FI93171B - Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten fosfopeptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

t 93171

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten fosfopeptidien valmistamiseksi

Hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 880629 5

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen ja hammasmädän syntyä estävän fosfopepti-din valmistamiseksi.

Fosfopeptldejä voidaan käyttää hammasmädän ja ien-10 tulehduksen estämiseksi.

Tämä keksintö antaa fosfopeptidin tai sen suolan, missä fosfopeptidillä on 5 - 30 aminohappoa, käsittäen sekvenssin

A-B-C-D-E

15 jossa A, B, C, D ja E ovat riippumattomasti fosfoseruni, fosfotreoniini, fosfotyrosiini, fosfohistidiini, glutamaatti ja aspartaatti.

Edullisia fosfopeptidejä ovat ne, joissa A, B ja C

ovat riippumattomasti fosfoseriini, fosfotreoniini, fos- 20 ....

fotyrosiini ja fosfohistidiini ja D ja E ovat riippumattomasti fosfoseriini, fosfotreoniini, glutamaatti ja aspartaatti.

Erityisen edullisia fosfopeptldejä ovat ne, joissa A, B ja C ovat fosfoseriini ja D ja E ovat glutamaatti.

25 . Fosfopeptidi on edullisesti pääasiallisesti puh taassa muodossa.

Tämän keksinnön fosfopeptideistä ja niiden suoloista voi olla hyötyä (i) hammassairauksien, kuten ham-^ masmädän, ientulehduksen ja hammasta ympäröivien tautien, (ii) luuta ohentavien tautien, kuten luun huokoistumis-ja luun pehmenemistautien ja (iii) kivennäisaineiden imeytymishäiriöön liittyvien tautien hoidossa tai estämisessä.

Vastaavasti, tämä keksintö mahdollistaa koostumuksen, joka sisältää peptidin tai sen suolan, tämän keksin- J 0 nön mukaisesti ja fysiologisesti hyväksyttävän laimenti-men.

• · 2 931 71

Koostumus voi olla farmaseuttisen koostumuksen muodossa.

Koostumus voi olla suun kautta annettavissa.

Fosfopeptidien ja/tai niiden suolojen seosta voidaan käyttää koostumuksessa. Tässä tapauksessa on edul-5 lista, että ne, jotka sisältävät sekvenssin A-B-C-D-E, ovat vallitsevia.

Fosfopeptidi tai fosfopeptidien seos on edullisesti pääasiallisesti puhdas, ainakin siinä määrin, että se ei sisällä pahanmakuisia epäpuhtauksia.

10 Seuraavien fosfopeptidien on havaittu olevan hyö dyllisiä tämän keksinnön koostumuksissa:

Tl. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys, T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-15 Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg, T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys, T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys ja 20 T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pthi-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

Aminohapposymbolit ovat seuraavia: Pse-fosfoserii-ni, Ser-seriini, Pth-fosfotreoniini, Thr-treoniini, Glu-glutamaatti, Asp-aspartaatti, Ala-alaniini, Asn-aspara-giini, Gln-glutamiini, Gly-glysiini, Arg-arginiini, His-histidiini, Ile-isoleusiini, Leu-leusiini, Lys-lysnni, Met-metioniini, Pro-proliini, Tyr-tyrosiini, Väl-valiini.

Fosfopeptidi voidaan valmistaa synteettisesti kemiallisella synteesillä tai geeniteknologian avulla tai se voidaan uuttaa luonnollisesti esiintyvästä aineesta.

Kustannussyistä johtuen on nykyään edullisempaa * uuttaa fosfopeptidi kaseiinista ja erityisesti alfa-s- kaseiinista tai beeta-kaseiinista. Fosvitiinia voidaan myös käyttää peptidin lähteenä. Lisäksi fosfoproteiineja viljakasveista, pähkinöistä ja kasviksista, erityisesti riisin, vehnän, kauran, ohran tai rukiin leseakanoista tai kuorista voidaan käyttää tuottamaan edellä mainittua peptidiä. Soijapapu ja liha sisältävät fosfoproteii- il : 93171 3 neja, joita voidaan käyttää edellä mainitun peptidin saamiseksi .

Kaseiini ja erityisesti alfa-s-kaseiini tai beeta-kaseiini tai niiden suolat, kuten natriumkaseinaatti, si-5 sältävät polypeptidejä, jotka voidaan lohkaista yksinkertaisemmiksi peptideiksi. Tällainen lohkaisu voidaan suorittaa uuttamalla, tällainen uutto voi olla kemiallinen tai proteolyyttinen.

Tällä hetkellä on edullista uuttaa kaseiini jolla-10 kin seuraavista aineista, trypsiini, pepsiini, kymotryp-siini, papaiini, termolysiini tai pronaasi. Näistä trypsiini on edullinen.

