ES2927887T3

ES2927887T3 - Esterilización de composiciones peptídicas

Info

Publication number: ES2927887T3
Application number: ES15731666T
Authority: ES
Inventors: Eun Seok Gil; Karl Patrick Gilbert
Original assignee: 3D Matrix Ltd
Current assignee: 3D Matrix Ltd
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2035-03-10
Also published as: US11090398B2; CN106456811A; US20170202986A1; JP7212104B2; US20220001047A1; EP3628337A1; EP3116551B1; ES3037364T3; WO2015136370A3; CN106456811B; JP2021138725A; JP2023040205A; EP3116551A2; WO2015136370A2; EP3628337B1; JP6684719B2; US20190111165A1; US10369237B2; JP2020073489A; JP2017515793A

Abstract

Métodos y dispositivos para esterilizar composiciones de péptidos viscosos que tienen propiedades reológicas de dilución por cizallamiento a altas concentraciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Esterilización de composiciones peptídicas

Campo de la invención

La invención se refiere al tratamiento en autoclave de péptidos.

Listado de Secuencias

Esta solicitud hace referencia a una lista de secuencias enviada en formato electrónico como archivo ASCII.txt denominado "2004837-0044_Sequences.txt". El archivo.txt se generó el 9 de marzo de 2015 y tiene un tamaño de 1 kB.

Antecedentes

Los agentes peptídicos con la capacidad de autoensamblarse en estructuras de gel tienen una amplia variedad de usos en contextos terapéuticos y de investigación. Uno de tales agentes peptídicos, por ejemplo, un polipéptido sintético de 16 aminoácidos con una secuencia repetitiva de arginina, alanina y ácido aspártico (es decir, RADARADARADARADA [SEQ ID NO: 1], también conocido como "RADA16"), es comercialmente disponible bajo los nombres comerciales PuraStat®, PuraMatrix® y PuraMatrix GMP® de 3-D Matrix Medical Technology, y ha demostrado su utilidad en una amplia gama de aplicaciones clínicas y de laboratorio, que incluyen el cultivo celular, la administración de fármacos, el crecimiento acelerado de cartílago y hueso, y regeneración del SNC, tejido blando y músculo cardiaco, y además como matriz, armazón o atadura que puede asociarse con uno o más agentes detectables, agentes biológicamente activos, células y/o componentes celulares.

El documento WO2014 / 008400 A2 describe la filtración estéril de péptidos IEIK13 acuosos.

Los documentos WO2006138023, WO9953019 y CA2618184 describen el tratamiento en autoclave de péptidos en general.

Resumen

La presente invención se define por la reivindicación 1. Las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción pueden ser particularmente aplicables a composiciones peptídicas de alta viscosidad y/o composiciones peptídicas autoensamblables.

Entre otras cosas, la presente descripción demuestra que ciertas composiciones peptídicas (por ejemplo, composiciones peptídicas particulares, en concentraciones particulares y/o que tienen propiedades reológicas particulares) tienen ciertas características y/o pueden no ser aptas para ciertas etapas de manipulación y/o procesamiento tales como, por ejemplo, filtración (por ejemplo, filtración esterilizante).

La presente descripción también demuestra que ciertas composiciones peptídicas particulares son sorprendentemente estables a uno o más tratamientos (por ejemplo, tratamiento térmico, como se aplica en procedimientos de autoclave) que dañan muchas composiciones peptídicas.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona una variedad de tecnologías relevantes para el procesamiento de composiciones peptídicas y, en particular, para la esterilización.

En algunas modalidades, la presente descripción demuestra que las composiciones peptídicas particulares pueden tener una o más características útiles y/o sorprendentes (por ejemplo, resistencia al daño por tratamiento térmico, respuesta reológica y/o recuperación de la aplicación de tensión de cizallamiento, etc.).

La presente descripción proporciona, entre otras cosas, sistemas para esterilizar composiciones peptídicas y/o sistemas para determinar tales sistemas apropiados para su aplicación a composiciones peptídicas particulares. En algunas modalidades, las composiciones peptídicas particulares pueden definirse, por ejemplo, por una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: secuencia peptídica, concentración peptídica, viscosidad, rigidez, sensibilidad al tratamiento térmico, capacidad de respuesta reológica a la aplicación de tensión de cizallamiento, recuperación reológica de la aplicación de tensión de cizallamiento, etc.).

Entre otras cosas, la presente descripción proporciona ciertas composiciones peptídicas que pueden esterilizarse mediante tratamiento en autoclave.

En algunas modalidades, la presente descripción proporciona ciertas tecnologías para lograr la filtración de ciertas composiciones peptídicas y, en particular, para alterar las propiedades reológicas de las composiciones peptídicas (como se define por la identidad y la secuencia del péptido) para que sean susceptibles de filtración. Por ejemplo, en algunas modalidades, la viscosidad de las composiciones peptídicas a filtrar puede reducirse antes de la filtración. En algunas modalidades, puede aplicarse tensión de cizallamiento a las composiciones peptídicas, de modo que puedan alterarse las propiedades reológicas. Por ejemplo, la viscosidad y/o la rigidez de una composición peptídica pueden reducirse antes de la filtración; en algunas modalidades, tal reducción es temporal.

En algunas modalidades, las tecnologías proporcionadas permiten la filtración de composiciones peptídicas a concentraciones más altas de lo que es factible con las técnicas de filtración convencionales. Por ejemplo, las tecnologías descritas en la presente descripción permiten filtrar RADA16 y, en particular, esterilizar por filtración, a concentraciones superiores al 2,5 % en correspondencia.

En algunas modalidades particulares, la presente descripción proporciona un método para esterilizar una composición peptídica líquida cuya secuencia comprende una serie de unidades repetitivas de IEIK que comprende someter la composición a un tratamiento en autoclave. En algunas modalidades, un método no implica filtración esterilizante.

En algunas modalidades, la presente descripción proporciona un método para esterilizar una composición peptídica líquida cuya secuencia comprende una serie de unidades repetitivas de IEIK que comprende someter la composición a un tratamiento térmico. En algunas modalidades, el tratamiento térmico se realiza a alrededor de 121 °C durante alrededor de 25 min.

En algunas modalidades, la presente descripción proporciona un método para esterilizar una composición peptídica líquida que tiene un módulo de almacenamiento inicial dentro del intervalo de alrededor de 300 a alrededor de 5000 Pa a 1 Pa de tensión de oscilación, el método comprende las etapas de someter la composición a una alta tensión de cizallamiento de modo que el módulo de almacenamiento de la composición se reduzca temporalmente a un nivel dentro de un intervalo de alrededor de 0,01 % a 80 % del módulo de almacenamiento inicial, y someter la composición a filtración mientras su viscosidad está en el nivel reducido.

En algunas modalidades, la etapa de someter la composición a una alta tensión de cizallamiento utiliza al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento.

En algunas modalidades, al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una aguja. En algunas modalidades, al menos una aguja tiene una longitud de al menos 10 mm. En algunas modalidades, al menos una aguja tiene un calibre dentro del intervalo de alrededor de 25 a alrededor de 35.

En algunas modalidades, al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos un tamiz con orificios de tamaño micro o nano. En algunas modalidades, los orificios de tamaño micro o nano tienen una dimensión más grande dentro de un intervalo de alrededor de 0,5 pm a alrededor de 200 pm. En algunas modalidades, un pellizco entre orificios es de alrededor de 5 pm a alrededor de 10 mm. En algunas modalidades, un tamiz está hecha al menos en parte de un material seleccionado del grupo que consiste en acero inoxidable, tungsteno, titanio, silicona, cerámica, plástico y una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el grosor del tamiz es de alrededor de 10 pm a alrededor de 10 mm.

