ES2988562T3 - Composiciones y procedimientos para la detección del virus de Epstein-Barr (VEB) - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la detección rápida de la presencia o ausencia del virus de Epstein Barr (VEB) en una muestra biológica o no biológica. Los métodos pueden incluir la realización de un paso de amplificación, un paso de hibridación y un paso de detección. Además, se proporcionan cebadores y sondas que se dirigen al VEB y kits que están diseñados para la detección de regiones diana del VEB. También se describen kits, mezclas de reacción y oligonucleótidos (por ejemplo, cebador y sonda) para la amplificación y detección del VEB. También se describen cebadores y sondas que detectan diferentes regiones del VEB y que se pueden emplear en un ensayo de doble diana para detectar simultáneamente dos regiones diana diferentes y no superpuestas del VEB. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la detección del virus de Epstein-Barr (VEB)

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al campo de diagnósticoin vitro.Dentro de este campo, la presente invención se refiere a la amplificación y detección de un ácido nucleico diana que puede estar presente en una muestra y, en particular, la amplificación, detección y/o cuantificación de un ácido nucleico diana que comprende variaciones de secuencia y/o mutaciones individuales del virus de Epstein-Barr (VEB), usando cebadores y sondas. La invención proporciona además mezclas de reacción y kits que contienen cebadores y sondas para la amplificación y detección de VEB.

Antecedentes de la invención

El virus de Epstein-Barr (VEB) es un virus de ADN, miembro del grupo de los herpesvirus (tiene una designación alternativa de herpesvirus humano 4 o HVH-4). La infección por VEB es común, con una prevalencia estimada de un 90 % en adultos y a menudo es asintomática. La infección por VEB puede provocar mononucleosis en su fase lítica inicial, antes de entrar en una o más de varias fases latentes. El VEB está altamente relacionado con enfermedades potencialmente mortales en pacientes inmunodeficientes y varias formas de cáncer (incluyendo linfoma de Burkitt (LB), linfoma hodgkiniano (LH), linfoma de células n Kt nasal (LNKT), carcinoma similar al linfoepitelioma (CSLE), carcinoma nasofaríngeo (CNF) y carcinoma gástrico (CG)). Los pacientes con trasplante inmunodeprimidos están en riesgo en particular, ya que pueden surgir complicaciones graves del crecimiento incontrolado de linfocitos B con infección por VEB latente dando lugar al trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT). El trasplante implica un equilibrio entre el riesgo de rechazo y el riesgo de enfermedad debido a la inmunodepresión. El VEB es una de varias infecciones víricas comunes (90 %), a menudo asintomáticas, pero que representa una amenaza en pacientes inmunodeprimidos, ya que el virus no se puede eliminar. TLPT es una proliferación de linfocitos B, predominantemente asociada con presencia de VEB (especialmente si es de aparición temprana). De hecho, el VEB es el segundo marcador de vigilancia postrasplante importante (después del citomegalovirus (CMV)), y el TLPT asociado a VEB es una de las neoplasias malignas más comunes después de un trasplante de órganos sólidos o células madre hematopoyéticas. Hasta un 5 % de los pacientes con trasplante desarrollan TLPT, que en el peor caso puede dar lugar a linfoma. El grupo de mayor riesgo incluye pacientes en su primer año después del trasplante, receptores sin VEB de órganos de donantes con VEB, pacientes con trasplante de células madre y pacientes pediátricos.

El VEB se puede detectar potencialmente en la circulación sanguínea a partir de ADN fragmentado y partículas víricas en plasma, y también de ARNm y genomas víricos de ADN episomal intracelular. El VEB tiene un tamaño de genoma de ~172 kb o mayor (dependiendo del número de repeticiones internas y deleciones) y puede existir en estructuras lineales o bien circulares (episomales). En general se informa de que la diversidad genética de VEB incluye dos tipos enumerados en la literatura; sin embargo, la caracterización de diversidad real del virus es más compleja y puede depender de qué sección del genoma se muestrea. Las secuencias génicas de EBNA2 y EBNA3A, B y C impulsan la clasificación de cepas de VEB en las categorías de "tipo 1" y "tipo 2" tradicionales. En general, el tipo 1 es más común en la mayoría de las áreas, aunque tanto el tipo 1 como el tipo 2 son altamente prevalentes en África. Fuera de estos genes, la divergencia tipo 1 /tipo 2 es menos pertinente y para genes seleccionados pueden existir diferentes patrones filogenéticos. Se ha descrito la variación geográfica a partir de las diferencias entre las cepas de Asia oriental de VEB y las de Europa y África; sin embargo, puede ser necesario el muestreo de más de una región génica para una caracterización completa de la diversidad del genoma de VEB. La recombinación parece que es frecuente en la historia del virus, lo que indica que se puede producir reinfección o coinfección de células individuales. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de obtener un medio fiable, sensible y reproducible para detectar el VEB.

La medición de la carga vírica de VEB se está convirtiendo en una prueba habitual para tratar a receptores de trasplantes, así como para diagnosticar y seguir enfermedades asociadas a VEB. En pacientes sometidos a seguimiento del virus VEB, se pueden usar mediciones de ADN en serie para indicar la necesidad de cambios de tratamiento potenciales y para evaluar la respuesta vírica al tratamiento. El documento US 10407733 se refiere a procedimientos y dispositivos para cribado de carcinoma nasofaríngeo.

JORDAN RICHARD C KETAL.,ORAL SURGERY, ORAL MEDICINE, ORAL PATHOLOGY, ORAL RADIOLOGY AND ENDODONTICS, vol. 92, n.° 6, páginas 650-669, se refiere a procedimientos de diagnóstico avanzados en patología oral y maxilofacial.

Dada la prevalencia generalizada de infecciones por VEB en el mundo y la frecuente recombinación que se produce en VEB, existe la necesidad en la técnica de obtener un procedimiento rápido, fiable, específico y sensible para detectar y/o cuantificar la presencia de VEB en una muestra.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En el campo del diagnóstico molecular, la amplificación y detección de ácidos nucleicos es de considerable importancia. Dichos procedimientos se pueden emplear para detectar cualquier número de microorganismos, tales como virus y bacterias. La técnica de amplificación más destacada y ampliamente usada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otras técnicas de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa, reacción en cadena de la polimerasa ligasa, Gap-LCR, reacción en cadena de reparación, 3 SR, NASBA, amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación Qp. Los sistemas automatizados para el análisis basado en PCR a menudo hacen uso de la detección ultrarrápida de la amplificación del producto durante el proceso de PCR en el mismo recipiente de reacción. La clave para dichos procedimientos es el uso de oligonucleótidos modificados que llevan grupos indicadores o marcadores. La presente invención se refiere a la amplificación y detección fiable, sensible y reproducible de VEB. Aunque el VEB es un virus de ADN con múltiples regiones diana bien conservadas para el diseño de ensayo, la posibilidad de sustituciones o deleciones no encontradas significó que un enfoque de diana doble era prudente y sensible. El diseño de los cebadores y sondas usó información de secuencia pública disponible para maximizar la inclusión para VEB y excluir otros herpesvirus.

