ES3037364T3 - Sterilization and filtration of peptide compositions - Google Patents

Abstract

Métodos y dispositivos para esterilizar composiciones peptídicas viscosas que tienen propiedades reológicas de pseudoplástico a altas concentraciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Esterilización y filtración de composiciones peptídicas

Esta solicitud hace referencia a una lista de secuencias enviada en formato electrónico como archivo ASCII.txt denominado “ 2004837-0044_Sequences.txt” . El archivo.txt se generó el 9 de marzo de 2015 y tiene un tamaño de 1 kb.

Antecedentes

Los agentes peptídicos con la capacidad de autoensamblarse en estructuras de gel tienen una amplia variedad de usos en contextos terapéuticos y de investigación. Uno de tales agentes peptídicos, por ejemplo, un polipéptido sintético de 16 aminoácidos con una secuencia repetitiva de arginina, alanina y ácido aspártico (es decir, RADA<r>A<d>A<r>ADARADA [SEQ ID NO: 1], también conocido como “ RADA16” ), está comercialmente disponible bajo los nombres comerciales PuraStat®, PuraMatrix®, and PuraMatrix GMP®de 3-D Matrix Medical Technology, y ha demostrado su utilidad en una amplia variedad de aplicaciones clínicas y de laboratorio, que incluyen el cultivo celular, la administración de fármacos, el crecimiento acelerado de cartílago y hueso, y regeneración del SNC, tejido blando y músculo cardíaco, y asimismo como matriz, armazón o atadura que puede asociarse con uno o más agentes detectables, principios biológicamente activos, células y/o componentes celulares. La patente WO2010/147763A2 expone la eliminación de agentes antiplaquetarios y antococoagulantes previamente añadidos a una preparación plaquetaria para mejorar el período de validez de la preparación plaquetaria antes de la administración a un paciente. La patente WO2014/008400A2 expone la esterilización y el envasado a escala comercial de RADA16 al 2,5 %. La patente WO2010/017369A2 expone el “ adelgazamiento por cizallamiento” de un hidrogel autoensamblado a través de una aguja de jeringa.

Resumen

La presente invención proporciona métodos para esterilizar una composición peptídica líquida tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria.

Entre otras cosas, la presente exposición demuestra que ciertas composiciones peptídicas (p. ej., composiciones peptídicas particulares, en concentraciones particulares y/o que tienen propiedades reológicas particulares) tienen ciertas características y/o pueden no ser aptas para ciertas etapas de manipulación y/o procesamiento tales como, por ejemplo, filtración (p. ej., filtración esterilizante).

La presente exposición también demuestra que ciertas composiciones peptídicas particulares son sorprendentemente estables a uno o más tratamientos (p. ej., tratamiento térmico, como se aplica en procedimientos de autoclave) que dañan muchas composiciones peptídicas.

Por tanto, la presente exposición describe una variedad de tecnologías relevantes para el procesamiento de composiciones peptídicas y, particularmente, para la esterilización.

La presente exposición demuestra que las composiciones peptídicas particulares pueden tener una o más características útiles y/o sorprendentes (p. ej., resistencia al daño por tratamiento térmico, respuesta reológica y/o recuperación de la aplicación de tensión de cizallamiento, etc.).

La presente exposición describe, entre otras cosas, sistemas para esterilizar composiciones peptídicas y/o sistemas para determinar tales sistemas apropiados para su aplicación a composiciones peptídicas particulares.

Las composiciones peptídicas particulares pueden definirse, por ejemplo, por una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: secuencia de péptidos, concentración peptídica, viscosidad, rigidez, sensibilidad al tratamiento térmico, capacidad de respuesta reológica a la aplicación de tensión de cizallamiento, recuperación reológica de la aplicación de tensión de cizallamiento, etc.).

Entre otras cosas, la presente exposición describe ciertas composiciones peptídicas que pueden esterilizarse mediante tratamiento en autoclave.

La presente exposición describe ciertas tecnologías para lograr la filtración de ciertas composiciones peptídicas y, particularmente, para alterar las propiedades reológicas de las composiciones peptídicas (como se define por la identidad y la secuencia del péptido) para que sean susceptibles de filtración. Por ejemplo, en algunos casos, la viscosidad de las composiciones peptídicas a filtrar puede reducirse antes de la filtración. En algunos casos, puede aplicarse tensión de cizallamiento a las composiciones peptídicas, de modo que puedan alterarse las propiedades reológicas. Por ejemplo, la viscosidad y/o la rigidez de una composición peptídica pueden reducirse antes de la filtración; en algunos casos, tal reducción es temporal.

Las tecnologías descritas permiten la filtración de composiciones peptídicas a concentraciones más altas de lo que es factible con las técnicas de filtración convencionales. Por ejemplo, las tecnologías descritas en la presente memoria permiten filtrar RADA16 y, particularmente, esterilizar por filtración, a concentraciones superiores al 2,5 % en correspondencia.

La presente exposición describe un método para esterilizar una composición peptídica líquida cuya secuencia comprende una serie de unidades repetitivas de IEIK que comprende someter la composición a un tratamiento en autoclave. En algunos casos, un método no implica filtración esterilizante.

La presente exposición describe un método para esterilizar una composición peptídica líquida cuya secuencia comprende una serie de unidades repetitivas de IEIK que comprende someter la composición a un tratamiento térmico. En algunos casos, el tratamiento térmico se realiza a aproximadamente 121 °C durante aproximadamente 25 min.

La presente exposición describe un método para esterilizar una composición peptídica líquida que tiene un módulo de almacenamiento inicial dentro del intervalo de aproximadamente 300 a aproximadamente 5000 Pa a 1 Pa de tensión de oscilación, el método comprende las etapas de someter la composición a una alta tensión de cizallamiento de modo que el módulo de almacenamiento de la composición se reduzca temporalmente a un nivel dentro de un intervalo de aproximadamente 0,01 % a 80 % del módulo de almacenamiento inicial, y someter la composición a filtración mientras su viscosidad está en el nivel reducido.

En algunos casos, la etapa de someter la composición a una alta tensión de cizallamiento utiliza al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento.

En algunos casos, al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una aguja. En algunos casos, al menos una aguja tiene una longitud de al menos 10 mm. En algunos casos, al menos una aguja tiene un calibre dentro del intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 35.

En algunos casos, al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos un tamiz con orificios de tamaño micro o nanométrico. En algunos casos, los orificios de tamaño micro o nanométrico tienen una dimensión más grande dentro de un intervalo de aproximadamente 0,5 pm a aproximadamente 200 pm. En algunos casos, un pellizco entre orificios es de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 mm. En algunos casos, un tamiz está hecho al menos en parte de un material seleccionado del grupo que consiste en acero inoxidable, tungsteno, titanio, silicona, cerámica, plástico y una combinación de los mismos. En algunos casos, el grosor del tamiz es de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 10 mm.

En algunos casos, al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una membrana con poros de tamaño micro o nanométrico. En algunos casos, los poros dieron un tamaño con un intervalo de aproximadamente 0,45 pm a aproximadamente 120 pm.

En algunos casos, la alta tensión de cizallamiento para la esterilización está en un intervalo de aproximadamente 30 a aproximadamente 200 Pa.

En algunos casos, una composición peptídica líquida comprende RADA16, IEIK13 o KLD12.

En algunos casos, una composición peptídica líquida se presuriza antes de la filtración. En algunos casos, una composición líquida peptídica se almacena adicionalmente al vacío.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B muestran un análisis de espectrometría de masas ilustrativo de RADA16 antes y después del tratamiento en autoclave, para evaluar la sensibilidad al calor. La Figura 1A representa la espectrometría de masas antes del tratamiento en autoclave. La Figura 1B representa la espectrometría de masas después del tratamiento en autoclave. La Figura 1C ilustra una estructura molecular ilustrativa de RADA16; en la composición peptídica particular que se analizó, la proteína estaba compuesta por RADARADARADARADA donde el extremo N-terminal y el extremo C-terminal están protegidos por grupos acetilo y amino.

