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ES3037975T3 - In vitro growth method for hair follicular epithelial stem cells - Google Patents

In vitro growth method for hair follicular epithelial stem cells

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Publication number
ES3037975T3
ES3037975T3 ES19867367T ES19867367T ES3037975T3 ES 3037975 T3 ES3037975 T3 ES 3037975T3 ES 19867367 T ES19867367 T ES 19867367T ES 19867367 T ES19867367 T ES 19867367T ES 3037975 T3 ES3037975 T3 ES 3037975T3
Authority
ES
Spain
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culture medium
cells
fgf
epithelial
medium according
Prior art date
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Active
Application number
ES19867367T
Other languages
English (en)
Inventor
Takashi Tsuji
Kyosuke Asakawa
Makoto Takeo
Koh-ei TOYOSHIMA
Miho Ogawa
Yutaka Mori
Kyosuke Kishimoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Organtech Inc
RIKEN
Original Assignee
Organtech Inc
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

[Problema] Proporcionar un medio para el crecimiento eficiente de células epiteliales y que permita la producción de gérmenes de folículos pilosos regenerados. [Solución] Se proporciona un medio de cultivo para el crecimiento de células epiteliales, que permite la producción de gérmenes de folículos pilosos regenerados, y que contiene un medio de cultivo básico y al menos uno de (1)-(3): (1) al menos un inhibidor de BMP; (2) al menos un factor de crecimiento de fibroblastos; y (3) Sonic Hedgehog (SHH) o un agonista de SHH. También se proporciona un método para el crecimiento de células epiteliales utilizando el medio de cultivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de crecimiento in vitro para células madre epiteliales foliculares de cabello
Campo técnico
La presente invención se refiere a un medio de cultivo para el crecimiento eficiente de células epiteliales capaces de ser utilizadas para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados y a un método para el crecimiento de dichas células epiteliales utilizando el mismo.
Antecedentes de la técnica
Para hacer una realidad la medicina regenerativa del cabello es necesaria la adquisición de células madre mesenquimales y células madre epiteliales que posean inductividad del folículo piloso, necesarias para la reconstrucción de los gérmenes del folículo piloso, así como el crecimientoin vitrodel mismo. Con respecto a las células madre mesenquimales, se sabe que las células de la papila dérmica, que se pueden adquirir a partir de las papilas dérmicas, poseen inductividad del folículo piloso, y se ha demostrado que estas pueden adquirirse mediante cultivoin vitrode las mismas (Referencia no patente No. 1).
Con respecto a las células madre epiteliales, las técnicas para el cultivo de células madre Lgr5+ a partir del tejido epitelial intestinal se han establecido y se ha demostrado posible la regeneración de las vellosidades intestinales a partir del cultivo de células madre Lgr5+ (Referencia no patente No. 2).
Con respecto a los folículos pilosos, se ha sugerido la presencia de células madre que poseen inductividad del folículo piloso en la región de la protuberancia (Referencia no patente No. 3); y con respecto al crecimientoin vitro,mientras que hay reportes de métodos de crecimiento de células madre CD34+ integrina a6+ que implican cultivo tridimensional de células derivadas de folículos pilosos murinos (Referencia no patente No. 4), no se ha demostrado lo suficientemente su regeneratividad orgánica.
La Referencia de patente No. 1 divulga una métodoin vitropara la producción de folículos pilosos que comprende el cocultivo de células de la papila dérmica con queratinocitos, con la adición opcional de melanocitos, en un medio que favorece el crecimiento del cabello, por ejemplo, Epilife, cuyo medio se puede suplementar con sustancias como las que allí se enlistan para promover el desarrollo del proto-cabello.
La Referencia de patente No. 2 divulga un método para la proliferación de células madre del folículo piloso, en el que las células madre del folículo piloso se cultivan en un medio de cultivo para el cultivo de células epiteliales que comprende un inhibidor de ALK5 y un inhibidor de ROCK o en un medio que comprende un inhibidor de A<l>K5 y un inhibidor de TGFp.
Referencias de la técnica anterior
Referencias no patente
[Referencia no patente No. 1]Tissue Eng. 13, 975-82, 2007
[Referencia no patente No. 2] Nature. 459, 262-5, 2009
[Referencia no patente No. 3] Exp. Cell. Res. 316, 1422-8, 2010
[Referencia no patente No. 4] EMBO J. 36, 151-164, 2017
Referencias de patente
[Referencia de patente No. 1] US 2009/198336 A1
[Referencia de patente No. 2] JP 2012-249556 A
Sumario de la invención
Problema por resolver mediante la invención
Hasta el momento no se ha reportado una técnica que permita la producción a gran escala de células madre epiteliales que posean inductividad del folículo piloso mediante cultivoin vitrode las mismas.
Es, por lo tanto, un objetivo de la presente invención proporcionar un medio para el crecimiento eficiente de células epiteliales que se puedan utilizar para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados.
Medios para resolver el problema
Como resultado de intensos y repetidos esfuerzos para resolver los problemas anteriores, el(los) presente(s) inventor(es) establecieron que el uso de un medio de cultivo celular que comprende una combinación particular de aditivos para llevar a cabo el cultivo de células derivadas de tejido epitelial permitirá el uso de las mismas para la fabricación de gérmenes de folículos pilosos regenerados, es decir, que esto hará posible llevar a cabo la producción a gran escala de poblaciones de células epiteliales que poseen inductividad del folículo piloso, lo que culminó en la presente invención.
Un aspecto de la presente invención proporciona:
[1] un medio de cultivo para el crecimiento de células epiteliales capaz de ser utilizado para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados, comprendiendo el medio de cultivo medio basal y al menos (1) a (3), a continuación:
(1) al menos una especie de inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP);
(2) al menos una especie de factor de crecimiento de fibroblastos; y
(3) al menos una especie de erizo sónico (SHH) y/o agonista de SHH.
Varias realizaciones (características) del medio de cultivo de la presente invención son las siguientes, cuyas realizaciones también se reflejan en las reivindicaciones adjuntas 2-10:
[2] El medio de cultivo de acuerdo con [1], en el que
el inhibidor de BMP se selecciona del grupo que consiste en Nogina, Dorsomorfina, Cordina, Folistatina y Ectodina.
[3] El medio de cultivo de acuerdo con [1] o [2], en el que
el medio de cultivo comprende al menos dos especies del factor de crecimiento de fibroblastos.
[4] El medio de cultivo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], en el que
el factor de crecimiento de fibroblastos se selecciona del grupo que consiste en FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9 y FGF-10.
[5] El medio de cultivo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [4], en el que
el agonista de SHH se selecciona de entre SAG y Purmorfamina.
[6] El medio de cultivo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5], en el que
el medio de cultivo comprende adicionalmente (4) al menos una especie de ligando del receptor de la tirosina cinasa.
[7] El medio de cultivo de acuerdo con [6], en el que
el ligando del receptor de la tirosina cinasa se selecciona del grupo que consiste en EGF, TGFa, anfiregulina y factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF).
