FI92709B - Fosfopeptidejä, niiden valmistusmenetelmä ja käyttö sekä niitä sisältäviä suunhuoltokoostumuksia - Google Patents

Description

92709

Fosfopeptidejä, niiden valmistusmenetelmä ja käyttö sekä niitä sisältäviä suunhuoltokoostumuksia Tämän keksinnön kohteena ovat fosfopeptidit ja nii-5 tä sisältävät suunhuoltokoostumukset.

Tämän keksinnön kohteena on myös menetelmä näiden fosfopeptidien valmistamiseksi sekä niiden käyttö suun-huoltolisäaineena elintarvikkeissa, makeisissa tai juomissa.

10 FI-patenteista 67655 ja 67656 tunnetaan fosfoamino- happoja sisältäviä polypeptidijakeita, jotka ovat hyödyllisiä ravinteina tai lääkkeinä. Fosfopeptidien rakennetta ei ole ilmoitettu.

Tämän keksinnön mukaiselle fosfopeptidille on tun-15 nusomaista, että sillä on sekvenssi:

Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-

Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys;

Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-

Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg; 20 Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-

Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys;

Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; tai

Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

25 Aminohapposymbolit ovat seuraavia: Pse-fosfoserii- ni, Ser-seriini, Pth-fosfotreoniini, Thr-treoniini, Glu-glutamaatti, Asp-aspartaatti, Ala-alaniini, Asn-aspara-giini, Gln-glutamiini, Gly-glysiini, Arg-arginiini, His-histidiini, Ile-isoleusiini, Leu-leusiini, Lys-lysiini, 30 Met-metioniini, Pro-proliini, Tyr-tyrosiini, Val-valiini.

Fosfopeptidi on edullisesti pääasiallisesti puhtaassa muodossa.

Tämä keksintö mahdollistaa koostumuksen, joka sisältää peptidin tai sen suolan, tämän keksinnön mukaisesti 35 ja fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen.

li , 92709

Koostumus voi olla suun kautta annettavissa.

Fosfopeptidien ja/tai niiden suolojen seosta voidaan käyttää koostumuksessa.

Fosfopeptidi tai fosfopeptidien seos on edullises-5 ti pääasiallisesti puhdas, ainakin siinä määrin, että se ei sisällä pahanmakuisia epäpuhtauksia.

Fosfopeptidi voidaan valmistaa synteettisesti kemiallisella synteesillä tai geeniteknologian avulla tai se voidaan uuttaa luonnollisesti esiintyvästä aineesta. Kek-10 sinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että fraktioidaan kaseiinin, ae-kaseiinin, β-kaseiinin tai niiden suolan uute.

Kustannussyistä johtuen on nykyään edullisempaa uuttaa fosfopeptidi kaseiinista ja erityisesti alfa-s-15 kaseiinista tai beeta-kaseiinista. Fosvitiinia voidaan myös käyttää peptidin lähteenä. Lisäksi fosfoproteiineja viljakasveista, pähkinöistä ja kasviksista, erityisesti riisin, vehnän, kauran, ohran tai rukiin leseakanoista tai kuorista voidaan käyttää tuottamaan edellä mainittua pep-20 tidiä. Soijapapu ja liha sisältävät fosfoproteiineja, joita voidaan käyttää edellä mainitun peptidin saamiseksi.

Kaseiini ja erityisesti alfa-s-kaseiini tai beeta-kaseiini tai niiden suolat, kuten natriumkaseinaatti, sisältävät polypeptidejä, jotka voidaan lohkaista yksinker-. 25 taisemmiksi peptideiksi. Tällainen lohkaisu voidaan suorittaa uuttamalla, tällainen uutto voi olla kemiallinen tai proteolyyttinen.

Tällä hetkellä on edullista uuttaa kaseiini jollakin seuraavista aineista, trypsiini, pepsiini, kymotryp-30 siini, papaiini, termolysiini tai pronaasi. Näistä trypsiini on edullinen.

Uutettu kaseiini voidaan fraktioida peptideiksi, käsittäen keksinnön mukaiset ja muut peptidit. Mainittujen muiden peptidien läsnäolo ei ole vahingollista tehokkuu-35 delle, kuitenkin, tietyillä mainituilla muilla peptideillä 3 92709 on epämiellyttävä maku ja senmukaisesti, mikäli jonkin mainituista muista peptideistä on oltava mukana, on edullista poistaa ne, joilla on epämiellyttävä maku. Yleensä ne mainituista peptideistä, joilla on epämiellyttävä maku, 5 vaikuttavat olevan hydrofobisia.

