JP7444367B2 - 増幅毛包間葉系細胞の製造方法及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、増幅毛包間葉系細胞の製造方法及びその使用に関する。

非特許文献１には、ヒト毛包から分離した毛乳頭を培養液中プラスチックペトリディッシュ上に載置し、当該毛乳頭から当該ディッシュ底面上に毛乳頭細胞を遊走させて培養する初代培養法が記載されている。

非特許文献２には、in vitroにおいてヒト毛乳頭細胞の機能を維持するための培養法を検討した結果が記載されている。非特許文献２には、毛乳頭細胞の初代培養においてコンフルエントに到達したら細胞を回収し、６０ｍｍディッシュに２００００cells/dishの細胞密度で再播種したこと、及び、その後、さらに継代培養を行ったことも記載されている。

特許文献１には、ＦＧＦ系材料、ＢＭＰ－２／ＢＭＰ－４系材料及びＷＮＴ系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養することを特徴とする、毛誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法が記載されている。特許文献１には、一般に細胞の数を十分に確保するため、また、細胞の密度を適切に保ち、良好な増殖能力を維持するために、培養器具内で培養細胞が過密になる前に細胞を回収し、数を調整した後新しく培養するという継代が必要になることも記載されている。

特許文献２には、ａ）活力のある毛髪を調製する工程と、ｂ）工程ａ）で調製した毛髪を分割する工程と、ｃ）真皮毛乳頭と共に杯状様物質付着毛杯を単離する工程と、ｄ）前記毛杯から真皮毛乳頭を分離する工程と、ｅ）工程ｄ）で得た毛杯を培養する工程と、ｆ）コンフルエントな細胞をプールする工程とを含む、毛包間葉系幹細胞の単離方法が記載されている。特許文献２には、マウスの毛包から採取した杯状様物質付着ヘアボウル（ＤＳＣ）細胞を２４ウェル培養フラスコで培養し、コンフルエントに到達後、当該細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで分離し、２５ｍｌ培養フラスコに移すことを含む継代培養を行ったことが記載されている。

非特許文献３には、ヒト毛包から採取された毛乳頭細胞を二次元培養することによりin vivo特性が低下するのに対し、当該二次元培養で継代された当該毛乳頭細胞をハンギングドロップ法で培養してスフェロイドを形成すると、当該スフェロイドを構成する毛乳頭細胞のin vivo特性は回復することが記載されている。

国際公開第２０１０－０２１２４５号 特表２００５－５２８９１６号公報

A.G. MESSENGER, British Journal of Dermatology (1984) 110, 685-689 M. Ohyama et al., Journal of Cell Science (2012) 125, 4114-4125 Claire A. Higgins et al., PNAS (2013) vol.110, no.49, 19679-19688

従来、毛乳頭細胞の数を増幅するためには、当該毛乳頭細胞を二次元培養し、継代を繰り返すことが行われていた。しかしながら、二次元培養された毛乳頭細胞の毛髪再生能は大きく低下してしまうというのが技術常識であった。

一方、毛乳頭細胞を三次元培養、すなわち当該毛乳頭細胞からスフェロイドを形成して培養すると、当該スフェロイドを構成する毛乳頭の毛髪再生能は、ある程度まで回復する。しかしながら、スフェロイドを形成した毛乳頭細胞の数を増幅することは困難であった。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、その数が増幅され、且つ毛髪再生能が回復した毛包間葉系細胞及びその使用を提供することをその目的の一つとする。

［１］上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法の一側面は、基材表面に接着した毛包間葉系細胞を、コンフルエントな状態から、継代することなく培養する主工程を含み、前記主工程は、前記毛包間葉系細胞を、前記コンフルエントな状態から、さらに増殖させて、増殖した前記毛包間葉系細胞が前記基材表面の少なくとも一部において積み重なって２層以上の細胞層を形成するまで培養することを含む、増幅毛包間葉系細胞の製造方法である。本発明によれば、その数が増幅され、且つ毛髪再生能が回復した毛包間葉系細胞の製造方法が提供される。

［２］前記［１］の方法において、前記主工程は、前記コンフルエントな状態から１２０時間以上の時間が経過するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。［３］前記［１］又は［２］の方法において、前記主工程は、前記基材表面上の前記毛包間葉系細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上に到達するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。［４］前記［１］乃至［３］のいずれかの方法において、前記主工程は、前記基材表面上の前記毛包間葉系細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で５０時間以上、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。［５］前記［１］乃至［４］のいずれかの方法において、前記主工程は、前記基材表面上の前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記コンフルエントな状態におけるそれの１．５倍以上に到達するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。［６］前記［１］乃至［５］のいずれかの方法において、前記主工程は、前記毛包間葉系細胞の１以上の発毛関連遺伝子の発現量が前記コンフルエントな状態におけるそれの１．５倍以上に増加するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。

［７］前記［１］乃至［６］のいずれかの方法は、前記主工程に先立って実施される前工程をさらに含み、前記前工程は、前記基材表面上において、未だ前記コンフルエントな状態に到達していない前記毛包間葉系細胞を培養して、前記コンフルエントな状態に到達するまで前記毛包間葉系細胞を増殖させることを含むこととしてもよい。［８］前記［７］の方法において、前記前工程は、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の細胞密度で前記毛包間葉系細胞を培養して、前記コンフルエントな状態に到達するまで前記毛包間葉系細胞を増殖させることを含むこととしてもよい。［９］前記［７］又は［８］の方法において、前記主工程は、前記前工程における前記毛包間葉系細胞の培養の開始から２００時間以上の時間が経過するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。［１０］前記［７］乃至［９］のいずれかの方法において、前記主工程は、前記毛包間葉系細胞の１以上の発毛関連遺伝子の発現量が、前記前工程における前記毛包間葉系細胞の培養開始から２４時間が経過した時点のそれの１．１倍以上に増加するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含むこととしてもよい。

［１１］前記［１］乃至［１０］のいずれかの方法は、前記主工程において前記コンフルエントな状態から継代することなく前記基材表面上で培養して得られた毛包間葉系細胞を、前記基材表面から脱離させて回収する回収工程をさらに含むこととしてもよい。［１２］前記［１］乃至［１１］のいずれかの方法において、前記毛包間葉系細胞は、毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。

［１３］上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法の他の側面は、前記［１］乃至［１２］のいずれかの方法により製造された増幅毛包間葉系細胞を含む細胞凝集塊を形成することを含む、細胞凝集塊の製造方法である。本発明によれば、その数が増幅され、且つ毛髪再生能が回復した毛包間葉系細胞を含む細胞凝集塊の製造方法が提供される。

［１４］上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法のさらに他の側面は、前記［１］乃至［１２］のいずれかの方法により製造された増幅毛包間葉系細胞を含む移植用組成物を調製することを含む、移植用組成物の製造方法である。本発明によれば、その数が増幅され、且つ毛髪再生能が回復した毛包間葉系細胞を含む移植用組成物の製造方法が提供される。

［１５］上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法のさらに他の側面は、前記［１］乃至［１２］のいずれかの方法により製造された増幅毛包間葉系細胞を生体に移植することを含む、毛髪再生方法である。本発明によれば、その数が増幅され、且つ毛髪再生能が回復した毛包間葉系細胞を用いた毛髪再生方法が提供される。

本発明によれば、その数が増幅され、且つ毛髪再生能が回復した毛包間葉系細胞及びその使用が提供される。

実施例１の例１で培養した毛乳頭細胞のギムザ染色を示す説明図である。 実施例１の例Ｃ１培養した毛乳頭細胞（スフェロイド）の顕微鏡写真を示す説明図である。 実施例１で培養した毛乳頭細胞の数を定量した結果を示す説明図である。 実施例１で培養した毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現を定量した結果を示す説明図である。 実施例１の例１で培養した毛乳頭細胞の細胞層を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例１の例１においてフィブロネクチン及び細胞核を免疫蛍光二重染色した結果を示す説明図である。 図６Ａに示す蛍光二重染色画像のうち、フィブロネクチンの免疫蛍光染色画像のみを示す説明図である。 実施例１の例１においてＩ型コラーゲン及び細胞核を免疫蛍光二重染色した結果を示す説明図である。 図６Ｃに示す蛍光二重染色画像のうち、Ｉ型コラーゲンの免疫蛍光染色画像のみを示す説明図である。 実施例１の例１においてアルカリフォスファターゼ及び細胞核を免疫蛍光二重染色した結果を示す説明図である。 図６Ｅに示す蛍光二重染色画像のうち、アルカリフォスファターゼの免疫蛍光染色画像のみを示す説明図である。 実施例２の例２で培養した毛包間葉系細胞のギムザ染色を低倍率で観察した結果を示す説明図である。 実施例２の例２で培養した毛包間葉系細胞のギムザ染色を高倍率で観察した結果を示す説明図である。 実施例２の例Ｃ２培養した毛包間葉系細胞（スフェロイド）の顕微鏡写真を示す説明図である。 実施例２で培養した毛包間葉系細胞の数を定量した結果を示す説明図である。 実施例２で培養した毛包間葉系細胞のＡＬＰ遺伝子発現を定量した結果を示す説明図である。 実施例３の例３で培養した毛乳頭細胞を位相差顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例３の例Ｃ３で培養した毛乳頭細胞（スフェロイド）を位相差顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例３の例３で培養した毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を位相差顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例３の例Ｃ３で培養した毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を位相差顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例３の例３で培養した毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した結果を示す説明図である。 実施例３の例Ｃ３で培養した毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した結果を示す説明図である。 実施例３の例３で培養した毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊の移植部位に生えた毛を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例３の例Ｃ３で培養した毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊の移植部位に生えた毛を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す説明図である。 実施例３において毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した部位に生えた毛の数を定量した結果を示す説明図である。 実施例４の例４－１において移植後２１日目にヌードマウスの移植部位を撮影して得られた写真を示す説明図である。 実施例４の例４－２において移植後２１日目にヌードマウスの移植部位を撮影して得られた写真を示す説明図である。 実施例４の例４Ｃにおいて移植後２１日目にヌードマウスの移植部位を撮影して得られた写真を示す説明図である。 実施例４において移植後２１日目にヌードマウスの移植部位に生えていた毛髪の数をカウントした結果を示す説明図である。 実施例５においてＳＨＯマウスの移植部位における相対蛍光強度を評価した結果を示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。

本実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）は、その一側面として、基材表面に接着した毛包間葉系細胞を、コンフルエントな状態から、継代することなく培養する主工程を含む増幅毛包間葉系細胞の製造方法を包含する。

本方法の主工程は、基材表面に接着した毛包間葉系細胞を、コンフルエントな状態から、さらに増殖させて、増殖した当該毛包間葉系細胞が当該基材表面の少なくとも一部において積み重なって２層以上の細胞層を形成するまで培養することを含むことが好ましい。

ここで一般に、接着性の細胞をin vitroで二次元培養して、その数を増幅させる場合には、まず当該細胞を細胞接着性の基材表面上に当該細胞の増殖に適した低密度で播種し、次いで当該基材表面に接着した細胞を培養して増殖させ、その後、好ましくはコンフルエントに到達する前に、又は遅くともコンフルエントに到達した時点で継代する方法が用いられる。

なお、「継代」とは、上述のように、まずは細胞を基材表面で二次元培養して増殖させ、次いでコンフルエントに到達する前に又はコンフルエントに到達した時点で、当該細胞を当該基材表面から脱離させて回収し、その後、回収された当該細胞を新たな基材表面に播種しなおす操作である。そして従来、in vitroで毛乳頭細胞等の毛包間葉系細胞の数を増幅する場合においても、上述のように当該毛包間葉系細胞を二次元培養して継代する方法が用いられていた。

これに対し、本発明の発明者らは、毛包間葉系細胞（以下、「ＨＦＭ細胞」という。）の数の増幅と、毛髪再生能の維持又は回復との両方を達成するための技術的手段について検討した結果、意外にも、ＨＦＭ細胞を、コンフルエントの状態から、継代することなく、さらに増殖させて培養することにより、当該ＨＦＭ細胞の数を増幅させながら、その毛髪再生能を効果的に回復させることができることを独自に見出し、本発明を完成するに至った。

ＨＦＭ細胞は、毛髪再生能を有する間葉系細胞である。すなわち、例えば、ＨＦＭ細胞は、生体に移植された場合に、当該ＨＦＭ細胞が移植された部位における発毛を促進する。具体的に、生体に移植されたＨＦＭ細胞は、例えば、発毛を促進する因子（例えば、Ｗｎｔ）を分泌することにより、当該ＨＦＭ細胞が移植された部位における発毛を促進する。

ＨＦＭ細胞は、生体から採取された毛包に由来するものであってもよいし、毛包以外の組織に由来する細胞からin vitroで分化誘導されたものであってもよいが、当該毛包に由来するものであることが好ましい。