[8] El medio de cultivo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [7], en el que
el medio de cultivo comprende adicionalmente (5) al menos una especie del receptor TGFp/inhibidor de ALK5.
[9] El medio de cultivo de acuerdo con [8], en el que
el receptor TGFp/inhibidor de ALK5 se selecciona del grupo que consiste en SB431542, KY03-I, IWR-1-endo y A83-01.
[10] El medio de cultivo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9], en el que
el medio de cultivo no comprende Wnt ni el agonista de Wnt, y no comprende Notch ni agonista de Notch. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona:
[11] un método para el crecimiento de células epiteliales para uso en la fabricación de gérmenes de folículos pilosos regenerados, comprendiendo el método:
una operación en la cual se cultivan células derivadas de tejido epitelial en el medio de cultivo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [10].
A continuación, se describen diversas realizaciones (características) del método de la presente invención, cuyas realizaciones también se reflejan en las reivindicaciones adjuntas 12 y 13:
[12] El método de acuerdo con [11], en el que
las células derivadas del tejido epitelial son células que se obtienen ocasionando que el tejido epitelial recolectado se someta a un tratamiento para la desagregación en células individuales.
[13] El método de acuerdo con [11] o [12], en el que el tejido epitelial es el tejido epitelial de la región de la protuberancia del folículo piloso.
Cualquier combinación deseada de una o más de las características de la presente invención tal como se identifican anteriormente en la presente memoria también está incluida dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Beneficio de la invención
La presente invención hace posible proporcionar un medio de cultivo para el crecimiento eficiente de células epiteliales capaces de ser utilizadas para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados, así como un método para utilizar el medio de cultivo para crecer eficientemente dichas células epiteliales.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra imágenes de cultivos después de 6 días de cultivo cuando las células epiteliales foliculares de cabello murino se cultivaron respectivamente en medio de cultivo NFFSE, medio de cultivo NFFS y medio de cultivo NFFS Wnt Notch.
La figura 2 muestra los resultados de la medición de (A) la eficiencia de siembra, (B) las veces de la expansión y (C) el tamaño del esferoide después de 5 días de cultivo cuando las células epiteliales foliculares de cabello murino se cultivaron respectivamente en medio de cultivo NFFSE, medio de cultivo NFFS y medio de cultivo NFFS Wnt Notch.
La figura 3 muestra los resultados del análisis de marcadores cuando las células epiteliales foliculares de cabello murino cultivadas se cultivaron respectivamente en medio de cultivo NFFSE, medio de cultivo NFFS y medio de cultivo NFFS Wnt Notch.
La figura 4 muestra (C) resultados cuantitativos y (B) crecimiento representativo de cabello nuevo cuando se evaluó la inductividad del órgano mediante el empleo de (A) trasplante intracutáneo de gérmenes de folículos pilosos regenerados reconstruidos a partir de células epiteliales foliculares de cabello murino cultivadas respectivamente en medio de cultivo NFFSE, medio de cultivo NFFS y medio de cultivo NFFS Wnt Notch. En la figura, GT indica el hilo guía, E indica el agregado de células epiteliales y DP indica el agregado de células de la papila dérmica.
La figura 5 muestra imágenes de cultivos y números de células adquiridas por folículo después de 10 días y después de 20 días de cultivo cuando las células epiteliales foliculares de cabello humano se cultivaron en medio de cultivo NFFS.
La figura 6 muestra los resultados del análisis de marcadores de células madre cuando se cultivaron células epiteliales foliculares de cabello murino (después de 6 días de cultivo) y se cultivaron células epiteliales foliculares de cabello humano (después de 20 días de cultivo) en medio de cultivo NFFSE o medio de cultivo NFFS.
La figura 7 muestra (B) los resultados del análisis histoquímico y (A) el método experimental para la evaluación de la inductividad del órgano de las células epiteliales foliculares de cabello humano cultivadas en medio de cultivo NFFS.
Realizaciones para llevar a cabo la invención
A continuación, se describen en detalle las realizaciones de la presente invención. Como se señaló anteriormente en la presente memoria, un aspecto de la presente invención se refiere a un medio de cultivo (en adelante también denominado como el medio de cultivo de la presente invención) para el crecimiento de células epiteliales capaces de ser utilizadas para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados.
Los gérmenes del folículo piloso son tejido derivado de los folículos pilosos y están formados por células epiteliales y células mesenquimales. Los gérmenes de los folículos pilosos se forman durante la etapa embrionaria cuando una porción de la epidermis se engrosa y las células mesenquimales a las que se enfrentan se aglomeran.
En el contexto de la presente invención, el término "germen del folículo piloso regenerado" se refiere a un germen del folículo piloso que ha sido inducido y/o regenerado artificialmente a partir de célula(s) epitelial(es) y/o célula(s) mesenquimal(es).
En el contexto de la presente invención, el término "capaz de ser utilizado para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados" significa al menos capaz de inducir germen(es) de folículos pilosos regenerados que poseen tricogenicidad cuando se utilizan con célula(s) mesenquimal(es) apropiadas para fabricar germen(es) de folículos pilosos regenerados. Esto es, en el contexto de la presente invención, no se pretende con ello el mero crecimiento de células derivadas de tejido epitelial (por ejemplo, folículos pilosos), ni el crecimiento de células epiteliales que inducen únicamente gérmenes de folículos pilosos regenerados que no poseen tricogenicidad.
En el contexto de otra realización de la presente invención, el término "capaz de ser utilizado para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados" significa permitir la fabricación de gérmen(es) de folículos pilosos regenerados que tienen una alta tasa de supervivenciain vivoy poseen tricogenicidad cuando se utilizan para fabricar gérmen(es) de folículos pilosos regenerados. Aquí, "tener una alta tasa de supervivenciain vivo"puede significar al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, o más preferiblemente al menos 95%.
Un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque comprende medio basal y al menos (1) a (3), a continuación:
(1) al menos una especie de inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP);
(2) al menos una especie de factor de crecimiento de fibroblastos; y
(3) al menos una especie de erizo sónico (SHH) y/o agonista de SHH.
El medio basal se refiere a un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sal(es) inorgánica(s), y así sucesivamente, los cuales son esenciales para el cultivo de células, particularmente células de mamíferos (por ejemplo, humanas). Como medio basal que se puede utilizar en medio de cultivo de acuerdo con la presente invención, es posible utilizar cualquier medio de cultivo tal como que se puede utilizar ordinariamente en el cultivo de células animales; y aunque no hay limitación con respecto a esto, se pueden citar como ejemplos el Medio de Eagle y otros medios esenciales mínimos (MEM), Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo a (MEM-a), Medios F-12 y F-10 de Ham, Medio DMEM/F12, Medio E de Williams, Medio RPMI-1640, Medio MCDB, Medio 199, Medio de Fischer, Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), Medio modificado de McCoy, Medio DEF-CS, Medio CnT-PR, Medio DMEM Avanzado, Medio MEM Avanzado, Medio DMEM/F12 Avanzado, así como los medios que son combinaciones de los mismos.
