ES3035753T3

ES3035753T3 - New cell preparations for extemporaneous use, useful for healing and rejuvenation in vivo

Info

Publication number: ES3035753T3
Application number: ES22200374T
Authority: ES
Inventors: Antoine Turzi
Original assignee: Regen Lab SA
Current assignee: Regen Lab SA
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2025-09-08
Anticipated expiration: 2027-08-21
Also published as: EP3111974A2; ES2600793T3; US10881691B2; WO2008022651A1; US20200405765A1; US9833478B2; EP3111974A3; US20210330709A1; EP2073862B1; EP3395383B1; EP3111974B1; PL3111974T3; WO2008023026A2; US10092598B2; US20180036346A1; US10064894B2; US11110128B2; US20160158286A1; US20170258839A1; US20210030805A1

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas preparaciones de plasma o plasma rico en plaquetas, nuevos métodos de disociación celular, nuevas asociaciones o composiciones celulares, un método de preparación, un uso de los mismos, dispositivos para su preparación y preparaciones que contienen dichas preparaciones de plasma rico en plaquetas y asociaciones o composiciones celulares. Específicamente, la invención proporciona plasma o plasma rico en plaquetas, solo o en combinación con preparaciones celulares, para su uso en la regeneración tisular y ósea, y en la reducción del dolor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas preparaciones celulares para uso extemporáneo, útiles para la cicatrización y el rejuvenecimientoin vivo

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de la regeneración de tejidos, especialmente piel, cartílago, músculo, tendón, tejido adiposo, córnea, nervios periféricos, columna vertebral y regeneración ósea. Se describen nuevas preparaciones celulares como andamio biológico, un método de preparación de los mismos, un uso de los mismos, un dispositivo para la preparación de los mismos y preparaciones que contienen dicha preparación celular para uso extemporáneo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La importancia de los materiales biológicos autólogos en el proceso de cicatrización ha sido bien documentada. Lo más importante, se ha demostrado que dos materiales biológicos autólogos están directamente implicados en la formación de la estructura de los coágulos sanguíneos, los cuales proporcionan una barrera hemostática cuya función es garantizar la hemostasia y sellar la herida: (1) fibrina, la cual procede de la separación del fibrinógeno plasmático en dos hebras por acción de la trombina, y (2) membranas activadas de las plaquetas.

El proceso de cicatrización de heridas se presenta generalmente como la sucesión de una fase de coagulación, un proceso inflamatorio y un proceso de regeneración.

La fase de coagulación (coagulación de la sangre o formación de coágulos) es un proceso complejo por el que la pared de un vaso sanguíneo dañado se cubre con un coágulo de fibrina para detener la hemorragia y se inicia la reparación del vaso dañado mediante la liberación en grandes cantidades de citocinas y factores de crecimiento procedentes de los gránulos alfa de las plaquetas. La formación de coágulos sanguíneos (formados en condiciones fisiológicas por fibrina, plaquetas y glóbulos rojos, entre otros componentes sanguíneos) es un fenómeno natural que resulta de un traumatismo tisulary es bien conocido su papel en el proceso de cicatrización de heridas, así como en la unión de fracturas óseas.

El proceso de inflamación, el cual sigue a la formación de un coágulo sanguíneo, es estimulado por numerosos mediadores vasoactivos y factores quimiotácticos (señales específicas en forma de proteínas) liberados por los glóbulos blancos y las plaquetas. Estas señales atraen a los macrófagos que "limpian" el sitio de bacterias y partículas extrañas, así como a los glóbulos rojos antes de la migración de nuevas células.

La fase de regeneración tisular implica la quimioatracción y la mitosis de las células indiferenciadas en el andamiaje (o matriz de crecimiento) formado por el coágulo sanguíneo. Las nuevas células que se multiplican bajo la estimulación de los factores de crecimiento de plaquetas sustituirán a las células dañadas o destruidas ingeridas por los macrófagos.

Los factores de crecimiento y numerosas proteínas plasmáticas, también llamadas moléculas señalizadoras, las cuales promueven la migración y división celular dentro de los coágulos sanguíneos, desempeñan un papel crucial en el proceso de cicatrización de heridas.

Teóricamente, es posible amplificar los efectos de estas primeras fases de la cascada de cicatrización de heridas descartando los glóbulos rojos y aumentando la concentración de factores de crecimiento.

La amplificación de la coagulación sanguínea puede definirse como la formación de un "coágulo enriquecido (EC por sus siglas en inglés)". Los EC se obtienen mediante el uso de concentrados de plaquetas y se han descrito en Platelets and Megacaryocytes 2004, vol 1 & 2, como "Estructura y señales", Ed. Gibbins y Mahaut-Smith, Humana Press, Nueva Jersey.

El plasma rico en plaquetas (PRP) puede definirse como un concentrado autólogo de plaquetas en un pequeño volumen de plasma; se ha desarrollado como un biomaterial autólogo y ha demostrado ser útil en la cicatrización y regeneración de tejidos (Marx et al., 2004, J. Oral Maxillofac. Surg., 62, 489-496). El PRP no sólo consiste en un concentrado de plaquetas, sino que también contiene factores de crecimiento (tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas: PDGF (por sus siglas en inglés), factor de crecimiento endotelial vascular: VEGF (por sus siglas en inglés), factor de crecimiento transformante: TGF (por sus siglas en inglés) y factor de crecimiento epidérmico: EGF (por sus siglas en inglés)) que son secretadas activamente por las plaquetas y se sabe que tienen un papel fundamental en el proceso de iniciación de la cicatrización de heridas.

Por ejemplo, se sabe que el PDGF inicia la cicatrización del tejido conectivo, incluida la regeneración y reparación óseas. PDGF también aumenta la mitogénesis (células cicatrizantes), la angiogénesis (mitosis endotelial en capilares funcionales) y la activación de macrófagos. También se sabe que el VEGF liberado por los leucocitos tiene potentes actividades angiogénicas, mitogénicas y de mejoramiento de la permeabilidad vascular en las células endoteliales. TGF-p promueve la mitosis y la diferenciación celular para el tejido conectivo y óseo, actúa sobre las células madre mesenquimales, los preosteoblastos y los fibroblastos e inhibe la formación de osteoclastos. Se sabe que EGF induce el desarrollo epitelial y favorece la angiogénesis.

Los concentrados de plaquetas se utilizan generalmente en implantología dental y cirugía ósea, sobre todo en Estados Unidos. Se han desarrollado diversas técnicas de preparación de PRP mediante procesos de centrifugación. Sin embargo, debido a la sensibilidad de las células de plaquetas y a la variabilidad de la eficacia de los métodos de separación de las plaquetas de los glóbulos rojos, existe una gran variabilidad entre los métodos utilizados para la preparación de concentrados de plaquetas(Marx et al., 2004, anterior;Roukis et al., Adv. Ther., 2006, 23(2):218-37): por ejemplo, el material de laboratorio para diagnósticoin vitro,el cual se utiliza para la preparación de plaquetas, da lugar a un rendimiento deficiente de plaquetas y otros componentes del plasma(Marx et al., 2004, anterior:Anitua 35 %, Landsberg 30 %, Clinaseal 39 %, ACE surgical 33 %, Curasan 29 %). Los ajustes automatizados de Biomet PCCS & GPS(Marx et al., 2004, anterior),los cuales no sólo presentan el inconveniente de ser un proceso complejo con costos prohibitivos para el proceso de una muestra de sangre, sólo conducen a un rendimiento del<61>% y SmatPreP de Harvest Technology al 62 %. En estos sistemas, existe obviamente una importante pérdida de valioso tejido biológico de los pacientes, por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un proceso fiable de recogida de células plasmáticas con altos rendimientos, fácil de usar y rentable.

Recientemente se ha demostrado que los efectos positivos del plasma rico en plaquetas sobre la regeneración ósea abarcan un intervalo limitado de concentración de plaquetas y se ha revelado que se produce un efecto inhibidor en presencia de más de 106 plaquetas por pL, lo cual es de 3 a 4 veces el recuento basal (Weibrich et al., 2004, Bone, 34(4):665-71).

Además, la obtención de concentrados de plaquetas sigue requiriendo el uso de kits relativamente complejos y costosa maquinaria específica, así como la participación igualmente costosa de técnicos especializados. Este inconveniente hace que los actuales métodos conocidos de preparación de PRP no se adapten a un uso en el punto de atención.

Además, la preparación de células con vistas a la regeneración celular o tisular para su uso en trasplantes, regeneración postoperatoria o con fines estéticos se enfrenta al problema de la conservación a largo plazo de células y tejidos. La crioconservación de tejidos o células se utiliza generalmente para el mantenimiento a largo plazo de tejidos o células, sobre todo plaquetas, pero esta técnica ha mostrado serios inconvenientes y problemas tales como la formación de cristales, problemas osmóticos, agregación, inhibición de la capacidad de síntesis de proteínas, expresión de proteínas de estrés en respuesta al estrés térmico, etc. Por lo tanto, se sabe que la crioconservación de tejidos o células altera la viabilidad y estabilidad celular(Agence franqaise de sécurité sanitaire, 2003;Arnaud et al., 1999, Cryobiology, 38, 192 199; Tablin et al., 2001, Cryobiology, 43(2), 1 l4-23). Algunos de los efectos secundarios de la crioconservación pueden limitarse mediante el uso de agentes anticongelantes tales como DMSO o glicerol u otros crioconservantes (US 5, 5891, 617 , Oh et al., Cornea, 26, 840-846), pero la concentración de estos agentes debe adaptarse para limitar su toxicidad y efectos secundarios.

Por lo tanto, existe la necesidad de métodos nuevos o alternativos de preparación de células y tejidos adecuados para su uso extemporáneo mientras se preserva su integridad, especialmente en términos de capacidad de secreción de factores de crecimiento y viabilidad.

Breve descripción de la invención

La invención está limitada por las reivindicaciones y además se describe una nueva preparación celular, un método de preparación de nuevas preparaciones celulares, un uso de tales preparaciones celulares que contienen tales como preparaciones de células de plaquetas, opcionalmente mezcladas con un extracto celular, tal como un extracto autólogo de queratinocitos, células de médula ósea, fibroblastos, células de periostio o córneas, melanocitos y células de Langheran; células grasas; células musculares tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células de cordón umbilical; Células de Schwann o del tendón de Aquiles.

El proceso para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención constituye un proceso fiable que recoge el 95 % /-5 de las células plasmáticas, fácil de usar y rentable(Borzini P et al., in preparation).

En un primer aspecto, se proporciona un proceso para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas, que comprende las etapas de:

a) Centrifugar la sangre total en un tubo separador seleccionado de:

• un tubo separador de vidrio que contiene un gel tixotrópico a base de poliéster y una solución amortiguadora de citrato de sodio a 0,10 M; y

• un tubo separador de tereftalato de polietileno que contiene un gel altamente tixotrópico formado por una mezcla de polímeros y un citrato de sodio anhidro a 3,5 mg/mL;

b) Separar el plasma rico en plaquetas enriquecido del plasma completo al eliminar la mitad del sobrenadante que contiene el plasma pobre en plaquetas;

c) Re-suspender el plasma enriquecido;

donde la etapa de centrifugación se realiza a una fuerza de o aproximadamente 1500 g hasta aproximadamente 2000 g en un tiempo suficiente para formar una barrera entre el plasma que contiene las plaquetas, los linfocitos y los monocitos y el gránulo que contiene los eritrocitos; la etapa de separación b) se realiza recogiendo el sobrenadante de la parte superior de dicha barrera y donde el plasma enriquecido está enriquecido en leucocitos, trombocitos y proteínas de adhesión (por ejemplo, fibronectina) en comparación con la sangre total nativa.

Además, se describe una composición de concentrado de plaquetas aislado que comprende:

a) plasma;

b) plaquetas en una concentración de al menos 300x109 células/L;

c) glóbulos blancos en una concentración de al menos 7,0x109 células/L;

d) fibrinógeno en una concentración de al menos 3 mg/L;

y donde la concentración de eritrocitos es inferior a 0,6x1012 células/L.

Además, se describe una composición cicatrizante de heridas que comprende:

a) plasma;

b) plaquetas en una concentración de al menos 300x109 células/L;

c) glóbulos blancos en una concentración de al menos 7,0x109 células/L;

d) fibrinógeno en una concentración de al menos 3 mg/L;

e) activador de la coagulación en una proporción en vol. (concentrado de plaquetas: activador de la coagulación) de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 10:3;

f) opcionalmente, un extracto celular autólogo, tal como un extracto de queratinocitos, células de médula ósea, osteoblastos; condrocitos, fibroblastos, células del periostio o de la córnea, melanocitos y células de Langheran; células grasas; células musculares tales como mioblastos y células satélite; células del cordón umbilical; Células de Schwann, células tendinosas o células de islotes pancreáticos; y donde la concentración de eritrocitos es inferior a 0,6x1012 células/L.

Además, se describe un proceso para la preparación de una composición cicatrizante de heridas que comprende:

a) Proporcionar un concentrado de plaquetas de la invención;

b) Mezclar el concentrado de plaquetas con un activador de la coagulación en una proporción en volumen (concentrado de plaquetas: activador de la coagulación) de aproximadamente 10:1 hasta aproximadamente 10:3;

c) Opcionalmente, mezclar extracto de células autólogas, tal como extracto de queratinocitos, médula ósea, fibroblastos, células del periostio o de la córnea, melanocitos y células de Langheran; células adiposas; células musculares, tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células del cordón umbilical; Células de Schwann o células del tendón de Aquiles.

Además, se describe un dispositivo para la preparación de un concentrado de plaquetas a partir de sangre total que comprende un tubo separador donde el tubo separador se selecciona de:

• un tubo separador de tereftalato de polietileno que contiene un gel altamente tixotrópico formado por una mezcla de polímeros y un citrato de sodio anhidro a 3,5 mg/mL; caracterizado porque el dispositivo tiene una entrada para introducir dicha sangre total, se mantiene en un vacío destinado a aspirar la muestra de sangre total, es estéril, tiene un vacío utilizable de o aproximadamente 8 a aproximadamente 10 mL y es adecuado para someterse a centrifugación.

Además, se describe un uso de un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para la curación de heridas o para promover el crecimiento óseo o periodontal y/o la regeneración ósea y/o tisular.