En algunas modalidades, al menos una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende al menos una membrana con poros de tamaño micro o nano. En algunas modalidades, los poros dieron un tamaño con un intervalo de alrededor de 0,45 pm a alrededor de 120 pm.

En algunas modalidades, la alta tensión de cizallamiento para la esterilización está en un intervalo de alrededor de 30 a alrededor de 200 Pa.

En algunas modalidades, una composición peptídica líquida comprende RADA16, IEIK13 o KLD12.

En algunas modalidades, una composición peptídica líquida se presuriza antes de la filtración. En algunas modalidades, una composición líquida peptídica se almacena adicionalmente al vacío.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B muestran un análisis de espectrometría de masas ilustrativo de RADA16 antes y después del tratamiento en autoclave, para evaluar la sensibilidad al calor. La Figura 1A representa la espectrometría de masas antes del tratamiento en autoclave. La Figura 1B representa la espectrometría de masas después del tratamiento en autoclave. La Figura 1C ilustra la estructura molecular de RADA16 a modo de ejemplo; en la composición peptídica particular que se analizó, la proteína estaba compuesta por RADARADARADARADA donde el extremo N-terminal y el extremo C-terminal están protegidos por grupos acetilo y amino.

Las Figuras 2A y 2B muestran un análisis de espectrometría de masas ilustrativo de IEIK13 antes y después del tratamiento en autoclave, para evaluar. La Figura 2A representa la espectrometría de masas antes del tratamiento en autoclave. La Figura 2b representa la espectrometría de masas después del tratamiento en autoclave. La Figura 2C ilustra la estructura molecular de IEIK13 a modo de ejemplo; en la composición peptídica particular que se analizó, la proteína estaba compuesta por IEIKIEIKIEIKI, donde el extremo N-terminal y el extremo C-terminal están protegidos por grupos acetilo y amino.

Las Figuras 3A y 3B muestran un ejemplo ilustrativo de espectrometría de masas de KLD12 antes y después del tratamiento en autoclave para evaluar la sensibilidad al calor. La Figura 3A representa la espectrometría de masas antes del tratamiento en autoclave. La Figura 3B representa la espectrometría de masas después del tratamiento en autoclave. La Figura 3C ilustra la estructura molecular de KLD12 a modo de ejemplo; en la composición peptídica particular que se analizó, la proteína estaba compuesta por KLDLKLDKKLDL, donde el extremo N-terminal y el extremo C-terminal están protegidos por grupos acetilo y amino.

La Figura 4 muestra ejemplos ilustrativos de pruebas de barrido de tiempo de RADA16 e IEIK13 antes y después del tratamiento en autoclave.

La Figura 5 proporciona una imagen de los péptidos y dispositivos necesarios para filtrar soluciones de péptidos viscosos, por ejemplo, RADA16, KLD12 e iEiK13. Se aplicó tensión de cizallamiento a través de una aguja de calibre 30 a las soluciones de péptidos (centro), de modo que las soluciones de péptidos se filtraron (derecha). La Figura 6 muestra ejemplos de pruebas de barrido de tiempo de 1 % y 2,5 % de RADA16 realizadas a 1 Pa y 10 rad/s. Se inyectó RADA16 a través de una aguja de calibre 30 para que la tensión de cizallamiento aplicada redujera la rigidez de los péptidos. Las mediciones se iniciaron 1 minuto después de la inyección.

La Figura 7 muestra ejemplos de pruebas de barrido de tiempo al 1 % y al 2,5 % con KLD12 realizadas a 1 Pa y 10 rad/s. Se inyectó K^{l d}12 a través de una aguja de calibre 30 para que la tensión de cizallamiento aplicada redujera la rigidez de los péptidos. Las mediciones se iniciaron 1 minuto después de la inyección.

La Figura 8 muestra ejemplos de pruebas de barrido de tiempo de 2,5 % IEIK13 realizadas a 1 Pa y 10 rad/s. Se inyectó IEIK13 a través de una aguja de calibre 30 para que la tensión de cizallamiento aplicada redujera la rigidez de los péptidos. Las mediciones se iniciaron 1 minuto después de la inyección.

La Figura 9 muestra una prueba de viscosidad de flujo ilustrativa realizada de 0,003 a 1000 1/segundo de velocidad de cizallamiento en una solución de RADA16 al 2,5 %.

La Figura 10 muestra una prueba de viscosidad de flujo ilustrativa realizada de 0,003 a 1000 1/segundo de velocidad de cizallamiento en una solución de IEIK13 al 1,5 %.

La Figura 11 muestra medidas de viscosidad ilustrativas de RADA16 al 2,5 % en función del tiempo para demostrar la recuperación de la viscosidad. En el tiempo = 0, se aplicó tensión de cizallamiento a los péptidos, de modo que se redujo la viscosidad. La línea horizontal indica la viscosidad original al 2,5 % de RADA16.

La Figura 12 muestra medidas de viscosidad ilustrativas de IEIK13 al 1,5 % en función del tiempo para demostrar la recuperación de la viscosidad. En el tiempo = 0, se aplicó tensión de cizallamiento a los péptidos, de modo que se redujo la viscosidad. La línea horizontal indica la viscosidad original al 1,5 % de IEIK13.

La Figura 13 muestra dispositivos ilustrativos para filtrar soluciones de péptidos viscosos, por ejemplo, RADA16, KLD12 e IEIK13. La tensión de cizallamiento se aplicó a través de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento con múltiples poros. La solución de péptido se dispensó con una jeringa en la parte superior (i). La solución de péptido pasó a través de la primera cámara de dilución por cizallamiento (soporte de filtro de 25 mm, Millipore (ii)) donde se insertó una unidad de dilución por cizallamiento con poros u orificios para reducir temporalmente la viscosidad de la solución de péptido. La solución peptídica pasó luego a la segunda cámara de filtrado (soporte de filtro de 25 mm, Millipore (iii)) donde se insertó una membrana filtrante para esterilizar las soluciones peptídicas o eliminar las partículas de las soluciones peptídicas. La solución filtrada se recibió en una botella (iv) para la salida. Se conectó un dispensador de alta presión a la jeringa dispensadora (v). Se conectó gas nitrógeno a alta presión al dispensador de alta presión (vii).

La Figura 14 muestra la observación visual de la viscosidad después de aplicar la tensión de cizallamiento una solución de KLD12 al 2,5 % y una solución de IEIK13 al 1,5 %. La fila superior incluye imágenes de 2,5 % KLD. La fila inferior incluye imágenes de 1,5 % IEIK13. Las soluciones en la columna más a la izquierda permanecen en la parte superior de los viales. Las soluciones en la columna más a la derecha (después de aplicar tensión de cizallamiento) tienen una viscosidad baja, por lo que la mayoría de los materiales se ubican en el fondo de los viales.

Las Figuras 15A, 15B, 15C y 15D muestran materiales y dispositivos (un tamiz de micro o nanoorificios) para filtrar soluciones de péptidos viscosos como RADA16, KLD12 e IEIK13. Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran las características de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento ilustrativa, un tamiz de microorificios, que puede usarse en el dispositivo que se muestra en la Figura 13. Los orificios fueron generados por tecnología de perforación láser. Dicho tamiz puede insertarse en la primera cámara para reducir la viscosidad de las soluciones de péptidos antes de la filtración real a través de la membrana en la segunda cámara. La Figura 15D muestra la observación visual de la viscosidad después de aplicar una tensión de cizallamiento al 2,5 % de KLD12 mediante el uso de un tamiz de micro o nanoorificios.