La presente invención consiste en diseños de oligonucleótidos novedosos, diseñados para maximizar la inclusión de VEB y evitar la reactividad cruzada con otros moldes. Este ensayo de VEB se puede usar en cobas® 6800/8800. Los cebadores y sondas de la presente invención se pueden usar como un ensayo de diana doble, usando ambas dianas el mismo tinte, para proteger contra la heterogeneidad de secuencia vírica. La estrategia de diseño fue seleccionar regiones de secuencia conservadas del genoma de VEB y evaluar varias combinaciones de cebadores y sondas para cada diana. Las cinco regiones de las que se seleccionaron los diseños de ensayo fueron la repetición IR-1, LMP2A, EBNA-1 (BKRF-1), BMRF-2 y reductasa/BORF-2. Las secuencias incluyeron VEB tanto de tipo 1 como de tipo 2, y secuencias de localizaciones geográficas de todo el mundo incluyendo Asia, África, América del Norte, América del Sur, Europa y Australia. Después de un proceso de cribado y optimización, se identificaron los dos candidatos que estaban justo más allá del exón final de EBNA-1 y dentro de la secuencia codificante de BMRF-2. Estos candidatos se podrían usar individualmente o juntos en duplicado en un ensayo de diana doble. Si se usa como ensayo de diana doble, se emplean dos conjuntos de cebadores y sonda (detectando cada conjunto EBNA-1 o bien BMRF-2).

Determinados modos de realización en la presente divulgación se refieren a procedimientos para la detección rápida de la presencia o ausencia de VEB en una muestra biológica o no biológica, por ejemplo, detección múltiple y cuantificación de VEB por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ultrarrápida en un único recipiente o tubo de ensayo. Los modos de realización incluyen procedimientos de detección de VEB que comprenden realizar al menos una etapa de ciclado, que puede incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. Además, los modos de realización incluyen cebadores, sondas y kits que se diseñan para la detección de VEB en un único tubo o recipiente.

Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del virus de Epstein-Barr (VEB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra de ácido nucleico; (b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más conjuntos de cebadores para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB está presente en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB está presente en la muestra, con una o más sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra; y en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y/o (ii) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma. En un modo de realización relacionado, la muestra es una muestra biológica. En un modo de realización relacionado, la muestra biológica es plasma. En un modo de realización relacionado, la muestra biológica es sangre. En otro modo de realización, el procedimiento es para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra, en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas para detectar los primeros ácidos nucleicos diana de VEB comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas para detectar los segundos ácidos nucleicos diana de VEB comprenden: (ii) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.

Otro aspecto se refiere a un procedimiento para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra de ácido nucleico; (b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con dos conjuntos de cebadores para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB está presente en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB está presente en la muestra, con dos sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra; y en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas para detectar el primer ácido nucleico diana de<v>E<b>comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas para detectar el segundo ácido nucleico diana de VEB comprenden: (ii) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica. En otro modo de realización, la muestra biológica es plasma. En otro modo de realización, la muestra biológica es sangre.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos diana de VEB que pueden estar presentes en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden: (a) una ADN polimerasa; (b) monómeros nucleotídicos; (c) uno o más conjuntos de cebadores; y (d) una o más sondas, en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y/o (ii) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, la una o más sondas se marca con un resto fluorescente donante y un resto aceptador correspondiente. En otro modo de realización, el kit es para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra, en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas para detectar los primeros ácidos nucleicos diana de VEB comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas para detectar los segundos ácidos nucleicos diana de VEB comprenden: (ii) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden: (a) una ADN polimerasa; (b) monómeros nucleotídicos; (c) un primer conjunto de cebadores y una sonda para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB; y (d) un segundo conjunto de cebadores y una sonda para detectar un segundo ácido nucleico diana de VEB, en el que un primer conjunto de cebadores y una sonda para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y en el que el segundo conjunto de cebadores y una sonda para detectar un segundo ácido nucleico diana de VEB comprenden: (ii) un conjunto de cebadores que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, las sondas se marcan con un resto fluorescente donante y un resto aceptador correspondiente. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes. En otro modo de realización, el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.

Otros aspectos proporcionan un oligonucleótido que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de s Eq ID NO: 1-6, o un complemento de la misma, oligonucleótido que tiene 100 o menos nucleótidos. En otro modo de realización, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90%o 95 %, etc.) con una de SEQ ID. NO: 1-6, o un complemento de las mismas, oligonucleótido que tiene 100 o menos nucleótidos. En general, estos oligonucleótidos pueden ser ácidos nucleicos de cebador, ácidos nucleicos de sonda o similares en estos modos de realización. En determinados de estos modos de realización, los oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos (por ejemplo, 35 o menos nucleótidos, 30 o menos nucleótidos, 25 o menos nucleótidos, 20 o menos nucleótidos, 15 o menos nucleótidos, etc.). En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación de ácido nucleico con respecto a nucleótidos no modificados. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y opcionalmente al menos un resto extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos incluyen al menos una variación modificada de forma conservadora. "Variaciones modificadas de forma conservadora" o, simplemente, "variaciones conservadoras" de una secuencia de ácido nucleico particular se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único nucleótido o un pequeño porcentaje de nucleótidos (típicamente menos de un 5 %, más típicamente menos de un 4 %, 2 % o 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de forma conservadora" donde las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar.

En un aspecto, la amplificación puede emplear una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3'. Por tanto, el resto fluorescente donante y el resto aceptador, por ejemplo, un extintor, pueden estar dentro de no más de 5 a 20 nucleótidos (por ejemplo, dentro de 7 o 10 nucleótidos) entre sí a lo largo de la longitud de la sonda. En otro aspecto, la sonda incluye una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructura secundaria. Dicha formación de estructura secundaria puede dar como resultado una proximidad espacial entre el primer y segundo resto fluorescente. De acuerdo con este procedimiento, el segundo resto fluorescente en la sonda puede ser un extintor.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de VEB o ácido nucleico de VEB en una muestra biológica de un individuo. Estos procedimientos se pueden emplear para detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico de VEB en plasma, por ejemplo, para su uso en hemocribado y pruebas de diagnóstico. Adicionalmente, la misma prueba se puede usar por alguien con experiencia en la técnica para evaluar orina y otros tipos de muestras para detectar y/o cuantificar ácido nucleico de VEB. Dichos procedimientos incluyen en general realizar al menos una etapa de ciclado, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de unión a tinte. Típicamente, la etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con una pluralidad de pares de cebadores oligonucleotídicos para producir uno o más productos de amplificación si una molécula de ácido nucleico está presente en la muestra, y la etapa de unión a tinte incluye poner en contacto el producto de amplificación con un tinte de unión a ADN bicatenario. Dichos procedimientos también incluyen detectar la presencia o ausencia de unión del tinte de unión a ADN bicatenario en el producto de amplificación, en los que la presencia de unión es indicativa de la presencia de ácido nucleico de VEB en la muestra, y en los que la ausencia de unión es indicativa de la ausencia de ácido nucleico de VEB en la muestra. Un tinte de unión a ADN bicatenario representativo es bromuro de etidio. Otros tintes de unión a ácido nucleico incluyen DAPI, tintes Hoechst, PicoGreen®, RiboGreen®, OliGreen® y tintes de cianina tales como YO-YO® y SY<b>R® Green. Además, dichos procedimientos también pueden incluir determinar la temperatura de fusión entre el producto de amplificación y el tinte de unión a ADN bicatenario, en los que la temperatura de fusión confirma la presencia o ausencia de ácido nucleico de VEB.