Además, se describe un uso de un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención para la fabricación de una preparación cosmética para usarse como agente antienvejecimiento o agente reparador de la piel, tal como un agente reparador de cicatrices, un agente de rellenado y/o reparador de arrugas.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

Además, se describe una composición cosmética que comprende concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención y un portador cosméticamente aceptable. En un décimo aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo implantable para usarse en terapia de regeneración tisular que comprende:

(a) un núcleo permeable que comprende un concentrado de plaquetas de la invención; y

(b) una cubierta externa que rodea dicho núcleo, comprendiendo dicha cubierta un material biocompatible, preferentemente biorreabsorbible.

Además, se describe un kit adaptado para la regeneración tisular que comprende un tubo separador de acuerdo con la invención, accesorios de flebotomía para la preparación del cicatrizante de acuerdo con la invención y un dispositivo aplicador (por ejemplo, una jeringa doble) para la dispensación simultánea sobre la herida del concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención y un activador de la coagulación.

Además, se describe un método para promover la cicatrización y/o el sellar y/o la regeneración tisular y/u ósea en una herida de un ser humano o un animal inferior que comprende:

a) Proporcionar un cicatrizante de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho cicatrizante a una herida, un tejido dañado o un hueso dañado.

Además, se describe un método para inducir la regeneración periodontal en una herida o un defecto periodontal de un mamífero con enfermedad periodontal u otra afección que requiera regeneración periodontal que comprende:

a) Proporcionar un cicatrizante de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho cicatrizante a dicha herida o a dicho defecto o cavidad periodontal;

c) Opcionalmente, insertar una barrera periodontal, donde la barrera se coloca entre el tejido gingival y la herida tratada de acuerdo con las etapas a) y b) y dicha barrera se selecciona entre una membrana, un polímero biodegradable y/o un material poroso biocompatible;

d) Cerrar la herida.

En un decimocuarto aspecto, la invención proporciona un método para promover la regeneración de la piel en una cicatriz o una arruga de animal humano o inferior que comprende:

a) Proporcionar un cicatrizante de acuerdo con la invención;

b) Rellenar la cicatriz de la piel o la línea de la arruga con dicho cicatrizante.

Además, se describe un procedimiento para la preparación de una composición celular, que comprende las etapas de:

(a) Centrifugar sangre total en un tubo separador seleccionado de:

(b) Opcionalmente, separar el plasma rico en plaquetas enriquecido del plasma completo eliminando la mitad del sobrenadante que contiene el plasma pobre en plaquetas;

(c) Re-suspender el plasma enriquecido;

(d) Proporcionar un extracto celular, tal como un extracto de células dérmicas, tales como queratinocitos, fibroblastos, melanocitos y célula de Langheran; células adiposas; células de la médula ósea; células musculares, tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células de la membrana perióstica; células corneales; células del cordón umbilical; Células de Schwann, células tendinosas o células de los islotes pancreáticos;

(e) Mezclar el concentrado de plaquetas obtenido en la etapa (c) con el extracto celular obtenido en la etapa (d);

donde la etapa de centrifugar a) se realiza a una fuerza de o aproximadamente 1500 g hasta aproximadamente 2000 g en un tiempo suficiente para formar una barrera entre el plasma que contiene las plaquetas, los linfocitos y los monocitos y el gránulo que contiene los eritrocitos; la etapa de separación b) se realiza recogiendo el sobrenadante de la parte superior de dicha barrera y donde el plasma enriquecido está enriquecido en leucocitos, trombocitos y proteínas de adhesión (por ejemplo, fibronectina) en comparación con la sangre total nativa.

Además, se describe un procedimiento para la preparación de una composición cicatrizante de heridas o tejidos, que comprende las etapas de:

a) Centrifugar la sangre total en un tubo separador seleccionado de:

b) Opcionalmente, separar el plasma rico en plaquetas enriquecido del plasma completo eliminando la mitad del sobrenadante que contiene el plasma pobre en plaquetas;

c) Re-suspender el plasma enriquecido;

d) Mezclar el concentrado de plaquetas obtenido en la etapa c) con un activador de la coagulación en una proporción en volumen (concentrado de plaquetas: activador de la coagulación) de aproximadamente 10:1 hasta aproximadamente 10:3; e) Proporcionar un extracto celular tal como un extracto de células dérmicas tales como queratinocitos, fibroblastos, melanocitos y célula de Langheran; células adiposas; células de la médula ósea; células musculares tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células de membrana perióstica; células corneales; células de cordón umbilical; Células de Schwann, células tendinosas o células de los islotes pancreáticos;

f) Mezclar la mezcla de concentrado de plaquetas obtenida en la etapa d) con el extracto celular obtenido en e); donde la etapa de centrifugar se realiza a una fuerza de aproximadamente 1500 g hasta aproximadamente 2000 g durante un tiempo suficiente para formar una barrera entre el plasma que contiene las plaquetas, los linfocitos y los monocitos y el gránulo que contiene los eritrocitos; la etapa de separación b) se realiza recogiendo el sobrenadante de la parte superior de dicha barrera y donde el plasma enriquecido es enriquecido en leucocitos, trombocitos y proteínas de adhesión (por ejemplo, fibronectina) en comparación con la sangre total nativa.

Además, se describe una composición celular aislada, que comprende:

a) plasma;

b) plaquetas en una concentración de al menos 300x109 células/L;

c) glóbulos blancos en una concentración de al menos 7,0x109 células/L;

d) fibrinógeno en una concentración de al menos 3 mg/L;

e) un extracto celular, tal como un extracto de células dérmicas tales como queratinocitos, fibroblastos, melanocitos y célula de Langheran; células adiposas; células de la médula ósea; células musculares tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células de la membrana perióstica; células corneales; células del cordón umbilical; células de Schwann, células tendinosas o células de islotes pancreáticos, donde las células se encuentran en una concentración de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 células/mL de plasma o plasma enriquecido;

y donde la concentración de eritrocitos es inferior a 0,6x1012 células/L.

Además, se describe una composición celular aislada, que comprende:

a) plasma;

b) plaquetas en una concentración de al menos 300x109 células/L;

c) glóbulos blancos en una concentración de al menos 7,0x109 células/L;

d) fibrinógeno en una concentración de al menos 3 mg/L;

f) un extracto celular, tal como un extracto de células dérmicas tales como queratinocitos, fibroblastos, melanocitos y célula de Langheran; células adiposas; células de la médula ósea; células musculares tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células de la membrana perióstica; células corneales; células del cordón umbilical; Células de Schwann, células tendinosas o células de islotes pancreáticos, donde las células se encuentran en una concentración de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 células/mL de plasma o plasma enriquecido;

y donde la concentración de eritrocitos es inferior a 0,6x1012 células/L.

Además, se describe una composición cicatrizante de heridas o tejidos que comprende una composición celular aislada de acuerdo con la invención.

Además, se describe un método para promover la cicatrización de heridas y/o sellar y/o la regeneración de un tejido y/o un cartílago y/o un hueso y/o un nervio en un ser humano o un animal inferior, que comprende:

a) Proporcionar una composición cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular de acuerdo con la invención; b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición cicatrizante de heridas o tejidos o composición celular a una herida, un tejido dañado, o un cartílago dañado o un hueso dañado.

Además, se describe un método para aumentar el volumen de tejido adiposo en un mamífero con un injerto de grasa dérmica u otra afección que requiera regeneración de tejido adiposo, que comprende:

a) Proporcionar una composición de células grasas de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéutica o cosméticamente eficaz de dicha composición de células adiposas al injerto de grasa dérmica o al tejido adiposo que requiera regeneración de tejido adiposo;

c) Opcionalmente, insertar un colgajo quirúrgico o implante, donde el colgajo quirúrgico o implante se coloca en el sitio que requiere regeneración o amplificación volumétrica y el dicho colgajo quirúrgico o implante comprende una combinación de una preparación de células grasas de acuerdo con la invención y plasma o material plasmático enriquecido.

Además, se describe un método para inducir la regeneración miocárdica en un mamífero con deficiencia miocárdica u otra afección que requiera regeneración miocárdica tisular, que comprende:

a) Proporcionar una célula muscular o una composición de células de la médula ósea de acuerdo con la invención; b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición de células musculares al tejido miocárdico que requiere regeneración.

Además, se describe un método para inducir la regeneración corneal en un mamífero con deficiencia corneal u otra condición que requiera regeneración corneal, que comprende:

a) Proporcionar una composición celular corneal de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición celular corneal al tejido corneal que requiere regeneración.

Además, se describe un método para inducir la regeneración articular o cartilaginosa en un mamífero con deficiencia articular o cartilaginosa u otra afección que requiera regeneración de tejido articular o cartilaginoso, que comprende: a) Proporcionar una composición de condrocitos o células de la médula ósea de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de condrocitos al tejido articular o cartilaginoso que requiera regeneración;

c) Opcionalmente insertar un colgajo quirúrgico o implante, donde el colgajo quirúrgico o implante, se coloca en el defecto del cartílago o bajo un parche perióstico, y el dicho colgajo quirúrgico o implante comprende una combinación de una composición de condrocitos o de la médula ósea de acuerdo con la invención y plasma o material plasmático enriquecido. Además, se describe un método para promover la regeneración de la piel en una cicatriz, una arruga o una deficiencia de grasa de humano o de animales inferiores, que comprende:

a) Proporcionar un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular de acuerdo con la invención;

b) Rellenar la cicatriz de la piel, la línea de arruga o la deficiencia de grasa con el dicho cicatrizante de heridas o tejidos o composición celular de acuerdo con la invención.

Además, se describe un método para inducir la regeneración del nervio periférico en un mamífero con daño del nervio periférico, sutura nerviosa o lesión de la médula espinal u otra condición que requiera la regeneración del nervio periférico, que comprende:

a) Proporcionar una composición de células de Schwann de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición celular de Schwann al nervio periférico que requiere regeneración.

Además, se describe un método para inducir la regeneración ósea en un mamífero con daño óseo, deficiencia ósea u otra condición que requiera regeneración ósea, que comprende:

a) Proporcionar una composición celular de la médula ósea o de células osteoblásticas de acuerdo con la invención; b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición celular de la médula ósea o de células osteoblásticas al hueso que requiere regeneración.

Además, se describe un método para el tratamiento de la diabetes de tipo I, la diabetes insulinodependiente o la hiperglucemia en un mamífero, que comprende:

a) Proporcionar una composición de células de islotes pancreáticos de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células de islotes pancreáticos, por ejemplo, mediante inyección.

Además, se describe un método para el tratamiento de la incontinencia urinaria en un mamífero u otra afección que requiera la regeneración de la vejiga, que comprende:

a) Proporcionar una composición de células mioblásticas de acuerdo con la invención;

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células mioblásticas al cuello de la vejiga que requiere regeneración.

En un trigésimo aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de la incontinencia anal en un mamífero u otra afección que requiera la regeneración del músculo anal, que comprende:

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células mioblásticas en el área para-anal que requiere regeneración.

Además, se describe un método para el tratamiento de la esofagitis por reflujo o trastornos por reflujo gastroesofágico en un mamífero u otra afección que requiera la regeneración del esfínter esofágico, que comprende:

b) Aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células mioblásticas al esfínter esofágico que requiere regeneración.

Además, se describe un uso de una preparación celular de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para la cicatrización de heridas o tejidos o para promover el crecimiento óseo o periodontal y/o la regeneración ósea y/o de tejidos tales como piel, cartílago, músculo, tendón, tejido adiposo, córnea, nervios periféricos, columna vertebral o regeneración ósea.

Además, se describe un uso de una composición celular de acuerdo con la invención para la fabricación de una preparación cosmética para usarse como agente antienvejecimiento o agente reparador de la piel, tal como agente reparador de cicatrices, agente reparador de lipoatrofia o agente de rellenado y/o reparador de arrugas.

Además, se describe una composición farmacéutica que comprende una composición celular de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En un vigésimo quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición cosmética que comprende la composición celular de acuerdo con la invención y un portador cosméticamente aceptable.

Además, se describe un dispositivo implantable para usarse en terapia de regeneración tisular, que comprende:

a) un núcleo permeable, que comprende una composición celular de la invención; y

b) una cubierta externa que rodea dicho núcleo, comprendiendo dicha cubierta un material biocompatible, preferentemente biorreabsorbible.

Los usos, métodos y composiciones son útiles en la regeneración y/o rejuvenecimiento de tejidos, huesos y/o cartílagos. Los usos, métodos y composiciones de acuerdo con la invención son particularmente útiles en el tratamiento de úlceras neuropáticas diabéticas o úlceras por decúbito; daños óseos y cartilaginosos tales como daños profundos del cartílago articular o condrales tales como la reparación quirúrgica de tendones desgarrados; artritis en articulaciones causada por traumatismos o por envejecimiento; trastornos del manguito rotador; heridas que no cicatrizan, tales como heridas inducidas por vasculitis, por ejemplo en miembros inferiores equinos; enfermedades periodontales; cirugía de implantes; daños en el músculo cardíaco, tales como en la insuficiencia cardíaca crónica, la insuficiencia cardíaca, los trastornos isquémicos y no isquémicos, la cardiomiopatía; enfermedad por reflujo gastroesofágico; incontinencia anal o urinaria, cirugía facial tal como la alopecia inducida por cirugía facial (alopecia debida a la pérdida de folículos pilosos en las areas de quemaduras laterales), cirugía de lifting facial (ritidectomía), rinoplastia, injertos de grasa dérmica (en el tratamiento del aumento facial, hemiatrofia congénita de la cara tal como la atrofia congénita cartilaginosa de la nariz y lipoatrofia tal como en pacientes que padecen VIH/SIDA, erosión y artroscopia); complicaciones en la cicatrización de heridas tales como después de una blefaroplastia de párpados; trastornos de la córnea tales como opacidad de la córnea tal como las causadas por quemaduras químicas, afección por el síndrome de Steven Johnson y úlceras corneales; cicatrización de la córnea; síndrome del ojo seco; enfermedades hematológicas tales como latalasemia; lesión de nervios periféricos, sutura de nervios y lesión de la médula espinal; defectos o trastornos óseos tales como injerto óseo o fractura ósea, daños o trastornos cutáneos tales como acné (especialmente después de tratamiento de dermoabrasión), quemaduras, cicatrices de rubéola o viruela, vitíligo, lipoatrofia, sarcoma de Kaposi, esqueleto cutáneo o fibromatosis palmar de Dupuytren.

