ES3035698T3

ES3035698T3 - Nanopore-based analysis of protein characteristics

Info

Publication number: ES3035698T3
Application number: ES14883310T
Authority: ES
Inventors: Jens Gundlach; Ian Michael Derrington; Andrew Laszlo; Jonathan Craig; Henry Brinkerhoff
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2025-09-08
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: US12085533B2; EP3108229A4; EP4603838A2; US20200049656A1; EP3108229A1; EP3108229B1; WO2015126494A1; US10948454B2; SG11201607796TA; US20240377357A1; EP3108229C0; EP4603838A3; US20170199149A1; CN106133513A; US11808734B2; SG10202111841TA; CN106133513B; US20240085372A1; US20210293748A1; US10359395B2

Abstract

Se proporcionan métodos para el análisis de proteínas basado en nanoporos. Estos métodos abordan la caracterización de un analito proteico diana, cuya dimensión es mayor que el diámetro interno del túnel nanoporoso y que también está físicamente asociado con un polímero. Además, comprenden la aplicación de un potencial eléctrico al sistema nanoporoso para provocar la interacción del polímero con el túnel nanoporoso. Se mide la corriente iónica a través del nanoporo para obtener un patrón de corriente que refleja la estructura de la porción del polímero que interactúa con el túnel nanoporoso. Esto se utiliza como métrica para caracterizar la proteína asociada que no atraviesa el nanoporo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Análisis de características de proteínas basado en nanoporos

REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA

[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/941,919, presentada el 19 de febrero de 2014.

DECLARACIÓN DE DERECHOS DE LICENCIA GUBERNAMENTAL

[0002] La presente invención se realizó con el apoyo gubernamental R01HG005115, otorgado por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRi) de los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

ANTECEDENTES

[0003] La capacidad de proporcionar una caracterización a escala fina de la conformación y el movimiento de las proteínas puede proporcionar una gran cantidad de información sobre la función de la proteína. Se han desarrollado diversas técnicas para lograr un gran avance en la resolución de estos estudios funcionales de proteínas. Los ensayos que incorporan la Transferencia de Energía por Resonancia de Forster (FRET,Forster Resonance Energy Transfer)proporcionan señales detectables cuando los restos unidos a dominios proteicos predeterminados interactúan dentro de un intervalo espacial. Sin embargo, las señales de FRET se generan en ensayos masivos que agregan señales de un gran número de interacciones individuales y, por lo tanto, tienen una resolución inherentemente limitada. Otros ensayos evitan la dispersión de datos inherente a los ensayos masivos al abordar las interacciones de moléculas individuales. Por ejemplo, las herramientas comúnmente utilizadas para realizar mediciones en enzimas motoras incluyen pinzas ópticas, pinzas magnéticas y ensayos de partículas ancladas. Por ejemplo, las pinzas ópticas emplean un haz láser altamente enfocado para sujetar (o repeler) un objeto, tal como una microesfera. La microesfera puede estar unida a un polímero que funciona como ancla. El polímero puede entonces ser manipulado por una enzima objetivo que interactúa (es decir, aplica fuerza) con el polímero. Estas manipulaciones se detectan midiendo el desplazamiento de la microesfera (u otro objeto) desde el campo aplicado por el láser. Hasta la fecha, las pinzas ópticas pueden alcanzar una precisión de ~0,3 nm de resolución espacial en escalas de tiempo de ~1 ms sin promediar el conjunto. La limitación de esta resolución se debe, en parte, a la larga longitud del ancla del polímero necesaria para evitar que el láser aplicado dañe la proteína objetivo.

[0004] La capacidad de observar el funcionamiento mecanístico de biomoléculas complejas directamente, y no solo mediante la entrada y salida de ensayos masivos, puede acelerar la atención médica y dirigirse a cómo funcionan realmente los sistemas biológicos. Sin embargo, a pesar de los avances en las técnicas monomoleculares, persiste la necesidad de técnicas económicas y sencillas que permitan abordar los movimientos mecanísticos y los estados de conformación de las proteínas con resoluciones espaciales y temporales mejoradas.

RESUMEN

[0005] Este resumen se presenta para introducir una selección de conceptos de forma simplificada, que se describen con más detalle más adelante en la Descripción Detallada. Este resumen no pretende identificar las características clave de la materia reivindicada ni pretende servir de ayuda para determinar el alcance de la materia reivindicada.

[0006] La presente invención se define de acuerdo con las reivindicaciones.

[0007] En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para caracterizar una proteína en un sistema de nanoporos que comprende un nanoporo dispuesto en una membrana que separa un primer medio líquido conductor de un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende un túnel que proporciona comunicación líquida entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor, y en el que la proteína está físicamente asociada con un polímero en el primer medio líquido conductor, comprendiendo el procedimiento:

(a) aplicar un potencial eléctrico entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor para hacer que el polímero interactúe con el túnel de nanoporo, en el que la proteína no puede pasar a través del nanoporo; (b) medir una corriente iónica a través del nanoporo durante la interacción del polímero con el túnel del nanoporo para proporcionar un patrón de corriente;

(c) determinar una posición y/o movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo a partir del patrón de corriente; y

(d) asociar la posición y/o el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero con una característica de la proteína;

en el que el procedimiento comprende comparar el patrón de corriente con un patrón de corriente de referencia; determinar un cambio en la posición y/o movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo a partir de la posición y/o movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo determinados a partir del patrón de corriente de referencia; y asociar el cambio en la posición y/o movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo con una característica de la proteína.

[0008] En una realización, el polímero es un ácido nucleico, PNA o una combinación de los mismos; opcionalmente en donde:

(a) el ácido nucleico es ADN, ARN o una combinación de los mismos;

(b) el ácido nucleico comprende un residuo abásico; o

(c) el ácido nucleico no es un homopolímero.

[0009] En una realización, la proteína es una enzima, opcionalmente en donde la característica de la enzima es una presencia o grado de modulación de la actividad enzimática conferida por una condición de reacción o un posible agonista, antagonista o cofactor.

[0010] En una realización, la enzima es un motor molecular.

[0011] En una realización, el motor molecular es una translocasa, una polimerasa, una helicasa, una exonucleasa, un motor de empaquetamiento viral o una topoisomerasa.

[0012] En una realización, la enzima es un motor browniano, un ribosoma de trinquete browniano, miosina o kinesina.

[0013] En una realización:

(a) la proteína es una proteína mutante o una proteína de fusión;

(b) la proteína comprende dos o más dominios capaces de interacción mutua;

(c) la proteína está acoplada covalentemente al polímero;

(d) la posición y/o el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero se puede resolver en aproximadamente 35 pm; o

(e) la posición de dicha al menos una subunidad de polímero está asociada con un estado conformacional de la proteína.

[0014] En una realización:

(a) el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero está asociado con una longitud de una etapa de translocación discreta del polímero dentro del túnel de nanoporo que es conferido por el motor molecular;

(b) el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero está asociado con una duración temporal de una etapa de translocación discreta del polímero dentro del túnel de nanoporo que es conferido por el motor molecular; opcionalmente en donde la duración temporal puede resolverse en aproximadamente 800 ns; o

(c) el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero está asociado con una tasa de incidencia de errores de las etapas de translocación de polímero cometidos por el motor molecular.

[0015] En una realización, la proteína es una enzima y en donde:

(a) el procedimiento comprende además generar un patrón de corriente de referencia; y/o

(b) el sistema de nanoporos comprende una diferencia con respecto al sistema de nanoporos utilizado para generar el patrón de corriente de referencia, donde opcionalmente la diferencia es:

(i) la presencia o ausencia de un posible agonista, antagonista o cofactor de la proteína en el primer medio conductor;

(ii) una diferencia en la concentración de un posible agonista, antagonista o cofactor de la proteína en el primer medio conductor; o

(iii) una diferencia de al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la proteína en comparación con la secuencia de aminoácidos en el sistema de nanoporos utilizado para generar el patrón de corriente de referencia.

[0016] En una realización, el nanoporo es un nanoporo de estado sólido, un nanoporo de proteína, un nanoporo híbrido de estado sólido-proteína, un nanoporo de estado sólido biológicamente adaptado o un nanoporo de origami de ADN.

[0017] En una realización, el nanoporo de proteína es alfa-hemolisina, leucocidina, porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipasa A de membrana externa, lipoproteína autotransportadora deNeisseria(NalP), WZA, canal selectivo catiónico NfpA/NfpBde Nocardia farcinica,lisenina o un homólogo o variante de los mismos.

[0018] En una realización, la secuencia de nanoporo de proteína se modifica para contener al menos una sustitución, eliminación o adición de aminoácido.

[0019] En una realización, dicha al menos una sustitución, eliminación o adición de aminoácidos da como resultado un cambio de carga neta en el nanoporo.

[0020] En una realización, el nanoporo de proteína tiene una zona de constricción con una carga no negativa.

[0021] En una realización, el potencial eléctrico aplicado está entre 10 mV y 1 V o entre -10 mV y -1 V.

[0022] Esta divulgación proporciona un procedimiento para caracterizar una proteína en un sistema de nanoporos. El sistema de nanoporos comprende un nanoporo dispuesto en una membrana que separa un primer medio líquido conductor de un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende un túnel que proporciona comunicación líquida entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor, y en el que la proteína está físicamente asociada a un polímero en el primer medio líquido conductor. El procedimiento comprende: (a) aplicar un potencial eléctrico entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor para hacer que el polímero interactúe con el túnel de nanoporo, en el que al menos una dimensión de la proteína supera un diámetro del túnel de nanoporo;

(b) medir una corriente de iones a través del nanoporo durante la interacción del polímero con el túnel del nanoporo para proporcionar un patrón de corriente;

(d) asociar la posición y/o el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero con una característica de la proteína.

[0023] Tal como se describe en este documento, cuando al menos una dimensión de la proteína supera el diámetro del túnel del nanoporo, cualquier movimiento del polímero asociado hacia el espacio interior del nanoporo no da lugar al paso de la propia proteína a través del nanoporo. En una realización, el polímero es un ácido nucleico, PNA o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico es ADN, ARN o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico comprende un residuo abásico. En una realización, el ácido nucleico no es un homopolímero.

[0024] En una realización, la proteína es una enzima. En una realización, la enzima es un motor molecular. En una realización, el motor molecular es una translocasa, una polimerasa, una helicasa, una exonucleasa, un motor de empaquetamiento viral o una topoisomerasa. En una realización, la enzima es un motor browniano, un ribosoma de trinquete browniano, miosina o kinesina. En una realización, la proteína es una proteína mutante o proteína de fusión. En una realización, la proteína comprende dos o más dominios capaces de interactuar entre sí. En una realización, la proteína está acoplada covalentemente al polímero.

[0025] En una realización, la posición y/o el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero se puede resolver en aproximadamente 35 pm. En una realización, la posición de dicha al menos una subunidad de polímero se asocia con un estado conformacional de la proteína. En una realización, el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero se asocia con la longitud de una etapa de translocación discreta del polímero dentro del túnel de nanoporo que es conferida por el motor molecular. En una realización, el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero se asocia con la duración temporal de una etapa de translocación discreta del polímero dentro del túnel de nanoporo que es conferida por el motor molecular. La duración temporal se puede resolver en aproximadamente 800 ns. En una realización, el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero se asocia con la tasa de incidencia de errores de las etapas de translocación del polímero cometidos por el motor molecular. En una realización, la característica de la enzima es una presencia o grado de modulación de la actividad enzimática conferida por una condición de reacción o un posible agonista, antagonista o cofactor.