Seuraavilla peptideillä on havaittu olevan epämiellyttävä maku: 1. Glu-Val-Leu-Asn 2. Asn-Glu-Asn-Leu-Leu 10 3. Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly 4. Leu-Arg-Phe 5. Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly-Lys 6. Leu-Arg-Leu 7. Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu-Phe 15 (Glu-glutamaatti; Val-valiini; Leu-leusiini; Asn-aspara- giini; Ala-alaniini; Pro-proliini; Phe-fenyylialaniini; Gln-glutamiini; Gly-glysiini; Arg-arginiini; Lys-lysiini; Tyr-tyrosiini.)

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa 20 ainakin 15 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 26 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

. 25 Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 30 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähentymistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 32 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vähen-30 tyrnistä tässä määritetyissä koeolosuhteissa.

.. Edullisesti peptidiä on läsnä 0,01 - 10 paino-%

Edullisesti peptidiä on läsnä 0,01 - 5 paino-%

Edullisesti peptidiä on läsnä 0,01 - 2 paino-%.

Tämän keksinnön mukainen koostumus voi olla syötä-35 väksi kelpaavassa muodossa, kuten hammaspuhdistusaineen, • 4 92709 tabletin muodossa tai se voi käsittää fysiologisesti hyväksyttävän apuaineen tai suspension liuoksen paikallista käyttöä varten hampaille tai suun pesuun. Muut peptidin antomuodot ovat hyväksyttäviä, mikäli ne ovat fysiologi-5 sesti hyväksyttäviä.

Erityisen kiinnostavia koostumuksia, joihin fosfo-peptidit voidaan lisätä, ovat purukumi, aamiaisruoat, jäätelö ja muut jäädytetyt makeiset, leivokset, makeiset ja kakut.

10 Erityisen kiinnostavia ovat myös hampaanpuhdistus- aineet, suunpesunesteet ja valmisteet paikallista levittämistä varten hampaille.

Koska tämän keksinnön mukaisen koostumuksen, joka on vesipitoinen liuos, käytöllä hampaiden pinnoille, jotka 15 ovat muodostuneet poistettaessa vaurioitunut aine olemassa olevista rei'istä tai murtumalla, on epätodennäköisesti pitkäaikainen vaikutus, on lisäksi yritetty valmistaa koostumuksia, joilla voi olla tämä haluttu pitkäaikainen vaikutus.

20 Tämän mukaisesti tämän keksinnön kohteena on myös tämän keksinnön mukainen koostumus, joka on sovellettu pysymään kosketuksessa hammaspinnan kanssa pitkitetty aika. Tämä keksintö mahdollistaa myös menetelmät ja keinot tämän keksinnön mukaisten koostumusten ylläpitämiseksi kos-. 25 ketuksessa hampaan pinnan kanssa pitkitetyn ajanjakson ajan.

Tähän viimeiseen nähden, pitkitetty ajanjakso tulisi tulkita sopusoinnussa haluttuun tehokkuuteen ja aikaan nähden, joka tarvitaan saavuttamaan tämä riittävä tehok-30 kuus, jolla on arvoa. Kuitenkin, joissakin tapauksissa .. tämä pitkitetty aika voi olla niin lyhyt kuin yksi päivä, mutta on edullisemmin viikkojen tai kuukausien jakso.

Eräässä mallissa koostumus on formuloitu, niin, että se on sovellettu pysymään paikoillaan pitkitetty 35 ajanjakso. Tässä tapauksessa keksinnön mukainen koostumus voi muodostaa osan hampaiden täytekoostumuksesta.

5 92709 Tämän mukaisesti tämän keksinnön kohteena on myös hampaiden täytekoostumus, joka sisältää keksinnön mukaista fosfopeptidiä, ja sitä varten sovellettu kännin, joka pitää koostumuksen hampaan pinnalla.

5 Tällainen hampaantäytekoostumus voi sisältää ham- paantäyttöaineita, jotka ovat sinänsä tunnettuja, mukaan lukien amalgaamit ja kovettumiskykyiset polymeerit.

Erityisen kiinnostavia ovat hampaan täytekoostu-mukset, jotka sisältävät kalsiumia. Kalsium on halutusti 10 kalsiumfosfaatin tai hydroksiapatiitin muodossa.

Keksinnössä käytettävät fosfopeptidit voidaan erottaa monilla tavoilla, mutta fraktiointitekniikan käyttö on yleensä edullista.

Fosfopeptidit voidaan erottaa fraktioimalla, perus-15 tuen molekyylin kokoon tai ominaisvarauksiin. Johtuen peptidien ainutlaatuisesta negatiivisesta varaustiheydestä ja kyvystä muodostaa kaksiarvoisia ionikomplekseja, edullinen fraktiointimenetelmä on anioni-ioninvaihtokromatografia tai selektiivinen sakkauttaminen tai niiden molempien yh-20 distelmä.

