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ES3035670T3 - Protein hydrolysate of moringa peregrina seed cake for its application as a medicament, process for obtaining same and pharmaceutical and dermatological compositions - Google Patents

Protein hydrolysate of moringa peregrina seed cake for its application as a medicament, process for obtaining same and pharmaceutical and dermatological compositions

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ES3035670T3
ES3035670T3 ES21728062T ES21728062T ES3035670T3 ES 3035670 T3 ES3035670 T3 ES 3035670T3 ES 21728062 T ES21728062 T ES 21728062T ES 21728062 T ES21728062 T ES 21728062T ES 3035670 T3 ES3035670 T3 ES 3035670T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protein hydrolysate
peregrina
mass
cake
moringa
Prior art date
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Active
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ES21728062T
Other languages
English (en)
Inventor
Elizabeth Dodinet
Vincent Bourgeteau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alula Peregrina Trading
Original Assignee
Alula Peregrina Trading
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

La invención se refiere a un proceso para la obtención de un hidrolizado proteico específico de torta de semilla de Moringa peregrina. La invención también se refiere a un hidrolizado proteico de torta de semilla de Moringa peregrina y a su uso como medicamento. Finalmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica o dermatológica que comprende, como principio activo, una cantidad eficaz de un hidrolizado proteico de torta de semilla de Moringa peregrina para su uso como medicamento en el tratamiento de enfermedades fibróticas e inflamatorias, el tratamiento del cáncer, el tratamiento de enfermedades infecciosas de tipo bacteriano o vírico, el tratamiento de la deriva genética y las patologías asociadas con la pigmentación cutánea. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrina parauso como medicamento, procedimiento para su preparación y composiciones farmacéuticas y dermatológicas
Campo técnico
La invención se refiere al campo de la farmacia y la dermatología y más particularmente al de los principios activos utilizados en la formulación de medicamentos. La invención se refiere a un procedimiento para obtener un hidrolizado proteico a partir de la torta de semillas deMoringa peregrina.La invención también se refiere al hidrolizado proteico de la torta de semillas deMoringa peregrina,composiciones farmacéuticas y dermatológicas que comprenden dicho hidrolizado y están destinadas al tratamiento de enfermedades fibróticas, al tratamiento de inflamaciones, cáncer, enfermedades infecciosas de tipo vírico.
Antecedentes tecnológicos
Las Moringáceas constituyen una familia monogenérica (un solo género,MoringaAdans), parte de la flora saharosindia, compuesta por entre doce y catorce especies según el autor, distribuidas desde África oriental hasta Asia. El género se divide clásicamente en 3 secciones que, sin embargo, los análisis filogenéticos no confirman como monofiléticas. En su lugar, han identificado clados basados en determinadas características morfológicas: árboles botella, árboles tuberosos y árboles esbeltos. La especieMoringa peregrina(Forssk.) Fiori, pertenece al tercer grupo. Los escasos estudios genéticos sobre el género o la familia confirman la realidad de la especie en relación con otras especies del género, en particular en relación con la Moringa india,Moringa oleiferaLam. (véanse en particular los artículos: OLSON, M. E., 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales), Systematic Botany 27(1): p. 55-73; HASSANEIN, A. M. A. et al., 2018, Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrina genotypes, Horticulture, Environment and Biotechnology 59(2): p.
251-261). Un trabajo reciente sobreMoringa peregrinamuestreada en diferentes localidades de Arabia Saudí concluyó, utilizando marcadores ITS, que la especie es genéticamente estable (ALAKLABI, A., 2015, Genetic diversity of Moringa peregrina species in Saudi Arabia with ITS sequences, Saudi Journal of Biological Sciences 22: p. 186 190) con, sin embargo, un alto nivel de variación genética intrapoblacional.
La especieMoringa peregrinase encuentra en ambientes rocosos de Yemen, Omán y Arabia Saudí, África oriental, Sudán, Etiopía, Eritrea, Somalia y Yibuti. Su presencia en Irán parece limitarse a las provincias del sudeste, pero debe confirmarse (PROTA14 = MUNYANZIZA, E. et al.). Aceites vegetales/Oleaginosas, Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtml/moringa peregrina_en.htm, consultado el 23/10/2019). En Levante y Egipto, la especie sólo representa actualmente un puñado de estaciones dispersas y relictas (a excepción de algunos rodales altitudinales), principalmente en las zonas sudanesas.Moringa peregrinatambién se considera ahora rara y en peligro en Sudán y Yemen.Moringa peregrinaocupa los hábitats más áridos e inhóspitos en comparación con otras especies de su clado. Es aparentemente más resistente a la sequía que laMoringa oleifera, que se planta comercialmente a gran escala en zonas tropicales y subtropicales. Trabajos recientes han demostrado que el tamaño y la tosquedad de las semillas influyen favorablemente en el tiempo de germinación y en la tasa y velocidad de crecimiento de los individuos jóvenes (GOMAA, N. H. et al., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the tree Moringa peregrina (Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany 98(6): pp. 1024-1030), indicando un ajuste en la asignación de recursos sobre la calidad de las semillas más que sobre su número, lo que permite aMoringa peregrinareproducirse eficientemente en ambientes abióticos extremos (hiperáridos). Las semillas deMoringa peregrinatienen una mesotesta central más gruesa, en términos de capa celular, que las deMoringa oleifera.
Existen algunos registros históricos que tienden a indicar que el aceite deMoringa peregrinase comercializaba activamente a principios del período islámico en la región de AlUla (NASEEF, A. A. S., 1995,Al-'Ul.a, A study of Cultural and Social Heritage).En la actualidad, el aceite producido a partir deMoringa peregrinase destina principalmente al autoconsumo o a los mercados locales. En Arabia Saudí, las hojas se utilizaban tradicionalmente como decocción de uso interno para tratar la diabetes, las enfermedades del colon, las enfermedades oculares y la anemia (ABDEL-KADER et al., A survey on the traditional plants used in AI Kobah village, Saudi Pharmaceutical Journal 26(6): pp. 817 821) y como diurético, rubefaciente y astringente (AQEEL, A. A. M. et al., 1984, Plants used in Arabia Folk medicine, Report submitted to Saudi Arabian National Centre for Science and Technology, Riyadh, Saudi Arabia). En Omán, el aceite, extraído por las mujeres a finales del verano, se utiliza para las migrañas, la fiebre, las quemaduras, las laceraciones y fracturas, el estreñimiento y el dolor de estómago, los dolores musculares y el cabello seco (GHAZANFAR, S. A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1a edn, CRC Press, Boca Raton, Ann Harbor, s.u.; GHAZANFAR, S.A., 1998, Plants of Economic Importance, cap. 15, en GHAZANFAR, S.A. et al. (ed.) Vegetación de la Península Arábiga. Geobotánica 25, pp. 241-264, Kluwer Academic Publishers, Tabla 11.1, p. 247 y 11.7 p. 251). También se utilizaba en composiciones perfumadas (GHAZANFAR, S. A., 1998, p. 259) y en Omán y Yemen como loción facial (GHAZANFAR, S. A. et al., 1996, Two multi-purpose seed oils form Oman.). Plantas para la alimentación y la medicina. Documento presentado en la reunión conjunta de la Society for Economic Botany y la International Society for Ethnopharmacology, 1-7 de julio de 1996, London).
Se conocen varios extractos de la semilla deMoringa oleiferaútiles más particularmente en el campo cosmético. En el campo dermatológico, se sabe por el documento FR2776519 que los extractos proteicos de semillas deMoringaoleífera,conocidos por sus efectos clarificantes sobre aguas turbias, tienen un efecto suavizante, acondicionador fisiológico, hidratante, reestructurante, reparador y anticontaminante sobre la piel y las mucosas. En este documento los ingredientes activos son proteínas con pesos moleculares entre 6.500 y 8.800 Da que se obtienen por extracción acuosa sobre torta deMoringa oleífera.
En el campo farmacéutico, se conoce por el documento KR20140143655 una composición que contiene un extracto hidrosoluble de hojas deMoringa oleíferacomo principio activo para tratar o prevenir el cáncer. El procedimiento de hidrólisis enzimática de extractos de hojas deMoringa oleíferaaísla proteínas con pesos moleculares de entre 6.000 y 8.000 Da.
El documento CN107012190 se refiere al uso de semillas deMoringa oleíferapara obtener, tras extraer el aceite y realizar hidrólisis enzimática mediante radiación de microondas, polipéptidos de las proteínas de la semilla. El producto obtenido se utiliza por vía oral y es útil por su actividad anticancerígena. Este producto en forma de polvo se describe por su acción para reducir los efectos secundarios de la quimioterapia y aumentar el apetito de los pacientes con cáncer de hígado, o para controlar el índice leucocitario y la temperatura corporal.
Por último, se sabe por el documento IN2009CH02906 que un extracto acuoso de torta deMorínga oleíferaque comprende glucosinolato combinado con proteínas catiónicas puede utilizarse como producto antidiabético.
Todos los documentos mencionados se refieren al uso de la especieMorínga oleífera;ninguno describe el uso en el ámbito farmacéutico o dermatológico de extractos de la especieMorínga peregrina.
También se conoce el documento de ABU TARBOSHet al.XP055753092, 2005 que describe la extracción de un hidrolizado a partir de semillas deMorínga peregrinadescascarilladas producido por hidrólisis enzimática durante un periodo de 10 horas. El objetivo de esta extracción es obtener un producto con una gran capacidad de absorción de aceite y agua.
Un extracto de aceite deMorínga peregrinaelaborado a partir de semillas egipcias, con una mezcla de diclorometano/metanol (1/1) mostró actividad sobre tres líneas celulares de cáncer humano MCF-7 (adenocarcinoma de mama), Hep-G2 (carcinoma hepatocelular) y HCT-116 (carcinoma de colon) con valores IC50 de 2,92, 9,40 y 9,48 |jg/mn (ABD E<l>BAKY et al., 2013, Characterization of Egyptian Moringa peregrina seed oil and its bioactivities, International Journal of Management Sciences and Business Research, 2(7): p. 98-108). Los autores también demostraron una actividad antioxidante significativa mediante los ensayosDPPH(2,2-difenil 1-picrilhidrazil),ABTS(capacidad de eliminación de aniones y poder reductor) y antiproliferativo. Dado que el extracto se obtiene mediante procedimientos diferentes a los utilizados en la invención, las moléculas obtenidas tienen una polaridad muy diferente.
ABOU-HASHEM y colegas (ABOU-HASHEM, M. M. M. et al., 2019, Induction of sub-G0 arrest and apoptosis by seed extract of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori in cervical and prostate cancer cell lines, Journal of Integrative Medicine 17: p. 410-422) también demostraron la inducción de la detención sub-Go y la actividad de apostosis en líneas celulares de cáncer cervical (HELA) y de próstata (PC-3). El protocolo consistió en semillas egipcias deMorínga peregrina, pulverizadas y extraídas con etanol al 95%, disueltas después en una solución acuosa de la que se estudiaron tres extractos fraccionados (fracciones de éter de petróleo (PE), CHCl3 y EtOAc), así como un extracto hidrolico residuo de la extracción. La actividad se demostró para la fracción total del cloroformo y se atribuyó a los ácidos grasos saturados e insaturados y a los polifenoles sin ningún estudio mecanístico específico. Debido a que los procedimientos de obtención del extracto difieren de los utilizados en la presente invención, las moléculas activas obtenidas tienen una polaridad muy diferente. Carrie Waterman et al. ("Stable,waterextractableisothiocyanatesfromMoringaoleiferaleavesattenuateinflammation in vitro", Phytochemistry, vol. II. 103, 1 de julio de 2014, páginas 114-122) divulga la preparación de un extracto de las hojas deMorínga oleíferarico en compuestos isotiocianatos obtenido por extracción con agua o etanol. El extracto obtenido demuestra un efecto antiinflamatorioín vítro.
Teniendo en cuenta lo anterior, un problema que la invención propone resolver es desarrollar nuevos productos basados en un extracto de la especieMorínga peregrinadel géneroMoríngay de la familia de las Moringáceas que sean utilizables en farmacia o dermatología y de fácil aplicación.
Así, el Solicitante ha identificado sorprendentemente un hidrolizado proteico particular obtenido a partir de la torta de semillas deMorínga peregrinapara su aplicación como medicamento, y en particular para el tratamiento de enfermedades fibróticas (como inhibidor de la furina convertasa), el tratamiento de la inflamación, el cáncer, las enfermedades infecciosas de tipo vírico.
La especieMorínga peregrinacrece en climas muy áridos. Así, su capacidad para resistir la sequía y reproducirse en condiciones extremófilas le ha permitido adquirir características particulares únicas, que el Solicitante ha podido identificar aplicando un procedimiento de extracción específico sobre la torta de semillas deMorínga peregrina.El hidrolizado proteico según la invención ha demostrado poseer propiedades como medicamento, en particular una actividad inhibidora muy elevada de la furina convertasa.
La furina convertasa (en lo sucesivo denominada furina) es una proteína transmembrana de tipo 1 con 794 aminoácidos que se expresa en diferentes tipos celulares. La furina es una proteína que ha demostrado estar implicada en un gran número de procedimientos biológicos (BRAUN E. et al., 2019, Furin-mediated protein processing in infectious diseases and cancer, Clinical & Translational Immunology https://doi.org/10.1002/cti2.1073j.En particular, interviene en la cicatrización de heridas, así como en la regulación de la fibrosis en el tratamiento de afecciones en las que la fibrosis es un importante mecanismo de reparación tisular o en las que una fibrosis excesiva conduce a una alteración patológica y a una disfunción tisular (véase a este respecto WO200409113 , que se refiere al uso de la convertasa para reducir la cicatrización de heridas durante la cicatrización de heridas y para reducir la fibrosis en el tratamiento de afecciones fibróticas). La cicatrización de heridas en adultos es un procedimiento de reparación complejo. Las heridas pueden causar daños, lesiones o traumatismos en un tejido u órgano interno, como los pulmones, los riñones, el corazón, los intestinos, los tendones o el hígado. El procedimiento de cicatrización de las heridas tisulares suele comenzar con una respuesta hemostática desencadenada por la lesión de los vasos sanguíneos de la piel. Durante este procedimiento, el tejido conjuntivo que se forma durante el procedimiento de cicatrización suele ser de naturaleza fibrosa y generalmente se convierte en tejido cicatricial (un procedimiento conocido como fibrosis). La fibrosis puede incluir fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, fibrosis cutánea, fibrosis ocular, fibrosis cardíaca y otras afecciones fibróticas. Los hidrolizados proteicos según la invención también pueden ser útiles para tratar otros estados de enfermedad mediados por furina, incluyendo, pero sin limitarse a, hipertensión, cáncer, enfermedades infecciosas (bacterianas y virales) y trastornos genéticos (por ejemplo, fibrosis quística (CF)), y trastornos neurodegenerativos (véase a este respecto WO2019215341 que se refiere a nuevos compuestos inhibidores de la furina convertasa y composiciones farmacéuticas que los contienen, y que cita numerosas publicaciones que demuestran la actividad farmacéutica de los inhibidores, cuyas citas se incorporan por referencia en la presente descripción).
Por acuerdo intergubernamental de fecha 10 de abril de 2018 entre el Gobierno de la República Francesa y el Reino de Arabia Saudí, el demandante, Agencia Francesa para el Desarrollo de AlUla (AFALULA) junto con la Comisión Real para la AIUIA (RCU) tienen un proyecto común en particular para desarrollar la agricultura responsable y la economía local, en particular a través de la producción local de productos naturales derivados de plantas autóctonas y proteger la biodiversidad y los derechos de la región de AlUla del Reino de Arabia Saudí. El Reino de Arabia Saudí es miembro del Protocolo de Nagoya desde el 8 de octubre de 2020. En el momento de redactar este informe, se está estudiando la normativa de aplicación en virtud de la cual el Protocolo de Nagoya se incorporará a los aspectos pertinentes de la legislación local. Por lo tanto, en esta fase, el Reino de Arabia Saudí no tiene requisitos específicos con respecto a esta solicitud de patente y al Protocolo de Nagoya. Así pues, el día en que se presenta la solicitud de patente, no se exige un certificado de conformidad relativo al acceso a los recursos genéticos.