具体的に、ＨＦＭ細胞は、生体から採取された毛包に含まれる毛乳頭（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ）及び／又は真皮毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ）に由来する間葉系細胞であることが好ましく、毛乳頭及び／又は毛球部真皮毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ ｃｕｐ）に由来する間葉系細胞であることがより好ましく、毛乳頭に由来する間葉系細胞であることが特に好ましい。

すなわち、ＨＦＭ細胞は、毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞からなる群より選択される１以上であることが好ましく、毛乳頭細胞及び毛球部真皮毛根鞘細胞からなる群より選択される１以上であることがより好ましく、毛乳頭細胞であることが特に好ましい。

ＨＦＭ細胞の分化誘導に用いられる細胞は、in vitroで当該ＨＦＭ細胞に分化する能力を有する細胞であれば特に限られないが、例えば、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ）細胞、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞、Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ－ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞、及び、ＥＧ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ）細胞からなる群より選択される１以上）、当該多能性幹細胞以外の幹細胞（例えば、分化細胞のリプログラミングにより得られた幹細胞、及び、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織由来間葉系幹細胞）からなる群より選択される１以上）、及び、胎児又は新生児の皮膚由来の間葉系細胞（例えば、胎児又は新生児の皮膚の真皮層に由来する間葉系細胞）からなる群より選択される１以上であることが好ましい。

ＨＦＭ細胞は、１以上の発毛関連遺伝子を発現していることが好ましい。ＨＦＭ細胞が発現する発毛関連遺伝子は、生体における発毛に関連する遺伝子であれば特に限られないが、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子、ＬＥＦ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子、ＮＯＧ遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、αＭＳＡ遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子からなる群より選択される１以上であってもよい。ここで、例えば、ＡＬＰ遺伝子は特に毛乳頭細胞が強く発現する遺伝子であり、αＭＳＡ遺伝子は特に真皮毛根鞘細胞（毛球部真皮毛根鞘細胞を含む）が強く発現する遺伝子であり、ＧＲＥＭ２遺伝子は、特に毛球部真皮毛根鞘細胞が強く発現する遺伝子である。したがって、ＨＦＭ細胞は、例えば、ＡＬＰ遺伝子、αＭＳＡ遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子からなる群より選択される１以上を発現する間葉系細胞であることが好ましく、ＡＬＰ遺伝子及びＧＲＥＭ２遺伝子からなる群より選択される１以上を発現する間葉系細胞であることがより好ましく、ＡＬＰ遺伝子を発現する間葉系細胞であることが特に好ましい。

ＨＦＭ細胞は、毛包を有する動物に由来するものであれば特に限られないが、例えば、哺乳動物の細胞であることが好ましい。哺乳動物の細胞は、ヒトの細胞であってもよいし、ヒト以外の哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ又はヒツジ））の細胞であってもよいが、ヒト細胞であることが好ましい。

生体への移植を目的として用いるＨＦＭ細胞は、当該ＨＦＭ細胞を移植する個体に由来するものであってもよいし、当該ＨＦＭ細胞を移植する個体以外の個体に由来するものであってもよいが、当該ＨＦＭ細胞を移植する個体に由来するものであることが好ましい。

例えば、ヒトへの移植のために用いられるヒトＨＦＭ細胞は、当該ヒトＨＦＭ細胞を移植するヒト患者に由来するものであってもよいし、当該患者以外のヒトに由来するもの（例えば、当該患者以外のヒトに由来する多能性幹細胞（例えば、セルバンクに保存されているｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞又はＥＧ細胞）からin vitroで分化誘導されたヒトＨＦＭ細胞）であってもよいが、当該患者に由来するものであることが好ましい。

本方法において培養されるＨＦＭ細胞の継代数は、本発明の効果が得られれば特に限られず、継代数がゼロのＨＦＭ細胞（未だ継代されたことがないＨＦＭ細胞）を用いてもよいし、継代数が１以上のＨＦＭ細胞（既に１回以上継代されたＨＦＭ細胞）を用いてもよい。また、ＨＦＭ細胞の継代数は、例えば、１５以下であってもよく、１０以下であることが好ましく、８以下であることがより好ましく、６以下であることがさらに好ましく、５以下であることがさらに好ましく、４以下であることがさらに好ましく、３以下であることが特に好ましい。

具体的に、例えば、生体から採取された毛包の毛乳頭及び／又は真皮毛根鞘（例えば、生体から採取後に酵素処理が施された毛乳頭及び／又は真皮毛根鞘）を基材表面に載置して、当該毛乳頭及び／又は真皮毛根鞘から当該基材表面上に遊走してくるＨＦＭ細胞を得る場合、当該基材表面上に遊走してきたＨＦＭ細胞（継代数がゼロのＨＦＭ細胞）を当該基材表面から脱離させることなく、そのまま本方法で培養してもよい。また、例えば、継代数がゼロのＨＦＭ細胞を基材表面から脱離させて回収し、新たな基材表面上に播種し、継代数が１のＨＦＭ細胞として本方法で培養してもよい。また、継代数が２以上のＨＦＭ細胞を本方法で培養してもよい。

基材表面は、ＨＦＭ細胞の培養担体として用いる基材の表面であり、ＨＦＭ細胞に対して接着性を有する表面である。基材表面を構成する材料は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、樹脂（例えば、ポリスチレン又はポリプロピレン）、ガラス、金属及びセラミックスからなる１以上の材料から構成される表面であることが好ましい。基材表面は、非多孔性であってもよいし、多孔性であってもよい。

基材表面は、細胞接着性を向上させる処理（例えば、細胞接着性成分のコーティング）が施されていてもよいし、当該処理が施されていなくてもよい。基材表面にコーティングされていてもよい細胞接着性成分は、当該基材表面のＨＦＭ細胞に対する接着性を向上させる成分であれば特に限られないが、例えば、細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン又はフィブロネクチン）、及び／又は、細胞接着性の部位（例えば、ＲＧＤ配列を含むアミノ酸配列）が人為的に導入された化合物であることが好ましい。

基材表面としては、例えば、培養容器（例えば、培養ディッシュ、培養フラスコ、又は、マルチウェルプレートのウェル、又はローラーボトル）の細胞接着性の表面が好ましく用いられる。なお、培養容器の基材表面が、ＨＦＭ細胞に対して接着性の領域と、非接着性の領域とを含む場合、当該表面のうち、当該接着性の領域が当該ＨＦＭ細胞を培養する基材表面として用いられる。また、基材表面としては、例えば、培養容器内で底面に載置され又は培養液中に浮遊して用いられる培養担体（例えば、マイクロキャリアビーズ等の粒子状の培養担体）の表面を用いてもよい。

基材表面の形状は、本発明の効果が得られれば特に限られず、平坦な表面（例えば、培養ディッシュ、培養フラスコ、又は、マルチウェルプレートのウェルの平底の表面）であってもよいし、曲面（例えば、ローラーボトルの内面、及び／又は、マイクロキャリアビーズ等の粒子状の培養担体の表面）であってもよい。

本方法において、ＨＦＭ細胞を接着させて培養する１つの基材表面は、当該ＨＦＭ細胞が接着している一続きの細胞接着性表面である。具体的に、１つの基材表面は、例えば、１つの培養フラスコの底面（多段フラスコの場合は１つの段の底面）、１つのローラーボトルの内面、１つの培養ディッシュの底面、マルチウェルプレートの１つのウェルの底面、ＨＦＭ細胞に対して非接着性の表面で囲まれた１つの細胞接着性表面、又は、粒子状担体（例えば、マイクロキャリアビーズ）の１つの粒子の表面であってもよい。

１つの基材表面の面積は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、５×１０^－５ｃｍ^２以上であってもよく、２×１０^－４ｃｍ^２以上であってもよく、２×１０^－３ｃｍ^２以上であってもよく、０．０１ｃｍ^２以上であってもよく、０．１ｃｍ^２以上であってもよく、０．３ｃｍ^２以上であってもよく、０．５ｃｍ^２以上であってもよく、１ｃｍ^２以上であってもよく、３ｃｍ^２以上であってもよく、５ｃｍ^２以上であってもよく、１０ｃｍ^２以上であってもよく、１５ｃｍ^２以上であってもよく、２０ｃｍ^２以上であってもよい。また、１つの基材表面の面積は、例えば、１０００ｃｍ^２以下であってもよいし、８００ｃｍ^２以下であってもよいし、６００ｃｍ^２以下であってもよい。１つの基材表面の面積は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

ＨＦＭ細胞の培養に用いる培養液は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、市販の毛乳頭細胞増殖用培地等、ＨＦＭ細胞の増殖に適した成分を含む培養液が好ましく用いられる。具体的に、培養液は、例えば、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）及びインスリンからなる群より選択される１以上を含むことが好ましく、ｂＦＧＦを含むことが特に好ましい。

本方法の主工程においては、基材表面に接着したコンフルエントな状態のＨＦＭ細胞を、継代することなく、さらに培養して増殖させる。すなわち、コンフルエントな状態のＨＦＭ細胞を基材表面から脱離させることなく、そのまま当該基材表面上で培養して、さらに増殖させる。

ここで、「コンフルエントな状態」とは、ＨＦＭ細胞が１つの基材表面の全体を覆い尽くしている状態である。コンフルエントな状態かどうかは、本発明が属する技術分野において技術常識を有する者であれば容易に判断することができるが、当該コンフルエントな状態は、例えば、基材表面上におけるＨＦＭ細胞の細胞密度（１つの基材表面上のＨＦＭ細胞の総数を、当該１つの基材表面の面積で除して得られる密度）により特定されてもよい。すなわち、ＨＦＭ細胞がコンフルエントな状態とは、例えば、基材表面上におけるＨＦＭ細胞の細胞密度が、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲内である状態であってもよく、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、５．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲内である状態であってもよく、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲内である状態であってもよく、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、４．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲内である状態であってもよく、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲内である状態であってもよい。

なお、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度の算出に用いられる当該基材表面上における当該ＨＦＭ細胞の数は、蛍光酵素と、生細胞によって当該蛍光酵素の基質に変換される前駆体化合物とを含む測定キットを用いて好ましく測定される。具体的に、例えば、蛍光酵素としてのルシフェラーゼと、生細胞の細胞質内でルシフェラーゼの基質に変換される細胞膜透過性の前駆体化合物とを含む測定キットが好ましく用いられる。この場合、まずルシフェラーゼ及び前駆体化合物を、基材表面上のＨＦＭ細胞を含む培養液中に添加する。その結果、前駆体化合物は培養液中から生きたＨＦＭ細胞の細胞質内に透過し、当該細胞質内で、当該ＨＦＭ細胞による還元能によってルシフェラーゼの基質に変換される。生成された細胞膜透過性の基質はＨＦＭ細胞の細胞質から培養液中に漏出し、当該培養液中においてルシフェラーゼによって発光物質に変換される。そこで、この発光物質に由来する蛍光の強度（例えば、特定波長における吸光度）を測定し、当該測定された蛍光強度と、予め作成された検量線（蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフ）とに基づき、基材表面上のＨＦＭ細胞の数を算出する。なお、検量線は、例えば、基材表面への播種時のＨＦＭ細胞を用いて作成される。そして、算出されたＨＦＭ細胞の数を、基材表面の面積で除することにより、当該基材表面上におけるＨＦＭ細胞の細胞密度を算出する。

主工程は、ＨＦＭ細胞を、コンフルエントな状態から、さらに増殖させて増殖した当該ＨＦＭ細胞が基材表面の少なくとも一部において積み重なって２層以上の細胞層を形成するまで培養することを含むことが好ましい。

具体的に、単層のＨＦＭ細胞が基材表面を覆い尽くしているコンフルエントな状態から、継代することなく、当該ＨＦＭ細胞をさらに増殖させることにより、当該基材表面の一部又は全部において、基材表面に接している１層目のＨＦＭ細胞に加えて、当該１層目のＨＦＭ細胞上に積み重なった２層目のＨＦＭ細胞をさらに含む細胞層が形成される。

さらに、主工程は、基材表面の少なくとも一部において、増殖したＨＦＭ細胞が３層以上、好ましくは４層以上、より好ましくは５層以上、特に好ましくは６層以上の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

主工程は、増殖したＨＦＭ細胞が、基材表面の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは基材表面の全範囲（１００％）において、２層以上の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

また、主工程は、増殖したＨＦＭ細胞が、基材表面の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上において、３層以上の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

また、主工程は、増殖したＨＦＭ細胞が、基材表面の１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上において、４層以上の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

また、主工程は、増殖したＨＦＭ細胞が、基材表面の１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上において、５層以上の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

また、主工程は、増殖したＨＦＭ細胞が、基材表面の１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上において、６層以上の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