Definiciones

El término "agente", como se usa en la presente descripción, puede referirse a un compuesto o entidad de cualquier clase química que incluye, por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, sacáridos, lípidos, moléculas pequeñas, metales o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un agente es o comprende un producto natural que se encuentra y/o se obtiene de la naturaleza. En algunas modalidades, un agente es o comprende una o más entidades creadas por el hombre en el sentido de que está diseñado, diseñado, modificado por ingeniería genética, y/o producido mediante la acción de la mano del hombre y/o no se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, un agente puede utilizarse en forma aislada o pura; en algunas modalidades, puede utilizarse un agente en forma cruda. En algunas modalidades, los agentes potenciales se proporcionan como colecciones o bibliotecas, por ejemplo, que pueden tamizarse para identificar o caracterizar los agentes activos dentro de ellos. Algunas modalidades particulares de agentes que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNip, ARNhc, híbridos de ADN/ARN, oligonucleótidos antisentido, ribozimas), péptidos, miméticos de péptidos, etc. En algunas modalidades, un agente es o comprende un polímero. En algunas modalidades, un agente no es un polímero y/o está sustancialmente libre de cualquier polímero. En algunas modalidades, un agente contiene al menos un resto polimérico. En algunas modalidades, un agente carece o está sustancialmente libre de cualquier resto polimérico.

Como se usa en la presente, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse en una cadena polipeptídica, por ejemplo, mediante la formación de uno o más enlaces peptídicos. En algunas modalidades, un aminoácido tiene la estructura general H²N-C(H)(R)-COOH. En algunas modalidades, un aminoácido es un aminoácido natural. En algunas modalidades, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas modalidades, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunas modalidades, un aminoácido es un L-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en los péptidos naturales. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o si se obtiene de una fuente natural. En algunas modalidades, un aminoácido, que incluye un aminoácido carboxi- y/o amino-terminal en un polipéptido, puede contener una modificación estructural en comparación con la estructura general anterior. Por ejemplo, en algunas modalidades, un aminoácido puede modificarse mediante metilación, amidación, acetilación y/o sustitución en comparación con la estructura general. En algunas modalidades, dicha modificación puede, por ejemplo, alterar la vida media circulante de un polipéptido que contiene el aminoácido modificado en comparación con uno que contiene un aminoácido no modificado por lo demás idéntico. En algunas modalidades, tal modificación no altera significativamente una actividad relevante de un polipéptido que contiene el aminoácido modificado, en comparación con uno que contiene un aminoácido no modificado por lo demás idéntico. Como quedará claro por el contexto, en algunas modalidades, el término "aminoácido" se usa para referirse a un aminoácido libre; en algunas modalidades se usa para referirse a un residuo de aminoácido de un polipéptido.

Tal como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o sea evidente por el contexto (excepto donde dicho número excedería el 100 % de un valor posible).

Dos eventos o entidades están "asociados" entre sí, como se usa este término en la presente descripción, si la presencia, nivel y/o forma de uno está correlacionada con la del otro. Por ejemplo, se considera que una entidad particular (por ejemplo, polipéptido, firma genética, metabolito, etc.) está asociada con una enfermedad, trastorno o condición en particular, si su presencia, nivel y/o forma se correlaciona con la incidencia y/o la susceptibilidad a la enfermedad, trastorno o condición (por ejemplo, en una población relevante). En algunas modalidades, dos o más entidades están "asociadas" físicamente entre sí si interactúan, directa o indirectamente, de modo que están y/o permanecen en proximidad física entre sí. En algunas modalidades, dos o más entidades que están físicamente asociadas entre sí están unidas covalentemente entre sí; en algunas modalidades, dos o más entidades que están físicamente asociadas entre sí no están unidas entre sí de forma covalente, sino que están asociadas de forma no covalente, por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno, interacción de van der Waals, interacciones hidrofóbicas, magnetismo y combinaciones de las mismas.

El término "comparable" se usa en la presente para describir dos (o más) conjuntos de condiciones, circunstancias, individuos o poblaciones que son suficientemente similares entre sí para permitir la comparación de los resultados obtenidos o los fenómenos observados. En algunas modalidades, conjuntos comparables de condiciones, circunstancias, individuos o poblaciones se caracterizan por una pluralidad de características sustancialmente idénticas y una o un pequeño número de características variadas. Los expertos en la técnica apreciarán que los conjuntos de circunstancias, individuos o poblaciones son comparables entre sí cuando se caracterizan por un número y tipo suficientes de características sustancialmente idénticas para garantizar una conclusión razonable de que las diferencias en los resultados obtenidos o los fenómenos observados bajo o con diferentes conjuntos de circunstancias, los individuos o las poblaciones son causados o son indicativos de la variación en esas características que son variadas. Los expertos en la técnica apreciarán que el lenguaje relativo que se usa en la presente descripción (por ejemplo, mejorado, activado, reducido, inhibido, etc.) normalmente se referirá a comparaciones realizadas en condiciones comparables.

Ciertas metodologías descritas en la presente descripción incluyen una etapa de "determinación". Los expertos en la materia, al leer la presente memoria descriptiva, apreciarán que tal "determinación" puede utilizarse o lograrse mediante el uso de cualquiera de las diversas técnicas disponibles para los expertos en la materia, incluidas, por ejemplo, técnicas específicas a las que se hace referencia explícitamente en la presente descripción. En algunas modalidades, la determinación implica la manipulación de una muestra física. En algunas modalidades, la determinación implica la consideración y/o manipulación de datos o información, por ejemplo, mediante el uso de un ordenador u otra unidad de procesamiento adaptada para realizar un análisis relevante. En algunas modalidades, la determinación implica recibir información y/o materiales relevantes de una fuente. En algunas modalidades, la determinación implica comparar una o más características de una muestra o entidad con una referencia comparable.

El término "gel", como se usa en la presente descripción, se refiere a materiales viscoelásticos cuyas propiedades reológicas los distinguen de soluciones, sólidos, etc. En algunas modalidades, una composición se considera un gel si su módulo de almacenamiento (G') es mayor que su módulo (G"). En algunas modalidades, se considera que una composición es un gel si hay redes entrecruzadas químicas o físicas en la solución, que se distingue de las moléculas entrelazadas en una solución viscosa.

El término "in vitro " como se usa en la presente descripción se refiere a eventos que ocurren en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

El término "in vivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemas in vitro).

El término "péptido", como se usa en la presente descripción, se refiere a un polipéptido que normalmente es relativamente corto, por ejemplo, que tiene una longitud de menos de alrededor de 100 aminoácidos, menos de alrededor de 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos o menos de 10 aminoácidos.