[0026] En una realización, el nanoporo es un nanoporo de estado sólido, un nanoporo de proteína, un nanoporo híbrido de estado sólido y proteína, un nanoporo de estado sólido biológicamente adaptado o un nanoporo de origami de ADN. En una realización, el nanoporo de proteína es alfa-hemolisina, leucocidina, porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipasa A de membrana externa, lipoproteína autotransportadorade Neisseria(NalP), WZA, canal selectivo catiónico NfpA/NfpB deNocardia farcinica,lisenina o un homólogo o variante de los mismos. En una realización, la secuencia del nanoporo de proteína se modifica para contener al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos. En una realización, dicha al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos produce un cambio de carga neta en el nanoporo. En una realización, el nanoporo de proteína tiene una zona de constricción con una carga no negativa.

[0027] En una realización, el potencial eléctrico aplicado está entre 10 mV y 1 V o entre -10 mV y -1 V.

[0028] La presente divulgación proporciona un procedimiento para caracterizar una proteína en un sistema de nanoporos. El sistema de nanoporos comprende un nanoporo dispuesto en una membrana que separa un primer medio líquido conductor de un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende un túnel que proporciona comunicación líquida entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor, y en el que la proteína está físicamente asociada a un polímero en el primer medio líquido conductor. El procedimiento comprende:

(a) aplicar un potencial eléctrico entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor para hacer que el polímero interactúe con el túnel de nanoporo, en el que al menos una dimensión de la proteína supera un diámetro del túnel de nanoporo;

(b) medir una corriente de iones a través del nanoporo durante la interacción del polímero con el túnel del nanoporo para proporcionar un primer patrón de corriente;

(c) comparar el primer patrón de corriente con un patrón de corriente de referencia;

(d) determinar un cambio en la posición y/o movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo a partir de la posición y/o movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo determinado a partir del patrón de corriente de referencia; y

(e) asociar el cambio de posición y/o movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo con una característica de la enzima.

[0029] En una realización, el sistema de nanoporos comprende una diferencia con respecto al sistema de nanoporos utilizado para generar el patrón de corriente de referencia. En una realización, la diferencia radica en la presencia o ausencia de un posible agonista, antagonista o cofactor de la proteína en el primer medio conductor. En una realización, la diferencia radica en la diferencia en la concentración de un posible agonista, antagonista o cofactor de la proteína en el primer medio conductor. En una realización, la característica es la presencia o el grado de modulación de la actividad o conformación proteica conferida por el posible agonista, antagonista o cofactor. En una realización, la diferencia radica en la diferencia de al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la proteína en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína en el sistema de nanoporos utilizado para generar el patrón de corriente de referencia. En una realización, la característica es la presencia o el grado de modulación de la actividad o conformación proteica conferida por la diferencia de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos. En una realización, el procedimiento comprende además la generación de un patrón de corriente de referencia.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0030] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes de esta invención se apreciarán más fácilmente a medida que se entiendan mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La FIGURA 1A es una ilustración en dibujo de un sistema de nanoporos de ejemplo, útil en la práctica de la presente divulgación. Esquemáticamente, un único nanoporo (por ejemplo, MspA) está incrustado en una bicapa de fosfolípidos que separa dos volúmenes de un medio líquido conductor, tal como una mezcla de electrolitos. Un voltaje a través de la bicapa provoca que una corriente iónica fluya a través del interior del nanoporo. Una proteína, tal como una enzima motora molecular, se asocia físicamente con un polímero (por ejemplo, ADN) que es atraído hacia el interior del nanoporo. El extremo monocatenario pasa dentro y a través del nanoporo hasta que la proteína, que supera el diámetro máximo del túnel interior del nanoporo, se posa sobre el poro. La corriente iónica en el túnel del nanoporo se ve influenciada por las estructuras de los nucleótidos (y, por lo tanto, su identidad) dentro de la parte más estrecha del túnel del nanoporo ("constricción").

La FIGURA 1B es una ilustración gráfica de un patrón de corriente representativo producido por un sistema de nanoporos que utiliza un nanoporo MspA y ADN asociado a una enzima ADN polimerasa phi29. El patrón de corriente indica que el ADN se mueve a través del nanoporo por la enzima ADN polimerasa phi29 (ADNP) en etapas de translocación discretas. Los niveles de corriente observados pueden asociarse con la secuencia de ADN. La actividad ocasional de retroceso de la ADNP phi29 provoca repeticiones de los niveles indicados con *.

La FIGURA 1C es una representación gráfica de los valores de corriente iónica media ordenados en el tiempo derivados de las duraciones de nivel estocástico originales.

Las FIGURAS 2A-2F ilustran el proceso y la sensibilidad del sistema PINT caracterizando a pequeña escala el movimiento del ADN en el nanoporo para el análisis de proteínas. La FIGURA 2A ilustra gráficamente los niveles de corriente (líneas negras continuas) correspondientes a la secuencia de ADN mostrada, que proporcionan una medida de distancia (en nt). Se utiliza un perfil spline (línea curva) para demostrar las distancias entre niveles. La desviación estándar de los niveles de corriente proporciona la precisión con la que se pueden medir las distancias. La X en la secuencia indicada representa un residuo abásico. La FIGURA 2B es una ilustración en dibujo del ADN moviéndose dentro de la constricción de MspA por una distancia 8. La FIGURA 2C ilustra gráficamente los niveles de corriente correspondientes a la secuencia de ADN observada desde el sistema de nanoporos a 180 mV (círculos) y a 140 mV (triángulos). La FIGURA 2D ilustra gráficamente los valores de corriente para 180 mV (círculos) y un ajuste de spline a esos niveles (curva de puntos). Los triángulos representan los niveles tomados a 140 mV, tal como se ilustra en la FIGURA 2C, tras una escala multiplicativa y un desplazamiento aditivo. Para los niveles escalados de 140 mV, la posición horizontal se desplaza 0,3 nt para alinear los niveles con el perfil spline para los niveles de corriente observados a 180 mV. Esto indica que el voltaje aplicado desplaza el ADN dentro de MspA en 0,3 nt. La FIGURA 2E ilustra la media de los niveles observados de corriente iónica, ordenados temporalmente, correspondientes derivados del patrón de corriente original, donde el ADN fue desplazado por la ADNP phi29. Los niveles corresponden a la secuencia de ADN y, por lo tanto, al desplazamiento físico de la secuencia de ADN con respecto a MspA. Una línea discontinua superpone los niveles de corriente para indicar el perfil de corriente correspondiente a la secuencia de ADN específica al moverse continuamente a través del nanoporo. La FIGURA 2F ilustra gráficamente la media de los niveles de corriente iónica observados, ordenados temporalmente, derivados del patrón de corriente original, donde el mismo ADN fue movido por TGA hel308. Cuando el movimiento del ADN es controlado por la actividad de translocasa de TGA hel308, se observa un perfil de niveles directamente comparable al generado por la translocación de ADN controlada por ADNP phi29. Sin embargo, el patrón de corriente de TGA hel308 muestra el doble de niveles para la misma secuencia de ADN. Esto sugiere que TGA hel308 mueve el ADN dos veces por nucleótido, en relación con MspA.

Las FIGURAS 3A-3G ilustran el análisis basado en nanoporos de las etapas de translocación de ADN controladas por hel308.

La FIGURA 3A ilustra gráficamente un patrón de nivel de corriente de consenso generado en un sistema de nanoporos para un polímero de ADN asociado con la ADN polimerasa phi29.

La FIGURA 3B ilustra gráficamente un patrón de nivel de corriente de consenso generado en el mismo sistema de nanoporos para el mismo polímero de ADN que en la FIGURA 3A, pero donde el ADN está asociado con la helicasa hel308 TGA. Cada traducción de un nucleótido a lo largo del ADN se divide en dos etapas distintas, en comparación con la FIGURA 3A. Todos los datos de helicasa se toman en las condiciones experimentales de 22 °C, 300 mM KCl, 5 mM MgCl<2>y 180 mV.

La FIGURA 3<c>ilustra gráficamente la semivida de los niveles de corriente indicados en la FIGURA 3B. La duración del nivel alterna entre duraciones largas y cortas. La duración de cada nivel alterno depende de la concentración de ATP ("[ATP]"), determinada utilizando diferentes concentraciones de ATP: 10 jM de ATP (líneas discontinuas) y 1000 |jM de ATP (líneas continuas).

La FIGURA 3D ilustra gráficamente que la diferencia de las duraciones con [ATP] alto y bajo elimina la dependencia de la secuencia que también influye en las duraciones de las etapas.

La FIGURA 3E ilustra gráficamente la duración promedio de los niveles frente a [ATP]-1 para las etapas independientes del ATP (líneas discontinuas largas) y las etapas dependientes del ATP (líneas discontinuas cortas). Para las etapas independientes del ATP, se midió una velocidad promedio de 4,5 ± 0,4 s-1. Para las etapas dependientes del ATP, se observó una cinética de Michaelis-Menton con una velocidad máxima de 15,2 ± 1,3 s y una constante de Michaelis de 92,5 ± 9,9 jmol.

La FIGURA 3F ilustra gráficamente que la semivida de los niveles depende de la identidad del nucleótido que atravesó la constricción: A = alternancia de trazos largos y cortos, C = trazos continuos, G = trazos claros y cortos, T = trazos gruesos y largos; el conjunto de líneas inferiores representa las etapas dependientes del a Tp y los conjuntos superiores representan los etapas independientes del ATP, con [ATP] a 500 jM . Los picos a 14, 17 y 18 indican las posiciones dentro de la enzima donde G, T o C, respectivamente, causan duraciones de nivel más largas.

La FIGURA 3G ilustra gráficamente la fase de las etapas en relación con la ADNP phi29. Las etapas independientes del ATP se representan con barras sólidas y las dependientes del ATP con barras no rellenas. La longitud promedio de la etapa hel308 entre las etapas independientes de ATP y dependientes del ATP es de 0,53 ± 0,04 nt. Las incertidumbres promedio son desviaciones estándar de la media. Las incertidumbres de la corriente iónica para los niveles promedio que se ilustran en la FIGURA 3A son, en promedio, más pequeñas que el ancho de línea, <0,1 pA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0031] La presente divulgación se refiere a los avances de los inventores en el análisis y caracterización de proteínas objetivo utilizando sistemas basados en nanoporos.

[0032] Los sistemas de nanoporos se han empleado previamente para caracterizar diversos analitos, tales como moléculas pequeñas y polímeros. Estos procedimientos generalmente implican el paso del analito objetivo a través de una abertura nanoscópica mientras se monitoriza una señal detectable, tal como una señal eléctrica. La señal se ve influenciada por las propiedades físicas del analito objetivo a medida que pasa a través del nanoporo y, por lo tanto, puede asociarse con una característica estructural del analito, tal como su identidad. Al abordar analitos poliméricos, por ejemplo, ADN monocatenario ("ADNmc"), las señales detectables discretas pueden verse influenciadas por la estructura de cada subunidad de polímero consecutiva cuando el polímero pasa linealmente a través del nanoporo, lo que proporciona información sobre la secuencia del polímero. El documento US 2013/0146457 A1 y el documento US2012/094278 A1 describen procedimientos y sistemas relacionados con la secuenciación de unidades de analitos utilizando nanoporos.