Uutettu kaseiini voidaan fraktioida peptideiksi, käsittäen sekvenssin A-B-C-D-E ja muut peptidit. Mainit-15 tujen muiden peptidien läsnäolo ei ole vahingollista tehokkuudelle, kuitenkin, tietyillä mainituilla muilla peptideillä on epämiellyttävä maku ja senmukaisesti, mikäli jonkin mainituista muista peptideistä on oltava mukana, on edullista poistaa ne, joilla on epämiellyttävä maku.

20 Yleensä ne mainituista peptideistä, joilla on epämiellyttävä maku, vaikuttavat olevan hydrofobisia.

Seuraavilla peptideillä on havaittu olevan epämiellyttävä maku: 1. Glu-Val-Leu-Asn 25 2. Asn-Glu-Asn-Leu-Leu 3. Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly 4. Leu-Arg-Phe 5. Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly-Lys 6. Leu-Arg-Leu 30 7. Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu-Phe , (Glu-glutamaatti; Val-valiini; Leu-leusiini; Asn-aspara-giini; Ala-alaniini; Pro-proliini; Phe-fenyylialaniini; Gln-glutamiini; Gly-glysiini; Arg-arginiini; Lys-lysiini; Tyr-tyrosiini.) 35 Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 15 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

φ 4 931 71

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 26 %:n hydroksiapatiittiliukeneraisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa 5 ainakin 30 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 32 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

10 Edullisesti peptidiä on läsnä 0,01 - 10 paino-%

Edullisesti peptidiä on läsnä 0,01 - 5 paino-%

Edullisesti peptidiä on läsnä 0,01 - 2 paino-%.

Tämän keksinnön mukainen koostumus voi olla syötäväksi kelpaavassa muodossa, kuten ruoan tai makeisen, 15 hammaspuhdistusaineen, tabletin muodossa tai se voi käsittää farmakologisesti hyväksyttävän apuaineen tai suspension liuoksen paikallista käyttöä varten hampaille tai ienkudoksille tai suun pesuun. Muut peptidin antomuodot ovat hyväksyttäviä, mikäli ne ovat fysiologisesti tai far-20 makologisesti hyväksyttäviä.

Erityisen kiinnostavia koostumuksia ovat purukumi, aamiaisruoat, jäätelö ja muut jäädytetyt makeiset, leivokset, makeiset ja kakut, jotka kaikki ovat tunnettuja hammasmätää aiheuttavina aineina. Samanlainen huomio 25 koskee myös muita potentiaalisia hammasmätää aiheuttavia ί ruoan komponentteja.

Erityisen kiinnostavia ovat myös hampaanpuhdistus-aineet, suunpesunesteet ja valmisteet paikallista levittämistä varten hampaille ja ienkudokselle ja peräpuikot luu-30 sairauksien ja kivennäisaineen imeytymishäiriön hoitamiseksi.

! Mielenkiintoinen on myös tämän keksinnön mukaisten koostumusten käyttö reikien hammashoidossa. Tämän viimeksi mainitun suhteen näyttää olevan todisteita kivennäisai-35 neiden lisääntymisestä alkuasteella olevissa vaurioissa, joita pidetään reikiä edeltävänä vaiheena. Kuitenkin, on • « tl: 5 931 71 myös todisteita, jotka viittaavat siihen, että tämän keksinnön mukaisten koostumusten käyttö olemassa olevien reikien pinnoille ja hampaiden pinnoille, jotka ovat muodostuneet poistamalla vaurioitunut aine olemassa olevista rei-5 istä tai murtumalla, on edullista.

Koska tämän keksinnön mukaisen koostumuksen, joka on vesipitoinen liuos, käytöllä olemassa olevien reikien pinnoille tai hampaiden pinnoille, jotka ovat muodostuneet poistettaessa vaurioitunut aine olemassa olevis-10 ta rei'istä tai murtumalla, on epätodennäköisesti pitkäaikainen vaikutus, on lisäksi yritetty valmistaa koostumuksia, joilla voi olla tämä haluttu pitkäaikainen vaikutus .

Tämän mukaisesti tämän keksinnön kohteena on myös 15 tämän keksinnön mukainen koostumus, joka on sovellettu pysymään kosketuksessa hammaspinnan kanssa pitkitetty aika. Tämä keksintö mahdollistaa myös menetelmät ja keinot tämän keksinnön mukaisten koostumusten ylläpitämiseksi kosketuksessa hampaan pinnan kanssa pitkitetyn ajanjakson 20 ajan.

Tähän viimeiseen nähden, pitkitetty ajanjakso tulisi tulkita sopusoinnussa haluttuun tehokkuuteen ja aikaan nähden, joka tarvitaan saavuttamaan tämä riittävä tehokkuus, jolla on arvoa. Kuitenkin, joissakin tapauksissa 25 tämä pitkitetty aika voi olla niin lyhyt kuin yksi päivä, : mutta on edullisemmin viikkojen tai kuukausien jakso.

Erääsä mallissa hampaassa oleva reikä peitetään keksinnön mukaisella koostumuksella ja reikä suljetaan koostumuksen poistumisen estämiseksi. Tällainen sulkemi-30 nen voidaan suorittaa peittämällä tai käyttämällä hampaassa olevien reikien täytekoostumuksia.