Como inhibidor (1) de BMP que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, siempre que sea capaz de frustrar o inhibir la unión de las moléculas de BMP a los receptores de BMP, no existe ninguna limitación particular con respecto al mismo. Se puede determinar si una molécula o compuesto posee o no actividad inhibidora de BMP utilizando un método conocido por los expertos en la técnica (Zilberberg et al., BMC Cell Biol, 8:41, 2007) para medir la actividad transcripcional de BMP
Como inhibidor de BMP que se puede utilizar en medio de cultivo de acuerdo con la presente invención, si bien no existe limitación con respecto a la misma, se pueden citar como ejemplos Nogina, Dorsomorfina, Cordina, Folistatina y Ectodina, y así sucesivamente. En los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, cualquier especie de inhibidor de BMP se puede utilizar sola o se puede utilizar una pluralidad de ellas en combinación.
La concentración de inhibidor de BMP contenida en el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención puede estar dentro del intervalo de 0.1 ng/mL a 1000 ng/mL, preferiblemente de 0.3 ng/mL a 300 ng/mL, y más preferiblemente de 1 ng/mL a 100 ng/mL.
Como (2) factor de crecimiento de fibroblastos que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, si bien no existe limitación con respecto al mismo, se pueden citar como ejemplos FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9 y FGF-10. En los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, cualquier especie de factor de crecimiento de fibroblastos se puede utilizar sola o se puede utilizar una pluralidad de ellas en combinación. De acuerdo con otra realización de la presente invención, como factor de crecimiento de fibroblastos, se utilizan al menos dos especies de factor de crecimiento de fibroblastos en combinación.
De acuerdo con una realización de la presente invención, como factor de crecimiento de fibroblastos, se utiliza al menos FGF-7.
La concentración del factor de crecimiento de fibroblastos contenido en los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención puede estar dentro del intervalo de 0.1 ng/mL a 1000 ng/mL, preferiblemente de 0.3 ng/mL a 300 ng/mL, y más preferiblemente de 1 ng/mL a 100 ng/mL.
Como agonista (3) de SHH que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, siempre que sea capaz de regular positivamente la señalización mediada por SHH, no existe ninguna limitación particular con respecto al mismo. Se puede determinar si alguna molécula o compuesto posee o no actividad agonista de SHH, por ejemplo, utilizando un método como el sugerido en la Publicación de solicitud de patente japonesa Kokai No. 2009-213442.
Como agonista de SHH que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, si bien no existe ninguna limitación con respecto a esto, se pueden citar como ejemplos sAg y Purmorfamina.
La concentración de SHH y/o agonista de SHH contenida en los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención puede estar dentro del intervalo de 0.1 ng/mL a 1000 ng/mL, preferiblemente de 0.3 ng/mL a 300 ng/mL, y más preferiblemente de 1 ng/mL a 100 ng/mL.
En una realización, un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente (4) al menos una especie de ligando de la tirosina cinasa del receptor. Se prefiere que un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención comprenda adicionalmente un ligando del receptor de la tirosina cinasa debido al hecho de que permitirá una mejora marcada en la tasa de supervivencia cuando los gérmenes del folículo piloso regenerado que se fabrican finalmente se trasplantenin vivo.
Como ligando del receptor de la tirosina cinasa que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, si bien no existe ninguna limitación con respecto al mismo, se pueden citar como ejemplos EGF, TGFa, anfiregulina y factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF).
La concentración del ligando de la tirosina cinasa del receptor contenida en los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención puede estar dentro del intervalo de 0.1 ng/mL a 1000 ng/mL, preferiblemente de 0.3 ng/mL a 300 ng/mL, y más preferiblemente de 1 ng/mL a 100 ng/mL.
En una realización, un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente (5) al menos una especie de receptor TGFp/inhibidor de ALK5. Como receptor TGFp/inhibidor de ALK5 que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, siempre que sea capaz de inhibir la interacción entre el receptor TGFp y ALK5, no existe ninguna limitación particular con respecto al mismo, siendo posible que esto incluya el inhibidor del receptor TGFp y el inhibidor de ALK5.
Como receptor TGFp/inhibidor de ALK5 que se puede utilizar en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, si bien no existe ninguna limitación con respecto al mismo, se pueden citar como ejemplos SB431542, A83-01, inhibidor de ALK5, D4476, LY364947, SB525334 y SD208.
La concentración del receptor TGFp/inhibidor de ALK5 contenida en los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención puede estar dentro del intervalo de 0.001 ng/mL a 1000 ng/mL, preferiblemente de 0.01 ng/mL a 100 ng/mL, y más preferiblemente de 0.1 ng/mL a 10 ng/mL.
Los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención pueden, además de los anteriores (1) a (3), y opcionalmente (4) y/o (5), contener otro(s) componente(s) para la optimización de los medios de cultivo celular, y en particular de los medios de cultivo celular para células epiteliales. Como tales otros componentes para la optimización de medios de cultivo celular, si bien no existe ninguna limitación con respecto a esto, Glutamax™, suplemento B27 (GIBCO), suplemento N2 (GIBCO) y otros sustitutos del suero similares, Y-27632 y otros inhibidores de Rock similares se pueden citar como ejemplos.
Se prefiere que los medios de cultivo de acuerdo con la presente invención no contengan aditivos que promuevan la inducción de diferenciación y/o crecimiento distintos de los anteriores (1) a (5). Como otros aditivos, si bien no existe limitación con respecto a la presente, se pueden citar como ejemplos Wnt y agonistas de Wnt y Notch y agonistas de Notch. Si una molécula o compuesto posee o no actividad Wnt se puede determinar, por ejemplo, utilizando el método descrito en Korinek et al., Science 275 1784-1787, 1997 para medir la actividad transcripcional de Wnt, y si alguna molécula o compuesto posee o no actividad de Notch se puede determinar, por ejemplo, utilizando el método descrito en Hsieh et al., Mol. Cell. Biol. 16, 952-959, 1996 para medir la actividad transcripcional de Notch.
En una realización ejemplar de la presente invención, un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención está compuesto sustancialmente de medio basal, una combinación de los siguientes aditivos y otros componentes para la optimización de los medios de cultivo celular, y no contiene otros aditivos que promuevan la inducción de la diferenciación y/o el crecimiento: Nogina, EGF, FGF-7, FGF-10, SAG.
En otra realización ejemplar de la presente invención, un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención está compuesto sustancialmente de medio basal, una combinación del o los siguientes aditivos y otro(s) componente(s) para la optimización de los medios de cultivo celular, y no contiene otros aditivos que promuevan la inducción de la diferenciación y/o el crecimiento: Nogina, FGF-7, FGF-10, SAG.
En el contexto de la presente invención, cabe señalar que estar "sustancialmente compuesto de" algún(os) constituyente(s) significa que otro(s) aditivo(s) puede estar presente en el mismo en la medida en que dicho(s) otro(s) aditivo(s) no impida la obtención de resultados similares a los que se obtendrían si la totalidad estuviera "compuesta únicamente de" esos constituyentes en cuanto a la capacidad de fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados que posean inductividad de folículos pilosos y/o provoquen el crecimiento de células epiteliales.