Sumario
El primer objeto de la invención es un procedimiento para obtener un hidrolizado proteico a partir de la torta de semillas deMoringa peregrina,que comprende las siguientes etapas según las cuales:
a) se recogen semillas maduras no descascarilladas del fruto deMoringa peregrinaque se secan para obtener un contenido de humedad interna inferior al 8%,
b) las semillas secas se prensan para separar el aceite del resto de la semilla, con el fin de obtener una torta que contenga menos de un 6% en peso de aceite residual,
1. c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) la torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en una fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período aproximado de 2 horas, a un pH superior a 13 y a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C,
f) la proteólisis se neutraliza para estabilizar el hidrolizado proteico obtenido,
g) el hidrolizado proteico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado proteico se purifica por ultrafiltración y/o nanofiltración, y a continuación, opcionalmente,
i) el hidrolizado proteico obtenido en la etapa h) se liofiliza.
El segundo objeto de la invención es un hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrinaque comprende una fracción mayoritaria de derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular P1 está comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da, una fracción de aproximadamente el 20% (masa/masa) cuyo peso molecular P2 está comprendido entre 10.000 y 17.000 Da y una fracción de aproximadamente el 20% (masa/masa) cuyo peso molecular P3 es de aproximadamente 23.000 Da, en que se obtiene por proteólisis química a un pH superior a 13 durante un período de aproximadamente 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C y en que es líquida y tiene una densidad superior a 1 y preferentemente alrededor de 1.1.
Gracias a sus características, el hidrolizado proteico deMoringa peregrinasegún la invención nunca se ha encontrado en el géneroMoringay la familia Moringaceae. Se demostrará que el extracto de la especieMoringa peregrinatiene un perfil peptídico particular que es diferente del de otras especies del género, en particular de la especieMoringa oleifera,que el solicitante ha podido destacar.
El tercer objeto de la invención es un hidrolizado proteico de la torta de semillas deMoringa peregrinapara su aplicación como medicamento.
El cuarto objeto de la invención es una composición farmacéutica o dermatológica que comprende, como agente activo, una cantidad eficaz de un hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinay un excipiente fisiológicamente aceptable.
Por último, el quinto objeto de la invención es una composición farmacéutica o dermatológica para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, fibrosis cutánea, el tratamiento de inflamaciones, cáncer, enfermedades infecciosas de tipo vírico y lentigo.
Breve descripción de las figuras
La invención se comprenderá mejor, y otros propósitos, detalles, características y ventajas de la misma se harán más claros en el curso de la siguiente descripción de varias realizaciones particulares de la invención, dadas únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación, con referencia a los dibujos adjuntos.
La figura 1 representa un diagrama de la infección de un virus corona SARS-COV2 (Síndrome Respiratorio Agudo Severo-Coronavirus2) que demuestra el efecto antiinfeccioso y virostático del hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención contra pseudoviriones corona SARS COV2.
La figura 2 muestra el diagrama de inhibición de la furina por un extracto de aceite de peregrina. En esta figura, ** significa significativamente diferente del grupo "control" (P<0,001).
La figura 3 muestra el diagrama de inhibición de la furina por un extracto de torta de peregrina (etanol 96°). En esta figura, * *significa significativamente diferente del grupo de control (P<0,001).
La figura 4 muestra el diagrama de inhibición de furina por un hidrolizado proteico de torta de peregrina según la invención. En esta figura, *** significa significativamente diferente del grupo "control" (P<0,001).
Descripción de las realizaciones
En la presente descripción, a menos que se especifique lo contrario, se entiende que cuando se da un intervalo, éste incluye los límites superior e inferior de dicho intervalo.
En la presente invención, las siguientes abreviaturas significan:
• MTT: bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (la prueba MTT es un procedimiento rápido para contar células vivas).
• SDS: Dodecil sulfato sódico
• PBS: Solución salina tampón fosfato
• ELISA: Ensayo inmunoenzimático
• PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• ANOVA: Análisis de varianza
• MSH: Hormona estimulante de melanocitos
En la presente invención, se entiende por:
• "principalmente derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos" en una cantidad superior al 20%, preferentemente aún superior al 30% y hasta aproximadamente el 40% (masa/masa) de la materia seca en derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos, preferentemente aún el 50% del peso de la materia seca.
• "cantidad efectiva" es la cantidad de moléculas activas necesaria para obtener el resultado deseado, es decir, para garantizar la actividad terapéutica deseada.
• "proteólisis" se refiere a la segmentación de las proteínas en péptidos, oligopéptidos y sus fragmentos básicos (aminoácidos) y residuos mediante hidrólisis química.
• "vía local" se refiere al hecho de que el fármaco, aplicado directamente en su lugar de acción, ejerce su efecto farmacológico en el lugar preciso de la enfermedad. El objetivo de la vía local es limitar la difusión del principio activo desde el lugar de administración, minimizando así los efectos indeseables. Las principales vías locales utilizadas son la dérmica, la nasal, la respiratoria, la ocular, la auricular, la vaginal y la oral.
• "aplicación tópica": el acto de aplicar o extender el principio activo según la invención, o una composición que lo contenga, sobre la superficie de la piel, una membrana mucosa o los apéndices.
• "fisiológicamente aceptable" que es adecuado para uso tópico, en contacto con la piel humana, o para su uso por otras vías de administración, por ejemplo por vía oral o inyectado en la piel, sin riesgo de toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad o respuesta alérgica.
• "torta": la parte de la semilla que ha sido desaceitada tras el prensado. Es el residuo sólido de la extracción del aceite de las semillas. Es un subproducto del procedimiento de trituración del aceite. Generalmente representa entre el 50 y el 75% de la masa de las semillas.
• "semillas sin descascarillar" se refiere al hecho de que la cáscara (pericarpio) y el tegumento de las semillas recolectadas se mantienen alrededor de las almendras.
• "madurez del fruto" significa que el fruto está maduro, preferiblemente cuando la vaina está empezando a dehiscencia y es de color beige oscuro a marrón, y cuando un giro de 180° del cuarto inferior de la vaina empieza a abrir las valvas.
• " aproximadamente” un margen de más o menos entre el 10% y el 20% con respecto a la información facilitada.
• "grupo de moléculas activas", "agente activo" y también "principio activo", el hidrolizado proteico extraído según el procedimiento de la invención de la torta de semillas deMoringa peregrina.Este hidrolizado es responsable de las actividades biológicas descritas en esta invención.
• "agente activo" una cantidad suficiente de un extracto según la invención para obtener las actividades biológicas descritas. Dependiendo de si el extracto es líquido o seco, concentrado o no, las cantidades de agente activo pueden variar en proporciones de 0,0001 a 40% en peso en relación con el peso total de la composición.
La invención se refiere en el primer objeto a un procedimiento para la obtención de un hidrolizado proteico a partir de la torta de semillas deMoringa peregrinaque comprende las siguientes etapas según las cuales:
a) las semillas sin cáscara se recogen en su madurez del fruto deMoringa peregrinay se secan para obtener un contenido de humedad interna inferior al 8%,
b) las semillas secas se prensan para separar el aceite del resto de la semilla con el fin de obtener una torta que contenga menos de un 6% en peso de aceite residual,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) la torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en una fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período aproximado de 2 horas, a un pH superior a 13 y a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C,
f) la proteólisis se neutraliza para estabilizar el hidrolizado proteico obtenido,
g) el hidrolizado proteico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado proteico se purifica mediante ultrafiltración y/o nanofiltración realizada con un umbral de corte comprendido entre 100 y 25.000 Da. Entonces, según una realización particular,
i) el hidrolizado proteico obtenido en la etapa h) se liofiliza.
Se recolectan semillas sin cáscara, es decir, se conserva la cáscara cuando el fruto está maduro y, preferentemente, cuando la vaina se encuentra en las primeras fases de dehiscencia.
Las semillas se secan para obtener un contenido de humedad interna inferior al 8% y preferentemente en torno al 6%; el secado se realiza preferentemente en un bastidor ventilado alejado de los rayos solares, preferentemente bajo una sombra al aire libre.
A continuación, las semillas secas se trituran extemporáneamente al prensado en frío, que separa mecánicamente el aceite del resto de la semilla comprimida, es decir, la torta.
A continuación, la torta se tritura mecánicamente con cualquier tipo de triturador mecánico, como un sistema de martillos, mayal, cuchillas, aplastamiento/trituración, bolas o bolitas o mortero, pero también con cualquier tipo de triturador criogénico.
La dispersión en fase acuosa según la etapa d) y la proteólisis según la etapa e) se realizan ventajosamente siempre con agitación permitiendo así la dispersión y homogeneización del sólido en el líquido, mejorando así la superficie de intercambio global y en consecuencia la proteólisis.
Se obtiene un hidrolizado proteico líquido con una densidad superior a 1 y preferentemente en torno a 1,1, que comprende un contenido en materia seca de entre 10 y 15%, preferentemente en torno a 12,5%, que comprende entre 1 y 6% de compuestos nitrogenados, en particular derivados nitrílicos volátiles en una proporción de 0,5 a 1,5%, preferentemente en torno a 0,8%, así como 20 mg/litro de polifenoles (0,002%).
Según una realización preferente del procedimiento según la invención, la temperatura de proteólisis de la etapa f) es de aproximadamente 22°C.
Según una realización preferente del procedimiento según la invención, la separación sólido/líquido de la etapa g) se lleva a cabo mediante diversos procedimientos tales como centrifugación, deshidratación, filtración.
En una realización del procedimiento de obtención del hidrolizado proteico líquido deMoringa peregrinaobtenido, el hidrolizado proteico se purifica por destilación, microfiltración, ultrafiltración y/o nanofiltración para concentrarlo en compuestos de interés con respecto a los materiales orgánicos también extraídos, en particular los otros derivados también extraídos. Estas etapas de purificación permiten concentrar el conjunto de compuestos de interés a expensas de otros compuestos extraídos como se ha mencionado.
Según otra realización preferente del procedimiento según la invención, la nanofiltración se lleva a cabo para separar 3 bandas o fracciones del hidrolizado proteico que comprenden una banda P1 cuyo peso molecular es inferior a 10.000 Da, una banda P2 cuyo peso molecular está comprendido entre 10.000 y 17.000 Da y una banda P3 cuyo peso molecular es aproximadamente 23.000 Da.
También es ventajoso separar las tres bandas por nanofiltración para obtener por el procedimiento de obtención un hidrolizado proteico:
• una banda P1 con nanofiltración realizada con un umbral de corte comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da, preferentemente con un corte entre 3.000 Da y 4.500 Da.
• una banda P2 con nanofiltración utilizando un umbral de corte comprendido entre 10.000 Da y 17.000 Da.
• una banda P3 con nanofiltración utilizando un umbral de corte comprendido entre 17.000 Da y 25.000 Da.
En otra realización del procedimiento de extracción según la invención, el hidrolizado proteico líquido obtenido se seca para obtener un hidrolizado seco de la torta de semillas deMoringa peregrinaque contiene una cantidad superior al 10%, preferentemente superior al 20%, aún más preferentemente superior al 30% y hasta aproximadamente el 40% (Masa/Masa) de materia seca de péptidos, oligopéptidos, glucopéptidos y aminoácidos o sus derivados de nitrilo volátiles, aún más preferentemente el 50% del peso de la materia seca.
Según una realización de la invención, el hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinalíquido obtenido se seca, por ejemplo por atomización, liofilización o zeodración, para obtener un hidrolizado de semillas deMoringa peregrinasólido, evaporándose el agua. El secado puede realizarse en presencia de un soporte orgánico como la maltodextrina, la ciclodextrina o la inulina, o en presencia de un soporte inorgánico como el filosilicato, el silicato de magnesio o el carbonato y sus sales.
La invención también se refiere al hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinaobtenido por el procedimiento de extracción según la invención.
El segundo objeto de la invención es un hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrina,que comprende una fracción P1 mayoritaria de derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da, una fracción P2 de aproximadamente el 20% (masa/masa) cuyo peso molecular está comprendido entre 10.000 y 17.000 Da y una fracción P3 de aproximadamente el 20% (masa/masa) cuyo peso molecular está comprendido entre 23.000 Da aproximadamente, en que se obtiene por proteólisis química a un pH superior a 13 durante un período de aproximadamente 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C y en que es líquida y tiene una densidad superior a 1 y preferentemente alrededor de 1.1.
Según una realización, el hidrolizado proteico líquido obtenido se seca para obtener un hidrolizado seco de la torta de semillas deMoringa peregrinaque contiene una cantidad superior al 20%, preferentemente aún superior al 30% y hasta aproximadamente el 40% (Masa/Masa) de materia seca de péptidos, oligopéptidos, glucopéptidos y aminoácidos o sus derivados de nitrilo volátiles, preferentemente aún el 50% del peso de la materia seca.
Según una realización preferente, el hidrolizado proteico comprende también entre 0,3% y 3% de compuestos volátiles, de los cuales 50% de estos compuestos, es decir, entre 0,15% y 1,5% del extracto según la invención, consiste en compuestos de nitrilo ligeros, con principalmente isobutironitrilo y metil-butanenitrilo; de los cuales 5 a 10% de estos compuestos, es decir, entre 0,015 y 0,3% del extracto según la invención, consiste en derivados de isotiocianato, principalmente isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de isobutilo.015 y el 0,3% del extracto según la invención, consiste en derivados de isotiocianato, principalmente isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de isobutilo; del 1 al 5% de estos compuestos, es decir, entre el 0,003 y el 0,15%, consiste en aceite esencial, principalmente eucaliptol, mentol y benzaldehído.
Según otra realización más, el hidrolizado proteico comprende un contenido de materia seca de entre el 10 y el 15%, preferentemente alrededor del 12,5% que comprende entre el 1 y el 6% de compuestos nitrogenados, en particular derivados nitrílicos volátiles en una proporción de entre el 0,5 y el 1,5%, preferentemente alrededor del 0,8%, así como 20 mg/litro de polifenoles.
En el contexto de la presente invención, la parte vegetal elegida es la semilla deMoringa peregrina.Se sabe que las semillas deMoringa peregrinase utilizan para la extracción de su aceite, útil para el autoconsumo o en diversos tratamientos medicinales tradicionales. La torta obtenida tras el desaceitado de la semilla es un residuo que actualmente se utiliza sobre todo para la alimentación animal.
Según otra realización más, el hidrolizado proteico comprende la fracción mayoritaria P1 cuyo peso molecular está comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da.
Según otra realización más, el hidrolizado proteico comprende la fracción P2 de aproximadamente 20% (masa/masa) cuyo peso molecular está entre 10.000 Da y 17.000 Da.
Según otra realización más, el hidrolizado proteico comprende la fracción P3 de aproximadamente 20% (masa/masa) cuyo peso molecular es de aproximadamente 23.000 Da.
Según otra realización más, el hidrolizado proteico comprende la fracción P1 cuyo peso molecular está comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da y la fracción P2 cuyo peso molecular está comprendido entre 10.000 y 17.000 Da.
El tercer objeto de la invención es un hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinapara su uso como medicamento.
El cuarto objeto de la invención es una composición farmacéutica o dermatológica que comprende, como agente activo, una cantidad eficaz de un hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinasegún la invención y un excipiente fisiológicamente aceptable.
Las composiciones según la invención pueden presentarse en todas las formas galénicas normalmente utilizadas según que la composición vaya a ser ingerida, inyectada o aplicada sobre la piel o las mucosas.
Según una primera realización, las diversas composiciones son adecuadas para la ingestión; la composición puede presentarse en forma de cápsulas, jarabes, gránulos o comprimidos. Puede no contener ningún excipiente y consistir enteramente en el extracto de la planta que contiene el hidrolizado proteico en forma desecada.
Según una segunda realización, las diversas composiciones son adecuadas para inyección; la composición puede estar en forma de loción acuosa, oleosa o en forma de suero.
Según una tercera variante, las diversas composiciones están destinadas más particularmente a la administración local, permitiendo un efecto farmacológico en el lugar preciso de la afección a través de la piel o de las mucosas.