Las Figuras 2A y 2B muestran un análisis de espectrometría de masas ilustrativo de IEIK13 antes y después del tratamiento en autoclave, para evaluar. La Figura 2A representa la espectrometría de masas antes del tratamiento en autoclave. La Figura 2B representa la espectrometría de masas después del tratamiento en autoclave. La Figura 2C ilustra la estructura molecular del IEIK13 ilustrativo; en la composición peptídica particular que se analizó, la proteína estaba compuesta por IEIKIEIKIEIKI, donde el extremo N-terminal y el extremo C terminal están protegidos por grupos acetilo y amino.

Las Figuras 3A y 3B muestran un ejemplo ilustrativo de espectrometría de masas de KLD12 antes y después del tratamiento en autoclave para evaluar la sensibilidad al calor. La Figura 3A representa la espectrometría de masas antes del tratamiento en autoclave. La Figura 3B representa la espectrometría de masas después del tratamiento en autoclave. La Figura 3C ilustra la estructura molecular de KLD12 ilustrativo; en la composición peptídica particular que se analizó, la proteína estaba compuesta por KLDLKLDLKLDL, donde el extremo N-terminal y el extremo C terminal están protegidos por grupos acetilo y amino.

La Figura 4 muestra ejemplos ilustrativos de ensayos de barrido de tiempo de RADA16 e IEIK13 antes y después del tratamiento en autoclave.

La Figura 5 proporciona una imagen de los péptidos y dispositivos necesarios para filtrar soluciones de péptidos viscosos, por ejemplo, RADA16, KLD12 e IEIK13. Se aplicó tensión de cizallamiento a través de una aguja de calibre 30 a las soluciones de péptidos (centro), de modo que las soluciones de péptidos se filtraron (derecha). La Figura 6 muestra ensayos de barrido de tiempo ilustrativos de RADA16 al 1 % y 2,5 % realizados a 1 Pa y 10 rad/s. Se inyectó RADA16 a través de una aguja de calibre 30 para que la tensión de cizallamiento aplicada redujera la rigidez de los péptidos. Las mediciones se iniciaron 1 minuto después de la inyección.

La Figura 7 muestra ensayos de barrido de tiempo ilustrativos de KLD12 al 1 % y al 2,5 % realizados a 1 Pa y 10 rad/s. Se inyectó KLD12 a través de una aguja de calibre 30 para que la tensión de cizallamiento aplicada redujera la rigidez de los péptidos. Las mediciones se iniciaron 1 minuto después de la inyección.

La Figura 8 muestra ensayos de barrido de tiempo ilustrativos de IEIK13 al 2,5 % realizados a 1 Pa y 10 rad/s. Se inyectó IEIK13 a través de una aguja de calibre 30 para que la tensión de cizallamiento aplicada redujera la rigidez de los péptidos. Las mediciones se iniciaron 1 minuto después de la inyección.

La Figura 9 muestra un ensayo de viscosidad de flujo ilustrativo realizado de 0,003 a 1000 l/s de tasa de cizallamiento en una solución de RADA16 al 2,5 %.

La Figura 10 muestra un ensayo de viscosidad de flujo ilustrativo realizado de 0,003 a 1000 l/s de tasa de cizallamiento en una solución de IEIK13 al 1,5 %.

La Figura 11 muestra medidas de viscosidad ilustrativas de RADA16 al 2,5 % en función del tiempo para demostrar la recuperación de la viscosidad. En el tiempo = 0, se aplicó tensión de cizallamiento a los péptidos, de modo que se redujo la viscosidad. La línea horizontal indica la viscosidad original de RADA16 al 2,5 %.

La Figura 12 muestra medidas de viscosidad ilustrativas de IEIK13 al 1,5 % en función del tiempo para demostrar la recuperación de la viscosidad. En el tiempo = 0, se aplicó tensión de cizallamiento a los péptidos, de modo que se redujo la viscosidad. La línea horizontal indica la viscosidad original de IEIK13 al 1,5 %.

La Figura 13 muestra dispositivos ilustrativos para filtrar soluciones de péptidos viscosos, por ejemplo, RADA16, KLD12 e IEIK13. La tensión de cizallamiento se aplicó a través de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento con múltiples poros. La solución de péptido se dispensó con una jeringa en la parte superior (i). La solución de péptido pasó a través de la primera cámara de dilución por cizallamiento (soporte de filtro de 25 mm, Millipore (ii)) donde se insertó una unidad de dilución por cizallamiento con poros u orificios para reducir temporalmente la viscosidad de la solución de péptido. La solución de péptidos pasó después a la segunda cámara de filtrado (soporte de filtro de 25 mm, Millipore (iii)) donde se insertó una membrana filtrante para esterilizar las soluciones de péptidos o eliminar las partículas de las soluciones de péptidos. La solución filtrada se recibió en una botella (iv) para la salida. Se conectó un dispensador de alta presión a la jeringa dispensadora (v). Se conectó gas nitrógeno a alta presión al dispensador de alta presión (vii).

La Figura 14 muestra la observación visual de la viscosidad después de aplicar la tensión de cizallamiento a una solución de KLD12 al 2,5 % y una solución de IEIK13 al 1,5 %. La fila superior incluye imágenes de KLD al 2,5 %. La fila inferior incluye imágenes de IEIK13 al 1,5 %. Las soluciones en la columna más a la izquierda permanecen en la parte superior de los viales. Las soluciones en la columna más a la derecha (después de aplicar tensión de cizallamiento) tienen una viscosidad baja, por lo que la mayoría de los materiales se ubican en el fondo de los viales. Las Figuras 15A, 15B, 15C y 15D muestran materiales y dispositivos (un tamiz de micro o nanoorificios) para filtrar soluciones de péptidos viscosos tales como RADA16, KLD12 e IEIK13. Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran las características de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento ilustrativa, un tamiz de microorificios, que puede usarse en el dispositivo que se muestra en la Figura 13. Los orificios fueron generados por tecnología de perforación láser. Tal tamiz puede insertarse en la primera cámara para reducir la viscosidad de las soluciones de péptidos antes de la filtración real a través de la membrana en la segunda cámara. La Figura 15D muestra la observación visual de la viscosidad después de aplicar una tensión de cizallamiento de KLD12 al 2,5 % mediante el uso de un tamiz de micro o nanoorificios.