ＨＦＭ細胞の増殖は、基材表面の全体に亘って必ずしも均一ではないため、当該基材表面上に形成される細胞層に含まれる層の数もまた、当該基材表面の一部と他の一部とで異なり得る。このため、主工程は、増殖したＨＦＭ細胞が、基材表面の一部において、第一の数のＨＦＭ細胞層（例えば、１層、２層又は３層のＨＦＭ細胞層）を含む第一の細胞層を形成し、且つ、当該基材表面の他の一部において、当該第一の数より１以上、２以上、又は３以上多い数のＨＦＭ細胞層（例えば、４層以上、５層以上、又は６層以上のＨＦＭ細胞層）を含む第二の細胞層を形成するまで、ＨＦＭ細胞を培養することとしてもよい。

増殖したＨＦＭ細胞が積み重なって形成された細胞層は、ＨＦＭ細胞が分泌した細胞外マトリックス（例えば、Ｉ型コラーゲン及び／又はフィブロネクチン）を含むことが好ましい。すなわち、細胞層は、ＨＦＭ細胞の２以上の層と、当該ＨＦＭ細胞により分泌され、当該ＨＦＭ細胞間に蓄積された細胞外マトリックスとを含むことが好ましい。

主工程は、コンフルエントな状態から１２０時間以上の時間が経過するまで、ＨＦＭ細胞を継代することなく培養することを含むことが好ましい。具体的に、例えば、ＨＦＭ細胞が基材表面上でコンフルエントな状態に到達した時点（例えば、細胞密度が上述したコンフルエントな状態を形成する細胞密度に到達した時点）からさらに１２０時間以上、当該基材表面上において引き続き当該ＨＦＭ細胞を継代することなく培養する。

この場合、主工程は、コンフルエントな状態から２００時間以上、好ましくは３００時間以上、より好ましくは４００時間以上、さらに好ましくは５００時間以上、さらに好ましくは５５０時間以上、特に好ましくは６００時間以上の時間が経過するまで、ＨＦＭ細胞を継代することなく培養することを含んでもよい。

また、主工程においてコンフルエントな状態から継代することなくＨＦＭ細胞を培養する時間は、例えば、２４００時間以下であってもよく、２０００時間以下であってもよく、１８００時間以下であってもよく、１６００時間以下であってもよく、１４００時間以下であってもよく、１２００時間以下であってもよく、９５０時間以下であってもよく、７００時間以下であってもよい。主工程においてコンフルエントな状態から継代することなくＨＦＭ細胞を培養する時間は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が６．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上に到達するまで、継代することなく当該ＨＦＭ細胞を培養することを含むことが好ましい。この場合、主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、好ましくは７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、より好ましくは８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、さらに好ましくは８．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、さらに好ましくは９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、さらに好ましくは９．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、特に好ましくは１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上に到達するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程においてコンフルエントな状態から継代することなくＨＦＭ細胞を培養して到達する細胞密度は、例えば、２５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、２０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、１８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、１６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、１５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、１４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、１３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよく、１２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下であってもよい。主工程においてコンフルエントな状態から継代することなくＨＦＭ細胞を培養して到達する細胞密度は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で５０時間以上、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含むことが好ましい。この場合、主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で１００時間以上、好ましくは２００時間以上、より好ましくは３００時間以上、さらに好ましくは３５０時間以上、さらに好ましくは４００時間以上、特に好ましくは４５０時間以上、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程において、細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で培養する時間は、例えば、２０００時間以下であってもよく、１５００時間以下であってもよく、１０００時間以下であってもよく、８００時間以下であってもよく、６００時間以下であってもよく、５００時間以下であってもよい。主工程において細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で培養する時間は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で５０時間以上、好ましくは１５０時間以上、より好ましくは２５０時間以上、さらに好ましくは３００時間以上、特に好ましくは３５０時間以上、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程において、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で培養する時間は、例えば、２０００時間以下であってもよく、１５００時間以下であってもよく、１０００時間以下であってもよく、８００時間以下であってもよく、６００時間以下であってもよく、５００時間以下であってもよく、４００時間以下であってもよい。主工程において細胞密度が９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で培養する時間は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で５０時間以上、好ましくは１００時間以上、より好ましくは１５０時間以上、さらに好ましくは２００時間以上、特に好ましくは２５０時間以上、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程において、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度が１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で培養する時間は、例えば、２０００時間以下であってもよく、１５００時間以下であってもよく、１０００時間以下であってもよく、５００時間以下であってもよく、４００時間以下であってもよく、３００時間以下であってもよい。主工程において細胞密度が１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で培養する時間は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度がコンフルエントな状態におけるそれの１．５倍以上に到達するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含むことが好ましい。この場合、主工程は、基材表面上のＨＦＭ細胞の細胞密度がコンフルエントな状態におけるそれの２倍以上、好ましくは２．５倍以上、より好ましくは３倍以上、特に好ましくは３．５倍以上に到達するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

主工程において到達するＨＦＭ細胞の細胞密度は、コンフルエントな状態における細胞密度の１０倍以下であってもよく、８倍以下であってもよく、６倍以下であってもよく、５倍以下であってもよく、４倍以下であってもよい。主工程において到達するＨＦＭ細胞の細胞密度は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

主工程は、ＨＦＭ細胞の上述した１以上の発毛関連遺伝子（例えば、ＡＬＰ遺伝子）の発現量が、コンフルエントな状態におけるそれの１．５倍以上に増加するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含むことが好ましい。この場合、主工程は、ＨＦＭ細胞の１以上の発毛関連遺伝子の発現量が、コンフルエントな状態におけるそれの２．０倍以上、好ましくは２．５倍以上、より好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらに好ましくは４．０倍以上、さらに好ましくは４．５倍以上、さらに好ましくは５．０倍以上、特に好ましくは５．５倍以上に増加するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程においてＨＦＭ細胞を培養して到達する発毛関連遺伝子の発現量は、当該コンフルエントな状態におけるそれの１００倍以下であってもよく、５０倍以下であってもよく、４０倍以下であってもよい。主工程においてＨＦＭ細胞を培養して到達する発毛関連遺伝子の発現量は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

本方法において、基材表面上におけるＨＦＭ細胞のコンフルエントな状態を形成する方法は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、主工程において当該コンフルエントな状態を形成する細胞密度でＨＦＭ細胞を基材表面上に播種することにより、当該コンフルエントな状態を形成してもよいし、又は、主工程を実施する前に、コンフルエントな状態に到達していないＨＦＭ細胞を基材表面上で培養し増殖させることにより、当該コンフルエントな状態を形成してもよい。

すなわち、本方法は、主工程に先立って実施される前工程をさらに含み、当該前工程は、基材表面上において、未だコンフルエントな状態に到達していないＨＦＭ細胞を培養して、コンフルエントな状態に到達するまで当該ＨＦＭ細胞を増殖させることを含むこととしてもよい。

この場合、前工程においても、基材表面に接着したＨＦＭ細胞を、継代することなく培養する。すなわち、本方法においては、前工程及び主工程を通じて、継代することなく、ＨＦＭ細胞を培養する。具体的に、まず前工程では、基材表面上において未だコンフルエントな状態に到達していないＨＦＭ細胞を、継代することなく、当該基材表面上で培養することにより、当該基材表面上でコンフルエントな状態に到達するまで、当該ＨＦＭ細胞を増殖させる。そして、前工程に続く主工程においては、当該前工程で基材表面においてコンフルエントな状態に到達したＨＦＭ細胞を、継代することなく、当該基材表面上で培養してさらに増殖させる。

前工程における、未だコンフルエントな状態に到達していないＨＦＭ細胞の培養は、例えば、少なくとも一部が未だ細胞で覆われていない基材表面上における当該ＨＦＭ細胞の培養であってもよく、及び／又は、基材表面上においてコンフルエントな状態を形成する細胞密度より小さい細胞密度でのＨＦＭ細胞の培養であってもよい。

前工程は、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の細胞密度でＨＦＭ細胞を培養して、コンフルエントな状態に到達するまで当該ＨＦＭ細胞を増殖させることを含んでもよい。この場合、前工程は、好ましくは２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、より好ましくは１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、さらに好ましくは１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、さらに好ましくは０．８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、特に好ましくは０．７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の細胞密度でＨＦＭ細胞を培養して、コンフルエントな状態に到達するまで当該ＨＦＭ細胞を増殖させることを含んでもよい。

また、前工程は、０．００５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．０１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．０５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、又は０．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の細胞密度でＨＦＭ細胞を培養して、コンフルエントな状態に到達するまで当該ＨＦＭ細胞を増殖させることを含んでもよい。前工程においてＨＦＭ細胞を培養する細胞密度は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

前工程は、基材表面上にＨＦＭ細胞を播種することをさらに含んでもよい。すなわち、前工程は、まずコンフルエントな状態に到達しない細胞密度でＨＦＭ細胞を基材表面上に播種すること、及び、次いで当該基材表面に接着したＨＦＭ細胞を培養して、コンフルエントな状態に到達するまで当該ＨＦＭ細胞を増殖させることを含んでもよい。

この場合、前工程は、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、好ましくは２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、より好ましくは１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、さらに好ましくは１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、さらに好ましくは０．８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、特に好ましくは０．７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の細胞密度でＨＦＭ細胞を基材表面上に播種することを含んでもよい。

また、前工程は、０．００５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．０１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．０５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、０．４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、又は０．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の細胞密度でＨＦＭ細胞を基材表面上に播種することを含んでもよい。前工程におけるＨＦＭ細胞の播種密度は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

本方法においては、培養液に分散されたＨＦＭ細胞を基材表面上に播種することとしてもよい。ここで、培養液に分散された個々のＨＦＭ細胞は、実質的に他の細胞と結合しておらず、又は、他の細胞に付着しているがピペッティング等の操作により当該培養液を流動させることで当該他の細胞から容易に分離される。

また、本方法においては、細胞凝集塊を形成しているＨＦＭ細胞を基材表面上に播種することとしてもよい。すなわち、例えば、予めＨＦＭ細胞の細胞凝集塊（例えば、スフェロイド）を形成し、その後、当該細胞凝集塊を含む培養液を基材表面上に加えることで、当該細胞凝集塊を形成しているＨＦＭ細胞を当該基材表面上に播種してもよい。この場合、細胞凝集塊を形成するＨＦＭ細胞のうち一部のＨＦＭ細胞が基材表面に接着し、さらに基材表面上に遊走してくる。そして、細胞凝集塊から基材表面に遊走してきたＨＦＭ細胞を当該基材表面で培養することにより、当該ＨＦＭ細胞を当該基材表面上で増殖させることができる。具体的に、例えば、前工程において、細胞凝集塊を形成しているＨＦＭ細胞を基材表面上に播種し、少なくとも一部が未だ細胞で覆われていない当該基材表面上で、当該細胞凝集塊から当該基材表面に遊走してきたＨＦＭ細胞を培養し、増殖させることとしてもよい。なお、ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊の形成については後述する。

前工程におけるＨＦＭ細胞の培養時間（すなわち、前工程においてＨＦＭ細胞の培養を開始した時点から（例えば、前工程においてＨＦＭ細胞を基材表面上に播種した時点から）、コンフルエントな状態に到達するまでの時間）は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、２０時間以上であってもよく、４０時間以上であってもよく、６０時間以上であってもよく、８０時間以上であってもよく、１００時間以上であってもよい。

また、前工程におけるＨＦＭ細胞の培養時間は、例えば、５００時間以下であってもよく、４５０時間以下であってもよく、４００時間以下であってもよく、３５０時間以下であってもよく、３００時間以下であってもよく、２５０時間以下であってもよく、２００時間以下であってもよく、１５０時間以下であってもよい。前工程におけるＨＦＭ細胞の培養時間は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

本方法が前工程及び主工程を含む場合、当該主工程は、当該前工程におけるＨＦＭ細胞の培養の開始（例えば、前工程においてＨＦＭ細胞を基材表面上に播種した時点）から２００時間以上の時間が経過するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。この場合、主工程は、前工程におけるＨＦＭ細胞の培養開始から２５０時間以上、より好ましくは３００時間以上、さらに好ましくは３５０時間以上、さらに好ましくは４００時間以上、さらに好ましくは４５０時間以上、さらに好ましくは５００時間以上、さらに好ましくは５５０時間以上、さらに好ましくは６００時間以上、さらに好ましくは６５０時間以上、特に好ましくは７００時間以上の時間が経過するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程は、前工程におけるＨＦＭ細胞の培養開始から２５００時間以下、２０００時間以下、１８００時間以下、１６００時間以下、１４００時間以下、１２００時間以下、１０００時間以下、９００時間以下、８５０時間以下、８００時間以下、又は７５０時間以下の時間が経過するまで、当該ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。主工程においてＨＦＭ細胞を培養する時間は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

