ES3031673T3 - Compositions and methods for detection of candida auris - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la detección rápida de la presencia o ausencia de Candida auris (CA) en una muestra biológica o no biológica. Los métodos pueden incluir una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección. Además, se proporcionan cebadores y sondas dirigidas al gen ARNr CA 5.8s/ITS2, así como kits diseñados para la detección de CA. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la detección deCandida Auris

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al campo de diagnóstico molecular, y más en particular a la detección deCandida Auris.

Antecedentes de la invención

Candida auris(C. auris,CA) es un nuevo hongo que representa una grave amenaza sanitaria mundial. AunqueC. aurisse identificó por primera vez en 2009 en Japón, una revisión retrospectiva de las colecciones de cepas deCandidadescubrió que la cepa más antigua conocida deC. aurisdata de 1996 en Corea del Sur. AunqueC. aurisse reconoció apenas en 2009, ha surgido rápidamente y se ha informado de su presencia en más de 20 países, incluyendo los Estados Unidos. Los centros sanitarios de varios países han informado de queC. aurisha estado provocando enfermedades graves en pacientes hospitalizados. En algunos pacientes, esta levadura puede entrar en la circulación sanguínea y propagarse por todo el cuerpo, provocando graves infecciones invasivas.

La Candida aurises motivo de preocupación principalmente por varios motivos: 1) a menudo es multirresistente, lo que quiere decir que es resistente a múltiples fármacos antifúngicos usados comúnmente para tratar infecciones<por Candida;>2<) es difícil de identificar con procedimientos de laboratorio estándar, y se puede identificar>erróneamente en laboratorios sin tecnología específica. La identificación errónea puede dar lugar a una gestión inapropiada y 3) ha provocado brotes en entornos sanitarios. Por este motivo, es importante identificar rápidamenteC. aurisen un paciente hospitalizado de modo que los centros sanitarios puedan tomar precauciones especiales para detener su propagación.

Aproximadamente un 54 % de los casos deC. aurisse han identificado a partir de sangre; el 46 % restante de los casos se identificaron en otras zonas corporales, incluyendo, pero sin limitarse a, orina, heridas, esputo y bilis. Algunos laboratorios clínicos no determinan típicamente la especie de cepas aisladas de sitios no estériles, ya que la presencia deCandidaen estos sitios puede representar una colonización más que una infección y no requeriría tratamiento. Sin embargo, es importante identificarC. aurisincluso en una zona corporal no estéril, ya que la presencia deC. aurisen cualquier zona corporal puede representar una colonización más amplia, lo que supone un riesgo de transmisión y requiere la implementación de precauciones de control de infección.

Al igual que otras infecciones porCandida,las infecciones porC. aurisse diagnostican normalmente por cultivos de sangre u otros fluidos corporales. Sin embargo,C. aurises más difícil de identificar a partir de cultivos que otros tipos más comunes deCandida.Por ejemplo, se puede confundir con otros tipos de levaduras, en particularCandida haemulonii.Se necesitan pruebas de laboratorio especiales para identificarC. auris.

Datos limitados sugieren que los factores de riesgo para las infecciones porCandida aurisson en general similares a los factores de riesgo para otros tipos de infecciones porCandida.Estos factores de riesgo incluyen cirugía reciente, diabetes y uso de antifúngicos y antibióticos de amplio espectro.

Los pacientes que llevan mucho tiempo hospitalizados en un centro sanitario, tienen vías y sondas que se introducen en su cuerpo (tales como tubos endotraqueales, sondas de alimentación y catéteres venosos centrales), o han recibido previamente medicamentos antifúngicos o antibióticos, parecen tener mayor riesgo de infección conC. auris.Se han descubierto infecciones en pacientes de todas las edades, desde niños prematuros hasta ancianos. Se necesitan más estudios para conocer mejor los factores de riesgo para la infección porC. auris.Se han descrito previamente algunos ensayos de PCR para detectarC. auris(Leachet al., J Clin Microbiol(2018); vol. 56(2):e01223-17; Kordalewskaet al., J Clin Microbiol(2017); vol. 55(8): 2445-2452; Theillet al., Rev Iberoam Micol(2018); vol. 35(2): 110-112). Además, se describe un procedimiento de análisis de secuencia para la detección deC. aurisdirigido a la región ITS y a los dominios D1/D2 del gen ARNr 26S en Leeet al., J Clin Microbiol(2011);vol. 49(9):3139-42.

La apariencia y color de las colonias deCandida aurisen cultivo pueden ayudar en la identificación de la especie, pero no se pueden usar como único procedimiento de identificación deC. auris,ya queC. aurisno se puede distinguir de otras especies más comunes deCandidasin usar otros procedimientos. Los dispositivos de diagnóstico basados en desorción/ionización por láser asistida por matriz con analizador del tiempo de vuelo (MALDI-TOF) pueden diferenciarC. aurisde otras especies de cándida, pero no todas las bases de datos de referencia incluidas en dispositivos MALDI-TOF permiten la detección. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de obtener un procedimiento mejor y más completo para detectar específicamenteC. auris.

Sumario de la invención

Determinados modos de realización en la presente divulgación se refieren a procedimientos para la detección rápida de la presencia o ausencia deCandida auris(CA) en una muestra biológica o no biológica, por ejemplo, detección múltiple de CA por reacción en cadena de la polimerasa ultrarrápida en un único tubo de ensayo. Los modos de realización incluyen procedimientos de detección de CA que comprenden realizar al menos una etapa de ciclado, que puede incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. Además, los modos de realización incluyen cebadores, sondas y kits que se diseñan para la detección de CA en un único tubo. Los procedimientos de detección se diseñan para dirigirse a genes específicos del genoma deCandida auriscon un potencial para discriminar a los vecinos más cercanosCandida haemuloniiySaccharomyces cerevisiae.