Definiciones

El término “ agente” , como se utiliza en la presente memoria, puede referirse a un compuesto o entidad de cualquier clase química que incluye, por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, sacáridos, lípidos, micromoléculas, metales o combinaciones de los mismos. En algunos casos, un agente es o comprende un producto natural que se encuentra y/o se obtiene de la naturaleza. En algunos casos, un agente es o comprende una o más entidades artificiales en el sentido de que está diseñado, fabricado, modificado por ingeniería genética, y/o producido mediante la acción de la mano del hombre y/o no se encuentra en la naturaleza. En algunos casos, un agente se puede utilizar en forma aislada o pura; en algunos casos, se puede utilizar un agente en forma bruta. En algunos casos, los agentes potenciales se proporcionan como colecciones o bibliotecas, por ejemplo, que pueden analizarse para identificar o caracterizar los principios activos dentro de ellos. Algunos agentes particulares que pueden utilizarse según la presente enseñanza incluyen micromoléculas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, ácidos nucleicos p. ej., ARNip, ARNhc, híbridos de ADN/ARN, oligonucleótidos antisentido, ribozimas), péptidos, miméticos de péptidos, etc. En algunos casos, un agente es o comprende un polímero. En algunos casos, un agente no es un polímero y/o está prácticamente exento de cualquier polímero. En algunos casos, un agente contiene al menos un resto polimérico. En algunos casos, un agente carece o está prácticamente exento de cualquier resto polimérico.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ aminoácido” , en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse en una cadena polipeptídica, p. ej., mediante la formación de uno o más enlaces peptídicos. En algunos casos, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunos casos, un aminoácido es un aminoácido natural. En algunos casos, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunos casos, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunos casos, un aminoácido es un L-aminoácido. “Aminoácido estándar” se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en los péptidos naturales. “Aminoácido no estándar” se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara por síntesis o si se obtiene de una fuente natural. En algunos casos, un aminoácido, que incluye un aminoácido carboxi- y/o amino-terminal en un polipéptido, puede contener una modificación estructural en comparación con la estructura general anterior. Por ejemplo, en algunos casos, un aminoácido puede modificarse mediante metilación, amidación, acetilación y/o sustitución en comparación con la estructura general. En algunos casos, tal modificación puede, por ejemplo, alterar la semivida circulante de un polipéptido que contiene el aminoácido modificado en comparación con uno que contiene un aminoácido no modificado por lo demás idéntico. En algunos casos, tal modificación no altera significativamente una actividad relevante de un polipéptido que contiene el aminoácido modificado, en comparación con uno que contiene un aminoácido no modificado por lo demás idéntico. Como se desprenderá claramente del contexto, en algunos casos, el término “ aminoácido” se usa para referirse a un aminoácido libre; en algunos casos, se utiliza para referirse a un residuo de aminoácido de un polipéptido.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ alrededor de” o “ aproximadamente” , cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertos casos, el término “ alrededor de” o “ aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado salvo que se indique lo contrario o sea evidente de cualquier otra manera por el contexto (excepto donde tal número excedería el 100 % de un valor posible).

Dos eventos o entidades están “ asociados” entre sí, como se usa este término en la presente memoria, si la presencia, nivel y/o forma de uno está correlacionada con la del otro. Por ejemplo, se considera que una entidad particular (p. ej., polipéptido, firma genética, metabolito, etc.) está asociada con una enfermedad, trastorno o condición en particular, si su presencia, nivel y/o forma se correlaciona con la incidencia y/o la susceptibilidad a la enfermedad, trastorno o condición (p. ej., en una población relevante). En algunos casos, dos o más entidades están físicamente “ asociadas” entre sí si interactúan, directa o indirectamente, de modo que están y/o permanecen en proximidad física entre sí. En algunos casos, dos o más entidades que están físicamente asociadas entre sí están vinculadas covalentemente entre sí; en algunos casos, dos o más entidades que están físicamente asociadas entre sí no están unidas entre sí de forma covalente sino que están asociadas de forma no covalente, por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno, interacción de van der Waals, interacciones hidrófobas, magnetismo y combinaciones de las mismas.

El término “ comparable” se utiliza en la presente memoria para describir dos (o más) conjuntos de condiciones, circunstancias, individuos o poblaciones que son suficientemente similares entre sí para permitir la comparación de los resultados obtenidos o los fenómenos observados. En algunos casos, conjuntos comparables de condiciones, circunstancias, individuos o poblaciones se caracterizan por una pluralidad de características sustancialmente idénticas y una o un pequeño número de características variadas. Los expertos en la técnica apreciarán que los conjuntos de circunstancias, individuos o poblaciones son comparables entre sí cuando se caracterizan por un número y tipo suficientes de características sustancialmente idénticas para garantizar una conclusión razonable de que las diferencias en los resultados obtenidos o los fenómenos observados bajo o con diferentes conjuntos de circunstancias, los individuos o las poblaciones son causados o son indicativos de la variación en esas características que son variadas. Los expertos en la técnica apreciarán que el lenguaje relativo que se usa en la presente memoria (p. ej., mejorado, activado, reducido, inhibido, etc.) típicamente se referirá a comparaciones realizadas en condiciones comparables).

Ciertas metodologías descritas en la presente memoria incluyen una etapa de “ determinación” . Los expertos en la materia, al leer la presente memoria descriptiva, apreciarán que tal “ determinación” puede utilizarse o lograrse mediante el uso de cualquiera de las diversas técnicas disponibles para los expertos en la técnica, incluidas, por ejemplo, técnicas específicas a las que se hace referencia explícitamente en la presente memoria. En algunos casos, la determinación implica la manipulación de una muestra física. En algunos casos, la determinación implica la consideración y/o manipulación de datos o información, por ejemplo, mediante el uso de un ordenador u otra unidad de procesamiento adaptada para realizar un análisis relevante. En algunos casos, la determinación implica recibir información y/o materiales relevantes de una fuente. En algunos casos, la determinación implica comparar una o más características de una muestra o entidad con una referencia comparable.

El término “ gel” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a materiales viscoelásticos cuyas propiedades reológicas los distinguen de soluciones, sólidos, etc. En algunos casos, una composición se considera un gel si su módulo de almacenamiento (G') es mayor que su módulo (G"). En algunos casos, se considera que una composición es un gel si hay redes entrecruzadas químicas o físicas en la solución, que se distingue de las moléculas entrelazadas en una solución viscosa.

El término”in vitro"como se utiliza en la presente memoria se refiere a eventos que ocurren en un entorno artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

El término”in vivo",como se utiliza en la presente memoria, se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemas in vitro).

El término “ péptido” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que típicamente es relativamente corto, por ejemplo, que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos o menos de 10 aminoácidos.

El término “ polipéptido” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunos casos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que ocurre en la naturaleza. En algunos casos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza. En algunos casos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por ingeniería genética porque está diseñada y/o producida mediante la acción de la mano del hombre. En algunos casos, un polipéptido puede comprender o consistir en aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o ambos. En algunos casos, un polipéptido puede comprender o consistir en solo aminoácidos naturales o solo aminoácidos no naturales. En algunos casos, un polipéptido puede comprender D-aminoácidos, L-aminoácidos o ambos. En algunos casos, un polipéptido puede comprender solo D-aminoácidos. En algunos casos, un polipéptido puede comprender solo L-aminoácidos. En algunos casos, un polipéptido puede incluir uno o más grupos colgantes u otras modificaciones, p. ej., modificar o unirse a una o más cadenas laterales de aminoácidos, en el extremo N-terminal del polipéptido, en el extremo C terminal del polipéptido o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, tales grupos colgantes o modificaciones pueden seleccionarse del grupo que consiste en acetilación, amidación, lipidación, metilación, pegilación, etc., incluidas combinaciones de los mismos. En algunos casos, un polipéptido puede ser cíclico y/o puede comprender una porción cíclica. En algunos casos, un polipéptido no es cíclico y/o no comprende ninguna porción cíclica. En algunas realizaciones, un polipéptido es lineal. En algunos casos, un polipéptido puede ser o comprender un polipéptido grapado. En algunos casos, el término “ polipéptido” puede añadirse al nombre de un polipéptido, actividad o estructura de referencia; en tales casos, se utiliza en la presente memoria para referirse a polipéptidos que comparten la actividad o estructura relevante y, por tanto, pueden considerarse miembros de la misma clase o familia de polipéptidos. Para cada una de tales clases, la presente memoria descriptiva describe y/o los expertos en la técnica conocerán polipéptidos ilustrativos dentro de la clase cuyas secuencias y/o funciones de aminoácidos son conocidas; en algunos casos, tales polipéptidos ilustrativos son polipéptidos de referencia para la clase o familia de polipéptidos. En algunos casos, un miembro de una clase o familia de polipéptidos muestra una homología o identidad de secuencia significativa, comparte un motivo secuencial común (p. ej., un elemento de secuencia característico) y/o comparte una actividad común (en algunos casos a un nivel comparable o dentro de un intervalo designado) con un polipéptido de referencia de la clase; en algunos casos con todos los polipéptidos de la clase). Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido miembro muestra un grado general de homología de secuencia o identidad con un polipéptido de referencia que es de al menos aproximadamente 30-40 % y, frecuentemente, es mayor que aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más y/o incluye al menos una región (p. ej., una región conservada que puede en algunos casos ser o comprender un elemento de secuencia característico) que muestra una identidad de secuencia muy alta, frecuentemente superior al 90 % o incluso al 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Tal región conservada usualmente abarca al menos 3-4 y frecuentemente hasta 20 o más aminoácidos; en algunos casos, una región conservada abarca al menos un tramo de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos. En algunos casos, un polipéptido útil puede comprender o consistir en un fragmento de un polipéptido precursor. En algunos casos, un polipéptido útil puede comprender o consistir en una pluralidad de fragmentos, cada uno de los cuales se encuentra en el mismo polipéptido precursor en una disposición espacial diferente entre sí que la que se encuentra en el polipéptido de interés (p. ej., fragmentos que están directamente enlazados en el precursor pueden estar separados espacialmente en el polipéptido de interés o viceversa, y/o los fragmentos pueden estar presentes en un orden diferente en el polipéptido de interés que en el precursor), de modo que el polipéptido de interés es un derivado de su polipéptido precursor.

