiivi-35 set yhdistelmäplasmidit saatettiin myös lineaarisiksi • « 33 94876 SSt II:n ja aprotiniinigeenissä ainoana sijaitsevan restriktiokohdan avulla. Maxamin ja Gilbertin (1980) mukaan suoritettu emässekvenssianalyysi osoitti, että plasmidiin pRK 48.1.1 on liittynyt haluttu aprotiniini-5 DNA-palanen (katso kuviota 6). Plasmidia pRK 48.1.1 käytettiin lisäanalyyseissä ja ilmentämistyössä.

Plasmidin pRK 49.2.1 rakentaminen suoritettiin täsmälleen samalla menetelmällä käyttäen pRK 54.1.1:stä peräisin olevaa Val-15-Glu-52-geeniä. Positiivinen yhdistelmä-10 plasmidi 49.2.1 osoitti omaavansa oikean DNA-sekvenssin, ja tätä rakennelmaa käytettiin lisäanalyyseissä ja ilmen-tämistyöskentelyssä.

^-galaktosidaasi-Glu-52-aprotiniinin ja ^-galaktosi-daasi-Val-15-Glu-52-aprotiniinin ilmentymisen osoittaminen 15 Näiden kummankin rakennelman ilmentämisen yrittä miseksi istutettiin E. coli -kantoja, jotka sisälsivät pRK 48.1.1:n (tallennettu kokoelmaan DSM, DSM-nro 3679) tai pRK 49.2.1:n (tallennettu kokoelmaan DSM, DSM-nro 3678), 2 ml:aan LB-ampisilliini-elatusainetta, johon oli lisätty 20 4 yul 0,1 M IPTG:tä. Myös klooni, joka sisälsi pUR 278:n ilman lisättyä aprotiniinigeeniä, istutettiin viljelyai-neeseen, jotta saataisiin negatiivinen tarkistuskoe kokeita varten. Kun oli kasvatettu 12-16 tuntia 37°C:ssa sekoittaen, istutettiin 1 ml:n näytteitä suoraan 100 ml:aan LB-25 ampisilliini-elatusainetta. Kun oli kasvatettu 12-16 tuntia 37°C:ssa sekoittaen, otettiin solut talteen sentrifu-goimalla nopeudella 5000 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan Beckmann JA 10 -roottorissa.

Fuusioproteiinit osoitettiin suoraan SDS-polyakryy-30 liamidigeelielektroforeesin avulla U. K. Laemmlin mukaan (1970, Nature, 277, s. 680, katso myös B. D. Hames ja D. Rickwood 1981, Gel electrophoresis of proteins, IRL Press Limited, Oxford).

Kaistaa kohden sentrifugoitiin noin 1 x 10E9 solua 35 ja ne liuotettiin uudelleen 1:5-laimennokseen SDS-näyte-puskuriliuosta (0,3 M Tris-HCl pH 8,8, 50 % glyseroli, 34 94876 5 % SDS, 25 % merkaptoetanoli). Elektroforeesin jälkeen geelit värjättiin Coomassie-sinisellä. Kuviossa 7 on esitetty tyypillinen esimerkki E. colin proteiineista, joihin kuuluu indusoituva 6-galaktosidaasi-Glu-52-aprotinii-5 nifuusioproteiini.

Liuokset

Rikkomispuskuriliuos: 50 mM Tris 100 mM natriumkloridi, 10 10 mM magnesiumkloridi; 10 mM merkaptoetanoli; 2 M guanidinium-HCl-liuos: 2 M guanidinium-HCl; 15 50 mM Tris-HCl, pH 7,7 100 mM natriumkloridi; 10 mM merkaptoetanoli; 6 M guanidinium-HCl-liuos: 20 6 M guanidinium-HCl; 50 mM Tris-HCl; 100 mM natriumkloridi; 10 mM merkaptoetanoli.

Esimerkki 5 25 Glu-52-aprotiniinin valmistus 1. B-gal-fuusioproteiini-Lys-15-Glu-52-aprotinii-nin eristäminen ja lohkaiseminen syaanibromidilla

Valmistustarkoitusta varten sentrifugoitiin 6 1 E. coli -kannan RR1 delta Ml5 yli yön kasvatettua viljelmää 30 15 minuutin ajan nopeudella 8000 kierrosta minuutissa.