Como se señaló anteriormente en la presente memoria, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método (en adelante también denominado como el método de la presente invención) para el crecimiento de células epiteliales para uso en la fabricación de gérmenes de folículos pilosos regenerados.
Un método de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque comprende una operación en la que se cultivan células derivadas de tejido epitelial en un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, las células derivadas de tejido epitelial se pueden preparar típicamente a partir de folículos pilosos, siendo posible, por ejemplo, utilizar epitelio de folículo piloso inducido a partir de células ES o células iPS, y la matriz del cabello, la región de la protuberancia (por ejemplo, células en la capa más externa de la vaina radicular externa en la región de la protuberancia).
Como tejido epitelial que se puede utilizar en métodos de acuerdo con la presente invención, este se puede recolectar de cualquiera de varios tipos de animales, incluyendo no solo primates mamíferos (por ejemplo, humanos, monos, etc.), ungulados (por ejemplo, cerdos, vacas, caballos, etc.) y pequeños roedores mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, etc.), sino también, por ejemplo, perros y gatos. Con respecto a la recolección de tejido epitelial, las condiciones empleadas ordinariamente para la recolección de tejido se pueden adoptar sin alteración, siendo posible realizar la extracción bajo condiciones estériles y el almacenamiento se puede realizar utilizando una solución conservante apropiada.
La preparación de células derivadas de tejido epitelial que proviene de folículos pilosos podría, por ejemplo, llevarse a cabo haciendo que los folículos pilosos que primero han sido aislados del tejido circundante se separen en tejido epitelial y tejido mesenquimal dependiendo de la morfología de los mismos. En ese momento, se puede emplear enzima(s) para facilitar la separación. Como enzima(s) se pueden citar dispasa, colagenasa, tripsina y/u otra(s) sustancia(s) conocida(s) similar(es), siendo posible que un experto en la técnica emplee la(s) enzima(s) preferible(s) según corresponda.
Adicionalmente, como las células derivan del tejido epitelial, es posible emplear células derivadas de fuente(s) distinta(s) a los folículos pilosos. Como células derivadas de fuente(s) distinta(s) a los folículos pilosos, si bien no existe ninguna limitación con respecto a esto, se pueden citar células epiteliales de la piel o de la mucosa intraoral o de la encía, preferiblemente células precursoras epiteliales inmaduras capaces de diferenciarse en células epiteliales diferenciadas, por ejemplo, queratinizadas o paraqueratinizadas, de la piel o de la mucosa, tales como, por ejemplo, células epiteliales no queratinizadas o células madre de las mismas. Más específicamente, se describen ejemplos de uso de células epiteliales intraorales o células de cultivo primario de las mismas como células epiteliales como se describe en Publicación de solicitud de patente japonesa Kokai No. 2008-29756.
Al no existir ninguna limitación particular con respecto a la(s) fuente(s) de célula(s) ES que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención, se pueden emplear células ES derivadas de masa(s) celulares internas de todo tipo de animal(se). Por ejemplo, como fuente(s) de células ES, se pueden emplear células ES derivadas de masa(s) celular(es) internas de humanos, ratones, ratas, perros, gatos, conejos, vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos y/o monos.
"Célula iPS (célula madre pluripotente inducida)" se refiere generalmente a una célula a la que se le ha otorgado una pluripotencia tal que se le permitirá diferenciarse en un gran número de células después de la manera de una célula ES, y con una autorreplicabilidad tal que permitirá que la pluripotencia se mantenga a pesar de la división y proliferación como resultado de la introducción, por ejemplo, de múltiples tipos de genes y/o fármacos en una célula somática. Sin embargo, cabe señalar que la presente invención no se limita a la explicación anterior, sino que incluye ampliamente células que los expertos en la técnica considerarían "células iPS".
Al no existir ninguna limitación particular con respecto a la(s) fuente(s) de célula(s) iPS que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención, se pueden emplear células iPS derivadas de todo tipo de animal(es). Por ejemplo, como fuente(s) de células iPS, se pueden emplear células iPS derivadas de humanos, ratones, ratas, perros, gatos, conejos, vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos y/o monos. Además, al no existir ninguna limitación particular con respecto a las células somáticas que sirven como fuente(s) de células iPS que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención, se pueden emplear células iPS inducidas a partir de células derivadas de todo tipo de tejido(s). Además, al no existir ninguna limitación particular con respecto al método mediante el cual se pueden inducir las células iPS empleadas de acuerdo con la presente invención, siempre que sea un método que permita inducir células iPS a partir de células somáticas, se pueden emplear células iPS inducidas mediante el empleo de cualquier tipo de método.
Dónde se recolectan células derivadas del tejido epitelialin vivose utilizan como células derivadas del tejido epitelial, se prefiere que el tratamiento para su desagregación en células individuales se realice antes de que éstas estén disponibles para el cultivo. En el contexto de la presente invención, "desagregación en células individuales" se refiere a la separación de una pluralidad de células (normalmente de tejido u órgano) que están en un estado mutuamente unidas o adheridas en células individuales. Como tal tratamiento para la desagregación en células individuales, se pueden emplear métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica; si bien no existe limitación al respecto, esto se puede llevar a cabo mediante un tratamiento enzimático. Los expertos en la técnica conocen las enzimas que se pueden utilizar para dicho tratamiento enzimático y las condiciones bajo las que estas se pueden utilizar, siendo posible, por ejemplo, utilizar dispasa, colagenasa, tripsina y/u otra(s) enzima(s) similar(es). Se prefiere la desagregación en células individuales desde el punto de vista de promover eficientemente el crecimiento de las células epiteliales deseadas.
De acuerdo con una realización preferible de la presente invención, las células derivadas del tejido epitelial son células derivadas del epitelio de la región abultada. Estas células se pueden preparar recolectando tejido del epitelio de la región de la protuberancia (por ejemplo, la capa más externa de la vaina radicular externa) y sometiéndolo a un tratamiento para desagregarlo en células individuales.
Las condiciones empleadas habitualmente para el cultivo de células animales se pueden emplear para el cultivo de células derivadas de tejido epitelial en medios de cultivo de acuerdo con la presente invención, siendo posible, por ejemplo, emplear un cultivo que se lleva a cabo en una incubadora que tiene una concentración de CO<2>al 5% y una temperatura de aproximadamente 37° C. Además, se pueden agregar estreptomicina y/u otros antibióticos similares según sea apropiado.
Para el cultivo se pueden emplear, según sea apropiado, matrices extracelulares conocidas por los expertos en la técnica, siendo posible, por ejemplo, utilizar Matrigel™ (Corning), Colágeno Tipo IV (Invitrogen), Atelocolágeno (Koken), Colágeno Tipo I y Colágeno Tipo III.