Se proporciona un procedimiento para detectarCandida auris(CA) en una muestra, incluyendo realizar una etapa de amplificación que incluye poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores oligonucleotídicos diseñados para dirigirse a un gen de CA específico para producir un producto de amplificación si CA está presente en la muestra; realizar una etapa de hibridación que incluye poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas oligonucleotídicas detectables con el gen de CA diana; y detectar la presencia o ausencia del producto amplificado, en el que la presencia del producto amplificado es indicativa de la presencia de CA en la muestra y en el que la ausencia del producto amplificado es indicativa de la ausencia de CA en la muestra; en el que el gen de CA diana es el gen de ARNr 5.8s/ITS2.8s/ITS2.

En un aspecto se proporciona un procedimiento para detectarCandida auris(CA) en una muestra, comprendiendo el procedimiento realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 para producir un producto de amplificación si el ácido nucleico de CA está presente en la muestra; realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas de gen de ARNr 5.8s/ITS2 detectables; y detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de CA en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de CA en la muestra; en el que el conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; y en el que la una o más sonda oligonucleotídica de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o un complemento de la misma; o en el que el conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 y un segundo cebador oligonucleotídico que<comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:>8<; y en el que la sonda oligonucleotídica de>gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o el complemento de la misma.

En algunos modos de realización, la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación con la sonda de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable que se marca con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto aceptador; y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptador de la sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de C<a>en la muestra. En algunos modos de realización, las etapas de amplificación y las de hibridación se repiten. En el presente documento, el número de repeticiones depende, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de amplificación e hibridación para amplificar la secuencia diana lo suficiente para la detección. En algunos modos de realización, las etapas de<amplificación y las de hibridación se repiten al menos aproximadamente>20<veces, pero se pueden repetir tantas>como al menos 25, 30, 40, 50, 60 o incluso 100 veces. Además, la detección de la presencia o ausencia del producto de amplificación se puede realizar durante o después de cada etapa de amplificación e hibridación, durante o después de cada etapa de amplificación e hibridación alterna, durante o después de etapas de amplificación e hibridación particulares o durante o después de etapas de amplificación e hibridación particulares, en las que, si está presente, se espera suficiente producto de amplificación para la detección. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. En algunos modos de realización, el resto fluorescente donante y el resto aceptador correspondiente están dentro de no más de 8-20 nucleótidos entre sí en la sonda. En algunos modos de realización, el resto aceptador es un extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una secuencia de<nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-3, 5,>8<, 9-11 tienen 100 o menos nucleótidos, 50 o menos nucleótidos,>40 o menos nucleótidos o 30 o menos nucleótidos. En algunos modos de realización, el primer y segundo cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 y la sonda de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable tienen 40 o menos nucleótidos (por ejemplo, 35 o menos nucleótidos, 30 o menos nucleótidos, etc.). En algunos modos de realización, el primer cebador oligonucleotídico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, el segundo cebador oligonucleotídico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, y la sonda oligonucleotídica comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10. En determinados modos de realización, uno cualquiera del primer, segundo y tercer oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos. En algunos modos de realización, al menos uno del primer, segundo y tercer oligonucleótidos comprende al menos un nucleótido modificado.

La presente divulgación también proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que tiene al menos un 70%de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90%o 95 %, etc.) con una de<SEQ ID. NO: 1-3, 5-6,>8<, 9-11, o un complemento de las mismas, oligonucleótido que tiene 100 o menos>nucleótidos. En general, estos oligonucleótidos pueden ser ácidos nucleicos de cebador, ácidos nucleicos de sonda o similares. Los oligonucleótidos pueden comprender al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación de ácido nucleico en relación con nucleótidos no modificados. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Los oligonucleótidos pueden incluir al menos una variación modificada de forma conservadora. "Variaciones modificadas de forma conservadora" o, simplemente, "variaciones conservadoras" de una secuencia de ácido nucleico particular se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos de un 5 %, más típicamente menos de un 4 %, 2 % o 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de forma conservadora" donde las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Al menos uno del primer y segundo cebadores de gen de CA diana y la sonda de gen de CA diana detectable pueden comprender al menos un nucleótido modificado.

En algunos modos de realización, la amplificación (la etapa de amplificación) puede emplear una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'. Por tanto, el resto fluorescente donante y el resto aceptador, por<ejemplo, un extintor, pueden estar dentro de no más de 5 a 20 nucleótidos (por ejemplo,>8<o 10) entre sí a lo largo>de la longitud de la sonda. En otro aspecto, la sonda detectable incluye una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructura secundaria. Dicha formación de estructura secundaria en general da como resultado una proximidad espacial entre el primer y segundo resto fluorescente. De acuerdo con este procedimiento, el segundo resto fluorescente en la sonda puede ser un extintor.

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de CA en una muestra biológica de un individuo. Dichos procedimientos en general incluyen realizar al menos una etapa de ciclado, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de unión a tinte. Típicamente, la etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con una pluralidad de pares de cebadores diseñados para dirigirse a un gen de Ca específico para producir uno o más productos de amplificación de gen de CA diana si la molécula de ácido nucleico de gen de CA diana está presente en la muestra, y la etapa de unión a tinte incluye poner en contacto el producto de amplificación de gen de CA diana con un tinte de unión a ADN bicatenario. En un modo de realización, el gen de CA diana es el gen de ARNr CA 5.8s/ITS2. Dichos procedimientos también incluyen detectar la presencia o ausencia de unión del tinte de unión a ADN bicatenario en el producto de amplificación, en los que la presencia de unión es indicativa de la presencia de CA en la muestra, y en los que la ausencia de unión es indicativa de la ausencia de CA en la muestra. Un tinte de unión a ADN bicatenario representativo es bromuro de etidio. Además, dichos procedimientos también pueden incluir determinar la temperatura de fusión entre el producto de amplificación de gen de CA diana y el tinte de unión a ADN bicatenario, en los que la temperatura de fusión confirma la presencia o ausencia de CA.

