ES3030503T3

ES3030503T3 - Chimeric antigen receptor effector cell switches with humanized targeting moieties and/or optimized chimeric antigen receptor interacting domains and uses thereof

Info

Publication number: ES3030503T3
Application number: ES17794509T
Authority: ES
Inventors: Travis S Young; Leonard Presta; David Rodgers; Eric Hampton; Timothy Wright; Peter G Schultz; Eduardo Laborda; Elvira Khialeeva; Sophie Viaud
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2025-06-30
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: US11174306B2; CN110267982B; AU2017345479A1; EP3529268B1; CN110267982A; KR102613430B1; KR20230172612A; JP7149935B2; JP2019535244A; AU2017345479B2; WO2018075807A1; EP4559928A2; KR20190065433A; US20190359697A1; US12269869B2; JP2022185016A; EP4559928A3; EP3529268A1; CA3040343A1; AU2024202046A1

Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones, métodos, kits y plataformas para la activación y desactivación selectiva de células efectoras de receptores quiméricos mediante interruptores humanizados de células efectoras de receptores quiméricos que comprenden una fracción de diana humanizada que se une a CD19 en una célula diana y un dominio de interacción con el receptor quimérico que se une a una célula efectora de receptores quiméricos, y/o interruptores de células efectoras de receptores quiméricos que comprenden dominios optimizados de interacción con el receptor quimérico. También se describen métodos para el tratamiento de enfermedades y afecciones con dichas células efectoras de receptores quiméricos e interruptores de células efectoras de receptores quiméricos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conmutadores de células efectoras de receptor de antígeno quimérico con restos de direccionamiento humanizados y/o dominios de interacción con receptor de antígeno quimérico optimizados y usos de los mismos

Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica la prioridad con respecto a la solicitud provisional estadounidense n.° 62/410.315, presentada el 19 de octubre de 2016.

Declaración referente a la lista de secuencias

La lista de secuencias asociada con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es CIBR_011_01WO_ST25.txt. El archivo de texto tiene 717 KB, se creó el 18 de octubre de 2017, y se presenta electrónicamente mediante EFS-Web.

Declaración sobre interés gubernamental

Esta invención se realizó con apoyo del gobierno de acuerdo con la subvención número 1R01CA208398 concedida por el Instituto nacional de salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes

Las inmunoterapias están convirtiéndose en alternativas atractivas a las quimioterapias, incluyendo inmunoterapias que usan transferencia adoptiva de células T genéticamente modificadas para “volver a enseñar” al sistema inmunitario a reconocer y eliminar células tumorales malignas. Las células T genéticamente modificadas expresan receptores de antígenos quiméricos, que generalmente consisten en un endodominio de señalización CD3-zeta, un dominio transmembrana y un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) extracelular derivado de un anticuerpo monoclonal que proporciona la especificidad de receptor para un antígeno asociado a tumor en una célula maligna diana. Tras unirse al antígeno asociado a tumor a través del receptor de antígeno quimérico, la célula T que expresa receptor de antígeno quimérico (célula CAR-T) monta una respuesta inmunitaria que es citotóxica frente a la célula maligna. Tales terapias pueden eludir la resistencia a quimioterapia y se ha mostrado que son activas frente a enfermedad con recidiva/que no responde al tratamiento, dando como resultado remisiones sostenidas para pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia linfoblástica aguda (ALL). Sin embargo, estas terapias requieren una investigación y optimización adicionales, ya que provocaron efectos no deseados tales como síndrome de liberación de citocinas (CRS), linfopenia tóxica, hipogammaglobulinemia crónica para dianas hematológicas, citólisis específica de diana inespecífica de tumor mortal para dianas tumorales sólidas, edema cerebral, aplasia de células B persistente con el uso de células CAR-T que expresan anticuerpo anti-CD19, y, en algunos casos, muerte.

Los documentos WO 2015/057834 A1, WO 2016/168773 A2, y Rodgers DT,et al,PNAS, 2016; 113(4): E459-68. doi: 10.1073/pnas.1524155113. PubMed PMID: 26759369; PMCID: PMC4743815, dan a conocer, cada uno, un CAR humanizado que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en el que el dominio de señalización extracelular comprende un scFv anti-GCN4.

Sumario de las realizaciones

La invención se define en las reivindicaciones. Cualquier objeto que se describa en el presente documento, pero que no se reivindique, no forma parte de la invención. La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) humanizado que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular; en el que el dominio extracelular comprende un scFv anti-GCN4 humanizado que comprende la secuencia de aminoácidos s Eq ID NO: 322.

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para activar y desactivar selectivamente células efectoras de receptor quimérico (por ejemplo, células T de receptor de antígeno quimérico), que pueden proporcionar una inmunoterapia más segura y más versátil que los diseños de células CAR-T convencionales que están sometiéndose actualmente a prueba en ensayos clínicos al proporcionar control sobre la terapia.

La presente divulgación proporciona conmutadores de células efectoras de receptor quimérico (denominados “conmutadores”, en el presente documento), que incluyen conmutadores humanizados, y células efectoras de receptor quimérico conmutables. La presente divulgación también proporciona células efectoras de receptor quimérico que comprenden un receptor quimérico conmutable humanizado. La presente divulgación también proporciona plataformas de CAR-EC humanizadas que comprenden uno o más conmutadores de células efectoras de receptor quimérico humanizado y una o más células efectoras de receptor quimérico que comprenden un receptor quimérico conmutable humanizado.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) humanizado que comprende: un dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID) que interacciona con un receptor de antígeno quimérico en la CAR-EC; y un resto de direccionamiento humanizado que se une a CD19 en una célula diana.

El resto de direccionamiento puede unirse a una molécula de superficie celular en la célula diana.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un CAR en el que el CAR comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un CAR en el que (i) el dominio extracelular comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos: ESKYGPPCPPCPD o una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103 y 165-168; (ii) el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 398 y 417; y/o (iii) en el que el dominio de señalización intracelular comprende (a) un dominio CD3-zeta y (b) un dominio CD28; un dominio 4-1BB; o un dominio CD28 y un dominio 4-1BB. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un CAR en el que: el dominio CD28, si está presente, comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 418; en el que el dominio 4-1BB, si está presente, comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 419; en el que el dominio CD3-zeta comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 420; y/o en el que el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 417.

La presente invención también proporciona un primer conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) y una primera CAR-EC que expresa un CAR para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado seleccionado de (i) tumores heterogéneos o neoplasias de células sanguíneas; (ii) leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda o leucemia linfocítica crónica; y (iii) mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt o leucemia de células pilosas (HCL); en el que la primera CAR-EC expresa un CAR seleccionado de uno cualquiera de los CAR expuestos en las reivindicaciones 1-6; y en el que el primer conmutador de CAR-EC comprende:

a. un dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID) que comprende un péptido derivado de GCN4 que interacciona con un receptor de antígeno quimérico anti-GCN4 en la CAR-EC; y

b. un resto de direccionamiento;

en el que el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 27-35, 247, 249, 251,253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un primer conmutador de CAR-EC y primer CAR, en el que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un primer conmutador de CAR-EC y primer CAR, en el que el conmutador de CAR-Ec comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 7.

La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica para el CAR tal como se describió en las realizaciones anteriores, o un vector que comprende dicho polinucleótido. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona una célula huésped para dicho polinucleótido, en la que dicha célula huésped es una célula T.

También se da a conocer un receptor de antígeno quimérico (CAR) humanizado que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular; en el que el dominio extracelular comprende un scFv anti-GCN4 humanizado que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 290-388, y 423. Según la invención, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el scFv comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura seleccionada de las estructuras A-H en la figura 22A. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura según la estructura E en la figura 22A. También se da a conocer que el CAR comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. En algunas realizaciones de la invención, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411. También se da a conocer que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 411. En algunas realizaciones de la invención, el dominio extracelular comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93 103 y 165-168. En algunas realizaciones de la invención, el dominio extracelular comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos: ESKYGPPCPPCPD. En algunas realizaciones de la invención, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 398 y 417. En algunas realizaciones de la invención, el dominio de señalización intracelular comprende (a) CD3-zeta. También se da a conocer que el dominio CD28 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 418. En algunas realizaciones de la invención, el dominio CD28 comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 418. También se da a conocer que el dominio 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 419. En algunas realizaciones de la invención, el dominio 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 419. También se da a conocer que el dominio CD3-zeta comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 420. En algunas realizaciones de la invención, el dominio CD3-zeta comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 420. También se da a conocer que el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 417. En algunas realizaciones de la invención, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 417.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) humanizado que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, en el que el dominio extracelular comprende:

a. una región humanizada que interacciona con un conmutador de receptor de antígeno quimérico; y

b. un dominio bisagra.

También se da a conocer que el dominio bisagra tiene de aproximadamente uno a aproximadamente veinte aminoácidos de longitud. También se da a conocer que el dominio bisagra tiene más de aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. También se da a conocer que el dominio bisagra es flexible. También se da a conocer que el dominio bisagra es rígido. En algunas realizaciones, el dominio bisagra se selecciona de una bisagra de IgG4, una bisagra de IgG4m, una bisagra de CD28, y una bisagra de CD8. En algunas realizaciones, el dominio bisagra comprende o consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103 y 165-168. También se da a conocer que el dominio bisagra comprende o consiste en una secuencia que es homóloga en al menos el 50 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103 y 165-168. En algunas realizaciones, el dominio extracelular comprende un scFv anti-GCN4 humanizado. También se da a conocer que el dominio extracelular comprende un anticuerpo 52SR4 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunas divulgaciones, el scFv anti-GCN4 humanizado comprende o consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 290-388, y 423. También se da a conocer que el scFv anti-GCN4 humanizado comprende o consiste en una secuencia que es idéntica en al menos el 50 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 290-388, y 423. En algunas realizaciones, el scFv anti-GCN4 humanizado comprende o consiste en una secuencia que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98%, o al menos el 99% a SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el CAR comprende un dominio transmembrana seleccionado de un dominio transmembrana de CD8 o un dominio transmembrana de CD28. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 398 y 417. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende (a) un dominio CD3-zeta y (b) un dominio CD28; un dominio 4-1BB; o un dominio CD28 y un dominio 4-1Bb . En algunas realizaciones, el dominio CD28 comprende o consiste en SEQ ID NO: 418. En algunas realizaciones, el dominio 4-1BB comprende o consiste en SEQ ID NO: 419. En algunas realizaciones, el dominio CD3-zeta comprende o consiste en SEQ Id NO: 420. En algunas realizaciones, la región que interacciona con un conmutador de receptor de antígeno quimérico interacciona con un péptido de unión a receptor de antígeno quimérico del conmutador de receptor de antígeno quimérico, en el que el conmutador de receptor de antígeno quimérico comprende además un resto de direccionamiento que interacciona con una molécula de superficie celular en la diana. También se da a conocer que el receptor de antígeno quimérico comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. También se da a conocer que el receptor de antígeno quimérico consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401,403, 405, 407, 409, 411,413, y 415. También se da a conocer que el receptor de antígeno quimérico comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. En algunas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico se codifica por una secuencia seleccionada de s Eq ID NO: 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, y 416. En algunas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico se codifica por una secuencia que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, y 416. También se da a conocer que la secuencia de aminoácidos de la región humanizada comprende o consiste en SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el dominio bisagra comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos ESKYGPPCPPCPD. También se da a conocer que el dominio transmembrana comprende o consiste en SEQ ID NO: 417. En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización CD3-zeta que comprende o consiste en SEQ ID NO: 420. En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende un dominio coestimulante que comprende o consiste en SEQ ID NO: 418 o 419. En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende un primer dominio coestimulante que comprende o consiste en SEQ ID NO: 418 y un segundo dominio coestimulante que comprende o consiste en SEQ ID NO: 419. En algunas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico comprende o consiste en secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411. También se da a conocer que el receptor de antígeno quimérico comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia SEQ ID NO: 411.

En algunas realizaciones de la invención, la presente invención proporciona un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) humanizado y una primera CAR-EC que expresa un CAR para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado seleccionado de (i) tumores heterogéneos o neoplasias de células sanguíneas; (ii) leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda o leucemia linfocítica crónica; y (iii) mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt o leucemia de células pilosas (HCL); en el que la primera CAR-EC de TC expresa un CAR seleccionado de uno cualquiera de los CAR expuestos en las reivindicaciones 1-6; y en el que el primer conmutador de CAR-EC de TC comprende:

b. un resto de direccionamiento;

en el que el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 27 35, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) que comprende:

b. un resto de direccionamiento;

en el que el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 27-35, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un scFv. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 7. También se da a conocer que el resto de direccionamiento comprende una secuencia de cadena pesada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 7. También se da a conocer que el resto de direccionamiento comprende una secuencia de cadena ligera que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende una par de secuencias de cadena ligera / cadena pesada seleccionado de (i) SEQ ID NO: 30 / SEQ ID NO: 7; (ii) SEQ ID NO: 30 / SEQ ID NO: 6; (iii) SEQ ID NO: 34 / SEQ ID NO: 6; y (iv) SEQ ID NO: 34 / SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende una cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25; en el que el conmutador de CAR-EC comprende un CAR-ID que es un péptido de GCN4 seleccionado de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245; y en el que el conmutador de CAR-EC es un conmutador de LCNT.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) que comprende: un dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID) que comprende un péptido derivado de GCN4 que interacciona con un receptor de antígeno quimérico anti-GCN4 en la CAR-EC; y un resto de direccionamiento. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID nO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que X1 es K o está ausente. También se da a conocer que X2 se selecciona de K, A, y G. También se da a conocer que X3 se selecciona de L, A, y G. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, 145, y 154-163. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, 145, y 154-163. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un polipéptido de direccionamiento. En algunas realizaciones, el polipéptido de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno en la célula diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno del mismo está humanizado.

