RU2337966C2 - Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения - Google Patents
Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2337966C2 RU2337966C2 RU2006128449/13A RU2006128449A RU2337966C2 RU 2337966 C2 RU2337966 C2 RU 2337966C2 RU 2006128449/13 A RU2006128449/13 A RU 2006128449/13A RU 2006128449 A RU2006128449 A RU 2006128449A RU 2337966 C2 RU2337966 C2 RU 2337966C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hsa
- recombinant
- pastoris
- serum albumin
- human serum
- Prior art date
Links
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 101001086426 Homo sapiens Olfactory receptor 1J2 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100032722 Olfactory receptor 1J2 Human genes 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 101150026546 hsa gene Proteins 0.000 description 7
- 101000693961 Trachemys scripta 68 kDa serum albumin Proteins 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 3
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007469 bmm - medium Substances 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042546 GCGGCCGC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- HAMNKKUPIHEESI-UHFFFAOYSA-N aminoguanidine Chemical compound NNC(N)=N HAMNKKUPIHEESI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003809 bile pigment Substances 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000029865 regulation of blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 description 1
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и препаративной биохимии и может быть использовано в биофамакологии и медицине. Клетки дрожжей P.pastoris последовательно трансформируют двумя разными генетическими конструкциями, содержащими ген предшественника человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). Полученный штамм-продуцент культивируют в питательной среде. Рекомбинантный ЧСА выделяют из культуральной среды путем осветления указанной среды, а также проведения стадий последовательного центрифугирования при 2000 и 10000 g, ультрафильтрации, диализа и катионообменной хроматографии на колонке Source S. Целевой продукт представляет собой элюат, включающий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин, 50-мМ фосфатный буфер, содержащий 400 мМ хлорида натрия, с рН 9. Применение изобретения позволяет расширить арсенал средств, направленных на получение рекомбинантного ЧСА, и получать рекомбинантный ЧСА в виде продукта, который помимо рекомбинантного ЧСА содержит 50-мМ фосфатный буфер, содержащий 400 мМ хлорида натрия, и имеет рН 9. 2 н.п. ф-лы, 6 ил.
Description
Изобретение относится к биофамакологии, препаративной биохимии, биотехнологии и медицине и касается препарата человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и способа его получения.
Альбумин является наиболее распространенным растворимым белком позвоночных и в то же время представляет собой белок с самой высокой концентрацией в плазме.
У людей ЧСА продуцируется в печени в виде глобулярного, негликозилированного белка с молекулярной массой 65 кДа. Данный белок участвует в большом числе существенных функций, которые включают регуляцию кровяного давления в системе циркуляции, а также транспортировку жирных кислот, аминокислот, желчных пигментов и многих молекул сыворотки.
Для поддержания нормального осмотического давления у пациента, страдающего от потери жидкости, такой как в случае хирургической операции, шока, ожога или отека, ЧСА вводят в качестве заменителя плазмы. Для данной цели ЧСА в настоящее время производят путем фракционирования крови, собранной у доноров крови. Однако данный способ получения неизбежно включает опасность контаминации инфекционными агентами, такими как вирус гепатита, вирус иммунодефицита человека и т.д. Поэтому очистка ЧСА из крови человека включает пастеризацию продукта и является очень дорогостоящей.
Клонирование кДНК, кодирующей ЧСА, в экспрессионный вектор, трансформация бактериальных или дрожжевых клеток хозяина с использованием данного вектора, культивирование трансформированных хозяев и выделение полученного таким образом ЧСА, описаны, например, в ЕР 091527, ЕР 366400 и ЕР 612761. Одна из проблем, связанных с выделением ЧСА из рекомбинантных клеток хозяина, основывается на том факте, что остаточные микробные компоненты, такие как бактериальные или дрожжевые белки или липиды, являются высокоантигенными для человека и, таким образом, ЧСА должен быть достаточно очищен.
Тот факт, что ЧСА как белку-носителю присуща связывающая активность в отношении множества микробных продуктов и компонентов культуры ткани, дополнительно усложняет схему счистки и ее результативность.