[0033] Los presentes inventores han adoptado el enfoque del sistema de nanoporos descrito anteriormente para investigar analitos de mayor tamaño que no pueden atravesar la abertura del nanoporo, en lugar de analitos pequeños que sí pueden penetrar en el espacio interior del nanoporo. Tal como se describe con más detalle más adelante, los inventores descubrieron que es posible caracterizar características importantes de analitos proteicos de mayor tamaño mediante sistemas de nanoporos, a pesar del hecho de que no atraviesan el nanoporo. En resumen, en este novedoso enfoque, un polímero se asocia con la proteína objetivo. A medida que el polímero interactúa con el interior del túnel del nanoporo, la proteína asociada es atraída hacia el borde de la abertura del nanoporo, pero no puede atravesarlo debido a su tamaño. Utilizando esta información, el polímero puede utilizarse ahora como herramienta de medición para determinar la distancia entre la zona de constricción del nanoporo y la proteína objetivo con una resolución de hasta 30-40 picómetros. Además, la asociación polímero-proteína no tiene por qué ser estática, sino dinámica. En este caso, los movimientos del polímero a través del nanoporo pueden monitorizarse en tiempo real con una resolución inferior a un milisegundo, tal como, de hasta aproximadamente 700 u 800 microsegundos. Por consiguiente, es posible investigar una amplia variedad de características de proteínas con resoluciones espaciales y temporales nunca antes vistas en las tecnologías existentes, tales como las pinzas moleculares y el análisis FRET. Tal como se explicará, el sistema de nanoporos puede configurarse para abordar una amplia variedad de características de proteínas, tales como la naturaleza del plegamiento y los cambios conformacionales, los efectos estructurales y conformacionales de las mutaciones en la secuencia proteica y la naturaleza de las interacciones entre el motor molecular y el polímero. Además, estas configuraciones experimentales pueden aplicarse a investigaciones más amplias de posibles paneles de fármacos y sus efectos sobre la actividad de enzimas, tales como los motores moleculares, y similares. Estas y otras ventajas y aplicaciones resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción.

[0034] La presente divulgación proporciona un procedimiento para caracterizar una proteína en un sistema de nanoporos. En este procedimiento, la proteína se asocia físicamente con un polímero. El procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) aplicar un potencial eléctrico entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor del sistema de nanoporos para provocar la interacción del polímero con el túnel de nanoporo; (b) medir una corriente iónica a través del nanoporo durante la interacción del polímero con el túnel de nanoporo para proporcionar un patrón de corriente; (c) determinar una posición y/o el movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo a partir del patrón de corriente; y (d) asociar la posición y/o el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero con una característica de la proteína.

[0035] A continuación se describen con más detalle diversos aspectos de los sistemas de nanoporos abarcados por la presente divulgación. En términos generales, el sistema de nanoporos comprende un nanoporo dispuesto en una membrana que separa un primer medio líquido conductor de un segundo medio líquido conductor. El nanoporo forma en general un túnel interior que proporciona comunicación líquida entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor. En el presente aspecto, la proteína se dispone en el primer medio líquido conductor y está físicamente asociada al polímero.

[0036] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "asociado físicamente" puede referirse a un enlace covalente que proporciona una asociación permanente o estática entre la proteína y el polímero. Alternativamente, el término puede referirse a un enlace o asociación no covalente entre la proteína y el polímero. Esto abarca realizaciones en las que la proteína puede tener una asociación física dinámica con el polímero, tal como en el caso de muchas enzimas motoras moleculares que pueden contactar y aplicar fuerza a las moléculas de polímero (por ejemplo, ácidos nucleicos) y pueden moverse a lo largo del polímero en un movimiento dinámico.

[0037] En este procedimiento, al menos una dimensión de la proteína supera el diámetro del túnel del nanoporo. Por consiguiente, cualquier movimiento del polímero asociado hacia el espacio interior del nanoporo no da lugar al paso de la propia proteína a través del nanoporo. En cambio, la proteína simplemente entra en contacto con la entrada del borde exterior del nanoporo y se asienta en el borde exterior del nanoporo sin más progresión hacia el lado opuesto de la membrana. De este modo, la proteína proporciona un anclaje, ya sea dinámico o sustancialmente estático, al polímero, que opone resistencia al movimiento adicional del polímero hacia el nanoporo (y posiblemente a través del mismo). Así, gracias a la posición de la proteína en la entrada del borde exterior del nanoporo, la asociación de la proteína con el polímero da lugar a la velocidad controlada de movimiento del polímero (o evitar sustancialmente un movimiento adicional) hacia el nanoporo o a través del mismo.

[0038] La proteína es el analito objetivo de la presente divulgación. Se entenderá que la presente divulgación puede aplicarse ampliamente a cualquier proteína objetivo de interés para una amplia variedad de ensayos. Por lo tanto, la presente divulgación no se limita a un tipo de proteína objetivo en particular. Las dos limitaciones son que la proteína debe tener al menos una dimensión que supere el diámetro interno del nanoporo para evitar el paso de la proteína a través del nanoporo (descrito anteriormente) y que la proteína debe ser capaz o susceptible de asociación física con el polímero. Se enrenderá que la proteína puede ser cualquier proteína natural, cualquier proteína modificada (por ejemplo, diseñada), incluyendo proteínas mutadas o de fusión. Se describirán varias categorías de proteínas potenciales, aunque cabe destacar que estas descripciones son meramente ilustrativas y no pretenden ser limitativas.

[0039] En algunas realizaciones, la proteína es una enzima. Definido de forma general, una enzima es una macromolécula polipeptídica que, al plegarse correctamente en una estructura terciaria, puede realizar funciones, tales como catalizar una reacción.

[0040] En algunas realizaciones, la enzima es un motor molecular. Un "motor molecular" se define ampliamente como una proteína, tal como una enzima, que interactúa con un polímero particular, tal como un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la interacción implica la aplicación de cierta fuerza al polímero. En una situación natural, la fuerza podría provocar la unión del motor molecular al polímero, el movimiento del motor molecular a lo largo del polímero o un cambio en la conformación o forma del polímero. La fuerza puede dar lugar a la manipulación del polímero, tal como provocando el movimiento del polímero en el sistema de nanoporos. El motor molecular puede ser activo, es decir, utilizar energía, tal como el<a>T<p>, para mover o interactuar con el polímero. Dichos motores moleculares pueden abarcar restos que mueven el polímero en contra de la dirección de la fuerza aplicada por el voltaje a través del nanoporo. Alternativamente, el motor molecular puede ser pasivo, es decir, no utilizar energía para mover o interactuar con el polímero. La presente divulgación es útil para caracterizar la naturaleza de la asociación entre el motor molecular y el polímero particular. Por ejemplo, muchos motores moleculares se mueven a lo largo de una cadena de ácido nucleico en etapas discretas y repetitivas. Dichos motores moleculares, cuando se inmovilizan contra la entrada del borde exterior del nanoporo, facilitan el movimiento del ácido nucleico en etapas discretas a través del nanoporo de forma escalonada, donde el ácido nucleico progresa en movimientos discretos de una longitud relativamente constante, similar a un movimiento de trinquete o de cola. Algunos motores moleculares, tales como la ADN polimerasa (ADNP) phi29, mueven los polímeros de ácido nucleico en etapas de nucleótidos individuales medibles a través del nanoporo. Sin embargo, se entenderá que otros motores moleculares son útiles para mover los polímeros de ácido nucleico en etapas que tienen una longitud menor a un solo nucleótido. Sin embargo, otros motores moleculares son útiles para mover los polímeros de ácido nucleico en etapas que tienen una longitud mayor a un solo nucleótido.

[0041] El presente procedimiento se puede utilizar para medir características, tales como la distancia de cada movimiento con una resolución de subÁngstrom, monitorizando el movimiento resultante del polímero a través del nanoporo. El procedimiento también se puede utilizar para caracterizar los requerimientos energéticos de la acción del motor molecular, ajustando la disponibilidad de energía química (tal como la concentración de ATP). Como otro ejemplo, se pueden analizar los posibles cofactores, agonistas, antagonistas o cualquier otra condición de reacción potencial para determinar los cambios conferidos en el movimiento monitorizado del polímero a través del nanoporo. Como otros ejemplo, el procedimiento se puede aplicar para caracterizar la velocidad del movimiento del polímero a través del poro, facilitado por la proteína, en cualquier condición o entorno de reacción particular. Además, los motores moleculares suelen cometer errores, donde el motor molecular omite una etapa o retrocede y repite una etapa de movimiento. Dichas omisiones o alternancias se pueden detectar en los patrones de corriente. Véase el documento PCT/US2014/059360.

[0042] A continuación se proporcionan ejemplos ilustrativos y no limitativos de dichos motores moleculares.

[0043] El motor molecular puede ser una enzima natural, una enzima diseñada o mutada, o, en cualquier caso, un derivado de una enzima. En algunas realizaciones, el motor molecular se modifica para eliminar una función particular de la enzima, pero conserva la capacidad del motor molecular para asociarse con el analito polimérico (por ejemplo, ácido nucleico) y facilitar su movimiento dentro del nanoporo. En algunas realizaciones, la enzima es o deriva de un miembro de cualquiera de los grupos de la Clasificación de Enzimas (CE) 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 y 3.1.31. La enzima puede ser cualquiera de las descritas en la Publicación Internacional n.° WO 2010/1086603.

[0044] En algunas realizaciones, la enzima es una translocasa, una polimerasa, una helicasa, una exonucleasa o topoisomerasa, y similares.

[0045] Muchas exonucleasas de ejemplo se describen en generalmente en el documento WO 2010/1086603. Otros ejemplos son las exonucleasas, que pueden incluir la exonucleasa I, la exonucleasa III, la exonucleasa lambda o una variante u homóloga de las mismas. Para cualquier aspecto del presente documento, los homólogos, derivados y otras proteínas variantes, tal como se describe en el presente documento, pueden presentar preferiblemente una homología de al menos el 50 % con la proteína de referencia, basándose en la identidad de la secuencia de aminoácidos. Más preferiblemente, el polipéptido variante puede presentar una homología de al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % y, más preferiblemente, al menos el 95 %, 97 % o 99 %, basándose en la identidad de aminoácidos con la proteína de referencia, o cualquier intervalo derivable de la misma. La homología puede determinarse mediante cualquier procedimiento aceptado en la técnica. Por lo tanto, los homólogos o variantes pueden presentar modificaciones de secuencia y estructurales. La presente divulgación puede ser útil para determinar o, en cualquier caso, caracterizar las similitudes y/o diferencias funcionales resultantes de las diferencias indicadas. Si bien las exonucleasas a menudo contienen funciones enzimáticas para la escisión de porciones de los ácidos nucleicos, dichas enzimas pueden modificarse para suprimir dicha función nucleasa, conservando al mismo tiempo su capacidad de unirse y mover el polímero de ácido nucleico.

