ES3038401T3 - Substituted quinazolinyl compounds useful as t cell activators - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos de Fórmula (I): (I) o una sal de los mismos, donde: R1, R2, R4, R5, R6 y m se definen en el presente documento. También se describen métodos para usar dichos compuestos para inhibir la actividad de una o ambas de las diacilglicerol quinasas alfa (DGKα) y zeta (DGKζ), así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos. Estos compuestos son útiles en el tratamiento de infecciones virales y trastornos proliferativos, como el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de quinazolinilo sustituidos útiles como activadores de células t

Campo de la Invención

La presente invención generalmente se refiere a compuestos de quinazolinilo sustituidos que activan las células T, promueven la proliferación de células T y/o exhiben actividad antitumoral. En el presente documento se proporcionan compuestos de quinazolinilo sustituidos, composiciones que comprenden tales compuestos y métodos para su uso. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de acuerdo con la invención que son útiles para el tratamiento de trastornos proliferativos, tales como cáncer e infecciones virales. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes de la Invención

Los cánceres humanos albergan numerosas alteraciones genéticas y epigenéticas, generando neoantígenos potencialmente reconocibles por el sistema inmunitario (Sjoblom et al. (2006) Science 314:268-74). El sistema inmunitario adaptativo, compuesto por linfocitos T y B, tiene un poderoso potencial contra el cáncer, con una amplia capacidad y exquisita especificidad para responder a diversos antígenos tumorales. Además, el sistema inmunitario demuestra una plasticidad considerable y un componente de memoria. El aprovechamiento exitoso de todos estos atributos del sistema inmunitario adaptativo haría que la inmunoterapia fuera única entre todas las modalidades de tratamiento del cáncer. Sin embargo, aunque se observa una respuesta inmunitaria endógena al cáncer en modelos preclínicos y pacientes, esta respuesta es ineficaz y los cánceres establecidos se consideran "propios" y tolerados por el sistema inmunitario. Contribuyendo a este estado de tolerancia, los tumores pueden explotar varios mecanismos para subvertir activamente la inmunidad antitumoral Estos mecanismos incluyen señalización de células T disfuncionales (Mizoguchi et al., (1992) Science 258: 1795-98), células reguladoras supresoras (Facciabene et al., (2012) Cáncer Res. 72 :2162-71), y la cooptación de "puntos de control inmunitarios" endógenos, que sirven para modular a la baja la intensidad de las respuestas inmunitarias adaptativas y proteger los tejidos normales del daño colateral, por parte de los tumores para evadir la destrucción inmunitaria (Topalian et al., (2012) Curr. Opin. Immunol.

24:1-6; Mellman et al. (2011) Nature 480:480-489).

Las diacilglicerol cinasas (DGKs) son cinasas lipídicas que median la conversión de diacilglicerol en ácido fosfatídico, lo que termina con las funciones de las células T propagadas a través de la vía de señalización de TCR. Por lo tanto, las DGKs sirven como puntos de control intracelulares y se espera que la inhibición de las DGKs mejore las vías de señalización de las células T y la activación de las células T. La evidencia de respaldo incluye modelos de ratón knock-out de DGKa o DGKZ que muestran un fenotipo de células T hiperreactivas y una actividad inmunológica antitumoral mejorada (Riese M.J. et al., Journal o f Biological Chemistry, (2011) 7: 5254-5265; Zha Y et al., Nature Immunology, (2006) 12:1343; Olenchock B.A. et al., (2006) 11: 1174-81). Además, se observó que los linfocitos que se infiltran en el tumor aislados de pacientes con carcinoma de células renales humanas sobreexpresaban DGKa, lo que dio como resultado la inhibición de la función de las células T (Prinz, P.U. et al., J Immunology (2012) 12:5990-6000). Por lo tanto, DGKa y DGKZ se consideran objetivos para la inmunoterapia contra el cáncer (Riese M.J. et al., Front Cell Dev Biol. (2016) 4: 108; Chen, S.S. et al., Front Cell Dev Biol. (2016) 4: 130; Avila-Flores, A. et al., Immunology and Cell Biology (2017) 95: 549-563; Noessner, E., Front Cell Dev Biol. (2017) 5: 16; Krishna, S., et al, Front Immunology (2013) 4:178, Jing, W. et al., Cancer Research (2017) 77: 5676-5686.

Sigue existiendo la necesidad de compuestos útiles como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGKZ. Además, sigue existiendo la necesidad de compuestos útiles como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGKZ que tengan selectividad sobre otras diacilglicerol cinasas, proteínas cinasas y/u otras lípidos cinasas.

En consecuencia, un agente que es seguro y eficaz para restaurar la activación de las células T, reducir el umbral del antígeno, mejorar la funcionalidad antitumoral y/o superar los efectos supresores de uno o más puntos de control inmunitarios endógenos, tal como PD-1, LAG-3 y TGFp, sería una adición importante para el tratamiento de pacientes con trastornos proliferativos, tal como el cáncer, así como infecciones virales.

Breve Descripción de la Invención

Los solicitantes han encontrado compuestos que tienen actividad como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGKZ. Además, los solicitantes han encontrado compuestos que tienen actividad como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGKZ y tienen selectividad sobre otras diacilglicerol cinasas, proteína cinasas y/u otras cinasas lipídicas. Estos compuestos se proporcionan para ser útiles como productos farmacéuticos con valores deseables de estabilidad, biodisponibilidad, índice terapéutico y toxicidad que son importantes para su capacidad farmacéutica.

La presente invención proporciona compuestos de quinazolinilo sustituidos según se reivindican, que son útiles como inhibidores de DGKa, Dg Kz, o tanto DGKa como d GkZ, incluyendo sus sales.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto según se reivindica y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona compuestos para su uso en un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad de DGKa, DGKZ, o tanto DGKa como DGKZ, en donde el método comprende administrar a un paciente mamífero un compuesto de la invención y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describen (pero no se reivindican) procesos e intermediarios para preparar los compuestos de la invención y/o sus sales.

La presente invención también proporciona un compuesto según se reivindica y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia.

La presente invención también proporciona el uso de los compuestos según se reivindican y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos proliferativos, tales como cáncer e infecciones virales.

Los compuestos de la invención y las composiciones que comprenden los compuestos de la invención pueden usarse para tratar, prevenir o curar infecciones virales y diversos trastornos proliferativos, tal como el cáncer. Las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos son útiles para tratar, prevenir o retrasar la progresión de enfermedades o trastornos en una variedad de áreas terapéuticas, tal como infecciones virales y cáncer.

Estas y otras características de la invención se expondrán en forma ampliada a medida que continúe la descripción.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula (I):

DEFINICIONES

Las características y ventajas de la invención pueden ser comprendidas más fácilmente por los expertos en la materia al leer la siguiente descripción detallada. Debe apreciarse que ciertas características de la invención que, por razones de claridad, se describen arriba y abajo en el contexto de modalidades separadas, también pueden combinarse para formar una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención que, por razones de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también pueden combinarse para formar subcombinaciones de las mismas. Las modalidades identificadas en el presente documento como ejemplares o preferidas pretenden ser ilustrativas y no limitativas.

A menos que se indique específicamente lo contrario en este documento, las referencias hechas en singular también pueden incluir el plural. Por ejemplo, "un" y "una" pueden referirse a uno, una o más.

Como se usa en el presente documento, la frase "compuestos y/o sales de los mismos" se refiere a al menos un compuesto, al menos una sal de los compuestos o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los compuestos de la invención y/o sus sales incluyen un compuesto de la invención; dos compuestos de la invención; una sal de un compuesto de la invención; un compuesto de la invención y una o más sales del compuesto de la invención; y dos o más sales de un compuesto de la invención.

A menos que se indique lo contrario, se supone que cualquier átomo con valencias insatisfechas tiene suficientes átomos de hidrógeno para satisfacer las valencias.

A continuación se enumeran las definiciones de varios términos usados para describir la presente invención. Estas definiciones se aplican a los términos tal como se usan a lo largo de la descripción (a menos que estén limitados de otro modo en casos específicos), ya sea individualmente o como parte de un grupo más grande.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.

Los compuestos de la invención pueden formar sales que también están dentro del alcance de esta invención. A menos que se indique lo contrario, se entiende que la referencia a un compuesto de la invención incluye la referencia a una o más de sus sales. El término “sal(es)” denota sales ácidas y/o básicas formadas con ácidos y bases inorgánicos y/u orgánicos. Además, el término “sal(es) puede incluir zwitteriones (sales internas), por ejemplo, cuando un compuesto de la invención contiene un resto básico, tal como una amina o un anillo de piridina o imidazol, y un resto ácido, tal como un ácido carboxílico. Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente aceptables), tales como, por ejemplo, sales de aminas y metales aceptables en las que el catión no contribuye significativamente a la toxicidad o actividad biológica de la sal. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles, por ejemplo, en etapas de aislamiento o purificación que pueden emplearse durante la preparación y, por lo tanto, se contemplan dentro del alcance de la invención. Las sales de los compuestos de la invención se pueden formar, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de la invención con una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el que el precipitados de sal o en un medio acuoso seguido de liofilización.

Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen acetatos (tales como los formados con ácido acético o ácido trihaloacético, por ejemplo, ácido trifluoroacético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, canforatos, canforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etansulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, clorhidratos (formados con ácido clorhídrico), bromhidratos (formados con bromuro de hidrógeno), yodhidratos, maleatos (formados con ácido maleico), 2-hidroxietansulfonatos, lactatos, metansulfonatos (formados con ácido metansulfónico), 2-naftalensulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (tal como los formados con ácido sulfúrico), sulfonatos (tal como los mencionados aquí), tartratos, tiocianatos, toluensulfonatos tales como tosilatos, undecanoatos y similares.

Los ejemplos de sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, litio y potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio; sales de bario, zinc y aluminio; sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) como trialquilaminas tales como trietilamina, procaína, dibencilamina, N-bencil-p-fenetilamina, 1-efenamina, N,N'-dibenciletilendiamina, deshidroabietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, diciclohexilamina o aminas y sales farmacéuticamente aceptables similares con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. Los grupos básicos que contienen nitrógeno se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo inferior (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), sulfatos de dialquilo (por ejemplo, sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo), haluros de cadena larga (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo), haluros de aralquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo) y otros. Las sales preferidas incluyen sales de monoclorhidrato, hidrogenosulfato, metansulfonato, fosfato o nitrato.

Los compuestos de la invención se pueden proporcionar como sólidos amorfos o sólidos cristalinos. Puede emplearse la liofilización para proporcionar los compuestos de la invención como un sólido.

Debe entenderse además que los solvatos (por ejemplo, hidratos) de los compuestos de la invención también están dentro del alcance de la presente invención. El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto de la invención con una o más moléculas de solvente, ya sean orgánicas o inorgánicas. Esta asociación física incluye enlaces de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo, cuando se incorporan una o más moléculas de solvente en la red cristalina del sólido cristalino. “Solvato” abarca tanto la fase de solución como los solvatos aislables. Los solvatos ejemplares incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos, isopropanolatos, solvatos de acetonitrilo y solvatos de acetato de etilo. Los métodos de solvatación son conocidos en la técnica.

Además, los compuestos de la invención, con posterioridad a su preparación, pueden aislarse y purificarse para obtener una composición que contenga una cantidad en peso igual o superior al 99% de un compuesto de la invención (“sustancialmente puro”), que luego se usa o formula como se describe en este documento. Los compuestos "sustancialmente puros" de la invención también se contemplan aquí como parte de la presente invención.

"Compuesto estable" y "estructura estable" pretenden indicar un compuesto que es lo suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza de una mezcla de reacción y la formulación en un agente terapéutico eficaz. La presente invención pretende incorporar compuestos estables.

“Cantidad terapéuticamente efectiva” pretende incluir una cantidad de un compuesto de la presente invención solo o una cantidad de la combinación de compuestos reivindicados o una cantidad de un compuesto de la presente invención en combinación con otros ingredientes activos efectivos para actuar como inhibidor. de DGKa y/o DGKZ, o eficaz para tratar o prevenir infecciones virales y trastornos proliferativos, tal como el cáncer.

Como se usa aquí, "tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de un estado de enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que el estado de enfermedad ocurra en un mamífero, en particular, cuando tal el mamífero está predispuesto al estado de enfermedad pero aún no se le ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir el estado de enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y/o (c) aliviar el estado de enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado de enfermedad.

Se pretende que los compuestos de la presente invención incluyan todos los isótopos de átomos que se encuentren en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferente número de masa. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio (D) y tritio (T). Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos de la invención marcados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica o mediante procesos análogos a los descritos en este documento, usando un reactivo marcado isotópicamente en lugar del reactivo no marcado empleado de otro modo.

Los compuestos de la invención y/o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden administrarse por cualquier medio adecuado para la afección a tratar, que puede depender de la necesidad de un tratamiento específico del sitio o de la cantidad de compuesto que se va a administrar.

También se incluye dentro de esta invención una clase de composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención y/o sus sales farmacéuticamente aceptables; y uno o más portadores y/o diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos (denominados colectivamente en el presente documento como materiales “portadores”) y, si se desea, otros ingredientes activos. Los compuestos de la invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica adaptada a tal vía, y en una dosis eficaz para el tratamiento pretendido. Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden, por ejemplo, administrarse por vía oral, mucosa o parenteral, incluidas las vías intravascular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular e intraesternal en formulaciones de unidades de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. Por ejemplo, el portador farmacéutico puede contener una mezcla de manitol o lactosa y celulosa microcristalina. La mezcla puede contener componentes adicionales, tal como un agente lubricante, por ejemplo, estearato de magnesio y un agente desintegrador como la crospovidona. La mezcla de portadores puede llenarse en una cápsula de gelatina o comprimirse como una tableta. La composición farmacéutica se puede administrar como una forma de dosificación oral o una infusión, por ejemplo.

Para la administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma de, por ejemplo, tableta, cápsula, cápsula líquida, suspensión o líquido. La composición farmacéutica se prepara preferiblemente en forma de unidad de dosificación que contenga una cantidad particular del ingrediente activo. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede proporcionar como una tableta o cápsula que comprenda una cantidad de ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 1000 mg, preferiblemente de aproximadamente 0.25 a 250 mg, y más preferiblemente de aproximadamente 0.5 a 100 mg. Una dosis diaria adecuada para un humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la condición del paciente y otros factores, pero puede determinarse usando métodos de rutina.

Cualquier composición farmacéutica contemplada en el presente documento puede, por ejemplo, administrarse por vía oral a través de cualquier preparación oral aceptable y adecuada. Ejemplos de preparaciones orales incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas y oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras y blandas, cápsulas líquidas, jarabes y elixires. Las composiciones farmacéuticas destinadas a la administración oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para fabricar composiciones farmacéuticas destinadas a la administración oral. Con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente apetecibles, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener al menos un agente seleccionado de agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, emolientes, antioxidantes y agentes conservadores.

Se puede preparar una tableta, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un excipiente no tóxico farmacéuticamente aceptable adecuado para la fabricación de tabletas. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como, por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio y fosfato de sodio; agentes de granulación y disgregación, tales como, por ejemplo, celulosa microcristalina, croscarmelosa de sodio, almidón de maíz y ácido algínico; agentes aglutinantes, tales como, por ejemplo, almidón, gelatina, polivinilpirrolidona y goma arábiga; y agentes lubricantes, tales como, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. Además, una tableta puede estar sin recubrir o recubrirse mediante técnicas conocidas para enmascarar el mal sabor de un medicamento de sabor desagradable o retrasar la desintegración y absorción del ingrediente activo en el tracto gastrointestinal, manteniendo así los efectos del ingrediente activo por un período más largo. Los materiales de enmascaramiento del sabor solubles en agua a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa. Los ejemplos de materiales de retardo de tiempo incluyen, pero no se limitan a, etilcelulosa y butirato de acetato de celulosa.