Это связано с ростом содержания в культуральной жидкости продуктов крови, таких как факторы коагуляции, получаемых путем рекомбинантной экспрессии генов, кодирующих данные факторы. Предполагается, что динамика рынка будет далее повышать относительную стоимость очистки ЧСА из крови. Для обеспечения достаточной поставки ЧСА для фармацевтического применения в данной области разработаны различные альтернативные способы получения ЧСА, в большей части которых применяется рекомбинантная экспрессия генов, кодирующих данный белок.
Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ и препарат, описанный в ЕР 0091527, который принят в качестве прототипа.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение выхода ЧСА.
Данный технический результат достигается заявленным способом получения рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), включающим выделение и очистку из содержащего его источника. Для выделения ЧСА предварительно получают клетки дрожжей P.pastoris, стабильно трансформированные рекомбинантным вектором рР1С9, содержащим промотор А0Х1 гена, нативный терминатор и сигнал полиаденилирования АОХ1 гена, ген HIS4 дрожжей Pichia дикого типа и 3′А0Х1 последовательность после сигнала терминации транскрипции из А0Х1 гена, служащая для интеграции в А0Х1 локус, с получением ДНК плазмиды рР1С9/ЧСА5, которая была линеризована по сайтам BgIII и трансформирована в штамм GS115/4CA5 методом электропорации, затем дополнительно получают копию гена ЧСА с помощью вектора pP1CZ@A, позволяющего вести отбор полученных трансформантов за счет гена устойчивости к зеоцину, ДНК плазмиды pP1CZ@A/ЧСА была линеризована по сайту SacI и трансформирована методом электропорации в полученный на предыдущей стадии штамм-продуцент GS115/ЧСА5 с одной копией гена ЧСА. Результирующий штамм-продуцент GS115/Alb2 P.pastoris с двумя копиями гена ЧСА выращивают в питательной среде, затем отобранную культуральную среду осветляют последовательным центрифугированием при 2000 и 10000 g, супернатант концентрируют ультрафильтрацией, диализуют, проводят катионообменную хроматографию на колонке Source S. Адсорбированный ЧСА элюируют фосфатным буфером, элюат содержит рекомбинантный ЧСА.
Полученный ЧСА используют в качестве препарата для различных медицинских целей.
Заявленное изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг.1 - нуклеотидная и аминокислотная последовательности рЧСА.
(а) - нуклеотидная последовательность фрагмента, содержащего кДНК гена человеческого сывороточного альбумина; (b) - соответствующая ей аминокислотная последовательность человеческого сывороточного альбумина.
На фиг.2 представлена схема получения экспрессионного штамма GS115/ЧСА5.
(а) - рекомбинация между линеризованной плазмидой рРIС9/ЧСА и хромосомной ДНК P.pastoris; (b) - интегрирование нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий сывороточный альбумин, в АОХ 1 локус хромосомной ДНК P.pastoris.
На фиг.3 - электрофореграмма результатов анализа интеграции экспрессионных единиц ЧСА в геном P.pastoris. М-маркер молекулярного веса фирмы Fermentas (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 п.н.), 1 - ПНР с геномной ДНК P.pastoris GS115, 2 - ПЦР с плазмиды рРIС9/ЧСА, 3-5 - ПНР с геномной ДНК рекомбинантных клонов-продуцентов ЧСА.
На фиг.4 - авторадиограмма результатов анализа встраивания экспрессионной единицы проЧСА в геном P.pastoris. Саузерн-гибридизация зонда, соответствующего последовательности ЧСА, с геномной ДНК штамма GS115 P.pastoris (1) и продуцентов ЧСА (2, 3, 4), обработанной эндонуклеазами BamHI и NotI; маркер молекулярного веса - геномная ДНК фага λ, обработанная эндонуклеазой HindIII (5).