Seuraavat menetelmät kuvaavat erästä erotusmuotoa.

Erotusmenetelmä I

Esimerkki fosfopeptideistä ovat ne, jotka on valmistettu uuttamalla trypsiinillä sarvikarjan maidon ka-. 25 seiini. Koko natriumkaseinaatin tai fraktioiden (alfa-s tai beeta), jotka on valmistettu selektiivisellä sakkaut-tamisella (Zittle, C.A. ja Custer J.H; J. Dairy Sei 46L 1183 - 1188, 1963) uutto suoritetaan käyttäen proteiini: trypsiiniä suhteessa 50:1. 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 2,5 mM 30 NaCl 37 °C:ssa yksi tunti. Peptidit fraktioitiin käyttäen .. Pharmacia FPLC -systeemiä Mono Q HR 5/5 pylväässä ja eluoitiin NaCl-gradientilla; puskuri A 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 2,5 mM NaCl; puskuri B 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 500 mM NaCl, gradientti 0 - 100 % puskuri B/30 min; vir-35 tausnopeus 1 ml/min. Fraktiot pestiin ja väkevöitiin käyt-

II

4 6 92709 täen Amicon Ultrafiltration Cell'iä UM05 suodattimena. Peptidit tunnistettiin käyttäen Water Associates PICO-TAG aminohappoanalyysisysteemiä, käyttäen fenyyli-isotiosya-naatti-aminohappojohtamista. Fosfaatti määritettiin 5 Itaya'n ja Ui'n (Clin. Chim. Acta. 14:361-366, 1960) me netelmällä. Peptidit sekvensoitiin (fosfaatin poiston jälkeen alkalisella fosfataasilla) käyttäen manuaalista Edman-menetelmää ja saadut PTH-aminohapot tunnistettiin käyttäen käänteisfaasi HPLC:tä Zorbax ODS pylväässä 25 x 10 0,46 cm (DuPont).

Seuraavat fosfopeptidit saatiin yksittäisesti nat-riumkaseinaatin trypsiiniuutolla käyttäen edellä esitettyä menetelmää.

Tl. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu- 15 Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-

Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-

Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

20 T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-

Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

Lisäksi saatiin myös seuraavat peptidit: T6. Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-. 25 Met-Glu-Asp-Ile-Lys.

T7. Val-Pro-Gln-Leu-Gln-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Ala-

Glu-Glu-Arg.

T8. Thr-Val-Asp-Met-Glu-Pse-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-

Lys.

30 T9. Leu-Pth-Glu-Glu-Lys.

·. Peptidit Tl, T6 ja T7 saatiin myös alfael-kaseinaa- tin (sisältäen alfa8l'sen ja alfae0'n) TPCK-trypsiiniuutos-ta. Peptidi T2 saatiin myös beeta-kaseinaatin TPCK-tryp-siiniuutosta. Peptidit T3, T4, T5, T8 ja T9 saatiin myös 35 alfae2-kaseinaatin (käsittäen alfa62, alfae3, alfa„4 ja 7 92709 alfas6) TPCK-trypsiiniuutosta. Aminohapposymbolit ovat seuraavat: Pse-fosfoseriini, Ser-seriini, Pth-fosfotreo- niini, Thr-treoniini, Glu-glutamaatti, Asp-aspartaatti, Ala-alaniini, Asn-aspargiini, Gln-glutamiini, Gly-glysii-5 ni, Arg-arginiini, His-histidiini, Ile-isoleusiini, Leu-leusiini, Lys-lysiini, Met-metioniini, Pro-proliini, Tyr-tyrosiini, Val-valiini.

Erotusmenetelmä II

Seuraava menetelmä kuvaa yhtä selektiivistä sak-10 kauttamismallia.

Natriumkaseinaattiliuosta uutettiin trypsiinillä (50:1, kaseiini:trypsiini) yksi tunti 37 °C:ssa, samalla kun pH pidettiin 8,0:ssa lisäämällä NaOH. HC1 (0,1 M) lisättiin sitten liuokseen huoneen lämpötilassa pH-arvoon 15 4,7 ja aikaansaatu sakka poistettiin BaCl2 lisättiin sa kan yläpuolella olevaan liuokseen arvoon 0,25 % paino/ tilavuus, mitä seurasi yhtä suuri tilavuus absoluuttista etanolia ja saatu sakka poistettiin ja kuivattiin. Sakka liuotettiin kymmenesosaan alkuperäisestä tilavuudesta vet-20 tä (liukenemisen helpottamiseksi pH nostettiin NaOH:11a) ja liuos tehtiin happamaksi pH-arvoon 3,5 1 M HCl:llä. Yhtä suuri tilavuus asetonia lisättiin ja sakka poistettiin ja kuivattiin. Sakka liuotettiin sitten uudelleen H20:hon ja tehtiin happamaksi arvoon pH 2,0 lisäämällä HC1.