En algunas realizaciones, la molécula de superficie celular es CD19. En algunas realizaciones, la molécula de superficie celular es Her2, CLL1, CD33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, CEA o un fragmento de las mismas. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento se une específicamente a CD19. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento se une específicamente a Her2, CLL1, CD33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, CEA o un fragmento de las mismas.

En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-CD19 humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos dados a conocer en el presente documento). En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo FMC63 humanizado, o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo FMC63 humanizado. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD123, o un anticuerpo anti-CD33. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD20 humanizado, un anticuerpo anti-CD22 humanizado, un anticuerpo anti-EGFR humanizado, un anticuerpo anti-EGFRvIII humanizado, un anticuerpo anti-Her2 humanizado, un anticuerpo anti-CS1 humanizado, un anticuerpo anti-BCMA humanizado, un anticuerpo anti-CEA humanizado, un anticuerpo anti-CLL1 humanizado, un anticuerpo anti-CD123 humanizado o un anticuerpo anti-CD33 humanizado.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento (por ejemplo, un resto de direccionamiento humanizado), se selecciona del grupo que consiste en: una inmunoglobulina, una inmunoglobulina nula para Fc y un Fab, y fragmentos de los mismos.

También se da a conocer que el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-25. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27-35. También se da a conocer que el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2-15. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 247, 249, 251,253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. En algunas realizaciones de la invención, el conmutador de CAR-EC comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 7. También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC una secuencia de cadena ligera que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 30 y una secuencia de cadena pesada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC una par de secuencias de cadena ligera / cadena pesada seleccionado de (i) SEQ ID NO: 30 / SEQ ID NO: 6; (ii) SEQ ID NO: 34 / SEQ ID NO: 6; y (iii) SEQ ID NO: 34 / SEQ ID NO: 7.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena ligera que difiere de SEQ ID NO: 35 en desde aproximadamente uno hasta aproximadamente veinte aminoácidos. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO: 35 excepto porque comprende una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácido de cadena ligera de SEQ ID NO: 35 seleccionados del grupo que consiste en T7, T8, L15, S22, D41, G42, T43, V44, Y71, S72, N77, E79, Q80, I83, F87, y G100.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena pesada que difiere de SEQ ID NO: 15 en desde aproximadamente uno hasta aproximadamente treinta aminoácidos. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento humanizado comprende una secuencia de cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO: 15 excepto porque comprende una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácido de cadena pesada de SEQ ID NO: 15 seleccionados del grupo que consiste en E1, K3, A13, Q16, S17, V20, R42, L48, S61, A62, L67, I70, K71, N73, S76, V78, F79, M82, N83, L85, Q86, T87, D88, I92, K97, y S115.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera dada a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un resto de direccionamiento que es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena pesada dada a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada dadas a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268. En algunas realizaciones de la invención, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

En algunas realizaciones, CAR-ID comprende un péptido. En algunas realizaciones, CAR-ID comprende un péptido seleccionado de un péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura, un péptido de GCN4 variante que no experimenta dimerización; un péptido de etiqueta flag; un péptido que no se produce de manera natural, un péptido que se produce de manera natural, una etiqueta de péptido sintético, un péptido de formación de hélices alfa, un péptido de K4, y un péptido de E4. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID No : 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID nO: 269), en la que x 1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que X1 es K o está ausente. También se da a conocer que X2 se selecciona de K, A, y G. También se da a conocer que X3 se selecciona de L, A, y G. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245.

En algunas realizaciones, CAR-ID comprende una molécula pequeña. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un hapteno. En algunas realizaciones, el hapteno es FITC.

También se da a conocer un kit que comprende un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento y un receptor de antígeno quimérico (CAR) “complementario” expresado en una CAR-EC. También se da a conocer que el kit comprende (i) un conmutador de CAR-EC humanizado que comprende: un CAR-ID que interacciona con un receptor de antígeno quimérico en la CAR-EC y un resto de direccionamiento humanizado que se une a CD19 en una célula diana y (ii) un CAR complementario expresado en una CAR-EC. También se da a conocer que el kit comprende un CAR-ID seleccionado de un péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura o derivado del mismo, un péptido de GCN4 variante que no experimenta dimerización; un péptido de etiqueta flag; un péptido que no se produce de manera natural, un péptido que se produce de manera natural, una etiqueta de péptido sintético, un péptido de formación de hélices alfa, un péptido de K4, y un péptido de E4. También se da a conocer que el CAR-ID es FITC.

También se da a conocer que la presente divulgación proporciona un kit que comprende un primer conmutador de CAR-EC humanizado seleccionado de uno cualquiera de los conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento y una primera CAR-EC. En algunas realizaciones, la primera CAR-EC comprende un CAR humanizado. En algunas realizaciones, el CAR humanizado se selecciona de uno cualquiera de los CAR humanizados dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el CAR humanizado se selecciona de SEQ ID NO: 389-397, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 27-35, 247, 249, 251,253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

También se da a conocer un kit que comprende (i) una CAR-EC que expresa un CAR que comprende una región extracelular anti-GCN4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GCN4 o una porción de unión a GCN4 del mismo, dado a conocer en el presente documento) y (ii) un conmutador de CAR-EC que comprende: un CAR-ID que comprende un péptido derivado de GCN4 que interacciona con el CAR anti-GCN4 en la CAR-EC; y un resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, el derivado de GCN4 se selecciona de uno cualquiera de los derivados de GCN4 dados a conocer en el presente documento. También se da a conocer que el derivado de GCN4 no experimenta dimerización. También se da a conocer que el resto de direccionamiento comprende un resto de direccionamiento seleccionado de los restos de direccionamiento dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-CD19 humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos dados a conocer en el presente documento). En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo FMC63 humanizado, o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo FMC63 humanizado. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD23, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD123, o un anticuerpo anti-CD33. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD20 humanizado, un anticuerpo anti-CD22 humanizado, un anticuerpo anti-EGFR humanizado, un anticuerpo anti-EGFRvIII humanizado, un anticuerpo anti-Her2 humanizado, un anticuerpo anti-CS1 humanizado, un anticuerpo anti-BCMA humanizado, un anticuerpo anti-CEA humanizado, un anticuerpo anti-CLL1 humanizado, un anticuerpo anti-CD123 humanizado, o un anticuerpo anti-CD33 humanizado.

También se da a conocer que el kit comprende un conmutador de CAR-EC que comprende un resto de direccionamiento que es un anticuerpo FMC63, o una porción de unión a CD19 del mismo, que comprende (i) una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-25 y (ii) una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-15. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera dada a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un resto de direccionamiento que es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena pesada dada a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada dadas a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

También se da a conocer que el kit se usa para tratar a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, el sujeto se trata con el kit para una enfermedad o estado para el que células CD19+ están implicadas en la patología. También se da a conocer que el kit se usa para tratar a un sujeto para una enfermedad o estado seleccionado de tumores heterogéneos y neoplasias de células sanguíneas. También se da a conocer que el sujeto se trata para una enfermedad o estado seleccionado de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, y leucemia linfocítica crónica. También se da a conocer que el sujeto se trata para una enfermedad o estado seleccionado de mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, y leucemia de células pilosas (HCL). En algunas realizaciones, el sujeto se trata para una enfermedad o estado para el que células CD19+ están implicadas en la patología que comprende administrar un conmutador de CAR-EC anti-CD19 y una CAR-EC que expresa un CAR complementario. También se da a conocer que el kit se usa para (i) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD20+ están implicadas en la patología; (ii) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD22+ están implicadas en la patología; (iii) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD33+ están implicadas en la patología; (iv) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CEA+ están implicadas en la patología; (v) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CLL1+ están implicadas en la patología; (vi) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células BCMA+ están implicadas en la patología; (vii) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CS1+ están implicadas en la patología; (viii) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD123+ están implicadas en la patología; tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células Her2+ están implicadas en la patología; o (ix) tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que un antígeno diana particular (por ejemplo, un antígeno asociado con tumor) está implicado en la patología.

También se da a conocer un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita con un conmutador dado a conocer en el presente documento y un CAR complementario expresado en una CAR-EC. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita con (i) un conmutador de CAR-EC humanizado que comprende: un CAR-ID que interacciona con un receptor de antígeno quimérico en la CAR-EC y un resto de direccionamiento humanizado que se une a CD19 en una célula diana y (ii) un CAR complementario expresado en una CAR-EC. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC usado en el método comprende un cAR-ID seleccionado de un péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura o derivado del mismo, un péptido de GCN4 que no experimenta dimerización; un péptido de etiqueta flag; un péptido que no se produce de manera natural, un péptido que se produce de manera natural, una etiqueta de péptido sintético, un péptido de formación de hélices alfa, un péptido de K4, y un péptido de E4. También se da a conocer que el derivado de GCN4 no experimenta dimerización. También se da a conocer que el derivado de GCN4 se selecciona de uno cualquiera de los derivados de GCN4 dados a conocer en el presente documento. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID nO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que X1 es K o está ausente. También se da a conocer que X2 se selecciona de K, A, y G. También se da a conocer que X3 se selecciona de L, A, y G. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, 145, y 154-163. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, 145, y 154-163. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245.

También se da a conocer que el CAR-ID es FITC.

También se da a conocer un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita con (i) una CAR-EC que expresa un CAR que comprende una región extracelular anti-GCN4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GCN4 o una porción de unión a GCN4 del mismo, dado a conocer en el presente documento) y (ii) un conmutador de CAR-EC que comprende: un CAR-ID que comprende un péptido derivado de GCN4 que interacciona con el CAR anti-GCN4 en la CAR-EC; y un resto de direccionamiento. También se da a conocer que el derivado de GCN4 no experimenta dimerización. También se da a conocer que el derivado de GCN4 se selecciona de uno cualquiera de los derivados de GCN4 dados a conocer en el presente documento. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia de estructura I: X1NYHLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. También se da a conocer que X1 es K o está ausente. También se da a conocer que X2 se selecciona de K, A, y G. También se da a conocer que X3 se selecciona de L, A, y G. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, 145, y 154-163. También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 comprende o consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163 y 245.

También se da a conocer que el derivado de péptido de GCN4 consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, 145, y 154-163.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprendido en el conmutador de CAR-EC usado en el método de tratamiento de un sujeto que lo necesita comprende un resto de direccionamiento seleccionado de los restos de direccionamiento dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-CD19 humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos dados a conocer en el presente documento).

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo FMC63 humanizado, o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo FMC63 humanizado. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD123, o un anticuerpo anti-CD33. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD20 humanizado, un anticuerpo anti-CD22 humanizado, un anticuerpo anti-EGFR humanizado, un anticuerpo anti-EGFRvIII humanizado, un anticuerpo anti-Her2 humanizado, un anticuerpo anti-CS1 humanizado, un anticuerpo anti-BCMA humanizado, un anticuerpo anti-CEA humanizado, un anticuerpo anti-CLL1 humanizado, un anticuerpo anti-CD123 humanizado, o un anticuerpo anti-CD33 humanizado.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprendido en el conmutador de CAR-EC usado en el método de tratamiento de un sujeto que lo necesita comprende un resto de direccionamiento que es un anticuerpo FMC63, o una porción de unión a CD19 del mismo, que comprende (i) una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-25 o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27-35; y (ii) una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-15.

En algunas realizaciones, el método comprende tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD19+ están implicadas en la patología que comprende administrar un conmutador de CAR-EC anti-CD19 y una CAR-EC que expresa un CAR complementario. En algunas realizaciones, el método comprende a. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD20+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende b. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD22+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende c. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD33+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende d. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CEA+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende e. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CLL1 están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende f. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células BCMA+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende g. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CS1+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende h. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células CD123+ están implicadas en la patología; en algunas realizaciones, el método comprende tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que células Her2+ están implicadas en la patología; o tratar a un sujeto para una enfermedad o estado para el que un antígeno diana particular (por ejemplo, un antígeno tumoral) está implicado en la patología. En algunas realizaciones, el método comprende a. tratar a un sujeto para una enfermedad o estado seleccionado de tumores heterogéneos y neoplasias de células sanguíneas. En algunas realizaciones, el método comprende tratar a un sujeto para una enfermedad o estado seleccionado de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, y leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, el método comprende tratar a un sujeto para una enfermedad o estado seleccionado de mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, y leucemia de células pilosas (HCL). En algunas realizaciones, el método comprende administrar al menos un conmutador dado a conocer en el presente documento y una CAR-EC complementaria.