Las principales vías locales utilizadas para administrar el agente activo según la invención son la vía cutánea y percutánea, la vía nasal y respiratoria, la vía ocular, la vía auricular y la vía vaginal. Pueden contemplarse otras vías, en particular la vía bucal, para administrar las composiciones a través de las mucosas, y la vía subcutánea mediante microinyecciones.
Las composiciones según la invención para fines farmacéuticos pueden estar en cualquier forma galénica utilizada normalmente para aplicación tópica. Pueden administrarse en las mucosas, especialmente en la nariz o las vías respiratorias, los ojos, la boca, la vagina y el oído.
Las composiciones según la invención para fines dermatológicos pueden presentarse en todas las formas galénicas normalmente utilizadas en el campo de la dermatología para su aplicación por vía cutánea. Pueden administrarse por vía transdérmica o aplicarse tópicamente sobre la piel.
Las composiciones que incorporan un hidrolizado proteico según la invención pueden comprender ingredientes comúnmente utilizados en este tipo de formulaciones por vía tópica o cutánea.
Según una realización preferente, las diversas composiciones son adecuadas para administración tópica e incluyen cremas, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, leches, ungüentos, lociones, aceites, bálsamos, soluciones acuosas o hidroalcohólicas o glicólicas, sueros, polvos, parches, aerosoles o cualquier otro producto de aplicación externa como, por ejemplo, dispositivos médicos o productos en aerosol que contengan también un propulsor a presión.
Según otra realización preferente, las diversas composiciones son adecuadas para inyección subcutánea y administración transdérmica; la composición puede estar en forma de loción acuosa, emulsión o en forma de suero. En los sistemas transdérmicos o parches, la liberación del principio o principios activos se controla mediante una membrana permeable y generalmente adhesiva en contacto directo con la piel.
Las composiciones según la invención destinadas más particularmente a la administración tópica contienen un medio farmacéutico o dermatológico aceptable, es decir compatible con la piel y las mucosas, y cubren todas las formas galénicas adecuadas. Estas composiciones pueden presentarse, en particular, en forma de cremas, emulsiones o emulsiones múltiples de aceite en agua o agua en aceite, sueros, soluciones, suspensiones, geles, leches, lociones, barritas, aerosoles, pulverizadores o cualquier otro producto de aplicación externa como, por ejemplo, productos sanitarios o aerosoles que contengan también un propulsor a presión, o incluso en forma de polvos, y ser adecuadas para su aplicación sobre la piel y las mucosas. Estas composiciones incluyen los excipientes necesarios para su formulación, como disolventes, emolientes, espesantes, diluyentes, tensioactivos, antioxidantes, agentes bioactivos, colorantes, conservantes y fragancias.
Las composiciones según la invención comprenden, por tanto, cualquier aditivo comúnmente utilizado en el campo de aplicación previsto, así como los coadyuvantes necesarios para su formulación, tales como disolventes, espesantes, diluyentes, antioxidantes, colorantes, filtros solares, agentes autobronceadores, pigmentos, cargas, conservantes, perfumes, absorbentes de olores, principios activos dermatológicos o farmacéuticos, aceites esenciales, vitaminas, ácidos grasos esenciales, tensioactivos, polímeros formadores de película, etc.
En todos los casos, el experto en la materia se asegurará de que estos adyuvantes y sus proporciones se eligen de manera que no perjudiquen las propiedades ventajosas buscadas de las composiciones según la invención.
En las composiciones de la invención, el hidrolizado proteico según la invención se utiliza en una cantidad que oscila entre 0,0001 y 40% en peso con respecto al peso total de la composición.
En una realización preferente, el hidrolizado proteico según la invención se utiliza en una cantidad que oscila entre 0,001 y 10% en peso con respecto al peso total de la composición, aún más preferiblemente en una cantidad que oscila entre 0,01% y 5% en peso con respecto al peso total de la composición.
Finalmente, la invención tiene como quinto objeto una composición farmacéutica o dermatológica para su uso como medicamento para el tratamiento:
• de enfermedades fibróticas y el tratamiento de la inflamación, que comprende como agente activo una cantidad eficaz de la fracción P1 o P2 del hidrolizado proteico, preferentemente la fracción P1.
• de cáncer, que comprende como agente activo una cantidad eficaz de la fracción P3 del hidrolizado proteico.
• de enfermedades infecciosas de tipo vírico, y en particular para inhibir las proteínas Spike-COV2 del SARS-COV2, que comprende como agente activo una cantidad eficaz del hidrolizado proteico en su conjunto. •
• del lentigo, que comprende como agente activo una cantidad eficaz de las fracciones P1 y P2 del hidrolizado proteico.
Por "deriva genética" nos referimos al estrés ambiental en particular.
Para el tratamiento de enfermedades fibróticas, fibrosis significa fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, fibrosis cutánea, fibrosis ocular, fibrosis cardiaca y otras afecciones fibróticas diversas y para el tratamiento de otros estados de enfermedad mediados por furina, incluyendo, pero no limitado a, hipertensión, cáncer, enfermedades infecciosas incluyendo virales y bacterianas, desórdenes genéticos (por ejemplo, fibrosis quística (FQ)), y desórdenes neurodegenerativos.
Aunque la invención se ha descrito en relación con varias realizaciones particulares, está bastante claro que no está de ninguna manera limitada a las mismas y que incluye todos los equivalentes técnicos de los medios descritos, así como combinaciones de los mismos si éstos entran dentro del ámbito de la invención.
El uso del verbo "comprender", "contener" o "incluir" y sus formas conjugadas no excluye la presencia de elementos o etapas distintos de los establecidos en una reivindicación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de un hidrolizado proteico de vegetales según la invención a partir de torta de Moringa peregrina.
Semillas deMoringa peregrina(Forssk.) Fiori se secaron hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%, preferiblemente en torno al 6%, y después se prensaron con una prensa mecánica de tornillo para separar el aceite del resto de la semilla y obtener aceite virgen y una torta. A continuación, la torta se aísla en forma de filamentos precortados en trozos de 1 a 2 cm, a partir de los cuales se realiza la extracción.
Las materias primas utilizadas son las siguientes.
[Tabla 1]
Protocolo:
a) Se prepara una solución concentrada 1 molar de un agente alcalino fuerte como hidróxido sódico, hidróxido potásico o hidróxido cálcico, o de una mezcla acuosa que concentre 1 molar de agentes alcalinos fuertes, pero preferentemente hidróxido sódico; esta solución alcalina fuerte tiene un pH comprendido entre 13 y 14, b) El 9,1% (masa/masa) de torta deperegrinaprecortada en trozos de aproximadamente 1 cm se pesa en el 90,9% (masa/masa) de la solución alcalina,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) La torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en la fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período de 2 horas a una temperatura de 22°C,
f) la proteólisis se neutraliza para estabilizar el hidrolizado proteico obtenido,
g) el hidrolizado proteico se recupera mediante separación sólido/líquido a través de un filtro de 1 pm, h) el hidrolizado proteico se purifica por ultrafiltración,
Se obtiene un filtrado amarillo translúcido que contiene aproximadamente 12,48% de materia seca. El extracto líquido obtenido se denomina en lo sucesivo "hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención" o "hidrolizado de proteínas deperegrina"o "extracto según la invención".
Este hidrolizado de proteínasperegrinasegún la invención tiene un peso específico superior a 1 y preferentemente alrededor de 1,1, comprendiendo un contenido en materia seca de entre 10 y 15%, preferentemente alrededor de 12.5%, que comprende entre 1 y 6% de compuestos nitrogenados, en particular derivados nitrílicos volátiles en una proporción de 0,5 a 1,5%, preferentemente alrededor de 0,8%, y 20 mg/litro de polifenoles. A continuación se indica la composición del hidrolizado seco de proteínas deperegrinasegún la invención.
[Tabla 2]
El hidrolizado de proteínas deperegrinacontiene isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de isobutilo en niveles relativamente altos, lo que confirma publicaciones anteriores sobre la especie (KJAER, A. et al.). 1979, Isothiocyanates in Myrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina, Phytochemistry, 18, pp. 1485-1487; AFSHARYPUOR, S. et al., 2010, Volatile Constituents of the Seed Kernel and Leaf of Moringa peregrina (Forssk.). Fiori, Agricolt. Cultivada en Chabahar (Irán), Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6(2): pp. 141-144; DEHSHAHRI, S. et al., 2012, Determination of volatile glucosinate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures of Moringa peregrina (Forssk.). Fiori, ScienceOpen, Investigación en ciencias farmacéuticas 7(1): pp. 51-56). Los isotiocianatos son compuestos producidos por diversas plantas pertenecientes al orden Brassicales, en particular en las familias Brassicaceae, Capparaceae, Caricaceae y Moringaceae, como sistema de defensa contra el ataque de patógenos. En el géneroMoringa,se han identificado en particular enM. oleiferaLam. yM. stenopetala(Baker f.) Cufold. (ABD RANI, N.Z. et al., 2018, Moringa genus:. A review of Phytochemistry and Pharmacology, Fronteras de la Farmacología, vol. II. 9, art. 108, p. 3-8). Los isotiocianatos se producen por la hidrólisis de los glucosinolatos por la enzima mirosinasa cuando se dañan los tejidos vegetales. Los isotiocianatos tienen diversos efectos biológicos, como la actividad antifúngica (TRONCOSO-ROJAS, R. et al., 2007, Natural compounds to control fungal diseases in fruits & vegetables, en TRONCOSO-ROJAS, R., TIZNADO-HERNANDEZ, M. E., GONZALEZ-LEON, A. (eds) Recent advances in alternative postharvest technologies to control fungal diseases in fruits & vegetables.). Transworld Research Network, Kerala, India, p. 127-156; TRONCOSO-ROJAS, R. et al., 2005, Analysis of the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potential application to control Alternaria rot in bell peppers, Food Research International 38, pp. 701-708), efectos antimicrobianos, anticancerígenos y antiinflamatorios (PARK, E. J. et al., 2011, Inhibition of lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 expression and inducible nitric oxide synthase by 4-[(2'-O-acetyl-a-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate from M. oleifera, Nutrition and Cancer 63(6), pp. 971-982; RAJAN T S. et al., 2016, Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in human malignant astrocytoma cells, Fitoterapa 110, pp. 1 7; PADLA, E. P et al. 2012, Antimicrobial isothiocyanates from the seeds of Moringa oleifera Lam., Zeitschrift für Naturforschung C, 67, pp. 557-564; WATERMAN, C. et al., 2014, Stable, water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuate inflammation in vitro. Fitoquímica 103, pp. 114-122). El furfural está presente en una concentración muy estándar, que se encuentra en este tipo de semillas y en muchos frutos secos. El disulfuro de carbono, el isobutironitrilo, el isobutirato de metilo, el butanenitrilo de metilo y el hexanenitrilo son compuestos volátiles derivados de los aminoácidos. Son marcadores de la degradación de las proteínas. Estos compuestos de degradación representan alrededor del 50% de los compuestos volátiles del hidrolizado de proteínas de peregrina. Este resultado indica que el hidrolizado se compone principalmente de proteínas. Sólo se detectaron trazas muy pequeñas de grasas o azúcares libres en el hidrolizado de proteínas deperegrina;el hidrolizado consiste principalmente en proteínas y glicoproteínas. En la materia seca, el tampón citrato (que es un compuesto osídico) representa alrededor del 50% del resto e incluye compuestos glicosilados (osídicos) resultantes de la degradación por proteólisis de proteínas, oligopéptidos y aminoácidos. Por último, cabe destacar la presencia de aproximadamente 21 mg/litro de polifenoles (0,002%) procedentes de las semillas deMoringa peregrina.El ácido benzoico no debe incluirse en la caracterización, ya que es un agente estabilizador que se añade al extracto.
El extracto seco descrito anteriormente se obtiene por un procedimiento gravimétrico basado en la masa antes y después de la evaporación presente en el extracto líquido.
Ejemplo 2: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención como inhibidor de la furina convertasa (conocida como furina).
El objetivo del presente estudio es evaluar la actividad inhibidora del hidrolizado proteico de torta desemillas de Moringa peregrina,obtenido según el Ejemplo 1.
Protocolo: El estudio se lleva a cabo utilizando furina humana recombinante, que cataliza la escisión de un sustrato de referencia fluorescente específico.
Se utilizó Decanoil-Arg-Val-Lys-Arg-CMK a 100 nm como inhibidor de referencia de la actividad de furina.
La furina se preincubó durante 10 min a temperatura ambiente en ausencia (control) o presencia del producto de referencia o concentraciones crecientes del compuesto de ensayo:
"Hidrolizado de proteínas deperegrina";0,02; 0,2 y 2% (v / v).
Al final de la etapa de preincubación, se añadió un sustrato de furina y las condiciones experimentales se incubaron de nuevo a temperatura ambiente protegidas de la luz durante 5 min. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Preparación de compuestos:
El hidrolizado de proteínas deperegrinaensayado se solubilizó directamente en el tampón de ensayo y después se diluyó para alcanzar la concentración a ensayar descrita anteriormente.
Protocolo de evaluación
La escisión del sustrato de furina fluorescente se monitorizó durante 5 min después de la adición de sustrato leyendo la fluorescencia a 485 nm / 535 nm.
Estadísticas
Los resultados se expresan en RFU (unidades fluorescentes relativas) /- D.S. (Desviación típica).
La significación estadística de la diferencia observada entre los grupos "Control" y "Producto de referencia" se evaluó mediante una prueba t de Student (p <0,001).
La significación estadística de la diferencia observada entre los grupos "Control" o "Testigo" y "Compuesto de prueba" se evaluó mediante un análisis ANOVA de una vía seguido de una prueba HolmSidak (p <0,05).
El inhibidor de furina de referencia denominado Decanoil-Arg-Val-Lys-Arg-CMK, ensayado a 100 nm, inhibió significativamente la actividad de furina en un 97,9% (p <0,001).
Este resultado era el esperado y valida el estudio.
Los resultados de la actividad de la enzima furina frente a la actividad basal obtenidos se dan a continuación.
[Tabla 3]
Conclusión: A una concentración del 2%, el hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención es capaz de inhibir la actividad de la furina convertasa en un 98,8%. A partir de la concentración del 0,2%, el hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención es capaz de inhibir la actividad de la furina en un 26,8%.
E emplo 3: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención en la inhibición de las enzimas ) y Sirtuina I.
El objetivo de este estudio es demostrar la actividad inhibidora del hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención sobre las enzimas HDACs y Sirtuinas I, enzimas implicadas en el control de la deriva genética regulando la condensación/descondensación de la cromatina que da acceso o no a los genes portados por el ADN. Una solución tamponada de HDACs & Sirtuin I reacciona con un sustrato durante 20 minutos a 37°C y lo transforma para formar un compuesto que se tiñe en presencia de un revelador tras incubación a 37°C durante 10 minutos. Por lo tanto, la actividad máxima de desacetilación de las Sirtuinas puede evaluarse midiendo la absorbancia a 405 nM. El hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención o el producto de referencia "Inhibidor de tricostatina A (STA) 1|<j>M" se ponen en contacto con la solución de sirtuinas al mismo tiempo que el sustrato enzimático durante 20 minutos a 37°C; el sustrato transformado por la enzima se colorea mediante la adición de un revelador. A continuación, se evaluó la actividad desacetiladora de las HDAC y la Sirtuina I en presencia del agente activo midiendo la absorbancia a 405 nm. La modulación de esta actividad se expresa como porcentaje de inhibición o activación de la actividad máxima de las HDACs & Sirtuin I en ausencia de principio activo, es decir, sólo en presencia del sustrato para las enzimas HDACs & Sirtuin I.
Protocolo: Se incuba una solución de enzimas sirtuinas en su sustrato durante 20 minutos en ausencia (control) o presencia del producto de referencia, o concentraciones crecientes de los productos de ensayo. El hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención se prueba a las siguientes concentraciones: 2%; 1%; 0,1% (V/V). Al final del período de incubación, la actividad de las enzimas sirtuinas con y sin el producto de prueba o de referencia se reveló mediante tinción con una solución reveladora (10 min a 37°C) y se evaluó midiendo la absorbancia de los medios de reacción a 405 nm. Para cada concentración ensayada, la modulación de la actividad de desacetilación de las enzimas Histona Desacetilasa y Sirtuina I por el producto de ensayo se calcula según la fórmula siguiente.