, 25 Saatu sakka poistettiin ja hylättiin ja sakan yläpuolella olevan liuoksen pH säädettiin takaisin 3,5:een NaOH:lla ja yhtä suuri tilavuus asetonia lisättiin. Saatu sakka kerättiin, liuotettiin uudelleen veteen ja H2S04 lisättiin sak-kauttamaan BaS04, joka hylättiin. Sitten sakan yläpuolella 30 oleva liuos dialysoitiin ja kylmäkuivattiin tai sumutus- kuivattiin. Tällä menetelmällä saatiin viiden fosfopepti- din seos.

Seuraavassa ovat saadut fosfopeptidit:

Tl. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-35 Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

β 92709 Τ2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

Τ3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

5 T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-

Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Asn-Ser-Lys.

Fosfopeptidien (T1:T2:T3:T4:T5) suhde lopullisessa valmisteessa riippuu lähtöaineesta ja hydrolyysiolosuh-10 teista. Natriumkaseinaatin uutto TPCK-trypsiinillä antaa enimmäkseen T2, joissa oli pieniä määriä Tl, T3 ja T4. Kuitenkin T2 osoittaa suurempaa epävakaisuutta kuin muut peptidit niin, että voimakkaampi uutto, kuten tapahtuu joissakin kaupallisissa kaseiiniuutoissa, antaa valmis-15 teen, joka sisältää enimmäkseen Tl, jossa on pieniä määriä T3 ja T4.

Mikäli tässä menetelmässä käytetään natriumkaseinaatin asemesta alfa-sl-kaseiinia, saadaan puhdasta Tl. Kun beeta-kaseiini on lähtöaineena, saadaan puhdasta T2.

20 Tavallisimpia aktiivisten peptidien sekvenssejä on pentapeptidi Pse-Pse-Pse-Glu-Glu. Fosfaatti- ja karboksyy-liryhmien etäisyydet tämän pentapeptidin beeta-konformaa-tiossa on esitetty kuviossa 1.

Fosfaattien ja karboksyylien 6,88 Angströmrin etäi-: 25 syys sallii spesifisen kiinnittymisen kalsiumatomeihin hydroksiapatiittikiteiden c-akselia pitkin. Tämä penta-peptidisekvenssi tapahtuu peptideissä Tl - T4 ja tapahtuu modifioituna peptideissä T 5 - Pse-Pth-Pse-Glu-Glu, mitä seuraa fosfoseriinin varovainen korvaaminen fosfotreonii-30 nilla.

;; Varovaiset substituutiot aktiivisessa sekvenssissä olisivat fosfoseriinin korvaaminen fosfotreoniinilla ja pienemmässä määrässä fosfotyrosiinilla tai fosfohistidii-nillä, vaikka fosfoseriini on edullinen. Toinen mahdolli-35 nen fosfoseriinin korvaaminen saattaisi olla glutamaatilla 9 92709 tai aspartaaatilla, mutta jälleen fosfoseriini on edullinen. Mahdollinen korvaaja glutamaatille on aspartaatti.

Aktiiviset peptidit voivat muodostaa komplekseja kalsiumfosfaatin ja muiden kaksiarvoisten metalli-ioni-5 suolojen kanssa. Yksi mooli Tl sitoo 16 moolia CaHP04, niin että 10 mg/ml Tl-liuosta pH 7,0:ssa voi liuottaa 60 mM CaHP04, muodostaen metastabiilin ylikyllästetyn liuoksen suhteessa kalsiumfosfaattiyhdisteisiin. Kun kloridi on vastaionina, 1 mooli Tl sitoo ainoastaan 5 moolia Ca++, 10 joka sitoutuu ainoastaan seriinifosfaatteihin. Yhteen mooliin Tl, johon on sitoutunut 16 moolia CaHP04 (M.W. 4883) viitataan tämän jälkeen kalsiumfosfaatti Tl:nä. Kalsium-fosfaatin Tl tärkeä kemiallinen ominaisuus on, että se yli 2 % paino/tilav. vesikoostumuksessa on tiksotrooppinen 15 geeli. Tl - T5:n on osoitettu olevan potentiaalisesti hammasmätää vastustavia aineita, käyttämällä seuraavia koemenetelmiä:

Testi 1

Hydroksiapatiitin liukenemisnopeuskoe 20 Tämä koe on jo kuvatun testimenetelmän (Raynolds, E.C., Riley, P.F. ja Storey, E. Calcif. Tiss Int 34:s52 -s56, 1982) modifiointi. Tämän kokeen tarkoituksena on määrittää peptidien vaikutus hydroksiapatiitin liukenemiseen ja tässä suhteessa, koska hammaskiille koostuu suurelta : 25 osalta hydroksiapatiitista, on uskottu, että voidaan tehdä hyödyllisiä vertailuja.