Las poblaciones de células epiteliales cultivadas de acuerdo con los métodos anteriores son poblaciones de células epiteliales que poseen inductividad del folículo piloso, siendo posible utilizarlas tal cual, para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados, y siendo posible también, cuando sea necesario, emplear técnicas que impliquen selección negativa y/o positiva basada en marcador(es) de superficie para aislar aún más poblaciones de células epiteliales particulares. Los expertos en la técnica también conocen técnicas que implican una selección negativa y/o positiva basada en marcadores de superficie, siendo posible, por ejemplo, emplear técnicas basadas en cualquier anticuerpo o anticuerpos deseados, incluyendo la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y/o la separación con perlas magnéticas.
Salvo que se establezcan definiciones específicas, la terminología empleada en la presente memoria descriptiva se utiliza con el propósito de describir realizaciones específicas, y no se pretende que la invención quede limitada por ellas.
Además, salvo que del contexto resulte claro que se pretende un sentido diferente, el término "comprender", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, debe de entenderse en el sentido de que el elemento al que se hace referencia (miembro, paso, elemento, número, etc.) está presente y no que se excluye la presencia de otros elementos (miembros, pasos, elementos, números, etc.).
Excepto que se defina lo contrario, todos los términos utilizados en la presente memoria (incluyendo términos técnicos y científicos) tienen el mismo significado que entendería en términos generales una persona experta en la técnica a la que pertenece la presente invención. Excepto que se establezca explícitamente una definición diferente, la terminología utilizada en la presente memoria se debe de interpretar como si tuviera un significado consistente con el significado empleado en la presente memoria descriptiva y los campos de la técnica relacionados, y no se debe de interpretar en un sentido idealizado o excesivamente formal.
A continuación, se describe la presente invención con más detalle con referencia a los ejemplos funcionales. Sin embargo, téngase en cuenta que, como la presente invención se puede implementar en una amplia variedad de formas, no se debe de interpretar como limitada por los ejemplos funcionales que se describen en la presente memoria.
Ejemplos funcionales
(Ejemplo funcional 1) Método para el cultivo de células epiteliales foliculares de cabello murino
1) Animales experimentales
Se recolectaron folículos pilosos de ratones C57BL/6 (CLEA Japan) y de ratones C57BL/66-TgN (act-EGFP) de 7-8 semanas de edad. Además, se recolectó piel que contenía gérmenes de pelos corporales de ratones C57BL/66-TgN (act-EGFP) (SLC) de edad embrionaria de 18.0 a 18.5 días. Además, los gérmenes de folículos pilosos regenerados preparados de acuerdo con el siguiente procedimiento experimental se injertaron en ratones Balb/c nu/nu (SLC) de 6 a 8 semanas de edad.
2) Preparación de células epiteliales foliculares pilosas
Se utilizó una aguja de inyección de 25G para extraer la vaina de colágeno del tejido de los bigotes extraído de ratones C57BL/6 EGFP, y esta se subdividió en una porción correspondiente a la región de la protuberancia. Se permitió que el tejido de la región de la protuberancia reaccionara durante 4 minutos a 37 °C en una solución en la cual la concentración final de Dispasa II (Becton Dickinson) era 4.8 U/ml y de Colagenasa (Worthington; Lakewood NJ) era 100 U/ml, después de lo cual se utilizó una aguja de inyección de 25G para separar quirúrgicamente esto en tejido epitelial de la región de la protuberancia y tejido mesenquimal de un área periférica a la protuberancia. El tejido epitelial de la región de la protuberancia separada se sometió a tratamiento enzimático durante 1 hora en una incubadora con Tripsina al 0.05% (Invitrogen; Carlsbad, US), la desagregación en células individuales se llevó a cabo haciéndole pasar a través de un colador de células que tenía poros de 35-pm.
El cultivo de células individuales desagregadas se llevó a cabo utilizando ADVANCED DMEM/F-12 (ThermoFisher) como medio basal, con Matrigel (Corning) siendo empleado como andamiaje, haciendo que las células se suspendieran en un medio de cultivo (medio de cultivo NFFSE) que contenía aditivos en la forma de suplemento B27 (GIBCO), suplemento N2 (GIBCO), inhibidor de Rock (Y27632; WAKO), EGF (Peprotech), f Gf-7 (R&D), FGF-10 (R&D), agonista de Sh H (sAg ; cayman) e inhibidor de BMP (Nogina; Peprotech), así como penicilina-estreptomicina (GIBCO) al 1%; en un medio de cultivo (medio de cultivo NFFS) idéntico al medio de cultivo NFFSE excepto que EGF no estaba presente; y en un medio de cultivo (medio de cultivo NFFS Wnt Notch) idéntico al medio de cultivo NFFS excepto que Wnt3a (R&D) y el ligando Notch (Jagged2 y DLL1) (R&D) estaban presentes adicionalmente, después de lo cual se realizó un cultivo tridimensional en una placa de 6 pocillos. Las imágenes de cultivo se muestran en la Figura 1, los resultados de la medición de la eficiencia de siembra, el tamaño del esferoide y las veces de la expansión después de 5 días de cultivo se muestran en la Figura 2. Bajo condiciones distintas a las empleadas para el medio de cultivo NFFSE, se formaron colonias más pequeñas.
Se recuperó un gel que contenía células epiteliales foliculares pilosas cultivadas en las cuales se realizó un cultivo tridimensional, se realizó una digestión con Colagenasa I (Worthington), una digestión con Tripsina (GIBCO) y una digestión con DNasa Tipo I (Worthington) y después de suspenderlo en medio de cultivo, se le hizo pasar a través de un colador de células de 35-pm para obtener células epiteliales foliculares de cabello murino cultivadas.
3) Análisis de la diferenciación de células epiteliales foliculares pilosas cultivadas derivadas de folículos pilosos de ratón
Antes de evaluar la diferenciabilidad de las células epiteliales del folículo piloso, se realizó un análisis de PCR en tiempo real para evaluar la diferenciación de las células epiteliales del folículo piloso después del cultivo.
La extracción de ARN de las células epiteliales foliculares pilosas cultivadas se llevó a cabo utilizando un Micro Kit RNeasy Plus (QUIAGEN), utilizándose una MasterMix SuperScript VILO (Invitrogen) para sintetizar ADNc a partir del ARN obtenido. Se realizó PCR en tiempo real utilizando el ADNc anterior como templado con una Master Mix TaqManFast Advanced (applied biosystem) y una mezcla líquida de cebadores Taqman para los diversos marcadores en un QuantStudio 12K Flex (applied biosystem) para provocar la reacción de PCR (20 segundos a 95 °C, (1 segundo a 95 °C, 20 segundos a 60 °C) x 40 ciclos), y se analizó el grado en el que se expresaron los genes marcadores.