На фиг.5 - электрофоретический анализ в 8% SDS-ПААГ результатов экспрессии (96 часов после индукции) рекомбинантных клонов. 1 - препарат ЧСА промышленного производства (Вауег), 2-7 - 50 мкл осажденной 50% раствором трифторуксусной кислоты культуральной среды рекомбинантных клонов рРIС9/ЧСА1-6 соответственно
На фиг.6 - схема получения экспрессионного штамма GS115/Аlb2.
(а) - ПЦР гена ЧСА с полученной ранее рРIС9/ЧСА. (b) - клонирование гена проЧСА в вектор pPICZαA. (с) - рекомбинация между линеризованной плазмидой pPICZαA/ЧСА и хромосомной ДНК клона рР1С9/ЧСА5 P.pastoris. (d) - интегрирование нуклеотидной последовательности, кодирующей проЧСА, в 5′АОХ 1 локус хромосомной ДНК клона рР1С9/ЧСА5 P.pastoris. (e) - последовательность, амплифицирующаяся при помощи ПЦР со специфических праймеров, соответствующих 5′- и 3′-концам последовательности проЧСА и лежащая между копиями генов альбумина.
Изобретение осуществляется следующим образом.
ПОЛУЧЕНИЕ ИСХОДНОЙ ЭКСПРЕССИОННОЙ КОНСТРУКЦИИ
Для создания экспрессионной конструкции, содержащей ген ЧСА, был использован вектор pPIC9 (Invitrogen), содержащий следующие обязательные элементы: промотор АОХ1 гена, нативный терминатор и сигнал полиаденилирования АОХ1 гена, ген HIS4 дрожжей Pichia дикого типа и 3′АОХ1 последовательность после сигнала терминации транскрипции из АОХ1 гена, служащая для интеграции в АОХ1 локус. Этот вектор позволяет клонировать нуклеотидную последовательность целевого белка вместе с собственной сигнальной последовательностью (для секреции экспрессируемых продуктов), а также способен комплементировать ауксотрофность по гистидину за счет гена His4. Для клонирования фрагмента белка ЧСА был выбран 5′-концевой сайт BamHI, что позволяет получить нативный N-конец целевого продукта при отщеплении сигнальной последовательности.
Поли(А)+РНК, выделенная из образцов биопсии клеток печени доноров, была использована в качестве матрицы для реакции обратной транскрипции с олиго(dT18) праймером. Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность ЧСА (фиг.1 (а)), был амплифицирован методом ПЦР с полученной кДНК с использованием специфических олигонуклеотидов
(5′)-AGTAGGATCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATT
(5′)-AGATCATCAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG,
комплементарных 5′- и 3′-концам последовательности проЧСА соответственно, и содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и NotI. ПЦР-продукт размером 1800пар оснований, содержащий последовательность проЧСА, был обработан эндонуклеазами рестрикции BamHI и NotI и клонирован в аналогично рестрицированный вектор рРIС9. Рестрикционный анализ ДНК отобранных положительных клонов показал наличие BamHI - NotI фрагмента величиной 1800 пар оснований. Нуклеотидная последовательность альбумина (V00495) была определена в составе конструкции рРIС9/ЧСА секвенированием по методу Сенгера. ДНК плазмиды рРIС9/ЧСА была линеризована по сайтам BgIII и трансформирована в штамм GS155 (Invitrogen) методом электропорации. Схема получения экспрессионного штамма GS115/ЧСА5 представлена на фиг.2.
Полученные клоны были тестированы на Mut+ или Muts фенотип по росту на чашках с ММ- и MD-агаром. Среди полученных трансформантов были отобраны клоны со слабо выраженным ростом на ММ-агаре (MutS фенотип). Встраивание нуклеотидной последовательности ЧСА в дрожжевой геном было проанализировано при помощи метода ПЦР со специфических праймеров, соответствующих 5′- и 3′-концам последовательности ЧСА, соответственно. В результате ПЦР с геномной ДНК рекомбинантных клонов и вектора рРIС9/ЧСА образовывались фрагменты ДНК размером около 1850 п.н., соответствующие последовательности ЧСА. В качестве контроля использовалась геномная ДНК штамма GS115 (фиг.3).