Solunappi, painoltaan noin 15 g, suspendoitiin uudelleen 30 mitään rikkomispuskuriliuosta ja sonikoitiin 6 minuutin ajan (jääjäähdytys). Solulysaattia sentrifugoitiin 20 minuutin ajan nopeudella 20 000 kierrosta minuutissa. Su-35 pernatantti heitettiin pois. Sakka, noin 10 g, suspendoitiin uudelleen 20 mitään 2 M guanidiniumhydrokloridiliuosta . ja homogenoitiin. Kun oli sentrifugoitu 20 minuutin ajan nopeudella 20 000 kierrosta minuutissa, heitettiin super- 35 94876 natantti pois. Sakka, noin 8 g, liuotettiin ^-ilmakehässä 20 ml:aan 6 M guanidiniumhydrokloridiliuosta, joka sisälsi 200 mg DTT:tä, ja pelkistettiin 1 tunnin ajan 50°C:ssa. Liuosta sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeu-5 della 10 000 kierrosta minuutissa ja dialysoitiin 24 tunnin ajan vettä vastaan, joka sisälsi 10 mM merkaptoetano-lia. Saostunut fuusioproteiini koottiin sentrifugoimalla 20 minuutin ajan nopeudella 20 000 kierrosta minuutissa. Märkä fuusioproteiini liuotettiin 30 ml:aan väkevää muu- 10 rahaishappoa ja laimennettiin sitten 70-prosenttiseksi vedellä. Fuusioproteiini jaettiin lisäämällä 4 g syaani-bromidia ja inkuboimalla 18 tunnin ajan typpi-ilmakehäs-sä pimeässä. Reaktio pysäytettiin laimentamalla 200 ml:11a vettä. Vesi ja haihtuvat sivutuotteet poistettiin pakaste- 15 kuivaamalla.

Syaanibromidilohkaisu tarkistettiin SDS-geelielekt-roforeesin avulla Laemmlin mukaan. Saanto oli noin 1,5 g syaanibromidikappaleita. Sarjassa kokeita saannot vaihte-livat 0,8:sta 2,5:een g:aan.

20 Liuokset

Puskuriliuos A, pH 8,2 50 mM Tris-HCl 1 mM EDTA Säädä pH 8,2:ksi 25 Puskuriliuos B, pH 8,2 8 M virtsa-aine 1 mM bis-(2-hydroksietyyli)-disulfidi 1 mM 2-merkaptoetanoli puskuriliuoksessa A; 30 Puskuriliuos C, pH 8,2 1 mM bis-(2-hydroksietyyli)-disulfidi 1 mM 2-merkaptoetanoli puskuriliuoksessa A;

Puskuriliuos D, pH 8,2 35 0,6 M natriumkloridi puskuriliuoksessa A.

36 94876 2. Glu-52-aprotiniinin erottaminen ja rena-turointi

Noin 300 mg pakastekuivattuja Lys-15-Glu-52-apro-tiniini-^3-galaktosidaasin syaanibromidipalasia liuotet-5 tiin 300 ml;aan puskuriliuosta B, joka sisälsi 300 mg DTT:tä. Liuosta pelkistettiin 1 tunnin ajan 50°C:ssa typ-pi-ilmakehässä. Sitten liuos syötettiin CM-Sephadex-pylvää-seen (25 x 1 00 mm), joka oli täytetty noin 15 ml:11a CM- T5 sepharose Fast Flow :ä. Pylväs tasapainotettiin puskuri-10 liuoksella B. Pylvästä pestiin puskuriliuoksella B, kunnes perusviiva oli vakiintunut. Ensimmäisessä lineaarista gradienttia käyttävässä eluutiossa pylvästä kehitettiin 100 ml :11a puskuriliuosta B ja 100 ml :11a puskuriliuosta C. Ennen kuin otettiin käyttöön toinen lineaarinen eluutio-15 gradientti, pylvästä pestiin puskuriliuoksella A, kunnes perusviiva oli vakiintunut. Toinen gradientti muodostettiin 100 ml:11a puskuriliuosta A ja 100 ml :11a puskuriliuosta D. Huipun muodostaneista fraktioista analysoitiin tryp-siiniä inhiboiva aktiivisuus ja ne tutkittiin ELISA:n ja 20 Western-täpläkokeen avulla (kuvio 10). Sarjassa kokeita oli eri testien avulla arvioitu saanto väliltä 0,4-2 mg.

3. Glu-52-aprotiniinin puhdistaminen käänteisfaasi-HPLC:n avulla

Aktiiviset fraktiot konsentroitiin haihduttamalla 25 ja niitä dialysoitiin sitten 0,1 M NH^HCO^ja, pH 7,5, vastaan 18 tunnin ajan. Lyofilisoinnin jälkeen inhibiittori liuotettiin 0,1 % TFA:han ja fraktioitiin käänteisfaasikro-matografian avulla käyttäen runsashuokoista RP-18-pylvästä (BIORAD) ja gradienttia, jonka muodostivat 0,1 % TFA pusku-30 riliuoksessa A ja 0,1 % TFA 60 % puskuriliuoksessa B. Inhibiittori luonnehdittiin N-terminaalisen sekvenssoinnin ja • aminohappoanalyysin avulla.

37 94876

Esimerkki 6

Val-15-Glu-52-aprotiniinin ilmentäminen ja tuotteen luonnehtiminen

Plasmidin pRK 49.2.1 sisältävän E. coli -transfor-5 mäntin fermentaatiokasvatus ja Val-15-Glu-52-aprotiniinin puhdistaminen suoritettiin samojen menetelmien mukaan kuin on kuvattu esimerkissä 5, sillä erotuksella, että aktiivisuus testattiin elastaasin-inhibointikokeen avulla trypsii-nin-inhibointitestin asemesta. Val-15-Glu-52-aprotiniini 10 eluoituu CM-Sephadex-pylväästä aikaisemmin kuin Glu-52- aprotiniini.