'll Eräässä toisessa mallissa koostumus on formuloitu niin, että se on sovellettu pysymään paikoillaan pitkitetty ajanjakso. Tässä tapauksessa keksinnön mukainen koostumus 35 voi muodostaa osan hampaiden täytekoostumuksesta.

6 931 71 Tämän mukaisesti tämän keksinnön kohteena on myös hampaiden täytekoostumus, joka sisältää fosfopeptidiä, jolla on kaava A-B-C-D-E, kuten edellä on määritetty ja sitä varten sovellettu kännin, joka pitää koostumuksen 5 hampaan pinnalla.

Tällainen hampaantäytekoostumus voi sisältää ham-paantäyttöaineita, jotka ovat sinänsä tunnettuja, mukaan lukien amalgaamit ja kovettumiskykyiset polymeerit.

Erityisen kiinnostavia ovat hampaan täytekoostu-10 mukset, jotka sisältävät kalsiumia. Kalsium on halutusti kalsiumfosfaatin tai hydroksiapatiitin muodossa.

Keksinnössä käytettävät fosfopeptidit voidaan erottaa monilla tavoilla, mutta fraktiointitekniikan käyttö on yleensä edullista.

15 Fosfopeptidit voidaan erottaa fraktionoimalla, pe rustuen molekyylin kokoon tai ominaisvarauksiin. Johtuen peptidien, joita kuvaa aktiivinen sekvenssi A-B-C-D-E, kuten on määritetty, ainutlaatuisesta negatiivisesta va-raustiheydestä ja kyvystä muodostaa kaksiarvoisia ioni-20 komplekseja, edullinen fraktionointimenetelmä on anioni-ioninvaihtokromatografia tai selektiivinen sakkauttaminen tai niiden molempien yhdistelmä.

Seuraavat menetelmät kuvaavat erästä erotusmuotoa.

Erotusmenetelmä I

25 Esimerkki fosfopeptideistä ovat ne, jotka on val- : mistettu uuttamalla trypsiinillä sarvikarjan maidon ka seiini. Koko natriumkaseinaatin tai fraktioiden (alfa-s tai beeta), jotka on valmistettu selektiivisellä sakkaut-tamisella (Zittle, C.A. ja Custer J.H; J. Dairy Sei 46L 30 1183 - 1188, 1963) uutto suoritetaan käyttäen proteiini: trypsiiniä suhteessa 50:1. 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 2,5 mM NaCl 37°C:ssa yksi tunti. Peptidit fraktioitiin käyttäen Pharmacia FPLC -systeemiä Mono Q HR 5/5 pylväässä ja eluoitiin NaCl-gradientilla; puskuri A 20 mM Tris HC1 35 pH 8,0, 2,5 mM NaCl; puskuri B 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 500 mM NaCl, gradientti 0 - 100 % puskuri B/30 min; II: 7 93171 virtausnopeus 1 ml/min. Fraktiot pestiin ja väkevöitiin käyttäen Amicon Ultrafiltration Cell'iä UM05 suodattimel-la. Peptidit tunnistettiin käyttäen Water Associates PICO-TAG aminohappoanalyysisysteemiä, käyttäen fenyyli-isotio-5 syanaatti-aminohappojohtamista. Fosfaatti määritettiin Itaya'n ja Ui'n (Clin. Chim. Acta. 14:361-366, 1960) menetelmällä. Peptidit sekventoitiin (fosfaatin poiston jälkeen alkalisella fosfataasilla käyttäen manuaalista

Edman-menetelmää ja saadut PTH-aminohapot tunnistettiin 10 käyttäen käänteisfaasi HPLC:tä Zorbax ODS pylväässä 25 x 0,46 cm (DuPont).

Seuraavat fosfopeptidit saatiin yksittäisesti nat-riumkaseinaatin trypsiiniuutolla käyttäen edellä esitettyä menetelmää.

15 Tl. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile:Pse-Pse-Pse-Glu-

Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-20 Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

Lisäksi saatiin myös seuraavat peptidit: 25 T6. Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-

Met-Glu-Asp-Ile-Lys.

T7. Val-Pro-Gln-Leu-Gln-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Ala-Glu-Glu-Arg.

T8. Thr-Val-Asp-Met-Glu-Pse-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys. 30 T9. Leu-Pth-Glu-Glu-Lys.

Peptidit Tl, T6 ja T7 saatiin myös alfag^-kaseinaa-;; tin (sisältäen alfagl'sen ja alfag0'n) TPCK-trypsiiniuu- tosta. Peptidi T2 saatiin myös beeta-kaseinaatin TPCK-trypsiiniuutosta. Peptidit T3, T4, T5, T8 ja T9 saatiin 35 myös alfag2-kaseinaatin (käsittäen alfag2, alfag3, alfag4 ja alfagg) TPCK-trypsiiniuutosta. Aminohapposymbolit ovat 8 931 71 seuraavat: Pse-fosfoseriini, Ser-seriini, Pth-fosfotreo-niini, Thr-treoniini, Glu-glutamaatti, Asp-aspartaatti, Ala-alaniini, Asn-aspargiini, Gln-glutamiini, Gly-glysii-ni, Arg-arginiini, His-histidiini, Ile-isoleusiini, Leu-5 leusiini, Lys-lysiini, Met-metioniini, Pro-proliini, Tyr-tyrosiini, Val-valiini.