Aún en otro aspecto, se proporciona un kit para detectar el gen de ARNr CA 5.8s/ITS2. El kit puede incluir uno o más conjuntos de cebadores específicos para la amplificación del gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 y una o más sondas detectables específicas para la detección de los productos de amplificación de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2.

En particular, los cebadores y sondas oligonucleotídicos divulgados anteriormente en conexión con el procedimiento de acuerdo con la invención son adecuados para incluirse en un kit de acuerdo con la invención. En el presente documento, se proporciona un kit para detectar el gen de ARNr 5.8s/ITS2 deCandida auris(CA) que comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de<s>E<q>ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; y una sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable fluorescentemente que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o un complemento de la misma, la sonda marcada de manera detectable configurada para hibridarse a un amplicón generado por el primer y el segundo cebador oligonucleotídico; un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda<secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:>8<; y una sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable>fluorescentemente que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma, la sonda marcada de manera detectable configurada para hibridarse a un amplicón generado por el primer y el segundo cebador oligonucleotídico. En un aspecto, el kit puede incluir sondas ya marcadas con el resto donante y correspondiente aceptador, por ejemplo, otro resto fluorescente o un extintor oscuro, o puede incluir restos fluoróforos para marcar las sondas. El kit también puede incluir al menos uno de nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. El kit también puede incluir un prospecto del envase e instrucciones para usar los cebadores, sondas y restos fluoróforos para detectar la presencia o ausencia de CA en una muestra. En algunos modos de realización, la sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable fluorescentemente comprende un resto fluorescente donador y un correspondiente resto aceptador. En algunos modos de realización, el resto aceptador es un extintor. En algunos modos de realización, el primer cebador oligonucleotídico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, el segundo cebador oligonucleotídico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, y la sonda oligonucleotídica comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10. En determinados modos de realización, uno cualquiera del primer, segundo y tercer oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos. En algunos modos de realización, al menos uno del primer, segundo y tercer oligonucleótidos comprende al menos un nucleótido modificado. En algunos modos de realización, el primer, segundo y tercer oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos.

Además, se proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de cebadores oligonucleotídicos para amplificar un gen de CA diana como se divulga anteriormente. En el presente documento, el conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 comprende un primer cebador que comprende o que consiste en una primera secuencia oligonucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-3 o un complemento de la misma, y un segundo cebador que comprende o que consiste en una segunda secuencia oligonucleotídica<seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5-6, y>8<, o un complemento de la misma. La composición>puede comprender además una o más sondas de gen de ARNr CA 5.8<s>/<i>TS2 detectables que comprenden o que consisten en una tercera secuencia oligonucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-11, o el complemento de la misma.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente materia objeto, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos solo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.

Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra curvas de crecimiento de PCR del experimento PCR ultrarrápida generado a partir de cebadores de ARNr CA 5.8s/ITS2 (SEQ ID NO: 2 y 5) y la sonda (SEQ ID NO: 10) en el ensayo AUR2 (véase la tabla V) en presencia de molde de ADN deC. aurisgenómico en concentraciones de 100.000, 10.000 y 1000 concentraciones genómicas equivalentes por reacción de PCR (ge/PCR), y en presencia de 100.000 ge/PCR de molde deC. haemuloniigenómico o sin ADN molde (NTC). TBB se refiere a cebadores modificados con un resto ferc-butil-bencilo en el extremo 3'.

Descripción detallada de la invención

El diagnóstico de infección por CA por amplificación de ácido nucleico proporciona un procedimiento para detectar de forma rápida y con exactitud la infección fúngica. Un ensayo ultrarrápido para detectar CA en una muestra se describe en el presente documento. Se proporcionan cebadores y sondas para detectar CA, así como artículos de fabricación o kits que contienen dichos cebadores y sondas. El incremento en la sensibilidad de PCR ultrarrápida para la detección de CA en comparación con otros procedimientos, así como la mejora en los rasgos característicos de PCR ultrarrápida incluyendo contención de muestra y detección ultrarrápida del producto amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología para el diagnóstico habitual de infecciones por CA en el laboratorio clínico. La presente divulgación incluye cebadores oligonucleotídicos y sondas de hidrólisis marcadas fluorescentes que se hibridan a un locus de gen específico del genoma de CA para identificar específicamente CA usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La selección de diana para CA requirió una búsqueda exhaustiva de la base de datos de secuencias pública, así como una búsqueda de literatura para dianas de CA con un potencial para discriminar a los vecinos más cercanosCandida haemuloniiySaccharomyces cerevisiae.Se analizaron múltiples dianas de la base de datos de secuencias pública en el procedimiento de selección de dianas, pero muchas mostraron reactividad cruzada con C.

haemuloniiy S.cerevisiae.Además, las secuencias en la base de datos pública se complican por los datos de secuencia "masivos" de dianas de múltiples copias. Como resultado del análisis, un gen de CA diana que se eligió fue el gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 (número de acceso GenBank AB375772).