Los resultados del análisis de la expresión de marcadores de diferenciación y marcadores de células madre para células epiteliales foliculares pilosas cultivadas utilizando medio de cultivo NFFSE, medio de cultivo NFFS o medio de cultivo NFFS Wnt Notch se muestran en la Figura 3. Para las células cultivadas en medio de cultivo NFFS, los marcadores secundarios de germen piloso (Lgr5 y P-cadherina) y el marcador de bulbo piloso (Lef1) se expresaron en un alto grado; para las células cultivadas en medio de cultivo NFFS Wnt Notch, se observó una fuerte inducción de marcadores de glándulas sebáceas (Blimp1, c-myc y PPAR-y) y marcadores de epidermis (CK1 y Loricrina); para las células cultivadas en medio de cultivo NFFSE, se mantuvieron los niveles de CD34, CD49f y otros marcadores de células madre similares.
4) Evaluación de la inductividad del órgano de las células epiteliales foliculares de cabello murino
Para evaluar la inductividad del órgano de las células epiteliales foliculares pilosas cultivadas, se utilizó el método de generación de yemas de órganos para reconstruir los gérmenes de los folículos pilosos regenerados, realizándose el análisis utilizando como un indicador la tricogenicidad posterior al trasplante en animales.
La preparación de los gérmenes de folículos pilosos regenerados se llevó a cabo de acuerdo con el método de generación de yemas de órganos (Patente japonesa No. 5932671). Es decir, las células de la papila dérmica cultivadas y las células epiteliales foliculares de cabello murino que se obtuvieron se transfirieron respectiva e individualmente a microtubos de 1.5-ml (Eppendorf) recubiertos con grasa de silicona (Dow Corning Toray), después de lo cual se realizó la separación centrífuga, recuperándose la fracción precipitada y utilizándose una punta GELoader de 0.5-20-pl (Eppendorf) para eliminar completamente la solución de cultivo sobrenadante después de la centrifugación. A continuación, se vertieron 30 ml de matriz celular tipo I-A (gelatina Nitta; Osaka, Japón) en una placa de Petri recubierta con grasa de silicona para preparar una gota de gel de colágeno, y se utilizó una punta de pipeta de 0.1-10-pl (Quality Scientific Plastics) para inocularla con en el orden de 0.2 pl de las células de papila dérmica cultivadas que se prepararon anteriormente para preparar un agregado celular. Posteriormente se utilizó una punta de pipeta de 0.1-10-pl (Quality Scientific plastics) para inocular el interior de la misma gota de gel con en el orden de 0.2 pl de las células epiteliales que se prepararon anteriormente, de tal manera que se adhirieran al agregado de células de la papila dérmica cultivada, para preparar un agregado celular. Además, mientras se utilizaba un microscopio estereoscópico para confirmar la colocación apropiada, se insertó un hilo de nailon (Matsuda Ika Kogyo) de una longitud total de 5 mm desde el lado de las células epiteliales del agregado celular que comprendía células de papila dérmica cultivadas y células epiteliales de tal manera que penetrara verticalmente la superficie de contacto entre la fracción de células de papila dérmica cultivadas y la fracción de células epiteliales sin alterar la estructura (particularmente la superficie de contacto entre las células epiteliales y las células mesenquimales) del agregado celular, después de lo cual se dejó reposar sin tocar durante 5 minutos a 37 °C y se dejó que la gota de gel se solidificara para hacer que la unión entre las células epiteliales y las células mesenquimales se fortaleciera aún más para preparar un germen de folículo piloso regenerado que tenga una guía.
Después de un período de cultivo de 8 a 16 horas, se realizó el trasplante intracutáneo del germen del folículo piloso en la piel de un ratón de acuerdo con el método convencional. Es decir, se anestesió a un ratón desnudo de la forma habitual y, tras la desinfección del dorso con Isodine, se le hizo asumir una postura reclinada natural. Se utilizó un microbisturí V-lance (Alcon Japón) para perforar la piel, el injerto que se formó se extendió desde la capa epidérmica de la piel hasta la capa subdérmica. El injerto se extendió hasta una profundidad de aproximadamente 400 pm en una dirección vertical desde la superficie del cuerpo, siendo en el orden de aproximadamente 1 mm en la dirección horizontal. Se utilizaron pinzas afiladas No. 5 (Natsume Seisakusho) para hacer que el germen del folículo piloso regenerado en el cual se insertó la guía hecha de hilo de nailon para que se insertara en el mismo de tal manera que el componente de células epiteliales se dirigiera hacia el lado de la superficie corporal del injerto. La profundidad del trasplante se ajustó de manera que la porción superior del componente de células epiteliales del germen del folículo piloso regenerado quedara expuesta en la porción superior del injerto, y la guía hecha de hilo de nailon se ubicó de manera que quedara expuesta en la superficie del cuerpo. La guía hecha de hilo de nailon se aseguró con SteriStrip (3M) a la superficie de la piel cerca del injerto, después de lo cual se utilizó Nurseban y cinta quirúrgica (3M) para proteger el injerto. De 5 a 7 días después del trasplante, se retiró la cinta protectora y se dejó la guía hecha de hilo de nailon en el lugar del trasplante, pero se retiró de allí 1 día después si aún permanecía. La supervivencia del material trasplantado se determinó mediante inspección visual o estereomicroscopía de fluorescencia, después de lo cual se realizó una observación de seguimiento. Se realizó una observación de seguimiento mediante inspección visual, estereomicroscopía de fluorescencia y microscopía estereoscópica para inspeccionar y fotografiar la ubicación trasplantada en el ratón anestesiado para evaluar el crecimiento de cabello nuevo del folículo piloso regenerado.
Como resultado, mientras que se observó un nuevo crecimiento de cabello en células cultivadas en medio de cultivo NFFSE y en medio de cultivo NFFS, no se observó un nuevo crecimiento de cabello en células cultivadas en medio de cultivo NFFS Wnt Notch, lo que indica que el cultivo de células epiteliales foliculares pilosas que poseen inductividad del órgano fue posible con medio de cultivo NFFSE o NFFs (Figura 4).