Erotusmenetelmä II

Seuraava menetelmä kuvaa yhtä selektiivistä sak-kauttamismallia.

10 Natriumkaseinaattiliuosta uutettiin trypsiinillä (50:1, kaseiini:trypsiini) yksi tunti 37°C:ssa, samalla kun pH pidettiin 8,0:ssa lisäämällä NaOH. HC1 (0,1 M) lisättiin sitten liuokseen huoneen lämpötilassa pH-arvoon 4,7 ja aikaansaatu sakka poistettiin BaCl2 lisättiin sa-15 kan yläpuolella olevaan liuokseen arvoon 0,25 % paino/ tilavuus, mitä seurasi yhtä suuri tilavuus absoluuttista etanolia ja saatu sakka poistettiin ja kuivattiin. Sakka liuotettiin kymmenesosaan alkuperäisestä tilavuudesta vettä (liukenemisen helpottamiseksi pH nostettiin 20 NaOH:11a) ja liuos tehtiin happamaksi pH-arvoon 3,5 IM HCl:llä. Yhtä suuri tilavuus asetonia lisättiin ja sakka poistettiin ja kuivattiin. Sakka liuotettiin sitten uudelleen H20:hon ja tehtiin happamaksi arvoon pH 2,0 lisäämällä HC1. Saatu sakka poistettiin ja hylättiin ja sa-25 kan yläpuolella olevan liuoksen pH säädettiin takaisin : 3,5:een NaOH:lla ja yhtä suuri tilavuus asetonia^lisät tiin. Saatu sakka kerättiin, liuotettiin uudelleen veteen ja H2SO^ lisättiin sakkauttamaan BaS04, joka hylättiin. Sitten sakan yläpuolella oleva liuos dialysoitiin 30 ja kylmäkuivattiin tai sumutuskuivattiin. Tällä menetelmällä saatiin viiden fosfopeptidin seos.

Seuraavassa ovat saadut fosfopeptidit: «

Tl. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

35 T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-

Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

il 9 93171 T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

5 T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Asn-Ser-Lys.

Fosfopeptidien (Tl:T2:T3:T4:T5) suhde lopullisessa valmisteessa riippuu lähtöaineesta ja hydrolyysiolosuh-teista. Natriumkaseinaatin uutto TPCK-trypsiinillä antaa enimmäkseen T2, joissa oli pieniä määriä Tl, T3 ja T4.

10 Kuitenkin T2 osoittaa suurempaa epävakaisuutta kuin muut peptidit niin, että voimakkaampi uutto, kuten tapahtuu joissakin kaupallisissa kaseiiniuutoissa, antaa valmisteen, joka sisältää enimmäkseen Tl, jossa on pieniä määriä T3 ja T4.

15 Mikäli tässä menetelmässä käytetään natriumkasei naatin asemesta alfa-sl-kaseiinia, saadaan puhdasta Tl.

Kun beeta-kaseiini on lähtöaineena, saadaan puhdasta T2.

Tavallisimpia aktiivisten peptidien sekvenssejä on pentapeptidi Pse-Pse-Pse-Glu-Glu. Fosfaatti- ja karb-20 oksyyliryhmien etäisyydet tämän pentapeptidin beeta-kon-formaatiossa on esitetty kuviossa 1.

Fosfaattien ja karboksyylien 6,88 Angström:in etäisyys sallii spesifisen kiinnittymisen kalsiumatomeihin hydroksiapatiittikiteiden c-akselia pitkin. Tämä penta-25 peptidisekvenssi tapahtuu peptideissä Tl - T4 ja tapah-.· tuu modifioituna peptideissä T 5 - Pse-Pth-Pse-G'lu-Glu, mitä seuraa fosfoseriinin varovainen korvaaminen fosfotreo-niinilla.

Varovaiset substituutiot aktiivisessa sekvenssis-30 sä olisivat fosfoseriinin korvaaminen fosfotreoniinilla ja pienemmässä määrässä fosfotyrosiinilla tai fosfohis-*: tidiinillä, vaikka fosfoseriini on edullinen. Toinen mah dollinen fosfoseriinin korvaaminen saattaisi olla gluta-maatilla tai aspartaaatilla, mutta jälleen fosfoseriini 35 on edullinen. Mahdollinen korvaaja glutamaatille on as-partaatti.