En otro modo de realización, se proporciona un kit para detectar y/o cuantificar uno o más ácidos nucleicos de VEB. El kit puede incluir uno o más conjuntos de cebadores específicos para la amplificación de la diana génica; y una o más sondas oligonucleotídicas detectables específicas para la detección de los productos de amplificación.

En un aspecto, el kit puede incluir sondas ya marcadas con restos donantes y aceptadores correspondientes, por ejemplo, otro resto fluorescente o un extintor oscuro, o puede incluir restos fluoróforos para marcar las sondas. El kit también puede incluir nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. El kit también puede incluir un prospecto del envase e instrucciones para usar los cebadores, sondas y restos fluoróforos para detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico de VEB en una muestra.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente materia objeto, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos solo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

LaFIG. 1muestra la estructura de genoma de VEB. La FIG. 1A muestra un diagrama esquemático del genoma de VEB lineal (forma lítica). La FIG. 1B muestra un diagrama esquemático del genoma de VEB circular (forma latente). El VEB es un virus de ADN bicatenario que es de ~172 kb y más grande. Existen: (i) regiones en gran medida únicas, (ii) regiones de repetición interna (IR1-IR4), (iii) repetición terminal (TR), (iv)Ori P.,que es el origen de la replicación del episoma de VEB de infección latente, tiene actividad de mantenimiento plasmídico y replicación de a Dn , y (v) exones para proteínas nucleares y proteínas de membrana inducidas por VEB latentes. La FIG. 1 resalta las dianas de VEB BMRF2 y EBNA1, que se pueden usar como un ensayo de diana doble.

LaFIG. 2muestra las dianas de VEB y el conjunto de oligonucleótidos para EBNA1, incluyendo el amplicón de 96 pares de bases, generado por los cebadores y detectado por la sonda.

LaFIG. 3muestra las dianas de VEB y el conjunto de oligonucleótidos para BMRF2, incluyendo el amplicón de 98 pares de bases, generado por los cebadores y detectado por la sonda.

LasFIGS.4A-Cmuestran curvas de crecimiento de PCR de una serie de diluciones del rendimiento del ensayo en un panel analítico de VEB Qnostics (n.° catálogo Qnostics EBVAQP03-C) frente a un patrón de la OMS para VEB (código NIBSC 09/260), en 8 (FIG. 4C), 80 (FIG. 4B) y 8.000 Ul/ml (FIG. 4A). También se sometieron a prueba otros tipos de muestras de VEB, tales como ADN de VEB extraído y ADN de la línea celular Raji enriquecido en plasma sin VEB (datos no mostrados).

LasFIGS. 5A-5Lmuestran curvas de crecimiento de PCR de una serie de diluciones del rendimiento del ensayo multiplexado en un material derivado de cultivo celular (de 1E4 Ul/ml a 20 Ul/ml) (FIGS. 5H-5L) y para un molde de control (de 1E9 Ul/ml a 1E3 Ul/ml) (FIGS. 5A-5G). El canal 2 muestra el ensayo de VEB de diana doble y el canal 5 es una reacción de control interno.

LasFIGS. 6Ay6Bmuestran curvas de crecimiento de PCR para reacciones separadas para EBNA1 (FIG. 6Ay BMRF2 (FIG. 6ben moldes plasmídicos que contienen dianas individuales (E1c, B2c) o ambas dianas (dC), así como una extracción de línea celular B95-8 (que contiene copias de ADN de VEB). Estos estudios demuestran que los ensayos de VEB de EBNA1 y BMRF2 de diana doble son eficaces e identifican específicamente el ácido nucleico de VEB de EBNA1 y BMRF2.

LaFIG. 7muestra datos de linealidad para el ensayo de diana doble en un material derivado de cultivo celular de genotipo 1 y para un molde de control.

LaFIG. 8muestra datos de linealidad para el ensayo de diana doble en un material derivado de cultivo celular que contiene genotipo 2 de VEB.

Descripción detallada de la invención

El diagnóstico de infección por VEB por amplificación de ácido nucleico proporciona un procedimiento para detectar y/o cuantificar de forma rápida, exacta, fiable, específica y sensible la infección por VEB. Un ensayo de PCR ultrarrápida para detectar y/o cuantificar ácidos nucleicos de VEB, incluyendo<a>D<n>y/o ARN, en una muestra biológica o no biológica se describe en el presente documento. Se proporcionan cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar VEB, al igual que artículos de fabricación o kits que contienen dichos cebadores y sondas. El incremento en la especificidad y sensibilidad de PCR ultrarrápida para la detección de VEB en comparación con otros procedimientos, así como la mejora en los rasgos característicos de PCR ultrarrápida incluyendo la contención de muestra y detección y cuantificación ultrarrápida del producto amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología para el diagnóstico habitual de infecciones por VEB en el laboratorio clínico. Adicionalmente, esta tecnología se puede emplear para hemocribado así como para pronóstico. Este ensayo de detección de VEB también se puede multiplexar con otros ensayos para la detección de otros ácidos nucleicos, por ejemplo, otras bacterias y/o virus, en paralelo.

La presente divulgación incluye cebadores oligonucleotídicos y sondas de hidrólisis marcadas con fluorescencia que se hibridan al genoma de VEB, para identificar específicamente VEB usando, por ejemplo, tecnología de amplificación y detección TaqMan®.

Los procedimientos divulgados pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una o más porciones de la diana génica de la molécula de ácido nucleico de una muestra usando uno o más pares de cebadores. "Cebador(es) de VEB" como se usa en el presente documento se refiere a cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente a secuencias de ácido nucleico halladas en el genoma de VEB e inician la síntesis de ADN a partir de las mismas en condiciones apropiadas produciendo los respectivos productos de amplificación. Los ejemplos de secuencias de ácido nucleico halladas en el genoma de VEB incluyen ácidos nucleicos dentro de la región proteica de la cápside vírica del genoma de VEB, tal como la región VP2. Cada uno de los cebadores de VEB analizados se hi brida a una diana de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la diana. El uno o más productos de amplificación se producen siempre que uno o más ácidos nucleicos estén presentes en la muestra, por tanto la presencia del uno o más productos de amplificación es indicativa de la presencia de VEB en la muestra. El producto de amplificación debe contener secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una o más sondas detectables para VEB. "Sonda(s) de VEB" como se usa en el presente documento se refiere a sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente a secuencias de ácidos nucleicos halladas en el genoma de VEB. Cada etapa de ciclado incluye una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en las que la muestra se pone en contacto con la una o más sondas de VEB detectables para la detección de la presencia o ausencia de v Eb en la muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere al proceso de sintetizar moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico molde (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico del genoma de VEB). Amplificar una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores al ácido nucleico molde a una temperatura que está por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores y alargar enzimáticamente a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación típicamente requiere la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Platinum® Taq) y un tampón y/o cofactores apropiados para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCh y/o KCl).