En otro aspecto, los usos, métodos y composiciones son útiles en la regeneración y/o rejuvenecimiento de los tejidos de la piel, en particular en la promoción y/o iniciación de la regeneración de la piel, tal como la reducción de las arrugas de la piel, el acné (especialmente después de un tratamiento de dermoabrasión), quemaduras, cicatrices por rubéola o viruela, vitíligo y lipoatrofia (p. ej., composiciones antienvejecimiento y composiciones de regeneración de la piel), la mejora de las líneas nasolabiales y el tratamiento de daños o trastornos cutáneos tales como quemaduras cutáneas, sarcoma de Kaposi, dermatofitosis o fibromatosis palmar de Dupuytren y la reducción del dolor asociado a la regeneración de la piel y los tejidos.

Descripción de las Figuras

La Figura 1es una representación esquemática de la variación de la concentración en factores de crecimiento (PDGF-AB, EGF y VEGF) de una composición de concentrado de plaquetas frente al tiempo (T en horas) después de la etapa de centrifugación en el proceso de preparación de la invención.

La Figura 2es una representación esquemática del resultado del tratamiento de un sitio donante de injerto cutáneo con una preparación que contiene una composición de concentrado de plaquetas en comparación con un grupo de control en términos de tiempo de cicatrización (HT por sus siglas en inglés) en días, dolor (P por sus siglas en inglés) en el día 5 en una escala de 0 a 10 y epitalización (E por sus siglas en inglés) en el día 5 en una escala de 0 a 7. Grupo de control: C, preparación rica en plaquetas sola: RegenPRP™, preparación rica en plaquetas y queratinocitos autólogos: RegenExtracell™. La línea de puntos indica cuándo se cambia el primer vendaje al día 5.

La Figura 3representa la morfología de un fibroblasto humano expandido en preparación celular bajo la condición descrita en el Ejemplo 7, mostrando ramificación y filopodios x 5'000 (microscopio invertido Olympus®).

La Figura 4arepresenta un andamio 3D de fibroblastos humanos de una preparación celular en las condiciones descritas en el Ejemplo 7.

La Figura 4brepresenta monocapas de fibroblastos densamente empaquetadas en cultivo 3D a partir de una preparación celular bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 7.

Descripción detallada de la invención

Los siguientes párrafos proporcionan definiciones de los términos de acuerdo con la invención y están destinados a aplicarse de manera uniforme en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que una definición establecida expresamente proporcione una definición más amplia.

Por la expresión "tixotrópico" se entiende un gel que se vuelve más fluido como resultado de la agitación o la presión, es decir, un gel cuya viscosidad disminuye como resultado de la agitación o la presión. El término viscosidad se refiere a aquellas características del material o materiales especificados que determinan el grado de gelificación, tal como, por ejemplo, la firmeza o dureza del material, el grado la cual el material se resiste a fluir como un fluido. Un gel tixotrópico que comprende un gel de poliéster o una mezcla del mismo el cual es insoluble en agua y químicamente inerte a los constituyentes sanguíneos los cuales pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Los geles tixotrópicos típicos se utilizan en la separación de células sanguíneas con fines de diagnóstico y proteómica.

Por la expresión "punto de atención" se entienden todos los servicios prestados a los pacientes a pie de cama.

Por la expresión "accesorios de flebotomía" o "accesorios de venopunción" se entienden los accesorios que permiten la punción de una vena con una aguja con el fin de extraer sangre.

Por la expresión "cicatrizante de heridas" o "sellante de heridas" o "composición cicatrizante de tejidos" se entiende un agente o una composición que es capaz de promover y/o aumentar la velocidad y/o la calidad de la cicatrización de una herida. Los cicatrizantes o selladores de heridas son capaces de promover la regeneración de los tejidos.

Por la expresión "herida" se entiende cualquiertejido dañado, por ejemplo, después de un traumatismo o una intervención quirúrgica. Las heridas en mamíferos incluyen, por ejemplo, escaras, úlceras, laceraciones y quemaduras, sitios de injerto (sitios donantes y receptores de injerto), fístulas, daños en el tejido periodontal, heridas diabéticas que no cicatrizan, consecuencias de traumatismos o cualquier acto quirúrgico. En su sentido general, la expresión pretende abarcar también los daños cutáneos en los que la superficie de la piel presenta alguna depresión sin necesariamente un corte en su superficie, tal como los daños tisulares relacionados con la edad (por ejemplo, las arrugas) y las cicatrices tales como, por ejemplo, el acné (especialmente después de un tratamiento de dermoabrasión) o las cicatrices de la rubéola.

Por la expresión "PRP" se entiende que se refiere a un plasma rico en plaquetas, preferentemente de origen humano, más preferentemente autólogo, preparado por el procedimiento de la invención con el fin de granular y eliminar los eritrocitos y concentrar el plasma en leucocitos, trombocitos y proteínas de adhesión en comparación con la sangre total nativa.

Con la expresión "autóloga" o "autogénica" o "autógena" se pretende utilizar la sangre de un único donante y donde la sangre extraída de este donante se destina a ser utilizada en el mismo donante. Por el contrario, los métodos "alogénicos" utilizan sangre de uno o varios terceros para su uso en un donante ("homóloga" o "heteróloga"). Un producto autólogo evita algunos de los problemas comunes asociados con el uso de materiales biológicos de terceros, tales como, por ejemplo, el cribado para asegurar que el donante era biológica o inmunológicamente compatible con el paciente y la posible contaminación con hepatitis, VIH, priones, enfermedad de Creutzfeld-Jacob y similares.

Por la expresión "activador de la coagulación" se entiende un agente que es capaz de desencadenar o activar la coagulación. Un activador de la coagulación comprende un activador de la trombina y/o un activador del fibrinógeno.

Por la expresión "activador de la trombina" se entiende un agente que es capaz de activar la trombina y desencadenar la coagulación. Los activadores típicos de la trombina son ciertos cofactores tales como el sodio o el calcio. La activación de la trombina se produce preferentemente en presencia de iones de calcio. Los iones de calcio se añaden generalmente al concentrado de plaquetas como una solución salina para proporcionar una concentración final generalmente de o aproximadamente 0,1 mg/mLde concentrado de plaquetas. Las sales de calcio adecuadas incluyen, sin limitación, CaCO<3>y CaSO<4>. Una sal de calcio preferida para usarse es cloruro de calcio (CaCh). El CaCh está disponible como cloruro cálcico inyectable, USP 10 % (Regen Lab, Suiza).

Por la expresión "activador del fibrinógeno" se entiende un agente que es capaz de activar la conversión del fibrinógeno en fibrina y desencadenar la formación del coágulo. Los activadores típicos del fibrinógeno son la trombina o la batroxobina. El término trombina puede incluir trombina calcificada, en particular, de o aproximadamente 100 a aproximadamente 10 unidades de trombina por 1 mL de solución acuosa de cloruro de calcio al 10 %; puede incluir trombina bovina calcificada, trombina alogénica otrombina humana recombinante, preferiblemente trombina autóloga. Un activador de fibrinógeno puede ser una composición de trombina enriquecida tal como las composiciones de trombina descritas en US 6,472,162 o un suero de trombina autólogo de acuerdo con la invención.

Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende la cantidad o cantidades de los elementos constituyentes o la combinación de los mismos necesarias para mejorar la cicatrización de heridas tal como, por ejemplo, la reducción del volumen o del área de superficie de una herida, el aumento de la cantidad de tejido de granulación u otro material biológico que facilite el depósito de colágeno, el crecimiento vascular, la proliferación de fibroblastos o la cicatrización general; Se supone que todas las versiones de la invención descritas en el presente documento tienen la(s) cantidad(es) de sustancias constituyentes, o combinaciones de las mismas, terapéuticamente efectiva(s). Por la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende un ingrediente adicional farmacéuticamente aceptable, tal como estabilizadores, agentes antimicrobianos, amortiguadores, adyuvantes, anestésicos, corticosteroides y similares.

Por la expresión "portador cosméticamente aceptable" se refiere a ingredientes adicionales cosméticamente aceptables, tales como, estabilizantes, amortiguadores, agentes colorantes, agentes aromatizantes, adyuvantes y similares.

Las composiciones, usos y métodos de acuerdo con la invención son particularmente útiles en tratamientos de cicatrización o regeneración de heridas o tejidos, especialmente el tratamiento de heridas traumáticas o quirúrgicas tales como en la colocación y/o sujeción y/o sellado de injertos nativos o protésicos (especialmente piel, injertos óseos y/o prótesis o implantes dentales o similares, incluyendo también el sitio donante del injerto); tratamiento de vasculitis; úlceras tales como úlceras neuropáticas diabéticas o úlceras por decúbito; radiodermatitis (p. ej., después de la irradiación en un carcinoma epidermoide de piel) y cierre de fístulas (tal como en ciclistas).

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos cardíacos, regeneración cardíaca tal como en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca isquémica y no isquémica y cardiomiopatía.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de la incontinencia urinaria y/o anal.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de la esofagitis por reflujo y/o el trastorno por reflujo gastroesofágico.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de daños cutáneos tales como en pieles dañadas por radiaciones (radiodermatitis o piel dañada por el sol), pieles envejecidas o pieles quemadas y/o en la mejora de arrugas faciales, ritides, acné (especialmente después de un tratamiento de dermoabrasión), quemaduras, cicatrices de rubéola o viruela, vitíligo, lipoatrofia o lipodistrofia, sarcoma de Kaposi, dermatofitos o fibromatosis palmar de Dupuytren y/o en tratamientos de rejuvenecimiento de la piel.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de la lipoatrofia, tal como en pacientes con VIH/SIDA, y en otras hemiatrofias congénitas de la cara, tales como la atrofia congénita del cartílago de la nariz.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos óseos, cartilaginosos y articulares, tales como daños condrales, artritis, lesiones cartilaginosas y/u óseas, tales como daños y/o erosiones profundas del cartílago y/o artroscopia, desgarros tendinosos y del manguito rotador del hombro.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades hematológicas tales como la Talasemia.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos corneales tales como el síndrome del ojo seco; opacidad corneal tal como la causada por quemaduras químicas, afección por el síndrome de Steven Johnson; cicatrización de la córnea y úlceras corneales.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento del daño del nervio periférico, sutura del nervio y lesión de la médula espinal.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de la diabetes tipo 1, diabetes insulinodependiente y/o la hiperglucemia.

Además, las composiciones, usos y métodos son particularmente útiles en el tratamiento de defectos o trastornos óseos tales como el injerto óseo o la fractura ósea.

El uso de la composición resultante la invención puede modificarse aún más antes de la aplicación y de acuerdo con el objetivo terapéutico.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse junto con materiales de relleno óseo, especialmente materiales de relleno reabsorbibles tales como la hidroxiapatita (cerámica de fosfato de calcio utilizada como biomaterial) o hueso desmineralizado, o utilizarse como mezcla con extractos óseos en un proceso para el recrecimiento de hueso, por ejemplo, en procedimientos craneofaciales y ortopédicos.

Las composiciones de las invenciones pueden utilizarse como sellador de heridas en cirugía plástica, incluidos los injertos para quemaduras y otras aplicaciones de injertos cutáneos libres, por ejemplo, en oncología para favorecer la regeneración tisular, incluida la aceleración de la (neo)vascularización.

Las composiciones de acuerdo con la invención son particularmente útiles en tratamientos de cicatrización de heridas en el sitio donante del injerto de piel. La extracción de un injerto de piel sobre una piel sana crea una nueva herida en el sitio del donante el cual normalmente cicatriza espontáneamente entre 12 y 14 días. Sin embargo, esta cicatrización es extremadamente exigente para el cuerpo, especialmente si el sitio donante es amplio o la persona es menos resistente (por ejemplo, víctimas de quemaduras, personas que sufren múltiples traumatismos, personas tratadas con corticoides, niños o ancianos) y las pérdidas energéticas se ven incluso incrementadas por la pérdida de minerales, elementos traza y proteínas inducida por las pérdidas de fluido de la nueva herida. Además, en el sitio del donante del injerto suele presentarse un dolor importante durante los primeros 8 días. A menudo se utilizan tratamientos para reducir el dolor, tales como el uso de analgésicos (p. ej. morfina) y/o apósitos hidrocelulares para heridas, sin embargo, el dolor sigue presente, especialmente durante el cambio de apósito que se produce imperativamente dentro de 48 horas hasta 1 semana después de la retirada del injerto. Además, los apósitos hidrocelulares para heridas tienen el inconveniente no sólo de ser bastante caros, sino también de que, al mantener la humedad sobre la herida, impiden que ésta se seque, aumentan la profundidad de la herida, favorecen la aparición de infecciones bacterianas y dan lugar a cicatrices no estéticas. Por lo tanto, es muy deseable la estimulación de la cicatrización del sitio donante del injerto cutáneo.

Las composiciones de la invención están particularmente adaptadas a las heridas crónicas que pueden carecer de suficiente circulación sanguínea para facilitar la cascada de cicatrización de la herida.

Las composiciones y métodos de acuerdo con la invención pueden utilizarse también en el tratamiento de la enfermedad periodontal en la que se observa una pérdida y/o un daño de los tejidos periodontales, comprendiendo dicho tratamiento, por ejemplo, colocar en el sitio o cavidad periodontal en un ser humano o en un animal inferior que necesite regeneración del tejido periodontal, una composición de acuerdo con la invención.

Las composiciones de acuerdo con esta invención son eficaces para eliminar o reducir en gran medida la hemorragia postoperatoria y la extravasación o pérdida de fluido seroso o de otro tipo en estas aplicaciones, para reducir el riesgo de infección causado por la mayoría de las bacterias y/o mejora la formación de tejido conjuntivo en comparación con la curación natural (es decir, sin agentes exógenos añadidos) o con la curación obtenida mediante el uso de otros concentrados de plaquetas preparados con métodos conocidos.

Las composiciones de acuerdo con la invención son particularmente útiles en la preparación de productos farmacéuticos para promover y/o iniciar la cicatrización de heridas y/o la regeneración de tejidos o para la preparación de composiciones cosméticas para la regeneración de la piel, tal como la reducción de las arrugas cutáneas, acné (especialmente después de un tratamiento de dermoabrasión), las cicatrices de rubéola o viruela, vitíligo y lipoatrofia (por ejemplo, composiciones antienvejecimiento y composiciones para la regeneración de la piel).