Käytettiin kahdesti tislattua, deionisoitua vettä (18 mega ohmia/cm). Puhtaat analyysireagenssikemikaalit saatiin Ajax Chemicals'ilta, Australia. Pallomainen hyd-30 roksiapatiitti ostettiin BDH’lta. Kromatografiapylvästä, ;; joka sisälsi 0,1 g hydroksiapatiittipalloja, käytettiin kivennäisaineiden poistokokeessa. Tris 5 mM, pH 8,3, joka sisälsi 50 mM NaCl, käytettiin pylvään puskurina 20 °C:ssa ja sitä pumpattiin pylvään läpi nopeudella 0,1 ml/min. 35 Peptidiliuosta 0,1 mg/ml puskuria laskettiin pylvääseen ja li 10 92709 0,2 ml:n fraktiot kerättiin sekä ennen peptidin käyttöä että sen jälkeen ja analysoitiin kokonaismäärälle kalsiumia, fosfaattia ja peptidiä. Näistä arvoista saatiin liu-kenemisnopeus (nmol kalsiumia tai fosfaattia/min) jokaista 5 0,2 ml:n fraktiota kohti.

Kaikki fosfopeptidit Tl - T5 vähensivät hydroksi-apatiittiliukoisuusnopeuden n. 32 %:lla.

Fosfopeptidien T6 - T9 havaittiin olevan huomattavasti tehottomampia.

10 Fluoridi ja fosfopeptidi Tl antoivat yhdistetyn pienentymisen hydroksiapatiitin liukoisuudessa (40 %:n alentuminen). Fosfopeptidi Tl aiheutti 50 % suuremman fluoriretention hydroksiapatiittipylväässä.

Tämä työ osoittaa, että nämä fosfopeptidit sitou-15 tuvat hydroksiapatiittiin ja vähentävät kivennäisaineiden liukenemisnopeutta ja parantavat fluoridin retentiota kiteiseen sideaineeseen. Hydroksiapatiitin liukoisuuden pienentyminen oli suhteessa fosfoseriinipitoisuuteen ja etäisyyksiin peptidien välillä.

20 Testi 2

Suunsisäinen plakkikoe

Fosfopeptidin Tl plakkiin kohdistuva vaikutus määritettiin käyttäen Koulourides'in ja Ostrom'in suunsisäi-sen plakkitestin (Caries Res. 10:442 - 482, 1976) muunnos-25 ta. Emalilevyt sijoitettiin siirrettävään suunsisäiseen laitteeseen jäljittelemään hampaiden välistä tilaa. Tämä tehtiin siirrettävän laitteen molemmille puolille (vasen ja oikea). Laitetta kulutettiin sallimaan plakin kasautuminen hampaiden välistä tilaa jäljittelevillä alueilla.

30 Kahdeksan kertaa päivässä laite poistettiin ja pantiin ;; 37 °C:n liuokseen. Liuos sisälsi 2 paino/ tilavuus-% sakka

roosia, 2 paino/tilavuus-% glukoosia, 140 mM KC1, 20 mM NaCl pH:ssa 7,0. Kahdesti päivässä oikeanpuoleiset emali-levyt altistettiin liuokselle, joka sisälsi 1,8 paino/ti-35 lavuus-% kalsiumfosfaattia Tl 140 mM KCl:ssä, 20 mM

11 92709

NaCl:ssä pH:ssa 7,0 samalla kun vasen puoli altistettiin ainoastaan suolaliuokselle. Kokeen päätyttyä emalilevyt poistettiin. Plakkia otettiin laitteen molemmilta puolilta ja analysoitiin kalsiumfosfaatin, seriinifosfaatin ja pep-5 tidin Tl suhteen käyttäen kilpailukykyistä, kvantitatiivista, entsyymisitoutunutta immunosorptiokoetta (ELISA) käyttäen monoklonaalista antipeptidi-Tl-vasta-ainetta.

Tämä osoitti, että plakki laitteen oikealla puolella, joka oli altistettu kahdesti päivässä peptidi-Tl-10 liuokselle, sisälsi peptidiä vähintään 0,4 % paino/plakin märkäpaino ja kalsiumfosfaatin pitoisuus oli kohonnut 2 - 4-kertaiseksi.