El término “ referencia” , como se utiliza en la presente memoria, describe un estándar o control con respecto al cual se realiza una comparación. Por ejemplo, en algunos casos, un agente, animal, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés se compara con un agente, animal, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia o de control. En algunos casos, una referencia o control se ensaya y/o determina sustancialmente simultáneamente con el ensayo o determinación de interés. En algunos casos, una referencia o control es una referencia o control histórico, incorporado opcionalmente en un medio tangible. Normalmente, como entenderán los expertos en la técnica, una referencia o control se determina o caracteriza en condiciones o circunstancias comparables a las que están en evaluación. Los expertos en la técnica apreciarán cuando hay suficientes similitudes para justificar la confianza y/o la comparación con una posible referencia o control particular.

Exposición técnica de referencia

La exposición técnica de referencia que se establece más abajo puede en algunos aspectos ir más allá de la exposición de la invención en sí misma, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Por lo tanto, se apreciará que esta exposición técnica de referencia no pretende definir la invención como tal, sino situarla en un contexto técnico más amplio.

La presente exposición describe tecnologías para la esterilización de composiciones peptídicas. En algunos casos, los métodos expuestos son particularmente aplicables a soluciones de péptidos con alta viscosidad y/o rigidez. En algunos casos, la presente exposición define soluciones de péptidos particulares que pueden esterilizarse mediante tratamiento en autoclave. En algunos casos, la presente exposición define soluciones de péptidos particulares que pueden no ser susceptibles a filtración salvo que y hasta que se traten para alterar sus propiedades reológicas. En algunos casos, la presente exposición describe tecnologías que pueden reducir temporalmente la viscosidad y/o la rigidez de la solución de péptidos de manera suficiente como para permitir la filtración. En algunos casos, la presente exposición enseña tecnologías para facilitar la manipulación, el procesamiento y/o la filtración de ciertas soluciones de péptidos, por ejemplo, mediante la aplicación de una alta tensión de cizallamiento que modifica las propiedades reológicas de las mismas.

Péptidos y composiciones peptídicas

Las composiciones peptídicas para las que las enseñanzas de la presente exposición pueden ser relevantes incluyen composiciones peptídicas anfifílicas que tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 200 residuos de aminoácidos. En ciertos casos, un péptido relevante puede tener una longitud de al menos aproximadamente 7 aminoácidos. En algunos casos, un péptido puede tener una longitud de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 17 aminoácidos. En ciertos casos, un péptido puede tener una longitud de al menos 8 aminoácidos, de al menos aproximadamente 12 aminoácidos o de al menos aproximadamente 16 aminoácidos.

En algunos casos, como se entiende en la técnica, un polipéptido anfifílico es uno cuya secuencia incluye tanto aminoácidos hidrófilos como aminoácidos hidrófobos. En algunos casos, tales aminoácidos hidrófilos e hidrófobos pueden unirse alternativamente, de modo que el péptido tenga una secuencia de aminoácidos hidrófilos y de aminoácidos hidrófobos alternos. En algunos casos, tal péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es o comprende repeticiones de Arg-Ala-Asp-Ala (RADA); en algunos casos, tal péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es o comprende repeticiones de Lys-Leu-Asp (KLD); en algunos casos, tal péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es o comprende repeticiones de Ile-Glu-Ile-Lys (IEIK).

En algunos casos, un péptido para usar según la presente exposición, generalmente puede autoensamblarse y/o puede exhibir una estructura de hoja beta en solución acuosa bajo ciertas condiciones.

En algunos casos, un péptido para usar según la presente exposición tiene una secuencia de aminoácidos como la que se encuentra en el producto comercial conocido como PuraMatrix®, es decir, tiene la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala (es decir, RADA16, también conocido como [RADA]4; SEQ ID NO: 1). En algunos casos, un péptido para su uso según la presente exposición tiene una secuencia de aminoácidos: Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu (es decir, KLDL12, también conocido como [KLDL]3, también conocido como KLD12;<s>E<q>ID NO: 2). Un péptido para su uso según la presente exposición tiene una secuencia de aminoácidos: Ile-Glu-Me-Lys-Ile-Glu-Ne-Lys-Ne-Glu-Me-Lys-Me (es decir, IEIK13, también conocido como (IEIK)3I; SEQ ID NO: 3).

En algunos casos, las composiciones peptídicas para las que puede ser relevante la presente exposición son aquellas caracterizadas por ciertas propiedades reológicas. En algunos casos, las propiedades reológicas relevantes pueden ser o incluir el módulo de pérdida, la rigidez, el tiempo de recuperación reológica, el módulo de almacenamiento, la viscosidad, la tensión de fluencia, etc. En algunos casos, las propiedades reológicas se evalúan mediante medición; en algunos casos, se pueden evaluar una o más propiedades reológicas mediante observación visual.

En ciertos casos, el módulo de almacenamiento y la rigidez tienen una correlación positiva; generalmente, los expertos en la materia aprecian que un módulo de almacenamiento superior está relacionado con una mayor rigidez.

En algunos casos, una composición peptídica de alta viscosidad se caracteriza por un módulo de almacenamiento dentro del intervalo de aproximadamente 300 a aproximadamente 5000 Pa a 1 rad/s de frecuencia y 1 Pa de tensión de oscilación.

En algunos casos, una composición peptídica tiene una concentración peptídica dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10 %.

En algunos casos, una composición peptídica a la que se aplica una o más de las metodologías descritas en la presente memoria tiene un volumen a escala comercial.

En algunos casos, una composición peptídica a la que se aplica una o más de las metodologías descritas en la presente memoria es una que se ha almacenado durante un período de tiempo. En algunos casos, una composición peptídica se ha almacenado en un recipiente a presión.

En algunos casos, una composición peptídica a la que se aplican una o más metodologías descritas en la presente memoria se almacena, por ejemplo, en un recipiente de depósito antes del envasado.

Propiedades mejoradas

La presente exposición aprecia que la preparación y/o manejo de ciertas composiciones peptídicas (p. ej., particularmente composiciones de ciertos péptidos autoensamblables y/o de altas concentraciones de péptidos) ha sido complicada por dificultades relacionadas, por ejemplo, con alta viscosidad y/o rigidez. La presente exposición demuestra particularmente que ciertas composiciones peptídicas no son susceptibles de filtración y, en particular, de filtración a través de filtros esterilizantes.