10 931 71

Aktiiviset peptidit voivat muodostaa komplekseja kalsiumfosfaatin ja muiden kaksiarvoisten metalli-ioni-suolojen kanssa. Yksi mooli Tl sitoo 16 moolia CaHPO^, niin että 10 mg/ml Tl-liuosta pH 7,0:ssa voi liuottaa 5 60 mM CaHPO^, muodostaen metastabiilin ylikyllästetyn liuoksen suhteessa kalsiumfosfaattiyhdisteisiin. Kun kloridi on vastaionina, 1 mooli Tl sitoo ainoastaan 5 moolia Ca++, joka sitoutuu ainoastaan seriinifosfaatteihin. Yhteen mooliin Tl, johon on sitoutunut 16 moolia CaHPO^ 10 (M.W. 4883) viitataan tämän jälkeen kalsiumfosfaatti

Tl:nä. Kalsiumfosfaatin Tl tärkeä kemiallinen ominaisuus on, että se yli 2 % paino/tilav. vesikoostumuksessa on tiksotrooppinen geeli. Tl - T5:n on osoitettu olevan potentiaalisesti hammasmätää vastustavia aineita, käyttämäl-15 lä seuraavia koemenetelmiä:

Testi 1

Hydroksiapatiitin liukenemisnopeuskoe Tämä koe on jo kuvatun testimenetelmän (Raynolds, E.C., Riley, P.F. ja Storey, E. Calcif. Tiss Int 34:s52 -20 s56, 1982) modifiointi. Tämän kokeen tarkoituksena on mää rittää peptidien vaikutus hydroksiapatiitin liukenemiseen ja tässä suhteessa, koska hammaskiille koostuu suurelta osalta hydroksiapatiitista, on uskottu, että voidaan tehdä hyödyllisiä vertailuja.

25 Käytettiin kahdesti tislattua, deionisoitua vettä .· (18 mega ohmia/cm). Puhtaat analyysireagenssikemikaalit saatiin Ajax Chemicals'ilta, Australia. Pallomainen hydr-oksiapatiitti ostettiin BDH'lta. Kromatografiapylvästä, joka sisälsi 0,1 g hydroksiapatiittipalloja, käytettiin 30 kivennäisaineiden poistokokeessa. Tris 5 mM, pH 8,3, joka sisälsi 50 mM NaCl, käytettiin pylvään puskurina 20°C:ssa ja sitä pumpattiin pylvään läpi nopeudella 0,1 ml/min. Peptidiliuosta 0,1 mg/ml puskuria laskettiin pylvääseen ja 0,2 ml:n fraktiot kerättiin sekä ennen pepti-35 din käyttöä että sen jälkeen ja analysoitiin kokonaismäärälle kalsiumia, fosfaattia ja peptidiä. Näistä u 93171 arvoista saatiin liukenemisnopeus (nmol kalsiumia tai fosfaattia/min) jokaista 0,2 ml:n fraktiota kohti.

Kaikki fosfopeptidit Tl - T5 vähensivät hydroksi-apatiittiliukoisuusnopeuden n. 32 %:lla.

5 Fosfopeptidien T6 - T9 havaittiin olevan huomatta vasti tehottomampia.

Fluoridi ja fosfopeptidi Tl antoivat yhdistetyn pienentymisen hydroksiapatiitin liukoisuudessa (40 %:n alentuminen). Fosfopeptidi Tl aiheutti 50 % suuremman 10 fluoriretention hydroksiapatiittipylväässä.

Tämä työ osoittaa, että nämä fosfopeptidit sitoutuvat hydroksiapatiittiin ja vähentävät kivennäisaineiden liukenemisnopeutta ja parantavat fluoridin retentio-ta kiteiseen sideaineeseen. Hydroksiapatiitin liukoisuu-15 den pienentyminen oli suhteessa fosfoseriinipitoisuuteen ja etäisyyksiin peptidien välillä.

Testi 2

Suunsisäinen hammasmätäkoe

Fosfopeptidin Tl hammasmätää vastustava vaikutus 20 määritettiin käyttäen Koulourides'in ja Ostrom'in suun- sisäisen hammasmätätestin (Caries Res. 10:442 - 482, 1976) muunnosta. Emalilevyt sijoitettiin siirrettävään suunsi-säiseen laitteeseen jäljittelemään hampaiden välistä tilaa. Tämä tehtiin siirrettävän laitteen molemmille puo-25 lille (vasen ja oikea). Laitetta kulutettiin sallimaan ·* plakin kasautuminen hampaiden välistä tilaa jäljittele villä alueilla. Kahdeksan kertaa päivässä laite poistettiin ja pantiin 37°C:n liuokseen. Liuos sisälsi 2 paino/ tilavuus-% sakkaroosia, 2 paino/tilavuus-% glukoosia, 140 30 mM KC1, 20 mM NaCl pH:ssa 7,0. Kahdesti päivässä oikeanpuoleiset emalilevyt altistettiin liuokselle, joka sisäl-*: si 1,8 paino/tilavuus-% kalsiumfosfaattia Tl 140 mM KClrssä, 20 mM NaClissä pHissa 7,0 samalla kun vasen puoli altistettiin ainoastaan suolaliuokselle. Kokeen päätyttyä ema-35 lilevyt poistettiin, poikkileikattiin ja saatettiin mikro-radiografia- ja mikrokovuustesteihin. Mikroradiografia 12 931 71 osoitti, että levyillä, jotka oli altistettu sokeri-suolaliuokselle (vasen puoli), oli pinnanalaisia, hammasmätää muistuttavia vioittumia. Kuitenkin, levyt, jotka oli altistettu sokeri-suolaliuokselle ja peptidi Tl-liuoksel-5 le kahdesti päivässä, eivät osoittaneet lainkaan hammas-mädän kaltaisia muutoksia. Tulokset varmistettiin mikro-kovuusanalyysillä. Plakkia otettiin myös laitteen molemmilta puolilta ja analysoitiin kalsiumfosfaatin, seriini-fosfaatin ja peptidin Tl suhteen käyttäen kilpailukykyis-10 tä, kvantitatiivista, entsyymisitoutunutta immunosorptio-koetta (ELISA) käyttäen monoklonaalista antipeptidi-Tl-vasta-ainetta.