本方法が前工程及び主工程を含む場合、当該主工程は、ＨＦＭ細胞の上述した１以上の発毛関連遺伝子（例えば、ＡＬＰ遺伝子）の発現量が、当該前工程におけるＨＦＭ細胞の培養の開始（例えば、前工程においてＨＦＭ細胞を基材表面上に播種した時点）から２４時間が経過した時点のそれの１．１倍以上に増加するまで、ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。この場合、主工程は、ＨＦＭ細胞の１以上の発毛関連遺伝子の発現量が、前工程におけるＨＦＭ細胞の培養開始から２４時間が経過した時点のそれの１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、特に好ましくは３．８倍以上に増加するまで、ＨＦＭ細胞を培養することを含んでもよい。

また、主工程において到達するＨＦＭ細胞の発毛関連遺伝子の発現量は、前工程におけるＨＦＭ細胞の培養開始から２４時間が経過した時点のそれの５０倍以下であってもよく、３０倍以下であってもよく、２５倍以下であってもよく、２０倍以下であってもよく、１５倍以下であってもよく、１０倍以下であってもよい。主工程において到達するＨＦＭ細胞の発毛関連遺伝子の発現量は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

本方法において、基材表面上に播種される細胞又は基材表面上で培養される細胞の総数に対する、当該細胞に含まれるＨＦＭ細胞の数の割合は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、８０％以上であってもよく、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。

本方法において、基材表面上に播種されるＨＦＭ細胞又は基材表面上で培養されるＨＦＭ細胞の総数に対する、当該ＨＦＭ細胞に含まれる毛乳頭細胞の数の割合は、例えば、５％以上であってもよく、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、４０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、８０％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよい。

本方法は、主工程においてコンフルエントな状態から継代することなく基材表面上で培養して得られたＨＦＭ細胞を、当該基材表面から脱離させて回収する回収工程をさらに含むこととしてもよい。

すなわち、この場合、まず主工程において、基材表面上でコンフルエントな状態から継代することなく培養することによって数が増幅されたＨＦＭ細胞（以下、「増幅ＨＦＭ細胞」という。）を得る。次いで、主工程に続く回収工程において、当該主工程で得られた増幅ＨＦＭ細胞を当該基材表面から脱離させて回収する。

具体的に、回収工程においては、例えば、増幅ＨＦＭ細胞を、分散された細胞として回収する。すなわち、例えば、基材表面上に接着した増幅ＨＦＭ細胞に酵素処理を施すことにより、当該増幅ＨＦＭ細胞を当該基材表面から脱離させるとともに分散させ、培養液中に分散された当該増幅ＨＦＭ細胞を回収する。酵素処理には、例えば、トリプシン等のプロテアーゼが好ましく用いられる。

また、回収工程においては、例えば、増幅ＨＦＭ細胞を、分散された細胞層片として回収する。すなわち、例えば、基材表面上に形成された増幅ＨＦＭ細胞の細胞層を破砕し、又は脱離させることにより、培養液中に分散された１又は複数の細胞層片を回収する。

より具体的に、例えば、基材表面を覆う増幅ＨＦＭ細胞の細胞層をセルスクレーパー等の破砕器具を用いて破砕することにより、当該細胞層の破砕により形成され、培養液中に分散された複数の細胞層片を回収することとしてもよい。

また、例えば、基材表面上において互いに離間した、増幅ＨＦＭ細胞の複数の細胞層を形成し、その後、当該複数の細胞層の各々を当該基材表面から脱離させることにより、培養液中に分散された複数の細胞層片を回収することとしてもよい。この場合、基材表面において互いに離間した複数の細胞層を形成する方法は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、１つの基材表面上に、各々がＨＦＭ細胞に対して非接着性の表面に囲まれた、ＨＦＭ細胞に対して接着性の複数の領域を形成し、当該基材表面上の当該各接着性領域でＨＦＭ細胞を培養して細胞層を形成する方法を用いてもよい。

基材表面から１又は複数の細胞層を脱離させる方法は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、培養液中で細胞層の外周部分のみを培養液中でセルスクレーパー等の剥離器具を用いて剥離することにより、その後の当該細胞層の当該外周部分からの剥離及び凝集を促進し、最終的に当該細胞層の凝集体を基材表面から脱離させてもよい。

また、例えば、温度応答性ポリマーがコーティングされた細胞接着性の基材表面上でＨＦＭ細胞を培養して細胞層を形成し、その後、温度を変化させることにより当該温度応答性ポリマーを可溶化することにより、当該基材表面から当該細胞層を脱離させる方法を用いてもよい。また、例えば、特開２００８－２９５３８２号公報に記載されているような電気化学的方法を用いてもよい。

回収された細胞層片は、基材表面上に形成されていた細胞層に由来する、２層以上を形成するよう積層された増幅ＨＦＭ細胞層を含む。また、回収された細胞層片は、ＨＦＭ細胞から分泌され細胞層に蓄積していた細胞外マトリックスをさらに含むことが好ましい。

上述のとおり、少なくとも主工程を含む本方法によれば、ＨＦＭ細胞の数を増幅させるのみならず、当該ＨＦＭ細胞の毛髪再生能を効果的に回復させることができる。すなわち、本方法によれば、高い毛髪再生能を有する増幅ＨＦＭ細胞が製造される。

本方法の主工程で最終的に得られる増幅ＨＦＭ細胞（すなわち、主工程における長期高密度培養によって得られる増幅ＨＦＭ細胞）は、当該増幅ＨＦＭ細胞を得るための培養前のコンフルエントな状態のＨＦＭ細胞に比べて、高い毛髪再生能を有する。

すなわち、本方法で製造される増幅ＨＦＭ細胞は、例えば、生体に移植された場合に、当該生体の移植部位において、当該増幅ＨＦＭ細胞を得るための培養前のコンフルエントな状態から回収されたＨＦＭ細胞に比べて、より多い数の毛髪を再生する能力を有する。

具体的に、本方法の主工程は、例えば、生体に移植された場合に、当該生体の移植部位において、コンフルエントな状態から回収されたＨＦＭ細胞のそれの５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１５倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは２５倍以上、特に好ましくは３０倍以上の数の毛髪を再生する能力を有する増幅ＨＦＭ細胞を得ることを含んでもよい。

そこで、本方法は、他の側面として、上述のようにして製造された増幅ＨＦＭ細胞を生体に移植することを含む毛髪再生方法を包含する。増幅ＨＦＭ細胞を移植する生体は、毛包を有する動物であれば特に限られないが、例えば、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。増幅ＨＦＭ細胞の生体への移植は、当該生体の皮膚への移植であることが好ましく、当該生体の頭皮への移植であることが特に好ましい。

増幅ＨＦＭ細胞の生体への移植は、医学用途であってもよいし、研究用途であってもよいが、脱毛を伴う疾患の治療又は予防のためであることが好ましい。すなわち、増幅ＨＦＭ細胞の生体への移植は、脱毛を伴う疾患を患っているヒト患者、又は脱毛を伴う疾患を患う可能性のあるヒト患者への移植であることが好ましい。したがって、増幅ＨＦＭ細胞を生体に移植することを含む毛髪再生方法は、脱毛を伴う疾患の治療又は予防方法であることが好ましい。

脱毛を伴う疾患は、特に限られないが、例えば、男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、及び症候性脱毛症からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。

増幅ＨＦＭ細胞を生体に移植する際には、当該増幅ＨＦＭ細胞を含む移植用組成物を当該生体に移植することが好ましい。この点、本方法は、さらに他の側面として、上述のようにして製造された増幅ＨＦＭ細胞を含む移植用組成物を調製することを含む、移植用組成物の製造方法を包含する。

増幅ＨＦＭ細胞を含む移植用組成物は、移植による効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該増幅ＨＦＭ細胞と、当該増幅ＨＦＭ細胞の生存を維持する生体適合性の担体とを含むことが好ましい。具体的に、移植用組成物に含まれる担体は、例えば、生理食塩水等の等張液を含むことが好ましい。移植用組成物は、さらに他の成分を含んでもよい。すなわち、移植用組成物は、例えば、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分をさらに含んでもよい。

移植用組成物に含まれる増幅ＨＦＭ細胞の形態は、移植による効果が得られれば特に限られないが、当該移植用組成物は、例えば、分散された増幅ＨＦＭ細胞、及び／又は、互いに接着した複数の増幅ＨＦＭ細胞を含むことが好ましい。

分散された増幅ＨＦＭ細胞は、例えば、基材表面上に接着した当該増幅ＨＦＭ細胞に酵素処理を施すことにより得られる。互いに接着した複数の増幅ＨＦＭ細胞は、例えば、当該増幅ＨＦＭ細胞の細胞層片、及び／又は、細胞凝集塊として得られる。細胞層片は、例えば、上述のとおり、主工程において基材表面上に形成した増幅ＨＦＭ細胞の細胞層を回収することにより得られる。細胞凝集塊は、分散された増幅ＨＦＭ細胞、及び／又は、基材表面上に形成した増幅ＨＦＭ細胞の細胞層を凝集させることにより形成させる。ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊は、球状の細胞凝集塊（スフェロイド）であってもよい。

この点、本方法は、さらに他の側面として、上述のようにして製造された増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊を形成することを含む、細胞凝集塊の製造方法を包含する。細胞凝集塊の製造方法においては、増幅ＨＦＭ細胞を凝集させることにより、当該増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊を形成する。

増幅ＨＦＭ細胞を凝集させる方法は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該増幅ＨＦＭ細胞を浮遊培養する方法、当該増幅ＨＦＭ細胞に遠心処理を施す方法、又は、当該増幅ＨＦＭ細胞の細胞層を基材表面から剥離させて凝集させる方法が好ましく用いられる。

すなわち、例えば、分散された増幅ＨＦＭ細胞を浮遊状態（非接着状態）で培養することにより、当該増幅ＨＦＭ細胞を凝集させて、当該増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊を形成する。浮遊培養は、全体として流動性を有する培養液中で行う。また、浮遊培養には、細胞に対して非接着性の表面を有する培養容器（例えば、培養ディッシュ、培養フラスコ、又は、マルチウェルプレートのウェル）が好ましく用いられる。

この場合、播種された細胞は、浮遊培養において、培養容器の表面に実質的に接着することなく、非接着状態で培養される。具体的に、例えば、培養容器の非接着性の表面上に沈降した細胞は、培養液中、当該表面に接着せず、又は、ピペッティング等の操作で当該培養液を流動させることにより当該表面から容易に脱離する程度に弱く当該表面に付着する。非接着性の底面上で培養される細胞の形状は、ほぼ球形に維持される。

また、細胞凝集塊は、非接着性の表面に実質的に接着することなく、培養液中で浮遊した状態（すなわち、非接着状態）で形成される。具体的に、例えば、非接着性の表面を有する培養容器中で形成された細胞凝集塊は、培養液中、当該表面に接着せず、又は、ピペッティング等の操作で当該培養液を流動させることにより当該表面から容易に脱離する程度に弱く当該表面に付着する。

また、例えば、容器内で培養液に分散された増幅ＨＦＭ細胞に遠心処理を施すことにより、当該容器内で当該増幅ＨＦＭ細胞を沈降させるとともに凝集させて、当該増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊を形成することとしてもよい。

また、例えば、上述のとおり、基材表面上に形成された細胞層の外周部分のみを培養液中でセルスクレーパー等の剥離器具を用いて剥離することにより、その後の当該細胞層の当該外周部分からの剥離及び凝集を促進し、細胞凝集塊を形成することとしてもよい。

ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊が球状である場合、当該細胞凝集塊の直径は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、２０μｍ以上であってもよく、４０μｍ以上であることが好ましく、６０μｍ以上であることがより好ましく、８０μｍ以上であることがさらに好ましく、１００μｍ以上であることが特に好ましい。また、ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊の直径は、例えば、９００μｍ以下であってもよく、８００μｍ以下であることが好ましく、７００μｍ以下であることがより好ましく、６００μｍ以下であることがさらに好ましく、５００μｍ以下であることが特に好ましい。ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊の直径は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

１つの細胞凝集塊の形成に用いられる細胞の数、及び／又は、１つの細胞凝集塊に含まれる細胞の数は、本発明の効果が得られれば特に限れないが、例えば、０．１×１０^３個以上であってもよく、０．５×１０^３個以上であることが好ましく、０．６×１０^３個以上であることがより好ましく、０．７×１０^３個以上であることがさらに好ましく、０．８×１０^３個以上であることがさらに好ましく、０．９×１０^３個以上であることがさらに好ましく、１．０×１０^３個以上であることが特に好ましい。