El término "cebador" como se usa en el presente documento es conocido para los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3' del, por ejemplo, oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre donde se pueden unir otros "nucleótidos" por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato y con lo que se libera pirofosfato.

El término "hibridar" se refiere a la hibridación de una o más sondas a un producto de amplificación. Las "condiciones de hibridación" típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación inespecífica de las sondas.

El término "actividad nucleasa 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebra de ácido nucleico, con lo que los nucleótidos se retiran del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión de cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y avanza en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables deThermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilusyMethanothermus fervidus.No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no son termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima, si es necesario.

El término "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que tanto tiene la misma longitud que, como es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento" cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótido, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los programas BLAST, que se describen en, por ejemplo, Altschulet al.(1990) "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 215:403-410, Gishet al.(1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266-272, Maddenet al.(1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschulet al.(1997) "Gapped BLAST and PSI-B<l>AST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 y Zhanget al.(1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation" Genome Res. 7:649-656.

Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia de oligonucleótidos se reemplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, un t-butilbencilo, un C5-metil-dC, un C5-etil-dC, un C5-metil-dU, un C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, un C5-propinil-dC, un C5-propinil-dU, un C7-propinil-dA, un C7-propinil-dG, un C5-propargilamino-dC, un C5-propargilamino-dU, un C7-propargilamino-dA, un C7-propargilamino-dG, un 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, un pseudo-dU, un nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, un N4-etil-dC, un N6-metil-dA, un 5-propinil-dU, un 5-propinil-dC, 7-desaza-desoxiguanosina (desaza G (u-desaza)) y similares. Se hace referencia a muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos en el presente documento o de otro modo son conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos no modificados correspondientes. Para ilustrar además, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico inespecífica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebador o similares), incrementar el rendimiento de un amplicón diana previsto y/o similares en algunos modos de realización. Los ejemplos de estos tipos de modificaciones de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.001.611.

Otras sustituciones de nucleótidos modificados pueden alterar la estabilidad del oligonucleótido o proporcionar otros rasgos característicos deseables.

Detección/cuantificación de ácido nucleico diana de VEB

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar VEB amplificando, por ejemplo, una porción de la secuencia de ácido nucleico de VEB. Específicamente, los cebadores y sondas para amplificar y detectar y/o cuantificar dianas de moléculas de ácido nucleico de VEB se proporcionan por los modos de realización de la presente divulgación.

Para la detección y/o cuantificación de VEB, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar y detectar/cuantificar el VEB. También se pueden usar ácidos nucleicos de VEB distintos de los ejemplificados en el presente documento para detectar VEB en una muestra. Por ejemplo, se pueden evaluar variantes funcionales para determinar la especificidad y/o sensibilidad por los expertos en la técnica usando procedimientos habituales. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los ácidos nucleicos de VEB divulgados en el presente documento.

Más específicamente, los modos de realización de los oligonucleótidos incluyen cada uno un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1-6, una variante sustancialmente idéntica de la misma en la que la variante tiene al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 1 6, o un complemento de SEQ ID NO: 1-6 y la variante.

Tabla 1: oligonucleótidos en la prueba de VEB

En un modo de realización, los conjuntos descritos anteriormente de cebadores y sondas de VEB se usan para proporcionar la detección de VEB en una muestra biológica sospechosa de contener VEB (tabla 1). Los conjuntos de cebadores y sondas pueden comprender o consistir en los cebadores y sondas específicos para las secuencias de ácido nucleico de<v>E<b>, que comprenden o consisten en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-6. En otro modo de realización, los cebadores y sondas para la diana de VEB comprenden o consisten en una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y sondas de SEQ ID NO: 1-6.

Una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y/o sondas de SEQ ID NO: 1-6 se puede identificar usando los cebadores y/o sondas en los procedimientos divulgados. Una variante funcionalmente activa de un cebador y/o sonda de cualquiera de SEQ ID NO:1-6 pertenece a un cebador y/o sonda que proporciona una especificidad y sensibilidad similares o mayores en el procedimiento o kit descrito en comparación con la respectiva secuencia de SEQ ID NO: 1-6.

La variante puede variar, por ejemplo, de la secuencia de SEQ ID NO:1-6 en una o más adiciones, deleciones o sustituciones nucleotídicas tal como una o más adiciones, deleciones o sustituciones nucleotídicas en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la respectiva secuencia de SEQ ID NO:1-6. Como se detalla anteriormente, un cebador y/o sonda se puede modificar químicamente, es decir, un cebador y/o sonda puede comprender un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. A continuación, una sonda (o un cebador) es un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos nucleotídicos") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un glúcido pentofuranosilo o un compuesto similar a glúcido pentofuranosilo, una porción fosfato o porción similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un "marcador" se puede unir a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede reemplazar por, por ejemplo, una 7-desazapurina con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo nucleotídico" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo nucleosídico") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo nucleotídico").

Los oligonucleótidos que incluyen oligonucleótidos modificados y análogos oligonucleotídicos que amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica la diana de VEB, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican porciones alternativas de VEB, se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa informático tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser lo suficientemente largos como para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis oligonucleotídica). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos son de 8 a 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos de longitud).

Además de un conjunto de cebadores, los procedimientos pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de VEB. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse bajo restricciones predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) a "ácidos nucleicos diana", en el presente caso a un ácido nucleico (diana) de VEB. Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", que quiere decir que detecta el ácido nucleico diana.

En algunos modos de realización, las sondas de VEB descritas se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas de VEB se pueden marcar con un resto fluorescente donante, por ejemplo, un tinte fluorescente y un resto aceptador correspondiente, por ejemplo, un extintor. En un modo de realización, la sonda comprende o consiste en un resto fluorescente y las secuencias de ácido nucleico comprenden o consisten en SEQ ID NO: 2 y/o 5.

Diseñar oligonucleótidos que se van a usar como sondas se puede realizar de manera similar al diseño de cebadores. Los modos de realización pueden usar una única sonda o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, la(s) sonda(s) usada(s) puede(n) comprender al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Como con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas en general son de 15 a 40 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21,22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud. Las construcciones pueden incluir vectores conteniendo cada uno una de moléculas de ácido nucleico de cebadores y sondas de VEB (por ejemplo, SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 y 5). Se pueden usar construcciones, por ejemplo, como moléculas de ácido nucleico molde de control. Los vectores adecuados para su uso están disponibles comercialmente y/o se producen por procedimientos de tecnología de ácido nucleico recombinante habituales en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico de VEB se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis química, clonación directa de VEB o por amplificación de ácido nucleico.