Los procedimientos divulgados pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una o más porciones de la diana génica de la molécula de ácido nucleico de una muestra usando uno o más pares de cebadores. "Cebador(es)" como se usa en el presente documento se refiere a cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente al gen diana en CA e inician la síntesis de ADN a partir del mismo en condiciones apropiadas produciendo los respectivos productos de amplificación. Cada uno de los cebadores analizados se hibrida a una diana dentro de o contigua a la respectiva molécula de ácido nucleico diana de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contiene la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la diana. El uno o más productos de amplificación se producen siempre que uno o más del ácido nucleico de gen de CA diana esté presente en la muestra, por tanto la presencia del uno o más de los productos de amplificación de gen de CA diana es indicativa de la presencia de Ca en la muestra. El producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una o más sondas detectables para el gen de CA diana. "Sonda(s)" como se usa en el presente documento se refieren a sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen de CA diana. Cada etapa de ciclado incluye una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en las que la muestra se pone en contacto con la una o más sondas detectables para la detección de la presencia o ausencia de CA en la muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere al procedimiento de sintetizar moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico molde. Amplificar una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores al ácido nucleico molde a una temperatura que está por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores y alargar enzimáticamente a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación típicamente requiere la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Taq Platinum®) y un tampón y/o cofactores apropiados para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCh y/o KCl).

El término "cebador" como se usa en el presente documento es conocido por los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden fijar otros "nucleótidos" por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster de 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato, y con lo que se libera pirofosfato. Por lo tanto, no existe ninguna diferencia fundamental, excepto posiblemente para la función prevista, entre un "cebador", un "oligonucleótido" o una "sonda".

El término "hibridar" se refiere a la hibridación de una o más sondas a un producto de amplificación. Las condiciones de hibridación típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación inespecífica de las sondas.

El término "actividad nucleasa de 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebra de ácido nucleico, con lo que se retiran nucleótidos del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión de cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y avanza en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables deThermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilusyMethanothermus fervidus.No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no son termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

El término "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que es tanto de la misma longitud que, como exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento" cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótido, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los programas BLAST, que se describen en, por ejemplo, Altschulet al.(1990) “Basic local alignment search tool”J. Mol. Biol.215:403-410, Gishet al.(1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search”Nature Genet.3:266-272, Maddenet al.(1996) “Applications of network BLAST server”Meth. Enzymol.266:131-141, Altschulet al.(1997) “Gapped BLAST and PSI-BL<a>ST: a new generation of protein database search programs”Nucleic Acids Res.25:3389-3402 y Zhang et al. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation”GenomeRes. 7:649-656.

Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia oligonucleotídica se reemplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, una C5-metil-dC, una C5-etil-dC, un C5-metil-dU, un C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, una C5-propinil-dC, un C5-propinil-dU, una C7-propinil-dA, una C7-propinil-dG, una C5-propargilamino-dC, un C5-propargilamino-dU, una C7-propargilamino-dA, una C7-propargilamino-dG, una 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, un seudo-dU, un<nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, una N4-etil-dC, una N>6<-metil-dA y similares. Se hace>referencia a muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos en el presente documento o de otro modo son conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los correspondientes oligonucleótidos no modificados. Para ilustrar además, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico inespecífica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebador o similares), incrementar el rendimiento de un amplicón diana previsto y/o similares en algunos modos de realización. Se describen ejemplos de estos tipos de modificaciones de ácido nucleico, por ejemplo, en la pat. de EE. UU. n.° 6.001.611.

Detección de CA

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar CA amplificando, por ejemplo, una porción de la secuencia de ácido nucleico de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2. Las secuencias de ácido nucleico del gen están disponibles públicamente (por ejemplo, n.° de acceso GenBank AB375772). Específicamente, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar y detectar dianas de moléculas de ácido nucleico de CA específicas en los modos de realización en la presente divulgación.

Para la detección de CA, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar el gen de ARNr CA 5.8s/ITS2. También se pueden usar ácidos nucleicos distintos de los ejemplificados en el presente documento para detectar CA en una muestra. Por ejemplo, se pueden evaluar variantes funcionales para determinar la especificidad y/o sensibilidad por los expertos en la técnica usando procedimientos habituales. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los ácidos nucleicos de gen de CA diana divulgados en el presente documento.

Más específicamente, los modos de realización de los oligonucleótidos incluyen cada uno un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1-12, una variante sustancialmente idéntica de la misma en la que la variante tiene al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 1-12, o un complemento de s Eq ID NO: 1-12 y la variante.

TABLA I: cebadores de ARNr 5.8s/ITS2

TABLA II: sondas de ARNr 5.8s/ITS2

En un modo de realización, los conjuntos de cebadores y sondas descritos anteriormente se usan para proporcionar la detección de CA en una muestra biológica sospechosa de contener CA. Los conjuntos de cebadores y sondas pueden comprender o consistir en los cebadores y sondas específicos para las secuencias de ácido nucleico del gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 que comprenden o que consisten en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-12. En otro modo de realización, los cebadores y sondas para los genes de ARNr CA 5.8s/ITS2 comprenden o consisten en una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y sondas de SEQ ID NO: 1-12.

Una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y/o sondas de SEQ ID NO: 1-12 se puede identificar usando los cebadores y/o sondas en los procedimientos divulgados. Una variante funcionalmente activa de un cebador y/o sonda de cualquiera de SEQ ID NO:1-12 pertenece a un cebador y/o sonda que proporciona una especificidad y sensibilidad similares o mayores en el procedimiento o kit descrito en comparación con la respectiva secuencia de SEQ ID NO: 1-12.