Интеграция последовательности, кодирующей ЧСА, в геном P.pastoris была также подтверждена результатами гибридизации по Саузерну (фиг.4). Обработанная рестриктазами BamHI и NotI геномная ДНК рекомбинантных клонов была прогибридизована с радиоактивно меченым фрагментом проЧСА. На полученной авторадиограмме можно видеть появление фрагмента размером около 1,8 т.п.н., соответствующего интегрированной в геном последовательности ЧСА, по сравнению с геномной ДНК нетрансформированных клеток штамма GS115 P.pastoris.
Для аналитической экспрессии в качалочных колбах было отобрано несколько клонов. Экспрессия проводилась в течение 4 суток, аликвоты экспрессионной культуры отбирались каждые 24 часа. Для анализа содержания рекомбинантного ЧСА в культуральной среде использовался метод денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией геля (фиг.5).
По результатам денситометрического анализа для дальнейшей работы был выбран клон GS115/ЧСА5 с наибольшим уровнем экспрессии целевого белка (1,5 г/л).
ПОЛУЧЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИОННОЙ КОНСТРУКЦИИ
Для увеличения количества экспрессируемого белка в геном полученного клона GS115/ЧСА5 была интегрирована еще одна копия гена альбумина. Для создания еще одной экспрессионной конструкции, содержащей ген ЧСА, был использован вектор pPICZαA (Invitrogen), позволяющий вести отбор полученных трансформантов за счет гена устойчивости к зеоцину.
Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность ЧСА (фиг.1(а)), был амплифицирован методом ПНР с полученной ранее рРIС9/ЧСА с использованием специфических олигонуклеотидов
(5′)-AGTAGGATCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATT
(5)′-AGATCATCAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG,
комплементарных 5′- и 3′-концам последовательности ЧСА соответственно и содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции HindIII и NotI. ПНР-продукт размером 1800 пар оснований, содержащий последовательность проЧСА, был обработан эндонуклеазами рестрикции HindIII и NotI и клонирован в аналогично рестрицированный вектор pPICZαA. Рестрикционный анализ ДНК отобранных положительных клонов показал наличие HindIII - NotI фрагмента величиной 1800 пар оснований. Нуклеотидная последовательность альбумина (V00495) была определена в составе конструкции pPICZαA/ЧСА секвенированием по методу Сенгера. ДНК плазмиды pPICZαA/ЧСА была линеризована по сайту SacI и трансформирована в штамм-продуцент GS115/ЧСА5 (полученный нами ранее и содержащий в геноме одну копию гена альбумина) методом электропорации. Схема получения экспрессионного штамма GS115/Аlb2 представлена на фиг.6.
ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА GS115/Аlb2 МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ P.pastoris
Отбор полученных трансформантов осуществлялся по устойчивости к антибиотику зеоцину. Полученные клоны были тестированы на Mut+ или MutS фенотип по росту на чашках с ММ- и MD-агаром. Среди полученных трансформантов были отобраны клоны со слабо выраженным ростом на ММ-агаре (MutS фенотип). Встраивание второй копии нуклеотидной последовательности проЧСА в дрожжевой геном было проанализировано при помощи метода ПЦР со специфических праймеров, соответствующих 5′- и 3′- концам последовательности ЧСА, амплифицирующих последовательность, лежащую между копиями генов альбумина. В результате ПЦР с геномной ДНК рекомбинантных клонов и вектора pPICZαA/ЧСА образовывались фрагменты ДИК размером около 3500 п.н., соответствующие последовательности вектора pPICZαA (фиг.5(е)). В качестве отрицательного контроля использовалась геномная ДНК штамма GS115 и рРIС9/ЧСА (полученного нами ранее и содержащего в геноме одну копию гена альбумина).