Las construcciones adecuadas para su uso en los procedimientos típicamente incluyen, además de las moléculas de ácido nucleico de VEB (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una o más secuencias de SEQ ID NO: 1-6), secuencias que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) para seleccionar construcciones y/o transformantes deseados, y un origen de replicación. La elección de sistemas de vectores normalmente depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la elección de células huésped, eficacia de la replicación, selectividad, inducibilidad y la facilidad de recuperación.

Las construcciones que contienen moléculas de ácido nucleico de VEB se pueden propagar en una célula huésped.

Como se usa en el presente documento, el término célula huésped pretende incluir procariotas y eucariotas, tales como células de levadura, vegetales y animales. Los huéspedes procariotas pueden incluirE. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescensyBacillus subtilis.Los huéspedes eucariotas incluyen levaduras tales como S.cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris,células de mamífero tales como células COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto y células vegetales tales comoArabidopsis thalianayNicotiana tabacum.Se puede introducir una construcción en una célula huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus son procedimientos comunes para introducir ácidos nucleicos en células huésped. Además, se puede suministrar ADN no marcado directamente a las células (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.580.859 y 5.589.466).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en algunos modos de realización incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como puntos de iniciación de síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de VEB descritas (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 4 y 6). Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una eficacia máxima en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. En primer lugar, se desnaturalizan los cebadores bicatenarios, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento para desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento para separar las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal del tampón y la longitud y composición nucleotídica de los ácidos nucleicos que se están desnaturalizando, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo dependiendo de rasgos característicos de la reacción, tales como temperatura y la longitud de ácido nucleico. La desnaturalización típicamente se realiza durante de aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de 1 min a 2 min 30 s, o 1,5 min).

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueve la hibridación de cada cebador con su secuencia diana. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). A continuación, se ajusta la mezcla de reacción hasta una temperatura a la que la actividad de la polimerasa se promueve o se optimiza, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía en general de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C)). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).

El genoma de un retrovirus o virus de ARN, o el ARNm producido por un virus de ADN, tal como VEB, está compuesto de un ácido ribonucleico, es decir, ARN. En dicho caso, el ácido nucleico molde, ARN, se debe transcribir primero en ADN complementario (ADNc) por medio de la acción de la enzima retrotranscriptasa. Las retrotranscriptasas usan un molde de ARN y un cebador corto complementario al extremo 3' del ARN para dirigir la síntesis de la primera hebra de ADNc, que a continuación se puede usar directamente como molde para la reacción en cadena de la polimerasa.

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico de VEB tal como ARN o ADN (ADNc). No se necesita purificar el ácido nucleico molde; puede ser una fracción minoritaria de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico de VEB contenido en células humanas. Las moléculas de ácido nucleico de VEB se pueden extraer de una muestra biológica por técnicas habituales tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persinget al.(eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos de una serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales incluyendo bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 4 y 6) se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión de cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena en general incluyen KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCh 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5 1,0 |jg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de polimerasa Taq y D<m>S<o>al 10 %). Las reacciones normalmente contienen de 150 a 320 jM de cada uno de dATP, dCTP, dTTp dGTP o uno o más análogos de los mismos.

Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación de hebras, hibridación y alargamiento se pueden repetir tan a menudo como se necesite para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondiente a las moléculas de ácido nucleico de VEB. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana lo suficiente para su detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tantas como 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología FRET (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en el concepto de que cuando un resto fluorescente donante y un resto fluorescente aceptador correspondiente se sitúan dentro de una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o detectar y/o cuantificar de otro modo. El donante típicamente transfiere la energía al aceptador cuando el donante se excita por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptador típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En determinados sistemas, se puede transferir energía no fluorescente entre restos donantes y aceptadores, por medio de biomoléculas que incluyen restos donantes sustancialmente no fluorescentes (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.741.467).

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto o tinte fluorescente donante (por ejemplo, HEX o FAM) y un extintor correspondiente (por ejemplo, BlackHole Quencher™ (BHQ) (tal como BHQ-2)), que puede ser fluorescente o no, y que disipa la energía transferida en una forma distinta de luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía típicamente se produce entre los restos donantes y aceptadores, de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante se extingue por el resto aceptador. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, una sonda unida a un producto de amplificación se escinde por la actividad nucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante ya no se extingue. Las sondas ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donante-aceptador usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quencher™ (BHQ) (tal como BHQ2), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), lowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, lowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, que contienen cada una un resto fluorescente, se pueden hibridar a un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con la secuencia de ácido nucleico diana de VEB. Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas al ácido nucleico de producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min.

Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para supervisar la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. La excitación para iniciar la transferencia de energía, o para permitir la detección directa de un fluoróforo, se puede llevar a cabo con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una lámpara de xenón, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos donantes y aceptadores correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptador o un extintor oscuro que tiene un espectro de absorbancia que se superpone al espectro de emisión del resto fluorescente donante. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptador debe ser al menos 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donante. En consecuencia, se puede producir transferencia de energía no radiante eficaz entre los mismos.

Los restos donantes y aceptadores correspondientes fluorescentes en general se eligen para (a) transferencia de energía de Foerster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) desplazamiento de la emisión lo más lejos posible en la porción roja del espectro visible (>600 nm); y (d) desplazamiento de la emisión a una longitud de onda mayor que la emisión fluorescente de agua de Raman producida por excitación a la longitud de onda de excitación de donante. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donante que tiene su máximo de excitación cercano a una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y una buena superposición de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del resto fluorescente aceptador correspondiente. Se puede elegir un resto fluorescente aceptador correspondiente que tiene un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, una buena superposición de su excitación con la emisión del resto fluorescente donante y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).

Los restos fluorescentes donantes representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptadores en tecnología FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptadores representativos, dependiendo del resto fluorescente donante usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonilo de lisaminarodamina B, tetrametilrrodamina-isotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donantes y aceptadores, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donantes y aceptadores se pueden unir al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donantes y aceptadores. La longitud de un brazo conector puede ser la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica al resto fluorescente. En general, un brazo conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser del tipo descrito en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para unir brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para unir restos fluorescentes a un brazo conector.

Un resto fluorescente aceptador, tal como un LC Red 640, se puede combinar con un oligonucleótido que contiene un conector de amino (por ejemplo, C6-aminofosforamiditas disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, un oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante tal como fluoresceína a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-NHS-éster, tal como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG que requieren el acoplamiento de fluoresceína-NHS-éster después de la síntesis oligonucleotídica.