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse localmente o inyectarse en la herida o en o cerca del órgano injertado o inyectarse subcutáneamente. La administración local puede ser por inyección en el sitio de la lesión o defecto, o por inserción o fijación de un portador sólido en el sitio, o por mezcla con una crema o emulsión, o por inclusión en un portador de tejido o papel o hidrogel, o por aplicación tópica directa de la composición de la invención, tal como en forma de colirio. Preferiblemente, las composiciones son composiciones fácilmente jeringables. El modo de administración, la dosis administrada, como dosis única o múltiple, a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo propiedades farmacocinéticas, condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), extensión de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en combinación con un coagente útil en el tratamiento de la regeneración tisular, tal como un agente cicatrizante, un rellenador de arrugas, un agente antienvejecimiento, tal como un complejo vitamínico antienvejecimiento, un agente antibacteriano, un agente antibiótico, un agente corticosteroide, un agente antálgico y analgésico, o un agente anestésico como la adrenalina, etc. La invención comprende composiciones combinadas con un coagente útil en el tratamiento de la regeneración tisular para su uso simultáneo, separado o secuencial en la terapia de regeneración tisular, tal como la cicatrización de heridas y la reparación del crecimiento óseo y periodontal.

Las composiciones de la invención, el dispositivo y los procedimientos para la preparación de concentrados de plaquetas autólogas o composiciones celulares de la invención son particularmente útiles para uso terapéutico, en particular como pegamento biológico autógeno en un sistema hemostático destinado a acelerar el proceso fisiológico de regeneración de tejidos, por ejemplo, en implantología dental, cirugía cutánea y ósea, cirugía de cartílagos y tendones, regeneración de córneas y nervios periféricos y cirugía cardíaca. Las composiciones de la invención, el dispositivo y los procedimientos para la preparación de concentrados de plaquetas autólogas y la composición celular de la invención son particularmente útiles para uso cosmético, en particular como material de rejuvenecimiento autógeno destinado a ser utilizado, por ejemplo, como relleno de arrugas, cicatrices o deficiencias de grasa, solo o en combinación con al menos un agente antienvejecimiento.

El concentrado de plaquetas de la invención puede combinarse con una preparación de extracto de células autólogas tales como, por ejemplo, queratinocitos, células de médula ósea, osteoblastos, condrocitos, fibroblastos, periostio, melanocitos y células de Langheran; células adiposas; células de médula ósea; células musculares tales como mioblastos y células satélite; células de la membrana perióstica; células corneales; células del cordón umbilical; células tendinosas o células de islotes pancreáticos. Los queratinocitos pueden cosecharse mediante un método descrito por Reinwald y Green, 1975, Cell, 6(3):331-43. Otras células mencionadas pueden cosecharse mediante métodos descritos en "Culture de cellules animales; méthologies-applications", 2003, Ed. Barlovatz-Meimom y Adolphe, ediciones INSERM,París.Alternativamente, los extractos celulares se derivan de un banco de células o de un cultivo celular o se cosechan como se describe en los Ejemplos siguientes.

El concentrado de plaquetas y las composiciones celulares de la invención han demostrado ser realmente beneficiosos en la aceleración y/o promoción del proceso de cicatrización de heridas, incluso de heridas crónicas sin cicatrizar, llevando a cierres exitosos donde semanas de terapias convencionales habían fracasado y consiguiendo una disminución de los riesgos de infección, una mejora en la recuperación y confort del paciente, una reducción de los costes de atención médica y un mejor resultado estético final.

Por supuesto, las composiciones de la invención también pueden prepararse a partir de plasma derivado de varios donantes identificados. La invención no se limita a materiales biológicos autólogos, tales como la recogida de plaquetas concentradas a partir del propio material biológico del herido. La invención abarca el uso de materiales biológicos obtenidos de una o más terceras partes, que no necesitan ser de la misma especie que el paciente cuya herida está siendo tratada con la composición cicatrizante de heridas descrita en el presente documento, a menos que la bioincompatibilidad resultara del uso de dichos materiales biológicos de terceras partes.

Se proporciona un proceso para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas o una composición celular tal como se describe en el presente documento.

En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas a partir de sangre total como se describe en el presente documento.

En una realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas donde la etapa de centrifugación se realiza a una fuerza entre aproximadamente 1.500 g y hasta aproximadamente 1.700 g durante un tiempo seleccionado entre aproximadamente 3 min y aproximadamente 15 min, preferentemente a 1.500 g durante aproximadamente 8 min.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas donde el tubo separador tiene una entrada para introducir dicha sangre total, se mantiene en un vacío destinado a aspirar la muestra de sangre total, es estéril, tiene un vacío utilizable de 8 a 10 mL y es adecuado para someterse a centrifugación.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas donde el tubo separador es un tubo separador de tereftalato de polietileno que contiene un gel altamente tixotrópico formado por una mezcla de polímeros y un citrato de sodio anhidro a 3,5 mg/mL.

En otra realización, se proporciona una composición de concentrado de plaquetas aislado obtenible a partir del proceso de acuerdo con la invención.

En otra realización, se proporciona una composición de concentrado de plaquetas aislado que comprende:

a) plasma;

b) plaquetas en una concentración de al menos 300x109 células/L, preferentemente de al menos 350x109 células/L, más preferentemente de al menos 400x109 células/L;

c) glóbulos blancos en una concentración de al menos 7,0x109 células/L, preferentemente de al menos 8,0x109 células/L; d) fibrinógeno en una concentración de al menos 3 mg/L;

y donde la concentración de eritrocitos es menor que 0,6x1012 células/L, preferentemente menor que 0,5x1012 células/L. En otra realización, una composición cicatrizante de heridas o tejidos que comprende:

a) plasma;

e) un activador de la coagulación en una proporción en vol. (concentrado de plaquetas: activador de la coagulación) de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 10:3;

f) opcionalmente, un extracto celular autólogo, tal como extracto de queratinocitos, células de médula ósea, fibroblastos, periostio, melanocitos y célula de Langheran; células adiposas; células de médula ósea; células musculares tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células de la membrana perióstica; células corneales; células del cordón umbilical; células tendinosas o células de islotes pancreáticos;

y donde la concentración de eritrocitos es menor que 0,6x1012 células/L, preferentemente menor que 0,5x1012 células/L.

En otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de una composición cicatrizante de heridas o tejido como se describe en el presente documento.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de una composición cicatrizante de heridas o tejido donde el activador de coagulación el cual está mezclado es cloruro e calcio al 10 %.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de una composición cicatrizante de heridas o tejido donde el activador de coagulación el cual está mezclado bajo la etapa b) es una preparación de trombina enriquecida. En el documento US 6,472,162 se describe un método para preparar trombina para usarse en un pegamento biológico mediante la adición de 8 a 20 % de ETOH a un volumen de plasma y esta preparación puede utilizarse como una preparación enriquecida de trombina en el contexto de la invención. Alternativamente, se puede utilizar un suero autólogo de trombina (ATS por sus siglas en inglés), una preparación enriquecida de trombina en el contexto de la invención. Un suero autólogo de trombina de acuerdo con la invención se obtiene por un procedimiento que comprende (i) agregar a una muestra de sangre total de un paciente (por ejemplo, 8 mL) recogida en un tubo separador de la invención, un 10 % del volumen final de cloruro de calcio al 10 % (por ejemplo, 1 mL) y un 10 % del volumen final de una preparación de solución de etanol al 95 % v. (por ejemplo, 1 mL) y (ii) precipitar durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, centrifugara 1.500 g durante 8 a 10 minutos. En otra realización preferida, la preparación enriquecida con trombina y preferiblemente el suero autólogo de trombina se mezclan en la etapa b) directamente sobre la herida.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición cicatrizante de heridas o tejidos de acuerdo con la invención, donde una etapa adicional b') donde la composición de preparación rica en plaquetas activadas (obtenida por la mezcla del concentrado de plaquetas con el dicho activador de la coagulación) obtenida en la etapa b) puede deshidratarse parcialmente por el contacto de un apósito para heridas cubierto por una capa hidrófoba blanda para evitar la contaminación con microcadenas procedentes del apósito con el fin de obtener un gel semisólido que pueda manipularse mediante instrumentos adecuados, por ejemplo, para rellenar una cavidad o deficiencia tisular, o como matriz de crecimiento ("andamio") mientras se espera la reconstitución de la matriz extracelular autógena. El cicatrizante de heridas o tejidos obtenido es particularmente útil en un método para inducir la regeneración periodontal en una herida, un tejido o un defecto periodontal o una cavidad.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de queratinocitos.

En aún otra realización, se proporciona por la invención un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto autólogo de queratinocitos.

En aún otra realización, se proporciona por la invención un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células musculares esqueléticas tales como células progenitoras musculares o células madre satélite.

En aún otra realización, se proporciona por la invención un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de fibroblastos.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de adipocitos.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de condrocitos.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células madre, tales como las células madre del cordón umbilical.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células de tendón.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de membrana perióstica o células gingivales.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto células corneales.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células de médula ósea.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células de osteoblastos.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células de Schwann.

En aún otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de un cicatrizante de heridas o tejidos o una composición celular donde el extracto celular es un extracto de células de islotes pancreáticos.

En otra realización, la composición de concentrado de plaquetas aislado, la composición cicatrizante de heridas o tejidos, el suero enriquecido con trombina y/o el extracto celular de la invención son autólogos.

En otro aspecto, se proporciona un kit adaptado para la regeneración tisular de acuerdo con la invención, donde el kit comprende además viales separados que contienen ETOH y CaCh, soportes de jeringa, clumper y un aplicador de punta con doble salida.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit adaptado para la regeneración de tejidos de acuerdo con la invención que comprende dos blísteres estériles:

(1) un blíster que comprende accesorios para la flebotomía, tubos separadores de la invención, viales de ETOH y CaCh para la preparación de un suero autólogo de trombina; y

(2) un segundo blíster que comprende accesorios para dos porta jeringas y clumper, y aplicador de puntas con doble salida.

En otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde el extracto celular proporcionado en la etapa d) o e) se obtiene mediante un proceso que comprende las etapas de:

(A) Proporcionar las dichas células en un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención;

(B) Cultivar opcionalmente las células;

(C) Re-suspender las células cultivadas obtenidas en la etapa (B) en un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención.

En otra realización, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la expansión celular en la etapa (A) se lleva a cabo en un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención de forma que la concentración final en plaquetas esté comprendida entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 40 % del volumen del medio de cultivo.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la etapa de cultivo celular (B) comprende al menos una etapa de enchapado de las células, por ejemplo, en una superficie de cultivo celular tal como una placa de Petri o un matraz de cultivo.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención que comprende al menos una etapa adicional de recolección de las células después de la etapa de cultivo celular (B).

En otra realización adicional, un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la etapa de cultivo celular (B) se realiza a 37 °C.

En otra realización adicional, un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la etapa de cultivo celular (B) se realiza bajo un flujo de gas que comprende oxígeno o aire y dióxido de carbono, típicamente el flujo de gas comprende 95 % de oxígeno o aire y 5 % de dióxido de carbono.

En otra realización adicional, la invención proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la etapa de cultivo celular (B) dura de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 4 semanas.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde durante la etapa de cultivo celular (B), el medio de cultivo celular se cambia regularmente durante la incubación, típicamente cada aproximadamente 3 días.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la etapa de cultivo celular (B), comprende al menos una etapa de exposición de las células a la luz visible, típicamente a aproximadamente 633 nm, durante aproximadamente 10 minutos. En otro aspecto, la etapa de exposición a la luz visible se repite una vez a la semana durante la incubación de las células.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la composición celular es una composición celular de queratinocitos o fibroblastos y la etapa de cultivo celular (B), comprende al menos una etapa de exposición de las células a luz visible, típicamente a aproximadamente 633 nm, durante aproximadamente 10 minutos. En otro aspecto, la etapa de exposición a la luz visible se repite una vez a la semana durante la incubación de las células.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la etapa de cultivo celular (B), comprende al menos una etapa de adición de concentrado de plaquetas diluido de acuerdo con la invención tal que la concentración final en plaquetas comprenda entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 % del volumen del medio de cultivo.

En otra realización adicional, se proporciona un proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención, donde la composición celular es una composición celular de queratinocitos o fibroblastos y la etapa de cultivo celular (B), comprende al menos una etapa de adición de concentrado de plaquetas diluido de acuerdo con la invención tal que la concentración final en plaquetas comprende entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 % del volumen del medio de cultivo.

En otra realización, se proporciona una composición celular aislada obtenible a partir de un proceso.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición de células adiposas, tal como una composición de células adipocitarias.

En otra realización, se proporciona una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición de células musculares, tal como una célula mioblástica o una composición de células madre satélite.

En otra realización, se proporciona una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición celular corneal.

En otra realización, se proporciona una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición celular de cartílago, tal como una composición celular de condrocitos.

En otra realización, se proporciona una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición celular cutánea, tal como una composición celular de fibroblastos o celular de queratinocitos.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una membrana perióstica o una composición celular gengival.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición celular tendinosa, tal como la composición celular tendinosa.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición de células madre, tal como una composición de células madre de cordón umbilical.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición celular de médula ósea.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición de células de Schwann.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición de células de islotes pancreáticos.

Además, se describe una composición celular aislada, donde la composición celular aislada es una composición celular de osteoblastos.

Además, se describe una composición celular aislada, donde las células están en una concentración de aproximadamente 3x105 a aproximadamente 106 células/mL de plasma o plasma enriquecido.

Además, se proporcionan composiciones, métodos y usos para promover el sellado de heridas y/o la regeneración tisular y/u ósea en una herida de un ser humano o un animal inferior, tal como se describe en el presente documento.

Además, se proporcionan composiciones, métodos y usos para promover el sellado de heridas y/o la regeneración tisular y/u ósea en una herida de un mamífero, preferentemente humano.

Además, se proporcionan composiciones, métodos y usos para inducir la regeneración periodontal en una herida o un defecto periodontal de un mamífero con enfermedad periodontal u otra afección como se describe en el presente documento.

Además, se proporciona un método para inducir la regeneración periodontal en una herida o un defecto periodontal o cavidad de un mamífero con enfermedad periodontal u otra afección donde el mamífero es humano.