Porcentaje de modulación de la actividad enzimática de las sirtuinas = 100 x [(DO<405>producto de ensayo o de referencia) - (DO<405>HDACs y Sirtuina I solas)]/DO<405>Sirtuinas solas.
Si el resultado es negativo, el porcentaje se expresa como inhibición de la reacción enzimática; si el resultado es positivo, el porcentaje se expresa como activación de la reacción enzimática. A continuación se presentan los resultados de la inhibición de las enzimas histonas desacetilasas (HDAC).
[Tabla 4]
Conclusión: Al 2%, el hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención muestra una inhibición significativa de las HDACs; esta inhibición revela la capacidad de promover la autoprotección de las células de la piel frente a la deriva genética. Así pues, el extracto parece ser útil contra uno de los trastornos genéticos más frecuentes en la superficie de la piel, la fibrosis, que se manifiesta con la aparición de un "grano" de carne (protuberancia fibrótica). El extracto puede interferir ventajosamente con los fenómenos de fibrosis en la superficie de la piel.
Ejemplo 4: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención en la inhibición de la acción de la endotelina-1 (ET-1).
La endotelina es una hormona peptídica derivada de las células endoteliales capaz de actuar sobre diversas células y tejidos a través de sus receptores. Por ejemplo, se sabe que la endotelina provoca un aumento de la concentración de calcio intracelular en las células del músculo liso vascular y en otras células (OHBA T et al., WO2012/081370).
En los últimos años se ha informado de que la endotelina tipo 1 (ET-1) es un factor bioactivo que contrae continuamente el músculo liso vascular y no vascular mediante acciones directas e indirectas. Se cree que el aumento de la acción de la endotelina proporciona una vasoconstricción continua a los vasos sanguíneos de los sitios periféricos, el riñón y el cerebro, y que subyace a diversas enfermedades como la hipertensión, el infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular, la insuficiencia renal aguda, el síndrome de Raynaud, la aterosclerosis, el asma y el cáncer de próstata (MIYAGAWA K. & EMOTO N. et al., 2014, Current state of endothelin receptor antagonism in hypertension and pulmonary hypertension, Therapeutic Advances in Cardiovascular Diseases, vol. 8(5) 202-216; SCHINZARI F. et al., 2018, Aumento del tono vasoconstrictor mediado por endotelina-1 en la obesidad humana:. Efectos de las hormonas intestinales, Physiological Research 67 suppl.1: S69-S81). Tres tipos de péptidos de la familia de la endotelina con estructuras similares están presentes en animales, incluidos los humanos (KADONO, S. et al., 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis, Journal of Investigative Dermatology 1164, pp. 571-577; ANONYMOUS, 2006, American Society for Biochemistry and Molecular Biology, New Cosmetics Handbook, pp. 527-529). Todos estos péptidos tienen un efecto vasoconstrictor y acciones vasopresoras.
En los últimos años, se ha dilucidado el papel de la endotelina en diversas células distintas de las células musculares lisas vasculares. Las publicaciones científicas, por ejemplo, han informado de que la generación de ET-1 y otros factores aumenta en los queratinocitos cuando la piel se expone a la irradiación UV, y han sugerido que la ET-1 está asociada a la melanogénesis en los melanocitos expuestos a la irradiación UV. En consecuencia, la supresión de la expresión de endotelina se considera útil, no sólo para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades mencionadas, sino también para la prevención o mejora de la pigmentación de la piel (IMOKAWA, G. et al., 1995, Endothelin-1 as a New Melanogen:. Coordinated Expression of its Gene and the Tyrosinase Gene in UVB-Exposed Human Epidermis, Journal of Investigative Dermatology 1051, pp. 32-37; IMOK<a>W<a>, G. et al.., 1992, Endothelins Secreted from Keratinocytes are Intrinsic Mitogens for Human Melanocytes, Journal of Biological Chemistry, 267, pp.
24675-24680; GILCHREST, B. et al., 1996, Mechanisms of Ultraviolet Light-Induced Pigmentation, Photochemistry and Photobioliogy63, pp. 1-10).
El objetivo es ensayar endotelina tipo 1 en células endoteliales microvasculares humanas después de la exposición durante 24h a hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención.
Protocolo: Las células endoteliales microvasculares humanas fueron suministradas por PELOBiotech y cultivadas en placas de 96 pocillos según los procedimientos de producción del proveedor. Se dejó que los extractos actuaran a diferentes concentraciones sobre las células endoteliales al 80% de confluencia durante 24 horas y, a continuación, se cuantificó la endotelina-1 utilizando el kit ELISA PicoKine (EDN1) en los sobrenadantes celulares. Se realiza previamente un ensayo de viabilidad para definir las dosis no tóxicas que se utilizarán para el ensayo de endotelina-1. El control negativo se realiza utilizando células en medio de cultivo sin tratamiento. El control positivo en la prueba de viabilidad es 0,5% SDS. Todas las condiciones se prepararon en medios de cultivo y las células se incubaron a 36,5°C / 5% CO2 durante 24 horas.
a) Aplicación de soluciones de ensayo a células endoteliales:
Los productos de ensayo se ponen en contacto con células endoteliales bajo subconfluencia en placas de 96 pocillos. Para cada concentración, la prueba se realiza en 3 pocillos. Las placas se incubaron durante 24 horas ± 1 hora a 36,5°C / 5% CO2.
b) Prueba de viabilidad:
La viabilidad celular se evalúa mediante el procedimiento MTT en células después de la incubación con los productos. Tras 24 horas de incubación, se recuperan los sobrenadantes y se almacenan a -20°C para los ensayos. A continuación, los pocillos se enjuagaron 1 vez con 200 pl de PBS. Añadir 50 pl de solución de MTT 0,5 mg/ml a cada pocillo e incubar durante 3 horas a 36,5°C / 5% CO2. Se añadieron 100 pl de isopropanol a cada pocillo. Tras la homogeneización, se lee la absorbancia a 550 nm. Para cada condición, la relación entre la densidad óptica media de las células y la densidad óptica media de los controles negativos determinará el índice de viabilidad.
c) Determinación de la endotelina 1:
El ensayo se realiza utilizando el kit ELISA. A continuación se presentan los resultados de la inhibición de la acción de la endotelina.
[Tabla 5]
Conclusión: La prueba de viabilidad realizada al final del tratamiento no mostró ningún efecto tóxico para las concentraciones probadas.
El ensayo de endotelina-1 se realiza en sobrenadantes celulares a concentraciones no tóxicas. La cantidad de endotelina-1 en cada condición se determinó utilizando el kit ELISA.
Para las células de control de nivel basal, los valores se sitúan en torno a 134,94 pg/ml. Para las células tratadas con diferentes concentraciones de hidrolizado, el nivel basal se reduce en 47,09 pg/ml (con un 2% del extracto según la invención) y se reduce en 17,58 pg/ml (con un 1% del extracto según la invención). Esto demuestra una inhibición muy significativa a partir del 1% del extracto según la invención con aproximadamente un 13% de inhibición de la producción de endotelina de tipo 1 y hasta un 34,90% de inhibición con un 2% del extracto según la invención.
Los resultados sobre la endotelina y su inhibición específica dependiente de la dosis demuestran que el hidrolizado proteico según la invención tiene un efecto antiangiogénico y antifibrótico, debido a su capacidad para disminuir significativamente la endotelina.
A continuación se describe un estudio adicional para la evaluación de P1, P2, P3 y el complejo P1 P2 descrito en el Ejemplo 12 sobre la producción de endotelina: Modelo de ensayo celular en células endoteliales humanas normales.
Como se describe en el Ejemplo 12, se aislaron 3 bandas o fracciones proteicas caracterizadas por su masa P1 (tiene un peso molecular de menos de 10.000 Da), P2 (tiene un peso molecular de entre 10.000 y 17.000 Da) y finalmente P3 (tiene un peso molecular de aproximadamente 23.000 Da) a partir del hidrolizado según la invención. Estas fracciones también se denominarán en lo sucesivo "extractos".
[Tabla 6]
En todas las concentraciones, las desviaciones estándar son elevadas, y la fracción P1 del hidrolizado proteico no muestra una modulación significativa sobre la endotelina de tipo I.
[Tabla 7]
A concentraciones del 0,1% y del 1%, las desviaciones estándar son altas, y la fracción P2 del hidrolizado proteico no muestra modulación significativa sobre la endotelina de tipo I a estas concentraciones. A una concentración del 0,3%, el P2 inhibe la producción de endotelina de tipo I en un 24,8%.
[Tabla 8]
En todas las concentraciones, las desviaciones estándar son elevadas, y la combinación de fracciones P1 P2 no muestra una modulación significativa sobre la endotelina de tipo I.
[Tabla 9]
A concentraciones del 0,3% y del 1%, la fracción P3 del hidrolizado proteico inhibe muy significativamente la producción de endotelina de tipo I en aproximadamente un 50%.
Conclusión: Los compuestos denominados "Extracto P1" y "Extracto P2" no tienen ninguna acción significativa sobre la modulación de la endotelina de tipo 1 y sólo el "Extracto P3" reduce significativamente la endotelina 1 liberada en el medio de cultivo por las células endoteliales humanas normales en cultivo en monocapa, con una puntuación de 52,3% de inhibición con 0,3% del extracto según la invención. No se observa sinergia cuando se combinan P1 y P2.
El extracto de P3 demuestra específicamente actividad anticancerígena (BAGNATO A. et al., 2011, Role of the endothelin axis and its antagonists in the treatment of cancer, British Journal of Pharmacology, 163:. 220-233).
Ejemplo 5: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención en la protección de células madre
Los tejidos adultos, incluyendo la epidermis de la piel, el epitelio gastrointestinal y el sistema hematopoyético, tienen una alta tasa de recambio celular. El procedimiento fisiológico de mantenimiento de la homeostasis tisular se atribuye al mantenimiento de un número constante de células en la renovación de los órganos. Las ESC (células madre embrionarias) son esenciales para el mantenimiento y la regeneración del tejido cutáneo.
La epidermis se desarrolla a partir del ectodermo embrionario superficial. Comienza como una capa única de células progenitoras no especificadas que cubre el embrión tras la neurulación y se desarrolla en la capa basal epidérmica. La capa epidérmica basal está enriquecida con CME (células madre epidérmicas). Las células de esta capa dan lugar a todas las estructuras epidérmicas, incluida la epidermis estratificada (también conocida como epidermis interfolicular) y los apéndices epidérmicos, como los folículos pilosos, las glándulas sebáceas y las glándulas sudoríparas. La dermis subyacente deriva principalmente del mesodermo situado bajo el ectodermo. El mesodermo es la principal fuente de células madre mesenquimales, que dan lugar a fibroblastos productores de colágeno, adipocitos subcutáneos y células inmunitarias de la piel.
Las células madre son células indiferenciadas conocidas como células pluripotentes con un genotipo joven capaz de autorrenovarse y diferenciarse para producir un órgano o tejido, como la piel. En esta fase, se identifican como "células multipotentes". Dado que el 50% de la progenie de la población de células madre permanece indiferenciada, éstas contribuyen a preservar la homeostasis y garantizan la renovación de las células diferenciadas dañadas o senescentes. Estas células madre epidérmicas se ven frecuentemente afectadas por el medio ambiente. El estrés oxidativo, como la contaminación o la radiación ultravioleta, daña su ADN según YEJIN GE et al. (10 de marzo de 2020, The aging skin microenvironment dictates stem cell behavior, PNAS, Vol. 117, pp. 5339-5350). Este daño altera su capacidad de autorrenovación y diferenciación, lo que provoca una reducción del conjunto de células madre y, en última instancia, el envejecimiento de la piel.
El objetivo del estudio es evaluar el efecto del hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención sobre la protección de las células madre epidérmicas frente a la irradiación UVB.
Protocolo: Se obtuvieron células de queratinocitos humanos de un donante de 62 años. Para llevar a cabo los experimentos, se cultivaron queratinocitos en monocapas hasta que alcanzaron el 80% de confluencia.
A continuación, el cultivo celular se enriqueció con células madre epidérmicas siguiendo el procedimiento descrito por GOODELL, M. et al. (1996, Hoescht 33342 HSC staining and stem cell purification protocol Journal of Experimental Medicine 183, pp. 1797-806).
Producto de referencia: La quercetina a 1 pM se utilizó como producto de referencia en este estudio. La quercetina se adquirió en Sigma Aldrich.
Las células se preincubaron durante 24 horas en ausencia ("Control") o presencia del producto de referencia o concentración creciente del compuesto de ensayo. Al final del periodo de preincubación, las células se irradiaron con UVB (30mJ / cm2) y luego se incubaron durante 8 días a 37°C en ausencia (testigo) o presencia del producto de referencia o aumentando la concentración del compuesto de ensayo.
"Hidrolizado de proteínas deperegrina":0,01; 0,05 y 0,15% (v/v).
Preparación del compuesto de ensayo:
El compuesto de ensayo "hidrolizado de proteínas de peregrina"se diluyó directamente en el medio de incubación para alcanzar las diferentes concentraciones descritas anteriormente.
Al final del periodo de incubación, se midió la viabilidad celular utilizando azul de Alamar, un indicador de viabilidad no citotóxico basado en la reducción de rezazurina por las mitocondrias. Cada condición experimental se realizó por triplicado (n = 3).
Los resultados se presentan a continuación como porcentaje de viabilidad en comparación con la condición experimental "Control sin UVB" (media /- D.S.). El nivel de significación entre "Control sin UVB" y "Control con UVB" se evaluó mediante una prueba t de Student (p <0,05).
[Tabla 101
Conclusión: El hidrolizado de proteínas deperegrinapuede proteger significativamente las células madre de piel humana sometidas a estrés celular (UV). Las células madre son células con material de ADN joven conservado. Son responsables de la regeneración de los tejidos y del retorno a un estado joven y sano. La protección de las células madre está relacionada con la capacidad de preservar el material de ADN. El hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención mantiene la integridad de las células madre; participa así en la conservación del ADN.
Ejemplo 6: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención en la conservación del ADN.
La dinámica de la longitud de los telómeros es muy importante para la regulación de la vida útil replicativa en las células, particularmente en especies longevas. El acortamiento de los telómeros y la actividad de la telomerasa son factores importantes en el envejecimiento y la tumorigénesis (SHAY, J. W. & WRIGHT, W. E., 2005, Senescence an Immortalization:). Role of Telomeres and Telomerase, Carcinogenesis 26(5), pp. 867-874). Los telómeros son secuencias complejas de nucleótidos que protegen los extremos de los cromosomas de la degradación, la fusiónrecombinación no deseada y la activación inapropiada en respuesta a daños en el ADN. También desempeñan un papel esencial en la división celular y la estabilidad cromosómica. Cada vez hay más pruebas de que la estabilidad y la longitud media de los telómeros pueden verse afectadas por el estrés, en particular por el estrés ambiental o por enfermedades bajo influencia ambiental (VALDES, A.L. et al., julio de 2005, Obesity, cigarette smoking and telomere length in women, Research Letters,366(9486), pp. 662-664; PHILLIPS A.C. et al., 2013, Do symptoms of depression predict telomere length?. Evidence from the West of Scotland Twenty-07 Study, Psychosomatic Medicine, 75(3), pp.
288-296; SHIN, D. et al. Mayo de 2019, Effects of inflammation and depression on telomere length in young adults in the United States, Journal of Clinical Med 2019, 8(5), p. 711; SALIQu Es , S. et al., octubre de 2010, Telomer length and cardiovascular disease, Archives of Cardiovascular Diseases, 103(8-9), pp. 454-459). Los telómeros extremadamente cortos se han asociado a enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares (ECV) y al riesgo de cáncer.
La telomerasa es una ribonucleoproteína que cataliza la adición de repeticiones teloméricas a los extremos de los telómeros. Los telómeros son largos tramos de secuencias repetidas que cubren los extremos de los cromosomas y se cree que estabilizan el cromosoma. En los seres humanos, los telómeros suelen tener una longitud de entre 7 y 10 kb e incluyen varias repeticiones de la secuencia - TTAGGG-.