La variante puede variar, por ejemplo, de la secuencia de SEQ ID NO: 1-12 en una o más adiciones, deleciones o sustituciones nucleotídicas, tal como una o más adiciones, deleciones o sustituciones nucleotídicas en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la respectiva secuencia de SEQ ID NO: 1-12. Como se detalla anteriormente, un cebador (y/o sonda) se puede modificar químicamente, es decir, un cebador y/o sonda puede comprender un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. A continuación, una sonda (o un cebador) es un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos nucleotídicos") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un glúcido pentofuranosilo o un compuesto similar a glúcido pentofuranosilo, una porción fosfato o porción similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un "marcador" se puede fijar a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede remplazar por, por ejemplo, una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo nucleotídico" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo nucleosídico") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo nucleotídico").

Los oligonucleótidos que incluyen oligonucleótidos modificados y análogos oligonucleotídicos que amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica codifica el gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 diana se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa informático tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser lo suficientemente largos como para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se<reduzca la fidelidad durante la síntesis oligonucleotídica). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos son de>8<a 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo,>8<, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46,>48 o 50 nucleótidos de longitud). En algunos modos de realización, los cebadores oligonucleotídicos son de 40 o menos nucleótidos de longitud.

Además de un conjunto de cebadores, los procedimientos pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de CA. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que, por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse bajo restricciones predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) a "ácidos nucleicos diana", en el presente caso a un ácido nucleico de gen de CA diana. Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", que quiere decir que detecta el ácido nucleico diana.

En algunos modos de realización, las sondas de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 descritas se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 se pueden marcar con un resto fluorescente donante, por ejemplo, un tinte fluorescente y un correspondiente resto aceptador, por ejemplo, un extintor. En un modo de realización, la sonda comprende o consiste en un resto fluorescente y las secuencias de ácido nucleico comprenden o consisten en SEQ ID NO: 9-12.

Diseñar oligonucleótidos que se van a usar como sondas se puede realizar de manera similar al diseño de cebadores. Los modos de realización pueden usar una única sonda o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, el uso de sonda(s) puede comprender al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Como con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas en general son de 15 a 40 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21,22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud.

Las construcciones pueden incluir vectores que contienen cada uno una de moléculas de ácido nucleico de sondas y cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2. Se pueden usar construcciones, por ejemplo, como moléculas de ácido nucleico molde de control. Los vectores adecuados para su uso están disponibles comercialmente y/o se producen por procedimientos de tecnología de ácido nucleico recombinante habituales en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis química, clonación directa de CA o por amplificación por PCR.

Las construcciones adecuadas para su uso en los procedimientos típicamente incluyen, además de las moléculas de ácido nucleico de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una o más secuencias de SEQ ID NO: 1-12), secuencias que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) para seleccionar construcciones y/o transformantes deseados, y un origen de replicación. La elección de sistemas de vectores normalmente depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la elección de células huésped, eficacia de replicación, selectividad, inducibilidad y la facilidad de recuperación.

Las construcciones que contienen moléculas de ácido nucleico de gen de CA diana se pueden propagar en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, el término célula huésped pretende incluir procariotas y eucariotas, tales como células de levadura, vegetales y animales. Los huéspedes procariotas pueden incluirE. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescensyBacillus subtilis.Los huéspedes eucariotas incluyen levaduras, tales como S.cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris,células de mamífero tales como células COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto y células vegetales tales comoArabidopsis thalianayNicotiana tabacum.Se puede introducir una construcción en una célula huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus son procedimientos comunes para introducir ácidos nucleicos en células huésped. Además, se puede suministrar ADN no marcado directamente a las células (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 5.580.859 y 5.589.466).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las pat. de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en algunos modos de realización incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como puntos de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de gen de CA diana descritas (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-7). Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una eficacia máxima en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. En primer lugar, se desnaturalizan los cebadores bicatenarios, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento para desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento para separar las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal del tampón y la longitud y composición nucleotídica de los ácidos nucleicos que se están desnaturalizando, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo dependiendo de rasgos característicos de la reacción, tales como temperatura y la longitud de ácido nucleico. La desnaturalización típicamente se realiza<durante de aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de>1<min a>2<min 30 s, o 1,5 min).>

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar a una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador a su secuencia diana en las moléculas de ácido nucleico de gen de CA diana descritas. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). A continuación, se ajusta la mezcla de reacción a una temperatura a la que la actividad de la polimerasa se promueve o se optimiza, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía en general de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico, tal como ARN o ADN (ADNc). No se necesita purificar el ácido nucleico molde; puede ser una fracción minoritaria de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico contenido en células humanas. Las moléculas de ácido nucleico se pueden extraer de una muestra biológica por técnicas habituales, tales como las descritas enDiagnostic Molecular Microbiology. Principies and Applications(Persinget al.(eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos a partir de cualquier serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales, que incluyen bacterias, levaduras, protozoos, virus, orgánulos u organismos superiores, tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena incluyen, en general, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCh 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5-1,0 |jg de ADN molde protodesnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de polimerasa Taq y DMSO al 10 %). Las reacciones normalmente contienen de 150 a 320 jM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más análogos de los mismos.

Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación de hebras, hibridación y alargamiento se pueden repetir tan a menudo como se necesite para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a las moléculas de ácido nucleico diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana lo suficiente para la detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tantas como 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología de FRET (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en un concepto de que cuando un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptador se sitúan dentro de una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o de otro modo detectar y/o cuantificar. El donante típicamente transfiere la energía al aceptador cuando el donante se excita por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptador típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En determinados sistemas, se puede transferir energía no fluorescente entre restos donantes y aceptadores, por medio de biomoléculas que incluyen restos donantes sustancialmente no fluorescentes (véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 7.741.467).