Las cápsulas de gelatina dura se pueden preparar, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal del mismo con al menos un diluyente sólido inerte, tal como, por ejemplo, carbonato de calcio; fosfato de calcio; y caolín.

Las cápsulas de gelatina blanda se pueden preparar, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un portador soluble en agua, tal como, por ejemplo, polietilenglicol; y al menos un medio oleoso, tal como por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida y aceite de oliva.

Se puede preparar una suspensión acuosa, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un excipiente adecuado para la fabricación de una suspensión acuosa. Ejemplos de excipientes adecuados para la fabricación de una suspensión acuosa incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes de suspensión, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, ácido algínico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; agentes dispersantes o humectantes, tal como, por ejemplo, un fosfátido natural, por ejemplo, lecitina; productos de condensación de óxido de alquileno con ácidos grasos, tal como por ejemplo estearato de polioxietileno; productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, tal como por ejemplo heptadecaetileno-oxicetanol; productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitol; y productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de polietilensorbitán. Una suspensión acuosa también puede contener al menos un conservador, tal como, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo; al menos un agente colorante; al menos un agente saborizante; y/o al menos un agente edulcorante, incluyendo, entre otros, sacarosa, sacarina y aspartame.

Las suspensiones oleosas se pueden preparar, por ejemplo, suspendiendo al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuate; aceite de oliva; aceite de ajonjolí; y aceite de coco; o en aceite mineral, tal como por ejemplo parafina líquida. Una suspensión oleosa también puede contener al menos un agente espesante, tal como por ejemplo cera de abejas; parafina dura; y alcohol cetílico. Para proporcionar una suspensión oleosa apetecible, se puede añadir a la suspensión oleosa al menos uno de los agentes edulcorantes ya descritos anteriormente y/o al menos un agente saborizante. Una suspensión oleosa puede contener además al menos un conservador, que incluye, entre otros, un antioxidante, tal como, por ejemplo, hidroxianisol butilado y alfa-tocoferol.

Los polvos y gránulos dispersables se pueden preparar, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un agente dispersante y/o humectante; al menos un agente de suspensión; y/o al menos un conservador. Los agentes dispersantes, humectantes y suspensores adecuados son los ya descritos anteriormente. Los conservadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico. Además, los polvos y gránulos dispersables también pueden contener al menos un excipiente, incluidos, entre otros, por ejemplo, agentes edulcorantes; agentes saborizantes; y colorantes.

Una emulsión de al menos un compuesto de la invención y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede prepararse, por ejemplo, tal como una emulsión de aceite en agua. La fase oleosa de las emulsiones que comprenden compuestos de la invención puede estar constituida a partir de ingredientes conocidos de manera conocida. La fase oleosa puede ser proporcionada por, pero no se limita a, por ejemplo, un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de oliva y aceite de cacahuate; un aceite mineral tal como, por ejemplo, parafina líquida; y mezclas de los mismos. Mientras que la fase puede comprender simplemente un emulsionante, puede comprender una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con una grasa y un aceite. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fosfátidos naturales, por ejemplo, lecitina de soya; ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, tales como, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán. Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizador. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el(los) emulsionante(s) con o sin estabilizador(es) forman la llamada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa forman la llamada base de ungüento emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de la formulaciones de crema. Una emulsión también puede contener un agente edulcorante, un agente saborizante, un conservador y/o un antioxidante. Los emulsionantes y estabilizadores de emulsión adecuados para usar en la formulación de la presente invención incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo, laurilsulfato de sodio, diestearato de glicerilo solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica.

Los compuestos de la invención y/o al menos una de sus sales farmacéuticamente aceptables también pueden, por ejemplo, administrarse por vía intravenosa, subcutánea y/o intramuscular a través de cualquier forma inyectable farmacéuticamente aceptable y adecuada. Las formas inyectables ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, soluciones acuosas estériles que comprenden vehículos y solventes aceptables, tales como, por ejemplo, agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio; microemulsiones estériles de aceite en agua; y suspensiones acuosas u oleaginosas.

Las formulaciones para administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones inyectables estériles isotónicas acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles usando uno o más de los portadores o diluyentes mencionados para usar en las formulaciones para administración oral o usando otros agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. Los compuestos pueden disolverse en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, alcohol bencílico, cloruro de sodio, goma de tragacanto y/o diversos amortiguadores. Otros adyuvantes y modos de administración son bien y ampliamente conocidos en la técnica farmacéutica. El ingrediente activo también se puede administrar por inyección como una composición con portadores adecuados que incluyen solución salina, dextrosa o agua, o con ciclodextrina (es decir, Captisol), solubilización con cosolvente (es decir, propilenglicol) o solubilización micelar (es decir, Tween 80).

La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como solvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Una microemulsión de aceite en agua inyectable estéril puede prepararse, por ejemplo, 1) disolviendo al menos un compuesto de la invención en una fase oleosa, tal como, por ejemplo, una mezcla de aceite de soya y lecitina; 2) combinando la fase oleosa que contiene el compuesto de la invención con una mezcla de agua y glicerol; y 3) procesando la combinación para formar una microemulsión.

Se puede preparar una suspensión acuosa u oleaginosa estéril de acuerdo con métodos ya conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede preparar una solución o suspensión acuosa estéril con un diluyente o solvente no tóxico aceptable por vía parenteral, tal como, por ejemplo, 1,3-butanodiol; y se puede preparar una suspensión oleaginosa estéril con un solvente aceptable no tóxico estéril o medio de suspensión, tal como, por ejemplo, aceites fijos estériles, por ejemplo, mono- o diglicéridos sintéticos; y ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido oleico.

Los portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, entre otros, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS) tales como succinato de d-alfa-tocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos usados en formas de dosificación farmacéuticas tal como Tweens, aceite de ricino polietoxilado tal como el tensioactivo CREMOPHOR (BASF) u otras matrices poliméricas similares, proteínas séricas, tal como la albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras como los fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tal como sulfato de protamina, fosfato ácido de disodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las ciclodextrinas tales como alfa-, beta- y gamma-ciclodextrina, o derivados químicamente modificados tales como hidroxialquilciclodextrinas, incluyendo 2- y 3-hidroxipropil-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados también se pueden usar ventajosamente para mejorar la administración de compuestos de las fórmulas descritas en la presente.

Los compuestos farmacéuticamente activos de esta invención pueden procesarse de acuerdo con métodos convencionales de farmacia para producir agentes medicinales para administrar a pacientes, incluyendo humanos y otros mamíferos. Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, amortiguadores, etc. Las tabletas y píldoras también pueden prepararse con recubrimientos entéricos. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Las cantidades de compuestos que se administran y el régimen de dosificación para tratar una enfermedad con los compuestos y/o composiciones de esta invención dependen de una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso, el sexo, la condición médica del sujeto, el tipo de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la vía y frecuencia de administración, y el compuesto particular empleado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera rutinaria usando métodos estándar. Una dosis diaria de aproximadamente 0.001 a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0.0025 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y más preferiblemente entre aproximadamente 0.005 y 10 mg/kg de peso corporal, puede ser apropiada. La dosis diaria se puede administrar en una a cuatro tomas por día. Otros programas de dosificación incluyen una dosis por semana y una dosis por ciclo de dos días.

Para fines terapéuticos, los compuestos activos de esta invención normalmente se combinan con uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración indicada. Si se administran por vía oral, los compuestos pueden mezclarse con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ésteres de alquilo de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma arábiga, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y/o alcohol polivinílico, y luego en comprimidos o encapsulados para una administración conveniente. Tales cápsulas o tabletas pueden contener una formulación de liberación controlada que se puede proporcionar en una dispersión del compuesto activo en hidroxipropilmetilcelulosa.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden al menos un compuesto de la invención y/o al menos una de sus sales farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, un agente adicional seleccionado de cualquier portador, adyuvante y vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones alternativas de esta invención comprenden un compuesto de la invención descrito en el presente documento, o un profármaco del mismo, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

UTILIDAD

Los compuestos de la invención son útiles para el tratamiento del cáncer.

Una preparación combinada de un compuesto de la invención, y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un estereoisómero del mismo o un tautómero del mismo, y agente(s) terapéutico(s) adicional(es) pueden usarse para el uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento y/o profilaxis de varias enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del objetivo de DGK en células T.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de la invención para su uso en un método para tratar a un paciente que padezca o sea susceptible de padecer una afección médica que esté asociada con la inhibición del objetivo de DGK en las células T. Se pueden tratar varias condiciones médicas. El método puede comprender administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprenda un compuesto de la invención y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un estereoisómero del mismo o un tautómero del mismo.

Por ejemplo, los compuestos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar o prevenir infecciones virales y enfermedades proliferativas como el cáncer.

Los compuestos de la invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la invención son útiles para tratar o prevenir cualquier enfermedad o condición que esté asociada con la inhibición del objetivo de DGK en las células T. Estas incluyen infecciones virales y de otro tipo (por ejemplo, infecciones cutáneas, infecciones gastrointestinales, infecciones del tracto urinario, infecciones genitourinarias, infecciones sistémicas) y enfermedades proliferativas (por ejemplo, cáncer). Los compuestos de la invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la invención pueden administrarse a animales, preferiblemente mamíferos (por ejemplo, animales domésticos, gatos, perros, ratones, ratas) y más preferiblemente humanos. Se puede usar cualquier método de administración para administrar el compuesto o la composición farmacéutica al paciente. El compuesto de la invención o la composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto de la invención puede administrarse por vía oral. El compuesto de la invención o la composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto de la invención puede administrarse por vía parenteral.

Los compuestos de la invención pueden inhibir la actividad de la diacilglicerol cinasa alfa y zeta (DGKa/Z). Por ejemplo, los compuestos de la invención se pueden usar en un método para inhibir la actividad de DGKa y DGKZ en una célula o en un individuo que necesita la modulación de DGKa y DGKZ mediante la administración de una cantidad inhibidora de un compuesto de la invención o una sal del mismo.

La presente invención proporciona además compuestos según se reivindican para su uso en métodos para tratar enfermedades asociadas con la actividad o la expresión, incluyendo la actividad anormal y/o la sobreexpresión, de DGKa y DGKZ en un individuo (por ejemplo, paciente) mediante la administración al individuo que necesite el tratamiento de una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención o una composición farmacéutica del mismo. Las enfermedades de ejemplo pueden incluir cualquier enfermedad, trastorno o condición que esté directa o indirectamente relacionada con la expresión o actividad de la enzima DGKa y DGKZ, tal como sobreexpresión o actividad anormal. Una enfermedad asociada con DGKa y DGKZ también puede incluir cualquier enfermedad, trastorno o condición que pueda prevenirse, mejorarse o curarse mediante la modulación de la actividad enzimática de DGKa y DGKZ. Los ejemplos de enfermedades asociadas con DGKa y DGKZ incluyen cáncer e infecciones virales como la infección por VIH, la hepatitis B y la hepatitis C.

Los compuestos de la invención pueden administrarse secuencialmente antes de la administración del agente inmunooncológico. Los compuestos de la invención pueden administrarse simultáneamente con el agente inmuno-oncológico. Los compuestos de la invención pueden administrarse secuencialmente después de la administración del agente inmuno-oncológico.

Los compuestos de la invención se pueden co-formular con un agente inmuno-oncológico.

Los agentes inmuno-oncológicos incluyen, por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo u otra molécula biológica o pequeña. Los ejemplos de agentes inmuno-oncológicos biológicos incluyen, entre otros, vacunas contra el cáncer, anticuerpos y citocinas. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal puede ser humanizado o humano.

El agente inmuno-oncológico puede ser (i) un agonista de un receptor estimulador (que incluye un coestimulador) o (ii) un antagonista de una señal inhibidora (que incluye una co-inhibidora) en las células T, ambos de los cuales dan como resultado la amplificación de las respuestas de células T específicas de antígeno (a menudo denominadas reguladores de puntos de control inmunitarios).

Algunas de las moléculas estimulantes e inhibidoras son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF). Una familia importante de ligandos unidos a la membrana que se unen a receptores co-estimuladores o co-inhibidores es la familia B7, que incluye B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) y B7-H6. Otra familia de ligandos unidos a la membrana que se unen a receptores co-estimuladores o co inhibidores es la familia de moléculas TNF que se unen a miembros afines de la familia de receptores TNF, que incluye CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137 (4-1BB), TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, INTERVALO, RANKL, TWEAKR/FN14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTBR, LIGHT, DCR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTBR, Linfotoxina aip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR.

Las respuestas de las células T pueden estimularse mediante una combinación de un compuesto de la invención y uno o más de (i) un antagonista de una proteína que inhibe la activación de las células T (por ejemplo, inhibidores de puntos de control inmunitarios) tales como CT<l>A-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4, y (ii) un agonista de una proteína que estimula la activación de células T tales como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H.

Otros agentes que pueden combinarse con compuestos de la invención para el tratamiento del cáncer incluyen antagonistas de receptores inhibidores en células NK o agonistas de receptores activadores en células NK. Por ejemplo, los compuestos de la invención se pueden combinar con antagonistas de KIR, tal como lirilumab.

Otros agentes más para terapias combinadas incluyen agentes que inhiben o agotan los macrófagos o monocitos, incluidos, entre otros, antagonistas de CSF-1R tal como anticuerpos antagonistas de CSF-1R que incluyen RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) o FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357).

Los compuestos de la invención se pueden usar con uno o más agentes agonistas que ligan receptores co estimuladores positivos, agentes bloqueadores que atenúan la señalización a través de receptores inhibidores, antagonistas y uno o más agentes que aumentan sistémicamente la frecuencia de células T anti-tumorales, agentes que superan distintas vías inmunosupresoras dentro del microambiente tumoral (por ejemplo, bloquean la participación del receptor inhibitorio (por ejemplo, interacciones PD-L1/PD-1), agotan o inhiben las Treg (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab) o mediante el agotamiento de microesferas anti-CD25 ex vivo), inhiben enzimas metabólicas como iDo , o revierten/previenen la anergia o el agotamiento de las células T) y agentes que desencadenan activación inmunitaria innata y/o inflamación en sitios tumorales.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de CTLA-4, tal como un anticuerpo antagonista de CTLA-4. Los anticuerpos CTLA-4 adecuados incluyen, por ejemplo, YERVOY (ipilimumab) o tremelimumab.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de PD-1, tal como un anticuerpo antagonista de PD-1. Los anticuerpos PD-1 adecuados incluyen, por ejemplo, OPDIVO (nivolumab), KEYTRUDA (pembrolizumab) o MEDI-0680 (AMP-514; WO2012/145493). El agente inmuno-oncológico también puede incluir pidilizumab (CT-011), aunque se ha cuestionado su especificidad para la unión a PD-1. Otro enfoque para apuntar al receptor PD-1 es la proteína recombinante compuesta por el dominio extracelular de PD-L2 (B7-DC) fusionado con la porción Fc de IgG1, llamada AMP-224.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de PD-L1, tal como un anticuerpo antagonista de PD-L1. Los anticuerpos PD-L1 adecuados incluyen, por ejemplo, MPDL3280A (RG7446; WO2010/077634), durvalumab (MEDI4736), BMS-936559 (WO2007/005874) y MSB0010718C (WO2013/79174).