Tämä työ osoitti, että peptidi Tl on yhdistynyt plakkiin ja täten kohottanut plakin kalsium- ja fosfaat-15 tipitoisuutta. Tätä yhdistymis- ja akkumuloitumismenetel-mää hammasplakissa voidaan käyttää siirtämään uudelleen kivennäisaineita ja antibakteerisia ioneja plakkiin ja kiilteeseen, esim. Ca, P04, FP03, Zn, Cu, Sn, Ag, AI, Fe ja La.

20 Testi 3

Suun sisäinen kivennäisaineiden lisääminen Käytettiin suun sisäistä laitetta, joka oli samanlainen kuin edellisessä testimenetelmässä, paitsi että emalilevyt oli ennalta altistettu kivennäisaineita vähen- ° tävälle liuokselle, joka aiheutti kaksi pinnanalaista ki vennäisaineen vähentymisestä aiheutunutta vauriota kussakin levyssä. Kivennäisaineita poistavassa liuoksessa oli 0,1 M laktaattipuskuria pH 5,0, joka sisälsi 500 mg/1 hydroksiapatiittia ja 1 % agaria. Koehenkilöt käyttivät .. ^ laitteita 10 päivää. Kahdesti päivässä laitteet poistet-• tiin ja tippa kivennäisainetta lisäävää liuosta pantiin emalilevyille laitteen oikealle puolelle. Emalilevyjen vasen puoli toimi kontrollina. 10 päivän kuluttua emalilevyt poistettiin, poikkileikattiin ja saatettiin mikrora-35 diografiaan. Kivennäisainemäärä, joka oli kerrostunut ta- 12 92709 kaisin pinnanalaisiin vaurioikohtiin, määritettiin käyttäen mikrodensitometriä. Kivennäisainetta lisäävä liuos, joka sisälsi 1,8 % paino/tilav. Tl-kalsiumfosfaattia, pH 7,0, palautti 57 % kivennäisainehäviöstä verrattuna ai-5 noastaan syljestä aiheutuneeseen 13 %:iin.

Testi 4

Plakin pH:n aleneminen

Koehenkilöt pidättäytyivät suun hygieniasta 3-5 päivää, sen jälkeen seurasi yhden minuutin huuhtelu 10 5-%:isella sakkaroosiliuoksella. Plakkinäytteet poistet tiin ja pH mitattiin käyttäen yhden tipan menetelmää. Noin viiden minuutin kuluttua pH putosi n. 5,Oraan. Kuitenkin, mikäli koehenkilöt huuhtelivat liuoksella, joka sisälsi 1,8 % paino/tilav. Tl-kalsiumfosfaattia, pH 7,0, 15 mi-15 nuuttia ennen huuhtelua 5-%:isella sakkaroosiliuoksella, plakin pH ei pudonnut alle 6,7, mikä osoittaa Tl-kalsium-fosfaatin huomattavaa pH-puskurointia.

Koska tarkkaa mekanismia, jolla fosfopeptidit osoittavat plakkia vastustavaa aktiivisuutta, ei tunneta, 20 jatkossa esitetään seuraavat spekuloivat teoriat, mutta niitä ei tulisi pitää sitovina tai rajoittavina.

Fosfopeptidit voivat akkumuloitua plakkiin ja kiilteeseen, puskuroida plakkihappoa, estää kivennäisaineiden vähentymistä hammaskiilteestä ja lisätä kivennäisaineiden /· 25 lisääntymistä. Fosfopeptidien pieni molekyylipaino saattaa aiheuttaa läpitunkeutumista ja kasaantumista plakin ja kiilteen huokosissa. Fosfopeptidit, johtuen seriinifos-faattijäännösten sopivasta välistä, voivat sitoa hammas-kiilteen kivennäisaineita ja estää kivennäisaineiden vä-30 hentymistä. Peptidit voivat myös siirtää kalsiumia ja fos-;; faattia (fluorifosfaattia modifioitaessa) plakkiin ja kiilteeseen, sopivassa muodossa mahdollisesti sallien spontaanin kivennäisaineiden lisääntymisen. Fosfoseriini-jäännökset voivat myös puskuroida plakkihappoa. Fosfopep-35 tidi voi myös siirtää antibakteerisia metalli-ioneja, 13 92709 esim. Zn, Cu, Sn, Ag, AI, Fe ja La plakkiin ja tällä tavalla sillä on plakkia vastustava vaikutus. Metalli-ionit siirtyvät ensisijaisesti fosfopeptideissä, johtuen fosfo-seriinijäännöksistä. Fosfopeptidit voivat sitoa plakkibak-5 teereita ja estää sokerin hyväksikäytön.

Hakijat ovat formuloineet erilaisia koostumuksia tämän keksinnön mukaisesti seuraavassa. Yleensä koostumukset sisältävät 0,01 - 10 paino-% fosfopeptidiä.