Detección de producto amplificado de VEB (amplicón)

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de VEB en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos proporcionados evitan problemas de contaminación de muestra, negativos falsos y positivos falsos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de moléculas de ácido nucleico diana de VEB de una muestra usando uno o más pares de cebadores de VEB y una etapa de detección FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Se pueden realizar procedimientos usando cebadores y sondas de VEB para detectar la presencia de VEB, y la detección de VEB indica la presencia de VEB en la muestra. Como se describe en el presente documento, se pueden detectar productos de amplificación usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología FRET. Un formato FRET utiliza tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, y por tanto, la presencia o ausencia de VEB. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada con, por ejemplo, un resto o tinte fluorescente (por ejemplo, HEX o FAM) y un extintor (por ejemplo, BHQ-2), que puede ser fluorescente o no. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente o un extintor oscuro de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente en general es una molécula extintora. Durante la etapa de hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad nucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa tecnología TaqMan®, y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de VEB en la muestra. También se pueden usar balizas moleculares conjuntamente con FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de PCR ultrarrápida. La tecnología de baliza molecular usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente es en general un extintor, y los marcadores fluorescentes típicamente se localizan en cada extremo de la sonda. La tecnología de baliza molecular usa un oligonucleótido de sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructura secundaria dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación a los ácidos nucleicos diana (es decir, productos de amplificación), la estructura secundaria de la sonda se altera y los restos fluorescentes se separan entre sí de modo que después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se pueda detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Otro formato común de tecnología FRET utiliza dos sondas de hibridación. Cada sonda se puede marcar con un resto fluorescente diferente y en general se diseñan para hibridarse en estrecha proximidad entre sí en una molécula de ADN diana (por ejemplo, un producto de amplificación). Un resto fluorescente donante, por ejemplo, fluoresceína, se excita a 470 nm por la fuente de luz del instrumento LightCycler®. Durante FRET, la fluoresceína transfiere su energía a un resto fluorescente aceptador, tal como LightCycler®-Red 640 (LC Red 640) o LightCycler®-Red 705 (LC Red 705). A continuación, el resto fluorescente aceptador emite luz de una longitud de onda más larga, que se detecta por el sistema de detección óptica del instrumento LightCycler®. La FRET eficaz solo puede tener lugar cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donante se solapa con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptador. La intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ADN diana originales (por ejemplo, el número de genomas de VEB). Si se produce amplificación del ácido nucleico diana de VEB y se produce un producto de amplificación, la etapa de hibridación da como resultado una señal detectable basada en FRET entre los miembros del par de sondas.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de VEB en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de v Eb en la muestra. Sin embargo, la extracción de muestras inadecuada, retrasos de transporte, condiciones de transporte inapropiadas o uso de determinados hisopos de extracción (varilla de alginato de calcio o aluminio) son todas condiciones que pueden afectar al éxito y/o exactitud de un resultado de prueba.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar para practicar los procedimientos incluyen, pero no se limitan a sangre completa, muestras respiratorias, orina, muestras fecales, muestras de sangre, plasma, hisopos dérmicos, hisopos nasales, hisopos de heridas, hemocultivos, piel e infecciones de tejidos blandos. Los procedimientos de extracción y almacenamiento de muestras biológicas son conocidos para los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar ácido nucleico de VEB o en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados. En algunos casos, la muestra biológica es sangre completa. Cuando típicamente se extrae sangre completa, a menudo se extrae en recipientes que contienen anticoagulantes, tales como heparina, citrato o EDTA, lo que permite que la sangre completa se almacene a temperaturas adecuadas. Sin embargo, en dichas condiciones, los ácidos nucleicos dentro de la sangre completa experimentan una cantidad considerable de degradación. Por lo tanto, puede ser ventajoso extraer la sangre en un reactivo que lisará, desnaturalizará y estabilizará los componentes de sangre completa, incluyendo ácidos nucleicos, tal como una solución estabilizadora de ácido nucleico. En dichos casos, los ácidos nucleicos se pueden conservar y estabilizar mejor para su posterior aislamiento y análisis, tal como por una prueba de ácido nucleico, tal como PCR. Dichas soluciones estabilizadoras de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, medio de PCR cobas, que contiene sal de guanadinio (GuHCl) 4,2 M y Tris 50 mM, a un pH de 7,5.

La muestra se puede extraer por cualquier procedimiento o dispositivo diseñado para contener y almacenar adecuadamente la muestra antes del análisis. Dichos procedimientos y dispositivos son bien conocidos en la técnica. En el caso de que la muestra sea una muestra biológica, tal como sangre completa, el procedimiento o dispositivo puede incluir un recipiente de extracción de sangre. Dicho recipiente de extracción de sangre es bien conocido en la técnica y puede incluir, por ejemplo, un tubo de extracción de sangre. En muchos casos, puede ser ventajoso usar un tubo de extracción de sangre en el que el recipiente de extracción de sangre está bajo presión en el espacio destinado a la toma de muestra, tal como un recipiente para sangre con una cámara al vacío, tal como un tubo de extracción de sangre Vacutainer. Dichos tubos de extracción de sangre con una cámara al vacío, tales como un tubo de extracción de sangre Vacutainer, son bien conocidos en la técnica. Puede ser además ventajoso extraer la sangre en un recipiente de extracción de sangre, con o sin una cámara al vacío, que contiene en su interior una solución que lisará, desnaturalizará y estabilizará los componentes de sangre completa, incluyendo los ácidos nucleicos, tales como una solución estabilizadora de ácido nucleico, de modo que la sangre completa que se extrae se pone en contacto de inmediato con la solución estabilizadora de ácido nucleico en el recipiente de extracción de sangre.

El análisis de la curva de fusión es una etapa adicional que se puede incluir en un perfil de ciclado. El análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el ADN se funde a una temperatura característica llamada temperatura de fusión (Tf), que se define como la temperatura a la que la mitad de las dobles hebras de ADN se han separado en hebras únicas. La temperatura de fusión de un ADN depende principalmente de su composición nucleotídica. Por tanto, las moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen una mayor Tf que las que tienen una abundancia de nucleótidos A y T Detectando la temperatura a la que se pierde la señal, se puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. De forma similar, detectando la temperatura a la que se genera la señal, se puede determinar la temperatura de hibridación de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las sondas de VEB de los productos de amplificación de VEB puede(n) confirmar la presencia o ausencia de VEB en la muestra.

Dentro de cada tanda de termociclador, también se pueden ciclar muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contiene las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una tanda de muestra separada paralelamente con las muestras del paciente usando los mismos cebadores y sonda como se usa para la detección de la diana prevista. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada tanda de termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carece de ADN molde diana. El/los control(es) negativo(s) puede(n) medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no dan lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas para hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca FRET.

En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa se describe en las patentes de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una tanda de termociclador y la siguiente. Los procedimientos de PCR convencionales conjuntamente con tecnología FRET se pueden usar para practicar los procedimientos. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida como se usa en la tecnología LightCycler®: WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

El LightCycler® se puede operar usando una estación de trabajo de PC. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede mostrar las señales de fluorescencia de forma ultrarrápida de inmediato después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una visualización cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclos para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para análisis adicional.

El sistema de PCR ultrarrápida LightCycler® 480 II también se puede operar usando una estación de trabajo de PC. El instrumento tiene un ciclador de bloque térmico y el calentamiento y enfriamiento se logra usando elementos Peltier. Las señales fluorescentes de las muestras se obtienen de la placa de 96 pocillos usando una lámpara de xenón de alta intensidad que emite luz en un amplio espectro. La combinación flexible de los filtros incorporados para excitación y emisión específicas permite el uso de una variedad de tintes fluorescentes y formatos de detección. El programa informático puede mostrar las señales de fluorescencia y calcular valores de CT, y los datos generados se pueden almacenar para análisis adicional.