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donante y un correspondiente extintor, que puede ser o no fluorescente, y que disipa la energía transferida en una forma distinta de luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía típicamente se produce entre los restos donantes y aceptadores de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante se extingue por el resto aceptador. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, una sonda unida a un producto de amplificación se escinde por la actividad nucleasa de 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante ya no se extingue. Las sondas ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las pat. de EE. UU. n.os 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donante-aceptador usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry y Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, que contienen cada una un resto fluorescente, se pueden hibridar a un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con la secuencia de ácido nucleico diana. Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas al ácido nucleico de producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de<aproximadamente>10<s a aproximadamente>1<min.>

Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para supervisar la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. La excitación para iniciar la transferencia de energía, o para permitir la detección directa de un fluoróforo, se puede llevar a cabo con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos donantes y aceptadores correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptador o un extintor oscuro que tiene un espectro de absorbancia que se superpone al espectro de emisión del resto fluorescente donante. El máximo de longitud de<onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptador debe ser al menos>100<nm mayor que el máximo de>longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donante. En consecuencia, se puede producir una transferencia de energía no radiativa eficaz entre los mismos.

Los restos donantes y correspondientes aceptadores fluorescentes en general se eligen para (a) transferencia de energía de Forster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) desplazamiento de la emisión lo más lejos posible en la porción roja del espectro visible (>600 nm); y (d) desplazamiento de la emisión a una longitud de onda mayor que la emisión fluorescente de agua de Raman producida por excitación a la longitud de onda de excitación de donante. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donante que tiene su máximo de excitación cercano a una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y un buen solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del correspondiente resto fluorescente aceptador. Se puede elegir un correspondiente resto fluorescente aceptador que tiene un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, un buen solapamiento de su excitación con la emisión del resto fluorescente donante y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).

Los restos fluorescentes donantes representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptadores en tecnología FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptadores representativos, dependiendo del resto fluorescente donante usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonilo de lisamina-rodamina B, tetrametilrrodamina-isotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donantes y aceptadores, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donantes y aceptadores se pueden unir al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donantes y aceptadores. La longitud de un brazo conector puede ser la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica al resto fluorescente. En general, un brazo conector es de<aproximadamente>10<A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser del tipo descrito en el documento>W<o>84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para fijar brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para fijar restos fluorescentes a un brazo conector.

Un resto fluorescente aceptador, tal como un LC Red 640, se puede combinar con un oligonucleótido que contiene<un conector de amino (por ejemplo, C>6<-aminofosforamiditas disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen>Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, un oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante tal como fluoresceína a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-NHS-éster, tal como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG que requieren el acoplamiento de fluoresceína-NHS-éster después de la síntesis oligonucleotídica.

Detección de CA

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de CA en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos proporcionados evitan problemas de contaminación de muestra, negativos falsos y positivos falsos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de moléculas de ácido nucleico diana de una muestra usando uno o más pares de cebadores, y una etapa de detección por FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Se pueden realizar procedimientos usando los cebadores y sondas para detectar la presencia de CA, y la detección del gen de CA diana indica la presencia de CA en la muestra.

Como se describe en el presente documento, se pueden detectar productos de amplificación usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología FRET. Un formato FRET utiliza tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, y por tanto, la presencia o ausencia de CA. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada, por ejemplo, con un tinte fluorescente y un extintor, que puede ser o no fluorescente. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente o un extintor oscuro de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente en general es una molécula extintora. Durante la etapa de hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad nucleasa de 5' a 3' de, por ejemplo, la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa tecnología TaqMan®, y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de CA en la muestra.

También se pueden usar balizas moleculares conjuntamente con FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de<p>C<r>ultrarrápida. La tecnología de baliza molecular usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente es en general un extintor, y los marcadores fluorescentes típicamente se localizan en cada extremo de la sonda. La tecnología de baliza molecular usa un oligonucleótido de sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructura secundaria dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación a los ácidos nucleicos diana (es decir, productos de amplificación), la estructura secundaria de la sonda se altera y los restos fluorescentes se separan entre sí de modo que después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se pueda detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Otro formato común de tecnología FRET utiliza dos sondas de hibridación. Cada sonda se puede marcar con un resto fluorescente diferente y en general se diseñan para hibridarse en estrecha proximidad entre sí en una molécula de ADN diana (por ejemplo, un producto de amplificación). Un resto fluorescente donante, por ejemplo, fluoresceína, se excita a 470 nm por la fuente de luz del instrumento LightCycler®. Durante FRET, la fluoresceína transfiere su energía a un resto fluorescente aceptador, tal como LightCycler®-Red 640 (LC Red 640) o LightCycler®-Red 705 (LC Red 705). A continuación, el resto fluorescente aceptador emite luz de una longitud de onda más larga, que se detecta por el sistema de detección óptica del instrumento LightCycler®. La FRET eficaz solo puede tener lugar cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donante se solapa con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptador. La intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ADN diana originales (por ejemplo, el número de genomas de CA). Si se produce amplificación del ácido nucleico diana y se produce un producto de amplificación, la etapa de hibridación da como resultado una señal detectable basada en FRET entre los miembros del par de sondas.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de CA en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de CA en la muestra. Sin embargo, la extracción de muestras inadecuada, retrasos de transporte, condiciones de transporte inapropiadas o uso de determinados hisopos de extracción (varilla de alginato de calcio o aluminio) son todas condiciones que pueden afectar al éxito y/o exactitud de un resultado de prueba. Usando los procedimientos divulgados en el presente documento, la detección de FRET, por ejemplo, dentro de 45 etapas de ciclado es indicativa de una infección por CA.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar en la práctica de los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, muestras respiratorias, muestras fecales, muestras de sangre, hisopados dérmicos, hisopados nasales, hisopados en heridas, hemocultivos, piel e infecciones de partes blandas. Los procedimientos de extracción y almacenamiento de muestras biológicas son conocidos para los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar el ácido nucleico de C<a>o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de la reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados.