(Ejemplo funcional 2) Cultivo de células epiteliales foliculares pilosas derivadas de folículos pilosos humanos
1) Recuperación de células epiteliales de la protuberancia del folículo piloso a partir del tejido del cuero cabelludo humano
El tejido del cuero cabelludo humano extraído se lavó secuencialmente utilizando povidona yodada (Meiji Seika Pharma), PBS (Nacalai Tesque) y solución de recuperación de tejido (DMEM que contiene HEPES al 1%, 50 pg/mL de gentamicina y suero bovino al 10%), en ese orden. Se utilizó un bisturí para cortarlo en tiras, cada una de las cuales contenía folículos pilosos alineados en una sola fila, después de lo cual cada tira se separó adicionalmente en superior e inferior a lo largo de la superficie en el límite entre la capa dérmica y la capa de grasa subcutánea. La capa dérmica (tejido superior), que incluía células epiteliales de la protuberancia, se recuperó en una placa de cultivo y el tejido superior se cortó en trozos finos, cada uno de los cuales se convirtió en un solo poro folicular. Se mezclaron 1000 U/mL de Dispasa (Wako Pure Chemical) y Colagenasa (Worthington) y se añadieron al tejido que se había disgregado en folículos pilosos individuales, y se incubó durante 10 a 20 minutos a 37 °C. Después de lavar con 2 mL de solución de recuperación de tejido, se añadieron 2 mL de solución de recuperación de tejido y 1 pL de DNasa I (Worthington), y se dejó reposar de 1 a 2 minutos a temperatura ambiente. Se utilizaron pinzas para extraer el folículo piloso hacia arriba y la porción inferior producida como resultado del corte debajo de la glándula sebácea se recolectó en un tubo de centrífuga. La porción inferior se lavó dos veces con PBS mediante centrifugación. Se mezclaron y añadieron 100 pL de Tripsina al 2.5% (SAFC Bioscience) y 4.9 mL de PBS al mismo y esto se incubó durante 15 minutos a 37 °C, después de lo cual se agregaron 5 mL de solución de recuperación de tejido y 5 pL de DNasa I y se mezclaron suavemente. La suspensión celular que se obtuvo se hizo pasar a través de un colador de células de 40-pmde diámetro, efectuándose dos adiciones de 2 mL de solución de recuperación de tejido desde un lugar situado por encima del colador. La suspensión celular se centrifugó durante 3 minutos a 4 °C y 590 g, se descartó el sobrenadante y se añadió 1 mL de solución de recuperación de tejido al mismo. Se midió la concentración celular, tras lo cual una cantidad de suspensión celular suficiente para obtener 6 * 104 células/tubo se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5 mL. El tubo se centrifugó durante 3 minutos a 4 °C y 310 g, se descartó el sobrenadante y se le agregaron 600 pL/tubo de una solución de Atelocolágeno (Koken) al 1% y se mezcló con el mismo. Después de la centrifugación para eliminar las burbujas, los pocillos de una placa de 6 pocillos se sembraron respectivamente con 90 pL/pocillo de la suspensión celular. Después de permitir que el gel se solidificara durante en el orden de 30 minutos dentro de una incubadora, se le agregaron 3 mL/pocillo de medio de cultivo NFFSE humano que tenía la siguiente composición o medio de cultivo NFFS que era idéntico al medio de cultivo NFFSE excepto que EGF no estaba presente y se añadió al mismo, y se inició el cultivo en una incubadora de CO<2>: AD<v>A<n c>E<d>DMEM/F-12 (ThermoFisher), 1 M de HEPES, Glutamax (Thermo Fisher Scientific), suplemento N2 (Thermo Fisher Scientific), suplemento B27 (Thermo Fisher Scientific), 10 mM de Y-27632 (Wako Pure Chemical), 250 pg/mL de Nogina (Sigma), 100 pg/mL de FGF-7 (Millipore), 100 pg/mL de FGF-10 (Wako Pure Chemical), 20 ng/mL de EGF (Peprotech) y 500 pg/mL de SAG (Millipore). ;;2) Subcultivos de células epiteliales de la protuberancia del folículo piloso humano ;;Se utilizó un raspador de células para hacer que el gel en el que las células habían formado colonias se raspara de la placa de cultivo. El gel que se raspó del mismo se recuperó en un tubo de 50 mL y se agregaron 10 mL de medio de cultivo de células epiteliales humanas (ver arriba) al mismo. El gel se maceró físicamente mediante pipeteo y se añadió colagenasa al mismo. Este se incubó durante un tiempo máximo de 60 minutos a 37 °C hasta que el gel se disolvió completamente. Se agregaron 10 mL de PBS al mismo, esto se centrifugó durante 3 minutos a 4° C y 590 g y se descartó el sobrenadante, repitiéndose lo anterior tres veces. Después de aflojar la pella mediante golpeteo, se le añadió una solución de tripsina al 0.125%/10 pg/mL de DNasa I y se incubó durante 15 minutos a 37 °C. Se le añadieron 10 mL de medio de cultivo de células epiteliales humanas, esto se centrifugó durante 3 minutos a 4 °C y 590 g y se descartó el sobrenadante. Después de aflojar las células mediante golpeteo, se les agregó un medio de cultivo de células epiteliales humanas que contenía 5 pL de DNasa I. La suspensión celular que se obtuvo se hizo pasar por un colador celular de 40-pm-de diámetro y esto se centrifugó durante 3 minutos a 4 °C y 590 g. Después de descartar el sobrenadante, se le añadió 1 mL de medio de cultivo de células epiteliales humanas para obtener una suspensión celular. Se midió la concentración celular, tras lo cual una cantidad de suspensión celular suficiente para obtener 6 * 104 células/tubo se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5-mL. El tubo se centrifugó durante 3 minutos a 4 °C y 310 g, se descartó el sobrenadante y se le agregaron 600 pL/tubo de una solución de Atelocolágeno al 1% y se mezcló con el mismo. Después de la centrifugación para eliminar las burbujas, los pocillos de una placa de 6 pocillos se sembraron respectivamente con 90 pL/pocillo de la suspensión celular. Después de permitir que el gel se solidificara durante en el orden de 30 minutos dentro de una incubadora, se le agregaron 3 mL/pocillo de medio de cultivo de células epiteliales humanas y esto se cultivó adicionalmente en una incubadora de CO<2>. En la Figura 5 se muestran los números de células adquiridas por folículo y las imágenes de cultivo después de 10 y 20 días de cultivo.
3) Análisis de la diferenciación de células epiteliales foliculares pilosas cultivadas derivadas de folículos pilosos humanos
Se evaluó la diferenciación de células epiteliales foliculares pilosas cultivadas derivadas de humanos mediante análisis citométrico de flujo.
3-1) Análisis de marcadores intracelulares
Las células epiteliales foliculares pilosas cultivadas (después de 20 días de cultivo) se suspendieron en PBS -0.2 mM de EDTA - BSA al 0.05%, después de lo cual esto se centrifugó a 4 °C durante 5 minutos a 590 g, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en PFAal 4% o MeOH al 80%. La suspensión celular se incubó durante 10 minutos a 4 °C para inmovilizar la proteína intracelular. Después de la inmovilización, las células fueron resuspendidas en PBS - 0.2 mM de EDTA - BSA al 0.05%, tras lo cual se realizó un lavado a 4 °C durante 5 minutos a 1100 g) dos veces, después de lo cual esto se resuspendió en Triton X-100 al 0.1%, y esto se incubó durante 10 minutos a 4 °C para provocar su permeabilización. Después de la permeabilización, las células se lavaron dos veces y, posteriormente, se resuspendieron en una solución de PBS - 0.2 mM de EDTA - BSA al 0.05% que contenía anticuerpo etiquetado con PE-Cy7 específico para CD34 humano (BD) o anticuerpo etiquetado con eFlour 660 específico para CD49f humano (eBioScience), y esto incubó durante 15 minutos a 4 °C. Después de permitírsele reaccionar, las células se lavaron dos veces y, posteriormente, se utilizó un citómetro de flujo para realizar el análisis de las mismas. También se realizó un procedimiento similar al descrito anteriormente en células derivadas de tejido de bigotes murinos cultivados.
Los resultados se muestran en la Figura 6. Se encontró que las células epiteliales foliculares pilosas cultivadas comprendían poblaciones celulares que incluyen aquellas que eran CD34+ y CD49f+ (Figura 6).