[0046] Las helicasas de ejemplo que pueden ser proteínas objetivo se describen en generalmente en los documentos WO 2014/013260 y WO 2013/057495, y pueden incluir una helicasa hel308, una helicasa RecD, una helicasa Tral, una helicasa del subgrupo Tral, una helicasa XPD o una variante u homólogo de las mismas.

[0047] Las polimerasas de ejemplo que pueden ser proteínas objetivo incluyen ADN polimerasas, tales como la ADN polimerasa phi29 (a veces denominada ADNP phi29), el fragmento Klenow o una variante u homólogo de los mismos.

[0048] Las topoisomerasas de ejemplo pueden incluir una girasa, o una variante u homóloga de la misma.

[0049] Otras proteínas objetivo incluyen motores de empaquetamiento viral, o cualquier otra enzima viral o patógena que facilite la invasión, replicación u otra función patógena por parte del patógeno.

[0050] Otras proteínas objetivo de ejemplo incluyen motores brownianos, ribosomas de trinquete brownianos, miosina, kinesina y similares, tal como se conoce en la técnica.

[0051] Tal como se indicó anteriormente, el presente procedimiento también puede aplicarse para caracterizar los estados conformacionales de las proteínas. En este sentido, la proteína objetivo de tipo salvaje no necesita tener ninguna afinidad para asociarse con el polímero. En cambio, el polímero puede unirse covalentemente a la proteína según cualquier técnica estándar y comúnmente reconocida en el sector. En este contexto, el estado conformacional puede caracterizarse por la posición de una subunidad de polímero particular dentro del nanoporo. Esto es indicativo de la distancia entre la proteína y la subunidad de polímero particular, o de hecho la zona de constricción del nanoporo. Cualquier cambio en este estado conformacional puede resultar en cambios mínimos en esta distancia, que son detectables en este sistema. Por lo tanto, se pueden comparar múltiples proteínas (utilizando el mismo tipo de polímero unido de la misma manera, es decir, al mismo residuo de aminoácido de la proteína). Esto permite realizar estudios mutacionales para caracterizar los cambios conformacionales resultantes de la introducción de una o más mutaciones en una secuencia proteica. Además, una proteína puede ser natural o de fusión que comprende dos o más dominios que interactúan entre sí, provocando así un cambio conformacional. Los diversos parámetros de esta interacción pueden inferirse midiendo el movimiento del polímero en el nanoporo, tal como la frecuencia, la duración y la calidad (inferida por la distancia del movimiento del polímero).

[0052] En el presente procedimiento, la aplicación de un potencial eléctrico a través de la membrana (es decir, entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor) provoca la interacción del polímero con el túnel de nanoporo. Normalmente, el analito polimérico (por ejemplo, ácido nucleico) interactúa con el túnel de nanoporo de forma lineal, extendiéndose el polímero linealmente a lo largo del eje del túnel de nanoporo. En algunas realizaciones, este eje es transversal a la membrana. El término "interactuar", cuando se utiliza con respecto al túnel de nanoporo, indica que el polímero se desplaza hacia al menos una parte interior del nanoporo hasta tal punto que la presencia del polímero influye en la corriente iónica medible que circula a través del túnel de nanoporo. Tal como se describe con más detalle más adelante, muchos nanoporos presentan una "constricción" o "zona de constricción", que es un área del túnel interno con el diámetro más pequeño y, por lo tanto, donde es más probable que la corriente se vea afectada de forma diferencial por la presencia de estructuras poliméricas variables.

[0053] Los polímeros abarcados por esta divulgación pueden ser cualquier polímero capaz de 1) asociarse con la proteína objetivo y 2) interactuar con el túnel interior del nanoporo, de modo que la corriente iónica a través del nanoporo pueda verse afectada mediblemente por la estructura del polímero. En la práctica, el polímero sirve como referencia para caracterizar la distancia entre la proteína, a la que está unido el polímero y está situada en la abertura del borde exterior del nanoporo, y la región dentro del túnel donde la presencia del polímero puede afectar la corriente medible dentro del poro (a menudo denominada "zona de constricción"). La medición de esta distancia es posible porque la posición de las subunidades del polímero puede monitorizarse dentro del nanoporo debido a las variaciones en el patrón de corriente observadas durante el ensayo. La determinación de la posición dentro de un nanoporo de una subunidad de nucleótido de polímero en un polímero de ácido nucleico se describe con más detalle en el documento PCT/US2014/059360.

[0054] Tal como se utiliza en el presente documento, un "polímero" se refiere a cualquier macromolécula que comprende dos o más unidades lineales (también conocidas como "meros" o "subunidades"), donde cada subunidad puede ser igual o diferente. Ejemplos no limitativos de polímeros abarcados por la presente divulgación incluyen ácidos nucleicos, péptidos y proteínas, así como diversos polímeros de hidrocarburos (por ejemplo, polietileno, poliestireno) y polímeros de hidrocarburos funcionalizados, donde la estructura principal del polímero comprende una cadena de carbono (por ejemplo, cloruro de polivinilo, polimetacrilatos). El término "polímero" también puede incluir copolímeros, copolímeros de bloque y polímeros ramificados, tales como polímeros estrella y dendrímeros.

[0055] En ninguna realización, no es necesario que la secuencia del polímero se conozcaa priori,ni siquiera que sea descifrable a partir de los patrones de corriente producidos en el sistema de nanoporos. En cambio, entre las subunidades del polímero se puede producir un cambio medible en la corriente iónica y verificar la posición de la variación estructural en el polímero con respecto al túnel del nanoporo y/o la posición de la proteína en el borde de entrada externo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el polímero (por ejemplo, un ácido nucleico) no es un homopolímero.

[0056] El término "ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula polimérica que comprende múltiples subunidades de nucleótidos (es decir, un polinucleótido). Los ácidos nucleicos abarcados por la presente divulgación pueden incluir polímero desoxirribonucleótido (ADN), polímero ribonucleótido (ARN), ADNc o un ácido nucleico sintético conocido en la técnica, tal como ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), ácido nucleico de treosa (TNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) u otros polímeros sintéticos con cadenas laterales de nucleótidos, o cualquier combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o comprender partes tanto monocatenarias como bicatenarias. Típicamente, el ADNc, el ARN, el GNA, el TNA o el LNA son monocatenarios. El ADN puede ser bicatenario (ADNdc) o monocatenario (ADNmc).

[0057] Las subunidades de nucleótidos de los polímeros de ácidos nucleicos pueden ser naturales, artificiales o modificadas. Un nucleótido contiene típicamente una nucleobase, un azúcar y al menos un grupo fosfato. La nucleobase es típicamente heterocíclica. Las nucleobases adecuadas incluyen purinas y pirimidinas, y más específicamente adenina (A), guanina (G), timina (T) (o típicamente, en el ARN, uracilo (U) en lugar de timina (T)) y citosina (C). El azúcar es típicamente una azúcar pentosa. Los azúcares adecuados incluyen, pero sin limitación, ribosa y desoxirribosa. El nucleótido es típicamente un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido. El nucleótido contiene típicamente un monofosfato, difosfato o trifosfato. Estos se denominan generalmente en el presente documento nucleótidos o residuos nucleotídicos para indicar la subunidad. Sin una identificación específica, los términos generales nucleótidos, residuos nucleotídicos y similares no pretenden implicar ninguna estructura o identidad específica. Los nucleótidos también pueden ser sintéticos o modificados. Por ejemplo, el nucleótido puede marcarse o modificarse para que actúe como marcador con una señal distintiva. Además, antes de aplicar el potencial eléctrico, se pueden aplicar modificaciones al ácido nucleico que afecten selectivamente la estructura de un tipo de nucleótido limitado para mejorar la diferenciación de la señal resultante para el residuo (subunidad) objetivo. Por ejemplo, véase la Solicitud Internacional n.°.PCT/US2014/53754. Una estrategia particularmente ventajosa para la práctica de la presente divulgación consiste en incorporar un residuo de ácido nucleico con una estructura de base ausente, por ejemplo, una unidad abásica o un espaciador, en el polinucleótido. Esto resulta especialmente ventajoso, ya que se ha observado que los residuos abásicos dan lugar a un pico de corriente marcado (es decir, un aumento brusco de la corriente) cuando se posicionan dentro de la zona de constricción. Por consiguiente, la posición específica del residuo (o residuos) abásico se puede monitorizar fácilmente con poco riesgo de confusión de la señal. Esto proporciona una señal útil para monitorizar la posición y el movimiento del residuo abásico a través del nanoporo, según lo permita o influya la proteína asociada.

[0058] La presente divulgación también abarca el uso de polipéptidos como polímero. Un “polipéptido” es una macromolécula de múltiples aminoácidos unidos por enlaces peptídicos (amida). Tal como se utiliza en el presente documento, un “aminoácido” se refiere a cualquiera de los aminoácidos naturales presentes en las proteínas, los estereoisómeros D de los aminoácidos naturales (por ejemplo, D-treonina), los aminoácidos no naturales y los aminoácidos modificados químicamente. Cada uno de estos tipos de aminoácidos no es mutuamente excluyente. Los a-aminoácidos comprenden un átomo de carbono al que se une un grupo amino, un grupo carboxilo, un átomo de hidrógeno y un grupo distintivo denominado “cadena lateral”. Las cadenas laterales de los aminoácidos naturales son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, hidrógeno (por ejemplo, como en glicina), alquilo (por ejemplo, como en alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina), alquilo sustituido (por ejemplo, como en treonina, serina, metionina, cisteína, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina y lisina), arilalquilo (por ejemplo, como en fenilalanina y triptófano), arilalquilo sustituido (por ejemplo, como en tirosina) y heteroarilalquilo (por ejemplo, como en histidina).

[0059] Las siguientes abreviaturas se utilizan para los 20 aminoácidos canónicos naturales: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

[0060] Los aminoácidos no naturales (es decir, aquellos que no se encuentran de forma natural en las proteínas) también son conocidos en la técnica, tal como se establece, por ejemplo, en Mol. Cell. Biol., 9:2574 (1989);J. Amer. Chem. Soc., 112:4011-4030 (1990); J. Amer. Chem. Soc., 56:1280-1283 (1991); J. Amer. Chem. Soc., 113: 9276-9286 (1991); y todas las referencias citadas en las mismas. Los aminoácidos p y y son conocidos en la técnica y también se contemplan aquí como aminoácidos no naturales.

[0061] Tal como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido modificado químicamente" se refiere a un aminoácido cuya cadena lateral ha sido modificada químicamente. Por ejemplo, una cadena lateral puede modificarse para comprender un resto señalizador, tal como un fluoróforo o un radiomarcador. Una cadena lateral puede modificarse para comprender un nuevo grupo funcional, tal como un grupo tiol, ácido carboxílico o amino. Los aminoácidos modificados postraduccionalmente también se incluyen en la definición de aminoácidos modificados químicamente.