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de LAG-3, tal como un anticuerpo LAG-3 antagonista. Los anticuerpos LAG3 adecuados incluyen, por ejemplo, BMS-986016 (WO10/19570, WO14/08218) o IMP-731 o IMP-321 (WO08/132601, WO09/44273).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de CD137 (4-1BB), tal como un anticuerpo agonista de CD137. Los anticuerpos CD137 adecuados incluyen, por ejemplo, urelumab y PF-05082566 (WO12/32433).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de GITR, tal como un anticuerpo agonista de GITR. Los anticuerpos GITR adecuados incluyen, por ejemplo, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO06/105021, WO09/009116) y MK-4166 (WO11/028683).

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de IDO. Los antagonistas de IDO adecuados incluyen, por ejemplo, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoximod, BMS-986205 o NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de OX40, tal como un anticuerpo agonista de OX40. Los anticuerpos OX40 adecuados incluyen, por ejemplo, MEDI-6383 o MEDI-6469.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de OX40L, tal como un anticuerpo antagonista de OX40. Los antagonistas de OX40L adecuados incluyen, por ejemplo, RG-7888 (WO06/029879).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de CD40, tal como un anticuerpo agonista de CD40. El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de CD40, tal como un anticuerpo antagonista de CD40. Los anticuerpos CD40 adecuados incluyen, por ejemplo, lucatumumab o dacetuzumab.

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de CD27, tal como un anticuerpo agonista de CD27. Los anticuerpos CD27 adecuados incluyen, por ejemplo, varlilumab.

El agente inmuno-oncológico puede serMGA271 (a B7H3) (WO11/109400).

La terapia de combinación pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, en una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una única forma de dosificación que tenga una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples formas de dosificación únicas para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membranas mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Como alternativa, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección intravenosa. La terapia combinada también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describe anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía o radioterapia). Cuando la terapia combinada comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado siempre que se logre un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento no farmacológico se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.

Como se usa en el presente documento, el término "célula" se refiere a una célula que está in vitro, ex vivo o in vivo. Una célula ex vivo puede ser parte de una muestra de tejido extirpada de un organismo tal como un mamífero. Una célula in vitro puede ser una célula en un cultivo celular. Una célula in vivo puede ser una célula que vive en un organismo tal como un mamífero.

Como se usa en el presente documento, el término "poner en contacto" se refiere a la unión de los restos indicados en un sistema in vitro o un sistema in vivo. Por ejemplo, "poner en contacto" la enzima DGKa y DGKZ con un compuesto de la invención incluye la administración de un compuesto de la presente invención a un individuo o paciente, tal como un ser humano, que tenga DGKa y DGKZ, tal como así como, por ejemplo, introducir un compuesto de la Fórmula (I) en una muestra que contiene una preparación celular o purificada que contenga enzima DGKa y DGKZ.

El término "inhibidor de DGKa y DGKZ" se refiere a un agente capaz de inhibir la actividad de diacilglicerol cinasa alfa y/o diacilglicerol cinasa zeta (DGKa y DGKZ) en células T que dan como resultado la estimulación de células T. El inhibidor de DGKa y DGKZ puede ser un inhibidor de DGKa y DGKZ reversible o irreversible. "Un inhibidor reversible de DGKa y DGKZ" es un compuesto que inhibe reversiblemente la actividad enzimática de DGKa y DGKZ ya sea en el sitio catalítico o en un sitio no catalítico y "un inhibidor irreversible de DGKa y DGKZ" es un compuesto que destruye irreversiblemente la actividad enzimática de DGKa y DGKZ al formar un enlace covalente con la enzima.

Los tipos de cánceres que pueden tratarse con el compuesto de la invención incluyen, entre otros, cánceres de cerebro, cánceres de piel, cánceres de vejiga, cánceres de ovario, cánceres de mama, cánceres gástricos, cánceres de páncreas, cánceres de próstata, cánceres de colon, cánceres de sangre, cánceres de pulmón y cánceres de huesos. Ejemplos de tales tipos de cáncer incluyen neuroblastoma, carcinoma de intestino como carcinoma de recto, carcinoma de colon, carcinoma de poliposis adenomatosa familiar y cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, carcinoma de esófago, carcinoma labial, carcinoma de laringe, carcinoma de hipofaringe, carcinoma de lengua, carcinoma de glándulas salivales, carcinoma gástrico carcinoma, adenocarcinoma, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma renal, carcinoma de parénquima renal, carcinoma de ovario, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de cuerpo uterino, carcinoma de endometrio, carcinoma de corion, carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, carcinoma de testículo, carcinoma de mama, carcinoma urinario, melanoma, tumores cerebrales tales como glioblastoma, astrocitoma, meningioma, meduloblastoma y tumores neuroectodérmicos periféricos, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, leucemia linfática aguda (LLA), leucemia linfática crónica (LLC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma de leucemia de células T adultas, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), carcinoma hepatocelular, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma bronquial, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de células no pequeñas carcinoma de pulmón, mieloma múltiple, basalioma, teratoma, retinoblastoma, melanoma coroideo, seminoma, rabdomiosarcoma, craneofaringioma, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Ewing y plasmocitoma.

Uno o más agentes farmacéuticos o métodos de tratamiento adicionales como, por ejemplo, agentes antivirales, quimioterapéuticos u otros agentes contra el cáncer, potenciadores inmunológicos, inmunosupresores, radiación, vacunas antitumorales y antivirales, terapia con citocinas (por ejemplo, IL2 y GM-CSF), y/o inhibidores de tirosina cinasa se pueden usar opcionalmente en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas a DGKa y DGKZ. Los agentes pueden combinarse con los presentes compuestos en una sola forma de dosificación, o los agentes pueden administrarse simultánea o secuencialmente como formas de dosificación separadas.

Los agentes quimioterapéuticos u otros agentes contra el cáncer adecuados incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes (incluidos, entre otros, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos) tal como mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (CYTOXAN®), ifosfamida, melfalán, clorambucil, pipobroman, trietilenmelamina, trietilentiofosforamina, busulfán, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida.

En el tratamiento del melanoma, los agentes adecuados para usar en combinación con los compuestos de la invención incluyen: dacarbazina (DTIC), opcionalmente, junto con otros fármacos de quimioterapia tales como carmustina (BCNU) y cisplatino; el "régimen de Dartmouth", que consiste en DTIC, BCNU, cisplatino y tamoxifeno; una combinación de cisplatino, vinblastina y DTIC, temozolomida o YERVOY™. Los compuestos de la invención también pueden combinarse con fármacos de inmunoterapia, incluyendo citocinas tales como interferón alfa, interleucina 2 y factor de necrosis tumoral (TNF) en el tratamiento del melanoma.

Los compuestos de la invención también se pueden usar en combinación con la terapia de vacunas en el tratamiento del melanoma. Las vacunas contra el melanoma son, en cierto modo, similares a las vacunas antivirus que se usan para prevenir enfermedades causadas por virus como la poliomielitis, el sarampión y las paperas. Se pueden inyectar células de melanoma debilitadas o partes de células de melanoma llamadas antígenos en un paciente para estimular el sistema inmunitario del cuerpo a fin de que destruya las células de melanoma.

Los melanomas que están confinados a los brazos o las piernas también se pueden tratar con una combinación de agentes que incluyen uno o más compuestos de la invención, usando una técnica de perfusión hipertérmica de miembros aislados. Este protocolo de tratamiento separa temporalmente la circulación de la extremidad afectada del resto del cuerpo e inyecta altas dosis de quimioterapia en la arteria que alimenta la extremidad, proporcionando así altas dosis al área del tumor sin exponer los órganos internos a estas dosis que de otro modo podrían causar efectos secundarios severos. Por lo general, el fluido se calienta a 38.9 °C a 40 °C. El melfalán es el fármaco más usado en este procedimiento de quimioterapia. Esto se puede administrar con otro agente llamado factor de necrosis tumoral (TNF).

Agentes quimioterapéuticos u otros anticancerosos adecuados incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (incluidos, entre otros, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina desaminasa) tales como metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina.

Los agentes quimioterapéuticos u otros agentes contra el cáncers adecuados incluyen además, por ejemplo, ciertos productos naturales y sus derivados (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfocinas y epipodofilotoxinas) tales como vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, ara-C, paclitaxel (Taxol), mitramicina, desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, interferones (especialmente IFN-a), etopósido y tenipósido.

Otros agentes citotóxicos incluyen navelbene, CPT-11, anastrozol, letazol, capecitabina, reloxafina y droloxafina.

También son adecuados agentes citotóxicos tales como epidofilotoxina; una enzima antineoplásica; un inhibidor de topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino; modificadores de la respuesta biológica; inhibidores del crecimiento; agentes terapéuticos antihormonales; leucovorina; tegafur; y factores de crecimiento hematopoyéticos.

Otros agentes contra el cáncer incluyen terapias de anticuerpos como trastuzumab (HERCEPTIN®), anticuerpos contra moléculas coestimuladoras como CTLA-4, 4-1BB y PD-1, o anticuerpos contra citocinas (IL-1O o TGF-p).

Otros agentes contra el cáncer también incluyen aquellos que bloquean la migración de células inmunitarias, tal como los antagonistas de los receptores de quimiocinas, incluidos CCR2 y CCR4.

Otros agentes contra el cáncer también incluyen aquellos que aumentan el sistema inmunitario, tal como los adyuvantes o la transferencia de células T adoptivas.

Las vacunas contra el cáncer incluyen células dendríticas, péptidos sintéticos, vacunas de ADN y virus recombinantes.

La composición farmacéutica de la invención puede incluir opcionalmente al menos un inhibidor de la transducción de señales (STI). Un "inhibidor de la transducción de señales" es un agente que inhibe selectivamente uno o más pasos vitales en las vías de señalización, en la función normal de las células cancerosas, lo que conduce a la apoptosis. Las STI adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (i) inhibidores de cinasa bcr/abl tales como, por ejemplo, STI 571 (GLEEVEC®); (ii) inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) tales como, por ejemplo, inhibidores de cinasa (IRESSA®, SSI-774) y anticuerpos (Imclone: C225 [Goldstein et al., Clin. Cáncer Res., 1:1311-1318 (1995)] y Abgenix: ABX-EGF); (iii) inhibidores del receptor her-2/neu tales como inhibidores de farnesil transferasa (f T i) tales como, por ejemplo, L-744.832 (Kohl et al., Nat. Med., 1(8):792-797 (1995)); (iv) inhibidores de las cinasas de la familia Akt o de la vía Akt, tal como, por ejemplo, rapamicina (véase, por ejemplo, Sekulic et al., Cáncer Res., 60:3504-3513 (2000)); (v) inhibidores de la cinasa del ciclo celular como, por ejemplo, flavopiridol y UCN-O1 (véase, por ejemplo, Sausville, Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents, 3:47-56 (2003)); y (vi) inhibidores de fosfatidil inositol cinasa tales como, por ejemplo, LY294002 (ver, por ejemplo, Vlahos et al., J. Biol. hem., 269:5241-5248 (1994)). Como alternativa, al menos un STI y al menos un compuesto de la invención pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Al menos un compuesto de la invención y al menos un STI pueden administrarse al paciente de forma concurrente o secuencial. En otras palabras, al menos un compuesto de la invención puede administrarse primero, al menos un STI puede administrarse primero, o al menos un compuesto de la invención y al menos un STI pueden administrarse al mismo tiempo. Además, cuando se usa más de un compuesto de la invención y/o STI, los compuestos pueden administrarse en cualquier orden.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una infección viral crónica en un paciente que comprende al menos un compuesto de la invención, opcionalmente al menos un fármaco quimioterapéutico y, opcionalmente, al menos un agente antiviral, en un portador farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona un compuesto de la invención para su uso en un método para tratar una infección viral crónica en un paciente mediante la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica anterior.

Al menos un compuesto de la invención y al menos un agente quimioterapéutico puede administrarse al paciente al mismo tiempo o secuencialmente. En otras palabras, al menos un compuesto de la invención puede administrarse primero, al menos un agente quimioterapéutico puede administrarse primero, o al menos un compuesto de la invención y al menos un STI pueden administrarse al mismo tiempo. Además, cuando se usa más de un compuesto de la invención y/o agente quimioterapéutico, los compuestos pueden administrarse en cualquier orden. De manera similar, cualquier agente antiviral o STI también puede administrarse en cualquier punto en comparación con la administración del compuesto de la invención.

Las infecciones virales crónicas que pueden tratarse con el presente tratamiento combinado incluyen, entre otras, enfermedades causadas por: virus de la hepatitis C (HCV), virus del papiloma humano (HPV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes simple (HSV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la varicela zóster, virus de coxsackie, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En particular, las infecciones parasitarias (por ejemplo, malaria) también pueden tratarse mediante los métodos anteriores en los que se añaden opcionalmente compuestos que se sabe que tratan las afecciones parasitarias en lugar de los agentes antivirales.

Los agentes antivirales adecuados contemplados para usarse en combinación con el compuesto de la invención pueden comprender inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos y nucleótidos (NRTIs), inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos (NNRTIs), inhibidores de proteasa y otros fármacos antivirales.

Los ejemplos de NRTIs adecuados incluyen zidovudina (AZT); didanosina (ddl); zalcitabina (ddC); estavudina (d4T); lamivudina (3TC); abacavir (1592U89); adefovir dipivoxil [bis(POM)-PMEA]; lobucavir; BCH-I0652; emitricitabina [(-)-FTC]; beta-L-FD4 (también llamado beta-L-D4C y denominado beta-L-2',3'-didesoxi-5-fluoro-citideno); DAPD, ((-)-beta-D-2,6-diamino-purina dioxolano); y lodenosina (FddA). Los NNRTIs adecuados típicos incluyen nevirapina (BI-RG-587); delaviradina (BHAP, U-90152); efavirenz (DMP-266); PNU-142721; AG-1549; MKC-442 (1-(etoxi-metil)-5-(1-metiletil)-6-(fenilmetil)-(2,4(1H,3H)-pirimidindiona) y (+)-calanolida A (NSC-675451) y B. Los inhibidores de proteasa adecuados típicos incluyen saquinavir (Ro 31-8959); ritonavir (ABT-538); indinavir (MK-639); nelfnavir (AG-1343); amprenavir (141W94); lasinavir; DMP-450; BMS-2322623, ABT-378 y AG-1549. Otros agentes antivirales incluyen hidroxiurea, ribavirina, IL-2, IL-12, pentafuside y Yissum Project No.11607.

Los kits farmacéuticos útiles, por ejemplo, en el tratamiento o prevención de enfermedades o trastornos asociados con DGKa y DGKZ, y otras enfermedades mencionadas en este documento pueden incluir uno o más envases que contienen una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención. Los kits pueden incluir además, si se desea, uno o más de varios componentes de kits farmacéuticos convencionales, tal como, por ejemplo, recipientes con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, recipientes adicionales, tal como será fácilmente evidente para los expertos en la técnica. También se pueden incluir en el kit instrucciones, ya sea como insertos o etiquetas, que indiquen las cantidades de los componentes que se administrarán, las pautas para la administración y/o las pautas para mezclar los componentes.

La terapia de combinación pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, en una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una única forma de dosificación que tenga una proporción fija de cada agente terapéutico o en varias formas de dosificación únicas para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membranas mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Como alternativa, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección intravenosa. La terapia de combinación también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describe anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía o tratamiento con radiación). Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico se puede realizar en cualquier momento adecuado siempre que se logre un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento no farmacológico se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos de la invención, formulados junto con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos descritos anteriormente.

Los compuestos de esta invención se pueden administrar para cualquiera de los usos descritos en el presente documento por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, tal como tabletas, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación sostenida o de liberación controlada), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones (incluidas nanosuspensiones, microsuspensiones, dispersiones atomizadas), jarabes y emulsiones; sublingualmente; bucalmente; por vía parenteral, tal como por inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal, o técnicas de infusión (por ejemplo, tal como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); por vía nasal, incluyendo la administración a las membranas nasales, por ejemplo mediante un aerosol para inhalación; tópicamente, tal como en forma de crema o ungüento; o por vía rectal, tal como en forma de supositorios. Pueden administrarse solos, pero generalmente se administrarán con un portador farmacéutico seleccionado sobre la base de la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.