4) Evaluación de la inductividad del órgano de las células epiteliales foliculares de cabello humano
Para evaluar la inductividad del órgano de las células epiteliales foliculares de cabello humano cultivadas, se utilizó tejido mesenquimal de piel embrionaria de ratón que se sabe que posee inductividad del órgano para llevar a cabo el método de generación de brotes de órganos para reconstruir los gérmenes de los folículos pilosos regenerados, el análisis se llevó a cabo utilizando la capacidad de crecimiento del cabello después del cultivoin vitrocomo indicador.
Las células mesenquimales de la piel de embriones de ratón se prepararon de acuerdo con el método convencional. Es decir, se recolectó piel dorsal de embriones de ratón EGFP de edad embrionaria de 18.0 a 18.5 días y el método reportado por Nakao et al. (Nakao K et al., Nat. Methods, 4(3), 227-30, 2007) fue modificado parcialmente, realizándose el tratamiento con dispasa mientras se sometía a agitación en condiciones de 55 rpm y 4 °C durante 1 hora para provocar la separación de la capa epitelial y la capa dérmica. La capa dérmica se sometió adicionalmente dos veces a tratamiento con 100 unidades/ml de colagenasa I (Worthington) durante 40 minutos a 37 °C, tras lo cual se realizó un tratamiento de desagregación en células individuales para obtener células mesenquimales de piel embrionaria de ratón. Las células mesenquimales de piel embrionaria de ratón y las células epiteliales foliculares de cabello humano que se obtuvieron se transfirieron respectiva e individualmente a microtubos de 1.5-ml (Eppendorf) recubiertos con grasa de silicona, después de lo cual se realizó una separación centrífuga, recuperándose la fracción precipitada y utilizándose una punta GELoader de 0.5-20 pl (Eppendorf) para eliminar completamente la solución de cultivo sobrenadante después de la centrifugación. A continuación, se colocaron gota a gota 30 pl de matriz celular tipo I-A (gelatina Nitta; Osaka, Japón) en una placa de Petri recubierta con grasa de silicona para preparar una gota de gel de colágeno, y se utilizó una punta de pipeta de 0.1-10 pl (Quality Scientific Plastics) para inocularla con en el orden de 0.2 pl de las células de papila dérmica cultivadas que se prepararon anteriormente para preparar un agregado celular. Luego se utilizó una punta de pipeta de 0.1-10 pl (Quality Scientific plastics) para inocular el interior de la misma gota de gel con en el orden de 0.2 pl de las células epiteliales que se prepararon anteriormente, de tal manera que se adhirieran al agregado de células de la papila dérmica cultivada, para preparar un agregado celular. Además, mientras se utilizaba un microscopio estereoscópico para confirmar la colocación correcta, se insertó un hilo de nailon (Matsuda Ika Kogyo) de 5 mm de longitud total desde el lado de las células epiteliales del agregado celular que comprendía células de papila dérmica y células epiteliales cultivadas de tal manera que penetrara verticalmente la superficie de contacto entre la fracción de células de papila dérmica cultivadas y la fracción de células epiteliales sin alterar la estructura (en particular, la superficie de contacto entre las células epiteliales y las células mesenquimales) del agregado celular, el gel de colágeno se transfirió en su totalidad a una ubicación sobre un inserto de cultivo celular de 0.4 ml de tamaño de poro (Becton Dickinson) que se había colocado en una placa de 6 pocillos (Becton Dickinson) en la que se había añadido 1 ml de DMEm FBS al 10%, el cultivo de órganos se llevó a cabo durante 7 días en una incubadora a 37 °C/CO<2>al 5% para preparar gérmenes de folículos pilosos regenerados.
Después del cultivo, los folículos pilosos regenerados se extrajeron del gel y se fijaron con paraformaldehído al 4%, después de lo cual se utilizó un procesador de tejidos (Leica; ASP300S) y un dispositivo de inclusión (Sakura; Tissue-Tek TEC) para llevar a cabo la inclusión en parafina, después de lo cual se utilizó un micrótomo para preparar una sección de 5 pm y se utilizó un anticuerpo específico para mitocondria humana (Millipore) para llevar a cabo la inmunotinción. Para analizar la sección inmunoteñida se utilizó un microscopio láser confocal LSM-780 (Carl-Zeiss). Los resultados se muestran en la Figura 7. Después de 7 días de cultivo, se indicó una estructura similar al tejido del folículo piloso en la cual las células derivadas de humanos estaban dispuestas de tal manera que rodeaban a las células derivadas de ratón, y en la cual las células de la matriz pilosa rodeaban a las células de la papila dérmica. Con base en los resultados anteriores, se piensa que las células epiteliales foliculares de cabello humano cultivadas formaron tejido folicular piloso como resultado de una interacción epitelio-mesenquimal con células derivadas de tejido mesenquimal de piel embrionaria de ratón, indicándose que las células epiteliales foliculares de cabello humano cultivadas poseen inductividad del órgano.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo para el crecimiento de células epiteliales capaz de ser utilizado para fabricar gérmenes de folículos pilosos regenerados, comprendiendo el medio de cultivo medio basal y al menos (1) a (3), a continuación:
(1) al menos una especie de inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP);
(2) al menos una especie de factor de crecimiento de fibroblastos; y
(3) al menos una especie de erizo sónico (SHH) y/o agonista de SHH.
2. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el inhibidor de BMP se selecciona del grupo que consiste en Nogina, Dorsomorfina, Cordina, Folistatina y Ectodina.
3. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que
el medio de cultivo comprende al menos dos especies del factor de crecimiento de fibroblastos.
4. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que
el factor de crecimiento de fibroblastos se selecciona del grupo que consiste en FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9 y FGF-10.
5. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que
el agonista de SHH se selecciona de entre SAG y Purmorfamina.
6. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que
el medio de cultivo comprende adicionalmente (4) al menos una especie de ligando del receptor de la tirosina cinasa.
7. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que
el ligando del receptor de la tirosina cinasa se selecciona del grupo que consiste en EGF, TGFa, anfiregulina y factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina.
8. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que
el medio de cultivo comprende adicionalmente (5) al menos una especie del receptor TGFp/inhibidor de ALK5.
9. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que
el receptor TGFp/inhibidor de ALK5 se selecciona del grupo que consiste en SB431542, KY03-I, IWR-1-endo y A83-01.
10. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que
el medio de cultivo no comprende Wnt ni agonista de Wnt, y no comprende Notch ni agonista de Notch.
11. Un método para el crecimiento de células epiteliales para uso en la fabricación de gérmenes de folículos pilosos regenerados, comprendiendo el método:
una operación en la cual se cultivan células derivadas del tejido epitelial en el medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que
las células derivadas del tejido epitelial son células que se obtienen ocasionando que el tejido epitelial recolectado se someta a un tratamiento para su desagregación en células individuales.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que
el tejido epitelial es el tejido epitelial de la región de la protuberancia del folículo piloso.
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