[0062] Tal como se describió anteriormente, los patrones de corriente producidos en los sistemas descritos que contienen una proteína objetivo asociada a un polímero pueden utilizarse para determinar una característica de la proteína. Esto se debe al descubrimiento de que dichos sistemas de nanoporos pueden permitir una inferencia de alta resolución de la posición de una sola subunidad de polímero dentro del nanoporo y los cambios en esa posición en intervalos de tiempo minúsculos. Este análisis se basa en una investigación preliminar mediante espectroscopia de fuerza sobre ADN monocatenario (ADNmc) dentro de un nanoporo. Los inventores descubrieron previamente que un analito de ADN anclado se estira dentro de la zona de constricción de MspA con una fuerza creciente, aplicada con un mayor potencial eléctrico en el sistema de nanoporos. Mediante la variación del potencial eléctrico en el sistema de nanoporos y la monitorización simultánea de la corriente resultante, se caracterizó el estiramiento del ADN dentro del nanoporo con una precisión a nivel de ángstroms. Utilizando un modelo de cadena libremente unida para evaluar el estiramiento, se caracterizaron las posiciones relativas de los nucleótidos durante los eventos de estiramiento y se estableció la determinación de la contribución relativa del movimiento browniano a la sensibilidad del sistema de nanoporos a múltiples nucleótidos.

[0063] Gracias al conocimiento obtenido mediante el análisis del modelado de resortes, es posible calcular las posiciones de los nucleótidos en cualquier punto durante la interacción del ADN con el túnel del nanoporo. Por lo tanto, el patrón de corriente se puede analizar para identificar cualquier patrón de corriente como correspondiente a un segmento del ácido nucleico que reside en la zona de constricción del nanoporo, asociado con la aplicación de un potencial eléctrico. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la conversión de la curva de corriente-potencial en una curva de corriente-distancia de ácido nucleico se logra mediante la aplicación de un modelo basado en resortes. En algunas realizaciones, el modelo es un modelo de resorte con una fuerza de restauración lineal. En algunas realizaciones, el modelo es una fuerza de restauración no lineal, como en un modelo de cadena libremente unida (FJC,freely jointed chain)o un modelo de cadena libremente unida (FJC) modificado, tal como se describe con más detalle a continuación. Se pueden aplicar otros modelos apropiados según la experiencia en la técnica. Véase el documento PCT/US2014/059360.

[0064] La presente divulgación proporciona un procedimiento para caracterizar una proteína en un sistema de nanoporos. Tal como se mencionó anteriormente, la proteína en este aspecto está físicamente asociada a un polímero. El procedimiento puede comprender específicamente: (a) aplicar un potencial eléctrico entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor para provocar la interacción del polímero con el túnel de nanoporo; (b) medir una corriente iónica a través del nanoporo durante la interacción del polímero con el túnel de nanoporo para proporcionar un primer patrón de corriente; (c) comparar el primer patrón de corriente con un patrón de corriente de referencia; (d) determinar un cambio en la posición y/o el movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo a partir de la posición y/o el movimiento de al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo determinados a partir del patrón de corriente de referencia; y (e) asociar el cambio en la posición y/o el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero en el túnel de nanoporo con una característica de la enzima.

[0065] A continuación, se describen con más detalle diversos aspectos de los sistemas de nanoporos que abarca la presente divulgación. En términos generales, el sistema de nanoporos comprende un nanoporo dispuesto en una membrana que separa un primer medio líquido conductor de un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende un túnel que proporciona comunicación líquida entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor, y en el que la proteína está físicamente asociada a un polímero en el primer medio líquido conductor.

[0066] Tal como se describió anteriormente, dicha al menos una dimensión de la proteína supera el diámetro del túnel de nanoporo.

[0067] Los parámetros y características de este procedimiento son como se describen en el contexto del procedimiento anterior. En este aspecto, el procedimiento implicó comparar el primer patrón de corriente con un patrón de corriente de referencia. Por lo tanto , este procedimiento es aplicable a una configuración experimental para determinar el efecto de uno o más cambios en las condiciones de una reacción. Idealmente, el efecto es atribuible una característica o efecto sobre la proteína objetivo. Por lo tanto, cuando se detecta una diferencia entre las posiciones del polímero, tal como se refleja en el primer patrón de corriente y en un patrón de corriente de referencia, la diferencia puede atribuirse a un cambio en las condiciones del ensayo que produjeron cada patrón de corriente respectivo. Por lo tanto, las condiciones del ensayo en el sistema de nanoporos mencionado comprenden una perturbación, o diferencia, en comparación con las condiciones utilizadas para generar el patrón de corriente de referencia.

[0068] En algunas realizaciones, la diferencia puede ser la adición o eliminación de un posible agonista, antagonista o cofactor de la proteína. En dichas realizaciones, el procedimiento puede emplearse para analizar uno o más de un conjunto de factores potenciales que se sospecha que influyen en una proteína. Por ejemplo, se pueden analizar factores que se sospecha que potencialmente inhiben específicamente una helicasa viral, y se puede caracterizar la capacidad de la helicasa para desplazarse a lo largo del ADN midiendo la velocidad de movimiento del polímero de<a>D<n>en el nanoporo.

[0069] En otras realizaciones, las mutaciones en la proteína que se sospecha que alteran la interacción con polímeros de ácido nucleico se pueden analizar caracterizando la velocidad, frecuencia o carácter de los movimientos del ácido nucleico.

[0070] En otras realizaciones, la diferencia puede ser una diferencia en las condiciones de reacción, tales como una diferencia en la presencia de un cofactor, o una alteración en el cofactor. En otras realizaciones, la diferencia puede ser un cambio en la concentración (ya sea mayor o menor) de componentes como el ATP, y similares.

[0071] El primer patrón de corriente y el de referencia pueden generarse en la misma o diferente configuración del sistema de nanoporos con la misma proteína o diferente proteína y polímero asociado. En algunas realizaciones, el sistema, la proteína y el polímero son duplicados sustanciales, salvo por la perturbación específica introducida. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende generar el patrón de corriente de referencia. En algunas realizaciones, el patrón de corriente de referencia se genera antes o después de la generación del primer patrón de corriente, donde cada patrón se genera antes o después de la introducción de la perturbación, respectivamente. En algunas realizaciones, la perturbación se introduce en el sistema y el efecto sobre la conformación de la proteína se determina mediante la determinación de los cambios en la posición o el movimiento del polímero (o subunidad de polímero) dentro del nanoporo.

[0072] A continuación se describen varios aspectos de los sistemas de nanoporos empleados en la presente divulgación.

[0073] Los procedimientos de análisis basados en nanoporos se han investigado previamente para la caracterización de analitos que pasan a través del nanoporo. Los sistemas permiten el paso de una molécula polimérica, por ejemplo, ADN monocatenario ("ADNmc"), a través de una abertura nanoscópica, a la vez que proporcionan una señal, tal como una señal eléctrica, que se ve influenciada por las propiedades físicas de las subunidades de poliímero que residen en el espacio físico reducido del túnel del nanoporo en cualquier momento determinado. El nanoporo, óptimamente, tiene un tamaño o configuración tridimensional que permite que el polímero pase solo en un orden secuencial de una sola fila. En condiciones teóricamente óptimas, la molécula de polímero pasa a través del nanoporo a una velocidad tal que el paso de cada subunidad monomérica discreta del polímero puede correlacionarse con la señal monitorizada. Las diferencias en las propiedades químicas y físicas de cada subunidad monomérica que compone el polímero, por ejemplo, los nucleótidos que componen un ADNmc, dan lugar a señales eléctricas características que pueden identificar cada subunidad monomérica a medida que pasa a través del nanoporo. Los nanoporos, tales como los nanoporos de estado sólido y los nanoporos de proteína contenidos en las membranas de bicapa lipídica, se han utilizado hasta ahora para el análisis de ADN, ARN y polipéptidos y, por lo tanto, proporcionan una plataforma ventajosa para un análisis robusto de la posición y el movimiento del polímero como un reflejo de una proteína asociada.

[0074] Un "nanoporo" se refiere específicamente a un poro con un tamaño típicamente del orden de nanómetros que permite el paso de polímeros de analito (tales como ácidos nucleicos) a través del mismo. Típicamente, los nanoporos abarcados por la presente divulgación tienen una abertura con un diámetro en su punto más estrecho de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Los nanoporos útiles en la presente divulgación incluyen cualquier poro capaz de permitir la translocación lineal del polímero de analito de un lado al otro a una velocidad que permita técnicas de monitorización, tales como las técnicas para detectar fluctuaciones de corriente.

[0075] Los nanoporos pueden ser nanoporos biológicos (por ejemplo, nanoporos de proteínas), nanoporos de estado sólido, nanoporos híbridos de proteína y de estado sólido, un nanoporo de estado sólido adaptado biológicamente, un nanoporo de origami de ADN y similares.

[0076] En algunas realizaciones, el nanoporo comprende una proteína, tal como alfa-hemolisina, toxina del ántrax y leucocidinas, y proteínas/porinas de la membrana externa de bacterias, tales como porinas deMycobacterium smegmatis(Msp), incluyendo MspA, porinas de la membrana externa, tales como OmpF, OmpG, OmpATb y similares, fosfolipasa A de la membrana externa y lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NaIP), y lisenina, tal como se describe en la Publicación estadounidense n.° US2012/0055792, Publicaciones PCT internacional n.° WO2011/106459, WO2011/106456, WO2013/153359, y Manrao et al., "Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase”, Nat. Biotechnol. 30:349-353 (2012). Los nanoporos también pueden incluir poros de haz de hélices alfa que comprenden un barril o canal que está formado a partir de hélices a. Los poros de haz de hélices a adecuados incluyen, pero sin limitación, proteínas de membrana interna y proteínas de membrana externa, tales como WZA y la toxina ClyA. En una realización, el nanoporo de proteína es un canal selectivo catiónico heteroligomérico deNocardia faricinicaformado por las subunidades NfpA y NfpB. El nanoporo también puede ser un homólogo o derivado de cualquier nanoporo ilustrado anteriormente. Un "homólogo", tal como se usa en este documento, es un gen o proteína de otra especie que tiene una estructura y un origen evolutivo similares. A modo de ejemplo, los homólogos de la MspA de tipo salvaje, tal como MppA, PorMI, PorM2 y Mmcs4296, pueden servir como nanoporo en la presente invención. Los nanoporos de proteínas tienen la ventaja de que, como biomoléculas, se autoensamblan y son esencialmente idénticos entre sí. Además, es posible modificar genéticamente nanoporos de proteínas, creando así un “derivado” de un nanoporo, tal como los ilustrados anteriormente, que posee diversas características. Dichos derivados pueden resultar de la sustitución de residuos de aminoácidos por aminoácidos con diferentes cargas, a partir de la creación de una proteína de fusión (por ejemplo, una enzima alfahemolisina). Por lo tanto, los nanoporos de proteínas pueden ser de tipo salvaje o pueden modificarse para contener al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos da lugar a una carga neta diferente del nanoporo. En algunas realizaciones, la diferencia en la carga neta aumenta la diferencia de carga neta en comparación con el primer resto cargado del analito polimérico. Por ejemplo, si el primer resto cargado tiene una carga neta negativa, dicha al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos da lugar a un nanoporo con una carga menos negativa. En algunos casos, la carga neta resultante es negativa (pero menos), neutra (donde antes era negativa), positiva (donde antes era negativa o neutra) o más positiva (donde antes era positiva, pero menos). En algunas realizaciones, la alteración de las cargas en el borde de entrada del nanoporo o en el interior del túnel y/o la constricción facilita la entrada e interacción del polímero con el túnel del nanoporo.