La presente exposición aprecia además que los desafíos de filtración pueden complicar o impedir la esterilización de tales composiciones peptídicas. La presente exposición describe tecnologías que permiten la filtración de ciertas composiciones peptídicas y/o permiten la esterilización de cualquier otra manera.

Tratamiento en autoclave

El tratamiento en autoclave es un método de esterilización convencional que consiste en someter los materiales a vapor saturado a alta presión a 121 °C. Generalmente, se entiende en la técnica que la aplicación de altas temperaturas, tal como la que se produce en el tratamiento en autoclave, puede degradar los péptidos.

La presente exposición demuestra sorprendentemente que ciertas composiciones peptídicas son estables al tratamiento térmico, y particularmente al tratamiento en autoclave. Entre otras cosas, la presente exposición demuestra que tales composiciones peptídicas pueden esterilizarse con el tratamiento en autoclave. En algunos casos, tales composiciones pueden esterilizarse mediante tratamiento térmico a aproximadamente 121 °C durante aproximadamente 25 minutos.

En algunos casos, las composiciones peptídicas que pueden someterse a tratamiento térmico y/o tratamiento en autoclave son composiciones IEIK13. En algunos tales casos, las composiciones de IEIK13 tienen una concentración dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10 %.

En algunos casos, las composiciones peptídicas que pueden someterse a tratamiento térmico y/o tratamiento en autoclave son composiciones KLD12. En algunos casos, sin embargo, las composiciones KLD12 no se someten a tratamiento en autoclave según la presente enseñanza.

En algunos casos, las composiciones RADA16 no se someten a tratamiento en autoclave según la presente enseñanza.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, la presente exposición propone que la estabilidad de ciertas composiciones IEIK13 al tratamiento térmico, tal como el tratamiento en autoclave, puede atribuirse, al menos en parte, a la ausencia de ácido aspártico (Asp, D) en las composiciones, mientras que RADA16 y KLD12 tienen ácidos aspárticos.

En algunos casos, las composiciones peptídicas que pueden someterse apropiadamente a un tratamiento térmico, tal como un tratamiento en autoclave según la presente enseñanza, se caracterizan por su resistencia a la degradación cuando se exponen a tal tratamiento y/o por la estabilidad de las propiedades reológicas (p. ej., viscosidad y/o rigidez) cuando se somete a tal tratamiento. Según la presente exposición, las composiciones peptídicas de interés pueden exponerse a un tratamiento térmico, tal como un tratamiento en autoclave, y pueden evaluarse una o más propiedades de la composición (p. ej., degradación peptídica y/o una o más propiedades reológicas), por ejemplo antes y después del tratamiento, de modo que pueda determinarse la idoneidad de esterilizar tal composición mediante un tratamiento en autoclave (véase, p. ej., el Ejemplo 2).

Alteración de las propiedades reológicas

La presente exposición demuestra que ciertas composiciones peptídicas pueden volverse susceptibles a la filtración a través de la exposición a un tratamiento que altera una o más propiedades reológicas (p. ej., que altera la viscosidad y/o la rigidez).

En algunos casos particulares, la alteración de las propiedades reológicas se logra mediante la exposición a la tensión de cizallamiento.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, la presente exposición propone que someter las composiciones peptídicas como se describe en la presente memoria a una alta tensión de cizallamiento puede alterar las estructuras autoensambladas. La presente exposición propone además que el tiempo de recuperación puede representar el requerido para que tales estructuras se vuelvan a formar.

En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 20 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 30 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 40 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 50 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 60 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 60 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 80 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 90 Pa. En algunos casos, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos aproximadamente 100 Pa. En algunos casos, la cantidad de tensión de cizallamiento puede ser de al menos aproximadamente 30~100 Pa, por ejemplo, en vista de la tensión de fluencia de RADA16 al 2,5 %, IEIK13 al 1,5 % y 2,5 % y KLD12 al 2,5 % indicada anteriormente.

En algunos casos, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede disminuir significativamente con la tensión de cizallamiento. En algunos casos, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede disminuir al menos un 10 % con la tensión de cizallamiento. En algunos casos, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede disminuir al menos un 30 % con la tensión de cizallamiento. En algunos casos, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede disminuir al menos un 50 % con la tensión de cizallamiento. En algunos casos, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede disminuir al menos un 70 % con la tensión de cizallamiento. En algunos casos, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede disminuir al menos un 90 % con la tensión de cizallamiento.

En algunos casos, la alteración de la propiedad reológica es temporal. En algunos casos, la composición peptídica se caracteriza por características de recuperación reológica. Por ejemplo, en algunos casos, tales composiciones se caracterizan porque una o más de sus propiedades reológicas se restauran dentro de un período de tiempo dentro de un intervalo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 48 horas.

En algunos casos, se considera que se logra la regeneración reológica cuando una o más propiedades reológicas vuelven a un nivel de al menos el 20 % de su valor inicial.

En algunos casos, se considera que se logra la regeneración reológica cuando el cambio observado en una o más propiedades reológicas tras la aplicación de tensión de cizallamiento se invierte al menos en un 30 %.

En algunos casos, las composiciones peptídicas pueden recuperar su módulo de almacenamiento después de la aplicación de tensión de cizallamiento. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 0,1 al 100 % de su módulo de almacenamiento original en 1 minuto. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 0,1 al 10% de su módulo de almacenamiento original en 1 minuto. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 20 al 100 % de su módulo de almacenamiento original en 20 minutos. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 20 al 60 % de su módulo de almacenamiento original en 20 minutos.

En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar su viscosidad a lo largo del tiempo después de la filtración. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 0,1 al 30 % de su viscosidad original en 1 minuto. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 0,1 al 100% de su viscosidad original en 1 minuto. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 20 al 100% de su viscosidad original en 20 minutos. En algunos casos, las soluciones de péptidos pueden recuperar aproximadamente del 20 al 60 % de su viscosidad original en 20 minutos.

La presente exposición ilustra específicamente el ajuste apropiado de las propiedades reológicas de ciertas composiciones peptídicas tras la aplicación de tensión de cizallamiento (p. ej., específicamente tras el paso a través de una aguja, por ejemplo de estructura particular) (véase el Ejemplo 4). Los resultados presentados en este Ejemplo muestran un aumento logarítmico del módulo de almacenamiento desde 1 minuto después de la inyección, como se muestra en la Figura 10 para RADA16, la Figura 11 para KLD12 y la Figura 12 para IEIK13.

Entre otras cosas, la presente exposición describe metodologías según las cuales una o más de ciertas composiciones peptídicas se someten a una alta tensión de cizallamiento para que se ajusten una o más de sus propiedades reológicas (p. ej., se reduzca la viscosidad) a un nivel apropiado para que la(s) composición(es) se vuelva(n) susceptible(s) de filtración y, en algunos casos, de filtración esterilizante, y la(s) composición(es) se someta(n) a tal filtración, dentro de un período de tiempo después de someterla a una tensión de cizallamiento seleccionada de manera que la filtración ocurra mientras las propiedades reológicas permanecen ajustadas (p. ej., antes de que se haya producido una regeneración significativa o completa de tal(es) propiedad(es)).

En general, como se describe en la presente descripción, la tensión de cizallamiento puede aplicarse mediante la aplicación de una composición peptídica a (y/o el paso de una composición peptídica a través de) una unidad de adelgazamiento por cizallamiento. En algunos casos, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende una aguja, una membrana y/o un tamiz. En algunos casos, se utiliza una pluralidad de unidades de adelgazamiento por cizallamiento individuales, por ejemplo, para que pueda lograrse una filtración de alto rendimiento.

En algunos casos, la presente invención proporciona dispositivos y metodologías que pueden lograr la filtración de composiciones peptídicas a escala comercial.