La telomerasa no se expresa en la mayoría de las células adultas y la longitud de los telómeros disminuye con los sucesivos ciclos de replicación. Tras un cierto número de ciclos de replicación, el acortamiento progresivo de los telómeros hace que las células entren en una fase de crisis telomérica, que a su vez conduce a la senescencia celular. Ciertas enfermedades se asocian a una rápida pérdida de telómeros, lo que conduce a una senescencia celular prematura. Se ha demostrado que la expresión del gen que codifica la proteína telomerasa humana en células humanas (BLASCO M., 2007, Telomere Length, Stem Cells and Aging, Nature Chemical Biology, 3(10), pp. 640-649) confiere un fenotipo de calidad constante, probablemente eludiendo la vía de senescencia natural de las células. Además, en el estudio mencionado se demostró que la expresión del gen de la telomerasa en células envejecidas con telómeros cortos produce un aumento de la longitud de los telómeros y restaura un fenotipo generalmente asociado a células más jóvenes.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del compuesto denominado "hidrolizado de proteínas de peregrina"sobre el acortamiento de los telómeros en un modelo compuesto por fibroblastos humanos normales en cultivo en monocapa. Es bien sabido que el telómero corresponde a un reloj biológico. La longitud de los telómeros disminuye progresivamente con la división celular, lo que finalmente conduce a una célula incapaz de replicarse. La longitud de los telómeros se midió mediante PCR cuantitativa y se comparó con la longitud de los telómeros entre las células de los pasajes 2 y 5.
Protocolo: Se obtuvieron células de fibroblastos humanos de un donante de 44 años. Para llevar a cabo los experimentos, se utilizaron células en los pasajes 2 y 5. Se cultivaron fibroblastos durante 3 pases consecutivos en ausencia (control) o presencia de una concentración creciente a ensayar de hidrolizado de proteínas deperegrina:.0,01; 0,1 y 0,5% (v/v).
Preparación del compuesto de ensayo: El compuesto de ensayo "hidrolizado de proteínas de peregrina"se diluyó directamente en el medio de incubación para alcanzar las diferentes concentraciones descritas anteriormente.
Al final de la incubación, se tripsinizaron las células. El ADN se extrajo de las células utilizando un kit específico de extracción de ADN. El ADN se cuantificó mediante nanodrop.
La longitud de los telómeros se midió mediante PCR cuantitativa (q-PCR). Para cada muestra, la variación en la longitud de los telómeros se midió mediante cuantificación relativa utilizando el gen SCR (single copy reference) como gen de referencia. Para cada muestra, se realiza una q-PCR utilizando un conjunto de cebadores de telómeros que reconoce y amplifica secuencias de telómeros y una segunda q-PCR utilizando el conjunto de cebadores SCR que reconoce y amplifica una región de 100 pb en el cromosoma 17 humano y sirve como referencia para la normalización de los datos.
Los resultados se expresan en unidades relativas correspondientes a la longitud de los telómeros en relación con las células en la etapa 2 (media ± D.S.). El nivel de significación frente al "Control" en los pasajes 2 y 5 se evaluó mediante una prueba t de Student (*: p <0,05). El nivel de significación entre el "control" y el "compuesto de ensayo" se evaluó independientemente para cada producto mediante un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía seguido de una prueba de Holm-Sidak (*: p <0,05).
[Tabla 11]
Resultados: En nuestras condiciones experimentales, el hidrolizado de proteínas deperegrinaprobado al 0,05%, 0,1% y 0,5% (v / v), disminuyó significativamente el acortamiento de los telómeros en fibroblastos humanos normales.
El acortamiento de los telómeros mostró inhibición (en comparación con el control) al 0,05% (v / v) en 8,9% (p <0,05); al 0,1% (v / v) en 15,1% (p <0,01) y al 0,5% (v / v) en 16,6% (p <0,01). Conclusión: En un contexto de multiplicación o división normal de células humanas, el hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención demuestra una capacidad para aumentar significativamente la longitud de los telómeros. Los telómeros son tapones que intervienen en la protección del material de ADN; un aumento de la longitud de los telómeros se correlaciona con la capacidad de preservar el material de ADN. El hidrolizado de proteínas deperegrinapuede aumentar la longitud de los telómeros. Por tanto, este hidrolizado interviene en la conservación del material genético humano (ADN).
Estudio adicional de la evaluación de los extractos P1, P2, P3 y el complejo P1+P2 descrito en el Ejemplo 12 sobre su capacidad para proteger el ADN aumentando la longitud de los telómeros tras varias divisiones celulares.
[Tabla 12]
El extracto P1 según la invención tras 3 divisiones celulares a partir de la concentración del 0,3% aumenta el tamaño de los telómeros en un 24,3% en un modelo de cultivo de células humanas normales (fibroblastos). A una concentración del 1%, el extracto P1 aumentó el tamaño de los telómeros en un 39,6% en las mismas condiciones.
[Tabla 13]
El extracto P2 según la invención después de 3 divisiones celulares en un modelo de cultivo celular humano normal (fibroblastos) muestra una tendencia estadísticamente no confirmada hacia el alargamiento de los telómeros para cada concentración ensayada.
[Tabla 14]
El extracto de P3 según la invención después de 3 divisiones celulares en un modelo de cultivo celular humano normal (fibroblastos) no muestra capacidad para promover el alargamiento de los telómeros para cada concentración ensayada.
[Tabla 15]
La mezcla de los extractos P1 y P2 (50/50 en volumen) según la invención después de 3 divisiones celulares a la concentración del 1% (es decir, 0,5% de cada extracto) aumenta el tamaño de los telómeros en un 49,1% en un modelo de cultivo celular humano normal (fibroblastos). Como los extractos individuales no alcanzaron esta puntuación, se demostró un efecto sinérgico mezclando los extractos P1 y P2.
Conclusión: Los compuestos denominados "Extracto P1" y "Extracto P1 P2" redujeron significativamente el acortamiento de los telómeros tras 3 pases celulares consecutivos. La sinergia se confirma combinando P1 y P2.
Ejemplo 7: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención en la estimulación de la proteína ZAG.
La alfa-2-glicoproteína de zinc (ZAG) es una glicoproteína plasmática que deriva su nombre de su movilidad electroforética y capacidad para ser precipitada por sales de Zn. La ZAG pertenece a la superfamilia de genes de las inmunoglobulinas y tiene una estructura tridimensional muy homóloga a las moléculas MHC de clase I y II. La ZAG se detectó inmunohistoquímicamente en células epiteliales secretoras normales de mama, próstata e hígado, en glándulas salivales, bronquiales, gastrointestinales y sudoríparas y en epitelios estratificados normales, incluida la epidermis. El ARNm de z Ag permanece uniformemente distribuido en diferentes tipos celulares (FREIJE, J. P et al., 1991, Human Zn-a2-Glycoprotein cDNA Cloning and Expression Analysis in Benign and Malignant Breast Tissues, FEBS Letters 290 (1-2), pp. 247-249). Como resultado de su producción por el epitelio secretor, la ZAG está presente en la mayoría de las secreciones corporales, constituyendo el 2,5% de las proteínas de la saliva y el 30% de los fluidos seminales. Se ha descrito que los niveles plasmáticos o séricos de ZAG varían con la edad, habiéndose notificado valores que oscilan entre 0,9 y 3,5 mg/dl (feto) y 7,8 y 12,1 mg/dl (adultos jóvenes) (JIRKA, M. et al., 1974, The Znalpha 2-Glycoprotein Level in Human Serum During Ontogenesis.). Clinica Chimica Acta 56, pp. 31-33; JIRKA, M. et al., 1978, Human Serum Zn-a2-Glycoprotein in Amniotic Fluid, Clinica Chimica Acta 85, pp. 107-110). La ZAG se acumula en los fluidos quísticos mamarios hasta una concentración plasmática de 30 a 50 veces mayor (BUNDRED et al., 1987, An Immunohistochemical Study of the Tissue Distribution of the Breast Cyst Fluid Protein, Zinc Alpha2-Glycoprotein, Histopathology 11, pp. 603-610; DIEZ-ITZA, I. et al., 1993, Zn-a2-Glycoprotein Levels in Breast Cancer Cytosols and Correlation with Clinical, Histological, and Biochemical Parameters, European Journal of Cancer 29A, pp. 1256-1260) y se sobreexpresa en el 40-50% de los carcinomas de mama. Recientemente se ha demostrado (SUSAN, M. el al., Zinc-alpha2-glycoprotein Expression as a Predictor of Metastatic Prostate Cancer Following Radical Prostatectomy, 2006, Journal of the National Cancer Institute, Volume 98(19), pp. 1420-1424) que la ZAG es producida en cantidad por la mayoría de los carcinomas de próstata, lo que conduce a niveles séricos elevados de ZAG en pacientes con cáncer de próstata y carcinomas basocelulares. El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad del hidrolizado de proteínas deperegrinapara estimular la ZAG.
Protocolo: Los queratinocitos humanos normales se aíslan del prepucio y se cultivan en placas de 24 y 96 pocillos según procedimientos propios.
Esto implica permitir que las muestras a concentraciones definidas actúen sobre los queratinocitos al 80% de confluencia durante 48 horas, y después cuantificar los ZAG usando el kit ELISA en los sobrenadantes celulares.
Se lleva a cabo un ensayo de viabilidad preliminar para definir las dosis no tóxicas que se utilizarán al ensayar ZAG. El control negativo se realiza utilizando células en medio de cultivo sin tratamiento. El control positivo para la prueba de viabilidad es 0,5% SDS.
Todas las condiciones se preparan en medios de cultivo, y a continuación las células se incuban a 36,5°C / 5% CO2 durante 24 horas para el ensayo de viabilidad y 48 horas para el ensayo ZAG.
• Aplicación de soluciones de ensayo a los queratinocitos:
o<Los productos a ensayar se ponen en contacto con queratinocitos en subconfluencia en placas de>24 y 96 pocillos.
o<Para cada concentración, la prueba se realiza en 3 pocillos.>
o<Las placas se incubaron durante 24 horas y 48 horas a 36,5°C / 5% CO2.>
• Prueba de viabilidad:
o<La viabilidad celular se evaluó mediante el procedimiento MTT en las células tras la incubación con>los productos.
o<Tras 24 y 48 horas de incubación, los pocillos se enjuagaron 1 vez con 200|jL de PBS.>
o<Añadir 50 j l de solución de MTT 0,5 mg/ml a cada pocillo e incubar durante 3 horas a 36,5°C / 5%>CO2.
o<Añadir 100 j l de isopropanol a cada pocillo.>
o<Tras la homogeneización, se lee la absorbancia a 550 nm.>
o<Para cada condición, la relación entre la densidad óptica media de las células y la densidad óptica>media de los controles negativos determinará el índice de viabilidad.
• Determinación de las proteínas ZAG:
o<Tras 48 horas de incubación, se recogieron todos los sobrenadantes y se almacenaron a -20°C para>los ensayos.
o<La prueba se realiza mediante un kit ELISA. Los resultados se muestran a continuación.>
[Tabla 16]
Conclusión: El hidrolizado de proteínas deperegrinapuede aumentar significativamente la producción de ZAG, con buena dependencia de la dosis y baja toxicidad en células humanas. Por lo tanto, tiene un efecto antifibrótico y antiinflamatorio basado en su capacidad para aumentar significativamente la ZAG.
A continuación se describe un estudio adicional de la estimulación de ZAG a partir de las bandas de proteínas identificadas en el Ejemplo 12 en queratinocitos humanos normales.
[Tabla 17]
El extracto P1 a partir del 0,2% aumenta significativamente la producción de ZAG en más de un 107%.
[Tabla 18]
El extracto P2 a partir del 0,2% aumenta significativamente la producción de ZAG en más del 80%.
[Tabla 19]
El extracto P3 no tiene la capacidad de influir significativamente en la producción de ZAG en este modelo de estudio.
[Tabla 20]
La combinación de los extractos P1 y P2 mostró una tendencia hacia la activación de la producción de ZAG, pero esta tendencia no fue estadísticamente significativa. Por lo tanto, no existe ningún efecto sinérgico en la combinación de los extractos P1 y P2.
Los compuestos denominados "Extracto P1" y "Extracto P2" aumentan significativamente la ZAG liberada en medio de cultivo por queratinocitos humanos normales en cultivo en monocapa, pero no se observa sinergia al combinar P1 y P2.
Conclusión: En el extracto hidrolizado según la invención, el extracto P1 es el más eficaz para aumentar la ZAG. Por lo tanto, tiene un efecto antifibrótico y antiinflamatorio a dosis tan bajas como el 0,2%.
Ejemplo 8: Efecto del hidrolizado de proteínas de peregrina según la invención en la modulación de la dosificación de DKK1 y DKK3.
La implicación de las interacciones melanocito-fibroblasto en la regulación de la melanogénesis es bien conocida y se ha estudiado intensamente. Aunque estas interacciones aún no se conocen del todo, son las responsables de la "blancura" de las zonas palmoplantares y actualmente se utilizan en dermatología para el desarrollo de productos despigmentantes. Yamaguchi y colegas (YAMAGUCHI Y et al., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: El aumento de la expresión de Dickkopf por los fibroblastos palmoplantares inhibe el crecimiento y la diferenciación de los melanocitos, Journal of Cell Biology 165(2), p. 275-285) demostró que un mensajero soluble producido por los fibroblastos de las regiones palmoplantares, era capaz de modificar el programa de diferenciación de los melanocitos de estas regiones, provocando una disminución de la producción de melanina. Este mensajero fue identificado por el equipo como una proteína llamada Dikkopf-1 (DKK-1).
Las vías de señalización utilizadas por DKK-1 para producir estos resultados están bien identificadas en la actualidad. Gracias a su acción antagonista sobre el receptor Wnt, el DKK-1 es capaz de cortocircuitar las vías de señalización intracelular activadas por la p-catenina, responsables en general de la regulación de los genes implicados en la melanogénesis. Yamaguchi y colegas (véasesupra)también han demostrado que DKK-3, una molécula como DKK-1 pero sin efecto sobre el receptor Wnt, podría desempeñar un papel regulador sobre el efecto de DKK-1. De hecho, cuanto mayor es la cantidad de DKK-3 en las proximidades de este receptor Wnt, más débiles son las interacciones entre el DKK-1 y este receptor. El aumento de DKK3 reduce los efectos inhibidores de DKK-1 sobre la melanogénesis. El trabajo de Yamaguchi y colegas (véasesupra)sugiere además que la identificación de agentes que influyan en la relación DKK1 / DKK3 en cultivos de fibroblastos dérmicos humanos normales de origen no palmoplantar permitiría controlar la producción de melanina a partir de melanocitos humanos normales no palmoplantares.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del hidrolizado de proteínas deperegrinasobre la síntesis y liberación de DKK-1 en un modelo compuesto por fibroblastos humanos normales en cultivo en monocapa.
Protocolo: Las células de fibroblastos humanos se obtienen de un donante de 68 años. Para realizar los experimentos, los fibroblastos se cultivan en monocapas hasta alcanzar la confluencia. La dexametasona a 100 nm se utilizó como inductor de referencia de la síntesis y liberación de DKK-1. Los discos cutáneos se incubaron durante 48 horas en ausencia (control) o presencia del producto de referencia o del producto de ensayo: "Hidrolizado de proteínas deperegrina":0,01; 0,1 y 0,5% (v/v).
Al final de la incubación, se retiraron los medios de incubación para realizar la medición de la liberación de DKK-1.
El compuesto de ensayo "hidrolizado de proteínas de peregrina"se diluyó directamente en el medio de incubación para alcanzar las diferentes concentraciones descritas anteriormente.
Al final del periodo de incubación de 48 h, se cuantificó la DKK-1 liberada en los medios de incubación utilizando un kit ELISA sensible y específico.
Al final del periodo de incubación, las proteínas contenidas en los lisados celulares se cuantificaron mediante un procedimiento espectrocolorimétrico (procedimiento de Bradford).
Los resultados se expresan como ng DKK-1 por mg de proteína (media ± D.S.).
El nivel de significación entre el "control" y el "producto de referencia" se evaluó mediante una prueba t de Student (p <0,05).
El nivel de significación entre "Control" y "producto de prueba" se evaluó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía) seguido de una prueba de Holm-Sidak (p <0,05).