Además, se proporciona un método para inducir la regeneración periodontal en una herida o un defecto periodontal o cavidad de acuerdo con la invención, donde la dicha cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición cicatrizante de heridas o tejidos se aplica en forma de gel semisólido o una matriz de crecimiento a la dicha herida o dicho defecto periodontal o cavidad tal como se describe, por ejemplo, en Garg et al., 2000, Dental Implantology Update, 11(6), 41-44.

Además, se proporciona un método para promover la regeneración del tejido de la piel en una cicatriz o arruga como se describe en el presente documento.

Además, se proporciona un método para inducir la regeneración miocárdica de acuerdo con la invención, donde la dicha cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células musculares de acuerdo con la invención se inyecta en el miocardio, típicamente en el miocardio del ventrículo izquierdo. La inyección puede realizarse como inyección directa o inyección por catéter múltiple. Los mioblastos o las células satélite pueden injertarseex vivocomo se describe en la presente descripción sobre un amnios biológico humano desepitelizado e irradiado con UV y un constructo de biocompuesto, como una monocapa en la presente descripción. A continuación, se sutura el amnios al epicardio isquémico con el fin de repoblar el tejido subyacente con células madre, con el fin de mejorar la potencia contráctil de la pared ventriculary los miocitos.

Además, se proporciona un método para inducir la regeneración miocárdica de acuerdo con la invención, donde la dicha cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células musculares de acuerdo con la invención se inyecta en el miocardio, junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de células de fibroblastos de acuerdo con la invención, tal que la relación fibroblasto/mioblasto es de aproximadamente 30:70.

Además, se proporciona un método para inducir la regeneración miocárdica de acuerdo con la invención, donde la dicha cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células musculares de acuerdo con la invención se aplica sobre la superficie ventricular en la forma de un parche de amnios pre-incubado en una composición de mioblastos y células madre satélite de acuerdo con la invención.

Además, se proporciona un método para inducir la regeneración de la córnea de acuerdo con la invención, donde la dicha cantidad terapéuticamente eficaz de la dicha composición de células corneales se aplica al tejido corneal en la forma de un parche de amnios previamente extendido sobre una lente de contacto disoluble.

Dicho método de tratamiento de una herida, un tejido o una enfermedad puede incluir el uso de cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento; también puede incluir el uso de cualquier composición elaborada por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

Los métodos, los dispositivos y el kit presentan las ventajas de proporcionar una forma eficaz en el tiempo y relativamente barata de obtener concentrados de plaquetas en una sola operación, fácil de implementar y adaptada a una aplicación en el punto de atención. Los métodos presentan la ventaja no sólo de dar lugar a preparaciones enriquecidas donde las plaquetas se concentran en un alto rendimiento que no se obtiene por métodos conocidos, sino también donde el contenido en eritrocitos es mucho menor que el obtenido por métodos conocidos para la preparación de PRP Las composiciones de la invención presentan la ventaja de tener un mayor contenido en plaquetas, un menor contenido en eritrocitos que el PRP obtenido por métodos conocidos y unas propiedades completamente mantenidas para su posterior uso terapéuticoin vivo.Más concretamente, se mantiene la capacidad de las plaquetas para liberar los principales factores de crecimiento implicados en la regeneración tisular (PDGF, TGF-p, IGF, VEGF y EGF) a niveles de varios días (o los 7 10 días de vida de los trombocitos).

Además, en la medida en que las composiciones de la invención se elaboran a partir de sangre autóloga, la invención descrita en el presente documento reduce los riesgos de transmisión de enfermedades y de inmunorreacción asociados al uso de los materiales de tratamiento elaborados a partir de materiales biológicos obtenidos de uno o más terceros.

Por lo tanto, la invención proporciona un material biológico mejorado para la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos, preferiblemente autólogo, que favorece la regeneración de tejidos tales como la piel, los cartílagos y los huesos, especialmente la cicatrización y/o el rejuvenecimiento. Los beneficios de la invención comprenden un método sencillo y rápido de preparación de materiales mejorados de cicatrización de heridas y regeneración de tejidos adaptado a los servicios de punto de atención y el cual ha demostrado disminuir el tiempo de cicatrización, el dolor asociado y los costos médicos. Además, el material cicatrizante de heridas y regenerador de tejidos disminuye los riesgos de rechazo del injerto y mejora las tasas de éxito del injerto. Además, la mejora de los materiales de cicatrización de heridas y regeneradores de tejidos da lugar a cicatrices que tienen un aspecto final estético mucho mejor y al relleno duradero de cicatrices y arrugas.

Típicamente, los extractos celulares se obtienen de una biopsia de tejido, donde la biopsia se realiza preferentemente el día anterior a la mezcla con el concentrado de plaquetas de la etapa a). El tamaño de las biopsias se adapta a la finalidad terapéutica perseguida y a los tipos de células utilizados en la preparación de la composición celular de acuerdo con la invención. En los Ejemplos siguientes se dan ejemplos de biopsias para distintos tipos de tejidos.

Los ejemplos que ilustran la invención se describirán en lo sucesivo en una forma más detallada y haciendo referencia a las realizaciones representadas en las Figuras.

EJEMPLOS

Las siguientes abreviaturas se refieren respectivamente a las definiciones a continuación:

ATS(suero autólogo de trombina);BU (unidad de Baxotrobina); DMEM(medio esencial mínimo de Dulbecco); DMSO (dimetilsulfóxido);EC(coágulo enriquecido);FCS(suero fetal de ternera);HT(tiempo de curación);UI (Unidad Internacional); PBS(Solución salina amortiguada con fosfato)PET(tereftalato de polietileno);PRP (plasma rico en plaquetas); PPP (plasma pobre en plaquetas); USP(Farmacopea de los Estados Unidos);cm(centímetro);dL(decilitro);g(gramo);Gy(gris);J(Joule);L(litro);min(minuto);mm(milímetro);M(molar);mL(mililitro);nm(nanómetro);rpm(rotación por minuto);Vol.(volumen).

PROCEDIMIENTOS GENERALES & CONDICIONES

Para determinar la eficacia de las composiciones de la invención en la promoción de la cicatrización de heridas y/o la regeneración ósea y/o tisular, se realizaron los siguientes experimentos.

Las muestras de sangre humana completa se recogieron en un tubo separador. Un tubo separador es, por ejemplo, un tubo de vidrio de aproximadamente 15 mL(16 mm de diámetro y 130 mm de longitud) que contiene 3 mLde gel tixotrópico a base de poliéster, así como 1 mL de solución de citrato de sodio al 0,1 M y que contiene un vacío útil de o aproximadamente 8,5 mL. Este tubo separador constituye un dispositivo listo para usar para la preparación de una composición de concentrado de plaquetas de la invención (también llamado RegenTHT™ (Thrombocyte Harvesting Tube) de Regen Lab, Suiza).

Otro ejemplo de tubo separador es un tubo de aproximadamente 10 mL en PET (tereftalato de polietileno) que contiene 1 mL de un gel tixotrópico que comprende una mezcla de polímeros y citrato de sodio anhidro depositado en la superficie interior del tubo por pulverización (aproximadamente 3,5 mg por mL de sangre) y que contiene un vacío utilizable de o aproximadamente 8 mL, constituye un dispositivo listo para usar para la preparación de un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención (también denominado RegenBCT™ (Blood Cell Therapy) de Regen Lab, Suiza).

Estos tubos se esterilizan por irradiación (tal como prescriben las normas ISO 11137, UNI EN ISO 11737-2, UNI EN 552, UNI EN 556) y se sellan herméticamente mediante un tapón tradicional, tal como un tapón de goma convencional de bromobutilo moteado para el tubo de vidrio y un tapón de clorobutilo que tiene una cubierta de polietileno para la seguridad del operador.

A continuación, el tubo separador se centrifuga a o aproximadamente 1.500 g hasta o aproximadamente 2.000 g durante aproximadamente 3 a 10 minutos, es decir, de o aproximadamente 2.500 rpm hasta o aproximadamente 3.800 rpm con una centrifugadora de rotor oscilante de 20 cm de radio. En el caso de una centrifugadora que tenga un rotor con un ángulo fijo de unos 45°, el tiempo de centrifugación debe durar al menos aproximadamente 15 min.

Después de la centrifugación, el concentrado de plaquetas se recoge para usarse en aplicaciones terapéuticas o cosméticas de la invención o para la preparación de otras composiciones que contengan el concentrado de plaquetas obtenido mediante la mezcla con otros agentes tales como extractos celulares, preferentemente autólogos (por ejemplo, queratinocitos, fibroblastos, células de la médula ósea, osteoblastos, condrocitos, mioblastos, células de la córnea, células de Schwann, células grasas, células madre del cordón umbilical, células de los tendones, células de islotes pancreáticos, células de los ligamentos y de las encías, células de la membrana perióstica) y/o sustitutos óseos y/o activadores de la coagulación.

Para las aplicaciones terapéuticas, se utiliza un kit adaptado para la regeneración tisular donde el kit (también denominado RegenKit™) comprende dos blísteres estériles que comprenden:

- un blíster (RegenPRP™) que comprende accesorios para la flebotomía, tubos separadores de la invención (RegenTHT™ o RegenBCT™), opcionalmente viales de ETOH y CaCh para la preparación de un suero autólogo de trombina (RegenATS™).

- un blíster (RegenApplicator™) que comprende dos jeringas (por ejemplo, de 1 m Ly 1 o 3 mL), soportes y clamper y una punta aplicadora con salida doble.

Para la preparación de las composiciones celulares, las células se preparan de acuerdo con el protocolo general que se indica a continuación:

a) Biopsia

Se obtiene una biopsia del tejido correspondiente en condiciones estériles utilizando métodos normalizados adaptados a la célula específica que se va a recolectar. Las células se utilizan extemporánea u opcionalmente después del cultivoex vivoy la proliferación celular, como se indica a continuación.

b) Cultivoex vivoy proliferación celular

Células utilizadas para la preparación de composiciones celulares, tales como queratinocitos, células de médula ósea, fibroblastos; células del periostio o de la córnea, tales como células madre del limbo corneal; melanocitos y célula de Langheran; células adiposas; células musculares, tales como mioblastos y células satélite; osteoblastos; condrocitos; células del cordón umbilical; células de Schwann, células tendinosas o pancreáticas se expanden en un medio portador celular (por ejemplo, DMEM o de Ham) sobre placas (por ejemplo, placas de Petri o frascos de cultivo) recubiertas con un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención, preferentemente autólogo, enriquecido con fibronectina. Los medios de cultivo pueden enriquecerse preferentemente con DMEM, por ejemplo, en el caso de los queratinocitos. Para células tales como osteoblastos óseos, condrocitos y mioblastos, es necesaria la digestión enzimática del tejido correspondiente en presencia de, por ejemplo, colagenasa o tripsina antes de la implantación. La incubación en las placas se realiza a 37 °C bajo un flujo de gas de 95 % de oxígeno o aire y 5 % de dióxido de carbono. Típicamente, el tiempo de incubación varía de 10 a 20 min. La expansión celular puede incrementarse (como, por ejemplo, en el caso de células de mioblastos, fibroblastos y condrocitos) mediante fototerapia (por ejemplo, exposición a la luz a 633 nm de aproximadamente 10 min a 2 J/cm2, una vez a la semana durante la fase de incubación).

Los explantes pueden cultivarse en placas de Petri o en matraces de cultivo utilizando la técnica de elevación por aire(Molnar et al., 1996, Tissue & Cell, 28:547-556) y el método de la interfaz de aire (Meller et al., 2002, Br. J. Opht., 86, 463-471) con la mitad del explante expuesto al aire. El medio de cultivo se cambia regularmente durante la incubación, por ejemplo, cada 3 días. La expansión de las células en modo 2D como monocapas planas, se obtiene, por ejemplo, para células de mioblastos, fibroblastos y condrocitos. Puede obtenerse un patrón de crecimiento celular en 3d , por ejemplo, para células de córnea, mioblastos, fibroblastos, condrocitos, adipocitos y queratinocitos, añadiendo al medio de cultivo la composición de concentrado de plaquetas autólogas diluido de acuerdo con la invención en un volumen de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 % de plasma o plasma enriquecido. Típicamente, la adición de la composición de concentrado de plaquetas autólogas diluido de acuerdo con la invención se realiza 2 o tres veces durante el tiempo de incubación. El andamio biológico 3D así obtenido permite potenciar la matriz extracelular, la cual es útil para la transferencia autóloga de células madre.

Después de la incubación, las células se liberan de las placas con una digestión suave con tripsina que levanta las células y permite su granulación.

c) Control de calidad y seguridad de las células

La viabilidad celular en la preparación celular así obtenida se comprueba mediante recuento celular microscópico, recuento celular con citómetro de flujo junto con inmunoquímica de marcadores tisulares mediante técnicas estándar. La viabilidad celular también se comprueba mediante azul tripán justo después de la liberación de las células por tripsina. La seguridad de la preparación también se comprueba mediante una comprobación de la contaminación a través de un ensayo microbiológico para excluir la contaminación con virus o bacterias y evitar la transferencia de infecciones zoonóticas. Se evita el uso de FCS, previniendo así la transmisión de la enfermedad de las vacas locas.

d) Administración de la preparación celular

La preparación celular obtenida anteriormente se coloca en la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención como vehículo portador de células para su transporte antes de la administración al paciente. A continuación, la preparación celular obtenida anteriormente se inyecta o trasplanta en el paciente. El modo de inyección o trasplante tiene que ser adaptado al tipo de células contenidas en la preparación celular de acuerdo con la invención y al efecto terapéutico o estético pretendido. En los Ejemplos siguientes se dan más detalles sobre el método para la preparación y el uso de las composiciones celulares de acuerdo con la invención, más específicamente, dependiendo del tipo de células y del efecto terapéutico o estético pretendido.

Las preparaciones de células de queratinocitos o de células de fibroblastos de acuerdo con la invención pueden utilizarse inmediatamente después de la recogida o después del cultivo celulartal como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, las preparaciones celulares de acuerdo con la invención se preparan preferentemente después del cultivo celular descrito anteriormente.