La aguja como una unidad de adelgazamiento por cizallamiento

En algunos casos no limitativos, la tensión de cizallamiento puede aplicarse mediante inyección a través de una o más agujas. Por tanto, en algunos casos, pueden usarse una o más agujas como unidad de adelgazamiento por cizallamiento.

En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 1 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 2 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 5 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 10 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 15 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 20 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 30 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 40 mm de largo. En algunos casos, una aguja puede tener al menos aproximadamente 50 mm de largo.

En algunos casos, una aguja puede tener un calibre dentro de un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 34. En algunos casos, una aguja puede tener un calibre dentro de un intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 34. En algunos casos, una aguja puede tener un calibre de aproximadamente 27 a aproximadamente 34.

La Figura 5 expone un caso no limitativo de un dispositivo de esterilización según uno o más casos no limitativos. Como se representa, la composición peptídica (p. ej., solución viscosa de un péptido autoensamblado) (izquierda) puede transferirse a la primera jeringa con una aguja, inyectarse en la segunda jeringa (derecha) y después filtrarse.

La membrana como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

En algunos casos, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento utilizada para aplicar tensión de cizallamiento a una composición peptídica como se describe en la presente memoria puede ser un dispositivo o entidad caracterizada por micro o nanoporos. La Figura 13 representa un caso no limitativo de un dispositivo de esterilización según uno o más casos no limitativos de la presente enseñanza. Como se representa, una solución de péptido (p. ej., una solución viscosa de un péptido autoensamblado) puede transferirse a una jeringa dispensadora (o un recipiente a presión), suministrarse en una primera cámara con poros para tensión de cizallamiento y después filtrarse en la segunda cámara. Como entenderán los expertos en la técnica, el tamaño del diámetro de la membrana puede variar dependiendo de la cantidad de solución de péptidos.

En algunos casos, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de aproximadamente 0,45 pm a 120 pm. En algunos casos, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de aproximadamente 1 pm a 100 pm. En algunos casos, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de aproximadamente 3 pm a 80 pm. En algunos casos, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de aproximadamente 4 pm a 50 pm.

El tamiz como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

En algunos casos, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede tener micro o nanoorificios. En algunos casos, los orificios pueden modelarse o taladrarse en una placa cuyo grosor puede ser de aproximadamente 10 pm a 10 mm en algunos casos. La Figura 15 representa un caso no limitativo de un dispositivo de esterilización según uno o más casos no limitativos de la presente exposición. Puede insertarse una unidad de adelgazamiento por cizallamiento en la primera cámara de filtrado que se muestra en la Figura 13.

En algunos casos, los orificios en un caso de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento descrita en la presente memoria pueden tener una dimensión más grande dentro del intervalo de aproximadamente 0,5 pm a 200 pm. En algunos casos, tal dimensión puede estar dentro del intervalo de aproximadamente 0,5 pm a 100 pm. En algunos casos, tal dimensión puede estar dentro del intervalo de aproximadamente 0,5 pm a 80 pm. En algunos casos, tal dimensión puede estar dentro del intervalo de aproximadamente 0,5 pm a 50 pm.

En algunos casos, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento de este caso puede tener un paso entre orificios dentro del intervalo de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 mm.

En algunos casos, la unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede estar hecha, en su totalidad o en parte, de un material seleccionado del grupo que consiste en acero inoxidable, tungsteno, titanio, metal similar, silicio, cerámica o materiales plásticos, y combinaciones de los mismos.

Aplicaciones

En algunos casos, las composiciones peptídicas a las que se aplican las tecnologías descritas en la presente memoria se utilizan después en una o más aplicaciones que involucran células, tejidos u organismos biológicos (p. ej., para que las composiciones esterilizadas sean de particular utilidad).

Como es conocido en la técnica, ciertas composiciones peptídicas (p. ej., ciertas composiciones peptídicas autoensamblables) han demostrado ser particularmente útiles como matrices para el crecimiento celularin vivoy/oin vitro,y/o como rellenos de huecos, hemostáticos, barreras al movimiento de líquidos, agentes de cicatrización de las heridas, etc. En algunos casos, tales composiciones forman hidrogeles peptídicos con una o más características deseables (p. ej., tamaño de poro y/o canal, resistencia, deformabilidad, reversibilidad de la formación de gel, transparencia, etc.).

Los expertos en la técnica, al leer la presente exposición, apreciarán inmediatamente su utilidad en una variedad de contextos en los que se emplean tales composiciones peptídicas, incluidas las composiciones en gel y especialmente las que incluyen composiciones gelificantes reversibles. De particular interés son las aplicacionesin vivo(p. ej., aplicaciones quirúrgicas u otras aplicaciones, particularmente que permiten o se benefician de la suministración a través de un dispositivo de tipo cánula, tal como una aguja, a través del cual puede administrarse o aplicarse la composición).

Ejemplificación

Ejemplo 1: Filtración de soluciones de péptidos de alta viscosidad

El presente Ejemplo describe, entre otras cosas, las propiedades reológicas de diversas composiciones peptídicas (es decir, específicamente de composiciones peptídicas autoensamblables) y demuestra una variabilidad significativa de parámetros tales como viscosidad, módulo de almacenamiento (p. ej., rigidez), módulo de pérdida y tensión de fluencia para diferentes péptidos y/o para diferentes concentraciones del mismo péptido. El Ejemplo también demuestra que algunas de estas soluciones no son susceptibles de filtrar. En particular, el Ejemplo demuestra que las soluciones de alta viscosidad de tales péptidos presentan desafíos para las tecnologías de filtración. Se determinaron las propiedades reológicas para una variedad de soluciones de péptidos. Específicamente, las soluciones de RADA16, IEIK13 y KLD12 se prepararon en las concentraciones que se indican a continuación en la Tabla 1. Como puede verse, en general, las soluciones de mayor concentración mostraron una mayor viscosidad máxima. Además, los péptidos de diferente secuencia mostraron diferentes viscosidades máximas en soluciones de la misma concentración. Por ejemplo, las soluciones de KLD12 al 2 %, KLD12 al 2,5 % y IEIK13 al 1,5 % tienen viscosidades máximas 2, 3,4 y 3,2 veces mayores que las del RADA16 al 2,5 %, respectivamente.

Tabla 1 Propiedades reológicas de soluciones de péptidos a concentraciones seleccionadas

Cada una de las soluciones de péptido enumeradas en la Tabla 1 se sometió a filtración a través de un filtro de jeringa Nalgene de 0,2 pm con membranas de acetato de celulosa de 25 mm. Las soluciones de KLD12 al 1 % y al 1,5 % (que, como puede verse, se caracterizan por una concentración, viscosidad y/o rigidez relativamente bajas) pasaron con éxito a través del filtro. Por el contrario, las soluciones de KLD12 al 2 % y 2,5 % y las soluciones de IEIK13 al 1,5% (que, como puede verse, se caracterizan por una concentración, viscosidad y/o rigidez relativamente altas) no pudieron pasar con éxito a través del filtro; en cambio, el filtro estalló.

Ejemplo 2: Tratamiento en autoclave de soluciones de péptidos

El presente ejemplo demuestra que algunas composiciones peptídicas (es decir, específicamente composiciones peptídicas autoensamblables como se describe en la presente descripción) son sorprendentemente estables al tratamiento térmico. En particular, este ejemplo demuestra que ciertas composiciones peptídicas mantienen una masa molar estable incluso tras la aplicación de un tratamiento en autoclave a 121 °C durante 25 minutos. El presente Ejemplo establece, por lo tanto, que tales composiciones pueden esterilizarse con éxito mediante la aplicación de tecnologías de alta temperatura (p. ej., autoclave). Sin embargo, el Ejemplo demuestra simultáneamente que ciertas composiciones peptídicas no son estables a tal tratamiento.