También se da a conocer que la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un conmutador de CAR-EC dado a conocer y una o más sales, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. También se da a conocer que la composición farmacéutica comprende portadores, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservantes, agentes colorantes, aromatizantes y de dilución, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes espesantes, tampones, vehículos de administración, agentes de tonicidad, codisolventes, agentes humectantes, agentes complejantes, agentes tamponantes, antimicrobianos, y/o tensioactivos y uno o más conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. También se da a conocer que la composición farmacéutica comprende al menos dos conmutadores de CAR-EC, en la que al menos uno de los conmutadores es un conmutador dado a conocer en el presente documento, y una o más sales, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. También se da a conocer que la composición farmacéutica comprende dos o más conmutadores dados a conocer en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una CAR-EC que expresa un CAR seleccionado de uno cualquiera de los CAR dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el CAR comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular; en el que el dominio extracelular comprende un scFv anti-GCN4 humanizado que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 290-388, y 423. En algunas realizaciones, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el scFv comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura seleccionada de las estructuras A-H en la figura 22A. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura según la estructura E en la figura 22A. También se da a conocer que el CAR comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. También se da a conocer que el CAR comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411. También se da a conocer que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 411. También se da a conocer que la CAR-EC es una célula T.

También se da a conocer un método de tratamiento de cáncer con recidiva, que comprende administrar a un sujeto: un primer conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento; un segundo conmutador de CAR-EC que comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento; y una CAR-EC que se une al CAR-ID en el primer conmutador de CAR-EC y el CAR-ID en el segundo conmutador de CAR-EC, en el que la primera CAR-EC se administra antes de una recidiva del sujeto y el segundo conmutador de CAR-EC se administra después de la recidiva del sujeto. También se da a conocer que el segundo conmutador de CAR-EC comprende un resto de direccionamiento anti-CD20. También se da a conocer que el resto de direccionamiento del primer conmutador de CAR-EC comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

También se da a conocer un método de tratamiento de cáncer con recidiva, que comprende administrar a un sujeto: un primer conmutador de CAR-EC que comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento; un segundo conmutador de CAR-EC seleccionado de uno cualquiera de los conmutadores dados a conocer en el presente documento; y una CAR-EC que se une al CAR-ID en el primer conmutador de CAR-EC y el CAR-ID en el segundo conmutador de CAR-EC, en el que la primera CAR-EC se administra antes de una recidiva del sujeto y el segundo conmutador de CAR-EC se administra después de la recidiva del sujeto. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento del segundo conmutador de CAR-EC comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.

También se da a conocer un método de lisis de una célula diana, que comprende poner en contacto la célula diana con un conmutador de CAR-EC humanizado dado a conocer en el presente documento y poner en contacto el conmutador de CAR-EC con una CAR-EC complementaria. También se da a conocer un método de lisis de una célula diana, que comprende poner en contacto la célula diana con un conmutador de CAR-EC y poner en contacto el conmutador de CAR-EC con una CAR-EC complementaria humanizada dada a conocer en el presente documento.

También se da a conocer un método de destrucción de una célula diana, que comprende poner en contacto la célula diana con un conmutador de CAR-EC humanizado dado a conocer en el presente documento y poner en contacto el conmutador de CAR-EC con una CAR-EC complementaria

También se da a conocer un método de destrucción de una célula diana, que comprende poner en contacto la célula diana con un conmutador de CAR-EC y poner en contacto el conmutador de CAR-EC con una CAR-EC complementaria humanizada dada a conocer en el presente documento.

También se da a conocer un método de activación de una CAR-EC que comprende poner en contacto un CAR expresado en la CAR-EC con un conmutador de CAR-EC seleccionado de uno cualquiera de los conmutadores de<c>AR-EC expuestos en las reivindicaciones 21-68, en el que la CAR-EC se activa cuando el resto de direccionamiento en el conmutador de CAR-EC se une tanto a su diana en la célula diana como al dominio extracelular del CAR en la CAR-EC, en el que el CAR se une al CAR-ID en el conmutador de CAR-EC.

También se da a conocer un método de control de la magnitud de una respuesta de células T mediante modulación de la pauta posológica de una administración de conmutador de CAR-EC a un sujeto. También se da a conocer que la primera pauta posológica comprende administrar un conmutador de CAR-EC a una primera dosis alta en un primer calendario de dosificación corto y una segunda pauta posológica comprende administrar un conmutador de<c>AR-EC a una segunda dosis baja en un segundo calendario de dosificación que es más largo que el primer calendario de dosificación. También se da a conocer que el primer calendario de dosificación comprende administrar el conmutador de CAR-EC al menos una vez cada dos días. También se da a conocer que el primer calendario de dosificación comprende administrar el conmutador de CAR-EC cada dos días. También se da a conocer que el primer calendario de dosificación comprende administrar la primera dosis alta del conmutador de CAR-EC cada dos días durante un total de cuatro administraciones. También se da a conocer que el primer calendario de dosificación comprende administrar la primera dosis alta del conmutador de CAR-EC cada dos días o aproximadamente cada dos días durante un total de cuatro administraciones o un total de aproximadamente cuatro administraciones. También se da a conocer que el segundo calendario de dosificación comprende administrar la segunda dosis baja cada dos días durante un total de doce administraciones. También se da a conocer que el segundo calendario de dosificación comprende administrar la segunda dosis baja cada dos días o aproximadamente cada dos días durante un total de doce administraciones o aproximadamente doce administraciones. También se da a conocer que la dosis alta es al menos 5 veces, 10 veces o al menos 15 veces la de una dosis baja. También se da a conocer que la primera pauta posológica da como resultado una expansión de células T aumentada en un sujeto al que se le administra la dosis alta en comparación con la expansión de células T en un sujeto al que se le administra la dosis baja. También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC es un conmutador de CAR-Ec humanizado dado a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC comprende un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268. En algunas realizaciones, la célula T comprende un CAR descrito en el presente documento. También se da a conocer que la célula T comprende un CAR humanizado que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular; en la que el dominio extracelular comprende un scFv anti-GCN4 humanizado que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 290-388, y 423. En algunas realizaciones, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el scFv comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 322. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura seleccionada de las estructuras A-H en la figura 22A. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura según la estructura E en la figura 22A. También se da a conocer que el CAR comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. También se da a conocer que el CAR comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411. También se da a conocer que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 411. En algunas realizaciones, el dominio extracelular comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103 y 165-168.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una alineación de las secuencias de cadena pesada de diversos Fab de huFMC a modo de ejemplo que pueden usarse como conmutadores de CAR-EC de la presente divulgación.

La figura 2 muestra una alineación de las secuencias de cadena ligera de diversos Fab de huFMC a modo de ejemplo que pueden usarse como conmutadores de CAR-EC de la presente divulgación.

La figura 3 muestra un gel de SDS-PAGE, que representa conmutadores de CAR-EC de huFMC expresados en el formato de conmutador de LCNT. El lado izquierdo del gel no se somete a reducción. El lado derecho del gel se somete a reducción con DTT.

La figura 4 muestra un gel de SDS-PAGE, que representa los conmutadores de CAR-EC de huFMC expresados en el formato de conmutador de LCNT. El lado izquierdo del gel no se somete a reducción. El lado derecho del gel se somete a reducción con DTT.

La figura 5 muestra un ensayo de unión basado en citometría de flujo de Fab de huFMC63 en células RS4;11 CD19+. CE50 indicada en nM (nanomolar).

La figura 6 muestra un ensayo de unión basado en citometría de flujo de Fab de huFMC63 en células RS4;11 CD19+. CE50 indicada en nM (nanomolar).

La figura 7 muestra un ensayo de unión basado en citometría de flujo de Fab de huFMC63 en células RS4;11 CD19+. FMC63 WT significa Fab de FMC63 quimérico (indicado como lC, HC en la tabla de CE50). CE50 indicada en nM (nanomolar).

La figura 8 muestra un ensayo de unión basado en citometría de flujo de Fab de huFMC63 en células RS4;11 CD19+. FMC63 wt significa Fab de FMC63 quimérico (indicado como LC, HC en la tabla de CE50). CE50 indicada en nM (nanomolar).

La figura 9 muestra un ensayo de unión basado en citometría de flujo de Fab de huFMC63 en células RS4;11 CD19+. FMC63 wt significa Fab de FMC63 quimérico (indicado como LC, HC en la tabla de CE50). CE50 indicada en nM (nanomolar)

La figura 10 muestra la citotoxicidad de conmutadores basados en huFMC63 con células CAR-T conmutables (sCAR-T) frente a células RS4;11 CD19+. Los valores de CE50 para este experimento se indican en la tabla 8 junto con 3 repeticiones de este experimento. El 80 % de CAR+ indica que el 80 % de la población de células T usada en este ensayo eran positivas para el CAR conmutable. FMC63-LCNT significa Fab de FMC63 quimérico con péptido de GCN4 en el extremo N-terminal de la cadena ligera.

La figura 11 muestra la citotoxicidad de conmutadores basados en huFMC63 con células CAR-T conmutables frente a células K562 CD19-. No se calculó ningún valor de CE50 a partir de la citotoxicidad en K562 debido a los bajos niveles de citotoxicidad encontrados. El 80 % de CAR+ indica que el 80 % de la población de células T usada en este ensayo eran positivas para el CAR conmutable. FMC63-LCNT significa Fab de FMC63 quimérico con péptido de GCN4 en el extremo N-terminal de la cadena ligera.

La figura 12 muestra una regresión polinomial usada para predecir la inmunogenicidad de un anticuerpo mediante análisisin silico.Veintidós anticuerpos autorizados que constituyen la regresión polinomial usada para predecir respuestas de HAHA dependientes de células T.

La figura 13 muestra una escala de inmunogenicidad de proteínas de EpiMatrix con potencial inmunogénico global de secuencias de hFMC2b-LCNT (marcado como LC1) / hFMCH4c (marcado como HC).

La figura 14 muestra un resumen general de terapia con células T de receptor quimérico conmutables dada a conocer en el presente documento. Se aíslan linfocitos a partir de un sujeto y posteriormente se introduce un vector de expresión que codifica para un receptor quimérico en los linfocitos para producir células efectoras de receptor quimérico. Se administran células efectoras de receptor quimérico al sujeto, junto con un conmutador.

La figura 15 muestra a modo de ejemplo la optimización de conmutador para células CAR-T conmutables haciendo variar la longitud de la sinapsis inmunológica de larga (izquierda) a intermedia (centro) a corta (derecha), aumentando la actividad de izquierda a derecha.

La figura 16 muestra a modo de ejemplo la optimización de conmutador para células CAR-T conmutables haciendo variar la longitud del agente inmunológico de intermedia (izquierda) a corta (centro) a muy corta (derecha), actividad de conmutador óptima con una sinapsis corta, con respecto a la actividad de conmutador producida con la sinapsis intermedia o la sinapsis muy corta.

La figura 17 muestra a modo de ejemplo la optimización de bisagra de CAR y de conmutador de CAR. La figura 17A muestra un ejemplo de célula CAR-T conmutable y la formación de una sinapsis inmunológica monovalente a partir de un conmutador monovalente y un CAR monovalente. La figura 17B muestra un ejemplo de célula CAR-T conmutable y la formación de una sinapsis inmunológica bivalente a partir de un conmutador bivalente y un CAR monovalente. La figura 17C muestra un ejemplo de célula CAR-T conmutable y la formación de una sinapsis inmunológica bivalente a partir de un conmutador monovalente y un CAR bivalente. La figura 17D muestra un ejemplo de célula CAR-T conmutable y la formación de una sinapsis inmunológica bivalente a partir de un conmutador bivalente y un CAR bivalente. La actividad relativa de células CAR-T conmutables se muestra mediante signos (+) debajo de cada una de las figuras 17A-D.

La figura 18 ilustra un ejemplo de una plataforma de células T de receptor quimérico conmutable de acoplamiento y bloqueo en la que el módulo de DDD está en el dominio extracelular de receptor quimérico y el módulo de AD está en el conmutador.

La figura 19 muestra la numeración de residuos en derivados de péptido de GCN4 para referencia con el ejemplo 6. El péptido original usado para direccionamiento se muestra en la parte inferior coloreado mediante exploración con alanina. Rojo indica un residuo que es intolerante a la mutación de alanina (pérdida completa de unión a scFv anti-GCN4 52SR4), naranja indica un residuo que es algo tolerante a la mutación de alanina (algo de pérdida de unión a scFv anti-GCN452SR4, pero todavía cierto nivel de unión), y verde indica un residuo que es completamente tolerante a la mutación de alanina (ninguna pérdida de unión a scFv anti-GCN4 52SR4 en comparación con la secuencia de péptido original). Las posibles modificaciones en la secuencia se indican en la parte superior. Los residuos 1-4 forman parte de la secuencia de GCN4 nativa, incluida en el desarrollo anteriormente notificado del anticuerpo 52SR4. Amarillo indica un nuevo residuo no explorado anteriormente como diana de la CAR-EC. Azul indica una adición o modificación de residuo preferida basándose tanto en los residuos extendidos como en la exploración con alanina. Este esquema se usó para diseñar péptidos modificados A-O.