Las preparaciones celulares de acuerdo con la invención presentan una mejor viabilidad y estabilidad (incluida la integridad de las propiedades celulares conservadas, tales como la capacidad de sintetizar proteínas y liberar factores de crecimiento) que las células preparadas en un medio sin composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención. Además, la proliferación celular así obtenida es mejorada: las células crecen más rápido (entre 3 y 5 días más rápido) y son más densas en comparación con los medios de control y los medios sin suero. La ventaja del proceso para la preparación de una composición celular de acuerdo con la invención es que el mismo medio autólogo se utiliza como vector para el cultivo celular, la preservación celular, la inyección celular, el vector para la bioestimulación celular y la regeneración tisular.

Ejemplo 1: Preparación de un concentrado de plaquetas autólogas

Los tubos separadores se someten previamente a pruebas para comprobar la buena tolerabilidad, la no toxicidad y la no mutagenicidad del gel tixotrópico de acuerdo con las normas ISO 10993-11, ISO 10993-10, ISO 10993-12 e ISO 10993 3.

Se recogen aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10 mL de muestra de sangre humana en el tubo separador, donde la sangre es aspirada por el vacío. A continuación, la mezcla se centrifuga a aproximadamente 3.800 rpm durante aproximadamente 3,5 min. A continuación, se recoge el plasma rico en plaquetas.

El análisis del concentrado de plaquetas obtenido por el método ha demostrado que contiene de 2 a 4 veces los niveles normales de plaquetas y factores de crecimiento, en comparación con un coágulo de sangre natural, mientras mantiene los niveles normales de fibrina y fibrinógeno y sin contener prácticamente células sanguíneas (< 1 % hematocrito, en comparación con el 35-50 % de un coágulo de sangre normal y el 15-20 % del plasma rico en plaquetas obtenido con métodos de preparación conocidos). El estudio muestra también la presencia de fibronección de glicoproteínas leucocitarias y esto demuestra que las propiedades coagulantes se conservan.

La composición del concentrado de plaquetas (también llamado RegenPRP™ de Regen Lab, Suiza) en comparación con la sangre total, el plasma total y el plasma pobre en plaquetas se presenta en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1

El experimento se repitió en varios pacientes y se observó que los concentrados de plaquetas obtenidos presentan concentraciones reproducibles para las plaquetas (al menos 300x109 células/L), los glóbulos blancos (al menos 7,0x109 células/L), el fibrinógeno (al menos 3 mg/L) y los eritrocitos (menos de 0,6x1012 células/L).

Se ha medido el rendimiento de plaquetas obtenido por dicho método de la invención (90-99 %) y muestra ser drásticamente mayor en comparación con los rendimientos de plaquetas (30-62 %) obtenidos a partir de métodos conocidos de preparación descritos enMarx et al., 2004, anteriormente.

Además, se ha demostrado mediante kits ELISA (R&D Systems, Inc.) y la respuesta a la activación de la coagulación del concentrado de plaquetas de la invención, que la actividad de los factores de coagulación se conserva: la concentración de dímeros D (productos de descomposición de la fibrina), marcadores conocidos de la activación de la coagulación, y el proceso de lisis son estables y, por lo tanto, las propiedades de coagulación del concentrado de plaquetas no se ven debilitadas por el proceso.

Los niveles de factores de crecimiento (PDGF, EGF, TGF-p y VEGF) del concentrado de plaquetas son manifiestamente estables durante un periodo de al menos 72 horas (4 días) cuando se almacenan a temperatura ambiente en el tubo separador estéril de la invención. La evolución de los factores de crecimiento PDGF BB, EGF y VEGF a lo largo de 72 horas se presenta en la Figura 1.

Las propiedades del concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención hacen posible prever la preparación del concentrado de plaquetas obtenido usando el procedimiento, uno a varios días antes de una cirugía reparadora, con el fin de reducir la carga de trabajo en el quirófano y acelerar el procedimiento quirúrgico.

Para su uso terapéutico posterior, el concentrado de plaquetas autólogas se mezcla generalmente con un activador de la coagulación convencional, tal como un activador de la trombina (por ejemplo, cloruro de calcio, por ejemplo, al 10 %), mezclado opcionalmente con un activador del fibrinógeno, tal como la trombina, preferentemente homóloga (por ejemplo, de 10 UT a 100 IU por mL de plasma), batroxobina (por ejemplo, 20 BU por mL de plasma) o una preparación enriquecida con trombina.

Ejemplo 2: Uso terapéutico del concentrado de plaquetas autólogas de la invención

a) Pacientes:

Se seleccionan tres pacientes que presentan heridas crónicas sin cicatrizar:

- Un paciente de 88 años (Paciente 1) que padecía angiosarcoma de Kaposi de múltiples localizaciones en miembros inferiores y de una necrosis radioinducida en la pierna izquierda. La necrosis radioinducida era resultado del tratamiento de radioterapia. Después de 12 meses desde el final del tratamiento con rayos X de bajo voltaje, la necrosis consistía en una úlcera profunda sobreinfectada rodeada de una costra (35 x 25 mm). La herida había sido tratada anteriormente sin éxito con diversos tratamientos, tales como esteroides y cremas cicatrizantes.

- Una paciente de 81 años (Paciente 2) que padecía de un carcinoma espinocelular de vértex presentaba una ulceración cutánea (de unos 10 mm de diámetro) con disqueratosis periférica sin ningún signo de infección, resultado de una biopsiaresección y una radioterapia postquirúrgica (dosis total de 52 Gy).

- Un paciente de 60 años (Paciente 3) que había recibido una irradiación prequirúrgica (7 Gy) para una sinostosis de tibia y peroné en la pierna derecha presentaba una necrosis radioinducida consistente en una úlcera profunda (50 x 30 mm de diámetro) sin inflamación.

b) Tratamiento:

Se tomaron 8,5 mL de muestra de sangre de cada paciente y se centrifugaron en un tubo separador como se describe en el Ejemplo 1, de acuerdo con el protocolo como se describe en el Ejemplo 2. A continuación, los concentrados de plaquetas resultantes se mezclan con cloruro de calcio al 10 % en vol. Cada composición de concentrado de plaquetas autólogas es entonces aplicada en el sitio de la herida de radioepidermitis del paciente correspondiente. A continuación, la herida es cubierta y protegida con compresas húmedas (día 1).

Entre los días 3 y 5, se comprueba el estado de la herida y se cambia el apósito. En el día 7 ±1, se realiza una nueva aplicación de una nueva preparación de concentrado de plaquetas autólogas de la invención. Si es necesario, se sigue la misma secuencia de tratamiento con los mismos intervalos de tiempo hasta la cicatrización completa de la herida.

c) Efectos curativos:

Paciente 1: Cicatrización lenta y regular de la úlcera. Cicatrización completa después de 189 días.

Paciente 2: Curación muy rápida obtenida en 21 días.

Paciente 3: Curación progresiva y regular. Cicatrización completa después de 41 días.

Estos resultados muestran el efecto beneficioso de la composición de concentrado de plaquetas de la invención en la curación de úlceras crónicas radioinducidas, incluso en el caso de aquellas que eran resistentes a tratamientos tópicos anteriores y en ausencia de cualquier reacción alérgica.

Ejemplo 3: Uso terapéutico del concentrado de plaquetas autólogas de la invención en combinación con un suero autólogo enriquecido en trombina

Para activar la coagulación, una alternativa a la mezcla del concentrado de plaquetas de la invención con un activador de trombina antes del uso en un paciente, como se describe en el Ejemplo 1, es la combinación del concentrado de plaquetas de la invención con un activador de fibrinógeno tal como una composición enriquecida en trombina y preferentemente con un suero de trombina (por ejemplo, autólogo) de acuerdo con la invención.

a) Preparación de un suero autólogo de trombina (ATS)

Un suero autólogo de trombina para ser usado como una preparación enriquecida de trombina en el contexto de la invención se prepara mediante un proceso que comprende la adición a una muestra de sangre total de un paciente (por ejemplo, 8 mL) recogida en un tubo separador en cómo se describe en el Ejemplo 1, una solución de etanol al 95 % en vol. (por ejemplo, 1 mL) y cloruro de calcio al 10 % (por ejemplo, 1 mL). A continuación, se deja precipitar la mezcla (también denominada RegenATS™ de Regen Lab, Suiza) durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente.

Después de 30 min, casi el 80 % de la antitrombina (entre otras proteínas como el fibrinógeno) se precipita; a continuación, el tubo se centrifuga a o aproximadamente 1.500 g durante aproximadamente 8 a 10 min y el suero autólogo de trombina está listo para usarse en combinación con el concentrado rico en plaquetas de la invención.

b) Preparaciones combinadas

Una de las originalidades de este proceso es que después de la etapa inicial de incubación del proceso de preparación del suero de trombina autólogo (por ejemplo, al menos aproximadamente 30 min), los tubos separadores que contienen respectivamente la preparación de suero de trombina autólogo y la preparación de concentrado de plaquetas pueden centrifugarse simultáneamente con el fin de obtener las dos preparaciones de extracto de sangre listas para usarse al mismo tiempo.

c) Uso combinado

Para permitir que la polimerización del fibrinógeno en una malla de fibrina (lo cual ocurre durante el proceso de coagulación) ocurra únicamente en el momento de la aplicación de la preparación rica en plaquetas sobre la herida, la composición de concentrado de plaquetas y el suero de trombina autólogo (activador de la coagulación) se aplican simultáneamente en una proporción en vol. de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 10:3 (proporción de concentrado a activador de la coagulación) sobre la herida.

La administración simultánea de ambas preparaciones se consigue, por ejemplo, mediante un dispositivo que comprende dos jeringas (por ejemplo, una jeringa de 10 mL para la composición de concentrado de plaquetas y una jeringa de 1 mL o 3 mL para el suero de trombina), que libera las preparaciones simultáneamente para que se mezclen y polimericen al entrar en contacto con la herida.

Ejemplo 4: Uso terapéutico del concentrado de plaquetas autólogas de la invención en combinación con extracto de células cutáneas

Se han incluido en el estudio un total de 35 pacientes que habían recibido un injerto cutáneo (que representaba menos del 15 % de la superficie cutánea). Se excluyó a los pacientes tratados con inmunosupresores o corticoides o con insuficiencia renal o artropatía periférica grave.

Todas las manipulaciones siguientes se realizan bajo las estrictas normas de asepsia y esterilidad.

Grupo A: 13 pacientes

a) Preparación del concentrado de plaquetas

Se recoge una muestra de 8,5 mL de sangre total de cada paciente (de una extremidad superior en la que no se presente perfusión) en un tubo separador. El tubo separador con la sangre total se centrifuga inmediatamente durante aproximadamente 8 min a 2.800 rpm. Antes de recoger el plasma enriquecido (PRP), el operador desecha la mitad o 2 mL del sobrenadante y luego re-suspende las plaquetas en el plasma restante. A continuación, el concentrado rico en plaquetas se transfiere a un tubo estéril mantenido a una temperatura de 37 °C.

b) Recubrimiento de heridas

El concentrado de plaquetas autólogas de la invención (también denominado RegenPRP™) se mezcla con una solución de cloruro de calcio al 10 % en una proporción 10:1 y el sitio donante del injerto (donde se extirpó la piel) de cada paciente correspondiente se recubre con la mezcla autóloga correspondiente con el fin de obtener la coagulación del concentrado de plaquetas en la herida.