Tämä osoitti, että plakki laitteen oikealla puolella, joka oli altistettu kahdesti päivässä peptidi-Tl-15 liuokselle, sisälsi peptidiä vähintään 0,4 % paino/pla-kin märkäpaino ja kalsiumfosfaatin pitoisuus oli kohonnut 2 - 4-kertaiseksi.

Tämä työ osoitti, että peptidi Tl on yhdistynyt plakkiin ja täten kohottanut plakin kalsium- ja fosfaat-20 tipitoisuutta, estäen täten hammasmätäprosessin. Tätä yhdistymis- ja akkumuloitumismenetelmää hammasplakissa voidaan käyttää siirtämään uudelleen kivennäisaineita ja an-tibakteerisia ioneja plakkiin ja kiilteeseen, esim. Ca, PO4, FPO^/ Zn, Cu, Sn, Ag, Ai, Fe ja La.

25 Testi 3

Suun sisäinen kivennäisaineiden lisääminen Käytettiin suun sisäistä laitetta, joka oli samanlainen kuin edellisessä testimenetelmässä, paitsi että emalilevyt oli ennalta altistettu kivennäisaineita vä-30 hentävälle liuokselle, joka aiheutti kaksi pinnanalaista kivennäisaineen vähentymisestä aiheutunutta vauriota kus-I'. sakin levyssä. Kivennäisaineita poistavassa liuoksessa oli 0,1 M laktaattipuskuria pH 5,0, joka sisälsi 500 mg/1 hydroksiapatiittia ja 1 % agaria. Koehenkilöt käyttivät 35 laitteita 10 päivää. Kahdesti päivässä laitteet poistettiin ja tippa kivennäisainetta lisäävää liuosta pantiin il 13 931 71 emalilevyille laitteen oikealle puolelle. Emalilevyjen vasen puoli toimi kontrollina. 10 päivän kuluttua ema-lilevyt poistettiin, poikkileikattiin ja saatettiin mikro-radiografiaan. Kivennäisainemäärä, joka oli kerrostunut 5 takaisin pinnanalaisiin vaurioikohtiin, määritettiin käyttäen mikrodensitometriä. Kivennäisainetta lisäävä liuos, joka sisälsi 1,8 % paino/tilav. kalsiumfosfaattia Tl, pH 7,0, palautti 57 % kivennäisainehäviöstä verrattuna ainoastaan syljestä aiheutuneeseen 13 %:iin.

10 Testi 4

Plakin pH:n aleneminen

Koehenkilöt pidättäytyivät suun hygieniasta 3-5 päivää, sen jälkeen seurasi yhden minuutin huuhtelu 5-%:isella sukroosiliuoksella. Plakkinäytteet poistet-15 tiin ja pH mitattiin käyttäen yhden tipan menetelmää.

Noin viiden minuutin kuluttua pH putosi n. 5,0:aan. Kuitenkin, mikäli koehenkilöt huuhtelivat liuoksella, joka sisälsi 1,8 % paino/tilav. kalsiumfosfaattia Tl, pH 7,0, 15 minuuttia ennen huuhtelua 5-%:isella sukroosiliuoksel-20 la, plakin pH ei pudonnut alle 6,7, mikä osoittaa·kal-siumfosfaatin Tl huomattavaa pH-puskurointia.

Koska tarkkaa mekanismia, jolla fosfopeptidit osoittavat hammasmätää vastustavaa aktiivisuutta, ei tunneta, jatkossa esitetään seuraavat spekuloivat teoriat, 25 mutta niitä ei tulisi pitää sitovina tai rajoittavina.