El término "polipéptido", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que ocurre en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por ingeniería genética porque está diseñada y/o producida mediante la acción de la mano del hombre. En algunas modalidades, un polipéptido puede comprender o consistir en aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o ambos. En algunas modalidades, un polipéptido puede comprender o consistir en solo aminoácidos naturales o solo aminoácidos no naturales. En algunas modalidades, un polipéptido puede comprender D-aminoácidos, L-aminoácidos o ambos. En algunas modalidades, un polipéptido puede comprender solo D-aminoácidos. En algunas modalidades, un polipéptido puede comprender solo L-aminoácidos. En algunas modalidades, un polipéptido puede incluir uno o más grupos colgantes u otras modificaciones, por ejemplo, modificar o unirse a una o más cadenas laterales de aminoácidos, en el extremo N del polipéptido, en el extremo C del polipéptido o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, dichos grupos colgantes o modificaciones pueden seleccionarse del grupo que consiste en acetilación, amidación, lipidación, metilación, pegilación, etc., incluidas combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un polipéptido puede ser cíclico y/o puede comprender una porción cíclica. En algunas modalidades, un polipéptido no es cíclico y/o no comprende ninguna porción cíclica. En algunas modalidades, un polipéptido es lineal. En algunas modalidades, un polipéptido puede ser o comprender un polipéptido grapado. En algunas modalidades, el término "polipéptido" puede agregarse al nombre de un polipéptido, actividad o estructura de referencia; en tales casos, se usa en la presente descripción para referirse a polipéptidos que comparten la actividad o estructura relevante y, por lo tanto, pueden considerarse miembros de la misma clase o familia de polipéptidos. Para cada clase de este tipo, la presente memoria descriptiva proporciona y/o los expertos en la técnica conocerán polipéptidos ilustrativos dentro de la clase cuyas secuencias de aminoácidos y/o funciones son conocidas; en algunas modalidades, dichos polipéptidos ilustrativos son polipéptidos de referencia para la clase o familia de polipéptidos. En algunas modalidades, un miembro de una clase o familia de polipéptidos muestra una homología o identidad de secuencia significativa, comparte un motivo de secuencia común (por ejemplo, un elemento de secuencia característico) y/o comparte una actividad común (en algunas modalidades a un nivel comparable o dentro de un intervalo designado) con un polipéptido de referencia de la clase; en algunas modalidades con todos los polipéptidos dentro de la clase). Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido miembro muestra un grado general de homología de secuencia o identidad con un polipéptido de referencia que es al menos alrededor de 30-40 % y, a menudo, es mayor que alrededor de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más y/o incluye al menos una región (por ejemplo, una región conservada que puede en algunas modalidades ser o comprender un elemento de secuencia característico) que muestra una identidad de secuencia muy alta, a menudo superior al 90 % o incluso al 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99%. Tal región conservada normalmente abarca al menos 3-4 y a menudo hasta 20 o más aminoácidos; en algunas modalidades, una región conservada abarca al menos un tramo de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos. En algunas modalidades, un polipéptido útil puede comprender o consistir en un fragmento de un polipéptido original. En algunas modalidades, un polipéptido útil puede comprender o consistir en una pluralidad de fragmentos, cada uno de los cuales se encuentra en el mismo polipéptido original en una disposición espacial diferente entre sí que la que se encuentra en el polipéptido de interés (por ejemplo, fragmentos que están directamente enlazados en el original pueden estar separados espacialmente en el polipéptido de interés o viceversa, y/o los fragmentos pueden estar presentes en un orden diferente en el polipéptido de interés que en el original), de modo que el polipéptido de interés es un derivado de su polipéptido original.

El término "referencia", como se usa en la presente descripción, describe un estándar o control con respecto al cual se realiza una comparación. Por ejemplo, en algunas modalidades, un agente, animal, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés se compara con un agente, animal, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia o de control. En algunas modalidades, una referencia o control se prueba y/o determina sustancialmente simultáneamente con la prueba o determinación de interés. En algunas modalidades, una referencia o control es una referencia o control histórico, incorporado opcionalmente en un medio tangible. Normalmente, como entenderán los expertos en la técnica, una referencia o control se determina o caracteriza en condiciones o circunstancias comparables a las que están en evaluación. Los expertos en la técnica apreciarán cuando hay suficientes similitudes para justificar la confianza y/o la comparación con una posible referencia o control particular.

Descripción detallada de ciertas modalidades

La presente invención proporciona tecnologías para la esterilización de composiciones peptídicas. En algunas modalidades, los métodos descritos son particularmente aplicables a soluciones de péptidos con alta viscosidad y/o rigidez. En algunas modalidades, la presente descripción define soluciones de péptidos particulares que pueden esterilizarse mediante tratamiento en autoclave. En algunas modalidades, la presente descripción define soluciones de péptidos particulares que pueden no ser susceptibles de filtración a menos y hasta que se traten para alterar sus propiedades reológicas. En algunas modalidades, la presente descripción proporciona tecnologías que pueden reducir temporalmente la viscosidad y/o la rigidez de la solución peptídica lo suficiente como para permitir la filtración. En algunas modalidades, la presente descripción enseña tecnologías para facilitar la manipulación, el procesamiento y/o la filtración de ciertas soluciones de péptidos, por ejemplo, mediante la aplicación de una alta tensión de cizallamiento que modifica las propiedades reológicas de las mismas.

Péptidos y composiciones peptídicas

De acuerdo con una o más modalidades, las composiciones peptídicas a las que se refieren las enseñanzas de la presente descripción pueden ser composiciones peptídicas anfifílicos que tienen de alrededor de 6 a alrededor de 200 residuos de aminoácidos. En ciertas modalidades, un péptido relevante puede tener una longitud de al menos alrededor de 7 aminoácidos. En ciertas modalidades, un péptido puede tener una longitud de entre alrededor de 7 y alrededor de 17 aminoácidos. En ciertas modalidades, un péptido puede tener una longitud de al menos 8 aminoácidos, al menos de alrededor de 12 aminoácidos o al menos de alrededor de 16 aminoácidos.

En algunas modalidades, como se entiende en la técnica, un polipéptido anfifílico es uno cuya secuencia incluye tanto aminoácidos hidrófilos como aminoácidos hidrófobos. En algunas modalidades, dichos aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos pueden unirse alternativamente, de modo que el péptido tenga una secuencia de aminoácidos hidrofílicos y de aminoácidos hidrofóbicos alternos. En algunas modalidades, tal péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es o comprende repeticiones de Arg-Ala-Asp-Ala (RADA); en algunas modalidades, tal péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es o comprende repeticiones de Lys-Leu-Asp (KLD); en algunas modalidades, dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es o comprende repeticiones de Ile-Glu-Ile-Lys (IEIK).

En algunas modalidades, un péptido para usar de acuerdo con la presente descripción generalmente puede autoensamblarse y/o puede exhibir una estructura de hoja beta en solución acuosa bajo ciertas condiciones.

En algunas modalidades, un péptido para usar de acuerdo con la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos como la que se encuentra en el producto comercial conocido como PuraMatrix®, es decir, tiene la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala (es decir, RADA16, también conocido como [RADA]4; SEQ ID NO:1). En algunas modalidades, un péptido para usar de acuerdo con la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos: Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu (es decir, KLDL12, también conocido como [KLDL]3, también conocido como KLD12; SEQ ID NO:2). Un péptido para usar de acuerdo con la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos: Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile (es decir, IEIK13, también conocido como (IEIK)3I; SEQ ID NO:3).

En algunas modalidades, las composiciones peptídicas para las que puede ser relevante la presente descripción son aquellas caracterizadas por ciertas propiedades reológicas. En algunas modalidades, las propiedades reológicas relevantes pueden ser o incluir módulo de pérdida, rigidez, tiempo de recuperación reológica, módulo de almacenamiento, viscosidad, límite elástico, etc. En algunas modalidades, las propiedades reológicas se evalúan mediante medición; en algunas modalidades, una o más propiedades reológicas pueden evaluarse mediante observación visual.

En ciertas modalidades, el módulo de almacenamiento y la rigidez tienen una correlación positiva; en general, los expertos en la técnica apreciarán que un mayor módulo de almacenamiento está relacionado con una mayor rigidez. En algunas modalidades, una composición peptídica de alta viscosidad se caracteriza por un módulo de almacenamiento dentro del intervalo de alrededor de 300 a alrededor de 5000 Pa a 1 rad/s de frecuencia y 1 Pa de tensión de oscilación.

En algunas modalidades, una composición peptídica para uso de acuerdo con la presente invención tiene una concentración peptídica dentro del intervalo de alrededor de 0,01 % a alrededor de 10 %.