Sarjassa kokeita oli eri testien avulla arvioitu saanto 0,1 - 1 mg.

Samaa HPLC-puhdistusta käytettiin Val-15-Glu-52-15 aprotiniinin eristämiseen. Inhibiittoriaktiivisuus määri tettiin tutkimalla leukosyyttien elastaasin inhibitiota. Inhibiittori luonnehdittiin N-mterminaalisen sekvenssoin-nin ja aminohappoanalyysin avulla.

Esimerkki 7 20 Arg-15-Glu-52-aprotiniinin rakentaminen, ilmentämi nen ja luonnehtiminen

Arg-15-Glu-52-aprotiniinigeenin rakentamiseksi vaihdoimme plasmidin pRK 54.1.1 kloonatun Val-15-Glu-52-apro-tiniinigeenin beeta-lohkon (kuvio 1), joka on Apa I - Stu I 25 -DNA-palanen.

Tämä palanen korvattiin vastaavalla palasella, joka koodittaa aminohappoasemassa 15 arginiinin kodonilla CGT. Saadulle yhdistelmävektorille annettiin nimi pNH 01.1.1, se sekvenssoitiin osittain ja käytettiin lisäkokeisiin.

30 Arg-15-Glu-52-aprotiniinigeenin 5'-päähän lisättiin

Bam HI -kohta ja eristetty geeni ligoitiin Bam HI - Hind III -pilkottuun ilmentämisvektoriin pUR278.

Tämä DNA käytettiin E. coli -kannan RR1 delta M15 transformointiin ja selektoitiin transformantti, joka si-35 sälsi uuden ilmentämisplasmidin pRK 112.1.1.

38 9 4 8 7 6 Tästä transformantista eristettiin ^5-galaktosidaa-si-Arg-15-Glu-52-aprotiniini-fuusioproteiini ja Arg-15-Glu-52-aprotiniini puhdistettiin syaanibromidilla lohkoa-misen jälkeen kuten aikaisemmin on kuvattu.

5 Kineettiset tutkimukset osoittivat yllättäen, että rekombinaatiotuote Arg-15-Glu-52-aprotiniini on hyvin tehokas inhibiittori ihmisen plasman kallikreiinille (K. = -10 1 3,2 x 10 (M)), kationiselle ja anioniselle ihmisen tryp- -11 siinille, jolloin K^arvot ovat alle 10 (M). K^-arvot 10 määritettiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet M. W.

Empie ja M. Laskowski, jr., Biochem. 21, 2274 (1982).

Claims (8)

94876

1. DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa aprotiniinin, jossa kohdan 52 aminohappo on korvattu ami- 5 nohapolla Glu, tai sen funktionaalisesta vastaavan apro-tiniinihomologin, jossa kohdan 52 aminohappo on korvattu aminohapolla Glu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa aprotiniinin tai ap- 10 rotiniinihomologin, jossa kohdan 15 aminohappo on korvattu luonnossa esiintyvällä aminohapolla.

3 I CTTAGTAAAGCTTG !' 1S1 -............. 194. GAATCATT7CGAAC 94876

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa aprotiniinin tai ap-rotiniinihomologin, jossa kohdan 15 aminohappo on korvat- 15 tu aminohapolla Vai tai Arg.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se on E A C P o A 20 ? 1 AATTCATCCGTCCGGACTTCTGCCTCGAGCCGCCGTACACTGOGCCCTGCAAAGCTCGTA 1 - — — 50 TTAAGTACGCAGGCCTTGAAGACGGAGCTCGGCGGACATGTGACCGGACGTTTCGAGCAT c: s T u 25 1 TCATCCGTTAGTTCTACAATGCAAAGGCAGGCCTGTGTCAGACCTTCGTATACGGCGGTT tl ------....---------♦---------♦-----------------------------+120 AGTAGGCAATGAAGATGTTACGTTTCCGTCCGGACACAGTCTGGAAGCATATGCCGCCAA c: S A 30 c 2 GCCG7CCTAAGCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCGAACCTACTTGCGGTGGTC 1 21 -------- - --------------------*-----------------------------*180 CGGCACGATTCGCATTGTTGAAGTI i'AGGCGCCTTCTGACGCTTGCATGAACOCCACCAC H B I A

35. M D H

5. Ilmentämisplasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen DNA:n.

6. Bakteeri-isäntäsolu, tunnettu siitä, 5 että se on transformoitu ilmentämisvektorilla, joka sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen DNA:n.

7. Menetelmä aprotiniinin tai sen funktionaalises-ti vastaavan aprotiniinihomologin valmistamiseksi, 10 tunnettu siitä, että a) transformoidaan bakteeri-isäntäsolu ilmentämisvektorilla, joka sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen DNA:n, b) kasvatetaan isäntäsolua, 15 c) eristetään fuusioproteiini soluviljelmästä, d) lohkaistaan fuusioproteiini ja e) eristetään aprotiniini tai aprotiniinin homologi·

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että valmistetaan aprotiniini tai sen homologi β-galaktosidaasifuusioproteiinista, joka on saatu yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla. > · ' '» <«.< «Iin (:«!«·' I 4i 94876