また、１つの細胞凝集塊の形成に用いられる細胞の数、及び／又は、１つの細胞凝集塊に含まれる細胞の数は、例えば、１５×１０^４個以下であってもよく、１０×１０^４個以下であってもよく、８×１０^４個以下であってもよく、７×１０^４個以下であってもよく、６×１０^４個以下であってもよく、５×１０^４個以下であってもよく、４×１０^４個以下であってもよく、３×１０^４個以下であってもよく、２×１０^４個以下であってもよく、１×１０^４個以下であってもよい。１つの細胞凝集塊の形成に用いられる細胞の数、及び、１つの細胞凝集塊に含まれる細胞の数は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

細胞凝集塊の形成に用いられる細胞の総数に対する、当該細胞に含まれるＨＦＭ細胞の数の割合は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、４０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、８０％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよい。

また、細胞凝集塊に含まれる細胞の総数に対する、当該細胞に含まれるＨＦＭ細胞の数の割合は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、４０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、８０％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよい。

細胞凝集塊の形成に用いられるＨＦＭ細胞の数に対する、当該ＨＦＭ細胞に含まれる毛乳頭細胞の数の割合は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、４０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、８０％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよい。

また、細胞凝集塊に含まれるＨＦＭ細胞の数に対する、当該ＨＦＭ細胞に含まれる毛乳頭細胞の数の割合は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、４０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、８０％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよい。

細胞凝集塊の形成に用いられる細胞が増幅ＨＦＭ細胞に加えて他の細胞をさらに含む場合、当該他の細胞は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、上皮系細胞であることが好ましい。

この場合、細胞凝集塊の形成に用いられる増幅ＨＦＭ細胞の数と上皮系細胞の数との比率（増幅ＨＦＭ細胞：上皮系細胞）は、例えば、１：１０～１０：１の範囲内であってもよく、１：９～９：１の範囲内であってもよく、１：８～８：１の範囲内であってもよく、１：７～７：１の範囲内であってもよく、１：６～６：１の範囲内であってもよく、１：５～５：１の範囲内であってもよく、１：４～４：１の範囲内であってもよく、１：３～３：１の範囲内であってもよく、１：２～２：１の範囲内であってもよい。

また、細胞凝集塊に含まれる増幅ＨＦＭ細胞の数と上皮系細胞の数との比率（増幅ＨＦＭ細胞：上皮系細胞）は、例えば、１：１０～１０：１の範囲内であってもよく、１：９～９：１の範囲内であってもよく、１：８～８：１の範囲内であってもよく、１：７～７：１の範囲内であってもよく、１：６～６：１の範囲内であってもよく、１：５～５：１の範囲内であってもよく、１：４～４：１の範囲内であってもよく、１：３～３：１の範囲内であってもよく、１：２～２：１の範囲内であってもよい。

細胞凝集塊の形成に用いられる上皮系細胞は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、毛包上皮系細胞及びその前駆細胞からなる群より選択される１以上であることが好ましい。毛包上皮系細胞は、発毛に寄与する上皮系細胞（より具体的には、例えば、ＨＦＭ細胞と協調して発毛に寄与する上皮系細胞）である。

毛包上皮系細胞は、生体から採取された毛包に由来するものであってもよいし、in vitroで分化誘導されたものであってもよいが、生体から採取された毛包に由来するものであることが好ましい。

具体的に、毛包上皮系細胞は、毛包上皮幹細胞、毛母（ｈａｉｒ ｍａｔｒｉｘ）細胞、外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ ｒｏｏｔ ｓｈｅａｔｈ）細胞、及び内毛根鞘（ｉｎｎｅｒ ｒｏｏｔ ｓｈｅａｔｈ）細胞からなる群より選択される１以上であることが好ましく、毛包上皮幹細胞、毛母細胞、及び外毛根鞘細胞からなる群より選択される１以上であることが特に好ましい。

毛包上皮系細胞の分化誘導に用いられる未分化細胞は、in vitroで当該毛包上皮系細胞に分化する能力を有する細胞であれば特に限られないが、例えば、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞又はＥＧ細胞）、及び、当該多能性幹細胞以外の幹細胞（例えば、分化細胞のリプログラミングにより得られた幹細胞）からなる群より選択される１以上であることが好ましい。

毛包上皮系細胞の前駆細胞は、in vitroで当該毛包上皮系細胞に分化する能力を有する細胞であれば特に限られないが、例えば、胎児又は新生児の皮膚上皮系細胞（例えば、胎児又は新生児の皮膚の表皮層に由来する上皮系細胞）、及び、in vitroで当該毛包上皮系細胞に分化する能力を有する、多能性幹細胞以外の幹細胞（例えば、皮膚の基底細胞）からなる群より選択される１以上であることが好ましい。

毛包上皮系細胞は、毛包を有する動物に由来するものであれば特に限らないが、例えば、哺乳動物の細胞であることが好ましい。哺乳動物の細胞は、ヒトの細胞であってもよいし、ヒト以外の哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ又はヒツジ））の細胞であってもよいが、ヒト細胞であることが好ましい。

生体への移植を目的として用いる毛包上皮系細胞は、当該毛包上皮系細胞を移植する個体に由来するものであってもよいし、当該毛包上皮系細胞を移植する個体以外の個体に由来するものであってもよいが、当該毛包上皮系細胞を移植する個体に由来するものであることが好ましい。

例えば、ヒトへの移植のために用いられるヒト毛包上皮系細胞は、当該ヒト毛包上皮系細胞を移植するヒト患者に由来するものであってもよいし、当該患者以外のヒトに由来する細胞（例えば、当該患者以外のヒトに由来する多能性幹細胞（例えば、セルバンクに保存されているｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞又はＥＧ細胞）からin vitroで分化誘導されたヒト細胞）であってもよいが、当該ヒト毛包上皮系細胞を移植するヒト患者に由来するものであることが好ましい。

増幅ＨＦＭ細胞及び上皮系細胞を含む細胞凝集塊は、当該増幅ＨＦＭ細胞同士が凝集して形成されたＨＦＭ細胞凝集部と、当該上皮系細胞同士が凝集して形成された上皮系細胞凝集部とを含むこととしてもよい。

すなわち、例えば、培養液中で増幅ＨＦＭ細胞及び上皮系細胞を含む分散された細胞の浮遊培養を行うことにより、当該増幅ＨＦＭ細胞同士が凝集してＨＦＭ細胞凝集部を形成するとともに、当該上皮系細胞同士が凝集して上皮系細胞凝集部を形成し、さらに、当該ＨＦＭ細胞凝集部の一部と当該上皮系細胞凝集部の一部とが結合することにより、当該ＨＦＭ細胞凝集部と当該上皮系細胞凝集部をと含む細胞凝集塊を形成することとしてもよい。

また、例えば、増幅ＨＦＭ細胞に遠心処理を施すことによるＨＦＭ細胞凝集部の形成と、上皮系細胞に遠心処理を施すことによる上皮系細胞凝集部の形成とを別々に実施し、その後、当該ＨＦＭ細胞凝集部と当該上皮系細胞凝集部とを接触させて結合させることにより、当該ＨＦＭ細胞凝集部と当該上皮系細胞凝集部をと含む細胞凝集塊を形成することとしてもよい。

また、例えば、容器内で増幅ＨＦＭ細胞及び上皮系細胞の一方の細胞に遠心処理を施してＨＦＭ細胞凝集部及び上皮系細胞凝集部の一方を形成し、次いで、その上に当該増幅ＨＦＭ細胞及び上皮系細胞の他方の細胞を加えて遠心処理を施して当該ＨＦＭ細胞凝集部及び上皮系細胞凝集部の他方を形成することにより、積層された当該ＨＦＭ細胞凝集部と当該上皮系細胞凝集部をを含む細胞凝集塊を形成することとしてもよい。

増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊は、毛髪再生能を有する。細胞凝集塊の毛髪再生能は、当該細胞凝集塊を生体に移植した場合に、当該細胞凝集塊が移植された部位において発毛を生じさせる能力である。

すなわち、増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊は、例えば、生体に移植された場合に、当該生体の移植部位において、当該増幅ＨＦＭ細胞に代えて、当該増幅ＨＦＭ細胞を得るための培養前のコンフルエントな状態から回収されたＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊に比べて、より多い数の毛髪を再生する能力を有する。

具体的に、増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊の製造方法は、例えば、生体に移植された場合、当該生体の移植部位において、当該増幅ＨＦＭ細胞に代えて、当該コンフルエントな状態から回収されたＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊のそれの５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１５倍以上、より一層好ましくは２０倍以上、さらにより一層好ましくは２５倍以上、特に好ましくは３０倍以上の数の毛髪を再生する能力を有する細胞凝集塊を得ることを含んでもよい。

本方法により製造される増幅ＨＦＭ細胞、及び、当該増幅ＨＦＭ細胞を含む細胞凝集塊の用途は、上述した生体への移植に限られず、例えば、毛髪に関連する研究にも好ましく用いられる。

なお、本方法の前工程及び主工程において、基材表面上に接着したＨＦＭ細胞は、ハイドロゲルに包埋されていないこととしてもよい。また、基材表面は、ゲル化後のハイドロゲルの表面ではないこととしてもよい。また、基材表面上のＨＦＭ細胞の上に、当該ＨＦＭ細胞以外の細胞（他の細胞）を播種しないこととしてもよい。また、基材表面上のＨＦＭ細胞の上で、他の細胞を培養しないこととしてもよい。また、基材表面上のＨＦＭ細胞の上に他の細胞の層を形成しないこととしてもよい。また、他の細胞の層の上にＨＦＭ細胞を播種しないこととしてもよい。また、他の細胞の層の上でＨＦＭ細胞を培養しないこととしてもよい。

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

［継代培養］
市販のヒト毛乳頭細胞（PromoCell社、Ｐ２（継代数２））の継代培養を行った。すなわち、購入した毛乳頭細胞（Ｐ２）を培養液に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。培養液としては、市販の毛乳頭細胞増殖培地（PromoCell社）を用いた。

次いで、培養開始時の細胞密度が約０．９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となる量の細胞懸濁液を培養ディッシュに加えることで、毛乳頭細胞を当該培養ディッシュの平坦な底面（面積約５５ｃｍ^２）に播種した。そして、底面に接着した毛乳頭細胞（Ｐ３）の二次元培養を４日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

４日間の培養によって、毛乳頭細胞は増殖し、その細胞密度は、コンフルエントな状態のそれの７０％～９０％程度に到達した。この培養４日目における、コンフルエントになる前の毛乳頭細胞に０．２５％トリプシン溶液を加えて、当該毛乳頭細胞を培養ディッシュの底面から脱離させ、分散された当該毛乳頭細胞を得た。分散された毛乳頭細胞を回収し、新たな培養液に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。

次いで、培養開始時の細胞密度が約０．９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となる量の細胞懸濁液を、新たな培養ディッシュに加えることで、毛乳頭細胞を当該培養ディッシュの平坦な底面（面積約５５ｃｍ^２）に播種した。そして、底面に接着した毛乳頭細胞（Ｐ４）の二次元培養を３日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

培養３日目における、コンフルエントになる前の毛乳頭細胞に０．２５％トリプシン溶液を加えて、当該毛乳頭細胞を培養ディッシュの底面から脱離させ、分散された当該毛乳頭細胞を回収した。回収された毛乳頭細胞を新たな毛乳頭細胞増殖培地（PromoCell社）に懸濁し、当該毛乳頭細胞（Ｐ４）の細胞懸濁液を調製した。

［細胞培養］
例１として、毛乳頭細胞の長期接着培養を行った。すなわち、培養開始時の細胞密度が１×１０^４個／ウェル（約０．５３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）となる量の細胞懸濁液
を２４ウェルプレートの平底ウェル（底面積約１．９ｃｍ^２）に加えることで、毛乳頭細胞を当該ウェルの平坦な底面に播種した。播種された毛乳頭細胞（Ｐ５）は、ウェルの底面に接着した。そして、継代を行うことなく、毛乳頭細胞の接着培養を３０日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

一方、例Ｃ１として、毛乳頭細胞の長期浮遊培養を行った。すなわち、培養開始時の細胞密度が１×１０^３個／ウェルとなる量の細胞懸濁液を９６ウェルプレートの非接着性の丸底ウェルに加えることで、毛乳頭細胞を当該ウェル内に播種した。そして、継代を行うことなく、毛乳頭細胞（Ｐ５）の浮遊培養を３０日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。例Ｃ１において毛乳頭細胞は、培養時間の経過とともに凝集して、各ウェルに１つずつ細胞凝集塊（スフェロイド）を形成した。

なお、スフェロイドの径が大きすぎると、当該スフェロイドの内部の細胞が壊死してしまう。このため、内部が壊死しないサイズのスフェロイドが確実に形成されるよう、例Ｃ１においては、上述のとおり、例１の１０分の１の細胞密度で各ウェルに毛乳頭細胞を播種した。