Las Figuras 1-3 presentan los resultados del tratamiento en autoclave para ciertas composiciones de RADA16, IEKI13 y KLD12, respectivamente.

La masa molar medida de RADA16, antes del tratamiento en autoclave, fue 1712, que coincide con su masa molar calculada. Sin embargo, el análisis de espectrometría de masas demostró que RADA16 se degradó durante el tratamiento en autoclave, lo que demuestra que esta técnica no puede usarse para la esterilización de tal composición de RADA16.

La masa molar medida de IEIK13, antes del tratamiento en autoclave, fue 1622, que también coincide con su masa molar calculada. El análisis de espectrometría de masas demostró que IEIK13 no se degradó después del tratamiento en autoclave, lo que demuestra, de esta manera, que esta técnica puede emplearse de manera útil para la esterilización de tal composición de IEIK13.

La masa molar medida de KLD12, antes del tratamiento en autoclave, es 1467, que coincide con su masa molar calculada. KLD12 se degradó parcialmente durante el tratamiento en autoclave. Como el KLD12 se degradó durante el tratamiento en autoclave, se determinó que el tratamiento en autoclave no es una técnica preferida para la esterilización de tales composiciones de KLD12; se llevó a cabo un planteamiento de filtración convencional para la esterilización en KLD12 a varias concentraciones de péptido.

Las propiedades reológicas de ciertas composiciones peptídicas se determinaron antes y después del autoclave. Los datos se muestran en la Figura 4. Como puede verse, el IEIK13 esterilizado en autoclave mostró sorprendentemente una fuerza reológica casi idéntica a la del IEIK13 no esterilizado en autoclave, mientras que RADA16 mostró una disminución drástica de la fuerza reológica.

El tratamiento en autoclave puede usarse para la esterilización de las composiciones IEIK13 como se describe en la presente descripción, pero debe evitarse para las composiciones RADA16.

Ejemplo 3: Propiedades reológicas de composiciones peptídicas con aplicación de tensión de cizallamiento

El presente Ejemplo demuestra que la tensión de cizallamiento aplicada puede disminuir la viscosidad y/o la rigidez de ciertas soluciones de péptidos y, asimismo, demuestra que tal disminución de la viscosidad y/o la rigidez puede hacer que las composiciones sean aptas para diversas tecnologías de procesamiento (p. ej., filtración) para las que las composiciones no son aptas en ausencia de tal tratamiento.

Ensayo de flujo de cizallamiento

Se realizaron ensayos de flujo de cizallamiento en soluciones de péptido mediante el uso de un reómetro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm. Los resultados se muestran en la Figura 9 para soluciones RADA16 al 2,5 % y en la Figura 10 para soluciones IEIK13 al 1,5 %. Como puede verse, tanto las soluciones de RADA16 al 2,5 % como las de IEIK13 al 1,5 % mostraron propiedades típicas de adelgazamiento por cizallamiento. Es decir, a medida que aumentaba la velocidad de cizallamiento, sus viscosidades se reducían drásticamente. A medida que aumentaba la velocidad de cizallamiento, la tensión de cizallamiento aumentaba inmediatamente y luego disminuía ligeramente cuando la viscosidad alcanzaba una meseta. La tensión de fluencia fue de aproximadamente 40 Pa para una solución de RADA16 al 2,5 % y de aproximadamente 60 Pa para una solución de IEIK13 al 1,5 %.

Recuperación de viscosidad

Los tiempos de recuperación de la viscosidad de las soluciones RADA16 e IEIK13 se evaluaron después de la aplicación de una alta tensión de cizallamiento. Con un reómetro DHR-1 (TA Instruments), se midieron los cambios de viscosidad de las soluciones RADA16 al 2,5 % y IEIK13 al 1,5 % con ensayos de flujo a 0,005 l/seg de tasa de cizallamiento después de aplicar 1000 l/seg de tasa de cizallamiento a las muestras durante 1 minuto. Las soluciones RADA16 e IEIK13 mostraron un comportamiento tixotrópico típico, lo que significa que su viscosidad se recuperó lentamente. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, proponemos que los tiempos de recuperación de la propiedad reológica para estas soluciones pueden basarse en el reensamblaje de moléculas peptídicas en estructuras (p. ej., nanofibras) en las soluciones. Los tiempos de reensamblaje completos de la solución de RADA16 al 2,5 % y de IEIK13 al 1,5 % fueron de aproximadamente 12 a 48 horas. Los resultados se muestran en la Figura 11 para la solución RADA16 al 2,5 % y en la Figura 12 para la solución IEIK13 al 1,5 %.

Recuperación del módulo de almacenamiento

Los porcentajes de recuperación del módulo de almacenamiento original al cabo de 1 minuto y 20 minutos después de inyectar las composiciones peptídicas a través de una aguja de calibre 30 se enumeran en la Tabla 2. La velocidad de recuperación de IEIK13 (específicamente, de una solución de IEIK13 al 2,5%) fue la más rápida entre las soluciones de péptidos, al mostrar una recuperación del 100 % del módulo de almacenamiento original en 20 minutos. La de KLD12 fue la más lenta entre las ensayadas para recuperarse; mostró solo un 23 % de recuperación del módulo de almacenamiento original en 20 minutos (para un 2,5 %). En algunos casos no limitantes, la recuperación total a un módulo original puede tardar aproximadamente de 12 a 48 horas después del paso a través de una aguja (p. ej., inyección).

Tabla 2 Recuperación al módulo de almacenamiento original a 1 minuto y 20 minutos después de la inyección a través de una aguja de calibre 30

Se realizaron mediciones reológicas para soluciones RADA16 e IEIK13 después de inyectarlas a través de agujas de calibre 30. Los resultados mostraron un aumento logarítmico del módulo de almacenamiento desde 1 minuto después de la inyección. Los resultados se muestran en la Figura 6 para RADA16, la Figura 7 para KLD12 y la Figura 8 para IEIK13.

Ejemplo 4: Una aguja como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

El presente ejemplo describe un proceso de filtración para composiciones peptídicas (específicamente, de péptidos autoensamblables como se describe en la presente descripción) mediante el uso de una aguja como unidad de adelgazamiento por cizallamiento. En particular, el presente Ejemplo demuestra que la aplicación de una tensión de cizallamiento apropiada (p. ej., mediante el paso a través de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento) puede alterar las propiedades reológicas de la composición (p. ej., puede reducir la viscosidad y/o la rigidez, etc.) para que pueda pasar con éxito a través de un filtro tal como, por ejemplo, un filtro esterilizante).

La Figura 5 representa un caso no limitativo de un dispositivo de esterilización según la presente exposición. Tal como se representa, el dispositivo incluye una primera jeringa que aplica una tensión de cizallamiento bruta a la composición suficiente para alterar sus propiedades reológicas de modo que pase con éxito a través de una segunda jeringa que está equipada con un filtro de membrana de tamaño de poro apropiado para lograr la esterilización de la composición. Específicamente, el dispositivo representado incluye una primera jeringa con una aguja de calibre 30 (0,3 mm x 25 mm, aguja de irrigación Endo con ventilación de doble lado, Transcodent, Alemania) (centro) y una segunda jeringa con un filtro de membrana (derecha). Se transfirió una solución viscosa de KLD12 al 2,5 % (izquierda) a la primera jeringa, y después se inyectó en la segunda jeringa (derecha) y después se filtró a través del filtro de membrana. Con este método, se filtraron con éxito soluciones de KLD12 al 2,5 %.