Grupo B: 8 pacientes

a) Muestreo de células de la piel del paciente

Se extraen queratinocitos de cada uno de los pacientes de este grupo. Se extrae una fina muestra de piel sana (aproximadamente 2 cm2) de cada paciente y se lava tres veces en una solución de PBS. A continuación, la biopsia lavada se deposita en una placa de Petri que contiene tripsina y se corta en fragmentos muy pequeños (0,5 cm*0,5 cm) con un bisturí. A continuación, los fragmentos de piel se incuban durante 45 min a 37 °C en un dispositivo de agitación en un volumen del 20 % de composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominado RegenPRP™, obtenido anteriormente. A continuación, se recoge el sobrenadante, se centrifuga y se re suspenden las células en una solución de PBS. El recuento de queratinocitos se determina bajo el microscopio. Finalmente, los queratinocitos obtenidos se re-suspendieron en el concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención (5-40 % en vol.) del paciente correspondiente. ;b) Preparación del concentrado de plaquetas;El procedimiento es el mismo que para el Grupo A. ;c) Recubrimiento de heridas;La suspensión de queratinocitos (también llamada RegenExtracell™) se aplica tan pronto como esté lista (la preparación completa no debe exceder de un día) sobre la herida del mismo modo que se describe en el caso del Grupo AGrupo de control: 14 pacientes;El sitio donante del injerto de cada paciente de este grupo se recubre con una compresa no terapéutica (Jelonet®).Aleatorización y tratamiento;En la cirugía en bloque, después de la extracción del injerto de piel, el sitio donante se recubre con una compresa temporal empapada con una solución de adrenalina (1 ampolla de 1mg/mL de adrenalina diluida en 500 mL de NaCl al 0,9 %) y, en función de la tabla de aleatorización, el sitio donante se trata de acuerdo con los tres métodos siguientes: ;Grupos 1 y 2: Recubrimiento de la herida con la respectiva composición cicatrizante y cobertura de la herida con una compresa no terapéutica (Jelonet®). ;Grupo 3 Cobertura directa de la herida con una compresa no terapéutica (Jelonet®). A continuación, las compresas se cubren con bandas Kerlix® y bandas elásticas tal como "Velpeau". ;Criterios de eficacia del tratamiento;La eficacia del tratamiento se evalúa de acuerdo con 3 criterios: ;- El tiempo necesario para la cicatrización completa del sitio tratado (tiempo de cicatrización o TH en días) ;- La epitelización (evolución del progreso de la cicatrización) medida en el día 5 después del tratamiento de acuerdo con 7 grados: ;0: Ausente ;1: Leve ;2: Moderado ;3: Importante ;4-7: Muy importante, grados crecientes de importancia; ;- El dolor evaluado en el día 5 después del tratamiento por el propio paciente, generalmente en el momento del cambio de compresa en una escala de 0 a 10 (0: sin dolor y 10: dolor extremo). ;La compresa se abre en el día 5 postoperatorio para permitir la evaluación de la calidad del tratamiento y se cubre con nuevas compresas Jelonet® cubiertas con compresas secas. ;La compresa es entonces cambiada cada dos días hasta la cicatrización completa. Cualquier efecto secundario o complicación médica se vigila durante todo el proceso de cicatrización. ;Resultados;Los resultados de los tratamientos para cada grupo de pacientes (Grupo de control: C, Grupo A: RegenPRP™, Grupo B: RegenExtracell™) se presentan en la Figura 2 en términos de tiempo de cicatrización (HT) en días, dolor (P) en el día 5 y epitalización (E) en el día 5. La línea de puntos indica cuándo se cambia el primer vendaje al día 5. ;El proceso de cicatrización se ve claramente estimulado por el uso del concentrado de plaquetas de la invención en comparación con el grupo de control. La calidad de la cicatrización también es mejor en el caso del uso del concentrado de plaquetas de la invención. Además, el dolor en el sitio donante se reduce drásticamente en el caso en que se utilizó el concentrado de plaquetas de la invención en comparación con el grupo de control. ;Todos los efectos beneficiosos del concentrado de plaquetas de la invención se incrementan cuando se utiliza una mezcla de queratinocitos suspendidos en el concentrado de plaquetas de la invención. ;El tiempo medio de curación es de 7 días para el grupo tratado con un concentrado de plaquetas de la invención y de 5 días cuando los queratinocitos se suspenden en el concentrado de plaquetas, en comparación con un promedio de 12 días en el grupo de control. ;La tolerabilidad fue excelente y no se ha detectado ningún efecto secundario ni alergia. ;Esto demuestra que el concentrado de plaquetas de la invención solo o combinado con queratinocitos es muy eficaz para acelerar el proceso de cicatrización de heridas y no solo disminuye el dolor, sino también la reacción inflamatoria y mejora el aspecto final de la cicatriz. ;;Alternativamente, utilizando el mismo proceso de disociación, las células de la piel pueden colocarse en una placa de Petri recubierta con la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™, obtenido anteriormente y cultivarse durante 2 a 5 días. A continuación, antes del injerto, la preparación de células cutáneas obtenida puede pulverizarse sobre la herida, con el fin de preparar el sitio para una mejor biointegración de las células implantadas y una mejor expansiónin vivo.;;Ejemplo 5: Uso cosmético del concentrado de plaquetas autólogas de la invención;;Se prepara una composición de concentrado de plaquetas autólogas como se describe en el Ejemplo, 1,5 mL de esta composición de concentrado de plaquetas (también llamada RegenACR™: (Autologous Cell Rejuvenation) de RegenLab, Suiza) se inyecta por vía subcutánea en un surco de arrugas como material de relleno de arrugas, del mismo modo que se hace comúnmente con otros rellenadores de arrugas tal como el ácido hialurónico. La profundidad de la arruga disminuye progresivamente en las primeras semanas después del tratamiento y en el sitio de la inyección se obtiene una regeneración muy clara del área con un resultado óptimo a los dos o tres meses. A diferencia de lo que se observa con otros materiales de relleno de arrugas, no se observa inflamación ni hinchazón en el sitio de la inyección y el beneficio es duradero, a diferencia del ácido hialurónico, el cual se bioabsorbe después de 4 a 6 meses. ;;Se pueden utilizar métodos conocidos para estudiar el efecto de las composiciones de concentrado de plaquetas autólogas de la invención en la profundidad de las arrugas, tal como una reconstitución tridimensional del relieve de la piel mediante perfilometría óptica (método del estilete) (Grove et al., 1989, J. Am. Acad. Dermatol., 21 : 631-7 ) o mediante microscopía láser en réplicas de piel de silicona. Otro método consiste en la cuantificaciónin vivode la superficie cutánea "Evaluación de la superficie de la piel viva" o "SELS (por sus siglas en inglés)" mediante el análisis de imágenes en luz ultravioleta (Tronnier et al., 1997, Akt. Dermatol., 23 :290-295). Otro método para la evaluación de la superficie de la piel viva se basa en un sistema óptico con una cámara CCD que mide los cuatro parámetros de la piel: rugosidad, descamación, alisamiento y arrugas (Fluhr et al., 1995, Akt. Dermatol., 21:151-156^. El aumento dérmico profundo puede evaluarse mediante ultrasonido (Dermascan®, Dinamarca). ;;Otros ejemplos de uso cosmético del concentrado de plaquetas autólogas de la presente invención incluyen: ;Mezclar el concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención con una crema, preferentemente una emulsión, antes de su aplicación sobre una herida, después de una cirugía o sobre la piel sana. Durante el proceso de absorción, la preparación de plaquetas es transportada a la piel por la crema o emulsión con el fin de amplificar el beneficio hidratante y para bioestimular la regeneración o el rejuvenecimiento de la piel. ;;Utilizando un hidrogel como el Albugel(EP 1543846) preparación de albúmina al 100 % o cualquier otro hidrogel resultante de la reticulación de albúmina y otro compuesto químico como el polietilenglicol o cualquier otro ingrediente, utilizando una base de papel altamente hidrófilo, un portador para dejaren contacto con la piel hasta que el plasma rico en plaquetas se absorba. ;;Ejemplo 6: Preparación de la asociación de células musculares autólogas;;Ejemplo de asociación celular autóloga de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células musculares esqueléticas (células progenitoras musculares o células madre satélite) se proporcionan en la etapa (d) o (e). ;;a) Células madre progenitoras de mioblastos;;La biopsia de músculo esquelético se obtiene delVastus lateralisy mide 7 x 3 cm. El músculo se ceba el día anterior a la biopsia, con una inyección intramuscular en el sitio propuesto para la biopsia (área cutánea de 10 por 15 cm en la cara lateral que recubre el músculo vasto lateral y justo por encima de la articulación de la rodilla, a cualquiera de los lados) con Decadon y Marcaine (lignocaína de acción prolongada). El músculo se corta en dados y se digiere enzimáticamente con una combinación de colagenasa, pronasa y tripsina (Worthington). La acción enzimática se neutraliza utilizando suero de pacientes en medio de cultivo d Me M. Los explantes musculares se colocan en placas de Petri recubiertas con la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™ (preparada como se describe en el Ejemplo 4) y se incuban en 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono a 37 °C durante 3 a 4 semanas. La expresión de desmina o CD-56 se utiliza como marcador de mioblastos para identificar los mioblastos de los fibroblastos. La proliferación de células progenitoras de mioblastos en 3D se muestra en la Figura 3. ;La proliferación celular puede potenciarse mediante la foto exposición a 633 nm de 2 J/centímetro cuadrado durante 10 min durante el cultivo. El día del trasplante (por ejemplo, después de 3 a 4 semanas de incubación), las células del músculo esquelético se liberan mediante trisina y se colocan en la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™ (preparada como se describe en el Ejemplo 4). Las inyecciones en el miocardio pueden realizarse como inyección directa o como inyecciones múltiples con catéter en el miocardio del ventrículo izquierdo. La preparación de células mioblásticas de acuerdo con la invención es útil para trastornos cardíacos tales como la regeneración cardíaca, el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, la insuficiencia cardíaca crónica, la insuficiencia cardíaca isquémica y no isquémica y la miocardiopatía no isquémica. La fracción de eyección puede mejorar en un 9 % para los receptores cardíacos de mioblastos esqueléticos. ;;La preparación celular anterior también puede ser útil para el tratamiento de la incontinencia urinaria (extractos de células mioblásticas preparados como se ha descrito anteriormente e inyectados en el cuello de la vejiga), la esofagitis por reflujo o el trastorno por reflujo gastroesofágico (extractos de células mioblásticas preparados como se ha descrito anteriormente e inyectados en el esfínter esofágico inferior) y la incontinencia anal (extractos de células mioblásticas preparados como se ha descrito anteriormente e inyectados en el área para-anal). ;;Alternativamente, puede realizarse una preparación combinada de fibroblastos y mioblastos (los fibroblastos están presentes en la biopsia muscular y brotan del perimisio junto con los miotubos y las células madre satélite). ;;En el caso del tratamiento de trastornos cardíacos, se introduce en el miocardio una mezcla de preparación celular de fibroblastos y preparación celular de mioblastos (obtenidos como se ha indicado anteriormente) en una proporción fibroblastos/mioblastos de aproximadamente 30:70. ;;Para el tratamiento de la incontinencia del cuello de la vejiga, se realiza un cultivo separado de fibroblastos al mismo tiempo que los mioblastos, tal como se ha descrito anteriormente, y se inyecta la preparación celular de fibroblastos por vía para uretral y la preparación de células de mioblastos se inyecta en el rabdosfínter, bajo control con ultrasonido. ;b) Células madre satélite;;Los mioblastos y las células madre satélite se cultivanex vivoen presencia de la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™. El cebado de la proliferación celular se observa después de 7 días de cultivo primario. ;;A continuación, se cosechan las células después de una incubación de aproximadamente 3-4 semanas y se colocan en medio de cultivo tisular (DMEM más 5-10 % en vol. de composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención) que contiene un parche de amnios humano desepitelizado que mide 4 x 4 cm y la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™ (preparada como se describe en el Ejemplo 4). A continuación, la preparación se somete a irradiación UV durante 10 minutos, durante la incubación (normalmente aproximadamente 2 a 3 semanas), las células se extienden sobre el constructo de amnios y forman una monocapa. La viabilidad y el progreso de la monocapa se evalúan mediante biopsia dos veces por semana del borde del parche y evaluación histológica del grosor de la monocapa. ;;El día del trasplante (por ejemplo, después de aproximadamente 3 a 4 semanas de incubación), la superficie ventricular se unta con la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™ (preparada como se describe en el Ejemplo 4) y, a continuación, el parche obtenido anteriormente se coloca con las células hacia abajo sobre una superficie en bruto del ventrículo isquémico con el fin de permitir que las células madre en el parche pueblen el segmento isquémico después de la inyección ventricular. La retención celular se mantiene gracias al amnios que es inerte y no induce ninguna reacción inmunológica. ;;La preparación de células madre satélite es útil para la regeneración cardiaca y el tratamiento de la insuficiencia cardiaca como preparación diseñada tisular para la cardio mioplastia. ;;Ejemplo 7: Preparación de la asociación de células de fibroblastos autólogos;;Ejemplo de asociación de células de fibroblastos autólogos de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso de acuerdo con la invención, donde las células de fibroblastos dérmicos se proporcionan en la etapa (d) o (e). ;Los fibroblastos dérmicos se aíslan y expanden de acuerdo con el siguiente procedimiento: ;Un mes antes de la biopsia, el área de piel donante principal (detrás de una oreja de pliegue axilar anterior, por ejemplo, área no envejecida por el sol) se trata con crema de vitamina A para activar los fibroblastos dérmicos. Se realiza una biopsia de piel de 10 x 6 mm de espesortotal y se diseca bajo el microscopio para eliminartodo el epitelio. A continuación, la biopsia epitelizada (dermis) se corta en bloques de 3 x 3 mm como explantes. A continuación, la dermis papilar se coloca hacia arriba y se cultiva utilizando la técnica de elevación poraire(Molnar et al., 1996,anterior) y la interfaz de aire(Melleret al., 2002, anterior)con la mitad del explante expuesto al aire. Los explantes se colocan en placas (por ejemplo, 6 explantes por pocillo) en DMEM y se cultivan a 37 °C a 95 % de oxígeno y 5 % de CO<2>durante aproximadamente 3-5 hasta aproximadamente 9 días en placas Petri o matraces de cultivo. El medio se cambia cada 3 días. Los fibroblastos se expanden en modo 2D como monocapas planas, ya que se observa un crecimiento estático durante la incubación. En los días 7 a 9 después del inicio de la incubación, se obtiene un cambio en el patrón de proliferación y fenotipo a 3D añadiendo al medio de cultivo la composición de concentrado de plaquetas autólogas diluido al 5-10 % de acuerdo con la invención, también denominado RegenPRP™ (preparada como se describe en el Ejemplo 4): las células se ceban con RegenPRP™ (0,2 mL por pocillo) justo para cubrir la base. Las células crecen entonces como una matriz de gel de fibrina en 3D (Figura 3). A continuación, las células se diferencian para formar un andamiaje biológico o una red en gel de fibrina, tal como se muestra en las Figuras 4a y 4b. El número de células se mide por recuento diario bajo una rejilla y para evaluar la apoptosis: utilizar microscopio invertido (Olympus®). ;;Después de 3 a 6 semanas de incubación, se recogen las células del gel de fibrina. La viabilidad celular se evalúa con el método clásico del azul tripán y con una evaluación bacteriológica, incluida la contaminación vírica. ;;El extracto celular de fibroblastos expandido obtenido anteriormente se coloca en una jeringa en presencia de la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™ y la preparación se inyecta en las arrugas de la cara, más específicamente debajo de las arrugas. Las inyecciones deben realizarse sobre toda la cara para cubrir frente, papada, región molar, mejillas, barbilla y cuello. ;;La expansión celular puede incrementarse mediante la foto exposición del cultivo celular a 633 nm. La preparación de células de fibroblastos de acuerdo con la invención es útil para el rejuvenecimiento facial, la mejora de las arrugas faciales y las rugosidades, el tratamiento de pieles dañadas por radiaciones (radiodermatitis o piel dañada por el sol), pieles envejecidas o pieles quemadas y/o en la mejora de arrugas faciales, estrías, acné (especialmente después de un tratamiento de dermoabrasión), quemaduras, cicatrices de rubéola o viruela, vitíligo, lipoatrofia o lipodistrofia, tal como la lipodistrofia relacionada con el SIDA; sarcoma de Kaposi, los queloides cutáneos o la fibromatosis palmar de Dupuytren y/o en tratamientos de rejuvenecimiento cutáneo. ;;Ejemplo 8: Preparación de la asociación de células adiposas autólogas;;Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células madre adiposas se proporcionan en la etapa (d) o (e). ;;Las células madre adiposas adultas se aíslan mediante un método de cultivo estándar en un 5-10 % en vol. de una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™. A continuación, la preparación se inyecta con un aplicador en pacientes que sufren deficiencias tisulares, tal como deficiencias postraumáticas o deficiencias relacionadas con la edad para pacientes de aproximadamente 40 años. ;La preparación de células grasas de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento de la lipoatrofia tal como en pacientes con VIH/SIDAy otras hemiatrofias congénitas de la cara. ;;Ejemplo 9: Preparación de la asociación de células de condrocitos autólogos;;Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde los condrocitos se proporcionan en la etapa (d) o (e). ;;Se aísla el cartílago de la rodilla del donante (tamaño de la biopsia 10 x 5 mm) y se corta en dados. Las células de condrocitos de cartílago se cultivan durante 4-6 semanas en medio enriquecido con una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™. A continuación, las células cartilaginosas se liberan mediante digestión enzimática (colagenasa y pronasa). A continuación, la preparación celular se incorpora quirúrgicamente al paciente con defectos y daños condrales profundos. ;;La preparación de células de condrocitos es útil para el tratamiento de daño y erosiones profundos del cartílago o la artroscopia. ;;Otro ejemplo del uso de una preparación de células de condrocitos es el uso en la rinoplastia sin cirugía mediante un procedimiento de inyección única: Paciente que sufre de atrofia congénita del cartílago nasal. ;;El día anterior a la inyección, se realiza una biopsia del cartílago de la oreja de 0,4*0,4 cm y se coloca en un recipiente estéril lleno de DMEM y antibiótico. La biopsia se trata con digestión enzimática que incluye tripsina y colagenasa. A continuación, los condrocitos liberados se re-suspenden en la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención donde se ha añadido CaCh al 10%.