Como alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de unión a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBR® Green o SYBR® Gold (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes de unión a ADN fluorescentes emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de la curva de fusión para la confirmación de la presencia del producto de amplificación.

Un experto en la técnica apreciará que también se pueden emplear otros procedimientos de amplificación de señal o ácido nucleico. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen, sin limitación, amplificación de señales de ADN ramificado, amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3 SR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o procedimiento de amplificación inteligente versión 2 (SMAP 2).

Se entiende que los modos de realización de la presente divulgación no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

Los modos de realización de la presente divulgación proporcionan además artículos de fabricación o kits para detectar VEB. Un artículo de fabricación puede incluir cebadores y sondas usados para detectar la diana génica de VEB, conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Los cebadores y sondas representativos para la detección de VEB se pueden hibridar a moléculas de ácido nucleico diana de VEB. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. Los procedimientos para diseñar cebadores y sondas se divulgan en el presente documento, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican y se hibridan a moléculas de ácido nucleico diana de VEB.

Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, de forma alternativa, se pueden marcar las sondas suministradas con el kit. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donante y/o aceptador para marcar las sondas de VEB. Los ejemplos de restos fluorescentes donantes y restos fluorescentes aceptadores correspondientes de FRET adecuados se proporcionan anteriormente.

Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica del envase que tiene instrucciones en el mismo para usar los cebadores y sondas de VEB para detectar VEB en una muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para evitar la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento.

Los modos de realización de la presente divulgación también proporcionan un conjunto de cebadores y una o más sondas detectables para la detección de VEB en una muestra.

Los modos de realización de la presente divulgación se describirán además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a entender la materia objeto, el verdadero alcance de ésta se expone en las reivindicaciones adjuntas.

La prueba fue una preparación de muestra totalmente automatizada (extracción y purificación de ácido nucleico) seguida de amplificación y detección por PCR. El sistema usado fue el sistema cobas® 6800/8800, que consistió en un módulo de suministro de muestra, el módulo de transferencia, el módulo de procesamiento y el módulo analítico. La gestión de datos automatizada se realizó por el sistema cobas® 6800/8800. La mezcla maestra contuvo sondas de detección que fueron específicas para VEB y ácidos nucleicos de control. Las sondas de detección de VEB y de control específicas se marcaron cada una con uno de los dos tintes fluorescentes únicos que actúan como indicador. Cada sonda también tuvo un segundo tinte que actuó como extintor. El tinte indicador se mide a una longitud de onda definida, permitiendo por tanto la detección y discriminación de la diana de VEB amplificada y el control. La señal fluorescente de las sondas intactas se suprimió por el tinte extintor. Durante la etapa de amplificación por PCR, la hibridación de las sondas al molde de ADN monocatenario específico dio como resultado la escisión por la actividad nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa dando como resultado la separación de los tintes de indicador y extintor y la generación de señal fluorescente. Con cada ciclo de PCR, se generaron cantidades crecientes de sondas escindidas y al mismo tiempo se incrementó la señal acumulativa del tinte indicador. Debido a que los dos tintes indicadores específicos se miden a longitudes de onda definidas, fue posible la detección y discriminación simultáneas de la diana de VEB amplificada y el control.

Los cebadores y sondas para la prueba de VEB se diseñaron sembrando cebadores y sondas a lo largo del genoma en las regiones más conservadas en base a la alineación. Se diseñó un conjunto de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 1-3) para detectar la región BMRF2 del genoma de VEB. Se diseñó otro conjunto de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 4-6) para detectar la región EBNA1 del genoma de VEB.

Cada conjunto de oligonucleótidos (o cebadores/sondas) se puede usar de forma individual en su propia reacción para amplificar y detectar la región diana particular de interés (es decir, BMRF2 y EBNA1). Sin embargo, el conjunto de oligonucleótidos también se puede combinar en un ensayo de diana doble, con lo que en una única reacción de PCR ultrarrápida, tanto BMRF2 como EBNA1 se amplifican y se detectan en la muestra, porque la mezcla de reacción contiene ambos conjuntos de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 1-3 y SEQ ID NO: 4-6). Para la detección de la región BMRF2, el cebador directo corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, el cebador inverso corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 y la sonda corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2. Para la detección de la región EBNA1, el cebador directo corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, el cebador inverso corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 y la sonda corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. Estos oligonucleótidos se pueden emplear en ensayos individuales para la detección de la región BMRF2 de VEB (usando SEQ ID NO: 1-3) y para la detección de la región EBNA1 de VEB (usando SEQ ID NO: 4-6). De forma alternativa, los oligonucleótidos se pueden usar en un ensayo de diana doble en el que los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 1-6) detectan simultáneamente la región BMRF2 y la región EBNA1 de VEB dentro de la misma muestra. Existen determinadas ventajas en un ensayo de diana doble, ya que en el caso de que una o más de las regiones diana contengan un emparejamiento erróneo o un error de algún tipo, o si una de las reacciones experimenta un error, existe otra diana y otra reacción que se puede producir.

Ejemplo 1: diseño de cebadores y sondas para la detección de VEB por PCR ultrarrápida

La prueba de ácido nucleico de VEB se diseñó teniendo dos dianas en mente. Las dos dianas elegidas fueron BMRF2 y EBNA1, y se muestran en la FIG. 1. Estos candidatos se podrían usar individualmente o juntos en duplicado en un ensayo de diana doble. Si se usa como ensayo de diana doble, se emplean dos conjuntos de cebadores y sonda (detectando cada conjunto EBNA1 o bien BMRF2). Como se muestra en la tabla 1, anteriormente, los cebadores para la diana BMRF2 tienen la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 y 3, y la sonda para la diana BMRF2 tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2. También como se muestra en la tabla 1, anteriormente, los cebadores para la diana EBNA1 tienen la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 4 y 6, y la sonda para la diana EBNA1 tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. El amplicón generado por los cebadores dirigidos a BMRF2 es un amplicón de 96 pares de bases de largo y se muestra en la FIG. 2 (junto con localizaciones donde los cebadores y sondas se solapan al amplicón). El amplicón generado por los cebadores dirigidos a EBNA1 es un amplicón de 98 pares de bases de largo y se muestra en la FIG. 3 (junto con localizaciones donde los cebadores y sondas se solapan al amplicón).