En nuestras condiciones experimentales, el producto de referencia denominado "Dexametasona", ensayado a 100 nm, aumentó significativamente el DKK-1 liberado en un 181,8% (p <0,01) en comparación con el "Control". A continuación se presentan los resultados sobre la modulación de la dosis de DKK1.
[Tabla 21]
El estudio muestra que el hidrolizado según la invención aumenta significativamente el nivel de DKK1 a la dosis del 0,05% con un aumento del 26,1% en comparación con el nivel basal y a la concentración del 0,5% del extracto según la invención se observa un aumento del 131,5% del nivel basal.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del hidrolizado de proteínas deperegrinasobre la síntesis y liberación de DKK-3 en un modelo compuesto por fibroblastos humanos normales en cultivo en monocapa. Las células de fibroblastos humanos se obtuvieron de un donante de 68 años. Para realizar los experimentos, los fibroblastos se cultivaron en monocapas hasta alcanzar la confluencia. Las células de fibroblastos humanos se obtuvieron de un donante de 68 años. Para realizar los experimentos, los fibroblastos se cultivaron en monocapas hasta alcanzar la confluencia.
Al final del periodo de incubación de 48 h, se cuantificó la DKK-3 liberada en los medios de incubación utilizando un kit ELISA sensible y específico.
Al final del periodo de incubación, las proteínas contenidas en los lisados celulares se cuantificaron mediante un procedimiento espectrocolorimétrico (procedimiento de Bradford).
Los resultados se expresan como ng DKK-3 por mg de proteína (media ± D.S.). El nivel de significación entre el "Control" y el "Producto de referencia" se evaluó mediante una prueba t de Student (*: p <0,05).
El nivel de significación entre "Control" e hidrolizado de proteínas deperegrinase evaluó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía) seguido de una prueba de Holm-Sidak (*: p <0,05). A continuación se presentan los resultados sobre la modulación de la dosis de DKK3.
[Tabla 22]
Conclusión: El hidrolizado al 0,5% de proteínas deperegrinasegún la invención exhibe una notable inhibición del orden del 21% de DKK3 en comparación con el nivel basal. El hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención tiene una fuerte capacidad para gestionar genes implicados en la diferenciación celular gracias al principio de inhibición palmo-plantar (vía de señalización beta-catenina), a través de su capacidad para aumentar significativamente DKK1 y disminuir significativamente DKK3, aumentando así la relación DKK1/DKK3.
Estudio adicional de la evaluación de P1, P2, P3 y el complejo P1+P2 descrito en el Ejemplo 10 sobre la producción de DKK1: Modelo de ensayo celular en fibroblastos humanos normales.
[Tabla 23]
El extracto P1 aumentó significativamente la producción de DKK1 en un 26,6% a una dosis del 0,3%, y en un 27,8% a una dosis del 1%.
[Tabla 24]
El extracto P2 no aumentó de forma estadísticamente significativa la producción de DKK1 en ninguna de las dosis probadas.
[Tabla 25]
El extracto P3 no aumentó de forma estadísticamente significativa la producción de DKK1 en ninguna de las dosis probadas.
[Tabla 26]
La combinación de los extractos P1 y P2 en la dosis del 1% (es decir, 0,5% para cada extracto) aumenta significativamente la producción de DKK1 en más del 39%. Esta puntuación es superior a la obtenida con el extracto P1 o P2 solos; esto refleja, por tanto, un efecto sinérgico de la combinación de los dos extractos P1 y P2.
Conclusión: Los compuestos denominados "Extracto P1" y "Extracto P1 P2" aumentaron significativamente la DKK-1 liberada al medio de cultivo por los fibroblastos humanos normales en cultivo en monocapa. La sinergia se confirma mezclando P1 y P2.
Conclusión de las actividades anteriores del hidrolizado proteico según la invención:
La actividad más destacable del hidrolizado proteico deperegrinademostrada en ensayosin celluloes su acción epigenética con su capacidad para ralentizar muy significativamente el procedimiento de acortamiento de los telómeros tras las divisiones celulares. El hidrolizado protege las células, en particular las células madre, lo que lo convierte en un excelente regenerador de células y tejidos. Estas propiedades proporcionan una protección muy fuerte para el ADN y su material genético. El hidrolizado de proteínas deperegrinatambién es un potente modulador de la producción de ZAG y endotelina tipo I, con un efecto antifibrótico y antiinflamatorio.
Ejemplo 9: Evaluación del efecto del hidrolizado proteico de torta delipidada deperegrinasobre la angiotensina convertasa 2 (ACE2) - acelular de células del efecto inhibidor.
La angiotensina convertasa 2 está notablemente implicada en la infección intracelular de COVID19 tras la activación de spikes proteicos por otras convertasas y más particularmente furina, véase PETER BRADDING et al. (ACE, TMPRSS2, and furin gene expression in the airways of people with asthma - implications of COVID-19, JOURNAL ALLERGY CLINICAL IMMUNOLOGY, July 2020, n°146(1), p. 206-211 ).
[Tabla 27]
Conclusión: El extracto hidrolizado detorta de peregrinano participa significativamente en la inhibición directa de la angiotensina convertasa 2 (ACE2). Considerando la tabla [32] en el ejemplo 11 a continuación, se evaluó la amplitud de acción de este extracto sobre otra convertasa, la furina. La acción inhibidora del extracto según la invención sobre la furina está claramente demostrada y establecida en la tabla [32] del ejemplo 11. Esta inhibición específica demostrada sobre una sola enzima convertasa refuerza el interés del hidrolizado proteico según la invención como inhibidor específico de la furina convertasa.
Ejemplo 10: Evaluación del efecto antiinfeccioso del extracto hidrolizado para inhibir la furinain cellu loimpidiendo la penetración del "pseudovirus de corona spike SARS-CoV-2 ": modeloin cellu loen células humanas HEK en presencia de "Lentivirus pseudotipado SARS-CoV-2".
Esta evaluación utiliza dos componentes principales. Por un lado, las células HEK293 estables clonales recombinantes expresan constitutivamente ACE2 humana de longitud completa (Genbank # NM_021804.3) con expresión superficial de ACE2 confirmada por citometría de flujo. Además, se produjeron lentivirus pseudotipados de SARS-CoV-2 Spike utilizando SARS-CoV-2 Spike (número de acceso al Genbank QHD43416.1) como glicoproteína de envoltura en lugar de la VSV-G utilizada habitualmente. Estos pseudoviriones también contienen el gen de la luciferasa de luciérnaga dirigido por un promotor de CMV; por lo tanto, la entrada celular mediada por espigas puede medirse convenientemente mediante la actividad reportera de la luciferasa. El lentivirus pseudotipado SARS-CoV-2 Spike puede utilizarse para cribar aplicaciones en una instalación de bioseguridad de nivel 2.
El hardware utilizado es el siguiente:
[Tabla 28]
Primera etapa: Colocación de células ACE2-HEK
Las células ACE2-HEK se descongelan en medio de descongelación 1, se amplifican en medio de crecimiento 1N, después se cosechan y se siembran en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano blanco y transparente a 10.000 células / pocillo en 50 pl de medio de descongelación 1. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C.
Segunda etapa: Prueba de infección lentiviral pseudotipada
Al día siguiente, se valida el control visual de la homogeneidad e integridad de la capa celular utilizando un microscopio invertido y se preparan los siguientes ingredientes de ensayo de acuerdo con las siguientes instrucciones:
[Tabla 29]
En una primera etapa, el hidrolizado de proteínas deperegrinase diluye a una concentración intermedia 11x en medio de descongelación 1, para la posterior transferencia de 5 pl a la placa de ensayo y coincubación con células ACE2-HEK. Tras un periodo de incubación de 30 minutos a 37°C, se añadieron 5 pl de lentivirus pseudotipados no diluidos (Desnudo o S1-Spike) a los pocillos de ensayo correspondientes.
Como control positivo, se utiliza mAb bloqueante de ACE2 a una concentración final de 0,5 uM en pocillos de ensayo.
Tercera etapa:
Tras un periodo de incubación de 48 horas, se añade un volumen de 50 pl de reactivo de luciferasa a los pocillos de ensayo y se mide la señal luminiscente utilizando el luminofluorímetro PolarStar Omega.
En la Figura 1 se dan resultados para el efecto antiinfeccioso del hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención frente a pseudoviriones COV2 del SARS.
Conclusión: El hidrolizado de proteínas deperegrinamuestra un efecto antiinfeccioso convincente sobre los pseudoviriones COV2 del SRAS a partir de una dosis del 3% (C1) en este modelo de estudio. Se ha demostrado una marcada inhibición del 60% a la concentración C1 (3%).
Evaluación de las bandas P1, P2, P3 identificadas en el Ejemplo 12 y del complejo P1+P2 en la Furina convertasa: Modelo de ensayo sin células.
Los estudios realizados sobre las bandas identificadas no mostraron ninguna acción inhibidora sobre la furina convertasa sobre todas las concentraciones probadas con P1, P2, P3 y P1+P2.
Conclusión: Por lo tanto, la actividad inhibidora de la Furina Convertasa no es transportada por una de estas bandas de proteínas. Esto demuestra que la actividad inhibidora de la Furina Convertasa se debe al hidrolizado proteico en su totalidad obtenido por el procedimiento descrito.
El hidrolizado proteico en su conjunto inhibe las proteínas SPIKE similares a SARS-CoV2, en particular a través de la inactivación de la furina convertasa. Estas inhibiciones proporcionan propiedades antiinfecciosas y virostáticas.
Ejemplo 11: Ensayos comparativos de inhibición de la furina convertasa por diferentes preparados obtenidos a partir de semillas de Moringa peregrina.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto inhibitorio del aceite deperegrinaobtenido por primera presión en frío de semillas con cáscaras, y a continuación extracto deperegrinamediante etanol (96%) concentrando aproximadamente el 1.1% de materia seca, estando esta materia seca constituida a su vez por aproximadamente un 55% en peso de 2,5-dififormilfurano, un 2,5% de furfural, un 1,2% de miristato de isopropilo, un 4,7% de ácido palmítico, un 11,1% de ácido oleico y un 25,8% de triglicéridos, y por últimoperegrinahidrolizado proteico según la invención sobre la actividad de la furina.
Protocolo: El extracto en etanol (96%) deperegrinay el hidrolizado de proteínas deperegrinase almacenaron a 4 ° C, protegidos de la luz hasta su uso. El aceite deperegrinase almacenó a temperatura ambiente en una zona oscura.
El producto de referencia Decanoil-Arg-Val-Lys-Arg-CMK a 100 nm se utilizó como inhibidor de referencia de la actividad de furina.
Protocolo de incubación: La furina se preincubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en ausencia (Control) o en presencia del producto de referencia o de concentraciones crecientes de los compuestos de ensayo:
• Aceite dePeregrinaal 0,3, 1% y 3% (v/v).
• Extracto deperegrinacon etanol (96%) al 0,02%, 0,2% y 2% (v/v).
• Hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención al 0,02%, 0,2% y 2% (v/v). Al final de la etapa de preincubación, se añadió un sustrato de furina y las condiciones experimentales se incubaron de nuevo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 minutos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Preparación de compuestos: El extracto etanólico al 96% deperegrinay el hidrolizado proteico deperegrinase solubilizaron directamente en el tampón de ensayo y, a continuación, se diluyeron hasta alcanzar la concentración a ensayar, tal como se ha descrito anteriormente. El aceite deperegrinase solubilizó al 3% en una solución al 0,05% de Tween20 en tampón de ensayo. A continuación, la solución se diluyó hasta alcanzar la concentración descrita anteriormente.
Protocolo de evaluación: La escisión del sustrato de furina fluorescente se controló durante 5 min tras la adición del sustrato mediante la lectura de la fluorescencia a 485 nm / 535 nm. g. Estadísticas: Los resultados se expresan en RFU (Unidades Fluorescentes Relativas) /- D.S. (Desviación típica). La significación estadística de la diferencia observada entre los grupos "Control" y "Producto de referencia" se evaluó mediante una prueba t de Student (p<0,001). La significación estadística de la diferencia observada entre los grupos "Control" y "Compuesto de prueba" se evaluó mediante un análisis ANOVA unidireccional, seguido de una prueba de HolmSidak (p<0,05). Los resultados para el aceite deperegrinase dan en la Figura 2, los del extracto de etanol de 96°peregrinaen la Figura 3 y finalmente los del hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención en la Figura 4.
Resultados:
[Tabla 30]
[Tabla 31]
[Tabla 32]
Conclusión: El presente estudio nos ha permitido demostrar que sólo el hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención puede inhibir significativamente la actividad de la furina en un 98,8% a una concentración del 2%.
Ejemplo 12: Cromatografía separativa por electroforesis en gel de hidrolizado de proteínas de peregrina -Bandas de proteínas.
La electroforesis en gel de poliacrilamida que contiene dodecisulfato de sodio se denomina electroforesis SDS-PAGE. Esta técnica consiste en hacer que las proteínas desnaturalizadas por saturación de carga negativa migren a través del SDS en un gel de poliacrilamida bajo la influencia de un campo eléctrico, lo que permite separarlas. Se trata de una técnica de desnaturalización que disocia los complejos proteicos no covalentes utilizando un detergente iónico cargado negativamente (SDS). Este detergente se une indiferentemente por enlaces hidrófobos a dos aminoácidos. Esta técnica permite analizar y separar las proteínas en función de su peso molecular.
Cromatografía separativa por el procedimiento de electroforesis:
Depósitos:
• MW = marcador de tamaño
• pozo 1: Extracto hidrolizado de torta dePeregrina.
•pozo 2: sobrenadante de extracto hidrolizado de torta dePeregrina.
•pozo 3: pellet de extracto hidrolizado de torta dePeregrina.
El extracto hidrolizado del pocillo 1 sí muestra todas las bandas de proteínas esperadas.
El pocillo 2 (sobrenadante) muestra bandas atenuadas notablemente en los pesos moleculares intermedios y más altos; el pocillo 2 parece haber concentrado los pesos moleculares más bajos relacionados notablemente con los volátiles.
El pocillo 3 (pellet) muestra claramente las bandas de mayor peso molecular (> a 75.000 Da), luego una banda llamada P3 de alrededor de 23.000 Da, luego una banda llamada P2 de entre 10.000 y 17.000 Da y finalmente una banda por debajo de 10.000 Da llamada P1, estimada entre 4.000 y 6.000 Da.
Preparación de Rotavapor:
• Los volátiles se encuentran lógicamente en el sobrenadante con los compuestos más "ligeros"; se recuperan 10 ml de sobrenadante para añadir 10 ml de etanol de 96°;
• La mezcla se extrae al vacío a 45°C; los compuestos volátiles se condensan en un matraz de vacío.
• El condensado concentrado en volátiles pasará a GC/FID tras la microextracción SPME.
Estudio de cromatografía de gases tras un procedimiento de extracción SPME en detección FID. No se detectaron compuestos volátiles.
Conclusión: El aislamiento de las bandas de proteínas revela que los compuestos volátiles no están unidos a las proteínas; los compuestos volátiles no forman parte del patrón molecular de las bandas de proteínas más pequeñas.
Determinación de tres bandas de proteínas: Se prepararon las bandas P1 (menos de 10.000 Da), P2 (entre 10.000 y 17.000 Da) y P3 (alrededor de 23.000 Da) y se pasaron por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC MS/MS).
Los resultados se obtienen utilizando 2 paquetes de software bioinformático especializados en el reconocimiento de proteínas en plantas (Mascot y Peaks):
Los resultados de la identificación no permiten identificar con precisión estas proteínas; se trata de proteínas que no están descritas actualmente en las bases de datos mencionadas.
Ejemplo 13: Formulación de un producto dermatológico antifibrótico (limpiador líquido)
[Tabla 31]
Ejemplo 14: Formulación de un producto dermatológico para el tratamiento de la fibrosis tópica (producto de cuidado sin aclarado)
[Tabla 32]
Ejemplo 15: Formulación de una composición inyectable por vía subcutánea
Formulación de un producto para administración subcutánea: extracto seco según la invención (que contiene un 60% de hidrolizado proteico sobre un soporte de inulina) envasado en un vial monodosis bajo gas inerte listo para ser solubilizado por un medio fisiológico.