La frase "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, auxiliar de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o zinc, o ácido estérico), o material de encapsulación de solvente, implicado en transportar o transportar el compuesto en cuestión desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Cada proteína debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación, incluidos, por ejemplo, adyuvantes, excipientes o vehículos, tal como diluyentes, agentes conservadores, rellenos, agentes reguladores de flujo, agentes desintegrantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes de dosificación, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y formas de dosificación; y no perjudicial para el paciente.

El término "composición farmacéutica" significa una composición que comprende un compuesto de la invención en combinación con al menos un portador farmacéuticamente aceptable adicional.

Los portadores farmacéuticamente aceptables se formulan de acuerdo con una serie de factores dentro del alcance de los expertos en la materia. Estos incluyen, sin limitación: el tipo y la naturaleza del agente activo que se formula; el sujeto al que se va a administrar la composición que contiene el agente; la ruta prevista de administración de la composición; y la indicación terapéutica a la que se dirija. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen medios líquidos acuosos y no acuosos, así como una variedad de formas de dosificación sólidas y semisólidas. Estos portadores pueden incluir una serie de diferentes ingredientes y aditivos además del agente activo, los ingredientes adicionales se incluyen en la formulación por una variedad de razones, por ejemplo, estabilización del agente activo, aglutinantes, etc., bien conocidos por los de habilidad ordinaria en el arte. Las descripciones de portadores farmacéuticamente aceptables adecuados y los factores implicados en su selección se encuentran en una variedad de fuentes fácilmente disponibles como, por ejemplo, Allen, L. V. Jr. et al. Remington: The Science and Practice o f Pharmacy (2 volúmenes), 22.a edición (2012), Pharmaceutical Press.

El régimen de dosificación para los compuestos de la presente invención, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, edad, sexo, salud, condición médica y peso del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado.

A modo de guía general, la dosis oral diaria de cada ingrediente activo, cuando se usa para los efectos indicados, oscilará entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 5000 mg por día, preferiblemente entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 1000 mg por día, y más preferiblemente entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg por día. Por vía intravenosa, las dosis más preferidas oscilarán entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 10 mg/kg/minuto durante una infusión a velocidad constante. Los compuestos de esta invención pueden administrarse en una sola dosis diaria, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día.

Los compuestos se administran normalmente mezclados con diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticos adecuados (denominados colectivamente en el presente documento como portadores farmacéuticos) adecuadamente seleccionados con respecto a la forma de administración prevista, por ejemplo, tabletas orales, cápsulas, elixires y jarabes, y consistentes con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Las formas de dosificación (composiciones farmacéuticas) adecuadas para la administración pueden contener desde alrededor de 1 miligramo hasta alrededor de 2000 miligramos de ingrediente activo por unidad de dosificación. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0.1-95% en peso con respecto al peso total de la composición.

Una cápsula típica para administración oral contiene al menos uno de los compuestos de la presente invención (250 mg), lactosa (75 mg) y estearato de magnesio (15 mg). La mezcla se pasa a través de un tamiz de malla 60 y se envasa en una cápsula de gelatina No. L.

Una preparación inyectable típica se produce colocando asépticamente al menos uno de los compuestos de la presente invención (250 mg) en un vial, liofilizando y sellando asépticamente. Para su uso, el contenido del vial se mezcla con 2 mL de solución salina fisiológica, para producir una preparación inyectable.

La presente invención incluye dentro de su alcance composiciones farmacéuticas que comprenden, como ingrediente activo, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los compuestos de la presente invención, solo o en combinación con un portador farmacéutico. Opcionalmente, los compuestos de la presente invención se pueden usar solos, en combinación con otros compuestos de la invención, o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente contra el cáncer u otro material farmacéuticamente activo.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los de destreza en la técnica.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica para un paciente, una composición y un modo de administración en particular, sin ser tóxico para el paciente.

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción o metabolismo del compuesto particular que se emplee, la velocidad y el grado de absorción, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, el sexo, el peso, el estado de salud general y antecedentes médicos historia del paciente que está siendo tratado, y como factores bien conocidos en las artes médicas.

Un médico o veterinario que tenga una experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto.

En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será la cantidad del compuesto que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. La dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Generalmente, las dosis orales, intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas de los compuestos de esta invención para un paciente oscilarán entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por día.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. En ciertos aspectos de la invención, la dosificación es una administración por día.

Si bien es posible que un compuesto de la presente invención se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación (composición) farmacéutica.

Los otros agentes terapéuticos anteriores, cuando se emplean en combinación con los compuestos de la presente invención, se pueden usar, por ejemplo, en las cantidades indicadas en Physicians' Desk Reference (PDR) o de acuerdo con lo que determine un experto en la materia. En los métodos de la presente invención, tales otros agentes terapéuticos pueden administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de los compuestos de la invención.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN

Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse mediante muchos métodos disponibles para los expertos en la técnica de la química orgánica. Los esquemas sintéticos generales para preparar los compuestos de la presente invención se describen a continuación. Estos esquemas de reacción son ilustrativos y no pretenden limitar las posibles técnicas que un experto en la materia puede usar para preparar los compuestos descritos en el presente documento. Los diferentes métodos para preparar los compuestos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Los ejemplos de compuestos de la presente invención preparados mediante los métodos descritos en los esquemas generales se dan en la sección de Ejemplos que se expone a continuación. La preparación de ejemplos homoquirales puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los compuestos homoquirales se pueden preparar por separación de productos racémicos o diastereómeros por HPLC preparativa de fase quiral. Como alternativa, los compuestos de ejemplo pueden prepararse mediante métodos conocidos por dar productos enantioméricamente o diastereoisómeros enriquecidos.

Las reacciones y técnicas descritas en esta sección se llevan a cabo en solventes apropiados a los reactivos y materiales empleados y son adecuados para las transformaciones que se efectúan. Además, en la descripción de los métodos de síntesis que se da a continuación, debe entenderse que todas las condiciones de reacción propuestas, incluyendo la elección del solvente, la atmósfera de reacción, la temperatura de reacción, la duración del experimento y los procedimientos de elaboración, se eligen como condiciones estándar para esa reacción, que debe ser fácilmente reconocida por un experto en la técnica. Se entiende por un experto en la técnica de la síntesis orgánica que la funcionalidad presente en varias porciones de la molécula debe ser compatible con los reactivos y reacciones propuestos. Tales restricciones a los sustituyentes que son compatibles con las condiciones de reacción serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica, y se requieren alternativas cuando están presentes sustituyentes incompatibles. Esto a veces requerirá un juicio para modificar el orden de los pasos sintéticos o seleccionar un esquema de proceso particular sobre otro para obtener un compuesto de la invención. También se reconocerá que otra consideración importante en la planificación de cualquier ruta sintética en este campo es la elección juiciosa de un grupo protector usado para la protección de grupos funcionales reactivos presentes en los compuestos descritos en esta invención. Un relato autorizado que describe las muchas alternativas al profesional capacitado es Wuts y Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Cuarta edición, Wiley and Sons (2007).

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran las modalidades particulares y preferidas de la presente invención. Las abreviaturas y los símbolos químicos, así como las abreviaturas y los símbolos científicos, tienen sus significados usuales y habituales a menos que se especifique lo contrario. Las abreviaturas adicionales empleadas en los Ejemplos y en otras partes de esta solicitud se definen anteriormente. Los intermediarios comunes son generalmente útiles para la preparación de más de un Ejemplo y se identifican secuencialmente (por ejemplo, Intermediario 1, Intermediario 2, etc.) y se abrevian como Int. 1 o I1, Int. 2 o I2, etc. Los compuestos de los Ejemplos se identifican por el ejemplo y el paso en el que se prepararon (por ejemplo, "1-A" denota el Ejemplo 1, paso A), o por el ejemplo solo donde el compuesto es el título compuesto del ejemplo (por ejemplo, "1" indica el compuesto del título del Ejemplo 1). En algunos casos, se describen preparaciones alternativas de intermediarios o ejemplos. Con frecuencia, los químicos expertos en el arte de la síntesis pueden idear preparaciones alternativas que pueden ser deseables en función de una o más consideraciones, tal como un tiempo de reacción más corto, materiales de partida menos costosos, facilidad de operación o aislamiento, rendimiento mejorado, susceptible de catálisis, evitación de reactivos tóxicos, accesibilidad de instrumentación especializada y disminución del número de pasos lineales, etc. La intención de describir preparaciones alternativas es permitir aún más la preparación de los ejemplos de esta invención. En algunos casos, algunos grupos funcionales en los ejemplos y reivindicaciones descritos pueden reemplazarse por reemplazos bioisostéricos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el reemplazo de un grupo ácido carboxílico con un tetrazol o un resto fosfato. Los datos de RMN de 1H recopilados en sulfóxido de dimetilo deuterado usaron supresión de agua en el procesamiento de datos. Los espectros informados no están corregidos por los efectos de la supresión de agua. Los protones adyacentes a la frecuencia de supresión de agua de 3.35 ppm exhiben una intensidad de señal disminuida.

ABREVIATURAS

Ac acetilo

anhid. anhídrido

ac. acuoso

Boc ferc-butoxicarbonilo

BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris-(dimetilamino)-fosfonio

Bu butílico

CDI carbonildiimidazol

DCM diclorometano

DEA dietilamina

DIEA o DIPEA diisopropiletilamina

DMF dimetilformamida

DMSO sulfóxido de dimetilo

dppf 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno

Et etilo

EtOAc acetato de etilo

EtOH etanol

h, horas o hrs hora(s)

HCl ácido clorhídrico

HPLC cromatografía líquida de alta presión

LC cromatografía líquida

LCMS cromatografía líquida - espectrometría de masas

M molar

mM milimolar

Me metilo

MeOH metanol

Mesil-Cl cloruro de metansulfonilo

MHz megahercios

mins minuto(s)

M+1 (M+H)+

MS espectrometría de masas

n o N normal

NH4OAc acetato de amonio

nM nanomolar

NMP W-metilpirrolidinona

Pd2(dba)3 tris-(dibencilidenacetona)dipaladio

pet éter éter de petróleo

Ph fenilo

POCl3 oxicloruro de fósforo

rt o Ret t. tiempo de retención

sat. saturado

TEA trietilamina

TFA ácido trifluoroacético

THF tetrahidrofurano

INTERMEDIARIO 1

N-(4-bromo-2-cianofenil)-2,2,2-trifluoroacetamida

A una solución de 2-amino-5-bromobenzonitrilo (10 g, 50.8 mmol) en THF (200 mL) a 0 °C se le añadieron trietilamina (10.61 mL, 76 mmol) y anhídrido 2,2,2-trifluoroacético (7.82 mL, 55.8 mmol) por goteo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se inactivó con agua helada. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se lavó con agua, salmuera y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se evaporó a presión reducida para proporcionar el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando una columna ultrarrápida de 24 g y EtOAc al 20% en éter de petróleo. Las fracciones se concentraron a presión reducida para proporcionar N-(4-bromo-2-cianofenil)-2,2,2-trifluoroacetamida purificada (8 g, 51.1% de rendimiento). LCMS: m/z = 292.9 (M+H)+; rt 1.19 min. (Método de LCMS: Columna: Aquity UPLC BEH C18 (3.0 x 50 mm) 1.7 pm Fase móvil A: NH4OAc 10 mM: ACN (95:5) Fase móvil B: NH4OAc 10 mM: Acetonitrilo (5:95) Descripción: Método: %B: 0 min-20: 2 min-100: 2.3 min-100, Flujo: 0.7 ml/min, Detección: UV a 220 nm). RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 (ppm) 8.30-8.28 (m, 2H), 7.85-7.80 (m, 2H).

INTERMEDIARIO 2

N-(4-bromo-2-cianofenil)-2,2,2-trifluoro-N-metilacetamida

A una solución de N-(4-bromo-2-cianofenil)-2,2,2-trifluoroacetamida (8 g, 27.3 mmol) en DMF (25 mL) a temperatura ambiente se le añadió carbonato de potasio (9.43 g, 68.2 mmol), seguido de yoduro de metilo (8.54 mL, 136 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla de reacción se inactivó con agua y se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 mL). La capa orgánica combinada se lavó con agua, salmuera y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se evaporó a presión reducida para proporcionar N-(4-bromo-2-cianofenil)-2,2,2-trifluoro-N-metilacetamida (6 g, 71.6% de rendimiento). LCMS: m/z = 213.0 (M-COCF3+H)+; rt 1.57 min. (Columna: Aquity UPLC BEH C18 (3.0 x 50 mm) 1.7 pm fase A: 10 mM NH4OAc: ACN (95:5) M. fase B:10 mM NH4OAc: ACN (5:95) Descripción: Método: %B: 0 min-20:2 min-100:2.3 min-100, Flujo: 0.7 mL/min.

INTERMEDIARIO 3

5-bromo-2-(metilamino)benzamida

A una solución de N-(4-bromo-2-cianofenil)-2,2,2-trifluoro-N-metilacetamida (8 g, 26.1 mmol) en DMSO (80 mL)/agua (40 mL) a 0 °C se le añadió por goteo K2CO3 (7.2 g, 52.1 mmol), seguido de peróxido de hidrógeno (37%, 10.73 mL, 105 mmol) durante un período de 10 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se inactivó con agua helada. Los sólidos se separaron por filtración y se lavaron con agua y se secaron a presión reducida para dar 5-bromo-2-(metilamino)benzamida (4 g, 59.0% de rendimiento). LCMS: m/z = 229.1 (M+H)+; rt 1.14 min. Fase móvil A: NH4OAc:ACN 10 mM (95:5) Fase móvil B: NH4OAc:ACN 10 mM (5:95) Método: %B: 0 min-20%:1.1 min -90%:1.7 min-90% Nombre de columna: Aquity UPLC BEH 18 (3.0 x 50 mm) 1.7 pm, flujo: 0.7 mL/min.

INTERMEDIARIO 4

6-bromo-1-metilquinazolin-2,4(1H,3H)-diona

A una solución de 5-bromo-2-(metilamino)benzamida (4 g, 17.46 mmol) en N,N-dimetilformamida (40 mL) se le añadió NaH (1.379 g, 34.9 mmol, 60% p/p) a 0° C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió una solución de CDI (4.25 g, 26.2 mmol) en dimetilformamida (5 mL) y la mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 2 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. El producto sólido se separó por filtración, se lavó con agua y se secó a presión reducida para proporcionar 6-bromo-1-metilquinazolin-2,4(1H,3H)-diona (3 g, 67.4% de rendimiento). LCMS: m/z = 255.0 (M+H); tiempo de retención 0.91 min. (Columna: Aquity Up Lc BEH C18 (3.0 x 50 mm) 1.7 pm M. fase A: 10 mM NH4OAc:ACN (95:5) M. fase B: 10 mM NH4OAc:ACN (5:95) Método: %B: 0 min-20:2 min-100:2.3 min-100, Flujo: 0.7 mL/min). RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): 8 (ppm) 11.70 (br s, 1H), 8.04 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.91 (dd, J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.40 (d, J=9.0 Hz, 1H), 3.43 (s, 3H).