［ギムザ染色］
例１で培養された毛乳頭細胞のギムザ染色を行った。具体的に、まずウェルから培養液を捨て、当該ウェルの底面に接着した細胞を適量のメタノールでリンスした。その後、ウェルにメタノールを添加して１０分間保持することで、当該ウェルの底面に接着した細胞を固定した。一方、Giemsa's azur eosin methylene blue solution (1.09204, Merck)を精製水で２００倍希釈してギムザ染色液を調製した。そして、ウェルからメタノールを捨て、代わりにギムザ染色液１ｍＬを当該ウェルに加えて１時間放置した。その後、ウェルを水で１０分間よく洗浄し、２日間乾燥させた。

［蛍光染色］
例１で培養された毛乳頭細胞の蛍光染色を行った。具体的に、まずウェル内の毛乳頭細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、ＰＢＳを用いた５分間の洗浄を２回行った。さらに、１％ＢＳＡ溶液を添加して３０分インキュベーションすることで、ブロッキングを行った。そして、ＢＳＡ溶液で希釈した１次抗体（抗フィブロネクチン抗体、抗Ｉ型コラーゲン抗体、又は抗ＡＬＰ抗体）溶液を加え、４℃で一晩振盪した。その後、ＰＢＳを用いた１０分間の洗浄を３回行った。

次いで、蛍光標識された２次抗体の溶液を添加して、６０分保持した。その後、ＰＢＳを用いた１０分間の洗浄を３回行った。さらに、ＤＡＰＩ溶液を添加して９分間保持することで、細胞核を染色した。その後、ＰＢＳを用いた５分間の洗浄を２回行った。こうして蛍光染色された毛乳頭細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

［細胞数］
市販のキット（RealTime-Glo(商標)）を用いて、例１及び例Ｃ１のそれぞれで培養された毛乳頭細胞の数を定量した。すなわち、ルシフェラーゼと、生細胞の還元能によって当該ルシフェラーゼの基質に変換される細胞透過性の前駆体基質とを含むキットを用いて、毛乳頭細胞の数を測定した。

［発毛関連遺伝子の発現量］
例１及び例Ｃ１のそれぞれで培養された毛乳頭細胞の発毛関連遺伝子の発現量を定量した。具体的に、毛乳頭細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写した後、ＲＴ－ＰＣＲを行って、発毛関連遺伝子の一つであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子の発現量を定量した。なお、ＲＴ－ＰＣＲには、次の塩基配列を有するプライマーを用いた。ＡＬＰのフォワードプライマー：５´－ＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴ－３´。ＡＬＰのリバースプライマー：５´－ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＧＣＡ－３´。ＧＡＰＤＨのフォワードプライマー：５´－ＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣ－３´。ＧＡＰＤＨのリバースプライマー：５´－ＣＧＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧ－３´。

［結果］
図１には、例１における培養１日目（Day 1）、３日目（Day 3）、５日目（Day 5）、１０日目（Day 10）、１５日目（Day 15）、２０日目（Day 20）、２５日目（Day 25）、及び３０日目（Day 30）のウェル内の毛乳頭細胞をギムザ染色した結果を示す。

図１に示すように、例１の接着培養において、毛乳頭細胞は培養時間の経過とともに増殖し、培養５日目（Day 5）にはコンフルエントに達した。ここで従来、毛乳頭細胞の数を増幅するための接着培養においては、コンフルエントに到達する前、又はコンフルエントに到達した時点で、酵素処理によって当該毛乳頭細胞を基材表面から脱離させて、分散された当該毛乳頭細胞を回収し、次いで、回収された当該毛乳頭細胞を新たな培養液に懸濁し、新たな基材表面上に播種するという継代が行われていた。

これに対し、例１では、コンフルエントに達した後も、継代することなく、毛乳頭細胞の接着培養を継続した。その結果、毛乳頭細胞は、コンフルエントに到達した後も増殖を続けた。そして、培養１０日目（図１のDay 10）には、ウェルの底面の一部の領域で、増殖した毛乳頭細胞が積み重なった状態で高密度で存在している部分（図１のDay 10の写真において濃く染色されている部分）が観察された。

ギムザ染色において、この毛乳頭細胞が積み重なった部分は、ウェルの平面視において独特の縞模様として観察された。さらに、培養時間の経過に伴い、ウェルの底面において積み重なった毛乳頭細胞が占める領域が広がっていく傾向がみられた。

図２には、例Ｃ１における培養１日目（Day 1）、３日目（Day 3）、５日目（Day 5）、１０日目（Day 10）、１５日目（Day 15）、２０日目（Day 20）、２５日目（Day 25）、及び３０日目（Day 30）のウェル内の毛乳頭細胞を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。

図２に示すように、例Ｃ１の浮遊培養において、毛乳頭細胞は凝集し、培養１日目（Day 1）でスフェロイドを形成した。その後、スフェロイドのサイズは、やや増加したものの、培養１０日目以降はほとんど変化しなかった。

図３には、例１（実線）及び例Ｃ１（点線）における毛乳頭細胞の数を経時的に定量した結果を示す。図３において、横軸は培養日数（毛乳頭細胞を播種してから経過した日数）（日）を示し、縦軸は細胞数（×１０^４cells）を示す。

なお、上述のとおり、例１では１×１０^４個の細胞を２４プレートの１つのウェルに播種したのに対し、例Ｃ１では１×１０^４個の細胞を９６プレートの１０個のウェルに播種した。このため、図３では、培養１日目における１×１０^４個の細胞が、その後、培養時間の経過に伴ってどのように増えたかを示している。また、例１については、図３に示される細胞数をウェルの底面積（約１．９ｃｍ^２）で除して得られる値が、接着培養における細胞密度に相当する。

図３に示すように、例Ｃ１において浮遊培養され、スフェロイドを形成した毛乳頭細胞の増殖はわずかであった。すなわち、例Ｃ１において、培養３０日目の毛乳頭細胞の数は、培養１日目のそれの約２．４倍であった。

これに対し、例１において接着培養された毛乳頭細胞は、ウェルの底面上で増殖し、培養５日目にはコンフルエントに達した。具体的に、例１における毛乳頭細胞の数は、培養１日目で１．０９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（０．５７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養３日目で３．４６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１．８２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養５日目で６．６３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（３．４９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）であった。

さらに、例１の毛乳頭細胞は、コンフルエントに到達した後も増殖を続け、その数は培養２５日目まで増加した。具体的に、例１における毛乳頭細胞の数は、培養１０日目で１２．０２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６．３２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養１５日目で１７．７６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（９．３５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養２０日目で１８．９７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（９．９８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養２５日目で２０．１８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１０．６２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養３０日目で１９．９０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１０．４８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）であった。すなわち最終的に、例１の培養３０日目における毛乳頭細胞の数は、培養１日目のそれの約１８．４倍、及び培養５日目のそれの約３．０倍に増幅した。

図４には、例１（実線）及び例Ｃ１（点線）で培養された毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子の発現量を経時的に定量した結果を示す。図４において、横軸は培養日数（日）を示し、縦軸は例１の培養１日目におけるＡＬＰ遺伝子の発現量（算術平均値、ｎ＝３）を「１」とした場合の相対的なＡＬＰ遺伝子発現量を示す。

図４に示すように、例Ｃ１の毛乳頭細胞（すなわち、スフェロイドを形成している毛乳頭細胞）のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養５日目までは例１のそれより高く維持されていた。

これに対し、例１の毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養５日目まで（すなわちコンフルエントに到達するまで）減少する傾向を示したが、その後、増加傾向に転じ、培養１０日目には例Ｃ１のそれと同程度になった。

具体的に、例１の毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養１０日目には培養１日目の
それの約１．３倍及び培養５日目のそれの約１．９倍に達した。さらに、培養１０日目以降も例１の毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は増加し続けたのに対し、例Ｃ１の毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は低下する傾向がみられた。そして、例１の毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養１５日目には培養１日目のそれの約１．８倍及び培養５日目のそれの約２．６倍に達し、培養２０日目には培養１日目のそれの約２．２倍及び培養５日目のそれの約３．２倍に達し、培養２５日目には培養１日目のそれの約４．０倍及び培養５日目のそれの約５．８倍に達し、培養３０日目には培養１日目のそれの約３．９倍及び培養５日目のそれの約５．８倍に達した。最終的に、培養３０日目において、例１の毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、例Ｃ１のそれの約６．９倍に達した。

図５には、培養５日目（Day 5）及び培養３０日目（Day 30）における例１の毛乳頭細胞の細胞核をＤＡＰＩで蛍光染色し、当該毛乳頭細胞の細胞層の断面を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。上述のとおり、培養５日目（Day 5）において、例１の毛乳頭細胞はコンフルエントに達していたが、ウェルの底面上で積み重なることなく１層で接着していた。

これに対し、培養３０日目（Day 30）において、ギムザ染色で比較的薄い色で染色された細胞密度が比較的低い部分（Day 30：低密度部分）は、３層程度の細胞層を形成するよう積み重なった毛乳頭細胞を含み、また、ギムザ染色で比較的濃い色で染色された細胞密度が比較的高い部分（Ｄａｙ３０：高密度部分）は、４層から６層程度の細胞層を形成するよう積み重なった毛乳頭細胞を含んでいた。

図６Ａには、培養５日目（Day 5）及び培養３０日目（Day 30）における例１のウェル内のフィブロネクチン及び細胞核を免疫蛍光二重染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。図６Ｂには、図６Ａに示す蛍光二重染色画像のうち、フィブロネクチンの蛍光染色画像のみを示す。図６Ｃには、培養５日目（Day 5）及び培養３０日目（Day 30）における例１のウェル内のＩ型コラーゲン及び細胞核を免疫蛍光二重染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。図６Ｄには、図６Ｃに示す蛍光二重染色画像のうち、Ｉ型コラーゲンの蛍光染色画像のみを示す。図６Ｅには、培養５日目（Day 5）及び培養３０日目（Day 30）における例１のウェル内のＡＬＰ及び細胞核を免疫蛍光二重染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。図６Ｆには、図６Ｅに示す蛍光二重染色画像のうち、ＡＬＰの蛍光染色画像のみを示す。

図６Ａから図６Ｆに示すように、ウェル内のフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン及びＡＬＰの量は、培養５日目より培養３０日のほうが顕著に大きかった。すなわち、培養時間の経過に伴って、毛乳頭細胞が増殖するとともに、毛乳頭細胞により生成されたフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン及びＡＬＰが蓄積していったと考えられた。

また、培養３０日目（Day 30）においては、細胞密度が比較的低い部分（Day 30：低密度部分）よりも、細胞密度が比較的高い部分（Day 30：高密度部分）において、より多くのフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン及びＡＬＰが蓄積されていた。

［細胞の採取］
医療機関において脱毛症患者から採取され、研究室に冷蔵輸送されてきた頭髪の毛包からヒト毛包間葉系細胞を採取した。すなわち、まず毛包をプラスチックディッシュに移し、マイクロピンセット及びマイクロ剪刃を用いて、当該毛包のうち毛乳頭より上方の組織を切断し分離した。次いで、得られた毛乳頭及びその周囲の組織（毛乳頭及び毛球部真皮毛根鞘を含む毛包の下部組織）を新たなプラスチックディッシュに移し、ディスパーゼ及びコラゲナーゼを含む溶液（具体的には、ＨＢＳＳとＰＢＳとを体積比１：１で混合した溶液にDispase II（最終濃度4.8U/mL）とCollagenase（最終濃度100U/mL）とを混合し、滅菌フィルターを通して調製された酵素溶液）に浸し、３７℃で３０分インキュベートすることで酵素処理を施した。

その後、プラスチックディッシュから上澄みを捨て、代わりに新たな培養液を添加し、酵素処理によって軟化した毛乳頭及びその周辺組織をピペッティングでほぐした。その結果、毛乳頭の破片、毛乳頭の一部が付着した周辺組織、及び分散細胞を含む混合物が得られた。次いで、この混合物を含む培養液２ｍＬを６ウェルプレートの平底ウェル（底面積約９．５ｃｍ^２）に加えて、２日間の培養を行った。２日間の培養によって、混合物に含まれていた毛乳頭の破片及び一部の分散細胞がウェルの底面に接着した。培養２日目に、ウェルの底面に接着していない組織片及び細胞を含む培養液を捨て、代わりに新たな培養液を添加した。

そして、ウェルの底面に接着した細胞の培養を継続した。培養液は２日に１回交換した。培養期間中、底面に接着した毛乳頭の破片からは当該底面上に細胞が遊走してきた。これらウェル底面に接着した毛包間葉系細胞（継代数ゼロ：Ｐ０）は、培養時間の経過に伴って、当該底面上で増殖し、培養７日目にコンフルエントに到達した。