En algunas modalidades, una composición peptídica a la que se aplica una o más de las metodologías descritas en la presente descripción tiene un volumen a escala comercial.

En algunas modalidades, una composición peptídica a la que se aplica una o más de las metodologías descritas en la presente descripción es una que se ha almacenado durante un período de tiempo. En algunas modalidades, una composición peptídica se ha almacenado en un recipiente a presión.

En algunas modalidades, una composición peptídica a la que se aplican una o más metodologías descritas en la presente descripción se almacena, por ejemplo, en un recipiente de depósito antes del envasado.

Propiedades mejoradas

La presente descripción aprecia que la preparación y/o manejo de ciertas composiciones peptídicas (por ejemplo, particularmente composiciones de ciertos péptidos autoensamblables y/o de altas concentraciones de péptidos) ha sido complicada por dificultades relacionadas, por ejemplo, con alta viscosidad y/o rigidez. La presente descripción demuestra particularmente que ciertas composiciones peptídicas no son susceptibles de filtración y, en particular, de filtración a través de filtros esterilizantes.

La presente descripción aprecia además que los desafíos de filtración pueden complicar o impedir la esterilización de dichas composiciones peptídicas. La presente descripción proporciona tecnologías que permiten la filtración de ciertas composiciones peptídicas y/o permiten la esterilización de otro modo.

Tratamiento en autoclave

El tratamiento en autoclave es un método de esterilización convencional que consiste en someter los materiales a vapor saturado a alta presión a 121 °C. En general, se entiende en la técnica que la aplicación de altas temperaturas, como la que se produce en el tratamiento en autoclave, puede degradar los péptidos.

La presente descripción demuestra sorprendentemente que ciertas composiciones peptídicas son estables al tratamiento térmico, y particularmente al tratamiento en autoclave. Entre otras cosas, la presente descripción demuestra que dichas composiciones peptídicas pueden esterilizarse con el tratamiento en autoclave. En algunas modalidades, dichas composiciones pueden esterilizarse mediante tratamiento térmico a alrededor de 121 °C durante alrededor de 25 minutos.

En algunas modalidades, las composiciones peptídicas que pueden someterse a tratamiento térmico y/o tratamiento en autoclave son composiciones IEIK13. En algunas de tales modalidades, las composiciones de IEIK13 tienen una concentración dentro del intervalo de alrededor de 0,01 % a alrededor de 10 %.

En algunas modalidades, las composiciones peptídicas que pueden someterse a tratamiento térmico y/o tratamiento en autoclave son composiciones KLD12. En algunas modalidades, sin embargo, las composiciones KLD12 no se someten a tratamiento en autoclave de acuerdo con la presente invención.

En algunas modalidades, las composiciones de RADA16 no se someten a tratamiento en autoclave de acuerdo con la presente invención.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, la presente descripción propone que la estabilidad de ciertas composiciones IEIK13 al tratamiento térmico, como el tratamiento en autoclave, puede atribuirse, al menos en parte, a la ausencia de ácido aspártico (Asp, D) en las composiciones, mientras que RADA16 y KLD12 tienen ácidos aspárticos.

En algunas modalidades, las composiciones peptídicas que pueden someterse apropiadamente a un tratamiento térmico, como un tratamiento en autoclave de acuerdo con la presente invención, se caracterizan por su resistencia a la degradación cuando se exponen a dicho tratamiento y/o por la estabilidad de las propiedades reológicas (por ejemplo, viscosidad y/o rigidez) cuando se somete a dicho tratamiento. De acuerdo con la presente descripción, las composiciones peptídicas de interés pueden exponerse a un tratamiento térmico, tal como un tratamiento en autoclave, y pueden evaluarse una o más propiedades de la composición (por ejemplo, degradación peptídica y/o una o más propiedades reológicas), por ejemplo, antes y después del tratamiento, de modo que pueda determinarse la idoneidad de esterilizar dicha composición mediante un tratamiento en autoclave (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2).

Alteración de propiedades reológicas

La presente descripción demuestra que ciertas composiciones peptídicas pueden volverse susceptibles de filtración a través de la exposición a un tratamiento que altera una o más propiedades reológicas (por ejemplo, que altera la viscosidad y/o la rigidez).

En algunas modalidades particulares, la alteración de las propiedades reológicas se logra mediante la exposición a la tensión de cizallamiento.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, la presente descripción propone que someter las composiciones peptídicas como se describe en la presente descripción a una alta tensión de cizallamiento puede alterar las estructuras autoensambladas. La presente descripción propone además que el tiempo de recuperación puede representar el requerido para que tales estructuras se vuelvan a formar.

En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 20 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 30 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 40 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 50 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 60 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 60 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 80 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 90 Pa. En algunas modalidades, la tensión de cizallamiento aplicada a las soluciones de péptidos puede ser de al menos alrededor de 100 Pa. En algunas modalidades, la cantidad de tensión de cizallamiento puede ser de al menos alrededor de 30~100 Pa, por ejemplo, en vista del límite elástico de RADA162,5 %, IEIK131,5 % y 2,5 % y KLD122,5 % mencionado anteriormente. En algunas modalidades, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede caer significativamente con la tensión de cizallamiento. En algunas modalidades, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede caer al menos un 10 % con la tensión de cizallamiento. En algunas modalidades, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede caer al menos un 30 % con la tensión de cizallamiento. En algunas modalidades, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede caer al menos un 50 % con la tensión de cizallamiento. En algunas modalidades, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede caer al menos un 70 % con la tensión de cizallamiento. En algunas modalidades, la viscosidad de las soluciones de péptidos puede caer al menos un 90 % con la tensión de cizallamiento.

En algunas modalidades, la alteración de la propiedad reológica es temporal. En algunas modalidades, la composición peptídica se caracteriza por características de recuperación reológica. Por ejemplo, en algunas modalidades, tales composiciones se caracterizan porque una o más de sus propiedades reológicas se restauran dentro de un período de tiempo dentro de un intervalo de alrededor de 1 minuto a alrededor de 48 horas.

En algunas modalidades, se considera que se logra la restauración reológica cuando una o más propiedades reológicas vuelven a un nivel de al menos el 20 % de su valor inicial.

En algunas modalidades, se considera que se logra la restauración reológica cuando el cambio observado en una o más propiedades reológicas tras la aplicación de tensión de cizallamiento se invierte al menos en un 30 %.

En algunas modalidades, las composiciones peptídicas pueden recuperar su módulo de almacenamiento después de la aplicación de tensión de cizallamiento. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 0,1 al 100 % de su módulo de almacenamiento original en 1 minuto. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 0,1 al 10 % de su módulo de almacenamiento original en 1 minuto. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 20 al 100 % de su módulo de almacenamiento original en 20 minutos. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 20 al 60 % de su módulo de almacenamiento original en 20 minutos.

En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar su viscosidad con el tiempo después de la filtración. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 0,1 al 30 % de su viscosidad original en 1 minuto. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 0,1 al 100 % de su viscosidad original en 1 minuto. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 20 al 100 % de su viscosidad original en 20 minutos. En algunas modalidades, las soluciones de péptidos pueden recuperar alrededor de del 20 al 60 % de su viscosidad original en 20 minutos.

La presente descripción ejemplifica específicamente el ajuste apropiado de las propiedades reológicas de ciertas composiciones peptídicas tras la aplicación de tensión de cizallamiento (por ejemplo, específicamente tras el paso a través de una aguja, por ejemplo, de estructura particular) (véase el Ejemplo 4). Los resultados presentados en este Ejemplo muestran un aumento logarítmico del módulo de almacenamiento desde 1 minuto después de la inyección, como se muestra en la Figura 10 para RADA16, la Figura 11 para KLD12 y la Figura 12 para IEIK13.