INTERMEDIARIO 5

6-bromo-4-cloro-1-metilquinazolin-2(1H)-ona

A una suspensión de 6-bromo-1-metilquinazolin-2,4(1H,3H)-diona (1 g, 3.92 mmol) en tolueno seco (30 mL) se le añadieron DIPEA (1.712 mL, 9.80 mmol) y POCh (1.827 mL, 19.60 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 110 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el solvente se eliminó a presión reducida para proporcionar 6-bromo-4-cloro-1-metilquinazolin-2(1H)-ona (1 g, 41.0% de rendimiento). LCMS: m/z = 273.0 (M+H)+; rt 1.71 min. (Método LCMS: Columna-Kinetex XB-C18 (75 X 3 mm-2.6 pm) M. fase A: 10 mM NH4COOH en agua:ACN (98:2) M.fase B: 10 mM NH4COOH en agua:ACN (2 :98).

INTERMEDIARIO 6

(2R,5S)-4-(6-bromo-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-4-il)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada de (2R,5S)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo (CAS# 2165403-17-6) (1 g, 3.48 mmol) en acetonitrilo (20 mL) se le añadió DIPEA (6.08 mL, 34.8 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. A la mezcla de reacción se le añadió 6-bromo-4-cloro-1-metilquinazolin-2(1H)-ona (0.952 g, 3.48 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 6 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida para obtener el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (EtOAc al 60-70%/éter de petróleo; columna de 40 g) para producir (2R,5S)-4-(6-bromo-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-4-il)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo (0.8 g, 33.6%). LCMS: m/z = 467.2 (M+H); rt 1.74 min. Método LCMS: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18 (2.1 x 50 mm) 1.7 pm, fase móvil A: acetato amónico 10 mM:acetonitrilo (95:5); Fase móvil B: acetato de amonio 10 mM:acetonitrilo (5:95), Gradiente = 20% B durante 1.1 minutos, luego un mantenimiento de 2.2 minutos al 100% B; Temperatura: 50 °C; Velocidad de flujo: 0.7 mL/min; Detección: UV a 110 nm).

INTERMEDIARIO 7

(2R,5S)-4-(6-ciano-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-4-il)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada de (2R,5S)-4-(6-bromo-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-4-il)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo (0.3 g, 0.645 mmol) en NMP (2 mL) se le añadieron cianuro de zinc (0.151 g, 1.289 mmol) y zinc (0.042 g, 0.645 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó durante 5 min, seguido de la adición de Pd2(dba)3 (0.059 g, 0.064 mmol), dppf (0.071 g, 0.129 mmol) y se calentó a 90 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo y se filtró a través de una capa de Celite. El filtrado se lavó con agua, salmuera y la capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó a presión reducida para obtener el compuesto bruto. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (70-80% EtOAc/éter de petróleo; columna de 24 g) para producir el (2R,5S)-4-(6-ciano-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-4-il)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo (0.23 g, 63.3% de rendimiento) LCMS: m/z = 412.3 (M+H)+; temperatura ambiente 0.65 min. Método LCMS: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18 (2.1 x 50 mm) 1.7 pm, fase móvil A: acetato amónico 10 mM:acetonitrilo (95:5); Fase móvil B: acetato de amonio 10 mM:acetonitrilo (5:95), Gradiente = 20% B durante 1.1 minutos, luego un mantenimiento de 2.2 minutos al 100% B; Temperatura: 50 °C; Velocidad de flujo: 0.7 mL/min; Detección: UV a 110 nm).

INTERMEDIARIO 8

4-((2S,5R)-5-etil-2-metilpiperazin-1-il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-6-carbonitrilo

A una solución agitada de (2R,5S)-4-(6-ciano-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-4-il)-2-etil-5-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo (0.1 g, 0.243 mmol) en DCM seco (5 mL) se le añadió TFA (0.281 mL, 3.65 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 3 h. El solvente se eliminó a presión reducida para producir 4-((2S,5R)-5-etil-2-metilpiperazin-1-il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-6-carbonitrilo, TFA (0.1 g, 0.202 mmol, 83% de rendimiento). LCMS: m/z = 312.2 (M+H)+; ta 0.68 min. Método LCMS: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18 (2.1 x 50 mm) 1.7 pm, fase móvil A: acetato amónico 10 mM:acetonitrilo (95:5); Fase móvil B: acetato de amonio 10 mM: acetonitrilo (5:95), Gradiente = 20% B durante 1.1 minutos, luego una retención de 2.2 minutos al 100% B; Temperatura: 50 °C; Velocidad de flujo: 0.7 mL/min; Detección: UV a 110 nm).

EJEMPLOS 1 Y 2

4-((2S,5R)-5-etil-2-metil-4-(1-(4-(trifluorometil)fenil)etil)piperazin-1-il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-6-carbonitrilo

A una solución de 4-((2S,5R)-5-etil-2-metilpiperazin-1-il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinazolin-6-carbonitrilo, TFA (0.2 g, 0.47 mmol) en acetonitrilo (5 mL) a temperatura ambiente se le añadió DIPEA (0.246 mL, 1.410 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 15 min. A continuación, se añadieron a la mezcla de reacción 1-(1 -cloroetil)-4-(trifluorometil)benceno (0.196 g, 0.940 mmol) (CAS-85289-90-3) y yoduro de sodio (0.07 g, 0.47 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el solvente se eliminó a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida para producir el producto crudo como una mezcla de diastereoisómeros, que se purificó por HPLC preparativa [Método HPLC: Columna: EVO C18 (20 X 250 mm), 5 pm Fase Móvil A - bicarbonato de amonio 10 mM B: ACN/MeOH Flujo: 20 mL, para producir el Pico 1 (Ejemplo 1) y el Pico 2 (Ejemplo 2).

La fracción 1 (Pico 1) se concentró a presión reducida y el residuo se diluyó con (EtOH/H2O, 1:5) y se liofilizó para producir el Ejemplo 1 (6 mg, 2.6% de rendimiento); LCMS: m/z = 484.3 (M+H)+; ta 2.249 min; (Método LCMS: Columna: XBridge B<e>H XP C18 (50 x 2.1 mm), 2.5 pm; Fase móvil A: 95% agua: 5% acetonitrilo; 10 mM acetato de amonio; Fase móvil B: 5% Agua: 95% acetonitrilo; Acetato de amonio 10 mM; Flujo: 1.1 mL/min; Temp: 50 °C; Tiempo (min): 0-3;% B: 0-100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 88.16 (d, J=1.7 Hz, 1H), 8.04 (dd, J=8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.76-7.68 (m, 2H), 7.62 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.8Hz, 1H), 4.77-4.66 (m, 1H), 3.97-3.88 (m, 1H), 3.88-3.79 (m, 1H), 3.64-3.57 (m, 1H), 3.45 (s, 3H), 2.91-2.84 (m, 1H), 2.82-2.74 (m, 1H), 2.37-2.32 (m, 1H), 1.44 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.35-1.24 (m, 5H), 0.48 (t, J=7.5 Hz, 3H).

La fracción 2 (Pico 2) se concentró a presión reducida y el residuo se diluyó con (EtOH/H2O:1:5) y se liofilizó para producir el Ejemplo 2 (0.07 g, 0.144 mmol, 10.27% de rendimiento); LCMS: m/z = 484.3 (M+H); ta 2.27 min; (Método LCMS: Columna: XBridge BEH XP C18 (50 x 2.1 mm), 2.5 pm; Fase móvil A: 95% agua: 5% acetonitrilo; 10 mM acetato de amonio; Fase móvil B: 5% agua: 95% acetonitrilo; 10 acetato de amonio mM, flujo: 1.1 mL/min, temperatura: 50 °C, tiempo (min): 0-3,% B: 0-100 RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 8.15 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 8.05 (dd, J=8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.76-7.66 (m, 2H), 7.66-7.57 (m, 2H), 7.54 (d, J=9.0 Hz.1H), 4.57-4.47 (m, 1H), 4.16 (br d, J=13.4 Hz, 1H), 3.79-3.67 (m, 2H), 3.45 (s, 3H), 3.11-3.02 (m, 1H), 2.74-2.67 (m, 1H), 2.12 (dd, J=12.0, 2.0 Hz, 1H), 1.54-1.41 (m, 2H), 1.26 (dd, J=6.4, 3.4 Hz, 6H), 0.78 (t, J=7.5 Hz, 3H).

ENSAYOS BIOLÓGICOS

Las propiedades farmacológicas de los compuestos de esta invención pueden confirmarse mediante una serie de ensayos biológicos. Los ensayos biológicos ejemplificados, que siguen, se han llevado a cabo con compuestos de la invención.

Ensayo 1: Ensayos de inhibición de DGK in vitro - Método A

Las reacciones de DGKa y DGKZ se llevaron a cabo usando liposomas extruidos (ensayos DGKa y DGKZ LIPGLO) o sustrato de micela lípido/detergente (ensayos DGKa y DGKZ). Las reacciones se llevaron a cabo en MOPS 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, MgCh10 mM, CaCh 1 pM y DTT 1 mM (amortiguador de ensayo). Las reacciones que usaban un sustrato de micela detergente/lípido también contenían octil B-D-glucopiranósido 50 mM. Las concentraciones de sustrato lipídico fueron PS 11 mM y DAG 1 mM para las reacciones de detergente/micela lipídica. Las concentraciones de sustrato lipídico fueron PS 2 mM, DAG 0.25 mM y PC 2.75 mM para las reacciones de liposomas extruidos. Las reacciones se llevaron a cabo en ATP 150 pM. Las concentraciones de enzimas para DGKa y DGKZ fueron de 5 nM.

Los estudios de inhibición de compuestos se llevaron a cabo de la siguiente manera: se transfirieron gotas de 50 nL de cada compuesto de prueba (concentración superior 10 mM con 11 puntos, series de dilución de 3 veces para cada compuesto) solubilizados en DMSO a pocillos de una placa blanca de 1536 pocillos (Corning 3725). Se preparó una solución de enzima/sustrato de 5 mL a una concentración de reacción final de 2x combinando 2.5 mL de solución de enzima 4x (20 nM DGKa o DGKZ (preparada como se describe a continuación) en amortiguador de ensayo) y 2.5 mL de solución de micelas lipídicas de liposoma 4x o detergente/detergente 4x (composiciones descritas a continuación) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se añadió 1 pL de solución de enzima/sustrato 2x a los pocilios que contenían el compuesto de prueba y se iniciaron las reacciones con la adición de 1 pL de ATP 300 uM. Se permitió que las reacciones prosiguieran durante 1 h, después de lo cual se añadieron 2 pL de reactivo Glo (Promega V9101) y se incubaron durante 40 minutos. A continuación, se agregaron 4 pL de reactivo de detección de cinasa y se incubó durante 30 minutos. La luminiscencia se registró usando un lector de microplacas EnVision. El porcentaje de inhibición se calculó a partir de la conversión de ATP generada por reacciones sin control enzimático para una inhibición del 100% y reacciones con vehículo solo para una inhibición del 0%. Los compuestos se evaluaron a 11 concentraciones para determinar IC50.

Preparación de micelas de detergente/lípidos 4x

La micela de detergente/lípido se preparó combinando 15 g de fosfatidilserina (Avanti 840035P) y 1 g de diacilglicerol (8008110) y disolviendo en 150 mL de cloroformo en un matraz de fondo redondo de 2 litros. El cloroformo se eliminó a alto vacío mediante evaporación rotatoria. El aceite pegajoso e incoloro resultante se resuspendió en 400 mL de MOPS 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, NaF 20 mM, MgCh 10 mM, CaCh 1 pM, DTT 1 mM y octilglucósido 200 mM mediante mezcla vigorosa. La solución de lípido/detergente se dividió en alícuotas de 5 mL y se almacenó a -80 °C.

Preparación de liposomas 4x

La composición de lípidos era 5% mol de DAG (Avanti 8008110), 40% mol de PS (Avanti 840035P) y 55% mol de PC (Avanti 850457) con una concentración total de lípidos de 15.2 mg/mL para la solución de liposomas 4x. El PC, DAG y PS se disolvieron en cloroformo, se combinaron y se secaron al vacío hasta formar una película delgada. Los lípidos se hidrataron a 20 mM en MOPS 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, MgCh 5 mM y se congelaron y descongelaron cinco veces. La suspensión lipídica se extruyó once veces a través de un filtro de policarbonato de 100 nm. Se llevó a cabo una dispersión dinámica de la luz para confirmar el tamaño de los liposomas (radio de 50-60 nm). La preparación de liposomas se almacenó a 4 °C durante cuatro semanas.

Expresión de baculovirus de DGKa y DGKZ humana

Se generaron muestras de baculovirus DGK-alpha-TVMV-His-pFBgate humano y DGK-zeta-variante de transcrito-2-TVMV-His-pFBgate humano usando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN usado para la expresión de DGK-alfa y DGK-zeta tiene SEC ID NOs: 1 y 3, respectivamente. La amplificación de baculovirus se logró usando células Sf9 infectadas en proporciones de virus/célula de 1:1500 y se cultivaron durante 65 horas a 27 °C después de la transfección.