La figura 20 muestra la unión de conmutadores de CAR-EC que comprenden CAR-ID de derivado de péptido de GCN4 a células CAR-T conmutables (sCAR de 52SR4 y variantes humanizadas).

La figura 21 muestra ensayos de citotoxicidad de LDH usando conmutadores de CAR-EC basados en FMC63 que comprenden CAR-ID de derivado de péptido de GCN4 con células CAR-T conmutables (sCAR de 52SR4) frente a células RS4;11 CD19+.

La figura 22 muestra la humanización del conmutador anti-CD19. La figura 22A muestra la CE50 de citotoxicidad con variantes de conmutador humanizadas frente a células RS4;11. N=4, significación medida mediante ANOVA de un factor. La figura 22B muestra la correlación entre la producción de citocinas, la afinidad de unión y la CE50 de citotoxicidad. La figura 22C muestra un modelo de xenoinjerto de NALM-6. Se estableció la carga tumoral inyectando a ratones NSG i.v. 0,5*10® células NALM-6. Seis días después, se inyectaron 20*10® células sCAR-T, seguido por 8 dosis de conmutador humanizado administradas cada dos días a lo largo del periodo de 14 días (experimento 1: 0,5 mg/kg, líneas continuas; experimento 2: 0,05 mg/kg, líneas discontinuas). N=3. La figura 22D muestra la estabilidad térmica (N=4), cromatografía de exclusión molecular analítica (SEC) y rendimientos de purificación (N=8-12) de candidato de conmutador murino y conmutador humanizado L2b/H4c.

La figura 23 muestra una alineación de secuencias de las cadenas pesada y ligera del candidato humanizado L2b/H4c con las regiones de entramado humanizadas y la secuencia de FMC63 murina.

La figura 24 muestra constructos y secuencias de células sCAR-T. La figura 24A muestra esquemas de constructos de células sCAR-T. La figura 24B muestra una secuencia de sCAR-T a modo de ejemplo. La figura 24C muestra las SEQ ID NO de diversos componentes de constructos de células sCAR-T.

La figura 25 muestra una comparación de diferentes dominios coestimulantes. La figura 25A muestra la expresión del sCAR en células T humanas primarias mediante unión por citometría de flujo a un péptido de GCN4 marcado. La figura 25B muestra la CE50 de citotoxicidad con conmutador anti-CD19 frente a RS4;11. Se clasificaron constructos para enriquecer clones CAR+ y se expandieron hasta 8-12 días antes de la citotoxicidad. N=5-6. La figura 25C y la figura 25D muestran una tabla y un gráfico de dispersión de las CE50 por bisagra, dominio transmembrana y dominio coestimulante de constructo (N=6 a lo largo de tres donantes independientes). La significación en la figura 25D es mediante la prueba de la T para datos emparejados. La figura 25E muestra un modelo de xenoinjerto de NALM-6. Se estableció la carga tumoral inyectando a ratones NSG i.v. 0,5*10® células NALM-6. Seis días después, se inyectaron 20*10® células sCAR-T o CART19, seguido por 8 dosis de conmutador (0,5 mg/kg) administradas cada dos días. La figura 25F muestra citocinas medidas a partir de suero de ratón, 24 h tras la primera dosis de conmutador en el modelo de NALM-6, significación mediante ANOVA de un factor. La figura 25G muestra la expansión de células sCAR-T 24 h tras la última dosis de conmutador en el modelo de NALM-6. Significación mediante ANOVA de un factor. La figura 25E, la figura 25F y la figura 25G muestran datos acumulativos de tres donantes independientes.

La figura 2® muestra la eficaciain vivode las células sCAR-T basadas en bisagra de CD28 a partir del modelo de NALM-6 mostrado en la figura 25D.

La figura 27 muestra una selección del mejor constructo de CAR conmutable humanizado. La figura 27A muestra una alineación de secuencias de cadena ligera y pesada murinas, de línea germinal y humanizadas. El cuadrado azul son mutaciones puntuales V12S, L109D, E6Q, y A87 y CDR 1, 2, y 3 para cadenas ligera y pesada. La figura 27B muestra la eficacia tumoral a largo plazo (>50 días) a lo largo de múltiples ensayosin vivoque comparan variantes de CAR humanizado. Las líneas rojas indican variantes humanizadas con al menos 1 ratón con una radiancia de <104 en el día 50. La figura 27C, recuadro superior, muestra un esquema de variantes humanizadas de cadena ligera y pesada. La figura 27, porción inferior, muestra asignaciones de grupos de CAR humanizados correspondientes a A-G representados gráficamente en las figuras 27D y 27E. La figura 27D muestra una comparación de citotoxicidad de dosis-respuestain vitroa lo largo de dominios coestimulantes de 41BB, CD28 y 28BB de 3a generación de variantes de CAR murino y humanizado en la línea celular RS411 CD19+. La figura 27E muestra una comparación de eficacia antitumoralin vivoa lo largo de dominios coestimulantes de 41BB, CD28 y 28BB de 3a generación de variantes de CAR murino y humanizado en modelos de xenoinjerto Nalm6 CD19+.

La figura 28 muestra una alineación de secuencias de regiones variables de cadena pesada murinas (52SR4) y posibles humanizadas.

La figura 29 muestra una alineación de secuencias de regiones variables de cadena ligera murinas (52SR4) y posibles humanizadas.

La figura 30 muestra un modelo de la estructura cristalina de una variante de scFv anti-GCN4 (C11L34; verde: cadena pesada; azul claro: cadena ligera) complejada con péptido de GCN4 (azul oscuro). Los residuos humanizados están marcados en rojo.

La figura 31 muestra resultados experimentales de CAR conmutables murinos humanizados. Los tres gráficos superiores de la izquierda muestran comparaciones de expansión de células CAR-T a lo largo de dominios coestimulantes de 41BB, CD28 y 28BB de 3a generación de variantes de CAR murino y humanizado de modelos de xenoinjerto de eficaciain vivo.En el día 21, tras la inyección de Nalm6, se extrajo sangre y se tiñó para detectar CAR-T y se analizó mediante citometría de flujo. El gráfico superior derecho muestra cuentas de células CAR-T normalizadas de ensayosin vivode eficacia antitumoral. Se normalizaron los valores con respecto al constructo de L5H4. La significación es mediante ANOVA de un factor. El panel inferior muestra constructos de CAR humanizado clasificados. Se clasificaron la carga tumoral, frecuencia y tiempo de recidivas, y valores de expansión de células T a partir de modelosin vivopara cada constructo y se calculó el promedio en consecuencia.

La figura 32 muestra una comparación de la producción de citocinasin vivo.Se extrajo suero de ratón a partir de m modelos de xenoinjerto de eficacia 24 h tras la inyección de CAR-T y conmutador y se cuantificaron las citocinas. Los gráficos muestran valores normalizados con respecto al grupo de CAR-T de L5H4. Significación mediante ANOVA de un factor.

La figura 33 muestra la caracterizaciónin vitrode constructos de CAR humanizado. Paneles superiores: comparación de expansión de células T a lo largo de constructos humanizados de 41BB, CD28, y 28BB de 3a generación. Paneles inferiores: eficiencia de transducción de constructos de CAR humanizado de 41BB, CD28, y 28BB de 3a generación a lo largo del tiempo.

La figura 34 muestra la citotoxicidadin vitrode constructos de CAR humanizado a lo largo del tiempo. Las columnas izquierda, central y derecha representan constructos de CAR de 41BB, CD28, y 28BB de 3a generación, respectivamente. Las filas muestran la citotoxicidad de dosis-respuesta 19, 26, y 33 días tras la transducción de células T desde arriba hacia abajo, respectivamente.

La figura 35 muestra la citotoxicidadin vitrode constructos de CAR humanizado a lo largo del tiempo. La fila superior muestra valores de CE50 de ensayos de citotoxicidad a lo largo del tiempo tras la transducción de células T. La fila inferior muestra la destrucción máxima de cada constructo a lo largo del tiempo tras la transducción de células T.

La figura 36 muestra un modelo de xenoinjerto de NALM-6 usando una combinación del conmutador humanizado y CAR humanizado. Se estableció la carga tumoral inyectando a ratones NSG i.v. 0,5*106 células NALM-6. Seis días después, se inyectaron 5*106 células sCAR-T o CART19, seguido por 8 dosis de conmutador L2b/H4c humanizado administradas cada dos días a lo largo del periodo de 14 días (0,5 mg/kg). N=6.

La figura 37 muestra un modelo de xenoinjerto Raji CD19+/CD19- heterogéneo. Se estableció la carga tumoral inyectando a ratones NSG una mezcla de células Raji CD19+ y Raji CD19- (0,5*10® células totales por ratón). 3 días después, se inyectaron 10*10® células sCAR-T o CART19, seguido por 8 dosis de conmutador anti-CD19 (0,5 mg/kg) a lo largo del periodo de 14 días. Se administraron ocho dosis de conmutador anti-CD20 (0,5 mg/kg) una vez que la ROI promedio superó 105, indicando la recidiva de células Raji CD19-. La figura 37A muestra la progresión tumoral en ratones a los que se les inyectó una razón 1:1 de células Raji CD19+:CD19-, y tratados con conmutadores anti-CD19 y anti-CD20 simultáneamente. Se administraron 8 dosis adicionales de conmutador anti-CD20 cada dos días entre los días 64 y 78. N=3. La figura 37B muestra la progresión tumoral en ratones a los que se les inyectó una razón 4:1 de células Raji CD19+:CD19-. Se trataron los ratones con 8 dosis de conmutador anti-CD20 cada dos días en los días 10-24, y se administraron 8 dosis adicionales de conmutador anti-CD20 entre los días 64 y 78. N=3. La figura 37C muestra la progresión tumoral en ratones a los que se les inyectó una razón 49:1 de células Raji CD19+:CD19-. Se trataron los ratones con 8 dosis de conmutador anti-CD20 cada dos días en los días 18-32. N=3-®.

La figura 38 muestra un esquema que representa diversos constructos de sCAR murinos construidos con diferentes longitudes de bisagra usando la bisagra corta de IgG4, la bisagra de CD8 de ratón, o la bisagra de CD28 de ratón.

La figura 39 muestra un sistema singénico. La figura 39A muestra el control del crecimiento tumoral mediante células sCAR-T en ratones inmunocompetentes: comparación de la eficacia de CAR entre bisagra de IgG4 (SV-319-092) y de mCD8 (SV-319-089). Las figuras 39B y 39C muestran la cinética celular en la sangre periférica (números absolutos) a través de fenotipado mediante citometría de flujo en 2 experimentos independientes: la figura 39B muestra células sCAR-T CD45+ frente a 4-1BB (SV-319-091)/28Bb (SV-319-092); y la figura 39C muestra células B frente a células sCAR-T 28BB SV-319-092. Se estableció la carga tumoral en el día 0 inyectando a ratones inmunocompetentes C3H s.c. 1*10® células tumorales 38C13. Siete días después, se preacondiciona a los ratones con ciclofosfamida 100 mg/kg (CTX) i.p. (se pueden medir los tumores y se aleatoriza a los ratones). Veinticuatro horas después, se inyectan 10*10® células sCAR-T i.v., seguido por 8 dosis de conmutador administradas i.v. cada dos días a lo largo del periodo de 14 días a 1 mg/kg, empezando 4 h tras la inyección de células sCAR-T. Tras un periodo de reposo de 2 semanas, se reanudó la dosificación de conmutador durante otras 8 dosis a 1 mg/kg cada dos días en el día 3® y en el día 64. Se analizaron células inmunitarias de sangre periférica en el día 15, 25, 35, 53, ®3, 81 y 99 tras la implantación de tumor (N=5/®). Las figuras 39D y 39E muestran el impacto de diferentes pautas posológicas de conmutador sobre la expansión de células sCAR-T (figura 39D) y el fenotipo (figura 39E). Se preacondicionaron ratones inmunocompetentes C3H no sometidos a tratamiento previo con ciclofosfamida 100 mg/kg (CTX) i.p. (día -1) y se les inyectaron i.v. 24 horas después 10*10® células sCAR-T SV-319-092 seguido por 4, 8 o 12 dosis de conmutador administradas i.v. cada dos días a lo largo del periodo de ®, 14 o 22 días a 0,2, 1 o 5 mg/kg, empezando 4 h tras la inyección de células sCAR-T. Se monitorizaron la expansión de células sCAR-T y el fenotipo a lo largo del tiempo en la sangre periférica en el día 7, 25, 35 y 53 tras la inyección de sCAR-T mediante citometría de flujo (N=5).

Descripción detallada

Definiciones:

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede usarse en la práctica o pruebas de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales posibles y preferidos.