Entre otras cosas, la presente descripción proporciona metodologías de acuerdo con las cuales una o más de ciertas composiciones peptídicas se someten a una alta tensión de cizallamiento para que se ajusten una o más de sus propiedades reológicas (por ejemplo, se reduzca la viscosidad) a un nivel apropiado para que la(s) composición(es) se vuelve(n) susceptible(s) de filtración y, en algunas modalidades, de filtración esterilizante, y la(s) composición(es) se somete(n) a dicha filtración, dentro de un período de tiempo después de someterla a una tensión de cizallamiento seleccionada de manera que la filtración ocurra mientras las propiedades reológicas permanecen ajustadas (por ejemplo, antes de que se haya producido una restauración significativa o completa de dichas propiedades).

En general, como se describe en la presente descripción, la tensión de cizallamiento puede aplicarse mediante la aplicación de una composición peptídica a (y/o el paso de una composición peptídica a través de) una unidad de adelgazamiento por cizallamiento. En algunas modalidades, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento es o comprende una aguja, una membrana y/o un tamiz. En algunas modalidades, se utiliza una pluralidad de unidades de adelgazamiento por cizallamiento individuales, por ejemplo, para que pueda lograrse una filtración de alto rendimiento.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona dispositivos y metodologías que pueden lograr la filtración de composiciones peptídicas a escala comercial.

Aguja como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

En algunas modalidades no limitativas, la tensión de cizallamiento puede aplicarse mediante inyección a través de una o más agujas. Por lo tanto, en algunas modalidades, pueden usarse una o más agujas como unidad de adelgazamiento por cizallamiento.

En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 1 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 2 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 5 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 10 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 15 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 20 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 30 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 40 mm de largo. En algunas modalidades, una aguja puede tener al menos alrededor de 50 mm de largo.

En algunas modalidades, una aguja puede tener un calibre dentro de un intervalo de alrededor de 20 a alrededor de 34. En algunas modalidades, una aguja puede tener un calibre dentro de un intervalo de alrededor de 25 a alrededor de 34. En algunas modalidades, una aguja puede tener un calibre de alrededor de 27 a alrededor de 34.

La Figura 5 describe una modalidad no limitativa de un dispositivo de esterilización de acuerdo con una o más modalidades no limitativas. Como se representa, la composición peptídica (por ejemplo, solución viscosa de un péptido autoensamblado) (izquierda) puede transferirse a la primera jeringa con una aguja, inyectarse en la segunda jeringa (derecha) y luego filtrarse.

Membrana como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

En algunas modalidades, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento utilizada para aplicar tensión de cizallamiento a una composición peptídica como se describe en la presente descripción puede ser un dispositivo o entidad caracterizada por microporos o nanoporos.

La Figura 13 representa una modalidad no limitativa de un dispositivo de esterilización de acuerdo con una o más modalidades no limitativas de la presente invención. Como se representa, una solución de péptido (por ejemplo, una solución viscosa de un péptido autoensamblado) puede transferirse a una jeringa dispensadora (o un recipiente a presión), suministrarse en una primera cámara con poros para tensión de cizallamiento y luego filtrarse en la segunda cámara. Como entenderán los expertos en la técnica, el tamaño del diámetro de la membrana puede variar en dependencia de la cantidad de solución peptídica.

En algunas modalidades, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de alrededor de 0,45 pm a 120 pm. En algunas modalidades, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de alrededor de 1 pm a 100 pm. En algunas modalidades, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de alrededor de 3 pm a 80 pm. En algunas modalidades, el tamaño de poro de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede ser de alrededor de 4 pm a 50 pm.

Tamiz como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

En algunas modalidades, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede tener micro o nanoorificios. En algunas modalidades, los orificios pueden modelarse o taladrarse en una placa cuyo grosor puede ser de alrededor de 10 pm a 10 mm en algunas modalidades. La Figura 15 representa una modalidad no limitativa de un dispositivo de esterilización de acuerdo con una o más modalidades no limitativas de la presente descripción. Puede insertarse una unidad de adelgazamiento por cizallamiento en la primera cámara de filtrado que se muestra en la Figura 13. En algunas modalidades, los orificios en una realización de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento descrita en la presente descripción pueden tener una dimensión mayor dentro del intervalo de alrededor de 0,5 pm a 200 pm. En algunas modalidades, dicha dimensión puede estar dentro del intervalo de alrededor de 0,5 pm a 100 pm. En algunas modalidades, dicha dimensión puede estar dentro del intervalo de alrededor de 0,5 pm a 80 pm. En algunas modalidades, dicha dimensión puede estar dentro del intervalo de alrededor de 0,5 pm a 50 pm.

En algunas modalidades, una unidad de adelgazamiento por cizallamiento de esta modalidad puede tener un paso entre orificios dentro del intervalo de alrededor de 5 pm a alrededor de 10 mm.

En algunas modalidades, la unidad de adelgazamiento por cizallamiento puede estar hecha, en su totalidad o en parte, de un material seleccionado del grupo que consiste en acero inoxidable, tungsteno, titanio, metal similar, silicio, cerámica o materiales plásticos, y combinaciones de los mismos.

Aplicaciones

En algunas modalidades, las composiciones peptídicas a las que se aplican las tecnologías descritas en la presente descripción se utilizan luego en una o más aplicaciones que involucran células, tejidos u organismos biológicos (por ejemplo, para que las composiciones esterilizadas sean de particular utilidad).

Como se sabe en la técnica, ciertas composiciones peptídicas (por ejemplo, ciertas composiciones peptídicas autoensamblables) han demostrado ser particularmente útiles como matrices para el crecimiento celular in vivo y/o in vitro, y/o como rellenos de huecos, hemostáticos, barreras al movimiento de líquidos, agentes de cicatrización de heridas, etc. En algunas modalidades, dichas composiciones forman hidrogeles peptídicos con una o más características deseables (por ejemplo, tamaño de poro y/o canal, resistencia, deformabilidad, reversibilidad de la formación de gel, transparencia, etc.).

Los expertos en la técnica, al leer la presente descripción, apreciarán inmediatamente su utilidad en una variedad de contextos en los que se emplean tales composiciones peptídicas, incluidas las composiciones en gel y especialmente las que incluyen composiciones gelificantes reversibles. De particular interés son las aplicaciones in vivo (por ejemplo, aplicaciones quirúrgicas u otras aplicaciones, particularmente que permiten o se benefician de la suministración a través de un dispositivo de tipo cánula, como una aguja, a través del cual puede administrarse o aplicarse la composición).

Ejemplos

Ejemplo 1: Filtración de soluciones de péptidos de alta viscosidad

El presente ejemplo describe, entre otras cosas, las propiedades reológicas de varias composiciones peptídicas (es decir, específicamente de composiciones peptídicas autoensamblables) y demuestra una variabilidad significativa de parámetros tales como viscosidad, módulo de almacenamiento (por ejemplo, rigidez), módulo de pérdida y límite elástico para diferentes péptidos y/o para diferentes concentraciones del mismo péptido. El Ejemplo también demuestra que algunas de estas soluciones no son susceptibles de filtrar. En particular, el Ejemplo demuestra que las soluciones de alta viscosidad de tales péptidos presentan desafíos para las tecnologías de filtración. Se determinaron las propiedades reológicas para una variedad de soluciones de péptidos. Específicamente, las soluciones de RADA16, IEIK13 y KLD12 se prepararon en las concentraciones que se indican a continuación en la Tabla 1. Como puede verse, en general, las soluciones de mayor concentración mostraron una mayor viscosidad máxima. Además, los péptidos de diferente secuencia mostraron diferentes viscosidades máximas en soluciones de la misma concentración. Por ejemplo, las soluciones de KLD12 al 2 %, KLD12 al 2,5 % y IEIK13 al 1,5 % tienen viscosidades máximas 2, 3,4 y 3,2 veces mayores que las del RADA16 al 2,5 %, respectivamente.