El escalado de expresión para cada proteína se llevó a cabo en el Cellbag 50L WAVE-Bioreactor System 20/50 de GE Healthcare Bioscience. Se infectaron 12 L de 2 * 106 células/mL de células Sf9 (Expression System, Davis, CA) cultivadas en medio de insecto ESF921 (Expression System) con stock de virus en proporciones de virus/célula de 1:200, y se cultivaron durante 66-68 horas a 27 °C post-infección. El cultivo celular infectado se cosechó por centrifugación a 2000 rpm durante 20 min 4 °C en una centrífuga SORVALL® RC12BP. Los sedimentos celulares se almacenaron a -70 °C hasta su purificación. ;;Purificación de DGK-alfa y DGK-zeta humana ;;Se purificaron DGKa y DGKZ humanas de longitud completa, cada una expresada con una secuencia de etiqueta Hexa-His C-terminal escindible con TVMV (SEC ID NOs: 2 y 4, respectivamente) y producidas como se describió anteriormente, a partir de pasta de células de insecto infectadas con baculovirus Sf9. Las células se lisaron usando el método de cavitación de nitrógeno con una bomba de nitrógeno (Parr Instruments), y los lisados se clarificaron por centrifugación. Los lisados clarificados se purificaron hasta una homogeneidad de ~90% mediante tres pasos sucesivos de cromatografía en columna en un sistema ÁKTA Purifier Plus. La cromatografía en columna de tres pasos incluyó captura de resina de afinidad de níquel (es decir, crudo HisTrap FF, GE Healthcare), seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (es decir, HiLoad 26/600 Superdex 200 prep grade, GE Healthcare para DGK-alpha y HiPrep 26/600 Sephacryl S 300_HR, GE Healthcare para DGK-zeta). El tercer paso fue la cromatografía de intercambio iónico y fue diferente para las dos isoformas. DGKa se pulió mediante cromatografía de intercambio aniónico Q-Sepharose (GE Healthcare). La DGKZ se pulió mediante cromatografía de intercambio catiónico SP Sepharose (GE Healthcare). Las proteínas se administraron en concentraciones de >2 mg/mL. Los amortiguadores de formulación fueron idénticos para ambas proteínas: Hepes 50 mM, pH 7.2, NaCl 500 mM, glicerol al 10% v/v, TCEP 1 mM y EDTA 0.5 mM. ;;Ensayo 2: Ensayos de inhibición de DGK in vitro - Método B ;;Las reacciones de DGKa y DGKZ se llevaron a cabo usando liposomas extruidos (ensayos DGKa y DGKZ LIPGLO) o sustrato de micela lípido/detergente (ensayos DGKa y DGKZ). Las reacciones se llevaron a cabo en MOPS 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, MgCh 10 mM, CaCl2 1 pM y d Tt 1 mM (amortiguador de ensayo). Las reacciones que usaban un sustrato de micela detergente/lípido también contenían octil B-D-glucopiranósido 50 mM. Las concentraciones de sustrato lipídico fueron PS 11 mM y DAG 1 mM para las reacciones de detergente/micela lipídica. Las concentraciones de sustrato lipídico fueron PS 2 mM, DAG 0.25 mM y PC 2.75 mM para las reacciones de liposomas extruidos (lípido total 5 mM). Las reacciones se llevaron a cabo en ATP 150 pM. Las concentraciones de enzima para DGKa y DGKZ fueron de 5 nM. ;;Los estudios de inhibición de compuestos se llevaron a cabo de la siguiente manera: se transfirieron gotas de 25 nL de cada compuesto de prueba (concentración superior 10 mM con 11 puntos, series de dilución de 3 veces para cada compuesto) solubilizados en DMSO a pocillos de una placa blanca de 1536 pocillos (Corning 3725). Se preparó una solución de sustrato de enzima/lípido de 5 mL a una concentración de reacción final de 2x combinando 2.5 mL de solución de enzima 4x (DGKa o DGKZ 20 nM (preparada como se describe a continuación) en amortiguador de ensayo) y 2.5 mL de liposoma 4x o detergente 4x/solución de micelas lipídicas (composiciones descritas a continuación) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se le añadió 1 pL de solución de enzima/sustrato lipídico 2x a los pocillos que contenían el compuesto de ensayo y se iniciaron las reacciones con la adición de 1 pL de ATP 300 uM. Se permitió que las reacciones prosiguieran durante 2 horas, después de lo cual se añadieron 2 pL de reactivo Glo (Promega V9101) y se incubaron durante 40 minutos. A continuación, se agregaron 4 pL de reactivo de detección de cinasa y se incubó durante 30 minutos. La luminiscencia se registró usando un lector de microplacas EnVision. El porcentaje de inhibición se calculó a partir de la conversión de ATP generada por reacciones sin control enzimático para una inhibición del 100% y reacciones con vehículo solo para una inhibición del 0%. Los compuestos se evaluaron a 11 concentraciones para determinar IC50. ;;Preparación de micelas de detergente/lípidos 4x ;;La micela de detergente/lípido se preparó combinando 15 g de fosfatidilserina (Avanti 840035P) y 1 g de diacilglicerol (8008110) y disolviendo en 150 mL de cloroformo en un matraz de fondo redondo de 2 litros. El cloroformo se eliminó a alto vacío mediante evaporación rotatoria. El aceite pegajoso e incoloro resultante se resuspendió en 400 mL de MOPS 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, NaF 20 mM, MgCh 10 mM, CaCh 1 pM, DTT 1 mM y octilglucósido 200 mM mediante mezcla vigorosa. La solución de lípido/detergente se dividió en alícuotas de 5 mL y se almacenó a -80 °C. ;Preparación de liposomas 2x ;;La composición de lípidos era 5 mol% de DAG (Avanti 8008110), 40 mol% de PS (Avanti 840035P) y 55 mol% de PC (Avanti 850457) con una concentración total de lípidos de 7-8 mg/mL para la solución de liposomas. El PC, DAG y PS se disolvieron en cloroformo, se combinaron y se secaron al vacío hasta formar una película delgada. Los lípidos se hidrataron a 20 mM en MOPS 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, MgCh 5 mM y se congelaron y descongelaron cinco veces. La suspensión de lípidos se extruyó a través de un filtro de policarbonato de 100 nm 10-12 veces. Se llevó a cabo una dispersión dinámica de la luz para confirmar el tamaño de los liposomas (radio de 50-60 nm). La preparación de liposomas se almacenó a 4 °C durante cuatro semanas. ;;Expresión de baculovirus de DGKa humano de longitud casi completa y DGKZ de longitud completa ;;Se generaron muestras de baculovirus humano MA-hDGKa-(S9-S727)-Ct-TVMV-His-pFBgate y DGK-Z-variante de transcrito-2-TVMV-His-pFBgate humano de longitud completa usando la expresión de baculovirus Bac-to-Bac sistema (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante (nota: MA- en el nombre de los reactivos DGKa indica que se agregaron dos aminoácidos adicionales antes de Ser-9). El ADN usado para la expresión de DGK-a(9-727) y DGK-Z tiene SEC ID NOs: 5 y 3, respectivamente. La amplificación de baculovirus se logró usando células Sf9 infectadas en proporciones de virus/célula de 1:1500 y se cultivaron durante 65 horas a 27 °C después de la transfección. ;;La escala de expresión para la proteína DGK-a(9-727) de longitud casi completa se llevó a cabo en frascos de 2 L, y la DGKZ de longitud completa se llevó a cabo con un Cellbag 50 L WAVE-Bioreactor System 20/50 de GE Healthcare Bioscience. Las proteínas se expresaron en diferentes volúmenes usando condiciones similares. Para la expresión de DGKa(9-727), se usaron matraces de 2 x 2 L, cada uno con un volumen final de 0.8 L de medio de cultivo, y se cultivó DGKZ a una escala de 12 L en un Cellbag de 50 L. Para cada uno, se sembró una densidad inicial de 2 * 106 células/mL de células Sf9 (Expression System, Davis, CA) en medio de insecto ESF921 (Expression System), se infectaron con reserva de virus en proporciones de virus/células de 1:200 y se cultivaron durante 66-68 horas a 27 °C post-infección. Los cultivos de células infectadas se recolectaron por centrifugación a 2000 rpm durante 20 min 4 °C en una centrífuga SORVALL® RC12BP. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C hasta su purificación.

Purificación de DGK-alfa y DGK-zeta humana

La DGKa(9-727) humana y la DGKZ de longitud completa, cada una expresada con una secuencia etiqueta Hexa-His C-terminal escindible con TVMV (SEC ID NO: 2 y 4, respectivamente) y producida como se describió anteriormente, se purificaron a partir de Sf9 Pasta de células de insecto infectadas con baculovirus. Las pastas celulares se descongelaron y se suspendieron en amortiguador (HEPES 50 mM, pH 7.2, NaCl 300 mM, glicerol al 10% v/v, TCEP 1 mM que contenía benzonasa e inhibidores de proteasa), hasta 1:10 v/v del volumen de cultivo original. La lisis se llevó a cabo usando el método de cavitación de nitrógeno con una bomba de nitrógeno (Parr Instruments) y los lisados se clarificaron mediante centrifugación a alta velocidad. Los lisados clarificados se purificaron hasta una homogeneidad de ~90% mediante dos o tres pasos sucesivos de cromatografía en columna, respectivamente, en un sistema ÁKTA Purifier Plus. Ambas isotermas se purificaron mediante purificación por afinidad con níquel con elución en gradiente de imidazol (es decir, HisTrap FF, GE Healthcare), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (es decir, HiLoad 26/600 Superdex 200 prep grade, GE Healthcare, para DGKa(9-727), y HiPrep 26/600 Sephacryl S 300 HR, GE Healthcare, para DGKZ). Estos dos pasos produjeron DGKa(9-727) con una pureza >90%. Lograr una pureza similar para DGKZ de longitud completa requirió un tercer paso, empleando cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose FF, GE Healthcare) y eluyendo con un gradiente de NaCl. Los amortiguadores de formulación final fueron similares para ambas proteínas, con DGKa(9-727) preparado en Hepes 50 mM, pH 7.3, NaCl 300 mM, glicerol al 10% v/v y TCEP 1 mM, y DGKZ de longitud completa preparado en Hepes 50 mM, pH 7.3, NaCl 500 mM, glicerol al 5% v/v y TCEP 1 mM. Las proteínas se concentraron a 1-2 mg/mL, se congelaron instantáneamente y se mantuvieron a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.

Ensayo 3: Ensayo de IL2 de células T CD4 de Raji

Se llevó a cabo un ensayo de IL-2 de 1536 pocillos en un volumen de 4 pL usando células T CD4 preactivadas y células Raji. Antes del ensayo, las células T CD4 se preactivaron mediante tratamiento con a-CD3, a-CD28 y PHA a 1.5 pg/mL, 1 pg/mL y 10 pg/mL, respectivamente. Las células Raji se trataron con enterotoxina estafilocócica B (SEB) a 10,000 ng/mL. Los compuestos diluidos en serie se transfirieron primero a una placa de ensayo de 1536 pocillos (Corning, # 3727), seguido de la adición de 2 pL de células T CD4 preactivadas (densidad final a 6000 células/pocillo) y 2 pL de células Raji tratadas con SEB (2000 células/pocillo). Después de 24 horas de incubación en una incubadora a 37 °C/CÜ2 al 5%, se añadieron 4 pL de reactivos de detección de IL-2 a la placa de ensayo (Cisbio, #64IL2PEC). Las placas de ensayo se leyeron en un lector Envision. Para evaluar la citotoxicidad del compuesto, se incubaron células T Raji o CD4 con los compuestos diluidos en serie. Después de 24 horas de incubación, se añadieron 4 pL de Cell Titer Glo (Promega, #G7572) y las placas se leyeron en un lector Envision. La concentración efectiva al 50% (IC50) se calculó usando la fórmula logística de cuatro parámetros y = A+((B-A)/(1+((C/x)AD))), en donde A y B indican el % mínimo y máximo de activación o inhibición, respectivamente, C es la IC50, D es la pendiente de la colina y x representa la concentración del compuesto.

Ensayo 4: Ensayo de proliferación de células T CD8 CellTiter-Glo

Células T CD8 humanas vírgenes congeladas se descongelaron en RPMI FBS al 10%, se incubaron durante 2 h a 37 °C y se contaron. La placa de cultivo de tejidos de 384 pocillos se recubrió durante la noche a 4 °C con 20 pL de anti-CD3 humano a 0.1 pg/mL en RPMI simple, que se retiró de la placa antes de 20k/40 pL de células T CD8 con 0.5 p Se añadieron g/mL de anti-CD28 humano soluble a cada pocillo. Los compuestos se hicieron eco en la placa de células inmediatamente después de sembrar las células. Después de 72 h de incubación a 37 °C, se agregaron 10 pL de reactivo CellTiter-glo (número de catálogo Promega G7570) a cada pocillo. La placa se agitó vigorosamente durante 5 minutos, se incubó a temperatura ambiente durante otros 15 minutos y se leyó en Envision para determinar la proliferación de células T CD8. En el análisis, la señal de células T CD8 estimuladas con 0.1 pg/mL de anti-CD3 y 0.5 pg/mL de anti-CD28 era el fondo. El compuesto de referencia, 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil) piperazin-1 -il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo, a 3 pM se usó para establecer el intervalo de 100% y ECsüfue de 50% absoluto para normalizar los datos.

Ensayo 5: Ensayo DGK AP1-Reportero

El reportero de Jurkat AP1-luciferasa se generó usando el kit Cignal Lenti AP1 Reporter (luc) de SABiosciences (CLS-011L).

Los compuestos se transfirieron desde una placa Echo LDV a pocillos individuales de una placa de 384 pocillos (placa blanca, de fondo sólido, opaca PE CulturPlate 6007768) usando un instrumento Echo550. El tamaño de la muestra fue de 30 nL por pocillo; y una placa de destino por placa de origen. Las suspensiones celulares se prepararon transfiriendo 40 mL de células (2 x 20 mL) a tubos cónicos limpios de 50 mL. Las células se concentraron por centrifugación (1200 rpm; 5 min; temperatura ambiente). Se eliminó el sobrenadante y todas las células se suspendieron en RPMI (Gibco 11875) FBS al 10% para obtener una concentración de 1.35 x 106 células/mL. Las células se añadieron manualmente usando una pipeta multicanal, 30 pL/pocillo de suspensión celular a una placa TC de 384 pocillos que contenía los compuestos, 4.0x104 células por pocillo. Las placas de células se incubaron durante 20 minutos a 37 °C y 5% de CO2.

Durante la incubación, se prepararon soluciones de anticuerpos anti-CD3 (aCD3) mezclando 3 pL de aCD3 (1.3 mg/mL) con 10 mL de medio [concentración final = 0.4 pg/mL]. A continuación, se mezclaron 1.5 pL de aCD3 (1.3 mg/mL) con 0.5 mL de medio [conc. final = 4 pg/mL]. Después de 20 minutos, se agregaron 10 pL de medio a todos los pozos en la columna 1, pozos A a M, y 10 pL de aCD3 (4 ug/mL) por pozo en la columna 1, filas N a P como referencia. Luego, usando una pipeta multicanal, se agregaron 10 pL de aCD3 (0.4ug/mL) por pocillo. Las células tratadas con compuesto /- estimuladas con aCD3 se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 6 horas.

Durante este período de incubación, el reactivo Steady-Glo (Promega E2520) se descongeló lentamente a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 20 pL de reactivo Steady-Glo por pocillo usando un dispensador Combi multigota. Las burbujas se eliminaron por centrifugación (2000 rpm, temperatura ambiente, 10 segundos). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las muestras se caracterizaron midiendo las unidades de luz relativas (RLU) con un instrumento Envision Plate Reader en un protocolo de luminiscencia. Los datos se analizaron usando el compuesto de referencia, 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo, para normalizar la inhibición al 100%.

Ensayo 6: Ensayo de linfocitos T citotóxicos murinos

Se desarrolló un ensayo de células T citolíticas específicas de antígeno (CTL) para evaluar funcionalmente la capacidad de los inhibidores de DGKa y DGKZ para mejorar la actividad de destrucción de células tumorales mediada por células T efectoras. Células T CD8+ aisladas del ratón transgénico OT-1 reconocen las células presentadoras de antígeno, MC38, que presentan el péptido derivado de ovoalbúmina SIINFEKL. El reconocimiento del antígeno afín inicia la actividad citolítica de las células T CD8+ específicas del antígeno OT-1.

Células CTL funcionales se generaron de la siguiente manera: se aislaron y expandieron esplenocitos OT-1 de ratones de 8 a 12 semanas de edad en presencia del péptido SIINFEKL a 1 pg/mL y mIL2 a 10 U/mL. Después de tres días, se le añadió medio fresco con mIL2 U/mL. El día 5 de la expansión, las células T CD8+ se aislaron y quedaron listas para su uso. Las células CTL activadas pueden almacenarse congeladas durante 6 meses. Por separado, un millón de células tumorales MC38 fueron pulsadas con 1 pg/mL de péptido SIINFEKL-OVA durante 3 horas a 37 °C. Las células se lavaron (3X) con medio nuevo para eliminar el exceso de péptido. Finalmente, las células CTL que se pretrataron con inhibidores de DGK durante 1 hora en una placa inferior en U de 96 pocillos se combinaron con las células tumorales MC38 cargadas con antígeno en una proporción de 1:10. Luego, las células se centrifugaron a 700 rpm durante 5 min y se colocaron en una incubadora durante la noche a 37 °C. Después de 24 horas, se recogió el sobrenadante para el análisis de los niveles de citocinas de IFN-<y>mediante AlphaLisa adquirido de Perkin Elmer.

Ensayo 7: Ensayo de proliferación de PHA

Se incubaron células blásticas estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) de stocks congelados en medio RPMI (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante una hora antes de agregarlos a pocillos individuales de una placa de 384 pocillos (10,000 células por pocillo). Los compuestos se transfirieron a pocillos individuales de una placa de 384 pocillos y las células tratadas se mantuvieron a 37 °C, 5% de CO2 durante 72 h en medio de cultivo que contenía IL2 humana (20 ng/mL) antes de medir el crecimiento usando el reactivo MTS [3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio] siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). El porcentaje de inhibición se calculó comparando los valores entre el control estimulado con IL2 (0% de inhibición) y el control no estimulado (100% de inhibición). Las determinaciones de la concentración de inhibición (IC50) se calcularon sobre la base de una inhibición del 50% en el número de veces de inducción entre los tratamientos estimulados y no estimulados con IL2.