.· Fosfopeptidit voivat akkumuloitua plakkiin ja kiil teeseen, puskuroida plakkihappoa, estää kivennäisaineiden vähentymistä hammaskiilteestä ja lisätä kivennäisaineiden lisääntymistä. Fosfopeptidien pieni molekyylipaino saat-30 taa aiheuttaa läpitunkeutumista ja kasaantumista plakin ja kiilteen huokosissa. Fosfopeptidit, johtuen seriini-fosfaattijäännösten ^sopivasta välistä, voivat sitoa hammaskiilteen kivennäisaineita ja estää kivennäisaineiden vähentymistä. Peptidit voivat myös siirtää kalsiumia ja 35 fosfaattia (fluorifosfaattia modifioitaessa) plakkiin ja kiilteeseen, sopivassa muodossa mahdollisesti sallien 14 931 71 spontaanin kivennäisaineiden lisääntymisen. Fosfoseriini-jäännökset voivat myös puskuroida plakkihappoa. Fosfopep-tidi voi myös siirtää antibakteerisia metalli-ioneja, esim. Zn, Cu, Sn, Ag, AI, Fe ja La plakkiin ja tällä ta-5 valla sillä on plakkia ja ientulehdusta vastustava vaikutus. Metalli-ionit siirtyvät ensisijaisesti fosfopepti-deissä, johtuen fosfoseriinijäännöksistä. Fosfopeptidit voivat sitoa plakkibakteereita ja estää sokerin hyväksikäytön.

10 Näiden peptidien kyky muodostaa ionikomplekseja kalsiumfosfaatin kanssa voidaan hyödyntää erilaisten harvinaisten luusairauksien hoidossa. Nämä peptidit voivat huomattavasti lisätä kalsiumin, fosfaatin ja raudan absorptiota suolessa. Tästä johtuen farmaseuttisia apuai-15 neita (esim. peräpuikot) tai ruokia, jotka sisältävät kalsiumfosfaattia Tl ja ferrofosfaattia Tl, voidaan käyttää luun huokoistumis-/luun pehmenemistaudin ja anemian hoidossa.

Hakijat ovat formuloineet erilaisia koostumuksia 20 tämän keksinnön mukaisesti seuraavassa. Yleensä koostumukset sisältävät 0,01 - 10 paino-% fosfopeptidiä.

Esimerkki 1

Jauho:

Laitteessa kuivien aineiden sekoittamiseksi, se-25 koitettiin 1 paino-% kalsiumfosfaattia Tl jauhon kanssa.

.* Esimerkki 2

Viljavalmiste:

Aamiaisviljavalmiste suihkutettiin liuoksella, jossa oli kalsiumfosfaattia Tl vedessä. Sitten viljahiu-30 taleet kuivattiin antamaan lopputuote, joka sisälsi 1 % kalsiumfosfaattia Tl.

Esimerkki 3

Leipä: 1 paino-% kalsiumfosfaattia Tl lisättiin jauhoon 35 aineosien sekoittamisen aikana leivän valmistamiseksi.

tl , 15 93171

Esimerkki 4

Kakkujauhe: 1 paino-% kalsiumfosfaattia Tl lisättiin aineosiin kakkutaikinan valmistuksessa.

5 Esimerkki 5

Makeiset:

Makeisten valmistuksessa lisättiin 1 paino-% kalsiumfosfaattia Tl lopulliseen seokseen.

Esimerkki 6 10 Keksi:

Valmistettaessa keksi/seos lisättiin 1 paino-% kalsiumfosfaattia Tl muihin kuiviin aineosiin sekoituksen aikana.

Esimerkki 7 15 Virvoitusjuoma:

Valmistettiin virvoitusjuoma, johon oli liuotettu 0,1 paino-% kalsiumfosfaattia Tl.

Esimerkki 8

Tabletti: 20 Valmistettiin tabletti, joka sisälsi 10 paino-% kalsiumfosfaattia Tl yhdessä täyteaineiden, jotka olivat maku- ja sideaineita, kanssa.

Tavallisen hampaidenpuhdistusaineen valmistuksessa tämän keksinnön piirin mukaisesti tarvittava suola ja fos-25 fopeptidin valikoidut suolat yhdistetään hampaanpuhdistus-, ainekoostumuksiin jollakin sopivalla tavalla riippuen siitä, onko valmistettu jauhe, tahna tai nestevalmiste.

Tätä tarkoitusta varten lisätään tarkoituksenmukaisia valmisteita, kuten pinta-aktiivisia aineita, sideaineita, 30 makuaineita ja muita tarvittavia täyteaineita hampaidenpuhdistusaineen tarvittavan muodon aikaansaamiseksi.

Keksintöä kuvataan vielä seuraavien esimerkkien avulla:

Esimerkki 9 35 Hammastahna:

Valmistettiin hammastahna, jolla oli seuraava koostumus: V · 16 93171

Paino-%

Kalsiumfosfaatti Tl 5,0 CMC 7MF 1,0

Saccharin 450 0,2 5 Glyseriini (B.P.) 25,0

Natriumlauryylisulfaatti (Empicol 0919) 5,0

Natriumbentsoaatti 0,5

Makuaine 9/693090 0,8 10 Kalsiumfosfaatti 1,0

Deionisoitu vesi 39,5

Thixosyl 33J 9,5

Syloid Al-1 12,0

Titanium Dioxide 3328 0,5 15 Esimerkki 10

Hammastahna:

Valmistaminen, kuten esimerkissä 9 on esitetty, toistettiin, mutta lisättiin 0,2 % natriumfluoridia sopivassa muodossa.