Tabla 1 Propiedades reológicas de soluciones de péptidos a concentraciones seleccionadas

Cada una de las soluciones de péptido enumeradas en la Tabla 1 se sometió a filtración a través de un filtro de jeringa Nalgene de 0,2 pm con membranas de acetato de celulosa de 25 mm. Las soluciones de KLD12 al 1 % y al 1,5 % (que, como puede verse, se caracterizan por una concentración, viscosidad y/o rigidez relativamente bajas) pasaron con éxito a través del filtro. Por el contrario, las soluciones de KLD12 al 2 % y 2,5 % y las soluciones de IEIK13 al 1,5 % (que, como puede verse, se caracterizan por una concentración, viscosidad y/o rigidez relativamente altas) no pudieron pasar con éxito a través del filtro; en cambio, el filtro estalló.

Ejemplo 2: Tratamiento en autoclave de soluciones peptídicas

El presente ejemplo demuestra que algunas composiciones peptídicas (es decir, específicamente composiciones peptídicas autoensamblables como se describe en la presente descripción) son sorprendentemente estables al tratamiento térmico. En particular, este ejemplo demuestra que ciertas composiciones peptídicas mantienen una masa molar estable incluso tras la aplicación de un tratamiento en autoclave a 121°C durante 25 minutos. Por lo tanto, el presente ejemplo establece que dichas composiciones pueden esterilizarse con éxito mediante la aplicación de tecnologías de alta temperatura (por ejemplo, autoclave). Sin embargo, el ejemplo demuestra simultáneamente que ciertas composiciones peptídicas no son estables a dicho tratamiento.

Las Figuras 1-3 presentan los resultados del tratamiento en autoclave para ciertas composiciones de RADA16, IEKI13 y KLD12, respectivamente.

La masa molar medida de RADA16, antes del tratamiento en autoclave, fue 1712, que coincide con su masa molar calculada. Sin embargo, el análisis de espectrometría de masas demostró que RADA16 se degradó durante el tratamiento en autoclave, lo que demuestra que esta técnica no puede usarse para la esterilización de tal composición de RADA16.

La masa molar medida de IEIK13, antes del tratamiento en autoclave, fue 1622, que también coincide con su masa molar calculada. El análisis de espectrometría de masas demostró que IEIK13 no se degradó después del tratamiento en autoclave, lo que demuestra, de esta manera, que esta técnica puede emplearse de manera útil para la esterilización de tal composición de IEIK13.

La masa molar medida de KLD12, antes del tratamiento en autoclave, es 1467, que coincide con su masa molar calculada. KLD12 se degradó parcialmente durante el tratamiento en autoclave. Como KLD12 se degradó durante el tratamiento en autoclave, se determinó que el tratamiento en autoclave no es una técnica preferida para la esterilización de dichas composiciones de KLD12; se llevó a cabo un enfoque de filtración convencional para la esterilización en KLD12 a varias concentraciones de péptido.

Las propiedades reológicas de ciertas composiciones peptídicas se determinaron antes y después del autoclave. Los datos se muestran en la Figura 4. Como puede verse, el IEIK13 esterilizado en autoclave mostró sorprendentemente una fuerza reológica casi idéntica a la del IEIK13 no esterilizado en autoclave, mientras que RADA16 mostró una disminución drástica de la fuerza reológica.

El tratamiento en autoclave puede usarse para la esterilización de las composiciones IEIK13 como se describe en la presente descripción, pero debe evitarse para las composiciones RADA16.

Ejemplo 3: Propiedades reológicas de composiciones peptídicas con aplicación de esfuerzo cortante

El presente Ejemplo demuestra que la tensión de cizallamiento aplicada puede disminuir la viscosidad y/o la rigidez de ciertas soluciones peptídicas y, además, demuestra que dicha disminución de la viscosidad y/o la rigidez puede hacer que las composiciones sean aptas para diversas tecnologías de procesamiento (por ejemplo, filtración) para las que las composiciones no son aptas en ausencia de dicho tratamiento.

Ensayo de flujo de cizallamiento

Se realizaron pruebas de flujo de cizallamiento en soluciones de péptido mediante el uso de un reómetro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm. Los resultados se muestran en la Figura 9 para soluciones RADA16 al 2,5 % y en la Figura 10 para soluciones IEIK13 al 1,5 %. Como puede verse, tanto las soluciones de RADA16 al 2,5 % como las de IEIK13 al 1,5 % mostraron propiedades típicas de adelgazamiento por cizallamiento. Es decir, a medida que aumentaba la velocidad de cizallamiento, sus viscosidades se reducían drásticamente. A medida que aumentaba la velocidad de cizallamiento, la tensión de cizallamiento aumentaba inmediatamente y luego disminuía ligeramente cuando la viscosidad alcanzaba una meseta. El límite elástico fue de alrededor de 40 Pa para una solución de RADA16 al 2,5 % y de alrededor de 60 Pa para una solución de IEIK13 al 1,5 %.

Recuperación de viscosidad

Los tiempos de recuperación de la viscosidad de las soluciones RADA16 e IEIK13 se evaluaron después de la aplicación de una alta tensión de cizallamiento. Con un reómetro DHR-1 (TA Instruments), se midieron los cambios de viscosidad de las soluciones RADA16 al 2,5 % y IEIK13 al 1,5 % con pruebas de flujo a 0,005 1/segundo de velocidad de cizallamiento después de aplicar 10001/segundo de velocidad de cizallamiento a las muestras durante 1 minuto. Las soluciones RADA16 e IEIK13 mostraron un comportamiento tixotrópico típico, lo que significa que su viscosidad se recuperó lentamente. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, proponemos que los tiempos de recuperación de la propiedad reológica para estas soluciones pueden basarse en el reensamblaje de moléculas peptídicas en estructuras (por ejemplo, nanofibras) en las soluciones. Los tiempos de reensamblaje completos de la solución de RADA16 al 2,5 % y de IEIK13 al 1,5 % fueron de alrededor de 12 a 48 horas. Los resultados se muestran en la Figura 11 para la solución RADA16 al 2,5 % y en la Figura 12 para la solución IEIK13 al 1,5 %. Recuperación del módulo de almacenamiento

Los porcentajes de recuperación del módulo de almacenamiento original al cabo de 1 minuto y 20 minutos después de inyectar las composiciones peptídicas a través de una aguja de calibre 30 se enumeran en la Tabla 2. La velocidad de recuperación de IEIK13 (específicamente, de una solución de IEIK13 al 2,5 %) fue la más rápida entre las soluciones de péptidos, al mostrar una recuperación del 100 % del módulo de almacenamiento original en 20 minutos. La de KLD12 fue la más lenta entre las probadas para recuperarse; mostró solo un 23 % de recuperación del módulo de almacenamiento original en 20 minutos (para un 2,5 %). En algunas modalidades no limitantes, la recuperación total a un módulo original puede tardar entre 12 y 48 horas después del paso a través de una aguja (por ejemplo, inyección).

Tabla 2 Recuperación al módulo de almacenamiento original a 1 minuto y 20 minutos después de la inyección a través de una aguja de calibre 30

Se realizaron mediciones reológicas para soluciones RADA16 e IEIK13 después de inyectarlas a través de agujas de calibre 30. Los resultados mostraron un aumento logarítmico del módulo de almacenamiento desde 1 minuto después de la inyección. Los resultados se muestran en la Figura 6 para RADA16, la Figura 7 para KLD12 y la Figura 8 para IEIK13.