Ensayo 8: Ensayo de IFN-<y>de células T CD8 humanas

Las células T CD8 humanas vírgenes congeladas se descongelaron en medio AIM-V, se incubaron durante 2 h a 37 ° C y se contaron. La placa de cultivo de tejidos de 384 pocillos se cubrió durante la noche a 4 °C con 20 pL de anti-CD3 humano a 0.05 pg/mL en PBS, que se retiró de la placa antes de 40,000 células por 40 microlitros de células T CD8 con 0.1 pg /mL de anti-CD28 humano soluble a cada pocillo. Los compuestos se transfirieron usando un manipulador de líquidos Echo a la placa de células inmediatamente después de sembrar las células. Después de 20 h de incubación en una incubadora a 37 °C, se transfirieron 3 microlitros por pocillo de sobrenadante a una nueva placa de ensayo blanca de 384 pocillos para la medición de citocinas.

El interferón-Y (IFN-y) se cuantificó usando el kit AlphLISA (Cat#AL217) como se describe en el manual del fabricante (Perkin Elmer). Los recuentos de cada pocillo se convirtieron a concentración de IFN-<y>(pg/mL). Los valores de EC50 del compuesto se determinaron estableciendo 0.05 pg/mL de anti-CD3 más 0.1 pg/mL de anti-CD28 como línea de base y coestimulando 3 pM del compuesto de referencia, 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo, con anti-CD3 más anti-CD28 como Activación al 100%.

Ensayo 9: Ensayo pERK de células T CD8 humanas

Las células T CD8 humanas vírgenes congeladas se descongelaron en medio AIM-V, se incubaron durante 2 h a 37 ° C y se contaron. Los linfocitos T positivos para CD8 se añadieron a una placa de cultivo de tejido de 384 pocillos a razón de 20,000 células por pocillo en medio AIM-V. Se añadió un compuesto a cada pocillo, luego se añadieron mAb anti-CD3 humano y anti-CD28 unidos a perlas a una concentración final de 0.3 pg/mL. Las células se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. La reacción se detuvo añadiendo amortiguador de lisis del kit AlphaLISA Surefire. (Perkin Elmer, cat. # ALSU-PERK-A). El lisado (5 pL por pocillo) se transfirió a una nueva placa blanca de ensayo de 384 pocillos para medir la activación de pERK.

Se determinó que la EC50 del compuesto establece anti-CD3 más anti-CD28 como línea de base y coestimulación con 3 pM de 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo con anti-CD3 más anti-CD28 como activación al 100%.

Ensayo 10: Ensayo de IFN-y en sangre entera humana

Sangre entera venosa humana (22.5 pL por pocilio), obtenida de donantes sanos, se pretrató con compuestos durante una hora a 37 °C en una incubadora humidificada con 95% de aire/5% de CO2. La sangre se estimuló con 2.5 pL de mAb anti-CD3 humano y anti-CD28 a una concentración final de 1 pg/mL cada uno durante 24 horas a 37 °C. El IFN-Y en los sobrenadantes se midió usando el kit AlphLISA (Cat#AL217).

La EC50 del compuesto fue determinada estableciendo anti-CD3 más anti-CD28 como línea de base y coestimulación de 3 pM del compuesto de referencia, 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo, con anti-CD3 más anti-CD28 como activación al 100%.

Ensayo 11: Ensayo pERK de sangre entera humana DGK

El ensayo de fosforilación de ERK en sangre completa humana se llevó a cabo con sangre venosa completa humana obtenida de donantes sanos (extraído con heparina como anticoagulante). Se añadieron diluciones en serie de compuestos (11 puntos, 3 veces) en DMSO a placas de 384 pocillos a 20 nL/pocillo usando un dispensador acústico ECHO 550 (Labcyte) para lograr una concentración inicial final de 20 pM en el ensayo. Se añadió sangre completa humana heparinizada a la placa compuesta a razón de 9 pL por pocillo y se incubó durante una hora a 37 °C en un incubador humidificado al 95%, aire/5% CO2. Después de una hora de incubación del compuesto, se le añadió al pocillo 1 pL de anticuerpo anti-CD3 humano (interno) en presencia de IgG de cabra anti-ratón reticulante (4 pg/mL) a una concentración final de 1 pg/mL. concentración para la estimulación de la vía y, además, se incuba durante 15 minutos a 37 °C. La estimulación se detuvo añadiendo 90 pL de amortiguador Fix/Lyse (BD 558049). Las células se lavaron y tiñeron con anticuerpos anti-CD8 PE (BD 555635) durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo y se permeabilizaron en hielo usando amortiguador Perm III (BD 558050) durante 30 minutos. A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo Alexa Fluor® 647 anti-ERK1/2 fosfo (Thr202/Tyr204) (Bioleged 675504) durante 60 minutos a una dilución de 1:50. Las muestras se lavaron y se resuspendieron en dPBS que contenía BSA al 1% (dPBS, Gibco 14190136; BSA, Sigma-Aldrich A9205). Muestras analizadas con Intellicyt® iQue Screener PLUS. La activación de pERK se cuantificó por el porcentaje de población positiva para pERK dentro de la población positiva para CD8. Los cálculos de las potencias de los compuestos se basaron en el compuesto interno a una concentración de 20 pM como una activación del 100% y el control anti-CD3 como una activación del 0%.

Secuencia de nucleótidos que codifica para hDGKa-(M1-S735)-Ct-TVMV-His:

1 ATGGCCAAGG AGAGGGGCCT AATAAGCCCC AGTGATTTTG CCCAGCTGCA 5 1 AAAATACATG GAATACTCCA CCAAAAAGGT CAGTGATGTC CTAAAGCTCT 101 TCGAGGATGG CGAGATGGCT AAATATGTCC AAGGAGATGC CATTGGGTAC 151 GAGGGATTCC AGCAATTCCT GAAAATCTAT CTCGAAGTGG ATAATGTTCC 2 01 CAGACACCTA AGCCTGGCAC TGTTTCAATC CTTTGAGACT GGTCACTGCT 2 51 TAAATGAGAC AAATGTGACA AAAGATGTGG TGTGTCTCAA TGATGTTTCC 3 01 TGCTACTTTT CCCTTCTGGA GGGTGGTCGG CCAGAAGACA AGTTAGAATT 3 51 CACCTTCAAG CTGTACGACA CGGACAGAAA TGGGATCCTG GACAGCTCAG 40 1 AAGTGGACAA AATTATCCTA CAGATGATGC GAGTGGCTGA ATACCTGGAT 45 1 TGGGATGTGT CTGAGCTGAG GCCGATTCTT CAGGAGATGA TGAAAGAGAT 5 01 TGACTATGAT GGCAGTGGCT CTGTCTCTCA AGCTGAGTGG GTCCGGGCTG 5 51 GGGCCACCAC CGTGCCACTG CTAGTGCTGC TGGGTCTGGA GATGACTCTG 601 AAGGACGACG GACAGCACAT GTGGAGGCCC AAGAGGTTCC CCAGACCAGT 651 CTACTGCAAT CTGTGCGAGT CAAGCATTGG TCTTGGCAAA CAGGGACTGA 7 01 GCTGTAACCT CTGTAAGTAC ACTGTTCACG ACCAGTGTGC CATGAAAGCC 7 51 CTGCCTTGTG AAGTCAGCAC CTATGCCAAG TCTCGGAAGG ACATTGGTGT 801 CCAATCACAT GTGTGGGTGC GAGGAGGCTG TGAGTCCGGG CGCTGCGACC 851 GCTGTCAGAñ AAAGATCCGG ATCTACCACA GTCTGACCGG GCTGCATTGT 901 GTATGGTGCC ACCTAGAGAT CCACGATGAC TGCCTGCAAG CGGTGGGCCA 951 TGAGTGTGAC TGTGGGCTGC TCCGGGATCA CATCCTGCCT CCATCTTCCA 100 1 TCTATCCCAG TGTCCTGGCC TCTGGACCGG ATCGTAAAAA TAGCAAAACA 105 1 AGCCAGAAGA CCATGGATGA TTTAAATTTG AGCACCTCTG AGGCTCTGCG 110 1 GATTGACCCT GTTCCTAACA CCCACCCACT TCTCGTCTTT GTCAATCCTA 115 1 AGAGTGGCGG GAAGCAGGGG CAGAGGGTGC TCTGGAAGTT CCAGTATATA 120 1 TTAAACCCTC GACAGGTGTT CAACCTCCTA AAGGATGGTC CTGAGATAGG 125 1 GCTCCGATTA TTCAAGGATG TTCCTGATAG CCGGATTTTG GTGTGTGGTG 130 1 GAGACGGCAC AGTAGGCTGG ATTCTAGAGA CCATTGACAA AGCTAACTTG 135 1 CCAGTTTTGC CTCCTGTTGC TGTGTTGCCC CTGGGTACTG GAAATGATCT 140 1 GGCTCGATGC CTAAGATGGG GAGGAGGTTA TGAAGGACAG AATCTGGCAA 145 1 AGATCCTCAA GGATTTAGAG ATGAGTAAAG TGGTACATAT GGATCGATGG 150 1 TCTGTGGAGG TGATACCTCA ACAAACTGAA GAAAAAAGTG ACCCAGTCCC 155 1 CTTTCAAATC ATCAATAACT ACTTCTCTAT TGGCGTGGAT GCCTCTATTG 160 1 CTCATCGATT CCACATCATG CGAGAGAAAT ATCCGGAGAA GTTCAACAGC 165 1 AGAATGAAGA ACAAGCTATG GTACTTCGAA TTTGCCACAT CTGAATCCAT 170 1 CTTCTCAACA TGCAAAAAGC TGGAGGAGTC TTTGACAGTT GAGATCTGTG 175 1 GGAAACCGCT GGATCTGAGC AACCTGTCCC TAGAAGGCAT CGCAGTGCTA 180 1 AACATCCCTA GCATGCATGG TGGCTCCAAC CTCTGGGGTG ATACCAGGAG 185 1 ACCCCATGGG GATATCTATG GGATCAACCA GGCCTTAGGT GCTACAGCTA 190 1 AAGTCATCAC CGACCCTGAT ATCCTGAAAA CCTGTGTACC AGACCTAAGT 195 1 GACAAGAGAC TGGAAGTGGT TGGGCTGGAG GGTGCAATTG AGATGGGCCA20 01 AATCTATACG AAGCTCAAGA ATGCTGGACG TCGGCTGGCC AAGTGCTCTG 2 0 51 AGATCACCTT CCACACCACA AAAACCCTTC CCATGCAAAT TGACGGAGAA 2 10 1 CCCTGGATGC AGACGCCCTG TACAATCAAG ATCACCCACA AGAACCAGAT 2 15 1 GCCCATGCTC ATGGGCCCAC CCCCCCGCTC CACCAATTTC TTTGGCTTCT 2 2 01 TGAGCGGATC CTCGGAGACA GTGCGGTTTC AGGGACACCA CCACCATCAC 2 25 1 CACTGA

(SEQ ID NO: 1)

Secuencia de aminoácidos de hDGKa-(M1-S735)-Ct-TVMV-His:

00 01 MAKERGLISP SDFAQLQKYM EYSTKKVSDV LKLFEDGEMA KYVQGDAIGY EGFQQFLKIY 0060 00 61 LEVDNVPRHL SLALFQSFET GHCLNETNVT KDWCLNDVS CYFSLLEGGR PEDKLEFTFK 0120 01 21 LYDTDRNGIL DSSEVDKIIL QMMRVAE YLD WDVSELRPIL QEMMKEIDYD GSGSVSQAEW 0180 01 81 VRAGATTVPL LVLLGLEMTL KDDGQHMWRP KRFPRPVYCK L C E S 3IGLGK QGLSCNLCKY 0240 02 41 TVHDQCAMKA LPCEVSTYAK SRKDIGVQSH VWVRGGCESG RCDRCQKKIR IYHSLTGLHC 0300 03 01 VWCHLEIHDD CLQAVGHECD CGLLRDHI1P PSSIYPSVLA SGPDRKNSKT SQKTMDDLWL 0360 03 61 STSEALRIDP VPNTHPLLVF VNPKSGGKQG QRVLWKFQYI LNPRQVFNLL KDGPEIGLRL 0420 04 21 FKDVPDSRIL VCGGDGTVGW ILETIDKANL PVLPPVAVLP LGTGWDLARC LRWGGGYEGQ 0480 048 1 NLAKILKDLE MSKWHMDRW SVEVIPQQTE EKSDPVPFQI INNYFSIGVD ASIAHRFHIM 0540 05 41 REKYPEKFNS RMKNKLWYFE FA TSESIFST CKKLEESLTV EICGKPLDLS NLSLEGIAVL 0600 06 01 NIFSMHGGSN LWGDTRRPHG DIYGINQA1G ATAKVITDPD ILKTCVPDLS DKRLEWGLE 0660 06 61 GAIEMGQIYT KLKMAGRR1A KCSEITFHTT KTLPMQIDGE PWMQTPCTIK I THKMQMPML 0720 07 21 MGPPPRSTNF FGFLSGSSET VRFQGHHHHH H 0751

(SEQ ID NO: 2)

Secuencia de nucleótidos que codifica para hDGKZ-(M1-A928)-transcnpción variante-2 Ct-TVMV-His:

1 ATGGAGCCGC GGGACGGTAG CCCCGAGGCC CGGAGCAGCG ACTCCGAGTC 51 GGCTTCCGCC TCGTCCAGCG GCTCCGAGCG CGACGCCGGT CCCGAGCCGG 10 1 ACAAGGCGCC GCGGCGACTC AACAAGCGGC GCTTCCCGGG GCTGCGGCTC 15 1 TTCGGGCACA GGAAAGCCAT CACGAAGTCG GGCCTCCAGC ACCTGGCCCC 20 1 CCCTCCGCCC ACCCCTGGGG CCCCGTGCñG CGAGTCAGAG CGGCAGATCC 25 1 GGAGTACAGT GGACTGGAGC GAGTCAGCGA CATATGGGGA GCACATCTGG 30 1 TTCGAGACCA ACGTGTCCGG GGACTTCTGC TACGTTGGGG AGCAGTACTG 35 1 TGTAGCCAGG ATGCTGCAGA AGTCAGTGTC TCGAAGAAAG TGCGCAGCCT 40 1 GCAAGATTGT GGTGCACACG CCCTGCATCG AGCAGCTGGA GAAGATAAAT 45 1 TTCCGCTGTA AGCCGTCCTT CCGTGAATCA GGCTCCAGGA ATGTCCGCGA 5 01 GCCAACCTTT GTACGGCACC A CTGGGTACA CAGACGACGC CAGGACGGCA 55 1 AGTGTCGGCA CTGTGGGAAG GGATTCCAGC AGAAGTTCAC CTTCCACAGC 60 1 AAGGAGATTG TGGCCATCAG CTGCTCGTGG TGCAAGCAGG CATACCACAG 65 1 CAAGGTGTCC TGCTTCATGC TGCAGCAGAT CGAGGAGCCG TGCTCGCTGG 70 1 GGGTCCACGC AGCCGTGGTC ATCCCGCCCA CCTGGATCCT CCGCGCCCGG 75 1 AGGCCCCAGA ATACTCTGAA AGCAAGCAAG AAGAAGAAGA GGGCATCCTT 80 1 CAAGAGGAAG TCCAGCAAGA AAGGGCCTGA GGAGGGCCGC TGGAGACCCT 85 1 TCATCATCAG GCCCACCCCC TCCCCGCTCA TGAAGCCCCT GCTGGTGTTT 9 01 GTGAACCCCA AGAGTGGGGG CAACCAGGGT GCAAAGATCA TCCAGTCTTT 95 1 CCTCTGGTAT CTCAATCCCC GACAAGTCTT CGACCTGAGC CAGGGAGGGC 10 01 CCAAGGAGGC GCTGGAGATG TACCGCAAAG TGCACAACCT GCGGATCCTG 10 51 GCGTGCGGGG GCGACGGCAC GGTGGGCTGG ATCCTCTCCA CCCTGGACCA 11 01 GCTACGCCTG AAGCCGCCAC CCCCTGTTGC CATCCTGCCC CTGGGTACTG 11 51 GCAACGACTT GGCCCGAACC CTCAACTGGG GTGGGGGCTA CACAGATGAG 12 01 CCTGTGTCCA AGATCCTCTC CCACGTGGAG GAGGGGAACG TGGTACAGCT 12 51 GGACCGCTGG GACCTCCACG CTGAGCCCAA CCCCGAGGCA GGGCCTGAGG 13 01 ACCGAGATGA AGGCGCCACC GACCGGTTGC CCCTGGATGT CTTCAACAAC 13 51 TACTTCAGCC TGGGCTTTGA CGCCCACGTC ACCCTGGAGT TCCACGAGTC 14 01 TCGAGAGGCC AACCCAGAGA AATTCAACAG CCGCTTTCGG AATAAGATGT 14 51 TCTACGCCGG GACAGCTTTC TCTGACTTCC TGATGGGCAG CTCCAAGGAC 15 01 CTGGCCAAGC ACATCCGAGT GGTGTGTGAT GGAATGGACT TGACTCCCAA 15 51 GATCCAGGAC CTGAAACCCC AGTGTGTTGT TTTCCTGAAC ATCCCCAGGT 16 01 ACTGTGCGGG CACCATGCCC TGGGGCCACC CTGGGGAGCA CCACGACTTT 16 51 GAGCCCCAGC GGCATGACGA CGGCTACCTC GAGGTCATTG GCTTCACCAT 17 01 GACGTCGTTG GCCGCGCTGC AGGTGGGCGG ACACGGCGAG CGGCTGACGC 17 51 AGTGTCGCGA GGTGGTGCTC ACCACATCCA AGGCCATCCC GGTGCAGGTG 18 01 GATGGCGAGC CCTGCAAGCT TGCAGCCTCA CGCATCCGCA TCGCCCTGCG 18 51 CAACCAGGCC ACCATGGTGC AGAAGGCCAA GCGGCGGAGC GCCGCCCCCC 19 01 TGCACAGCGA CCAGCAGCCG GTGCCAGAGC AGTTGCGCAT CCAGGTGAGT 19 51 CGCGTCAGCA TGCACGACTA TGAGGCCCTG CACTACGACA AGGAGCAGCT 20 01 CAAGGAGGCC TCTGTGCCGC TGGGCACTGT GGTGGTCCCA GGAGACAGTG 20 51 ACCTAGAGCT CTGCCGTGCC CACATTGAGA GACTCCAGCA GGAGCCCGAT 21 01 GGTGCTGGAG CCAAGTCCCC GACATGCCAG AAACTGTCCC CCAAGTGGTG 21 51 CTTCCTGGAC GCCACCACTG CCAGCCGCTT CTACAGGATC GACCGAGCCC 22 01 AGGAGCACCT CAACTATGTG ACTGAGATCG CACAGGATGA GATTTATATC 22 51 CTGGACCCTG AGCTGCTGGG GGCATCGGCC CGGCCTGACC TCCCAACCCC 23 01 CACTTCCCCT CTCCCCACCT CACCCTGCTC ACCCACGCCC CGGTCACTGC 23 51 AAGGGGATGC TGCACCCCCT CAAGGTGAAG AGCTGATTGA GGCTGCCAAG 24 01 AGGAACGACT TCTGTAAGCT CCAGGAGCTG CACCGAGCTG GGGGCGACCT 24 51 CATGCACCGA GACGAGCAGA GTCGCACGCT CCTGCACCAC GCAGTCAGCA 25 01 CTGGCAGCAA GGATGTGGTC CGCTACCTGC TGGACCACGC CCCCCCAGAG 25 51 ATCCTTGATG CGGTGGAGGA AAACGGGGAG ACCTGTTTGC ACCAAGCAGC 26 01 GGCCCTGGGC CAGCGCACCA TCTGCCACTA CATCGTGGAG GCCGGGGCCT 26 51 CGCTCATGAA GACAGACCAG CAGGGCGACA CTCCCCGGCA GCGGGCTGAG 27 01 AAGGCTCAGG ACACCGAGCT GGCCGCCTAC CTGGAGAACC GGCAGCACTA 27 51 CCAGATGATC CAGCGGGAGG ACCAGGAGAC GGCTGTGGGA TCCTCGGAGA 28 01 CAGTGCGGTT TCAGGGACAC CACCACCATC ACCACTGA

(SEQ ID NO: 3)

Secuencia de aminoácidos de hDGKZ-(M1-A928)-variante de transcripción-? Ct-TVMV-His:

00 01 MEPRDGSPEA RSSDSESASA SSSGSERDAG PEPDKAPRRL NKRRFPGLRL FGHRKAITKS 0060 00 61 GLQHLAPPPP TPGAPCSESE RQIRSTVDWS ESATYGEHIW FETNVSGDFC YVGEQYCVAR 0120 01 21 mLQKSVSRRK CAACKIWHT PCIEQLEKIN FRCKPSFRES GSRNVREPTF VRHHWVHRRR 018 0 01 81 QDGKCRHCGK GFQQKFTFHS KEIVAISCSW CKQAYHSKVS CFMLQQIEEP C S LGVHAAW 0240 02 41 IPPTWILRAR RPQNTLKASK KKKRAS FKRK SSKKGPEEGR W RPFIIRPTP SPLMKPLLVF 0300 03 01 VNPKS GGNQG AKIIQSFLWY LNPRQVFDLS QGGPKEALEM YRKVHWLRIL ACGGDGTVGW 0360 03 61 ILSTLDQLRL KPPPPVAI1P LGTGNDLART LNWGGGYTDE PVSKILSHVE EGNWQ1DRW 0420 04 21 DLHAEPNPEA GPEDRDEGAT DRLPLDVFNN YFSLGFDAHV TLEFHESREA NPEKFNSRFR 0480 04 81 NKMFYAGTAF SDFLMGSSKD LAKHIRWCD GMDLTPKIQD LKPQCWFLN IPRYCAGTMP 0540 05 41 WGHPGEHHDF EPQRHDDGYL EVIGFTMTSL AALQVGGHGE RLTQCREWL TTSKAIPVQV 0600 06 01 DGEPCKLAAS RIRIALRNQA TMVQKAKRRS AAPLHSDQQP VPEQLRIQVS RVSMHDYEAL 0660 06 61 HYDKEQLKEA SVPLGTWVP GDSDLELCRA HIERLQQEPD GAGAKSPTCQ KLSPKWCFLD 0720 07 21 ATTASRFYRI DRAQEHLNYV TEIAQDEIYI LDPELLGASA RPDLPTPTS P LPTSPCSPTP 078 0 078 1 RSLQGDAAPP QGEELIEAAK RNDFCKLQEL HRAGGDLMHR DEQSRTLLHH AVSTGSKDW 0840 08 41 RYLLDHAPPE ILDAVEENGE TCLHQAAALG QRTICHYIVE AGASLMKTDQ QGDTPRQRAE 0900 09 01 KAQDTELAAY LENRQHYQMI QREDQETAVG SSETVRFQGH HHHHH 0945

(SEQ ID NO: 4)

Secuencia de nucleótidos que codifica para MA-hDGKa-(S9-S727)-Ct-TVMV-His:

0001 ATGGCTTCCC CAAGCGACTT CGCCCAGCTG CAGAAGTACA TGGAATACAG CACCAAGAAG 0060 0 061 GTGTCTGACG TCCTGAAGCT GT TCGAGGAC GGTGAAATGG GTAAGGACGT CCAGGGCGAC 0120 0121 GCTATCGGAT ACGAGGGATT CCAGCAGTTC CTGAAGATCT ACCTGGAAGT GGACAACGTC 0180 0181 CCCAGGCACC TGTCACTGGC TCTGTTCCAG TCCTTCGAGA CTGGCCACTG CCTGAACGAA 0240 0 241 ACCAACGTCA GTAAGGACGT GGTCTGCCTG AACGACGTGA GCTGCTACTT GTCTCTGCTG 0300 03 01 GAGGGTGGCA GACCAGAGGA CAAGCTGGAA TTCACCTTCA AGCTGTACGA CACTGACGGC 0360 0361 AAGGGAATCC TGGACTCCAG CGAAGTGGAC AAGATCATCC TGCAGATGAT GCGTGTCGCT 0420 0421 GAGTACCTGG ACTGGGACC-T GAGCGAACTG AGGCCTATCC TGCAGGAGAT GATGAAGGAA 0480 0 481 ATCGACTACG ACGGCTCTGG ATCAGTGTCC CAGGCTGAGT GGGTCCGCGC T GGT GG TAC G 0540 05 41 ACTGTGCCAC TGCTGGTCCT GCTGGGACTG GAAATGACCC TGAAGGACGA CGGTCAGCAC 0600 0 601 ArGTGGCGCC CAAAGCGTT l1 CCCCAGGCCA GTCTAC1GCA ACCTGTGCGA GTCTrCAATC 0660 0 661 GGTCTGGGCA AGCAGGGCC I1 GTCA rGCAAC CTGTGCAAGT ACACCGTGCA CGACCAGTGC 0720 0721 GCTATGAAGG CCCTGCCCTG CGAGGTCTCA ACTTACGCTA AGTCCCGTAA GGACATCGGA 0780 0 781 GTGCAGTCAC ACGTGTGGGT CACCCGACGT TGCCAATCCG GTAGATGCGA CCGGTGCGAG 0840 0841 AAGAAGATCC GTATCTACCA CTCCCTGACC GGACTGCACT GCGTCTGGTG CCACCTGGAG 0900 0 901 ATCCACGACG ACTGCCTGCA GGCCGTGGGA CACGAATGCG ACTGCGGTCT GCTGCGTGAG 0960 0 961 CACATCCTGC CTCCCTCCAG CATCTACCCT TCAGTCCTGG CTTGCGGTCC CGACAGGAAG 1020 1021 AACAGCAAGA CCTCTCAGAA GACTATGGAC GACCTGAACC TGAGCACCTC TGAGGCCCTG 1080 10 81 CGCATCGACC CTGTGCCCAA CACTCACCCA GTGCTGGTGT TCGTCAACCC TAAGAGCGGC 114 0 1141 GGAAAGCAGG GTCAGAGAGT CCTGTGGAAG TTCCAGTACA TCCTGAACCC ACGCCAGGTG 1200 1201 TTCAACCTGC T GAAGGACGG CCCTGAGATC GGACTGAGAC TGTTCAAGGA CGTGCCCGAC 1260 1261 TCTCGCATCC TCGTCTGCGG TGGCGACGGT ACTGTGGGAT GGATCCTGGA AACTATCGAC 1320 1321 AAGGCTAACC TGCCAGTGCT GCCACCTGTG GCTGTCCTGC CACTGGGAAC CGGTAACGAC 1380 1 381 CTGGCTCGTT GCCTGCGTTG GGGAGGTGGC TACGAGGGAC AGAACCTGGC CAAGATCCTG 1440 1441 AAGGACCTGG AAATGAGCAA GGTGGTCCAC ATGGACAGAT GGTCTGTGGA GGTCATCCCA 1 c n o 15 01 CAGCAGAC T G AGGAAAAGT C AGACCCAGTC CCTTTCCAGA TCATCAACAA CTAGTTCAGC 1560 15 61 ATGGGTGTGG ACGCTTCTAT CGCCCACAGA TTCCACATCA TGCGCGAGAA GTACCCTGAA 1620 1621 AAGTTGAAGT CCCGCATGAA GAAGAAGCTG TGGTACTTCG AGTTCGCTAG CTCAGAATCC 1680 1681 ATCTTCTCAA CTTGCAAGAA GCTGGAGGAA TCCCTGACCG TCGAGATCTG CGGCAAGCCT 1740 1741 CTGGACCTGT CAAACCTGTC CCTGGAAGGC ATCGCTGTGC TGAACATCCC AAGCATGCAC 1800 1 801 GGAGGTTCTA ACCTCTGGGG CGACACTAGG AGGCCTCACG GTGACATCTA CGGCATCAAC 1860 1 861 CAGGCCCTGG GAGCTACCGC CAAGGTCATC ACTGACCCCG ACATCCTGAA GACCTGCGTG 1920 1921 CCAGACCTGA GCGACAAGCG TCTGGAGGTG GTCGGACTGG AGGGTGCCAT CGAAATGGGC 1980 1981 CAGATCTACA CTAAGCTGAA GAACGCTGGA AGGAGACTGG CCAAGTGCTC T GAGATCACC 2040 2041 TTCCACACCA CTAAGACTCT GCCTATGCAG ATCGACGGTG AACCCTGGAT GCAGACCCCA 2100 2101 TGCACTATGA AGATCACCCA CAAGAACCAG ATGCCCATGC TGATGGGTCC TCCTCCTCGC 2160 2161 TC'I GGATCT 1 CAGAAACTGT GAGGTTCCAG GGCCACCACC ACCACCACCA CTGA 2214 (SEQ ID NO: 5)

Secuencia de aminoácidos de MA-hDGKa-(S9-S727)-Ct-TVMV-His:

00 01 MASPSDFAQL QKYMEYSTKK VSDVLKLFED GEMAKYVQGD AIGYEGFQQF LKIYLEVDNV 0060 00 61 PRHLSLALFQ SFETGHCLNE TNVTKDWCL NDVSCYFSLL EGGRPEDKLE FTFKLYDTDR 0120 01 21 WGILDSSEVD KIILQMMRVA EYLDWDVSEl RPILQEMMKE IDYDGSGSVS QAEWRAGAT 0180 01 81 TVPLLVLLGL EMTLKDDGQH MWRPKRFPRP VYCWLCESSI GLGKQGLSCN 1CKYTVHDQC 0240 02 41 AMKALPCEVS TYAKSRKDIG VQSHVWVRGG CESGRCDRCQ KKIRIYHS1T GLHCVWCHLE 0300 03 01 IHDDCLQAVG HECDCGLLRD H IL P PS S IY P SVLASGPDRK NSKTSQKTMD DLNLSTSEAL 03 60 03 61 RIDPVPNTHP LLVFVNPKSG GKQGQRV1WK FQYILNPRQV FNLLKDGPEI GLRLFKDVPD 0420 04 21 SRILVCGGDG TVGWILETID KANLPVLPPV AVLPLGTGND LARCLRWGGG YEGQNLAKIL 0480 04 81 KDLEMSKVVH MDRWSVEVIP QQTEEKSDPV PFQIINNYFS IGVDASIAHR FHIMREKYPE 0540 05 41 KFNSRMKNKL WYFEFATSES IFSTCKK1EE SLTVEICGKP LDLSNLSLEG IAVLNIPSMH 0600 06 01 GGSNLWGDTR RPHGDIYGIN QALGATAKVI TDPDILKTCV PDLSDKRLEV VGLEGAIEMG 0660 06 61 QIYTKLKNAG RRLAKCSEIT FHTTKTLPMQ IDGEPWMQTP CTIKITHKNQ MPMLMGPPPR 0720 07 21 SGSSETVRFQ GHHHHHH 0737

(SEQ ID NO: 6)

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   o una sal del mismo 2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable. 3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición de conformidad con la reivindicación 2, para su uso en terapia. 4. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición de conformidad con la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento del cáncer o infecciones virales. 5. El compuesto o la composición para su uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, linfoma, leucemia y melanoma.