Esimerkki 1 10 Jauho:

Laitteessa kuivien aineiden sekoittamiseksi, sekoitettiin 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia jauhon kanssa.

Esimerkki 2

Vilj avalmiste: 15 Aamiaisviljavalmiste suihkutettiin liuoksella, jos sa oli Tl-kalsiumfosfaattia vedessä. Sitten viljahiutaleet kuivattiin antamaan lopputuote, joka sisälsi 1 % Tl-kalsiumfosfaattia .

Esimerkki 3 20 Leipä: 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia lisättiin jauhoon aineosien sekoittamisen aikana leivän valmistamiseksi.

Esimerkki 4

Kakkuj auhe: ' 25 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia lisättiin aineosiin kakkutaikinan valmistuksessa.

Esimerkki 5

Makeiset:

Makeisten valmistuksessa lisättiin 1 paino-% Tl-30 kalsiumfosfaattia lopulliseen seokseen.

Esimerkki 6

Keksi:

Valmistettaessa keksi/seos lisättiin 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia muihin kuiviin aineosiin sekoituksen 35 aikana.

Il w 92709 14

Esimerkki 7 Virvoitusjuoma:

Valmistettiin virvoitusjuoma, johon oli liuotettu 0,1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia.

5 Esimerkki 8

Tabletti:

Valmistettiin tabletti, joka sisälsi 10 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia yhdessä täyteaineiden, jotka olivat maku- ja sideaineita, kanssa.

10 Tavallisen hampaidenpuhdistusaineen valmistuksessa tämän keksinnön piirin mukaisesti tarvittava suola ja fos-fopeptidin valikoidut suolat yhdistetään hampaanpuhdistus-ainekoostumuksiin jollakin sopivalla tavalla riippuen siitä, onko valmistettu jauhe, tahna tai nestevalmiste. Tätä 15 tarkoitusta varten lisätään tarkoituksenmukaisia valmis teita, kuten pinta-aktiivisia aineita, sideaineita, maku-aineita ja muita tarvittavia täyteaineita hampaidenpuhdistusaineen tarvittavan muodon aikaansaamiseksi.

Keksintöä kuvataan vielä seuraavien esimerkkien 20 avulla:

Esimerkki 9 Hammastahna:

Valmistettiin hammastahna, jolla oli seuraava koostumus : 25 Paino-%

Tl-kalsiumfosfaatti 5,0 CMC 7MF 1,0

Saccharin 450 0,2

Glyseriini (B.P.) 25,0 30 Natriumlauryylisulfaatti (Empicol 0919) 5,0

Natriumbentsoaatti 0,5

Makuaine 9/693090 0,8

Kalsiumfosfaatti 1,0 35 Deionisoitu vesi 39,5 15 92709

Thixosyl 33J 9,5

Syloid Al-1 12,0

Titanium Dioxide 3328 0,5

Esimerkki 10 5 Hammastahna:

Valmistaminen, kuten esimerkissä 9 on esitetty, toistettiin, mutta lisättiin 0,2 % natriumfluoridia sopivassa muodossa.

Esimerkki 11 10 Hammastahna:

Valmistaminen, kuten esimerkissä 9 on esitetty, toistettiin, mutta 0,4 %:n tinafluoridinlisäyksellä sopivassa muodossa.

Esimerkki 12 15 Hammastahna:

Valmistus, kuten esimerkissä 9 on esitetty, toistettiin, mutta 0,76 % mononatriumfluorifosfaattia lisättiin sopivassa muodossa.

Esimerkki 13 20 Hammasjauhe:

Tehtiin seuraava valmiste:

Tl-kalsiumfosfaatti 5,0 paino-% liukoinen sakkariini 0,1 paino-% väriaine pieni määrä 25 kaksiarvoinen kalsiumfosfaatti 94,1 paino-%

Esimerkki 14 Hammasjauhe:

Tehtiin valmiste, kuten esimerkissä 13 on esitetty, mutta lisättiin 0,76 % mononatriumfluorifosfaattia sopi-30 vassa muodossa.

Esimerkki 15

Nestemäinen hampaidenpuhdistusaine:

Tehtiin valmiste, joka sisälsi: natriumalginaattia 1,4 paino-% 35 Tl-kalsiumfosfaattia 2,0 paino-% 11 16 92709 natriumlauryylisulfaattia 1,0 paino-% makuainetta pieni määrä väriainetta pieni määrä vettä 95,5 paino-% 5 Esimerkki 16

Nestemäinen hampaidenpuhdistusaine:

Kuten esimerkissä 15, mutta lisättiin 0,5 % nat-riumfluoridia.