Ejemplo 2: los cebadores y sondas de VEB detectan BMRF2 y EBNA-1 de VEB en un ensayo de PCR ultrarrápida

La prueba de ácido nucleico de VEB se sometió a prueba usando cebadores/sondas para detectar BMRF2 (SEQ ID NO: 1-3) y EBNA1 (SEQ ID NO: 4-6). Se ejecutó un proceso completo del ensayo de VEB. Se emplearon cuatro tipos de muestras que contenían VEB: (1) extractos de células Raji infectadas con VEB enriquecidos en plasma sin VEB; (2) ADN de VEB extraído (extraído de una línea celular B95-8 de Advanced Biotechnologies (n.° catálogo 17-926-500)); (3) panel analítico de VEB Qnostics (EBV1604009C); y (4) el 1.er patrón internacional de la OMS para VEB. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La concentración final de oligonucleótidos en la mezcla maestra fue de 0,3 |jM para cebadores y 0,1 |jM para sondas. El perfil de PCR cobas® 6800/8800 empleado se representa en la tabla 2, a continuación:

Tabla 2

Los resultados se muestran a continuación, en la tabla 3, a continuación.

Tabla 3

El 1.er patrón internacional de la OMS para la reserva de VEB fue a una concentración de 5 * 106 Ul/ml, mientras que el panel analítico de VEB Qnostics tiene una serie de muestras de concentraciones variables. Se realizaron diluciones en serie del material de la OMS y una dilución adicional de una alícuota del panel Qnostics. El panel analítico de VEB Qnostics se analizó a 8000, 800, 80 y 8 UI/ml, mientras que el 1.er patrón internacional de la OMS para VEB se analizó en 800.000, 80.000, 8.000, 800, 80 y 8 UI/ml. Los resultados para el panel analítico de VEB Qnostics y el 1.er patrón internacional de la OMS para VEB se muestran en las FIGS. 4A-4C. Se realizó otra prueba de proceso completo del ensayo de diana doble tanto en un material vírico derivado de cultivo celular (sobrenadante de Exact Diagnostics), como se representa en las FIGS. 5H-5L, y un material plasmídico de control que contiene ambas regiones diana, como se representa en las FIGS. 5A-5G. Estos dos materiales se diluyeron cada uno y los valores estimados se superpusieron en 1E4 UI/ml y 1E3 UI/ml donde se pudieron someter a prueba ambos materiales. Las curvas de crecimiento resultantes se mostraron en la FIG. 5A-5L. Estos datos y resultados demuestran que los cebadores y sondas (SEQ ID NO: 1-6) amplifican y detectan la presencia de VEB en diversos tipos de muestras incluyendo patrones internacionales y comerciales.

Los plásmidos de diana doble y diana individual de VEB se sometieron a prueba usando los cebadores y sondas de VEB de diana individual. Los resultados se muestran en las FIGS. 6A y 6B, que demuestran que los moldes de control positivo tanto para BMRF2 como para EBNA1 se amplifican y se detectan por los respectivos cebadores/sondas de VEB para BMRF2 (SEQ ID NO: 1-3) y para EBNA1 (SEQ ID NO: 4-6), pero cada plásmido de control de diana individual no reacciona de forma cruzada con la otra diana, mientras que un plásmido de control de diana doble y un extracto de ADN genómico vírico se amplifican por ambos conjuntos de oligonucleótidos.

Se realizó una prueba de linealidad del ensayo de diana doble en materiales de genotipo 1 de VEB y de genotipo 2 de VEB. Para el genotipo 1 se usaron tanto un material vírico derivado de cultivo celular (Exact Diagnostics) como un material plasmídico de control conteniendo ambas regiones diana, con valores estimados que se superpusieron. Para el genotipo 2 se sometió a prueba un material vírico derivado de cultivo celular (ATCC cepa P3). Los resultados se muestran en las FIGS. 7 y 8. Estos datos y resultados muestran que el ensayo detecta y se podría usar para la cuantificación tanto del genotipo 1 como del genotipo 2 de VEB.

Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento, quedará claro para un experto en la técnica a partir de una lectura de la presente divulgación que se pueden realizar diversos cambios de forma y detalle.

Por ejemplo, se pueden usar todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente en diversas combinaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1.Un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del virus de Epstein-Barr (VEB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar una muestra de ácido nucleico;

(b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más conjuntos de cebadores para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB están presentes en la muestra;

(c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB están presentes en la muestra, con una o más sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra; y

en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas comprenden:

(i) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y/o

(ii) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento del mismo.

2.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra biológica y en el que la muestra biológica es plasma o sangre.

3.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el procedimiento es para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra,

en el que uno del uno o más conjuntos de cebadores y una de la una o más sondas para detectar los primeros ácidos nucleicos diana de VEB comprenden: (i) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y

en el que uno del uno o más conjuntos de cebadores y una de la una o más sondas para detectar los segundos ácidos nucleicos diana de VEB comprenden: (ii) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento del mismo.

4.El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes y en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.

5.Un procedimiento para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar una muestra de ácido nucleico;

(b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con al menos dos conjuntos de cebadores para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB están presentes en la muestra;

(c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de VEB están presentes en la muestra, con al menos dos sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana de VEB en la muestra; y

en el que uno del al menos dos conjuntos de cebadores y una de la al menos dos sondas son para detectar el primer ácido nucleico diana de VEB y comprenden:

(i) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y

en el que uno del al menos dos conjuntos de cebadores y una de la al menos dos sondas son para detectar el segundo ácido nucleico diana de VEB y comprende:

(ii) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento del mismo.

6.El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes y en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.

7.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en el que la muestra es una muestra biológica y en el que la muestra biológica es plasma o sangre.

8.Un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos diana de VEB que pueden estar presentes en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden:

(a) una ADN polimerasa;

(b) monómeros nucleotídicos;

(c) uno o más conjuntos de cebadores; y

(d) una o más sondas,

en el que el uno o más conjuntos de cebadores y la una o más sondas comprenden:

(i) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y/o

(ii) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento del mismo.

9.El kit de la reivindicación 8, en el que la una o más sondas se marcan con un resto fluorescente donante y un resto aceptador correspondiente.

10.El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, en el que el kit es para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra,

en el que uno del uno o más conjuntos de cebadores y una de la una o más sondas para detectar los primeros ácidos nucleicos diana de VEB comprenden:

(i) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y

en el que uno del uno o más conjuntos de cebadores y una de la una o más sondas para detectar los segundos ácidos nucleicos diana de VEB comprenden:

(ii) un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento del mismo.

11.El kit de la reivindicación 10, en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes y en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.

12.Un kit para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB y un segundo ácido nucleico diana de VEB en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden:

(a) una ADN polimerasa;

(b) monómeros nucleotídicos;

(c) un primer conjunto de cebadores y una sonda para detectar un primer ácido nucleico diana de VEB; y (d) un segundo conjunto de cebadores y una sonda para detectar un segundo ácido nucleico diana de VEB, en el que el primer conjunto de cebadores y una sonda son para detectar el primer ácido nucleico diana de VEB y comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma; y

en el que el segundo conjunto de cebadores y una sonda son para detectar el segundo ácido nucleico diana de VEB y comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, o complementos de la misma, y una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma.

13.El kit de la reivindicación 12, en el que las sondas se marcan con un resto fluorescente donante y un resto aceptador correspondiente.

14.El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB son diferentes y en el que el primer ácido nucleico diana de VEB y el segundo ácido nucleico diana de VEB no se superponen.