[0077] En algunas realizaciones, los nanoporos pueden incluir o comprender estructuras basadas en ADN, tales como las generadas mediante técnicas de origami de ADN. Para obtener descripciones de nanoporos basados en origami de ADN para la detección de analitos, véase la publicación PCT n.° WO2013/083983.

[0078] En algunas realizaciones, el nanoporo es una MspA, un homólogo o un derivado de la misma. La MspA se forma a partir de múltiples monómeros. El poro puede ser homomonómero o heteromonómero, donde uno o más de los monómeros contiene una modificación o diferencia con respecto a los demás en el nanoporo ensamblado. Se han descrito modificaciones en los nanoporos de MspA; véase la Publicación de EE. UU. n.° 2012/0055792. Brevemente descrito, los nanoporos de MspA pueden modificarse con sustituciones de aminoácidos para dar lugar a un mutante de MspA con una mutación en la posición 93, una mutación en la posición 90, la posición 91 o ambas posiciones 90 y 91, y opcionalmente una o más mutaciones en cualquiera de las siguientes posiciones de aminoácidos: 88, 105, 108, 118, 134 o 139, con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En una realización específica, la MspA contiene las mutaciones D90N/D91N/D93N, con respecto a las posiciones de la secuencia de tipo salvaje (denominadas en ese documento "M1MspA" o "M1-NNN"). En otra realización, la MspA contiene las mutaciones D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K, con referencia a las posiciones de la secuencia de tipo salvaje (denominadas en ese documento "M2MspA"). Véase la Publicación de EE. UU. n.° 2012/0055792. Dichas mutaciones pueden dar lugar a un nanoporo de MspA que comprende un vestíbulo con una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 nm y un diámetro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constricción con una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diámetro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, donde el vestíbulo y la zona de constricción juntos definen un túnel. Además, las sustituciones de aminoácidos descritas en estos ejemplos proporcionan una mayor carga neta positiva en el vestíbulo del nanoporo, lo que aumenta aún más la favorabilidad energética de la interacción con un extremo del analito polimérico con carga negativa.

[0079] Algunos nanoporos, tales como los nanoporos de la proteína MspA, pueden comprender un componente de túnel de forma variable a través del cual se desplaza el analito polimérico. Por ejemplo, se presenta una realización de ejemplo donde MspA se dispone en una membrana de bicapa lipídica. El nanoporo de MspA comprende una región de borde de entrada exterior que contacta con la enzima ilustrada. La sección interior más ancha del túnel se denomina a menudo vestíbulo. La parte más estrecha del túnel interior se denomina zona de constricción. El vestíbulo y la zona de constricción juntos forman el túnel. Un "vestíbulo" en MspA es una parte con forma cónica del interior del nanoporo cuyo diámetro generalmente disminuye de un extremo al otro a lo largo de un eje central, donde la parte más estrecha del vestíbulo se conecta a la zona de constricción. Dicho de otro modo, el vestíbulo de MspA puede visualizarse generalmente como "caliciforme". Debido a que el vestíbulo tiene forma caliciforme, su diámetro varía a lo largo de un eje central, siendo el diámetro mayor en un extremo que en el opuesto. El diámetro puede variar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, el diámetro es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4.0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable del mismo. La longitud del eje central puede variar desde aproximadamente 2 nm hasta aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, la longitud es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4.3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable del mismo. Cuando aquí se hace referencia a "diámetro", se puede determinar un diámetro midiendo distancias de centro a centro o distancias de superficie a superficie atómica.

[0080] El término “zona de constricción” hace referencia en general a la parte más estrecha del túnel del nanoporo, en términos del diámetro, que está conectada con el vestíbulo. La longitud de la zona de constricción puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 20 nm. Opcionalmente, la longitud es aproximadamente, como máximo aproximadamente o como mínimo aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable entre los mismos. El diámetro de la zona de constricción puede variar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. De manera opcional, el diámetro es aproximadamente, como máximo aproximadamente o como mínimo aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1.0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable entre los mismos. En otras realizaciones, tal como aquellas que incorporan los poros de estado sólido, el intervalo de dimensión (longitud o diámetro) se puede extender hasta aproximadamente 20 nm. Por ejemplo, la zona de constricción de un nanoporo de estado sólido es aproximadamente, como máximo aproximadamente o como mínimo aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nm o cualquier intervalo derivable entre los mismos. Una dimensión mayor en dichos nanoporos puede ser preferible dependiendo del polímero utilizado en el procedimiento. Tal como se describe con más detalle a continuación, la zona de constricción es generalmente la parte de la estructura del nanoporo donde la presencia de un polímero, tal como un ácido nucleico, puede influir en la corriente iónica de un lado del poro al otro lado del nanoporo. La FIGURA 2B proporciona un diagrama ilustrativo de una zona de constricción que es sensible a una subsecuencia de varios nucleótidos de un polímero. En este ejemplo, una posición específica dentro de la zona de constricción presenta la mayor sensibilidad para determinar la corriente a través del nanoporo, tal como lo indican la línea vertical y una indicación de desplazamiento de 0 nm. Por lo tanto, el nucleótido que reside en esa posición en cualquier momento proporcionará la mayor influencia en la señal de corriente y los nucleótidos vecinos en la zona de constricción tendrán una influencia menor sobre la señal. En consecuencia, las dimensiones de la zona de constricción del nanoporo pueden influir en la resolución de la señal de corriente en relación con la estructura (e identidad de secuencia) del polímero analito que reside en ella. En algunos casos, el término "zona de constricción" se utiliza en un contexto funcional basado en la resolución obtenida del nanoporo y, por lo tanto, el término no está necesariamente limitado por ningún parámetro específico de dimensión física. De este modo, la zona de constricción funcional de un nanoporo se puede optimizar modificando aspectos del sistema de nanoporos, pero sin realizar ninguna modificación física en el nanoporo en sí.

[0081] En algunas realizaciones, el nanoporo puede ser un nanoporo de estado sólido. Una capa de estado sólido no es de origen biológico. En otras palabras, una capa de estado sólido no se deriva ni se aísla de un entorno biológico, tal como un organismo o una célula, ni es una versión fabricada de forma sintética de una estructura biológicamente disponible. Los nanoporos de estado sólido pueden producirse tal como se describe en las Patentes de EE. UU. n.° 7,258,838 y 7,504,058. De manera resumida, las capas de estado sólido pueden formarse a partir de materiales orgánicos e inorgánicos, incluyendo, pero sin limitación, materiales microelectrónicos, materiales aislantes, tales como Si3N4, Al2O3 y SiO2, polímeros orgánicos e inorgánicos, tales como la poliamida, plásticos, tales como el Teflón® o elastómeros, tales como como el caucho de silicona de dos componentes de curado por adición y vidrios. La capa de estado sólido puede formarse a partir de grafeno. Las capas de grafeno adecuadas se describen enlos documentos WO 20091035647 y WO 20111046706. Los nanoporos de estado sólido tienen la ventaja de ser más robustos y estables. Además, en algunos casos, los nanoporos de estado sólido pueden multiplexarse y fabricarse por lotes de forma eficiente y rentable. Finalmente, pueden combinarse con tecnología de fabricación microelectrónica. En algunas realizaciones, el nanoporo comprende un nanoporo híbrido de proteína y de estado sólido, en el que una proteína del nanoporo se incorpora a un nanoporo de estado sólido. En algunas realizaciones, el nanoporo es un poro de estado sólido adaptado biológicamente.

[0082] En algunos casos, el nanoporo se dispone dentro de una membrana, película delgada, capa o bicapa. Por ejemplo, los nanoporos biológicos (por ejemplo, proteínicos) pueden insertarse en una capa anfifílica, tal como una membrana biológica, por ejemplo, una bicapa lipídica. Una capa anfifílica es una capa que está formada a partir de moléculas anfifílicas, tales como los fosfolípidos, que poseen propiedades tanto hidrofílicas como lipofílicas. La capa anfifílica puede ser una monocapa o una bicapa. La capa anfifílica puede ser un polímero de cobloque. Alternativamente, un poro biológico puede insertarse en una capa de estado sólido.

[0083] La membrana, película delgada, capa o bicapa separa típicamente un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor para proporcionar una barrera no conductora entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor. El nanoporo, por lo tanto, proporciona comunicación líquida entre el primer y el segundo medio líquido conductor a través de su túnel interno. En algunas realizaciones, el poro proporciona la única comunicación líquida entre el primer y el segundo medio líquido conductor. El medio líquido conductor comprende típicamente electrolitos o iones que pueden fluir del primer medio líquido conductor al segundo medio líquido conductor a través del interior del nanoporo. Los líquidos que se pueden emplear en los procedimientos descritos en este documento son bien conocidos en la técnica. Se proporcionan descripciones y ejemplos de dichos medios, incluidos los medios líquidos conductores, en la Patente de<e>E. UU. n.° 7.189.503, por ejemplo. El primer y el segundo medio líquido pueden ser el mismo o diferentes, y uno o ambos pueden comprender uno o más de una sal, un detergente o un tampón. De hecho, cualquier medio líquido descrito en este documento puede comprender uno o más de una sal, un detergente o un tampón. Además, cualquier medio líquido descrito en este documento puede comprender una sustancia que altere la viscosidad o una sustancia que altere la velocidad.

[0084] En algunos casos, el primer y el segundo medio líquido conductor, ubicados a ambos lados del nanoporo, se consideran que están en las regionescisytrans,donde el analito proteico y el polímero asociado se encuentran en la regióncis.Sin embargo, se entenderá que, en algunas realizaciones, el analito proteico a analizar y el polímero asociado pueden encontrarse en la regióntransy, al aplicar el potencial eléctrico, el polímero ingresa al nanoporo desde el ladotransdel sistema. En algunos casos, la longitud completa del polímero no atraviesa el poro, sino que solo ciertas porciones o segmentos del polímero atraviesan el nanoporo para su análisis. La direccionalidad y la velocidad de translocación pueden regularse mediante diversos mecanismos, tales como la aplicación de voltaje o la incorporación de un nanoporo en la orientación inversa.