20 Esimerkki 11

Hammastahna:

Valmistaminen, kuten esimerkissä 9 on esitetty, toistettiin, mutta 0,4 %:n tinafluoridilisäyksellä sopivassa muodossa.

25 Esimerkki 12 . Hammastahna:

Valmistus, kuten esimerkissä 9 on esitetty, toistettiin, mutta 0,76 % mononatriumfluorifosfaattia lisättiin sopivassa muodossa.

30 Esimerkki 13

Hammasjauhe:

Tehtiin seuraava valmiste: ti : 17 93171 kalsiumfosfaatti Tl 5,0 paino-% liukoinen sakkariini 0,1 paino-% väriaine pieni määrä kaksiarvoinen kalsiumfosfaatti 94,1 paino-% 5 Esimerkki 14

Hammasjauhe:

Tehtiin valmiste, kuten esimerkissä 13 on esitetty, mutta lisättiin 0,76 % mononatriumfluorifosfaattia sopivassa muodossa.

10 Esimerkki 15

Nestemäinen hampaidenpuhdistusaine:

Tehtiin valmiste, joka sisälsi: natriumalginaattia 1,4 paino-% kalsiumfosfaattia Tl 2,0 paino-% 15 natriumlauryylisulfaattia 1,0 paino-% makuainetta pieni määrä väriainetta pieni määrä vettä 95,5 paino-%

Esimerkki 16 20 Nestemäinen hampaidenpuhdistusaine:

Kuten esimerkissä 15, mutta lisättiin 0,5 % nat-riumfluoridia.

Esimerkki 17 Suunpesuneste: 25 Tehtiin seuraava valmiste: kalsiumfosfaatti Tl 2,0 paino-% natriumfluoridi 0,5 paino-% makuaine pieni määrä väriaine pieni määrä 30 vesi 97,5 paino-%

Esimerkki 18

Hiilihapotettu virvoitusjuoma: 0,1 paino-% kalsiumfosfopeptidiä Tl lisättiin kaupallisesti saatavaan hiilihapotettuun virvoitusjuomaan.

ie 93171

Esimerkki 19

Hedelmämehu: 0,1 paino-% kalsiumfosfopeptidiä Tl lisättiin kaupallisesti saatavaan hedelmämehuun.

5 Esimerkki 20

Liuos käytettäväksi paikallissti hampaisiin: kalsiumfosfaatti Tl 2 %

NaF 0,6 mM

Zn-asetaatti 0,1 mM

10 SrCl2 0,1 mM

(tämä liuos voidaan muodostaa geeliksi lisäämällä kalsium-fosfaatin Tl määrää).

Esimerkki 21

Hampaiden täyteaine 15 kalsiumfosfaatti Tl 5 % paino/paino kalsiumfosfaatti 95 % paino/paino polymerointiainetta pieni määrä

Tehdään tahnaksi veden kanssa.

Tässä esimerkissä käytetty polymerointiaine oli 20 glutaarialdehydi.

Esimerkki 22

Hampaiden täyteaine: kalsiumfosfaatti Tl 5 % paino/paino kalsiumfosfaatti 70 % 25 akryylipolymeeri 25 % katalyytti polymeerille pieni määrä >

Esimerkki 23

Paikallinen geeli yliherkkien hampaiden hoitoon: kalsiumfosfaatti Tl 4,0 paino-% 30 SrF2 1,0 paino-% makuaine pieni määrä vesi 95 %

Edellisessä käytettiin kalsiumfosfaattia Tl kuvaamistar-koituksessa, mutta sen asemesta voidaan käyttää mitä ta-35 hansa tarkoituksenmukaista fosfopeptidiä ja/tai suolaa.

• · 19 931 71

Muunnokset ja sovellutukset voidaan tehdä edellä kuvattuun poikkeamatta tämän keksinnön hengestä ja piiristä, joka käsittää kaikki uudet piirteet ja piirteiden yhdistelmät, joita tässä on käsitelty.

5 Patenttivaatimukset muodostavat osan tämän keksin nön esityksestä.

« • ·

Claims (4)

93171 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen ja hammasmädän syntyä estävän fosfopeptidin valmistamiseksi, 5 jolla on sekvenssi: Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu- Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys; Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val- Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg;

10 Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser- Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys; Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; tai Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys, tai 15 sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että muodostetaan kaseiinin, as-kaseiinin, β-kaseiinin tai niiden suolan uute ja erotetaan fosfopeptidi uutteesta valikoivalla aggregoinnilla ja erottamalla saostumalla tai fosfopeptidin molekyylikokoon tai varaukseen perustuen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fosfopeptidi suolan muodossa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fosfopeptidi 25 natriumsuolan muodossa.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fosfopeptidi oleellisesti puhtaassa muodossa. tl; 93171