［細胞培養］
上述のようにコンフルエントに到達した毛包間葉系細胞に０．２５％トリプシン溶液を加えてウェルの底面から脱離させ、分散された当該毛包間葉系細胞を得た。分散された毛包間葉系細胞を回収し、毛乳頭細胞増殖培地（PromoCell社）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。

そして、例２として、上述の実施例１における例１と同様に、毛包間葉系細胞の長期接着培養を行った。すなわち、培養開始時の細胞密度が１×１０^４個／ウェル（約５．３×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）となる量の細胞懸濁液を２４ウェルプレートの平底ウェル（底面積約１．９ｃｍ^２）に加えることで、毛包間葉系細胞を当該ウェルの平坦な底面に播種した。播種された毛包間葉系細胞（Ｐ１）は、ウェルの底面に接着した。そして、継代を行うことなく、毛包間葉系細胞の接着培養を３０日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

一方、例Ｃ２－１として、上述の実施例１における例Ｃ１と同様に、毛包間葉系細胞の長期浮遊培養を行った。すなわち、培養開始時の細胞密度が１×１０^３個／ウェルとなる量の細胞懸濁液を９６ウェルプレートの非接着性の丸底ウェルに加えることで、毛包間葉系細胞を当該ウェル内に播種した。そして、継代を行うことなく、毛包間葉系細胞（Ｐ１）の浮遊培養を３０日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

また、例Ｃ２－２として、毛包間葉系細胞の継代培養を行った。すなわち、培養開始時の細胞密度が１×１０^４個／ウェル（約５．３×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）となる量の細胞懸濁液を２４ウェルプレートの平底ウェル（底面積約１．９ｃｍ^２）に加えることで、毛包間葉系細胞を当該ウェルの平坦な底面に播種した。そして、底面に接着した毛包間葉系細胞（Ｐ１）の培養を５日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

その後、例Ｃ２－２では、培養５日目にコンフルエントに達した毛包間葉系細胞に０．２５％トリプシン溶液を加えてウェルの底面から脱離させ、分散された当該毛包間葉系細胞を回収した。回収された毛包間葉系細胞を新たな培養液に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。次いで、培養開始時の細胞密度が１×１０^４個／ウェル（約５．３×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）となる量の細胞懸濁液を、新たな２４ウェルプレートの平底ウェルに加えることで、毛包間葉系細胞を当該ウェルの平坦な底面に播種した。そして、底面に接着した毛包間葉系細胞（Ｐ２）の培養を５日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

さらに、例Ｃ２－２では同様に、Ｐ２の毛包間葉系細胞の培養５日目（Ｐ１の毛包間葉系細胞を播種してから１０日目）に、コンフルエントに達した当該毛包間葉系細胞を回収し、新たなウェルの底面に播種した。そして、毛包間葉系細胞（Ｐ３）の培養を５日間行った。さらに、例Ｃ２－２では同様に、Ｐ３の毛包間葉系細胞の培養５日目（Ｐ１の毛包間葉系細胞を播種してから１５日目）に、コンフルエントに達した当該毛包間葉系細胞を回収し、新たなウェルの底面に播種した。そして、毛包間葉系細胞（Ｐ４）の培養を５日間行った。さらに、例Ｃ２－２では同様に、Ｐ４の毛包間葉系細胞の培養５日目（Ｐ１の毛包間葉系細胞を播種してから２０日目）に、コンフルエントに達した当該毛包間葉系細胞を回収し、新たなウェルの底面に播種した。そして、毛包間葉系細胞（Ｐ５）の培養を５日間行った。

［ギムザ染色］
上述の実施例１と同様に、例２で培養された毛包間葉系細胞のギムザ染色を行った。

［細胞数］
上述の実施例１と同様に、例２、例Ｃ２－１及び例Ｃ２－２のそれぞれで培養された毛包間葉系細胞の数を定量した。

［発毛関連遺伝子の発現量］
上述の実施例１と同様に、例２、例Ｃ２－１及び例Ｃ２－２のそれぞれで培養された毛包間葉系細胞の発毛関連遺伝子の発現量を定量した。

［結果］
図７Ａには、例２における培養５日目（Day 5）、１０日目（Day 10）、２０日目（Day 20）、及び３０日目（Day 30）のウェル内の毛包間葉系細胞のギムザ染色を低倍率で観察した結果を示す。図７Ｂには、例２における培養５日目（Day 5）、１０日目（Day 10）、２０日目（Day 20）、及び３０日目（Day 30）のウェル内の毛包間葉系細胞のギムザ染色を高倍率で観察した結果を示す。

図７Ａ及び図７Ｂに示すように、例２の接着培養において、毛包間葉系細胞は培養時間の経過とともに増殖し、培養５日目（Day 5）にはコンフルエントに達した。また、例２では、コンフルエントに達した後も、継代することなく、毛包間葉系細胞の接着培養を継続した。その結果、毛包間葉系細胞は、コンフルエントに到達した後も増殖を続けた。

そして、培養１０日目（図７Ａ及び図７ＢのDay 10）には、ウェルの底面の一部の領域で、増殖した毛包間葉系細胞が積み重なった状態で高密度で存在している部分（図７Ａ及び図７ＢのDay 10の写真において濃く染色されている部分）が観察された。さらに、この毛包間葉系細胞が積み重なった部分は、培養時間の経過に伴い増加する傾向がみられた。

図８には、例Ｃ２－１における培養５日目（Day 5）、１０日目（Day 10）、２０日目（Day 20）、及び３０日目（Day 30）のウェル内の毛包間葉系細胞を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図８に示すように、例Ｃ２－１の浮遊培養において、毛包間葉系細胞は凝集してスフェロイドを形成した。培養期間を通じて、スフェロイドのサイズに大きな変化は見られなかった。

図９には、例２（実線）、例Ｃ２－１（点線）及び例Ｃ２－２（一点鎖線）において毛包間葉系細胞の数を経時的に定量した結果を示す。図３と同様、図９において、横軸は培養日数を示し、縦軸は細胞数（×１０^４ cells）を示す。

図９に示すように、例Ｃ２－１において浮遊培養され、スフェロイドを形成した毛包間葉系細胞の増殖はわずかであった。すなわち、例Ｃ２－１において、培養３０日目の毛包間葉系細胞の数は、培養１日目のそれの約２．９倍であった。

これに対し、例２及び例Ｃ２－２において接着培養された毛包間葉系細胞は、ウェルの底面上で増殖し、培養５日目にはコンフルエントに達した。具体的に、例２における毛包間葉系細胞の数は、培養１日目で１．２１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（０．６４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養３日目で４．１４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２．１８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養５日目で６．９１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（３．６４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）であった。

さらに、例２の毛包間葉系細胞は、コンフルエントに達した後も増殖を続け、その数は培養２５日目まで増加した。具体的に、例１における毛包間葉系細胞の数は、培養１０日目で１４．２８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（７．５２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養１５日目で１９．９０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１０．４７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養２０日目で２１．３４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１１．２３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養２５日目で２１．８２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１１．４８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）、培養３０日目で２１．４８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１１．３０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）であった。すなわち最終的に、例２の培養３０日目における毛包間葉系細胞の数は、培養１日目のそれの約１７．７倍、及び培養５日目のそれの約３．１倍に達した。また、培養３０日目において、例２の毛包間葉系細胞の数は、例Ｃ２－１のそれの約８．４倍に達した。

一方、例Ｃ２－２においては、上述のとおり毛包間葉系細胞の継代を繰り返した。その結果、Ｐ２の毛包間葉系細胞の培養５日目（すなわちＰ１の毛包間葉系細胞を播種してから１０日目）において、当該毛包間葉系細胞（Ｐ２）の数は、Ｐ１の毛包間葉系細胞の培養１日目におけるそれの約２１倍に達した。例Ｃ２－２においては、その後も継代のたびに毛包間葉系細胞の数は増幅した。

図１０には、例２（実線）、例Ｃ２－１（点線）及び例Ｃ２－２（一点鎖線）で培養された毛包間葉系細胞のＡＬＰ遺伝子の発現量を経時的に定量した結果を示す。図４と同様、図１０において、横軸は、Ｐ１の毛包間葉系細胞を播種してから経過した培養日数（日）を示し、縦軸は例２の培養１日目におけるＡＬＰ遺伝子の発現量（算術平均値、ｎ＝３）を「１」とした場合の相対的なＡＬＰ遺伝子発現量を示す。

図１０に示すように、例Ｃ２－１の毛包間葉系細胞（すなわち、スフェロイドを形成している毛包間葉系細胞）のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養５日目まで急激に増加し、その後も緩やかに増加を続ける傾向を示した。

一方、例Ｃ２－２の毛包間葉系細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養時間の経過に伴い低下する傾向を示した。なお、図１０に示す例Ｃ２－２の結果については、培養５日目の値はＰ１細胞（Ｐ１細胞の培養５日目）の結果を示し、培養１０日目の値はＰ２細胞（Ｐ２細胞の培養５日目）の結果を示し、培養１５日目の値はＰ３細胞（Ｐ３細胞の培養５日目）の結果を示し、培養２０日目の値はＰ４細胞（Ｐ４細胞の培養５日目）の結果を示し、培養２５日目の値はＰ５細胞（Ｐ５細胞の培養５日目）の結果を示す。

これらに対し、例２の毛包間葉系細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養５日目まで（すなわちコンフルエントに到達するまで）減少する傾向を示したが、その後、増加傾向に転じ、培養２５日目から培養３０日目の間に、例２－１のそれを上回った。

具体的に、例２の毛包間葉系細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、培養１０日目には培養１日目のそれの約１．２倍及び培養５日目のそれの約４．２倍に達し、培養１５日目には培養１日目のそれの約１．５倍及び培養５日目のそれの約５．４倍に達し、培養２０日目には培養１日目のそれの約２．３倍及び培養５日目のそれの約８．２倍に達し、培養２５日目には培養１日目のそれの約３．７倍及び培養５日目のそれの約１２．９倍に達し、培養３０日目には培養１日目のそれの約９．９倍及び培養５日目のそれの約３４．９倍に達した。最終的に、培養３０日目において、例２の毛包間葉系細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は、例Ｃ２－１のそれの約１．９倍、及び例Ｃ２－２のそれの約３４．９倍に達した。

［細胞培養］
例３においては、上述の実施例１の例１と同様にして、市販のヒト毛乳頭細胞を２４ウェルプレートの平底ウェルに播種し、継代を行うことなく、当該毛乳頭細胞の接着培養を３０日間行った。

例Ｃ３においては、上述の実施例１の例Ｃ１と同様にして、市販のヒト毛乳頭細胞を９６ウェルプレートの丸底ウェルに播種し、継代を行うことなく、当該毛乳頭細胞の浮遊培養を３０日間行った。

［移植実験］
例３における培養５日目及び３０日目の毛乳頭細胞を０．２５％トリプシン溶液を用いてウェル底面から脱離させ、分散された当該毛乳頭細胞を回収した。また、例Ｃ３における培養５日目及び３０日目のスフェロイドを、それぞれ０．２５％トリプシン溶液中で保持し、その後、ピペッティングによって当該スフェロイドを構成する毛乳頭細胞を分散させ、回収した。

一方、胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、４８Ｕ／ｍＬディスパーゼ処理を４℃で１時間、２０～３０ｒｐｍ振とう条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を８０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。

例３で回収した毛乳頭細胞、又は例Ｃ３で回収した毛乳頭細胞と、上述のようにして単離した上皮系細胞とを培養液に混合し、分散された毛乳頭細胞及び上皮系細胞を含む細胞懸濁液を調製した。なお、培養液としては、間葉系細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）と、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２とを体積比１：１で混合して調製された混合培地を用いた。

次いで、９６ウェルプレートの非接着性の丸底ウェルの各々に、毛乳頭細胞の播種密度が１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル及び上皮系細胞の播種密度が１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル（全細胞数２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル）となる量の細胞懸濁液を加えることで、当該毛乳頭細胞及び上皮系細胞を播種した。

そして毛乳頭細胞と上皮系細胞との共培養である浮遊培養をインキュベータ内で３日間行った。この共培養において、毛乳頭細胞及び上皮系細胞は凝集し、各ウェル内で１つの細胞凝集塊（毛包原基）を形成した。すなわち、培養時間が経過するにつれて、各ウェル内において細胞同士は自発的に凝集して、球状で浮遊状態の細胞凝集塊を形成した。