[0085] Los sistemas de nanoporos también incorporan elementos estructurales para medir y/o aplicar un potencial eléctrico a través de la membrana o película que contiene los nanoporos. Por ejemplo, el sistema puede incluir un par de electrodos de accionamiento que impulsan la corriente a través de los nanoporos. Normalmente, el polo negativo se dispone en la regióncisy el polo positivo en la regióntrans.Además, el sistema puede incluir uno o más electrodos de medición que miden la corriente a través del nanoporo. Estos pueden incluir, por ejemplo, un amplificador de tipo “patch-clamp” o un dispositivo de adquisición de datos. Por ejemplo, los sistemas de nanoporos pueden incluir un amplificador de de tipo “patch-clamp” Axopatch-200B (Axon Instruments, Union City, CA) para aplicar voltaje a través de la bicapa y medir la corriente iónica que fluye a través del nanoporo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el campo eléctrico aplicado incluye una corriente continua o constante que está entre aproximadamente 10 mV y aproximadamente 1 V. En algunas realizaciones que incluyen nanoporos basados en proteínas incrustados en membranas lipídicas, la corriente aplicada incluye una corriente continua o constante que está entre aproximadamente 10 mV y 300 mV, tal como aproximadamente 10 mV, 20 mV, 30 mV, 40 mV, 50 mV, 60 mV, 70 mV, 80 mV, 90 mV, 100 mV, 110 mV, 120 mV, 130 mV, 140 mV, 150 mV, 160 mV, 170 mV, 180 mV, 190 mV, 200 mV, 210 mV, 220 mV, 230 mV, 240 mV, 250 mV, 260 mV, 270 mV, 280 mV, 290 mV, 300 mV o cualquier voltaje dentro de estos. En algunas realizaciones, el campo eléctrico aplicado está entre aproximadamente 40 mV y aproximadamente 200 mV. En algunas realizaciones, el campo eléctrico aplicado incluye una corriente continua o constante de entre aproximadamente 100 mV y aproximadamente 200 mV. En algunas realizaciones, el campo eléctrico aplicado de corriente continua o constante es de aproximadamente 180 mV. En otras realizaciones donde se utilizan nanoporos de estado sólido, el campo eléctrico aplicado de corriente continua o constante puede estar en un intervalo similar al descrito, hasta 1 V. Tal como se comprenderá, el intervalo de voltaje que se puede utilizar puede depender del tipo de sistema de nanoporos que se está utilizando y del efecto deseado.

[0086] Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que también se puede aplicar el potencial eléctrico inverso con los valores e intervalos descritos anteriormente. Esto puede ser aplicable cuando un motor molecular se caracteriza en el contexto de un campo eléctrico que resiste la fuerza aplicada por el motor molecular sobre el polímero.

[0087] En algunas realizaciones, el potencial eléctrico no es constante, sino variable con respecto a un potencial de referencia. Este uso de potencial variable en el contexto de un polímero de ácido nucleico puede provocar el estiramiento del polímero para proporcionar más datos de muestreo para cada posición del polímero con respecto al nanoporo. Esto puede aplicarse a procedimientos que involucran un motor molecular con una asociación dinámica con el polímero, o a procedimientos que involucran polímeros acoplados covalentemente que no se mueven en etapas discretas, sino que están anclados por la proteína. Véase el documento PCT/US2014/059360.

[0088] Cabe indicar que generalmente el uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o a las alternativas que son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y "y/o".

[0089] Siguiendo la legislación de patentes de largamente establecida, las palabras "un" y "una", cuando se usan junto con la palabra "que comprende" en las reivindicaciones o la memoria descriptiva, indican uno o más, a menos que se indique específicamente.

[0090] Salvo que el contexto indique claramente lo contrario, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, las palabras “comprender”, “que comprende” y similares deben interpretarse en sentido inclusivo, no exclusivo o exhaustivo; es decir, en el sentido de “que incluye, pero sin limitación”. Las palabras en singular o plural también incluyen el plural y el singular, respectivamente. Además, los términos “en el presente documento”, “anteriormente” y “a continuación”, así como términos de significado similar, cuando se utilicen en esta solicitud, se referirán a la solicitud en su conjunto y no a ninguna parte específica de la misma. Palabras, tales como “aproximadamente” y “alrededor de” implican una pequeña variación en torno al valor indicado, generalmente dentro de un margen de error estándar, tal como dentro del 10 % o el 5 % del valor indicado.

[0091] Se describen materiales, composiciones y componentes que pueden usarse para, que pueden usarse junto con, que pueden usarse en la preparación de, o son productos de los procedimientos y composiciones descritos. Se entiende que, al describir combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc., de estos materiales, se contempla específicamente cada una de las diversas combinaciones individuales y colectivas, aunque no se describa explícitamente una referencia específica a todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de estos compuestos. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta descripción, incluyendo, pero sin limitación, las etapas de los procedimientos descritos. Por lo tanto, elementos específicos de cualquiera de las realizaciones anteriores pueden combinarse o sustituirse por elementos de otras realizaciones. Por ejemplo, si se pueden realizar diversas etapas adicionales, se entiende que cada una de estas etapas adicionales puede realizarse con cualquier etapa o combinación de etapas específicas del procedimiento descrito, y que cada una de dicha combinación o subconjunto de combinaciones se contempla específicamente y debe considerarse divulgada. Además, se entiende que las realizaciones descritas en este documento pueden implementarse utilizando cualquier material adecuado, tal como los descritos en otras partes del presente documento o como se conoce en la técnica.

[0092] A continuación se describe un uso ilustrativo del procedimiento divulgado para caracterizar la asociación entre el motor molecular, helicasa hel308, con el ADN a un nivel de resolución de subÁngstrom.

Resumen

[0093] Se describe el desarrolloin vitrode un sensor de nanoporo de alta resolución para observar la actividad enzimática. Un campo eléctrico a través de la proteína porina MspA, diseñada, provoca un flujo de corriente iónica. A medida que la enzima atrae ADN monocatenario a través del poro, los nucleótidos del ADN controlan esta corriente iónica. El análisis de la corriente iónica proporciona un registro en tiempo real de cómo la enzima procesa el ADN. Tal como se demuestra en este documento, el movimiento del ADN a través de las enzimas puede resolverse con una resolución longitudinal de hasta 35 pm y en escalas de tiempo de submilisegundos.

[0094] La utilidad de este procedimiento en la helicasa hel30 TGA se basa en la resolución de una etapa dependiente de ATP y una etapa independiente de ATP para el avance de cada nucleótido. La resolución espacial y temporal de esta nueva técnica de bajo coste para moléculas individuales permite la exploración en tiempo real de dinámicas enzimáticas nunca antes vistas.

Resultados y discusión

[0095] Se presenta una novedosa herramienta, denominada Transductor de Nanoporos de Corriente Iónica Picométrica (PINT,Picometer loncurrent Nanopore Transducer),para examinar motores moleculares basados en la translocación de ADN a través de un nanoporo. PINT permite observar el movimiento de los ácidos nucleicos en relación con la enzima que los procesa con una precisión de decenas de picómetros, en una escala de tiempo inferior a un milisegundo y con una carga de 20-40 pN. La sensibilidad intrínseca de PINT se aplica en el presente documento mediante la observación de una helicasa. En su forma básica, PINT utiliza un único poro de tamaño nanométrico. Un potencial electrostático aplicado a través del poro provoca el flujo de una corriente iónica. El ADN, al que se une una enzima, es atraído hacia el poro por el potencial electrostático. El ADNmc pasa por el poro, pero la enzima es demasiado ancha para atravesar el poro. Una vez que la enzima se asienta sobre el poro, limita la translocación del ADN a la velocidad a la que se mueve el ADN a través de la enzima, mientras que la composición del ADN en la parte más estrecha del poro controla la corriente iónica. Los cambios en la corriente iónica indican la procesión del ADN a través de la enzima con una precisión sorprendentemente alta (FIGURA 2). Para que los nucleótidos individuales controlen la corriente, el nanoporo debe tener características proporcionales a la separación entre los nucleótidos. La naturaleza proporciona poros de proteína robustos con características reproducibles atómicamente. Estos poros se pueden personalizar mediante mutación. Para nuestra investigación en secuenciación de ADN de nanoporos, desarrollamos mutantes específicos (Butler, T.Z., et al., "Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:20647-20652 (2008))) del poro de proteína de la porina A de Mycobacterium smegmatis, MspA. Este poro tiene una constricción corta y estrecha (FIGURA 1A) que es óptina para resolver nucleótidos individuales a lo largo del ADN (Derrington, I.M., et al., "Nanopore DNA sequencing with MspA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:16060-16065 (2010)); Manrao, E.A., et al., PLoS ONE 6, e25723 (2011)). Sin embargo, para aprovechar la capacidad de detección de alta resolución de MspA, el ADN que atraviesa el poro debe mantenerse estacionario (Derrington, I.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:16060-16065 (2010); Manrao, E.A., et al., Nature Biotechnology 30: 349-353 (2011)) o moverse lo suficientemente lento como para resolver los cambios de corriente de picoamperios. En Manrao et al. (Manrao, E.A., et al., "Reading DNA at single nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase," Nature Biotechnology 30:349-353 (2012))), se utilizó la ADN polimerasa (ADNP) de phi29 para atraer ADN a través de MspA. Se observó una sucesión de niveles discretos de corriente iónica (FIGURA 1B). La duración de estos niveles fue estocástica con constantes de tiempo de decenas de milisegundos. El trazado de la sucesión de amplitudes de corriente iónica reveló patrones de corriente reproducibles con una precisión de picoamperios (FIGURA 1C). Cada nivel se asoció con el avance del ADN de un nucleótido y el patrón de corriente se emparejó con la secuencia de ADN (Manrao, E.A., et al., Nature Biotechnology 30:349-353 (2012)). En estudios posteriores, se demostró cómo la magnitud de los niveles de corriente iónica estaba relacionada con la secuencia de nucleótidos (Laszlo et al., "Descodificación de lecturas de secuenciación de nanoporos largos de ADN natural", Nature Biotechnology 32:829-833 (2014))), sentando las bases de la secuenciación de cadenas de nanoporos.

[0096] Debido a la longitud finita de la zona de constricción de MspA y al movimiento browniano, cada nivel de corriente fue el promedio temporal que involucra aproximadamente cuatro nucleótidos, aplicando de manera efectiva el suavizado gaussiano a la sucesión de señales de corriente de un solo nucleótido. Si el ADN se hubiera movido continuamente, en lugar de en una etapa de nucleótido, se esperaría una evolución suave de la corriente iónica, i(x), donde x es la posición del ADN con respecto al poro. Las etapas discretos que proporciona la ADNP phi29 muestrean esta curva suave a intervalos de un nucleótido. Si la ADNP se hubiera detenido en etapas adicionales que movieran el ADN un nucleótido parcial, habríamos observado niveles adicionales en valores de corriente que caerían en esta curva suavei(x).La posición, x, de estas etapas se puede encontrar invirtiendo x =i_1(x). Localmente, un pequeño cambio de posiciónAxse puede inferir a partir de un cambio de corrienteAi,en primer orden, medianteAx = Ai/(di/dx).Para secuencias de ADN con valores altos dedi/dx,esto permite detectar cambios de posición en el ADN de mucho menos de un nucleótido.

[0097] Para ilustrar la precisión alcanzable de PINT, utilizamos un ADNP phi29 para atraer una sección de ADN a través de la constricción del poro que produce una pendiente grande y casi lineal en la corriente iónica. La FIGURA 2 muestra los niveles alrededor de un sitio abásico en el ADN, lo que produce corrientes particularmente grandes. La superposición de niveles de múltiples translocaciones de ADN demuestra la reproducibilidad de niveles. Suponiendo que la pendiente de la corriente es lineal y que la distancia entre fosfatos es de 690 pm, esto da lugar a una incertidumbre de posición de tan solo ~35 pm para un solo paso de una molécula de ADN.