Ejemplo 5: Unidad de adelgazamiento por cizallamiento de alto rendimiento

El presente ejemplo describe ciertas unidades de adelgazamiento por cizallamiento. El principio de funcionamiento es similar al de la primera aguja descrita anteriormente. Específicamente, cada unidad de dilución por cizallamiento aplica una tensión de cizallamiento adecuada y suficiente para ajustar una o más propiedades reológicas de una composición peptídica aplicada de modo que la composición se vuelva susceptible de filtración, y específicamente de filtración a través de un filtro esterilizante. En algunos casos, pueden usarse múltiples agujas o equivalentes como una unidad de adelgazamiento por cizallamiento.

Filtro de membrana

Este Ejemplo demuestra el uso de un filtro de membrana (tamaño de poro > 0,45 |jm) como unidad de adelgazamiento por cizallamiento. Las soluciones viscosas de KLD12 al 2,5 % o IEIK13 al 1,5 % pueden transferirse a una jeringa dispensadora (o un recipiente a presión), entregadas a una primera cámara con una unidad de adelgazamiento por cizallamiento (por ejemplo, el tamaño de poro oscila entre 0,45 jm y 120 jm ), y después se filtró a través de una membrana filtrante (por ejemplo, tamaño de poro: 0,2 jm ) en la segunda cámara.

Para examinar el efecto del tamaño de poro en la unidad de adelgazamiento por cizallamiento sobre el cambio de viscosidad de las soluciones de péptidos viscosos, se pasaron soluciones de KLD12 al 2,5 % y IEIK al 1,5 % a través de tamaños de poro seleccionados y se evaluaron sus cambios de viscosidad aparentes. Las soluciones de KLD al 2,5 % pasaron a través de la unidad de adelgazamiento por cizallamiento con tamaños de poro de 41 jm , 20 jm y 5 jm . La viscosidad de las soluciones disminuyó lo suficiente como para fluir hacia abajo cuando se volteó un recipiente que las contenía. Aunque las soluciones KLD al 2,5 % que habían pasado a través de la unidad de adelgazamiento por cizallamiento con un tamaño de poro de 120 jm eran ligeramente menos viscosas que las composiciones KLD al 2,5 % previas al paso, permanecieron demasiado viscosas para fluir hacia abajo en el ensayo de inversión del recipiente. La viscosidad de las soluciones de IEIK13 al 1,5 % se redujo significativamente cuando se pasó a través de una membrana con un tamaño de poro de 5 jm . Los resultados se muestran en la Figura 14.

Se estudiaron soluciones de RADA16 al 1,0 % para la reducción de la viscosidad con una unidad de adelgazamiento por cizallamiento (se muestra en la Figura 13). La solución de RADA16 al 1,0%, que muestra un comportamiento tixotrópico y de adelgazamiento por cizallamiento, se pasó a través de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento a 344,7 kPa de presión de inyección. La solución mostró de 1,4 ~ 1,7 ml/min de salida. La solución no se pudo pasar a través de un filtro (tamaño de poro de 0,2 jm ) a 344,7 kPa de presión de inyección (es decir, sin exposición previa a una unidad de adelgazamiento por cizallamiento). Sin embargo, el agua, que es un fluido newtoniano representativo, mostró que el caudal de salida era relativamente constante. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Capacidades de filtrado del sistema que se muestra en la Figura 13 para solución RADA16 al 1 % y agua.

Como se demostró anteriormente, las soluciones de KLD12 al 2,5 % y de IEK13 al 1,5 % no se pudieron filtrar a través de un filtro de jeringa Nalgene de 0,2 jm con membranas de acetato de celulosa de 25 mm. El RADA16 al 2,5 % no suele ser susceptible para la filtración a través de una membrana de 0,2 jm . Las soluciones de RADA16 al 2,5 %, IEIK13 al 1,5 % y KLD12 al 2,5 % se pudieron filtrar después de exponerlas a una unidad de adelgazamiento por cizallamiento a 689,5 kPa de presión de inyección que mostraron una producción de 3,8, 12,5 y 11,4 ml/min de salida, respectivamente. Las soluciones no pudieron filtrarse sin la unidad de adelgazamiento por cizallamiento. Una unidad de adelgazamiento por cizallamiento que se muestra en la Figura 16 puede utilizarse con éxito para la esterilización y filtración de soluciones de péptidos viscosos que no se filtran fácilmente. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Capacidades de filtrado del sistema de filtrado que se muestra en la Figura 13 para soluciones de RADA16 al 2,5 %, IEIK13 al 1,5 %, KLD12 al 2,5 %.

Tamiz

Estos Ejemplos demuestran el uso exitoso de un tamiz con micro y/o nanoorificios como unidad de adelgazamiento por cizallamiento. Las soluciones viscosas de KLD12 al 2,5 % o IEIK13 al 1,5 % pueden transferirse a una jeringa (o cámara) dispensadora, inyectarse en una primera cámara que incluye una unidad de adelgazamiento por cizallamiento con micro y/o nanoorificios y después filtrarse a través del filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 pm) en la segunda cámara. En lugar de una jeringa para inyección, puede usarse una cámara de alta presión para suministrar una composición peptídica. El tamaño de la membrana (por ejemplo, el diámetro) y/u otras características (por ejemplo, el tamaño de los poros, etc.) pueden seleccionarse para adaptarse a la cantidad de composición peptídica que se va a pasar a través de ella.

Tabla 5 Capacidades de filtrado del sistema de tamiz de microorificios que se muestra en la Figura 13 y la Figura 15 para soluciones RADA16 al 2,5 %, IEIK13 al 1,5 % y KLD12 al 2,5 %.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   i.Un método para esterilizar una composición peptídica líquidacaracterizado por quela composición tiene un módulo de almacenamiento inicial dentro del intervalo de 300 a 5000 Pa a 1 rad/s de frecuencia y 1 Pa de tensión de oscilación medida con placas de 20 mm, comprendiendo el método las etapas de:

   someter la composición peptídica líquida a una alta tensión de cizallamiento dentro de un intervalo de 30 a 200 Pa de modo que el módulo de almacenamiento de la composición se reduzca temporalmente a un nivel dentro de un intervalo del 0,01 % al 80 % del módulo de almacenamiento inicial; y

   someter la composición a una filtración esterilizante mientras su viscosidad está en un nivel reducido, en donde la composición peptídica está en solución acuosa y comprende un péptido en un intervalo de concentración del 1 % al 2,5 % que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Ala-Asp-Asp-Ala (RADA16); Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ne-Lys-Ne-Glu-Ne-Lys-Ne (IEIK13); y Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu (KLD12), en donde la etapa de someter la composición a una alta tensión de cizallamiento utiliza al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento seleccionada de entre: una aguja, un tamiz con orificios de tamaño micro o nanométrico y una membrana con poros de tamaño micro o nanométrico.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una aguja y la al menos una aguja tiene al menos 1 mm de longitud.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una aguja y la al menos una aguja tiene un calibre dentro del intervalo de 25G a 35G.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos un tamiz con orificios de tamaño micro o nanométrico, en donde los orificios de tamaño micro o nanométrico tienen una dimensión más grande dentro de un intervalo de 0,5 pm a 200 pm, opcionalmente en donde el paso entre los orificios es de 5 pm a 10 mm.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde al menos un tamiz está hecho al menos en parte de un material seleccionado del grupo que consiste en acero inoxidable, tungsteno, titanio, silicio, cerámica, plástico y una combinación de los mismos.
6. 6. El método de la reivindicación 4, en donde el grosor del tamiz es de 10 pm a 10 mm.
7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una membrana con poros de tamaño micro o nanométrico, en donde los poros tienen un tamaño dentro de un intervalo de 0,45 pm a 120 pm.
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde la composición peptídica líquida comprende RADA16.
9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde la composición peptídica líquida se presuriza antes de la filtración.
10. 10. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de almacenar la composición peptídica líquida esterilizada al vacío.