El análisis de la curva de fusión es una etapa adicional que se puede incluir en un perfil de ciclado. El análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el ADN se funde a una temperatura característica llamada temperatura de fusión (Tf), que se define como la temperatura a la que la mitad de las dobles hebras de ADN se han separado en hebras únicas. La temperatura de fusión de un ADN depende principalmente de su composición nucleotídica. Por tanto, las moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen una mayor Tf que las que tienen una abundancia de nucleótidos A y T. Detectando la temperatura a la que se pierde la señal, se puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. De forma similar, detectando la temperatura a la que se genera la señal, se puede determinar la temperatura de hibridación de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las sondas de los productos de amplificación puede(n) confirmar la presencia o ausencia de CA en la muestra.

Dentro de cada tanda de termociclador, también se pueden ciclar muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contiene las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una tanda con muestra separada paralelamente con las muestras de pacientes usando los mismos cebadores y sonda como se usa para la detección de la diana prevista. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada tanda de termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carece de ADN molde diana. El control negativo puede medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no dan lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas para hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca FRET.

En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa se describe en las pat. de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una tanda de termociclador y la siguiente.

Los procedimientos de PCR convencionales conjuntamente con tecnología FRET se pueden usar para practicar los procedimientos. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida como se usa en la tecnología LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

El LightCycler® se puede hacer funcionar usando una estación de trabajo con PC y puede utilizar un sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede mostrar las señales de fluorescencia de forma ultrarrápida de inmediato después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una visualización cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclos para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para análisis adicional.

Como alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de unión a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBR® Green o SYBR® Gold (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes de unión a ADN fluorescentes emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de la curva de fusión para la confirmación de la presencia del producto de amplificación.

Se entiende que los modos de realización de la presente divulgación no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

Los modos de realización de la presente divulgación proporcionan además artículos de fabricación, composiciones o kits para detectar CA. Un artículo de fabricación puede incluir cebadores y sondas usados para detectar el gen de CA diana, conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Las composiciones pueden incluir cebadores usados para amplificar el gen de CA diana. En determinados modos de realización, las composiciones también pueden comprender sondas para detectar el gen de CA diana. Los cebadores y sondas representativos para la detección de CA se pueden hibridar a moléculas de ácido nucleico diana. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. En el presente documento se divulgan procedimientos de diseño de cebadores y sondas, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican y se hibridan a moléculas de ácido nucleico diana.

Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, de forma alternativa, se pueden marcar las sondas suministradas con el kit. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donante y/o uno aceptador para marcar las sondas. Los ejemplos de restos fluorescentes donantes y correspondientes restos fluorescentes aceptadores de FRET adecuados se proporcionan anteriormente.

Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica del envase que tiene instrucciones en el mismo para usar los cebadores y sondas para detectar CA en una muestra. Los artículos de fabricación y las composiciones pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para prevenir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos, tablas y figuras se proporcionan para ayudar a entender la materia objeto, el verdadero alcance de ésta se expone en las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLO 1

La selección de diana para CA fue el resultado de una búsqueda exhaustiva de la base de datos de secuencias pública, así como una búsqueda de literatura para dianas de CA con un potencial para discriminar a los vecinos más cercanosCandida haemuloniiySaccharomyces cerevisiae.Se analizaron múltiples dianas de la base de datos de secuencias pública en el procedimiento de selección de dianas de la fase de diseño, pero todas mostraron reactividad cruzada conC. haemuloniiy S.cerevisiae.Las secuencias en la base de datos pública se complican por los datos de secuencia "masivos" de dianas de múltiples copias. El análisis BLAST de los oligonucleótidos elegidos indicó que la única reactividad cruzada significativa sería conCandida haemulonii.

Se realizó la detección por PCR ultrarrápida de CA usando las plataformas del sistemacobas® 4800 o bien de los sistemascobas® 6800/8800 (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA). Las concentraciones finales de los reactivos de amplificación se muestran a continuación:

La siguiente tabla muestra el termoperfil típico usado para la reacción de amplificación por PCR:

TABLA IV T rm rfil r P R

El programa Pre-PCR comprendió la desnaturalización inicial y la incubación a 55 °C, 60 °C y 65 °C para la retrotranscripción de moldes de ARN. La incubación a tres temperaturas combina los efectos ventajosos de que a menores temperaturas también se transcriben secuencias diana ligeramente emparejadas erróneamente (tales como las variantes genéticas de un organismo), mientras que a mayores temperaturas se suprime la formación de estructuras secundarias de ARN, dando lugar por tanto a una transcripción más eficaz. El ciclado de PCR se dividió<en dos mediciones, en el que ambas mediciones aplican una configuración de una etapa (combinando hibridación>y extensión). Los 5 primeros ciclos a 55 °C permiten un incremento en la inclusividad preamplificando secuencias diana ligeramente emparejadas erróneamente, mientras que los 45 ciclos de la segunda medición proporcionan un incremento en la especificidad usando una temperatura de hibridación/extensión de 58 °C.