Debe observarse que, tal como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de tales células y la referencia al “péptido” incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes del mismo, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Las publicaciones comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder a tal publicación gracias a una invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que puede ser necesario confirmar independientemente.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “fragmento de anticuerpo” y “fragmento de inmunoglobulina” se usan de manera intercambiable para referirse a cualquier forma de un anticuerpo distinta de la forma de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpo en el presente documento incluyen anticuerpos que son componentes más pequeños que existen dentro de anticuerpos de longitud completa, y anticuerpos que se han modificado por ingeniería. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fc, Fab, y (Fab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpo, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, una CDR1, una CDR2, una CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables, regiones de entramado, regiones constantes, cadenas pesadas, cadenas ligeras, moléculas distintas de anticuerpo de andamiajes alternativos, y anticuerpos biespecíficos. A menos que se indique específicamente lo contrario, las declaraciones y reivindicaciones que usan el término “anticuerpo” o “anticuerpos” pueden incluir específicamente “fragmento de anticuerpo” y “fragmentos de anticuerpo”. El término “fragmento de unión a antígeno”, usado en referencia a un anticuerpo o una inmunoglobulina, significa cualquier fragmento de anticuerpo que presenta afinidad de unión por una diana (tal como, por ejemplo, una proteína, péptido, molécula pequeña, antígeno tumoral diana). También se usan “fragmento” de anticuerpo y “porción” de anticuerpo de manera intercambiable en el presente documento, al igual que los términos “fragmento de unión a antígeno” y “porción de unión a antígeno”.

El término “anticuerpo anti-CD19” se refiere a un anticuerpo que se une a CD19. CD19, también conocido como “cúmulo de diferenciación 19”, se conoce bien en la técnica que es una proteína que se expresa en la superficie de células B.

Los términos “receptor quimérico”, “receptor de antígeno quimérico” y “CAR” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un receptor expresado en una célula efectora adecuada (por ejemplo, una célula T), pudiendo dicho receptor unirse a un CAR-ID, tal como se describe en el presente documento.

La referencia a “CAR-EC” significa “célula efectora de receptor de antígeno quimérico”, y CAR-EC se refiere, de manera general, a una célula efectora que expresa un receptor quimérico (tal como, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico). Sin embargo, en algunas realizaciones, CAR-EC no se limita simplemente a células efectoras que expresan receptores de antígenos quiméricos (es decir, que expresan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos), sino que el término también puede abarcar células efectoras que expresan otros receptores quiméricos que pueden unirse a una diana (por ejemplo, un “dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico” (CAR-ID) comprendido en un conmutador de CAR-EC, tal como se da a conocer en el presente documento. Las células efectoras adecuadas para su uso en la presente invención (por ejemplo, como CAR-EC) incluyen células efectoras seleccionadas de una célula T virgen, una célula T de célula madre de memoria, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora, una célula T cooperadora, una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T CD8/CD4+, una célula T ap, una célula T y§, una célula T citotóxica, una célula T citolítica natural, un linfocito citolítico natural, un macrófago.

La referencia a un CAR y su conmutador de CAR-EC “complementario” (por ejemplo, un conmutador de CAR-EC anti-CD19 humanizado complementario dado a conocer en el presente documento), o de manera similar la referencia a un conmutador de CAR-EC y su “CAR complementario” significa un par de un conmutador de CAR-EC que comprende un CAR-ID particular, y un CAR que comprende un dominio extracelular que comprende afinidad de unión para ese CAR-ID particular. Por tanto, como ejemplo no limitativo, un experto habitual en la técnica apreciará que un conmutador de CAR-EC que comprende un CAR-ID de péptido de GCN4 (por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26) se unirá a un CAR que comprende un dominio extracelular anti-GCN4 que tiene afinidad de unión por ese péptido de GCN4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GCN4 o porción de unión a antígeno del mismo tal como un scFv). Por tanto, un CAR anti-GCN4 de este tipo y una CAR-EC que comprende el CAR-ID de GCN4 son “complementarios” porque el CAR se une al conmutador de CAR-EC. De manera similar, los conmutadores que comprenden un CAR-ID de FITC, FLAG, K4, y E4 son complementarios a CAR que comprenden afinidad de unión por FITC, FLAG, K4 (por ejemplo, un péptido de E4), E4 (por ejemplo, un péptido de K4), respectivamente.

El término “libre de endotoxinas” o “sustancialmente libre de endotoxinas” se refiere de manera general a composiciones, disolventes y/o recipientes que contienen como mucho cantidades traza (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiológicos clínicamente adversos para un sujeto) de endotoxinas, y preferiblemente cantidades indetectables de endotoxinas. Las endotoxinas son toxinas asociadas con determinados microorganismos, tales como bacterias, normalmente bacterias gram-negativas, aunque pueden encontrarse endotoxinas en bacterias grampositivas, tales comoListeria monocytogenes.Las endotoxinas más prevalentes son lipopolisacáridos (LPS) o lipooligo-sacáridos (LOS) encontrados en la membrana externa de diversas bacterias gram-negativas, y que representan una característica patógena central en la capacidad de estas bacterias para provocar enfermedad. Pequeñas cantidades de endotoxinas en seres humanos pueden producir fiebre, una reducción de la tensión arterial, y la activación de inflamación y coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.

Por tanto, en la producción farmacéutica, con frecuencia es deseable eliminar la mayoría o la totalidad de las trazas de endotoxinas de productos terminados y/o recipientes de fármacos, dado que incluso pequeñas cantidades pueden provocar efectos adversos en seres humanos. Con este fin puede usarse un horno de despirogenación, dado que normalmente se requieren temperaturas superiores a 300°C para descomponer la mayoría de las endotoxinas. Por ejemplo, basándose en material de acondicionamiento primario tal como jeringas o viales, con frecuencia la combinación de una temperatura de vidrio de 250°C y un tiempo de mantenimiento de 30 minutos es suficiente para lograr una reducción de los niveles de endotoxinas de 3 log. Se contemplan otros métodos de eliminación de endotoxinas, incluyendo, por ejemplo, métodos de cromatografía y filtración, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. También se incluyen métodos de producción de conmutadores de CAR-EC en, y aislamiento de los mismos a partir de, células eucariotas tales como células de mamífero para reducir, incluso eliminar, el riesgo de que estén presentes endotoxinas en una composición de la invención. Se prefieren métodos de producción de conmutadores de CAR-EC en, y aislamiento de los mismos a partir de, células libres de suero.

Pueden detectarse endotoxinas usando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitario deLimulus,que usa sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxinas. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden provocar una coagulación detectable del lisado deLimulusdebido a una potente cascada enzimática que amplifica esta reacción. También pueden cuantificarse endotoxinas mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser de menos de aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/mg de proteína. Normalmente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.

La referencia a “FMC63” significa el clon de anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD19 originalmente descrito en 1991 por H. Zola y colaboradores (1), que se ha usado en la célula CAR-T convencional mejor estudiada de Carl June y colaboradores (2-4). Estas referencias (1, 2, 3, y 4) se indican a continuación en la sección de “bibliografía”. Los términos “FMC63”, “FMC”, “huFMC” y “hFMC” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

La referencia a “VH de FMC63” significa la porción variable de la cadena pesada del anticuerpo FMC63.

La referencia a “VL de FMC63” significa la porción variable de la cadena ligera del anticuerpo FMC63.

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como, por ejemplo, Fv, Fab, (Fab')2, Fv de cadena sencilla (scFv) u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) en los que las regiones de entramado no humanas (por ejemplo, murinas) del dominio variable se cambian por las secuencias de región de entramado humanas. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado conserva la especificidad y/o afinidad del anticuerpo no humano original. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado conserva sustancialmente toda la especificidad y/o afinidad del anticuerpo no humano original.

Tal como se usa en el presente documento, el término “o variantes humanizadas del mismo” se refiere a cualquier variante de secuencia de una secuencia de referencia, variante que comprende al menos un cambio de aminoácido (es decir, sustitución, deleción o adición) que da como resultado una secuencia variante que tiene identidad aumentada con respecto a una secuencia de línea germinal humana en comparación con la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, “o variantes humanizadas del mismo” se refiere a secuencias que comprenden al menos un cambio de aminoácido que hace que la secuencia esté “más humanizada”, es decir, hace que la secuencia tenga una mayor identidad con respecto a una secuencia de referencia humana. Por ejemplo, una variante humanizada de una secuencia de VH de FMC63 o VL de FMC63 es una secuencia que comprende una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más) mutaciones en comparación con las secuencias de VH y VL de FMC63 originales murinas proporcionadas como SEQ ID NO: 15 y 25, respectivamente. En realizaciones, la variante humanizada de una secuencia de anticuerpo de referencia o porción de la misma (por ejemplo, una secuencia de VH de FMC63 o VL de FMC63) conserva afinidad de unión por la diana del anticuerpo de referencia. Por ejemplo, pero sin ser de ningún modo limitativo, una secuencia de FMC63 humanizada puede conservar unión a CD19.

El término “conmutador anti-CD19 humanizado” se refiere, de manera general, a cualquier conmutador de CAR-EC que comprende un resto de direccionamiento que (i) puede unirse a CD19; y (ii) es una variante humanizada de un anticuerpo frente a CD19 de referencia. En algunas realizaciones, el conmutador anti-CD19 humanizado comprende una forma humanizada del anticuerpo FMC63 de referencia. En algunas realizaciones, el conmutador anti-CD19 humanizado comprende una porción humanizada del anticuerpo FMC63 de referencia (por ejemplo, (i) una VH de FMC63 humanizada, (ii) una VL de FMC63 humanizada, o (iii) una VH de FMC63 humanizada y una VL de FMC63 humanizada).

El término “conmutador humanizado” se refiere, de manera general, a cualquier conmutador de CAR-EC que comprende un resto de direccionamiento que (i) puede unirse a una diana; y (ii) es una variante humanizada de un anticuerpo de referencia o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el conmutador humanizado comprende una forma humanizada del anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones, el conmutador humanizado comprende una porción humanizada del anticuerpo de referencia (por ejemplo, (i) una VH humanizada, (ii) una VL humanizada, o (iii) una VH humanizada y una VL humanizada).

Por una secuencia de polipéptido objeto que tiene una secuencia de aminoácidos “idéntica” en al menos, por ejemplo, el 95 % a una secuencia de aminoácidos de consulta dada a conocer en el presente documento, quiere decirse que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto es idéntica a la secuencia de consulta excepto porque la secuencia de polipéptido objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. Dicho de otro modo, para obtener un polipéptido objeto que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95 % a una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta el 5 % de los residuos de aminoácido en la secuencia objeto pueden insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoácido. Estas alteraciones en comparación con la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxiterminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien de manera individual entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La identidad de dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos) pueden compararse entre sí, o con secuencias publicadas, usando el algoritmo de la herramienta de búsqueda de alineaciones locales básica(“Basic Local Alignment Search Tool’)o "BLAST”; descrito en Johnson M,et al.,(2008) NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Res. 36: W5-W9. De manera similar, puede determinarse la identidad entre dos secuencias de nucleótidos de la misma manera. Por tanto, para obtener una secuencia de nucleótidos objeto (por ejemplo, secuencia de ARN o ADN, tal como una secuencia de ADNc) que es idéntica en al menos el 95 % a una secuencia de nucleótidos de consulta, hasta el 5 % de los residuos de nucleótido en la secuencia objeto pueden insertarse, delecionarse o sustituirse por otro nucleótido.

Los términos “conmutador” y “conmutador de CAR-EC” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

La referencia a “VH” significa la porción variable de una cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

La referencia a “VL” significa la porción variable de la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

La referencia a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se dice que “se une específicamente” o “se une preferentemente” (usados de manera intercambiable en el presente documento) a un polipéptido u otra diana (por ejemplo, a CD19) es un término bien entendido en la técnica, y métodos para determinar tal unión específica o preferente también se conocen bien en la técnica. Se dice que una molécula muestra “unión específica” o “unión preferente” si reacciona o se asocia de manera más frecuente, más rápida, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular de lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo “se une específicamente” o “se une preferentemente” a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferentemente a CD19 es un anticuerpo que se une a CD19 con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otros polipéptidos distintos de CD19. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o una porción de unión a antígeno del mismo) que se une específica o preferentemente a una primera diana (por ejemplo, CD19) puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, “unión específica” o “unión preferente” no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferente.

“Sustancialmente” o “esencialmente” significa en cantidad, medida, tamaño abundante o considerable; casi total o completamente; por ejemplo, el 95 % o más de alguna cantidad dada.

Las secuencias “sustancialmente similares” son secuencias que comprenden al menos aproximadamente el 90 % de identidad en la secuencia (por ejemplo, secuencia de aminoácidos o nucleótidos) entre sí, o al menos aproximadamente el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de aproximadamente el 99 % de identidad entre sí.

Resumen:

En el presente documento se dan a conocer composiciones y métodos para activar y desactivar selectivamente células efectoras de receptor quimérico (por ejemplo, células T de receptor de antígeno quimérico), que pueden proporcionar una inmunoterapia más segura y más versátil que los diseños de células CAR-T convencionales que están sometiéndose actualmente a prueba en ensayos clínicos al proporcionar control sobre la terapia.

En el presente documento se dan a conocer células efectoras de receptor quimérico conmutables (CAR-EC) y conmutadores de células efectoras de receptor quimérico (denominados “conmutadores”, en el presente documento), incluyendo conmutadores humanizados y CAR-E<c>humanizadas.