Ejemplo 4: Una aguja como unidad de adelgazamiento por cizallamiento

El presente ejemplo describe un proceso de filtración para composiciones peptídicas (específicamente, de péptidos autoensamblables como se describe en la presente descripción) mediante el uso de una aguja como unidad de adelgazamiento por cizallamiento. En particular, el presente ejemplo demuestra que la aplicación de una tensión de cizallamiento apropiada (por ejemplo, mediante el paso a través de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento) puede alterar las propiedades reológicas de la composición (por ejemplo, puede reducir la viscosidad y/o la rigidez, etc.) para que pueda pasar con éxito a través de un filtro como, por ejemplo, un filtro esterilizante).

La Figura 5 representa una modalidad no limitativa de un dispositivo de esterilización de acuerdo con la presente descripción. Tal como se representa, el dispositivo incluye una primera jeringa que aplica una tensión de cizallamiento bruta a la composición suficiente para alterar sus propiedades reológicas de modo que pase con éxito a través de una segunda jeringa que está equipada con un filtro de membrana de tamaño de poro apropiado para lograr la esterilización de la composición. Específicamente, el dispositivo representado incluye una primera jeringa con una aguja de calibre 30 (0,3 mm x 25 mm, aguja de irrigación Endo con ventilación de doble lado, Transcodent, Alemania) (centro) y una segunda jeringa con un filtro de membrana (derecha). Se transfirió una solución viscosa de KLD12 al 2,5 % (izquierda) a la primera jeringa, y luego se inyectó en la segunda jeringa (derecha) y luego se filtró a través del filtro de membrana. Con este método, se filtraron con éxito soluciones de KLD12 al 2,5 %.

Ejemplo 5: Unidad de adelgazamiento por cizallamiento de alto rendimiento

El presente ejemplo describe ciertas unidades de adelgazamiento por cizallamiento. El principio de funcionamiento es similar al de la primera aguja descrita anteriormente. Específicamente, cada unidad de dilución por cizallamiento aplica una tensión de cizallamiento adecuada y suficiente para ajustar una o más propiedades reológicas de una composición peptídica aplicada de modo que la composición se vuelva susceptible de filtración, y específicamente de filtración a través de un filtro esterilizante. En algunas modalidades, pueden usarse múltiples agujas o equivalentes como una unidad de adelgazamiento por cizallamiento.

Filtro de membrana

Este ejemplo demuestra el uso de un filtro de membrana (tamaño de poro > 0,45 pm) como unidad de adelgazamiento por cizallamiento. Las soluciones viscosas de KLD12 al 2,5 % o IEIK13 al 1,5 % pueden transferirse a una jeringa dispensadora (o un recipiente a presión), entregadas a una primera cámara con una unidad de adelgazamiento por cizallamiento (por ejemplo, el tamaño de los poros oscila entre 0,45 pm y 120 pm), y luego se filtró a través de una membrana filtrante (por ejemplo, tamaño de poro: 0,2 pm) en la segunda cámara.

Para examinar el efecto del tamaño de poro en la unidad de adelgazamiento por cizallamiento sobre el cambio de viscosidad de las soluciones de péptidos viscosos, se pasaron soluciones de KLD12 al 2,5 % y IEIK al 1,5 % a través de tamaños de poro seleccionados y se evaluaron sus cambios de viscosidad aparentes. Las soluciones de KLD al 2,5 % pasaron a través de la unidad de adelgazamiento con tamaños de poro de 41 pm, 20 pm y 5 pm. La viscosidad de las soluciones disminuyó lo suficiente como para fluir hacia abajo cuando se volteó un recipiente que las contenía. Aunque las soluciones KLD al 2,5 % que habían pasado a través de la unidad de dilución por cizallamiento con un tamaño de poro de 120 pm eran ligeramente menos viscosas que las composiciones KLD al 2,5 % previas al paso, permanecieron demasiado viscosas para fluir hacia abajo en la prueba de inversión del recipiente. La viscosidad de las soluciones de IEIK13 al 1,5 % se redujo significativamente cuando se pasó a través de una membrana con un tamaño de poro de 5 pm. Los resultados se muestran en la Figura 14.

Se estudiaron soluciones de RADA16 al 1,0 % para la reducción de la viscosidad con una unidad de adelgazamiento por cizallamiento (se muestra en la Figura 13). La solución de RADA16 al 1,0 %, que muestra un comportamiento tixotrópico y de adelgazamiento por cizallamiento, se pasó a través de una unidad de adelgazamiento por cizallamiento a 50 psi de presión de inyección. La solución mostró de 1,4 ~ 1,7 mL/minuto de salida. La solución no se pudo pasar a través de un filtro (tamaño de poro de 0,2 pm) a 50 psi de presión de inyección (es decir, sin exposición previa a una unidad de adelgazamiento). Sin embargo, el agua, que es un fluido newtoniano representativo, mostró que el caudal de salida era relativamente constante. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Capacidades de filtrado del sistema que se muestra en la Figura 13 para solución RADA16 al 1 % y agua.

Como se demostró anteriormente, las soluciones de KLD12 al 2,5 % y de IEK13 al 1,5 % no se pudieron filtrar a través de un filtro de jeringa Nalgene de 0,2 pm con membranas de acetato de celulosa de 25 mm. El RADA16 al 2.5 % no suele ser susceptible para la filtración a través de una membrana de 0,2 pm. Las soluciones de RADA16 al 2.5 %, IEIK13 al 1,5 % y KLD12 al 2,5 % se pudieron filtrar después de exponerlas a una unidad de adelgazamiento por cizallamiento a 100 psi de presión de inyección que mostraron una producción de 3,8, 12,5 y 11,4 mL/min de salida, respectivamente. Las soluciones no pudieron filtrarse sin la unidad de adelgazamiento por cizallamiento. Una unidad de adelgazamiento por cizallamiento que se muestra en la Figura 16 puede utilizarse con éxito para la esterilización y filtración de soluciones de péptidos viscosos que no se filtran fácilmente. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Capacidades de filtrado del sistema de filtrado que se muestra en la Figura 13 para soluciones RADA16 al 2.5 %, IEIK13 al 1,5 %, KLD12 al 2,5 %.

Tamiz

Estos ejemplos demuestran el uso exitoso de un tamiz con micro y/o nanoorificios como unidad de adelgazamiento por cizallamiento. Las soluciones viscosas de KLD12 al 2,5 % o IEIK13 al 1,5 % pueden transferirse a una jeringa (o cámara) dispensadora, inyectarse en una primera cámara que incluye una unidad de adelgazamiento por cizallamiento con micro y/o nanoorificios y luego filtrarse a través del filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 pm) en la segunda cámara. En lugar de una jeringa para inyección, puede usarse una cámara de alta presión para suministrar una composición peptídica. El tamaño de la membrana (por ejemplo, el diámetro) y/u otras características (por ejemplo, el tamaño de los poros, etc.) pueden seleccionarse para adaptarse a la cantidad de composición peptídica que se va a pasar a través de ella.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para esterilizar una composición peptídica líquida cuya secuencia comprende una serie de unidades repetitivas, en donde la composición peptídica tiene una secuencia de aminoácidos que comprende repeticiones de Ile-Glu-Ile-Lys (IEIK) caracterizado porque

el método comprende someter la composición peptídica a un tratamiento en autoclave.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método no implica filtración esterilizante.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el tratamiento en autoclave se realiza a 121 °C durante 25 min.