Ejemplo 16: Formulación de una composición inyectable por vía subcutánea
Formulación de un producto inyectable líquido: extracto líquido según la invención dosificado al 5% en un medio fisiológico acondicionado en condiciones de esterilización en particular por filtración al vacío con un umbral de corte a 0. 45|jm.
Ejemplo 17: Formulación en forma de parche(Apósito o dispositivo médico externo adherido a la piel, impregnado del principio activo que libera lentamente, permitiendo un efecto de difusión lenta del principio activo).
Ejemplo 18: Formulación de un medicamento en cápsulas
Fármaco antifibrótico en cápsula de 750 mg que contiene 100 mg de piperina, 300 mg de extracto seco según la invención (que contiene 60% de hidrolizado proteico en un soporte de inulina), 100 mg de ácido boswélico, 250 mg de carbonato cálcico).
Ejemplo 19: Formulación de un medicamento en comprimidos
Medicamento antifibrótico en comprimido de 1 g: 300 mg de extracto seco según la invención (que contiene un 60% de hidrolizado proteico en un soporte de inulina), 400 mg de carbonato de calcio que contiene 200 UI de vitamina D, 150 mg de gluconato de magnesio, 80 mg de inulina y 70 mg de estearato de magnesio.
Ejemplo 20: Formulación farmacéutica en aerosol nasal(una solución que contiene el principio activo en un dispositivo médico que propulsa la solución activa a la cavidad nasal mediante nebulización).
Ejemplo 21: Pruebas toxicológicas del hidrolizado proteico según la invenciónPreparación del hidrolizado proteico según el Ejemplo 1: Semillas sin mondar deMoringa peregrina(Forssk.). Las semillas de fiori recolectadas cuando el fruto está maduro se secan hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%, preferiblemente en torno al 6%, y a continuación se prensan mediante una prensa mecánica de tornillo para separar el aceite del resto de la semilla y obtener aceite virgen y una torta. A continuación, la torta se aísla en forma de salchichas, precortadas en trozos de 1 a 2 cm. Siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1, obtenemos el extracto líquido que utilizamos sin diluir en las pruebas siguientes.
1. Determinación de la actividad mutagénica en la cepa bacterianaSalmonella tvphimurium(TA 100) - Ensayo de mutación inversa bacteriana.
La prueba se desarrolló en 3 fases principales:
• Se realiza un experimento preliminar para evaluar la citotoxicidad del elemento de ensayo y seleccionar el intervalo de dosis para los experimentos posteriores,
• Un experimento inicial de genotoxicidad (Ensayo 1), con y sin activación metabólica, con incorporación directa del sistema de ensayo y ensayo (o controles) en agar mínimo, en el intervalo de dosis definido por el estudio preliminar,
• Un segundo experimento (Prueba 2), con preincubación del sistema de prueba y del elemento de prueba (o controles), con y sin activación metabólica, a niveles de dosis definidos por el responsable del estudio tras el análisis de los resultados del primer experimento. Este segundo experimento se llevó a cabo para confirmar o completar los resultados del primero, sobre todo cuando se obtuvieron resultados equívocos o negativos. Se prepararon diluciones del extracto según el ejemplo 1 en agua para realizar el ensayo de citotoxicidad.
Esta última se realizó en la cepaSalmonella typhimuriumTA100 a concentraciones de 5000, 1600, 500, 160 y 50 pg/placa, con y sin S9-Mix.
Los reactivos utilizados para preparar S9-Mix se prepararon de acuerdo con las siguientes instrucciones:
[Tabla 33]
Se expusieron bacterias al extracto de ensayo según la invención con y sin un sistema de activación metabólica. El sistema metabólico utilizado es una fracción postmitocondrial potenciada por cofactores (S9). Esta fracción S9, una fracción microsomal de homogeneizado de hígado de rata Sprague Dawley tratado con un inductor enzimático, se prepara según MARON, D.M. et al., 1983, Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 113, p.173-215), y fue suministrada por MOLTOX TM. Se almacena a una temperatura inferior a -70°C. La fracción microsomal S9 se utilizó a una concentración del 10% en S9-Mix. El protocolo aplicado fue el siguiente:
• Se llenaron 3 tubos de hemólisis con:
° dosis sin activación metabólica:
o<0,1 ml de las diferentes concentraciones de elementos de ensayo,>
o<0,5 ml de tampón fosfato estéril 0,2 M, pH 7,4,>
o<2 ml de agar superior para S. typhimurium,.>
o0,1 ml de inóculo bacteriano (TA100).
° dosificación con activación metabólica:
o<0,1 ml de las diferentes concentraciones de elementos de ensayo,>
o<2 ml de agar superior para S. typhimurium,.>
o0,1 ml de inóculo bacteriano (TA100),
o<0,5 ml S9-Mix.>
• Mezclar y verter sobre la superficie del fondo de agar previamente distribuido en placas Petri.
• Incubar a 37°C ± 2°C durante 48 a 72 horas.
Estos ensayos se realizaron para cada prueba: prueba preliminar de citotoxicidad, prueba 1 y prueba 2. El control no tratado, los controles negativos y los controles positivos producidos durante el procedimiento de preincubación se incubaron durante 20 a 30 minutos a 37°C ± 2°C antes de verter el agar superior.
El protocolo aplicado fue el siguiente:
• En 4 fracciones de 2 ml de agar top para S.typhimurium,introducir:
° 0,1 ml de tampón fosfato 0,2 M, pH 7,4,
° 0,1 ml de disolvente,
° 0,1 ml de S9-Mix.
° 0,1 ml del preparado del elemento de ensayo a la concentración más alta,
• Una fracción de 2 ml de tapa de agar para S.typhimuriumpara controlar su esterilidad.
• Mezclar y verter sobre la superficie del fondo de agar previamente distribuido en placas Petri.
• Incubar a 37°C ± 2°C durante 48 a 72 horas.
• La prueba se realiza por triplicado.
• No debe observarse crecimiento bacteriano.
Para al menos 5 concentraciones del extracto a ensayar, se realizó un ensayo sin activación metabólica y un ensayo con activación metabólica.
Expresión e interpretación de los resultados
Existen muchos criterios para determinar si un resultado es positivo, incluyendo un aumento en el número de revertantes correlacionado con la dosis del elemento de prueba, o un aumento reproducible en el número de revertantes a una o más concentraciones, con o sin activación metabólica.
• El elemento de ensayo se considera mutagénico si, al final de las etapas de verificación, se ha obtenido de forma reproducible una relación dosis-respuesta en una o algunas de las 5 cepas con y/o sin activación metabólica. La mutagenicidad sólo se considera para una concentración dada cuando el número de revertantes es al menos dos veces la tasa de reversión espontánea para las cepas TA98, TA100 y TA102 (R > 2) y tres veces la tasa de reversión espontánea para las cepas TA1535 y TA1537 (R > 3).
• Se considera que el producto de ensayo no es mutagénico si, tras los ensayos 1 y 2, la tasa de reversión ha permanecido siempre por debajo del doble de la tasa de reversión espontánea para todas las concentraciones del producto de ensayo ensayado, en el caso de las cepas TA98, TA100 y TA102 (R <2) y menos de tres veces la tasa de reversión espontánea para las cepas TA1535 y TA1537 (R <3), con y sin activación metabólica, y siempre que se haya comprobado que la ausencia del efecto mutagénico no está vinculada a la toxicidad de las concentraciones ensayadas.
El estudio preliminar no mostró citotoxicidad del elemento de ensayo; en consecuencia, este intervalo de concentración se utilizó para el ensayo de genotoxicidad 1.
Basándose en el resultado obtenido para la prueba 1, se decidió utilizar el mismo intervalo de dilución para la prueba 2. Un análisis de los revertantes muestra que:
• No se observó ningún efecto citotóxico,
• Ninguna concentración del extracto de ensayo mostró un cociente R superior o igual al menos al doble del índice de reversión espontánea para TA98, TA100 y TA102 y al triple del índice de reversión espontánea para TA1535 y TA1537, con y sin activación metabólica,
• No se observó ninguna respuesta a la dosis, independientemente del sistema de ensayo o de las condiciones de ensayo.
A la vista de los resultados obtenidos en el presente estudio, puede considerarse que el hidrolizado proteico según el Ejemplo 1 no presenta actividad mutagénica ni pro-mutagénica.
<2. P ru e b a d e fo to to x ic id a d>in vitro<3 T 3 N R U>
E l p r in c ip io d e l e n s a y o s e b a s a e n c o m p a ra r la c ito to x ic id a d d e l h id ro liz a d o p ro te ic o s e g ú n e l E je m p lo 1 e n p re s e n c ia y a u s e n c ia d e u n a d o s is n o c ito tó x ic a d e U V A , s o b re c é lu la s c u lt iv a d a s . La c ito to x ic id a d s e e v a lú a d e te rm in a n d o la v ia b il id a d c e lu la r m e d ia n te un c o lo ra n te v ita l: ro jo n e u tro , 24 h o ra s d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to co n lo s e le m e n to s de<re fe re n c ia y e l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<s e g ú n la in v e n c ió n co n o s in ir ra d ia c ió n U V A . L a s c é lu la s>u t i l iz a d a s fu e ro n f ib ro b la s to s d e e m b r ió n d e ra tó n d e la lín e a B a lb /c 3 T 3 c lo n 31 (A T C C - C C L 163 ) . E l c o n tro l p o s it iv o e s u n a s o lu c ió n d e c lo rp ro m a z in a (n ú m e ro C A S :. 69 -09 -0 ) . E l c o n tro l n e g a tiv o e s un d ilu y e n te d e lo s e x tra c to s d e<p ru e b a y d e re fe re n c ia ( s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a / - 1 % d e d is o lv e n te ) . E l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<se>p ro b ó en 8 c o n c e n tra c io n e s e n a l m e n o s c u a tro p o c il lo s d e c u lt iv o p o r c o n c e n tra c ió n e s tu d ia d a , e n p re s e n c ia o a u s e n c ia d e U V A . S e t r ip s in iz a ro n lo s f ib ro b la s to s y s e s e m b ra ro n d o s p la c a s d e c u lt iv o d e 96 p o c il lo s c o n 100 p l d e u n a s u s p e n s ió n c e lu la r a 2 ,105 c é lu la s /m l (e s d e c ir, 2 ,106c é lu la s p o r p o c il lo ) e n m e d io d e c u lt iv o c o m p le to .
L a s p la c a s s e m b ra d a s se in c u b a ro n en la e s tu fa d u ra n te 24 h o ra s a 37 °C , 5 % C O 2. A l f in a l d e la in c u b a c ió n , se c o m p ro b ó la s e m ic o n f lu e n c ia d e la e s te ra c e lu la r. L a s d ilu c io n e s se p re p a ra ro n ju s to a n te s d e a p lic a r la s a la s c é lu la s . S e m id ió e l P H d e la c o n c e n tra c ió n m á s a lta , q u e o s c ila b a e n tre 6 ,5 y 7 ,8. S e re t iró e l m e d io d e c u lt iv o ; c a d a p o c illo s e e n ju a g ó s u a v e m e n te co n 150 p l d e P B S m a n te n id o a te m p e ra tu ra a m b ie n te a n te s d e s e r t ra ta d o c o n 100 p l de c a d a d ilu c ió n d e l e x tra c to o d e re fe re n c ia . L a s p la c a s d e c u lt iv o s e in c u b a ro n e n la o s c u r id a d d u ra n te 1h ± 5 m in a 37 °C y 5 % d e C O 2. L a ir ra d ia c ió n se re a liz ó c o n u n ir ra d ia d o r s o la r B IO S U N (V ilb e r L o u rm a t R M X 3 W ). B IO S U N e s un s is te m a q u e c o n tro la la ir ra d ia c ió n U V m e d ia n te un m ic ro p ro c e s a d o r p ro g ra m a b le . E l s is te m a c o n tro la c o n t in u a m e n te la e m is ió n d e lu z u lt ra v io le ta . La ir ra d ia c ió n s e d e t ie n e a u to m á tic a m e n te c u a n d o la e n e rg ía s u m in is tra d a e s ig u a l a la e n e rg ía p ro g ra m a d a . L a ir ra d ia n c ia e s p e c tra l d e l d is p o s it iv o s o m e tid o a e n s a y o s e m id ió en la g a m a d e lo n g itu d e s d e o n d a d e 250 a 700 n a n ó m e tro s u t i l iz a n d o un e s p e c tro r ra d ió m e tro c a lib ra d o .
U n a d e la s 2 p la c a s se ir ra d ió c o n la ta p a p u e s ta a te m p e ra tu ra a m b ie n te , y la o tra p la c a s e p ro te g ió d e lo s ra y o s U V A y se m a n tu v o a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te e l t ie m p o d e ir ra d ia c ió n . T ra s la ir ra d ia c ió n , se a s p iró e l m e d io de t ra ta m ie n to y se e n ju a g a ro n la s c é lu la s . A c o n tin u a c ió n , s e a ñ a d ie ro n s u a v e m e n te 100 p l d e m e d io d e c u lt iv o c o m p le to y la s p la c a s se in c u b a ro n d u ra n te 18 a 22 h a 37 °C y 5 % d e C O 2. A l d ía s ig u ie n te , se e v a lu ó la v ia b il id a d c e lu la r ( c re c im ie n to , m o r fo lo g ía , in te g r id a d d e la m o n o c a p a ) u t i l iz a n d o un m ic ro s c o p io d e c o n tra s te d e fa s e s . S e re tiró e l m e d io d e c u lt iv o y c a d a p o c il lo s e e n ju a g ó y s e m a n tu v o a te m p e ra tu ra a m b ie n te a n te s d e s e r t r a ta d o c o n 100 p l d e la s o lu c ió n d e t in c ió n . L a s p la c a s s e v o lv ie ro n a c o lo c a r e n la in c u b a d o ra d u ra n te 3 h e n la s m is m a s c o n d ic io n e s . S e re t iró la s o lu c ió n d e c o lo ra n te y se e n ju a g a ro n la s c é lu la s ; a c o n tin u a c ió n , se re t iró la s o lu c ió n d e e n ju a g u e y se a ñ a d ie ro n 150 p l d e s o lu c ió n d e d e s o rc ió n a c a d a p o c illo . L a s p la c a s s e a g ita ro n h a s ta la c o m p le ta s o lu b il iz a c ió n d e lo s c r is ta le s . L a s a b s o rb a n c ia s s e m id ie ro n a 450 nm .
V a lid a c ió n d e la p ru e b a :
L a s e n s ib il id a d d e la s c é lu la s a lo s ra y o s U V A s e c o m p ru e b a c a d a 10 p a s a je s a p ro x im a d a m e n te , e v a lu a n d o su v ia b il id a d t ra s la e x p o s ic ió n a d o s is c re c ie n te s d e ir ra d ia c ió n . L a s c é lu la s s e c u lt iv a n a la d e n s id a d u t iliz a d a e n e l e n s a y o . S e ir ra d ia ro n a l d ía s ig u ie n te c o n d o s is d e 2 ,5 y 9 J /c m 2 y se d e te rm in ó la v ia b il id a d c e lu la r un d ía d e s p u é s m e d ia n te e l e n s a y o N R U . L a s c é lu la s c u m p le n lo s c r ite r io s d e c a lid a d s i su v ia b il id a d t ra s la ir ra d ia c ió n c o n 5 J /c m 2 U V A e s s u p e r io r o ig u a l a l 80 % d e la v ia b il id a d d e los te s t ig o s m a n te n id o s e n o s c u r id a d ; a la d o s is m á s a lta d e 9 J /c m 2 U VA , la v ia b il id a d d e b e s e r a l m e n o s e l 50 % d e la d e lo s te s t ig o s m a n te n id o s e n o s c u r id a d .