En el presente documento se dan a conocer plataformas que comprenden uno o más conmutadores dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, un conmutador humanizado) y una o más CAR-EC (por ejemplo, una CAR-EC dada a conocer en el presente documento, tal como una CAR-EC humanizada), en las que un CAR expresado en una CAR-EC incluida en la plataforma es complementario a un conmutador incluido en la plataforma. En algunas realizaciones, las plataformas comprenden una pluralidad de conmutadores, cada uno de los cuales se une a dianas diferentes (es decir, cada conmutador tiene un resto de direccionamiento diferente) y cada uno de los cuales es complementario a una única CAR-EC incluida en la plataforma. En algunas realizaciones, las plataformas comprenden una pluralidad de conmutadores, cada uno de los cuales se une a dianas diferentes (es decir, cada conmutador tiene un resto de direccionamiento diferente) y cada uno de los cuales es complementario a al menos una de una pluralidad de CAR-EC incluidas en la plataforma.

Los conmutadores dados a conocer en el presente documento comprenden una primera región que se une a un receptor quimérico de célula efectora y una segunda región que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana. La primera región se denomina en el presente documento dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID). La segunda región se denomina en el presente documento “resto de direccionamiento”. El resto de direccionamiento puede ser un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno en la célula diana. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno del mismo puede estar humanizado. Los conmutadores humanizados dados a conocer en el presente documento pueden comprender un resto de direccionamiento que está humanizado. En algunas realizaciones, la molécula de superficie celular es CD19. En algunas realizaciones, la molécula de superficie celular es Her2, CLL1, CD33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, CEA o un fragmento de las mismas. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento se une a CD19. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento se une a Her2, CLL1, CD33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, CEA o un fragmento de las mismas. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento se une específicamente a CD19. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento se une específicamente a Her2, CLL1, CD33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, CEA o un fragmento de las mismas. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-CD19 humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos dados a conocer en el presente documento). En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo FMC63 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo.

La unión a receptor quimérico del conmutador puede estimular una respuesta inmunitaria a partir de la célula efectora que es citotóxica para la célula diana unida. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T. El conmutador puede actuar como “conmutador de activación”, desencadenando (o aumentando) la activación de célula efectora. El conmutador puede actuar como “conmutador de desactivación”, bloqueando (o reduciendo) la activación de célula efectora. La actividad de célula efectora puede “desactivarse” reduciendo o deteniendo la administración del conmutador. Los conmutadores humanizados dados a conocer en el presente documento pueden usarse con las células efectoras dadas a conocer en el presente documento, así como células CAR-T existentes, para el tratamiento de una enfermedad o estado, tal como cáncer, en el que la célula diana es una célula maligna. Tal tratamiento puede denominarse en el presente documento inmunoterapia conmutable, para la que se representa un resumen esquemático a modo de ejemplo en la figura 14.

Se proporcionan métodos, kits y composiciones para producir células CAR-EC, plataformas de CAR-EC y conmutadores de CAR-EC humanizados, que se usan para poner una célula efectora junto con una diana (por ejemplo, una célula diana tal como un tumor) en un sujeto. Estos métodos, kits y composiciones encuentran uso terapéutico en varias enfermedades y estados. Por ejemplo, métodos, kits y composiciones que comprenden un conmutador de CAR-EC con un resto de direccionamiento anti-CD19 pueden usarse para tratar cualquier enfermedad en la que células CD19+ están implicadas en la patología. Por ejemplo, pero sin ser de ningún modo limitativo, en algunas realizaciones, pueden tratarse eficazmente tumores heterogéneos y neoplasias de células sanguíneas (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda y leucemia linfocítica crónica) con una célula CAR-EC, conmutador de CAR-EC y/o una plataforma de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones no limitativas, pueden usarse células CAR-EC, plataformas de CAR-EC y/o conmutadores de CAR-EC humanizados para tratar, por ejemplo, una enfermedad seleccionada de mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, y leucemia de células pilosas (HCL).

De manera similar, métodos, kits y composiciones que comprenden un conmutador de CAR-EC con un resto de direccionamiento anti-Her2 pueden usarse para tratar cualquier enfermedad en la que células Her2+ están implicadas en la patología; métodos, kits y composiciones que comprenden un conmutador de CAR-EC con un resto de direccionamiento anti-CLL1 pueden usarse para tratar cualquier enfermedad en la que células CLL1 están implicadas en la patología, y de manera similar, métodos, kits y composiciones que comprenden un conmutador de CAR-EC con cualquier resto de direccionamiento que tiene especificidad por un antígeno diana particular (por ejemplo, un antígeno tumoral) pueden usarse para tratar cualquier enfermedad en la que ese antígeno diana (por ejemplo, antígeno tumoral) está implicado en la patología.

En algunas realizaciones, se optimiza la longitud, valencia y/u orientación de la unión de conmutador de CAR-EC así como el resto de direccionamiento de conmutador de célula CAR-EC. Los tumores heterogéneos pueden tratarse más eficazmente con múltiples conmutadores que seleccionan como diana más de un antígeno tumoral. Las ventajas y características de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras leer los detalles de las composiciones y métodos descritos más completamente a continuación.

I. Conmutadores de CAR-EC

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de células efectoras de receptor quimérico que comprenden: (i) una primera región (CAR-ID) que puede unirse a un receptor quimérico en una célula efectora (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico) y (ii) una segunda región (resto de direccionamiento) que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor quimérico que comprende: (i) una primera región (CAR-ID) que comprende un derivado de péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura (por ejemplo, un derivado de péptido de GCN4 seleccionado de SEQ ID NO: 139, 154-163) y (ii) una segunda región (resto de direccionamiento) que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana; en el que el CAR-ID puede unirse a un receptor quimérico en una célula efectora (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico).

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor quimérico humanizado que comprende: (i) una primera región (CAR-ID) que puede unirse a un receptor quimérico en una célula efectora (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico) y (ii) una segunda región (resto de direccionamiento) que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana; en el que el resto de direccionamiento está humanizado.

En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor quimérico humanizado que comprende: (i) una primera región (CAR-ID) que puede unirse a un receptor quimérico en una célula efectora (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico) y (ii) una segunda región (resto de direccionamiento) que se une a CD19 en una célula diana; en el que el resto de direccionamiento está humanizado.

En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un conmutador de células efectoras de receptor quimérico humanizado que comprende: (i) una primera región (CAR-ID) que comprende un derivado de péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura (por ejemplo, un derivado de péptido de GCN4 seleccionado de SEQ ID NO: 139, 154-163) y (ii) una segunda región (resto de direccionamiento) que se une a CD19 en una célula diana; en el que el resto de direccionamiento está humanizado.

En algunas realizaciones, la primera y segunda regiones están unidas mediante un ligador.

En algunas realizaciones, la primera región y la segunda región están fusionadas entre sí. Tal como se usa en el presente documento, el término “fusionado” puede referirse al acoplamiento de un extremo terminal del CAR-ID con un extremo terminal de un resto de direccionamiento de polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo). En algunas realizaciones, la primera región y la segunda región están fusionadas entre sí mediante un ligador.

En algunas realizaciones, la primera región está injertada en la segunda región. Tal como se usa en el presente documento, el término “injertado” puede referirse a insertar un CAR-ID dentro de un polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, entre dos aminoácidos del polipéptido de direccionamiento). En algunas realizaciones, la segunda región está injertada en la primera región. En algunas realizaciones, la primera región está injertada en la segunda región de tal manera que la primera y la segunda regiones están unidas mediante al menos un ligador. En algunas realizaciones, la segunda región está injertada en la primera región de tal manera que la primera y la segunda regiones están unidas mediante al menos un ligador.

En algunas realizaciones, la primera región está unida a la segunda región. En algunas realizaciones, la primera región está unida a la segunda región mediante un ligador. El ligador puede unirse a un CAR-ID. El ligador puede unirse a un resto de direccionamiento. El ligador puede unir un CAR-ID a un resto de direccionamiento. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento de una manera específica del sitio. La unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el uno o más CAR-ID a un sitio predeterminado en el uno o más restos de direccionamiento. Alternativa o adicionalmente, la unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el uno o más CAR-ID a un aminoácido no natural en el uno o más restos de direccionamiento. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento de una manera independiente del sitio. La unión de una manera independiente del sitio puede comprender unir el uno o más CAR-ID a un sitio aleatorio en el uno o más restos de direccionamiento. El CAR-ID puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de direccionamiento de una manera específica del sitio. El CAR-ID puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de direccionamiento de una manera independiente del sitio. Alternativamente, el resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más CAR-ID de una manera específica del sitio. La unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el uno o más restos de direccionamiento a un sitio predeterminado en el uno o más CAR-ID. El resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más CAR-ID de una manera independiente del sitio. La unión de una manera independiente del sitio puede comprender unir el uno o más restos de direccionamiento a un sitio aleatorio en el uno o más CAR-ID.

El conmutador de CAR-EC puede tener cualquier secuencia de conmutador dada a conocer en el presente documento. Por ejemplo, puede comprender una cadena ligera y una cadena pesada, en la que la cadena ligera comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena ligera de conmutador dada a conocer en el presente documento y la cadena pesada comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena pesada de conmutador dada a conocer en el presente documento. Tales secuencias de cadena pesada y/o ligera pueden estar humanizadas. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC está humanizado y comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un CAR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC puede estar humanizado y comprende una secuencia de cadena ligera que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y una secuencia de cadena pesada que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99% auna secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2-14, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un CAR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). En realizaciones particulares, la secuencia de cadena ligera comprende una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. También se da a conocer que la secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 27-34 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. En realizaciones particulares, el conmutador es un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, que presenta combinaciones de cadena pesada / cadena ligera comprendidas en varios de los conmutadores dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el conmutador es idéntico a un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, excepto porque el CAR-ID comprendido en el conmutador está modificado para tener una secuencia de estructura I. También se da a conocer que la secuencia de estructura I puede seleccionarse de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, y 154-163. En determinadas realizaciones particulares, el conmutador de CAR-EC comprende la cadena ligera de L2b-LCNT (SEQ ID NO: 30) y la cadena pesada de H4c (SEQ ID NO: 7).

También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC puede comprender (i) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena ligera de L2b-LCNT (SEQ ID NO: 30) y (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena pesada de H4c (SEQ ID NO: 7).

También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC puede comprender la cadena ligera de L2b-LCNT (SEQ ID NO: 30) y la cadena pesada de H4b (SEQ ID NO: 6). También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC puede comprender (i) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena ligera de L2b-LCNT (SEQ ID NO: 30) y (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena pesada de H4b (SEQ ID NO: 6).

También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC puede comprender (i) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena ligera de L2c-LCNT (SEQ ID NO: 34) y (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena pesada de H4b (SEQ ID NO: 6).

También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC puede comprender (i) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena ligera de L2c-LCNT (SEQ ID NO: 34) y (i) una secuencia que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 80 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la cadena pesada de H4c (SEQ ID NO: 7).

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador de CAR-EC que comprende o consiste en una secuencia que es idéntica a cualquier conmutador dado a conocer en cualquiera de las siguientes solicitudes: PCT/US2014/060713, PCT/US2014/060684, PCT/US2016/024524, PCT/US2016/027997 y PCT/US2016/027990, excepto porque el conmutador comprende un anticuerpo humanizado como su resto de direccionamiento o el conmutador comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo humanizado como su resto de direccionamiento. En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un conmutador de CAR-EC que comprende o consiste en una secuencia que es idéntica a cualquier conmutador dado a conocer en cualquiera de las siguientes solicitudes: PCT/US2014/060713, PCT/US2014/060684, PCT/US2016/024524, PCT/US2016/027997, y PCT/US2016/027990, excepto porque el conmutador comprende un anticuerpo FMC63 humanizado dado a conocer en el presente documento como su resto de direccionamiento o el conmutador comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo FMC63 humanizado como su resto de direccionamiento. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un conmutador que comprende un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo unido o fusionado a cualquiera de los CAR-ID dados a conocer en cualquiera de las solicitudes: PCT/US2014/060713, PCT/US2014/060684, PCT/US2016/024524, PCT/US2016/027997, y PCT/US2016/027990. Resultará evidente para un experto en la técnica que los documentos PCT/US2014/060684 y PCT/US2016/027997 se refieren a los CAR-ID como “CAR-BP”, y cualquier CAR-BP de este tipo es adecuado como CAR-ID para su uso en la presente invención. De manera similar, el documento PCT/US2016/024524 se refiere a los CAR-ID como “parejas de unión a receptor quimérico” y cualquier pareja de unión a receptor quimérico de este tipo es adecuada como CAR-ID para su uso en la presente invención. El documento PCT/US2016/027990 se refiere a los CAR-ID como CAR-ID, y cualquier CAR-ID de este tipo dado a conocer en el documento PCT/US2016/027990 es adecuado para su uso como CAR-ID en la presente invención. Además, la solicitud proporciona un receptor quimérico que puede unirse al CAR-ID en el conmutador y una célula efectora que expresa un receptor quimérico de este tipo. Por tanto, por consiguiente, cualquiera de los receptores quiméricos (por ejemplo, CAR) dados a conocer en cualquiera de las solicitudes: PCT/US2014/060713, PCT/<u>S2014/060684, PCT/US2016/024524, PCT/US2016/027997, y PCT/US2016/027990 puede usarse según la presente invención en combinación con un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento. La presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un paciente que necesita tal tratamiento con un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento y un CAR dado a conocer en cualquiera de las solicitudes: PCT/US2014/060713, PCT/US2014/060684, PCT/US2016/024524, PCT/US2016/027997, y PCT/US2016/027990.