[0098] En otra demostración, utilizamos PINT con fuerzas impulsoras de 180 mV y 140 mV, nuevamente con ADN atraído por la ADNP phi29. Debido a la elasticidad de la sección de ADN de aproximadamente 11 nucleótidos entre la ADNP y la constricción de MspA, esperábamos que el patrón de nivel a 140 mV se desplazara en comparación con el de 180 mV. Tras normalizar las amplitudes de corriente, comparamos los dos patrones de nivel (FIGURA 2E y FIGURA 3D) y se encontró que los patrones se desplazaron ~0,3 posiciones de nucleótidos. Este desplazamiento concuerda con las curvas experimentales de fuerza-estiramiento para el ADN monocatenario (Smith et al., Science, New Series, 271(5250):795-799 (1996); Bosco et al., Nucleic Acids Research, 42(3) (2014)) demostrando que los pequeños movimientos del ADN se resuelven bien usando PINT.

[0099] Una vez establecida la precisión de PINT, necesitábamos demostrar la utilidad de la herramienta para estudiar los motores moleculares. Las translocasas, incluyendo helicasas y polimerasas, son particularmente interesantes por diversas razones, ya que están asociadas con enfermedades humanas. Por ejemplo, las mutaciones en las helicasas están implicadas en diversas afecciones, tales como los síndromes cerebro-óculo-facio-esquelético, los síndromes de Bloom, Werners y Rothmund-Thomson, Baller-Gerold y de rotura de Varsovia, así como el cáncer. Las mutaciones en las polimerasas humanas también se asocian con diversas anomalías, incluyendo enfermedades mitocondriales y cánceres. Para asegurar su replicación, virus, tales como el VIH, la hepatitis C y el ébola codifican sus propias helicasas, polimerasas y/o motores de empaquetamiento en sus genomas. Por lo tanto, las helicasas y polimerasas se han convertido en posibles dianas farmacológicas para interferir con las infecciones virales, y la comprensión del mecanismo de estos motores es particularmente valiosa.

[0100] Aquí estudiamos la helicasa de la superfamilia II (SF2), hel308. Hel308 es una helicasa/translocasa similar a ski2 dependiente de ATP que desenrolla ADN dúplex que se mueve en una sola cadena en dirección 3' a 5'. Hel308 se conserva en muchas arqueas, así como en eucariotas, y también se encuentra en humanos. Con una estructura cristalina conocida, hel308 constituye un buen sistema modelo para comprender las enzimas SF2 procesivas. Elegimos la hel308 robusta de Thermococcus gammatolerans EJ3 (n.° de acceso YP_002959236.1).

[0101] Utilizamos construcciones de ADN similares o idénticas a las de los experimentos de secuenciación de ADN reportados previamente con ADNP phi29 (Manrao, E.A., et al., Nature Biotechnology 30:349-353 (2012), Laszlo et al., Nature Biotechnology 32:829-833 (2014))) (FIGURA 2E), pero para mover el extremo 5' del ADN hacia el vestíbulo de MspA, como durante la actividad enzimática de los experimentos con ADNP, hibridamos una cadena complementaria con nuestras muestras de ADN. Cuando el saliente del extremo 5' monocatenario atravesó la constricción de MspA, la cadena complementaria se eliminó prácticamente al instante, permitiendo que el ADN pasara a través del poro hasta que la helicasa lo retuvo. Con ATP presente, la helicasa comenzó a enrollar el ADN de vuelta a través del poro, devolviéndolo finalmente al ladocis.Registramos ~1000 señales de corriente consistentes con la actividad enzimática. Los patrones de corriente fueron cualitativamente similares a los observados con ADNP phi29 (FIGURA 3A), pero para hel308, encontramos aproximadamente el doble de niveles (FIGURA 3B) al igual que con la ADNP phi29, a pesar de que el mismo número de nucleótidos había pasado a través de la constricción. Se obtuvieron resultados similares con otras secuencias de ADN (no se muestran). Concluimos que la resolución espacial y temporal de PINT nos permitió observar directamente el movimiento internucleotídico del ADN a través de la helicasa. Tras la alineación con la secuencia conocida y los patrones de corriente (Laszlo et al., Nature Biotechnology 32:829-833 (2014))) y construir patrones de nivel de corriente de consenso (FIGURA 3A), observamos que la duración promedio de los niveles alternaba entre niveles largos y cortos. La distribución de la duración de cada nivel se caracteriza por su propia constante de tiempo. La FIGURA 3C muestra la duración media de cada nivel, aclarando además que cada avance de un nucleótido implica dos etapas distints con constantes de tiempo distintas.

[0102] Para investigar el origen de las dos etapas, variamos la concentración de ATP. La FIGURA 3D muestra la duración promedio para las dos etapas representadas frente a la concentración de ATP (FIGURAS 3C, 3D, y3E). La titulación de ATP revela que una de las etapas es dependiente de ATP, mientras que la otra etapa es independiente de ATP. En las condiciones del experimento (22 °C, 300 mM KCl, 5 mM MgCh y 180 mV), la etapa dependiente de ATP siguió la cinética de Michaelis-Menton con una velocidad máxima de 15,2 ± 1,3/s y una constante de Michaelis de 92,5 ± 9,9 pmol. Para la etapa independiente de ATP, se midió una velocidad de 4,5 ± 0,4 s-1. La FIGURA 3F sugiere que la duración de la etapa puede depender de la secuencia. Correlacionamos la semivida de cada etapa con la secuencia desplazada por noff nucleótidos. Descubrimos que la guanina a 14 nucleótidos de la constricción se asocia con una mayor duración del nivel (FIGURA 3E) en la etapa independiente de ATP. Este desplazamiento corresponde a una posición de nucleótido ubicada dentro de hel308.

[0103] A continuación, analizamos la longitud de los dos subetapas a lo largo del ADN. Utilizamos un spline de tercer orden para modelar el perfil de corriente continua y uniforme derivado del consenso de 393 eventos de translocación. Utilizando niveles dependientes de ATP, interpolamos la distancia al nivel independiente de ATP hacia el lado 5'. La distribución de las longitudes de etapa en unidades de espaciamiento de nucleótidos se convirtió en distancia a lo largo del ADN utilizando la longitud de contorno Lc = 690 pm/base (Bosco et al., Nucleic Acids Research, 42(3) (2014)). Al ajustar la longitud de la etapa a la distribución del tamaño del etapa ponderado por la incertidumbre se obtiene un valor más probable de 0,43 ± 0,11 Lc.

[0104] Se debe tener en cuenta que la longitud de la etapa puede depender de la ubicación de los puntos de contacto de hel308 con el borde de MspA.

[0105] La resolución espacial y temporal de esta nueva técnica de molécula única permite la exploración en tiempo real de dinámicas enzimáticas inéditas hasta la fecha. La resolución en tiempo real sin precedentes de PINT permite observar el movimiento del ADN de tan solo unas pocas decenas de picómetros. A primera vista, puede resultar sorprendente que se logre tal precisión, dado que el movimiento browniano reposiciona constantemente la enzima en el poro, afectando así a la posición del ADN en la constricción. Sin embargo, el movimiento browniano explora todas las configuraciones posibles con una velocidad tan alta que una medición de milisegundos proporciona un valor promedio preciso. Parece que gran parte de las fluctuaciones espaciales y temporales restantes observadas con PINT se pueden atribuir a la actividad enzimática. Es probable que el estudio de estas fluctuaciones mediante PINT contribuya a una comprensión detallada del mecanismo del funcionamiento enzimático.

[0106] Al igual que muchas otras técnicas de moléculas individuales, la PINT aplica una fuerza de decenas de piconewtons a la enzima. Para extrapolarla a condicionesin vivo,que generalmente se encuentran en un régimen de fuerza menor, calibramos la fuerza comparándola con curvas de estiramiento del ADN tomadas con pinzas ópticas (Smith et al., Science, New Series, 271(5250):795-799 (1996); Bosco et al., Nucleic Acids Research, 42(3) (2014)). A 180 mV, donde se obtuvo la mayor parte de los datos de PINT, se estima que la fuerza sobre el ADN es de 35 ± 10 pN. Se está realizando una medición directa de fuerza con incertidumbre reducida.

[0107] La extrema sensibilidad de PINT también puede extenderse a otros motores moleculares que no procesan polímeros. Al unir ADN a dichas enzimas o motores, será posible medir en tiempo real los cambios conformacionales asociados con la actividad enzimática.

[0108] La TABLA 1 compara PINT con las técnicas de molécula única más utilizadas para estudiar la actividad de la translocasa.

[0109] La PINT es altamente paralelizable para el alto rendimiento deseado en aplicaciones industriales, tales como el cribado de fármacos. Cabe destacar que la PINT es una técnica de una molécula sencilla y económica que puede implementarse en una amplia gama de laboratorios.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para caracterizar una proteína en un sistema de nanoporos que comprende un nanoporo dispuesto en una membrana que separa un primer medio líquido conductor de un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende un túnel que proporciona comunicación líquida entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor, y en el que la proteína está físicamente asociada con un polímero en el primer medio líquido conductor, comprendiendo el procedimiento:

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el polímero es un ácido nucleico, PNA o una combinación de los mismos; opcionalmente en el que:

(a) el ácido nucleico es ADN, ARN o una combinación de los mismos;

(b) el ácido nucleico comprende un residuo abásico; o

(c) el ácido nucleico no es un homopolímero.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína es una enzima, opcionalmente en el que la característica de la enzima es una presencia o grado de modulación de la actividad enzimática conferida por una condición de reacción o un posible agonista, antagonista o cofactor.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la enzima es un motor molecular.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que el motor molecular es una translocasa, una polimerasa, una helicasa, una exonucleasa, un motor de empaquetamiento viral o una topoisomerasa.

6. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la enzima es un motor browniano, un ribosoma de trinquete browniano, miosina o kinesina.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que:

(a) la proteína es una proteína mutante o una proteína de fusión;

(b) la proteína comprende dos o más dominios capaces de interacción mutua;

(c) la proteína está acoplada covalentemente al polímero;

8. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que:

(b) el movimiento de dicha al menos una subunidad de polímero está asociado con una duración temporal de una etapa de translocación discreta del polímero dentro del túnel de nanoporo que es conferido por el motor molecular; opcionalmente en el que la duración temporal se puede resolver en aproximadamente 800 ns; o

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína es una enzima y en el que:

(b) el sistema de nanoporos comprende una diferencia con respecto al sistema de nanoporos utilizado para generar el patrón de corriente de referencia, en el que opcionalmente la diferencia es:

10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el nanoporo es un nanoporo de estado sólido, un nanoporo de proteína, un nanoporo híbrido de estado sólido-proteína, un nanoporo de estado sólido biológicamente adaptado o un nanoporo de origami de ADN.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que el nanoporo de proteína es alfa-hemolisina, leucocidina, porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipasa A de membrana externa, lipoproteína autotransportadora deNeisseria(NalP), WZA, canal selectivo catiónico NfpA/NfpBde Nocardia farcinica,lisenina o un homólogo o variante de los mismos.

12. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que la secuencia de nanoporo de proteína se modifica para contener al menos una sustitución, eliminación o adición de aminoácido.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que dicha al menos una sustitución, eliminación o adición de aminoácido da como resultado un cambio de carga neta en el nanoporo.

14. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que el nanoporo de proteína tiene una zona de constricción con una carga no negativa.

15. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el potencial eléctrico aplicado está entre 10 mV y 1 V o entre -10 mV y -1 V.