Esimerkki 17 10 Suunpesuneste:

Tehtiin seuraava valmiste:

Tl-kalsiumfosfaatti 2,0 paino-% natriumfluoridi 0,5 paino-% makuaine pieni määrä 15 väriaine pieni määrä vesi 97,5 paino-%

Esimerkki 18

Hiilihapotettu virvoitusjuoma: 0,1 paino-% kalsiumfosfopeptidiä Tl lisättiin kau-20 pallisesti saatavaan hiilihapotettuun virvoitusjuomaan. Esimerkki 19 Hedelmämehu: 0,1 paino-% Tl-kalsiumfosfopeptidiä lisättiin kaupallisesti saatavaan hedelmämehuun.

25 Esimerkki 20

Liuos käytettäväksi paikallisesti hampaisiin: Tl-kalsiumfosfaatti 2 %

NaF 0,6 mM

Zn-asetaatti 0,1 mM

30 SrCl2 0,1 mM

(tämä liuos voidaan muodostaa geeliksi lisäämällä Tl-kal-siumfosfaatin määrää).

17 92709

Esimerkki 21 Hampaiden täyteaine

Tl-kalsiumfosfaatti 5 % paino/paino kalsiumfosfaatti 95 % paino/paino 5 polymerointiainetta pieni määrä

Tehdään tahnaksi veden kanssa.

Tässä esimerkissä käytetty polymerointiaine oli glutaraldehydi.

Esimerkki 22 10 Hampaiden täyteaine:

Tl-kalsiumfosfaatti 5 % paino/paino kalsiumfosfaatti 70 % akryylipolymeeri 25 % katalyytti polymeerille pieni määrä 15 Esimerkki 23

Paikallinen geeli yliherkkien hampaiden hoitoon: Tl-kalsiumfosfaatti 4,0 paino-%

SrF2 1,0 paino-% maku- aine pieni määrä 20 vesi 95 %

Edellisessä käytettiin Tl-kalsiumfosfaattia kuvaamistar-koituksessa, mutta sen asemesta voidaan käyttää mitä tahansa tarkoituksenmukaista fosfopeptidiä ja/tai suolaa.

Muunnokset ja sovellutukset voidaan tehdä edellä 25 kuvattuun.

li

Claims (20)

92709

1. Fosfopeptidi, tunnettu siitä, että sil-5 lä on sekvenssi: Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu- Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys; Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val- Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fosfopeptidi, tunnettu siitä, että se on hapon tai suolan muodossa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen fosfopeptidi, tunnettu siitä, että se on natriumsuolan muodossa.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen fos fopeptidi, tunnettu siitä, että se on oleellisesti puhtaassa muodossa.

5. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen fosfopeptidi, tunnettu siitä, että se on pe- 25 räisin kaseiinista, aB-kaseiinista, β-kaseiinista tai nii den suolasta.

6. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen fosfopeptidin saamiseksi, tunnettu siitä, että fraktioidaan kaseiinin, as-kaseiinin, β-kaseiinin tai 30 niiden suolan uute.

7. Suunhuoltokoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useamman jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen fosfopeptidin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, t u n- 35. e t t u siitä, että se sisältää kalsiumfosfaattia tai hydroksiapatiittia. 92709

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää noin 16 moolia CaHP04 moolia kohti fosfopeptidiä/fosfopeptidejä.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen 5 koostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen.

10 Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser- Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys; Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; tai Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että laimennin on suun kautta otettava aine.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 7-11 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää yhtä tai useampaa suolaa, joka sisältää kahdenarvoisia metalli-ioneja.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 7-12 mukainen 15 koostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää yhtä tai useampaa remineralisoivaa ja bakteerinvas-taista ionia.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että ionit on valittu seuraavista:

20 Ca, P04, FP03, Zn, Cu, Sn, Ag, Ai, Fe ja La.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 7-14 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että siinä ei oleellisesti ole pahanmakuisia epäpuhtauksia.

16. Jonkin patenttivaaimuksista 7 - 15 mukainen 25 koostumus, tunnettu siitä, että fosfopeptidiä on läsnä 0,01 - 10 paino-%.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että fosfopeptidiä on läsnä 0,01 -5 paino-%.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että fosfopeptidiä on läsnä 0,01 -2 paino-%.

19. Jonkin patenttivaatimuksista 7-18 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se on hammastah-35 nan, hammasjauheen, hampaanpuhdistusaineen, suunpesunes- II 92709 teen, hampaan täytekoostumuksen tai hampaille paikallisesti laitettavan valmisteen, liuoksen tai geelin muodossa.

20. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen yhden tai useamman fosfopeptidin käyttö suunhuoltolisä-5 aineena elintarvikkeessa, makeisissa tai juomissa. 92709