Primera región del conmutador de CAR-EC: dominios de interacción con CAR.

Los dominios de interacción con CAR (CAR-ID) comprendidos en los conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento pueden ser cualquier cosa que puede fusionarse, conjugarse o unirse de otro modo a un resto de direccionamiento descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo), de tal manera que el CAR-ID puede unirse a un receptor quimérico (por ejemplo, un CAR) en una célula efectora (por ejemplo, una célula T). Por ejemplo, en realizaciones no limitativas, el CAR-ID puede ser una proteína de unión a receptor quimérico (por ejemplo, una proteína de unión a CAR). En realizaciones no limitativas, el CAR-ID puede ser un péptido de unión a receptor quimérico (por ejemplo, un péptido de unión a CAR). En realizaciones no limitativas, el CAR-ID puede ser una molécula pequeña de unión a receptor quimérico (por ejemplo, molécula pequeña de unión a CAR). En algunas realizaciones, la unión del CAR al CAR-ID en un conmutador activa el CAR. En algunas realizaciones, la unión del CAR al CAR-ID en un conmutador activa el CAR únicamente si el resto de direccionamiento en el conmutador también se une simultáneamente a su diana. En algunas realizaciones, la unión de un CAR al CAR-ID en un conmutador activa el CAR únicamente si un anticuerpo anti-CD19 humanizado en el conmutador (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 humanizados dados a conocer en el presente documento) también se une simultáneamente a CD19 en una célula diana. En tales realizaciones, el CAR puede expresarse en una célula efectora. En tales realizaciones, la unión del CAR expresado en una célula efectora al CAR-ID en el conmutador mientras un anticuerpo anti-CD19 humanizado en el conmutador (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 humanizados dados a conocer en el presente documento) también se une simultáneamente a CD19 en una célula diana da como resultado citotoxicidad de célula diana.

Proteínas de unión a receptor quimérico

En algunas realizaciones, el CAR-ID comprende o consiste en una proteína de unión a receptor quimérico que se une a un receptor quimérico. La proteína de unión a receptor quimérico puede tener una alta estabilidad proteolítica y baja inmunogenicidad en seres humanos con respecto a una proteína en general. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína foránea o porción de la misma. La proteína de unión a receptor quimérico puede no comprender una proteína foránea o porción de la misma. La proteína de unión a receptor quimérico puede seleccionarse de una hormona, una citocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, una molécula de adhesión celular, un péptido de señalización, un receptor, un péptido de superficie celular y fragmentos de los mismos. La proteína de unión a receptor quimérico puede ser un ligando o un fragmento del mismo. El ligando puede ser un ligando hormonal. La proteína de unión a receptor quimérico puede tener una longitud de más de aproximadamente 100 aminoácidos, más de aproximadamente 200 aminoácidos, más de aproximadamente 300 aminoácidos, más de aproximadamente 400 aminoácidos, más de aproximadamente 500 aminoácidos, más de aproximadamente 600 aminoácidos, más de aproximadamente 700 aminoácidos, más de aproximadamente 800 aminoácidos, más de aproximadamente 900 aminoácidos, o más de aproximadamente 1000 aminoácidos. La proteína de unión a receptor quimérico puede tener una longitud de aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 200 aminoácidos, aproximadamente 300 aminoácidos, aproximadamente 400 aminoácidos, aproximadamente 500 aminoácidos, aproximadamente 600 aminoácidos, aproximadamente 700 aminoácidos, aproximadamente 800 aminoácidos, aproximadamente 900 aminoácidos, o aproximadamente 1000 aminoácidos. La proteína de unión a receptor quimérico puede ser un antígeno.

La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La proteína de unión a receptor quimérico puede no comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, o al menos aproximadamente 500 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio variable o porción del mismo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante o porción del mismo.

La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína que no se produce de manera natural. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína sintética. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína no animal (por ejemplo, una proteína no expresada en un animal). La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína no de mamífero. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína no humana. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína derivada de cualquier ser vivo de cualquiera de los seis reinos(Animalia, Plantae, Fungi, Protista, Archaea/Archaeabacteria,yBacteria/Eubacteria),virus y priones.

La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un sitio de escisión de proteasa. Cualquier sitio de escisión de proteasa conocido en la técnica puede estar comprendido en la proteína de unión a receptor quimérico. El sitio de escisión de proteasa puede reconocerse, por ejemplo, por trombina, factor Xa, proteasa de TEV, proteasa de rinovirus humano 3C (HRV3C), proteasa específica de tipo ubiquitina 1 (Ulp1), una metaloproteasa de matriz (MMP) o enterocinasa. La m Mp puede ser MMP8. La MMP puede ser Mm P9.

La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína que se produce de manera natural. El péptido puede basarse en o derivarse de una proteína humana. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína expresada en un animal seleccionado de un chimpancé, un mono, una rata, un ratón, un ave, un pez, un cerdo, un caballo, una vaca, una cabra, un pollo, un conejo y una cobaya. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína de mamífero. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína no de mamífero. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína expresada en una planta. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína procariota. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína eucariota. La proteína de unión a receptor quimérico puede basarse en o derivarse de una proteína expresada por una levadura.

Por tanto, en diversas realizaciones no limitativas, la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una enzima. La enzima puede ser una nucleasa. La nucleasa puede ser una ribonucleasa. La ribonucleasa puede ser procariota. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un sustrato. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender barstar. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender barnasa. En algunas realizaciones, la proteína de unión a receptor quimérico puede ser una proteína seleccionada de una proteína fibrosa, una proteína de molécula de adhesión y una proteína de membrana. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína pilina deStreptococcus pyogenes.La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína de unión a fibronectina deStreptococcus pyogenes(SpyCatcher). La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína o una porción de una proteína seleccionada de una sinaptobrevina, una SNAP25 y una sintaxina, y porciones de las mismas (por ejemplo, hélice alfa). La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una ARNasa l. La proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína adaptadora de HuS.

Péptido de unión a receptor quimérico

En algunas realizaciones, el CAR-ID comprende o consiste en un péptido, por ejemplo, un péptido de unión a CAR. El CAR-ID puede ser un péptido que puede unirse a un receptor de antígeno quimérico (CAR). El CAR-ID puede ser, por ejemplo, cualquier “antígeno peptídico”, “neo-epítopo peptídico (PNE)”, o “antígeno peptídico de unión a antígeno quimérico (CAR-BP)” dado a conocer en los documentos PCT/US2014/060684 o PCT/US2016/027997.

El CAR-ID puede tener una alta estabilidad proteolítica y baja inmunogenicidad en seres humanos con respecto a péptidos en general. El CAR-ID puede seleccionarse de una hormona, una citocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, una molécula de adhesión celular, un péptido de señalización, un receptor, un péptido de superficie celular y fragmentos de los mismos. El CAR-ID puede ser un peptoide. El CAR-ID puede ser un ácido nucleico peptídico (ANP). El CAR-ID puede ser un ligando o un fragmento del mismo. El ligando puede ser un ligando hormonal. El ligando puede ser un ligando peptídico. El CAR-ID puede ser un péptido cíclico. El CAR-ID puede ser un péptido lineal.

El CAR-ID puede tener una longitud de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10, aproximadamente 10 y aproximadamente 20, aproximadamente 20 y aproximadamente 30, aproximadamente 30 y aproximadamente 40, aproximadamente 40 y aproximadamente 50, aproximadamente 50 y aproximadamente 60, aproximadamente 60 y aproximadamente 70, aproximadamente 70 y aproximadamente 80, y aproximadamente 80 y aproximadamente 90 aminoácidos. El CAR-ID puede ser un antígeno. El CAR-ID puede ser un epítopo. El CAR-ID puede ser un epítopo no lineal. El CAR-ID puede comprender además un segundo péptido.

El CAR-ID puede no comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede comprender menos de 10 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede comprender menos de 12 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede comprender menos de 15 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede comprender menos de 20 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede comprender menos de 22 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede comprender menos de 30 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede no comprender un parátopo de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El CAR-ID puede comprender un péptido que no se produce de manera natural. El CAR-ID puede comprender un péptido sintético. El cAR-ID puede comprender un péptido no animal (por ejemplo, un péptido no expresado en un animal). El CAR-ID puede comprender un péptido no de mamífero. El CAR-ID puede comprender un péptido no humano. El péptido puede derivarse de cualquier ser vivo de cualquiera de los seis reinos(Animalia, Plantae, Fungi, Protista, Archaea/Archaeabacteria,yBacterias/Eubacteria),virus y priones. Por tanto, el péptido puede derivarse de, consistir en, o comprender, un ser humano, mamífero, animal no mamífero, planta, levadura, bacteria, reptil, ave, insecto, eucariota o procariota. Se pretende que el término “un péptido derivado de” un organismo biológico particular (por ejemplo, mamífero, levadura, etc.) describa un péptido que comprende una secuencia que es sustancialmente similar a una secuencia de un péptido nativo que se sabe que existe en tal organismo biológico, excepto porque la secuencia se ha modificado, es decir, para incluir una o más adiciones, deleciones, inserciones o sustituciones de un aminoácido. En algunas realizaciones, la secuencia se modifica mediante humanización, por ejemplo, para reducir la inmunogenicidad del péptido para seres humanos. En algunas realizaciones, el péptido derivado de un organismo biológico (por ejemplo, un eucariota, procariota, mamífero, ser humano, levadura, etc.) comprende una secuencia no natural que es idéntica en al menos aproximadamente el 80 % a un péptido que es nativo para ese organismo biológico, o idéntica en al menos aproximadamente el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, o más del 99 % a un péptido que es nativo para ese organismo biológico.

El CAR-ID puede comprender una etiqueta myc. El CAR-ID puede comprender una etiqueta His. El CAR-ID puede comprender una etiqueta HA. El CAR-ID puede comprender complejo de peridinina-clorofila-proteína. El CAR-ID puede comprender proteína verde fluorescente (GFP). El CAR-ID puede comprender proteína roja fluorescente (RFP). El CAR-ID puede comprender ficoeritrina (PE). El CAR-ID puede comprender estreptavidina. El CAR-ID puede comprender avidina. El CAR-ID puede comprender peroxidasa del rábano (HRP). El CAR-ID puede comprender fosfatasa alcalina. El CAR-ID puede comprender glucosa oxidasa. El CAR-ID puede comprender glutatión-S-transferasa (GST). El CAR-ID puede comprender proteína de unión a maltosa. El CAR-ID, como ejemplo no limitativo, puede ser una etiqueta c-myc, etiqueta de polihistidina, V5, VSVG, softag 1, softag 3, etiqueta de expresión, etiqueta S, palmitoilación, nitrosilación, etiqueta SUMO, tioredoxina, poli(NANP), poli-Arg, proteína de unión a calmodulina, fragmento PurF, cetoesteroide isomerasa, PaP3,30, dominio de pliegue de histona de TAF12, etiqueta FKBP, etiqueta SNAP, etiqueta Halo, péptidos de ARNasa I. El CAR-ID puede comprender un sitio de escisión de proteasa. El sitio de escisión de proteasa puede reconocerse por trombina, factor Xa, proteasa de TEV o enterocinasa.

El CAR-ID puede ser un péptido hidrófilo lineal pequeño. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede comprender un ligador. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser un péptido diana hidrófilo (HTP). El péptido hidrófilo lineal pequeño puede comprender la secuencia g Gg GSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 38). El péptido hidrófilo lineal pequeño puede comprender la secuencia GGGGSDYKDDDDKP (SEQ ID NO: 39). El péptido hidrófilo lineal pequeño puede consistir esencialmente en la secuencia GGGGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 38). El péptido hidrófilo lineal pequeño puede consistir esencialmente en la secuencia GGGGSDYKDDDDKP (SEQ ID NO: 39). El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 50 % a SEQ ID NO: 38 o 39. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 60 % a SEQ ID NO: 38 o 39. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 70 % a SEQ ID NO: 38 o 39. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 80 % a SEQ ID NO: 38 o 39. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 85 % a SEQ ID NO: 38 o 39. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 90 % a SEQ ID NO: 38 o 39. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede tener unión no específica reducida con respecto a otros péptidos conocidos en la técnica. El péptido hidrófilo lineal pequeño puede tener unión no específica reducida e inestabilidad de proteína de fusión reducida con respecto a otros péptidos dados a conocer en el presente documento. El CAR-ID puede comprender una etiqueta FlAg ® (DYKDDDDK SEQ ID NO: 40) o un derivado o un homólogo de la misma.