El paciente recibe primero anestesia local y desinfección de la nariz. A continuación, la preparación de condrocitos anterior se inyecta en la superficie del cartílago y/o en la membrana del periostio del sitio que requiere aumento de volumen o elevación. En una segunda fase, se inyecta en la parte superficial de la piel de la nariz la composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención donde se ha añadido CaCh al 10 %, con el fin de bioestimular la regeneración y el rejuvenecimiento de la piel. Después de una hora, se consigue la inyección y el paciente puede volver a casa. Se observa una recuperación excepcional de células viables: la cantidad de condrocitos y células plasmáticas recuperadas e inyectadas fue de aproximadamente 109 células.

Por lo tanto, la preparación de condrocitos es útil para el tratamiento de los defectos del cartílago nasal, sin intervención quirúrgica, pero sólo mediante inyección.

Ejemplo 10: Preparación de la asociación de células madre autólogas del cordón umbilical

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso de acuerdo con la invención, donde las células madre del cordón umbilical se proporcionan en la etapa (d) o (e). Las células madre del cordón umbilical se aíslan y luego se crio conservan y se utilizan para tratar trastornos sanguíneos.

La preparación de células madre de cordón umbilical de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento de enfermedades hematológicas (como la Talasemia).

Ejemplo 11: Preparación de la asociación de células tendinosas autólogas

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células del tendón se proporcionan en la etapa (d) o (e).

Las células de fibroblastos de tendón se aíslan de acuerdo con los procedimientos estándar en 5-10 % en vol. de composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención. Las células de fibroblastos de tendón se cultivan durante aproximadamente 1 a aproximadamente 3 semanas en medio de cultivo enriquecido con una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™. A continuación, la preparación celular se inyecta al paciente en el sitio de la lesión (por ejemplo, tendón desgarrado, área artrósica). La inyección puede guiarse mediante ecografía, para localizar el sitio dañado e injertar mejor la solución implantada.

La inyección de la preparación de células de fibroblastos de tendón también puede realizarse junto al manguito rotador en caso necesario: primero se repara artrosópicamente el desgarro del manguito rotador, a continuación, se inyecta la preparación de células de fibroblastos de tendón a través de un catéter largo en el área suturada. Esto mejora la cicatrización del fibroblasto del tendón en el borde del manguito rotador, previene el hematoma en el espacio confinado bajo el acromion, previene el hombro congelado acelerando la cicatrización y mejorando la rehabilitación y el movimiento de la articulación.

La preparación de células tendinosas de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento de tendones desgarrados, artritis en articulación causada por traumas o por envejecimiento, manguito rotador en hombro.

Ejemplo 12: Preparación de ligamento autólogo y asociación de células gingivales

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde la membrana perióstica y las células gingivales se proporcionan en la etapa (d) o (e).

Bajo anestesia general y local, se recoge asépticamente periostio (aproximadamente 10 x 10 mm) de la cara bucal del cuerpo mandibular en cuatro perras Beagle sanas. El periostio recolectado se corta en trozos de 3 x 3 mm. Los tejidos se colocan directamente en una placa de 6 pocillos y se cultivan (durante aproximadamente 3 a aproximadamente 6 semanas) en una atmósfera humidificada de 5 % de CO<2>y 95 % de aire a 37 °C en un medio de cultivo enriquecido con una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™. La membrana perióstica y las células gingivales se aíslan mediante digestión enzimática y se cultivan mediante técnica estática.

Típicamente, 6 semanas de cultivo eran suficientes para obtener un grosor adecuado de la membrana perióstica para el injerto.

Los pacientes son separados en dos grupos: (1) un grupo de control el cual recibe una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención sin células de membrana de periostio y (2) un grupo de tratamiento el cual recibe la preparación de células de membrana de periostio obtenida anteriormente. La composición de concentrado de plaquetas autólogas (en el grupo de control) y la preparación celular (para el grupo tratado) se inyectan respectivamente al paciente en el sitio de la lesión.

12 semanas después de la operación, la preparación celular de la membrana perióstica había desaparecido por completo tanto en el grupo de control como en el de tratamiento. La regeneración ósea en el grupo de tratamiento con membrana de periostio cultivado fue significativamente mayor que en el grupo de control: la rosca de los implantes dentales estaba casi cubierta por el hueso regenerado, mientras que la mayor parte de la rosca en el grupo de control estaba expuesta. El grupo de tratamiento mostró una formación ósea laminar relativamente gruesa y densa de abajo a arriba del defecto creado. Se adhirieron gruesas capas de hueso tejido a la superficie del implante y se observaron células similares a los osteoblastos alrededor de la superficie. Aunque se observó abundante neovascularización en la matriz ósea, rara vez se observaron células inflamatorias. El borde entre el hueso regenerado y el original no estaba claro. En el grupo de control, el espécimen exhibía una fina formación de hueso cortical en el defecto de dehiscencia. Se observó escaso hueso tejido entre la superficie del implante y el hueso cortical, y pocos osteocitos y osteoclastos dentro de la matriz ósea y en la superficie, respectivamente. La densidad ósea fue significativamente mayor en el grupo de tratamiento que en el grupo de control. Los valores medios de LF fueron 77,58±1,14 % y 37,03±4,63 % en los grupos de tratamiento y control, respectivamente (P<0,05).

La preparación de membrana perióstica y células gingivales es útil para el tratamiento de la enfermedad periodontal y los alveolos secos, especialmente para promover la regeneración ósea en los sitios de dehiscencia de los implantes.

Ejemplo 13: Preparación de la asociación de células corneales autólogas

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células de la córnea se proporcionan en la etapa (d) o (e).

Se toma una biopsia del epicanto en el borde de la córnea y las células madre limbares corneales se expandieron para trasplante autólogo en la misma persona después de 4 semanas de cultivo en placas de Petri o matraces recubiertos con una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también llamada RegenPRP™. Las células madre cultivadas de la córnea (de origen limbal) pueden injertarseex vivosobre la superficie de amnios humanos desepitelizados en una monocapa, después de sembrar el constructo con una suspensión de queratinocitos corneales cultivados y viables.

Se utilizaron aproximadamente 500.000 células para la siembra y se dejó que las células cubrieran la superficie del constructo con células después de incubación adicional de aproximadamente otras 3 semanas. El injerto con células ocurre después de aproximadamente tres semanas de cultivo celular primario, y puede ser necesaria una resiembra. El constructo biológico celular-biocompuesto resultante que consiste en colágeno, fibras de amnios y queratinocitos corneales, consta de membrana y monocapa de células.

La preparación de células corneales puede extenderse sobre una lente de contacto disoluble que se aplica a la córnea dañada. La lente de contacto desaparece y las células cierran el defecto corneal.

La preparación de células corneales de acuerdo con la invención puede administrarse tópicamente en colirios en pacientes que sufren de síntomas de ojo seco. Alternativamente, el amnios anterior puede utilizarse por sí solo en la córnea cicatrizada o el constructo y la preparación celular de acuerdo con la invención puede adherirse a la parte interior de una lente de contacto biológica o artificial y, a continuación, aplicarse a la córnea y cubrirse con una almohadilla ocular. La preparación de células corneales es útil para aliviar el dolor del ojo seco, para el tratamiento del síndrome de Steven-Johnson y la ceguera corneal debida a quemaduras ácidas y alcalinas corrosivas en la industria, úlceras corneales tales como la úlcera corneal recalcitrante neurotrófica, herpética e inmunológicamente inducida.

Ejemplo 14: Preparación de la asociación de células de médula ósea autólogas

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células de médula ósea se proporcionan en la etapa (d) o (e).

La médula ósea de cadera se recolecta y centrifuga en un dispositivo listo para usar para la preparación de un concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención (también llamado RegenBCT™ (Blood Cell Therapy)) con el fin de separar los glóbulos rojos.

A continuación, la preparación de células de médula ósea se mezcla con el concentrado de plaquetas de acuerdo con la invención y se aplica o inyecta con un aplicador con adición de CaCh en el sitio lesionado de los pacientes.

La preparación de células de médula ósea es útil para el tratamiento de cardiopatías isquémicas y no isquémicas, defectos óseos, defectos cartilaginosos.

Ejemplo 15: Preparación de la asociación de células de Schwann autólogas

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células de Schwann se proporcionan en la etapa (d) o (e).

Bajo anestesia local, se realiza una biopsia del N. safeno del N. SURALIS de la extremidad inferior. La biopsia del nervio se corta en pequeños bloques y se inducen cultivos primarios en placas de Petri enriqueciendo una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también llamada RegenPRP™.

Las monocapas se expanden en 3D y, las células eventualmente se recogen mediante digestión con tripsina y se concentran en una jeringa para infiltración local de la médula espinal expuesta y dañada quirúrgicamente. Se ha demostrado que las células cultivadas contienen mielina.

La preparación de células de Schwann es útil para el tratamiento de daño del nervio periférico, suturas nerviosas y lesiones de la médula espinal.

Ejemplo 16: Preparación autóloga de células de islotes humanos

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células de islotes de páncreas se proporcionan en la etapa (d) o (e).

Los islotes pancreáticos se recogen mediante biopsia abierta y se separan mediante digestión enzimática convencional y separación con Ficol o Hypaqe (Page et al., 2007, Diba. Vas. Dis. Res., 7-12) en un medio enriquecido con una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™.

A continuación, la preparación de células de islotes pancreáticos se inyecta como un bolo en el hígado a través de la vena porta.

La preparación de células de islotes pancreáticos de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento de la diabetes de tipo1 o diabetes insulinodependiente y para la reversión de la hiperglucemia de la diabetes mellitus.

Ejemplo 17: Preparación de células osteoblásticas humanas autólogas

Ejemplo de asociación de células autólogas de acuerdo con la invención puede prepararse utilizando el proceso donde las células de osteoblastos se proporcionan en la etapa (d) o (e).

La biopsia ósea cortical en sacabocados se deriva de la cresta ilíaca o de un sitio equivalente (maxilar) bajo anestesia local. La biopsia ósea se coloca asépticamente en medio DMEM a 4 °C, o en un medio de transporte equivalente por aquellos experimentados en el arte del cultivo óseo y de osteoblastosex vivo.A continuación, la biopsia ósea se corta en dados y se digiere diluida en colagenasa de tipo 1 al 10 % (Sigma o Boehringer) a 37 °C durante 15 minutos bajo campana de flujo laminar. Alternativamente, la digestión con tripsina (Worthington) puede usarse como alternativa. La digestión enzimática se termina con tres lavados con una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también llamada RegenPRP™ al 10 % en DMEM a 4 °C. La preparación se centrifuga, se peletiza y se re suspende. Los fragmentos óseos se colocan en placas de Petri o matraces como explantes con tecnología de elevación por aire en una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención, también denominada RegenPRP™. La preparación se cultiva a 37 °C con antibióticos, gentimicina y anfotericina-B bajo un flujo de gas de 95 % de aire y 5 % de CO<2>. El medio de cultivo se cambia tres veces por semana, cada vez añadiendo al medio DMEM un 10 % en vol. de una composición de concentrado de plaquetas autólogas de acuerdo con la invención. La viabilidad celular y la morfología se evalúan tres veces por semana para valorar el reptado celular, la apoptosis y la progresión de la monocapa tridimensional. La formación de microfilamentos y la diferenciación se evalúan mediante microscopía invertida (Olympus®). Se comprueba la ausencia de contaminación bacteriana y vírica. Los osteoblastos pueden injertarse en amnios humanos para crear un andamio biocompuesto celular y un portador/constructo de monocapa celular después de la siembra de la membrana con 100.000 células como se ha obtenido anteriormente y permitiendo la expansión de la membrana de monocapa durante 3-4 semanas permitiendo la construcción única de osteoblastos-amnios-constructo de membrana para su uso y transferencia para cubrir un defecto óseo o área injertada después de la no-unión de fractura en cualquier sitio.

La preparación de células osteoblásticas es útil para el tratamiento de defectos óseos, injertos óseos o trastornos óseos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición celular aislada que comprende:

a) plasma;

b) plaquetas en una concentración de al menos 300x10910*células/L;

c) glóbulos blancos en una concentración de al menos 7,0x109 células/L;

d) fibrinógeno en una concentración de al menos 3 mg/L;

e) un extracto celular en el que las células se seleccionan de fibroblastos y células grasas, donde las células se encuentran en una concentración de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 células/L;

y donde la concentración de eritrocitos es inferior a 0,6x1012 células/L.

2. Una composición celular aislada de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además activador de la coagulación en una relación en vol. (concentrado de plaquetas: activador de la coagulación) de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 10:3.

3. Una composición celular aislada de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde las células del extracto celular son fibroblastos.

4. Una composición celular aislada de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde las células del extracto celular son células grasas.

5. Una composición farmacéutica que comprende una composición celular aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición cosmética que comprende una composición celular aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador cosméticamente aceptable.

7. Uso de una composición celular aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la fabricación de un medicamento para la regeneración de la piel o la regeneración del tejido adiposo.

8. Uso de una composición celular aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la fabricación de un agente reparador de la piel, tal como un agente reparador de cicatrices, o un agente reparador de lipoatrofia.

9. Uso de una composición celular aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la fabricación de un agente antienvejecimiento o un agente de rellenado de arrugas.

10. Un método para promover la regeneración de la piel en una arruga de humano o animal inferior que comprende: a) proporcionar una composición celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;

b) rellenar la línea de arrugas con la dicha composición celular.