R e s u lta d o s :
E l c o n tro l n e g a t iv o t ie n e u n a a b s o rb a n c ia m a y o r o ig u a l a 0 ,4. L a c lo rp ro m a z in a , e l c o n tro l p o s it iv o , t ie n e un C l50 e n tre 0 ,1 y 2 p g /m l e n p re s e n c ia d e U V A y e n tre 7 y 90 p g /m l e n a u s e n c ia d e U V A . E s to s re s u lta d o s v a lid a n la p ru e b a . N o<p u e d e e s t im a rs e la c o n c e n tra c ió n d e h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<s e g ú n e l E je m p lo 1 q u e p ro p o rc io n a un>50 % d e m u e r te c e lu la r e n p re s e n c ia o a u s e n c ia d e U V A . La m o r ta lid a d n u n c a a lc a n z ó e l 50 % . N o s e p u e d e e s t im a r la c o n c e n tra c ió n d e h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d eperegrina<q u e p ro p o rc io n a un 50 % d e v ia b il id a d c e lu la r e n p re s e n c ia o>a u s e n c ia d e U V A . L a v ia b il id a d e s s ie m p re s u p e r io r a l 50 % .
<C o n c lu s ió n : E n la s c o n d ic io n e s e x p e r im e n ta le s re te n id a s e l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<s e g ú n la in v e n c ió n>p u e d e c o n s id e ra rs e n o fo to tó x ic o .
<3. E v a lu a c ió n d e l p o te n c ia l ir r ita n te o c u la r m e d ia n te e s tu d io d e c ito to x ic id a d>in vitro<u t il iz a n d o e l p ro c e d im ie n to de>lib e ra c ió n d e ro jo n e u tro e n la lín e a c e lu la r S IR C .
<L a b a s e d e e s te e s tu d io in v it ro e s la e v a lu a c ió n d e la c ito to x ic id a d d e l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<m e d ia n te>la d e te rm in a c ió n d e la c o n c e n tra c ió n q u e c a u s a e l 50 % d e m u e r te c e lu la r (C l50) en u n a m o n o c a p a c e lu la r u t i l iz a n d o la té c n ic a d e lib e ra c ió n d e ro jo n e u tro . L a s c é lu la s u t iliz a d a s fu e ro n f ib ro b la s to s d e c ó rn e a d e c o n e jo S IR C lib re s de m ic o p la s m a (A T C C - C C L 60 ).
<E l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<s e d ilu y ó e n s o lu c ió n s a lin a a l 25 % y a l 50 % . S e tr ip s in iz a ro n lo s f ib ro b la s to s>y s e s e m b ra ro n d o s p la c a s d e c u lt iv o d e 24 p o c il lo s c o n 1 m l d e u n a s u s p e n s ió n c e lu la r a 2 ,105 c é lu la s /m l e n m e d io d e c u lt iv o c o m p le to . L a s p la c a s s e m b ra d a s s e in c u b a ro n d u ra n te la n o c h e e n la e s tu fa a 37 °C y 5 % d e C O 2. A l f in a l d e la in c u b a c ió n , s e c o m p ro b ó la c o n f lu e n c ia d e la a lfo m b ra c e lu la r. L a s o lu c ió n d e t in c ió n s e p re p a ró a 0 ,5 m g /m l en m e d io d e c u lt iv o c o m p le to . S e re t iró e l m e d io d e c u lt iv o y s e a ñ a d ió 1 m l d e la s o lu c ió n c o lo ra n te a c a d a p o c ilio . L a s p la c a s s e v o lv ie ro n a c o lo c a r e n la in c u b a d o ra a 37 °C y 5 % d e C O 2 d u ra n te 3 h /- 15 m in u to s . T ra s e s te t ie m p o de c o n ta c to , se re t iró la s o lu c ió n c o lo ra n te y s e s u s t itu y ó p o r 1 m l d e m e d io d e c u lt iv o c o m p le to p o r p o c illo . L a s p la c a s se m a n tu v ie ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te a l m e n o s 30 m in u to s p a ra e s ta b i l iz a r e l s is te m a a n te s d e l c o n ta c to co n e l e x tra c to o la re fe re n c ia . C a d a p o c illo s e e n ju a g ó c o n 2 m l d e P B S , s e m a n tu v o a te m p e ra tu ra a m b ie n te y, a<c o n t in u a c ió n , s e d e p o s ita ro n 500 p l d e c a d a d ilu c ió n d e>peregrina<o h id ro liz a d o p ro te ic o d e re fe re n c ia e n c o n ta c to co n>e l ta p e te c e lu la r . E l t ie m p o d e c o n ta c to fu e d e 60 s e g u n d o s (30 s e g u n d o s p a ra e l c o n tro l p o s it iv o ) . E l t r a ta m ie n to se<re a liz ó b ie n p o r b ie n co n e l te m p o r iz a d o r a c t iv a d o e n e l m o m e n to d e la d e p o s ic ió n d e>peregrina<h id ro liz a d o p ro te ic o o>d e re fe re n c ia . L a p la c a s e a g itó m a n u a lm e n te d u ra n te to d o e l t ra ta m ie n to . T ra s 55 s e g u n d o s (o 25 s e g u n d o s p a ra e l c o n tro l p o s it iv o ) , s e a s p iró la d ilu c ió n . A lo s 60 o 30 s e g u n d o s e x a c to s , s e re a liz a ro n 5 e n ju a g u e s s u c e s iv o s (5 x 2 m l d e P B S m a n te n id o s a te m p e ra tu ra a m b ie n te ) . S e a s p iró e l s o b re n a d a n te d e s p u é s d e c a d a a c la ra d o y, t ra s e l ú lt im o a c la ra d o , se d e ja ro n lo s p o c illo s s in m e d io h a s ta la fa s e d e re v e la c ió n . T ra s e l t ra ta m ie n to c o m p le to d e la p la c a de c u lt iv o , s e a ñ a d ió 1 m l d e la s o lu c ió n d e d e s o rc ió n a c a d a p o c illo . S e a g ita la p la c a d u ra n te u n o s 15 m in u to s h a s ta o b te n e r un c o lo r u n ifo rm e . S e to m a ro n la s s o lu c io n e s o b te n id a s p a ra c a d a p o c illo d e c u lt iv o y se d is tr ib u y e ro n e n 2 p o c il lo s d e u n a p la c a d e 96 p o c illo s , e s d e c ir, 150 p l/p o c illo .
R e s u lta d o s :
<S e e s tim ó q u e la c o n c e n tra c ió n d e h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<q u e p ro p o rc io n a b a un 50 % d e m u e r te c e lu la r e ra > 50 % . E l p o rc e n ta je d e m u e r te c e lu la r a l 50 % d e h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<s e e s t im ó e n un 17% .>
C o n c lu s ió n : E n la s c o n d ic io n e s e x p e r im e n ta le s a d o p ta d a s , la c ito to x ic id a d d e l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s<d e>peregrina<s e g ú n la in v e n c ió n p u e d e c la s if ic a rs e c o m o c ito to x ic id a d in s ig n if ic a n te .>
<4. E v a lu a c ió n d e la c o m p a t ib il id a d c u tá n e a d e un h id ro liz a d o p ro te ic o d e>peregrina según la invención<t ra s a p lic a c ió n>ú n ic a b a jo v e n d a je o c lu s iv o d u ra n te 48 h o ra s b a jo c o n tro l d e rm a to ló g ic o .
E l o b je t iv o d e e s te e s tu d io e s e v a lu a r e l g ra d o d e c o m p a t ib il id a d c u tá n e a d e l h id ro liz a d o d e p ro te ín a s<d e>peregrina<m e d ia n te u n a p ru e b a d e p a rc h e , re a liz a d a en la c a ra a n te ro la te ra l d e l b ra z o d u ra n te 48 h o ra s ; y en>g e n e ra l e v a lu a r la c a p a c id a d d e l h id ro l iz a d o d e p ro te ín a s p a ra m a n te n e r la p ie l e n b u e n e s ta d o . S e in c lu y e ro n e n e l e s tu d io 10 v o lu n ta r io s s a n o s , d e a m b o s s e x o s , c o n e d a d e s c o m p re n d id a s e n tre lo s 18 y lo s 65 a ñ o s , s in p ie l s e c a ni s e n s ib le y s in le s io n e s d e rm a to ló g ic a s en la z o n a d e tra ta m ie n to . La c o m p a t ib il id a d c u tá n e a d e l h id ro liz a d o de<p ro te ín a s d e>peregrina,<p re p a ra d o c o m o lo c ió n co n un 5 % d e h id ro liz a d o d e p ro te ín a s d e>peregrina<s e g ú n e l e je m p lo>1 y un 95 % d e u n a m e z c la d e P ro p a n e d io l/S o rb ito l, s e e v a lu ó 48 h o ra s d e s p u é s d e la a p lic a c ió n in ic ia l e n tre 30 y 40 m in u to s d e s p u é s d e re t ira r e l a p ó s ito . L a s re a c c io n e s c u tá n e a s (e r ite m a y e d e m a ) s e c o n ta ro n d e 0 a 3 u t i l iz a n d o las s ig u ie n te s e s c a la s :
[T a b la 34 ]
C u a lq u ie r o tra re a c c ió n c u tá n e a (b u lla s , p á p u la s , v e s íc u la s , s e q u e d a d , d e s c a m a c ió n , a s p e re z a , e fe c to ja b ó n ... ) se e v a lu ó d e a c u e rd o c o n la s ig u ie n te e s c a la y s e c o m u n ic ó d e fo rm a d e s c r ip t iv a :
• 0: s in re a c c ió n ,
• 0 ,5 : m u y lig e ra
≤ •1:ligera
• 2: moderada
• 3: importante.
Al final del estudio, se calculó un índice de irritación medio (I.I.A.) de acuerdo con la siguiente fórmula:
I.I.M. = Suma de las reacciones cutáneas (E Oe bullas pápulas vesículas) / Número de voluntarios analizados El M.I.I. obtenido permitió clasificar el hidrolizado proteicoperegrinaensayado según la escala presentada a continuación:
I.I.M. ≤ 0,20 No irritante
0.20 < I.I.M. ≤ 0,50 Ligeramente irritante
0.50 < I.I.M. ≤ 2 Moderadamente irritante
2 < I.I.M. ≤ 3 Muy irritante
Resultados: El Indice de Irritación Medio (I.I.M.) del hidrolizado de proteínas deperegrinaes igual a: 0.
Conclusión: El hidrolizado de proteínas deperegrinapuede considerarse no irritante tras 48 horas consecutivas de aplicación en 12 voluntarios.
Conclusión general de las pruebas:
Los resultados de las pruebas realizadas anteriormente son concluyentes y demuestran para el hidrolizado de proteínas deperegrinasegún el Ejemplo 1:
1) Las pruebas de irritación ocular y cutánea son negativas
2) Las pruebas de fototoxicidad son negativas
3) Las pruebas de mutagenicidad son negativas.
La seguridad del hidrolizado de proteínas deperegrinasegún la invención está demostrada y es ideal para uso dermatológico a gran escala sin restricción en las poblaciones diana.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de obtención de un hidrolizado proteico a partir de torta de semillas deMoringa peregrina,caracterizado porquecomprende las siguientes etapas según las cuales:
a) las semillas sin cáscara se recogen en su madurez del fruto deMoringa peregrinay se secan para obtener un contenido de humedad interna inferior al 8%,
b) las semillas secas se prensan para separar el aceite del resto de la semilla con el fin de obtener una torta que contenga menos de un 6% en peso de aceite residual,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) la torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en fase acuosa en una proporción respectiva de 90,9/9,1 (masa/masa),
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período aproximado de 2 horas, a un pH superior a 13 y a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C,
f) la proteólisis se neutraliza para estabilizar el hidrolizado proteico obtenido,
g) el hidrolizado proteico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado proteico se purifica mediante ultrafiltración y/o nanofiltración realizada con un umbral de corte comprendido entre 100 y 25.000 Da.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,caracterizado porquela nanofiltración se lleva a cabo para separar 3 bandas del hidrolizado proteico que comprenden una banda P1 cuyo peso molecular es inferior a 10.000 Da, una banda P2 cuyo peso molecular está comprendido entre 10.000 y 17.000 Da y una banda P3 cuyo peso molecular es aproximadamente 23.000 Da.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2,caracterizado porquela etapa de nanofiltración h) se lleva a cabo con un umbral de corte comprendido entre 1500 Da y 5.000 Da, preferentemente con un umbral de corte comprendido entre 3.000 Da y 4.500 Da.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2,caracterizado porquela etapa de nanofiltración h) se lleva a cabo con un umbral de corte comprendido entre 10.000 Da y 17.000 Da.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2,caracterizado porquela etapa de nanofiltración h) se lleva a cabo con un umbral de corte comprendido entre 17.000 Da y 25.000 Da.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5,caracterizado porquei) se lleva a cabo la liofilización del hidrolizado proteico obtenido en la etapa h).
7. Hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrina,caracterizado porquecomprende una fracción mayoritaria P1 (masa/masa) de derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da, una fracción P2 de aproximadamente el 20% (masa/masa) cuyo peso molecular está comprendido entre 10.000 y 17.000 Da y una fracción P3 de aproximadamente el 20% (masa/masa) cuyo peso molecular es de aproximadamente 23.000 Da,porquese obtiene por proteólisis química a pH superior a 13 durante un período de aproximadamente 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C yporquees líquido y tiene una densidad superior a 1.
8. Hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrina,caracterizado porquecomprende la fracción mayoritaria P1 (masa/masa) de derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da,porquese obtiene por proteólisis química a pH superior a 13 durante un período aproximado de 2 horas a una temperatura de entre 16 y 25°C seguida de nanofiltración realizada con un umbral de corte comprendido entre 1.500 Da y 5.000 Da yporquees líquido y tiene una densidad superior a 1.
9. Hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrina,caracterizado porquecomprende la fracción P2 de aproximadamente un 20% (masa/masa) de derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 10.000 Da y 17.000 Da,porquese obtiene por proteólisis química a pH superior a 13 durante un período de aproximadamente 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C seguida de nanofiltración realizada con un umbral de corte comprendido entre 10.000 Da y 17.000 Da yporquees líquido y tiene una densidad superior a 1.
10. Hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas y recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrina,caracterizado porquecomprende la fracción P3 de aproximadamente 20% (masa/masa) de derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 23.000 Da,porquese obtiene por proteólisis química a pH superior a 13 durante un período de aproximadamente 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C seguida de nanofiltración realizada con un umbral de corte comprendido entre 17.000 Da y 25.000 Da yporquees líquido y tiene una densidad superior a 1.
11. Hidrolizado proteico de la torta de semillas no descascarilladas recolectadas en su madurez del fruto deMoringa peregrina,caracterizado porquecomprende en combinación el hidrolizado proteico según la reivindicación 8 y el hidrolizado proteico según la reivindicación 9.
12. Hidrolizado proteico de la torta de semillas deMoringa peregrinasegún una de las reivindicaciones 7 a 11 para su aplicación como medicamento.
13. Composición farmacéutica o dermatológica,caracterizada porquecomprende, como agente activo, una cantidad eficaz de un hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinasegún una de las reivindicaciones 7 a 11, y un excipiente fisiológicamente aceptable.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13,caracterizada porqueestá formulada para ser ingerida.
15. Composición dermatológica según reivindicación 13,caracterizada porqueestá formulada para ser aplicada tópicamente sobre la piel y las mucosas.
16. Composición según las reivindicaciones 13 a 15,caracterizada porqueel hidrolizado proteico de torta de semillas deMoringa peregrinaestá presente en la composición en una concentración de 0,0001 a 40% en peso con respecto al peso total de la composición.
17. Composición según una de las reivindicaciones 13 a 16 para su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades fibróticas y el tratamiento de la inflamación,caracterizada porquecomprende como agente activo una cantidad eficaz del hidrolizado proteico según la reivindicación 8 o 9, preferentemente según la reivindicación 9.
18. Composición según una de las reivindicaciones 13 a 16 para su uso como medicamento para el tratamiento del cáncer,caracterizada porquecomprende como agente activo una cantidad eficaz del hidrolizado proteico de la reivindicación 10.
19. Composición según una de las reivindicaciones 13 a 16 para su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas de tipo vírico para inhibir las proteínas Spike-COV2 de SARS-COV2,caracterizada porquecomprende como agente activo una cantidad eficaz del hidrolizado proteico según la reivindicación 7.
20. Composición según una de las reivindicaciones 13 a 16 para su uso como medicamento para el tratamiento de la fibrosis cutánea y el lentigo,caracterizada porquecomprende como agente activo una cantidad eficaz del hidrolizado proteico según la reivindicación 11.
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