Наличие двух копий, кодирующих ЧСА, в геноме штамма GS115/Аlb2 P.pastoris было подтверждено ПЦР в реальном времени со специфических праймеров (соответствующих 5′- и 3′-областям последовательности проЧСА), при котором скорость накопления продукта зависит от количества копий амплифицирующейся последовательности. Были проведены аналитические экспрессии нескольких клонов, содержащих две копии гена альбумина в геноме, и выбран клон с максимальным уровнем экспрессии - GS115/Аlb2. Экспрессия целевого белка возросла с 1,5 до 2,2 г/л.
КОНТРОЛЬ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ рЧСА
Экспрессия рекомбинантного ЧСА в качалочных колбах
Выращивание P.pastoris и экспрессию проводили либо на «богатой» среде (BMGY, BMMY), либо на «бедной» (BMG, ВММ).
Индивидуальные колонии P.pastoris были помещены в 250 мл среды BMGY или BMG в качалочные колбы и выращивались со встряхиванием при 30°С до оптической плотности OD600=2. Клетки собирали центрифугированием при 2000 g и индуцировали экспрессию суспендированием клеточного осадка в 50 мл среде BMMY или ВММ, соответственно. Среда BMGY содержала 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 100 мМ фосфата калия рН 6, 1.34% дрожжевой азотной основы, 4*10-5 биотина, 1% глицерина, среда BMMY вместо глицерина содержала выбранное количество метанола. Среда BMG содержала 100 мМ фосфата калия рН 6, 1.34% дрожжевой азотной основы, 4*10-5 биотина, 1% глицерина, среда ВММ вместо глицерина содержала выбранное количество метанола. Метанол добавлялся до выбранного количества каждые 24 часа.
Детекция уровня экспрессии
Культуральную среду осветляли последовательным центрифугированием при 2000 g и 10000 g. Супернатант отбирали, аликвоту анализировали с помощью электрофореза в 8% денатурирующем полиакриламидном геле по методике Лэммли. Количество белка оценивали денситометрией.
Хроматографическая очистка
Культуральную среду осветляли последовательным центрифугированием при 2000 g и 10000 g. рН осветленной среды доводили до 8,5, центрифугировали 14000 g 15 мин.
К супернатанту добавляли тетрабората натрия до концентрации 0.5 М и выдерживали 12 часов при +4°С. Суспензию центрифугировали 14000 g 15 мин. К супернатанту добавляли каприлат натрия, цистеин, аминогуанидин и 6-ацетил триптофан до концентрации 10 мМ каждого и выдерживали 2 часа при +65°С. Суспензию центрифугировали 14000 g 15 мин, супернатант концентрировали ультрафильтрацией до 1/10 первоначального объема. Концентрированную среду диализовали против хроматографического буфера (50 мМ CH3COONa, 50 мМ NaCl рН=4.5). Среду после диализа центрифугировали 14000 g 15 мин. Катионообменную хроматографию проводили в хроматографическом буфере (50 мМ CH3COONa, 50 мМ NaCl рН 4.5) на колонке Source S (Pharmacia, Швеция). Среду наносили на предварительно уравновешенную колонку со скоростью 10 объемов колонки в час. Колонку промывали тем же буфером до прекращения дрейфа базовой линии. Адсорбированный ЧСА элюировали 50-мМ фосфатным буфером рН 9, содержащим 400 мМ NaCl.
Чистота конечного продукта-ЧСА составила 98%, выход составил 85%.
Проведение масс-спектрометрического анализа
Масс-спектрометрический анализ проводили по методу TOF-MALDI на масс-спектрометре VISION 2000 (ИБХ РАН), детектировали положительно заряженные ионы в линейном режиме для белковых образцов. В качестве материала матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту. Исследуемый белок наносили на мишень в водном 0,2% растворе трифторуксусной кислоты. Дополнительную калибровку проводили при помощи бычьего сывороточного альбумина.
Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле, окрашенном Coomassie Brilliant Blue (G-250), проводили следующим образом: вырезали кусочек геля размером 4×1 мм, который дважды промывали для удаления красителя путем инкубации в 150 мкл 40% раствора ацетонитрила в 0,1 М NH4HCO3 в течение 20 мин при 56°С. После удаления ацетонитрила и высушивания геля добавляли 3 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega...) в 0,05 М NH4HCO3 с концентрацией 10 мкг×мл-1. Гидролиз проводили в течение 2 часов при 37°С, затем к раствору добавляли 5 мкл 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в 10% растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Надгелевый раствор использовали для получения масс-спектров MALDI.
Подготовку образцов для масс-спектрометрического исследования триптического гидролизата проводили следующим образом: на мишени смешивали по 0,5 мкл раствора образца и раствора 2-альфа-циано-5-гидрокси коричной кислоты (2 мг/мл в 60% ацетонитриле) и полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры триптического гидролизата белка были получены на время-пролетном масс-спектрометре с источником MALDI Reflex III BRUKER (Германия), оснащенном УФ-лазером (337 нм), в режиме регистрации положительных ионов. Точность измеренных масс - 0,01%.
Идентификацию белка в базе данных последовательностей белков SwissProt по результатам масс-спектрометрического анализа образцов осуществляли с помощью программ Mascot (http://www.matrixscience.com/) и ProteinProspector (http://prospector.ucsf.edu/). При поиске задавали специфичность расщепления трипсином, количество недорезов 5, точность измерения 100 ppm для спектров без внутренних стандартов.
Полученный заявленным способом рекомбинантный человеческий альбумин с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.1(b), может использоваться в качестве препарата для различных медицинских целей. Это дает возможность расширить арсенал препаратов белка и применять указанный препарат вместо ЧСА, полученного из крови, что исключает возможность заражения различными инфекционными агентами.
Claims (2)
1. Способ получения рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), включающий выделение и очистку его из источника, отличающийся тем, что для выделения ЧСА предварительно получают клетки штамма дрожжей P. pastoris, стабильно трансформированные генетической конструкцией, полученной путем обработки рестриктазой BglII вектора pPIC9, в который по сайтам BamHI и NotI клонируют ген предшественника ЧСА, и генетической конструкцией, полученной путем обработки рестриктазой Sad плазмиды pPICZαA, в которую по сайтам HindIII и NotI клонируют ген предшественника ЧСА, при этом указанные клетки получают путем введения в клетки штамма GS115 P. pastoris генетической конструкции, полученной путем обработки рестриктазой BglII вектора pPIC9, в который по сайтам BamHI и NotI клонируют ген предшественника ЧСА, отбора из полученных трансформантов клона с наибольшим уровнем экспрессии целевого белка, который обозначают как GS115/ЧСА5, и введения в данный клон генетической конструкции, полученной путем обработки рестриктазой Sad плазмиды pPICZαA, в которую по сайтам HindIII и NotI клонируют ген предшественника ЧСА, полученные клетки штамма дрожжей P. pastoris выращивают в питательной среде, отобранную культуральную среду осветляют последовательным центрифугированием при 2000 и 10000 g, супернатант концентрируют ультрафильтрацией, диализуют, проводят катионообменную хроматографию на колонке Source S, адсорбированный ЧСА элюируют 50 мМ фосфатным буфером, содержащим 400 мМ хлорида натрия, с рН 9, элюат содержит рекомбинантный ЧСА.