La amplificación y detección del gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 se realizaron usando las condiciones descritas anteriormente. Los resultados de los experimentos usando varios cebadores y sondas oligonucleotídicos seleccionados contra ADN de CA genómico presente a una concentración de 100.000, 10.000 y 1000 equivalentes genómicos por reacción PCR (ge/PCR) yCandida auris(CA) yCandida haemulonii,(CH) genómicos ambos a concentraciones de 100.000 equivalentes genómicos por reacción PCR (ge/PCR) se muestran a continuación como valores de Ct (ciclo umbral) para las reacciones de amplificación.

TABLA V Am lificación detección de en de ARNr CA 5.8s/ITS2

Los ensayos que presentaron la mejor sensibilidad para CA y la mejor exclusividad frente a CH fueron AUR1,<AUR2 y AUR5, mientras que los ensayos AUR4 y AUR>6<mostraron cierta reactividad cruzada frente a CH. El>ensayo AUR2 (es decir, cebador directo, SEQ ID NO: 2, cebador inverso, SEQ ID NO: 5 y sonda SEQ ID NO: 10) se sometió a prueba además en ADN de CA genómico presente en concentraciones de 100.000, 10.000 y 1000 ge/PCR y en ADN de CH genómico presente en una concentración de 100.000 ge/PCR y las curvas de crecimiento de PCR de este experimento se muestran en la FIG. 1. No se observó ninguna diferencia en las curvas de crecimiento entre cebadores no modificados (AUR2) y cebadores modificados con un resto ferc-butil-bencilo en el extremo 3' (AUR2TBB). No se detectaron señales para los moldes de CH usando cebadores modificados o no modificados(C. haemulonii/C. haemuloniiTBB) ni para los controles sin molde (AUR2 NTC/AUR2TBB NTC).Listado informal de secuencias

SEQ ID NO 1: Cebador directo para CAUR001TGAGCGTGATGTCTT CTCAC

SEQ ID NO 2: Cebador directo para CAUR003GAGCGTGATGTCTTCTCACC

SEQ ID NO 3: Cebador directo para CAUR005ACT GATTT GGATTTT AAAACTAACCCAASEQ ID NO 4 Cebador directo para CAUR007AACT AACCCAACGTTAAGTT CAAC

SEQ ID NO 5: Cebador inverso para CAUR002CCTGATTTGAGGCGACAACAA

<SEQ ID NO>6<: Cebador inverso para CAUR004>CGTCTGCAAGTCATACTACGTA

SEQ ID NO 7: Cebador inverso para CAUR006CGATGATTCACGTCTGCAAGTC

<SEQ ID NO>8<: Cebador inverso para CAUR008>CAACGCCACCGCGAA

SEQ ID NO 9: Sonda para CAUR101HQ6CTTCG CGGTGG CGTTGCATTCACA

SEQ ID NO 10: Sonda para CAUR103HQ6TTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA

SEQ ID NO 11: Sonda para CAUR105HQ10ACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGSEQ ID NO 12: Sonda para CAUR107HQ8CTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectarCandida auris(CA) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: - realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 para producir un producto de amplificación si el ácido nucleico ARNr CA 5.8s/ITS2 está presente en la muestra;

- realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectables; y

- detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de CA en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de CA en la muestra;

en el que el conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; y

en el que la una o más sonda oligonucleotídica de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o el complemento de la misma; o

en el que el conjunto de cebadores de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 y un segundo cebador oligonucleotídico<que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:>8<; y en el que la una o más sonda>oligonucleotídica de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o el complemento de la misma.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación con la sonda oligonucleotídica de gen de ARNr CA 5.8s/ITS2 detectable que se marca con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto aceptador; y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptador de la sonda oligonucleotídica, en el que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de CA en la muestra.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha etapa de amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa de 5' a 3'.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que el resto fluorescente donante y el<correspondiente resto aceptador están dentro de no más de>8-20<nucleótidos entre sí en la sonda.>

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el resto aceptador es un extintor.

6<. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el primer cebador oligonucleotídico>comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, el segundo cebador oligonucleotídico comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, y la sonda oligonucleotídica comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10.

<7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a>6<, en el que el primer y segundo cebador>oligonucleotídico y la sonda oligonucleotídica tienen 40 o menos nucleótidos.

8<. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que al menos uno del primer y segundo>cebador oligonucleotídico, y la sonda oligonucleotídica comprenden al menos un nucleótido modificado.

9. Un kit para detectar un ácido nucleico deCandida auris(CA) que comprende:

- un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;

- un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; y

- una sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable fluorescentemente que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o un complemento de la misma, la sonda marcada de manera detectable configurada para hibridarse a un amplicón generado por el primer y el segundo cebador oligonucleotídico; o

- un primer cebador oligonucleotídico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3;

- un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID<NO:>8<; y>

- una sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable fluorescentemente que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma, la sonda marcada de manera detectable configurada para hibridarse a un amplicón generado por el primer y el segundo cebador oligonucleotídico.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que la sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable fluorescentemente comprende un resto fluorescente donador y un correspondiente resto aceptador.

11. El kit de la reivindicación 10, en el que el resto aceptador es un extintor.

12. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende además al menos uno de nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa.

13. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que al menos uno del primer y segundo cebador oligonucleotídico y la sonda oligonucleotídica comprenden al menos un nucleótido modificado.

14. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el primer y segundo cebador oligonucleotídico y la sonda oligonucleotídica tienen 40 o menos nucleótidos.

15. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que el primer cebador oligonucleotídico comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, el segundo cebador oligonucleotídico comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, y la sonda oligonucleotídica comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10.