上述のようにして３日間の培養で形成した細胞凝集塊を回収して、ヌードマウスの皮内に移植した。すなわち、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を施し、その背部をイソジンで消毒した。次いで、Ｖランスマイクロメス（日本アルコン）を用いて、皮膚の表皮層から真皮層下部に至る移植創を形成した。そして、この移植創に、細胞凝集塊を3０個ずつ注入した。なお、ヌードマウスの飼育及び移植実験は、横浜国立大学動物実験専門委員会の指針を遵守して行った。

［結果］
図１１Ａには、例３の接着培養における培養５日目（Day 5）、及び３０日目（Day 30）のウェル内の毛乳頭細胞を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図１１Ａに示すように、培養５日目（Day 5）において毛乳頭細胞はコンフルエントに達していたが、当該毛乳頭細胞の積み重なりは見られず、当該毛乳頭細胞は単一の層を形成していた。一方、培養３０日目（Day 30）の毛乳頭細胞は、ウェル内の一部において、当該毛乳頭細胞が積み重なった高密度部分を含んでいた。

図１１Ｂには、例Ｃ３の浮遊培養における培養５日目（Day 5）、及び３０日目（Day 30）のウェル内のスフェロイドを位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図１１Ｂに示すように、培養５日目（Day 5）と３０日目（Day 30）とでスフェロイドの外観に大きな差異は見られなかった。

図１２Ａには、例３において接着培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊、及び例３において接着培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図１２Ｂには、例Ｃ３において浮遊培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊、及び例Ｃ３において浮遊培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を位相差顕微鏡で観察した結果を示す。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、これらの細胞凝集塊の外観に大きな差異は見られなかった。

図１３Ａには、例３において接着培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植してから２１日後のマウス皮膚の写真、及び例３において接着培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植してから２１日後のマウス皮膚の写真を示す。

図１３Ａに示すように、例３で接着培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合に再生された毛髪の量のほうが、接着培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合のそれに比べて顕著に多かった。

図１３Ｂには、例Ｃ３において浮遊培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植してから２１日後のマウス皮膚の写真、及び例Ｃ３において浮遊培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植してから２１日後のマウス皮膚の写真を示す。

図１３Ｂに示すように、例Ｃ３で浮遊培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合に再生された毛髪の量のほうが、例Ｃ３で浮遊培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合のそれに比べて顕著に少なかった。

図１４Ａには、例３において接着培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊の移植部位に生えた毛、及び、接着培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊の移植部位に生えた毛を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した結果を示す。図１４Ｂには、例Ｃ３において接着培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊の移植部位に生えた毛、及び、接着培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊の移植部位に生えた毛をＳＥＭで観察した結果を示す。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、細胞凝集塊を移植した部位に生えた毛はいずれも、生体の毛髪と同様のキューティクル構造を有していることが確認された。

図１５には、図１３Ａ及び図１３Ｂに示した４つの場合について、マウス皮膚で再生した毛髪の本数（縦軸）をカウントした結果を示す。図１５に示すように、例Ｃ３の浮遊培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合（例Ｃ３のDay 30（黒塗り棒グラフ））に再生された毛髪の数は、例Ｃ３の浮遊培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合（例Ｃ３のDay 5（白抜き棒グラフ））のそれの約０．４２倍であった。

これに対し、例３の接着培養３０日目（Day 30）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合（例３のDay 30（黒塗り棒グラフ））に再生された毛髪の数は、例３の接着培養５日目（Day 5）に回収された毛乳頭細胞を含む細胞凝集塊を移植した場合（例３のDay 5（白抜き棒グラフ））のそれの約３８倍であった。このように、例３の長期高密度接着培養によって数が増幅された毛乳頭細胞は、極めて高い毛髪再生能を有することが示された。

［細胞の採取］
上述の実施例２と同様に、脱毛症患者の頭髪の毛包からヒト毛包間葉系細胞を採取し、６ウェルプレートの平底ウェル内で培養した。ウェル底面に接着した毛包間葉系細胞（継代数ゼロ：Ｐ０）は、培養時間の経過に伴って、当該底面上で増殖し、培養７日目にコンフルエントに到達した。

［細胞培養］
上述の実施例２と同様に、コンフルエントに到達した毛包間葉系細胞をウェルの底面から脱離させ、分散された毛包間葉系細胞を毛乳頭細胞増殖培地に懸濁して、細胞懸濁液を調製した。

そして、例４－１として、上述の実施例２における例２と同様に、毛包間葉系細胞の長期接着培養を行った。すなわち、培養開始時の細胞密度が１×１０^４個／ウェル（約５．３×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）となる量の細胞懸濁液を２４ウェルプレートの平底ウェル（底面積約１．９ｃｍ^２）に加えることで、毛包間葉系細胞を当該ウェルの平坦な底面に播種した。播種された毛包間葉系細胞（Ｐ１）は、ウェルの底面に接着した。そして、継代を行うことなく、毛包間葉系細胞の接着培養を３０日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

また、例４－２として、上述の例４－１と同様に、毛包間葉系細胞の接着培養を３０日間行った。

また、例４Ｃとして、上述の例４－１及び例４－２の培養２５日目に、上述の例４－１及び例４－２と同様に患者の毛包から調製された毛包間葉系細胞を２４ウェルプレートのウェルの平坦な底面に播種した。播種された毛包間葉系細胞（Ｐ１）は、ウェルの底面に接着した。そして、継代を行うことなく、毛包間葉系細胞の接着培養を５日間行った。培養液の交換は２日に１回行った。

［培養細胞の回収］
例４－１においては、培養３０日目に、市販のセルスクレーパーを用いて、各ウェルの底面から毛包間葉系細胞を剥離させた。その結果、各ウェルから回収された、積み重なった毛包間葉系細胞を含み培地中に浮遊する細胞層片を得た。この細胞層片は、底面から剥離された直後はシート状であったが、培地中で浮遊している間に凝集し、細胞凝集塊を形成した。

例４－２においては、培養３０日目に、各ウェルに０．２５％トリプシン溶液を加えて、各ウェルの底面から毛包間葉系細胞を剥離させた。その結果、各ウェルから回収され、培地中に分散された毛包間葉系細胞を得た。

例４Ｃにおいては、その培養５日目、すなわち例４－１及び例４－２の培養３０日目に、各ウェルに０．２５％トリプシン溶液を加えて、各ウェルの底面から毛包間葉系細胞を剥離させた。その結果、各ウェルから回収され、培地中に分散された毛包間葉系細胞を得た。

［移植実験］
まず上述の実施例３と同様に、マウス胎児の皮膚組織から上皮系細胞を単離した。次いで、約２．２×１０^５個の上皮系細胞と、約２．２×１０^５個の毛包間葉系細胞を含む例４－１の細胞凝集塊、約２．２×１０^５個の例４－２の分散された毛包間葉系細胞、又は約２．２×１０^５個の例４Ｃの分散された毛包間葉系細胞とを混合して、３種類の細胞懸濁液を調製した。さらに、各細胞懸濁液を容積２００μＬのマイクロチップに入れ、当該マイクロチップに遠心処理を施すことにより、当該マイクロチップ内で沈降した細胞凝集塊を得た。そして、上述の実施例３と同様に、各細胞凝集塊をパッチ法にてヌードマウスの皮内に移植した。

［結果］
図１６Ａには、移植後２１日目に、ヌードマウスの背部のうち例４－１の細胞が移植された部位を撮影して得られた写真を示す。同様に、図１６Ｂ及び図１６Ｃには、移植後２１日目に、ヌードマウスの背部のうち、例４－２の細胞が移植された部位、及び例４Ｃの細胞が移植された部位をそれぞれ撮影して得られた写真を示す。また、図１７には、例４－１の細胞が移植された部位、例４－２の細胞が移植された部位、及び例４Ｃの細胞が移植された部位のそれぞれにおいて移植後２１日目に生えていた毛髪の数をカウントした結果を示す。

図１６Ａ～１６Ｂ及び図１７に示すように、例４－１の細胞が移植された部位における発毛数、及び例４－２の細胞が移植された部位における発毛数は、例４Ｃのそれに比べて顕著に多かった。さらに、例４－１の細胞が移植された部位における発毛数は、例４－２のそれに比べて顕著に多かった。

［細胞培養］
上述の実施例１の例１と同様に、市販のヒト毛乳頭細胞を継代培養し、継代数が６の毛乳頭細胞を得た。そして、例５として、この毛乳頭細胞（Ｐ６）を２４ウェルプレートの平底ウェルに播種し、継代を行うことなく、当該毛乳頭細胞の接着培養を５５日間行った。

［培養細胞の回収］
例５においては、上述の実施例４の例４－１と同様に、培養５５日目に、市販のセルスクレーパーを用いて、各ウェルの底面から毛乳頭細胞を剥離させ、培地中で浮遊している細胞凝集塊を回収した。次いで、回収された細胞凝集塊を市販の蛍光染色用試薬（DiD Cell-Labeling Solution）で染色した。また、例５Ｃとして、長期接着培養を行っていない分散された毛乳頭細胞（Ｐ６）を市販の蛍光染色用試薬（DiD Cell-Labeling Solution）で染色した。

［移植実験］
例５においては、染色された細胞凝集塊を２匹のＳＨＯマウス（５週齢、The Jackson Laboratory）のそれぞれの背部の互いに離間した３か所の皮下に移植した。また、例５Ｃにおいては、染色された毛乳頭細胞を分散された状態で各ＳＨＯマウスの背部の互いに離間した３か所の皮下に移植した。

［蛍光強度の測定］
移植直後、及び、移植後７日目に、市販のIn vivo蛍光イメージング装置（IVIS（商標） Lumina Series III、Perkin Elmer）を用いて、マウスの各移植部位の蛍光強度を測定した。そして各移植部位について、移植直後における蛍光強度に対する、移植後７日目における蛍光強度の比率を相対蛍光強度として評価した。なお、蛍光強度は、市販のソフトウェア（Living Image（商標） Software、Perkin Elmer）を用いて測定した。

［結果］
図１８には、例５の細胞が移植された部位、及び例５Ｃの細胞が移植された部位のそれぞれにおいて相対蛍光強度を評価した結果を示す。図１８に示すように、例５の細胞が移植された部位の相対蛍光強度は、図５Ｃのそれより顕著に大きかった。

Claims (14)

1. 基材表面に接着した毛包間葉系細胞を、前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の範囲内である状態から、継代することなく培養する主工程を含み、
   前記主工程は、前記毛包間葉系細胞を、前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態から、さらに増殖させて、増殖した前記毛包間葉系細胞が前記基材表面の少なくとも一部において積み重なって２層以上の細胞層を形成するまで培養することを含む、
   増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
2. 前記主工程は、前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態から１２０時間以上の時間が経過するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
   請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
3. 前記主工程は、前記基材表面上の前記毛包間葉系細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上に到達するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
   請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
4. 前記主工程は、前記基材表面上の前記毛包間葉系細胞の細胞密度が７×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の状態で５０時間以上、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
   請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
5. 前記主工程は、前記基材表面上の前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態におけるそれの１．５倍以上に到達するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
   請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
6. 前記主工程は、前記毛包間葉系細胞の１以上の発毛関連遺伝子の発現量が前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態におけるそれの１．５倍以上に増加するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
   請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
7. 前記主工程に先立って実施される前工程をさらに含み、
   前記前工程は、前記基材表面上において、未だ前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態に到達していない前記毛包間葉系細胞を培養して、前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態に到達するまで前記毛包間葉系細胞を増殖させることを含む、
   請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
8. 前記前工程は、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の細胞密度で前記毛包間葉系細胞を培養して、前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態に到達するまで前記毛包間葉系細胞を増殖させることを含む、
   請求項７に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
9. 前記主工程は、前記前工程における前記毛包間葉系細胞の培養の開始から２００時間以上の時間が経過するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
   請求項７に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
10. 前記主工程は、前記毛包間葉系細胞の１以上の発毛関連遺伝子の発現量が、前記前工程における前記毛包間葉系細胞の培養開始から２４時間が経過した時点のそれの１．１倍以上に増加するまで、前記毛包間葉系細胞を培養することを含む、
    請求項７に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
11. 前記主工程において前記基材表面上における前記毛包間葉系細胞の細胞密度が前記範囲内である前記状態から継代することなく前記基材表面上で培養して得られた毛包間葉系細胞を、前記基材表面から脱離させて回収する回収工程をさらに含む、
    請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
12. 前記毛包間葉系細胞は、毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞からなる群より選択される１以上である、
    請求項１に記載の増幅毛包間葉系細胞の製造方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法を実施すること、及び、
    前記方法により製造された増幅毛包間葉系細胞を含む細胞凝集塊を形成すること
    を含む、
    細胞凝集塊の製造方法。
14. 請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法を実施すること、及び、
    前記方法により製造された増幅毛包間葉系細胞を含む移植用組成物を調製すること
    を含む、
    移植用組成物の製造方法。