2. Продукт, полученный способом по п.1, представляющий собой элюат, включающий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин, 50 мМ фосфатный буфер, содержащий 400 мМ хлорида натрия, с рН 9.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006128449/13A RU2337966C2 (ru) | 2006-08-07 | 2006-08-07 | Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006128449/13A RU2337966C2 (ru) | 2006-08-07 | 2006-08-07 | Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006128449A RU2006128449A (ru) | 2008-02-20 |
| RU2337966C2 true RU2337966C2 (ru) | 2008-11-10 |
Family
ID=39266655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006128449/13A RU2337966C2 (ru) | 2006-08-07 | 2006-08-07 | Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2337966C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2629844C1 (ru) * | 2016-11-08 | 2017-09-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ получения контрастирующего препарата на основе человеческого сывороточного альбумина для визуализации опухолевых тканей |
| RU2733423C1 (ru) * | 2019-12-27 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris Yst-HSA-PDI1, продуцирующий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0091527A2 (en) * | 1981-12-14 | 1983-10-19 | The President And Fellows Of Harvard College | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides |
| EP0399455B1 (en) * | 1989-05-22 | 2003-03-26 | Mitsubishi Pharma Corporation | Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin |
| CN1618967A (zh) * | 2004-08-27 | 2005-05-25 | 富岩 | 高效表达人血清白蛋白酵母菌株的构建及发酵纯化工艺 |
-
2006
- 2006-08-07 RU RU2006128449/13A patent/RU2337966C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0091527A2 (en) * | 1981-12-14 | 1983-10-19 | The President And Fellows Of Harvard College | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides |
| EP0399455B1 (en) * | 1989-05-22 | 2003-03-26 | Mitsubishi Pharma Corporation | Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin |
| CN1618967A (zh) * | 2004-08-27 | 2005-05-25 | 富岩 | 高效表达人血清白蛋白酵母菌株的构建及发酵纯化工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J Biosci Bioeng. 2000; 89(1):55-61. Wei Sheng Wu Xue Bao. 2002 Feb; 42(1):62-8. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2629844C1 (ru) * | 2016-11-08 | 2017-09-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ получения контрастирующего препарата на основе человеческого сывороточного альбумина для визуализации опухолевых тканей |
| RU2733423C1 (ru) * | 2019-12-27 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris Yst-HSA-PDI1, продуцирующий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006128449A (ru) | 2008-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI94876C (fi) | Menetelmä aprotiniinin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja menetelmään soveltuva DNA, ilmentämisplasmidi ja isäntäsolu | |
| CA1340522C (en) | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification | |
| Hallewell et al. | Amino terminal acetylation of authentic human Cu, Zn superoxide dismutase produced in yeast | |
| US5939288A (en) | Plant secretory signal peptides and nectarins | |
| KR0159107B1 (ko) | 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포 | |
| Sparrow et al. | Purification and partial amino acid sequence of asialo murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor. | |
| Shames et al. | CMP-N-acetylneuraminic acid synthetase of Escherichia coli: high level expression, purification and use in the enzymatic synthesis of CMP-N-acetylneuraminic acid and CMP-neuraminic acid derivatives | |
| Leno et al. | ADP‐ribosylation of the 78‐kDa glucose‐regulated protein during nutritional stress | |
| Hnilica et al. | The effect of DNA-histone interactions on the biosynthesis of DNA in vitro | |
| JPH0787791B2 (ja) | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター | |
| Melloni et al. | Identity in Molecular Structure between" Differentiation Enhancing Factor" of Murine Erithroleukemia Cells and the 30-kDa Heparin-Binding Protein of Developing Rat Brain | |
| JPH03501201A (ja) | 組み換え技術により産生した、３−デス−ヒドロキシ−シスタチンｃポリペプチドまたはその修飾物 | |
| RU2337966C2 (ru) | Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения | |
| CA2890659C (en) | Method for producing, isolating and purifying recombinant human antitryptase (osraat) from rice seeds | |
| US20020169294A1 (en) | Method of purifying calcium ion-binding protein | |
| JP2971290B2 (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ | |
| CA2002446A1 (en) | Method for the isolation of purification of cu/zn superoxide dismutase | |
| RU2048521C1 (ru) | Способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| RU2315105C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pPIC9HAbIL-2 И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ | |
| KR0160934B1 (ko) | 효모에서 봉입체로 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법 | |
| Ostrem et al. | Purification of S1 nuclease from Aspergillus oryzae by recycling isoelectric focusing | |
| JPS60260521A (ja) | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の熱処理法 | |
| JPS63287A (ja) | 酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプチド | |
| JPH0413698A (ja) | 生理活性ペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080808 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20100720 |