El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido que se produce de manera natural. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido humano. El CAR-ID puede ser un péptido no endógeno o un péptido no nativo, en contraposición a un péptido endógeno o péptido nativo. Un péptido endógeno puede ser algo que está presente de manera natural o normal en el cuerpo humano (por ejemplo, biotina, Fc de anticuerpo monoclonal) o con lo que se encuentra normalmente el cuerpo humano. Por tanto, un péptido no endógeno será algo foráneo o que no está presente de manera natural en el cuerpo humano. Por ejemplo, los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden emplear péptidos de GCN4 como CAR-ID, que no se encuentran normalmentein vivo.En algunas realizaciones, tales péptidos no naturales conservan ortogonalidad de la interacción sCAR-conmutador. El CAR-ID puede ser un péptido no inmunogénico (por ejemplo, un péptido que se sabe que no provoca ninguna respuesta inmunitaria o provoca una respuesta inmunitaria despreciable en el cuerpo humano).

El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido expresado en un animal seleccionado de un chimpancé, un mono, una rata, un ratón, un ave, un pez, un cerdo, un caballo, una vaca, una cabra, un pollo, un conejo y una cobaya. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido de mamífero. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido no de mamífero. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido expresado en una planta. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido expresado en una bacteria. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido procariota. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido eucariota. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un péptido expresado por una levadura.

El CAR-ID puede comprender un péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura o un derivado o un homólogo del mismo. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender una secuencia de péptido de GCN4(7P14P) (definida en Bergeret al.FEBS Letters 450 (1999) 149-153). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender la secuencia RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER (SEQ ID NO: 36). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender la secuencia NYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 26). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede consistir en la secuencia RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER (SEQ ID NO: 36). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede consistir en la secuencia NYHLENEVARLKKL (SEQ ID N<o>: 26). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender una porción de SEQ ID NO: 36. La porción de SEQ ID NO: 36 puede tener al menos 4 aminoácidos de longitud. La porción de SEQ ID NO: 36 puede tener aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12 o aproximadamente 13 aminoácidos de longitud. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender una porción de SEQ ID NO: 36 que tiene 4 aminoácidos de longitud, o una porción de SEQ ID NO: 36 que tiene 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 aminoácidos de longitud. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender la secuencia NYBLENEVa RlKk (SEQ ID NO: 245). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender la secuencia NYBLENEVARLK (SEQ ID NO: 145). El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 50 % a una o ambas de SEQ ID NO: 26 o 36. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 60 % a una o ambas de SEQ ID NO: 26 o 36. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 70 % a una o ambas de SEQ ID NO: 26 o 36. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 80 % a una o ambas de SEQ ID NO: 26 o 36. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 85 % a una o ambas de SEQ ID NO: 26 o 36. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede ser idéntico en al menos aproximadamente el 90 % a una o ambas de SEQ ID NO: 26 o 36. El conmutador de CAR-EC puede comprender un péptido de GCN4 de levadura y uno o más ligadores. El conmutador de CAR-EC puede comprender SEQ ID NO: 37. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender o consistir en un epítopo de unión mínimo para un anticuerpo anti-GCN4. El péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura puede comprender o consistir en un epítopo de unión (por ejemplo, un epítopo de unión mínimo) para el scFv de anticuerpo anti-GCN452SR4 (descrito en Zahnd, C.,et al.,(2004), The Journal of Biological Chemistry 279, 18870-18877), o un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las secuencias de CDR comprendidas en el mismo (VL de CDR1: RSSTGAVTTSNYAS; VL de CDR2: GTNNRAP; VL de CDR3: ALWYSNHWV; VH de CDR1: DYGVN; VH de CDR2: VIWGDGITDYNSALKS; VH de CDR3: GLFDY). El CAR-ID puede comprender una secuencia de estructura I: X1NYBLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, yX3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. En algunas realizaciones, X1 es K o está ausente. En algunas realizaciones, X2 se selecciona de K, A, y G. En algunas realizaciones, X3 se selecciona de L, A, y G. En algunas realizaciones, el CAR-ID comprende o consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 139, 154-163. KNYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 154); KNYHLENEVARLKAL (SEQ ID NO: 155); KNYHLENEVARLKGL (SEQ ID NO: 156); KNYHLENEVARLKAA (SEQ ID NO: 157); KNYHLENEVARLKGG (SEQ ID NO: 158); NYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 159); NYHLENEVARLKAL (SEQ ID NO: 160); NYHLENEVARLKGL (SEQ ID NO: 161); NYHLENEVARLKAA (SEQ ID NO: 162); NYHLENEVARLKGG (SEQ ID NO: 163); y LLPKNYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 139).

En algunas realizaciones, a modo de ejemplo no limitativo, el CAR-ID puede comprender una etiqueta isopeptag (TDKDMTITFTNKKDAE; SEQ ID NO: 41). El CAR-ID puede comprender una etiqueta SpyTag (AHIVMVDAYKPTK; SEQ ID NO: 42). El CAR-ID puede comprender SNAr E. El CAR-iD puede comprender una etiqueta Hu.

La pareja de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido de primera hélice alfa que se une a un péptido de segunda hélice alfa de tal manera que la primera hélice alfa y la segunda hélice alfa pueden formar una estructura de hélice superenrollada cuando se unen.

También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender el péptido de E4 (EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK; SEQ ID NO: 44). También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender el péptido de K4 (KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE; SEQ ID NO: 43). También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender un péptido de E4 modificado. También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender un péptido de K4 modificado. También se da a conocer que el CAR-ID puede consistir en un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 44. También se da a conocer que el CAR-ID puede consistir en un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 43. También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a SEQ ID NO: 43. También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a SEQ ID NO: 44. También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a uno cualquiera de los siguientes péptidos de K4 o E4 (SEQ ID NO: 45-58):

EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK SEQ ID NO

KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE SEQ ID NO 46

EIAALEKEIAALEKEIAALEK SEQ ID NO 47

EIAALEKEIAALEKEIAALEKEIAALEK SEQ ID NO 48

KIAALKEKIAALKEKIAALKE SEQ ID NO 49

KIAALKEKIAALKEKIAALKEKIAALKE SEQ ID NO 50

EISALEKEISALEKEISALEK SEQ ID NO 51

EISALEKEISALEKEISALEKEISALEK SEQ ID NO 52

KISALKEKISALKEKISALKE SEQ ID NO 53

KISALKEKISALKEKISALKEKISALKE SEQ ID NO 54

EVAALEKEVAALEKEVAALEK SEQ ID NO 55

KVAALKEKVAALKEKVAALKE SEQ ID NO 56

EVSALEKEVSALEKEVSALEK SEQ ID NO

KVSALKEKVSALKEKVSALKE SEQ ID NO 58

También se da a conocer que el CAR-ID puede comprender un péptido que tiene una secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 45-58. Un conmutador que comprende un resto de direccionamiento descrito en el presente documento y un CAR-ID que comprende un péptido que tiene una secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 45, 47, 48, 51, 52, 55, y 57 pueden emparejarse con un CAR que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 65 para su uso según la presente invención (por ejemplo, un conmutador de este tipo puede usarse en combinación con una célula efectora que expresa un CAR de este tipo para producir un tratamiento descrito en el presente documento). Un conmutador que comprende un resto de direccionamiento descrito en el presente documento y un CAR-ID que comprende un péptido que tiene una secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 46, 49, 50, 53, 54, 56, y 58 pueden emparejarse con un CAR que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 64 para su uso según la presente invención (por ejemplo, un conmutador de este tipo puede usarse en combinación con una célula efectora que expresa un CAR de este tipo para producir un tratamiento descrito en el presente documento).

Además, a modo de ejemplo no limitativo, el CAR-ID puede comprender una hélice alfa de una proteína coronina 1A de ratón. Además, a modo de ejemplo no limitativo, el CAR-ID puede comprender un dominio de dimerización y acoplamiento (DDD) de proteína cinasa A dependiente de cAMP. El CAR-ID puede comprender un dominio de anclaje (AD) de una proteína de anclaje de cinasa A (AKAP). El CAR-ID puede comprender DDD1 (SEQ ID NO: 60). El Ca R-ID puede comprender AD1 (s Eq ID NO: 59). El CAR-ID puede comprender Dd D2 (SEQ ID NO: 62). El CAR-ID puede comprender AD2 (SEQ ID N<o>: 61).

Además, a modo de ejemplo no limitativo, el CAR-ID puede comprender un dominio de dimerización y acoplamiento de proteína cinasa A dependiente de cAMP (por ejemplo, DDD1 o DDD2), en el que el DDD se ha modificado con cisteínas que forman enlaces disulfuro entre el DDD y una pareja de AD en un receptor quimérico (por ejemplo, en el dominio extracelular distinto de anticuerpo). El CAR-ID puede comprender un AD (por ejemplo, AD1 o AD2), en el que el AD se ha modificado con cisteínas que forman enlaces disulfuro entre el AD y una pareja de DDD en un receptor quimérico (por ejemplo, en el dominio extracelular distinto de anticuerpo). Estos enlaces disulfuro pueden formar una interacción covalente entre el AD1 y el DDD1 o entre el AD2 y el DDD2. Esto puede resultar ventajoso para aumentar la afinidad del péptido distinto de anticuerpo para el CAR-ID, o viceversa.

Molécula pequeña de unión a receptor quimérico.

También se da a conocer que el CAR-ID comprende o consiste en una molécula pequeña. La molécula pequeña puede no comprender un péptido. La molécula pequeña puede no comprender dos o más aminoácidos unidos mediante un enlace amida. La molécula pequeña puede ser una molécula pequeña que se une a una proteína o péptido. La molécula pequeña puede ser una molécula pequeña que se une a una proteína o péptido, en la que la proteína o péptido está presente en el dominio extracelular distinto de anticuerpo del receptor quimérico. La molécula pequeña puede ser una molécula pequeña que se une a una proteína o péptido con alta afinidad. La molécula pequeña puede ser un fármaco. La molécula pequeña puede ser un compuesto inorgánico. La molécula pequeña puede ser un compuesto orgánico. La molécula pequeña puede producirse de manera natural. La molécula pequeña puede no producirse de manera natural. La molécula pequeña puede ser sintética. La molécula pequeña puede seleccionarse de un esteroide, una vitamina, un vitámero, un ligando, un agonista de receptor, un antagonista de receptor, un inhibidor enzimático, un aptámero de ADN, un ácido nucleico peptídico (ANP), un aptámero de ANP, un peptoide, un sustrato, un análogo de sustrato, un metabolito, un antibiótico, un monosacárido, un disacárido, un lípido, un ácido graso, un ácido nucleico, un alcaloide, un glicósido, una fenzina, un policétido, un terpeno y un tetrapirrol, y porciones de los mismos. A modo de ejemplo no limitativo, la molécula pequeña puede seleccionarse del grupo que consiste en DOTA, dinitrofenol, quinona, biotina, anilina, atrazina, un derivado de anilina, ácido o-aminobenzoico, ácido paminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, hidralazina, halotano, digoxigenina, arsonato de benceno, lactosa, trinitrofenol, biotina o un derivado de la misma.

También se da a conocer que la molécula pequeña puede comprender una vitamina o un derivado de la misma. La vitamina, como ejemplo no limitativo, puede seleccionarse de vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K. La vitamina puede ser vitamina C. La vitamina puede ser vitamina D. La vitamina puede comprender folato o un derivado del mismo. La molécula pequeña puede comprender un vitámero. La molécula pequeña puede comprender un metabolito de vitamina o precursor de vitamina. El vitámero, como ejemplo no limitativo, puede seleccionarse de retinol, retinal, beta-caroteno, un carotenoide, tiamina, riboflavina, niacina, niacinamida, ácido pantoténico, piridoxina, piridoxamina, piridoxal, biotina, ácido fólico, ácido folínico, cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina, ácido ascórbico, colecalciferol, ergocalciferol, un tocoferol, un tocotrienol, una filoquinona, y una menaquinona o un derivado de la misma. La molécula pequeña puede comprender un antioxidante o un derivado del mismo.

También se da a conocer que la molécula pequeña puede ser un inhibidor enzimático. La molécula pequeña puede seleccionarse, como ejemplo no limitativo, de un inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de proteasa, un inhibidor de receptor de factor de crecimiento, un inhibidor de receptor de hormona, un inhibidor de cinasa Janus, un inhibidor de cinasa de linfoma anaplásico (ALK), un inhibidor de Bcl-2, un inhibidor de poli-ADP ribosa polimerasa (PARP), un inhibidor de PI3K, un inhibidor de Braf, un inhibidor de MAP cinasa, un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina y un inhibidor de proteína de choque térmico. El inhibidor enzimático puede seleccionarse de apatinib, bortezomib, imatinib, ibrutinib, seliciclib, bosutinib, cabozantinib, crizotinib, dabrafenib, dasatinib, doxorubicina, erlotinib, everolimus, gefitinib, imatinib, iniparib, lapatinib, LEE011, LGX818, milotinib, obatoclax, olaparib, pazopanib, PD-0332991, perifosina, ponatinib, regorafenib, ruxolitinib, salinomicina, sorafebnib, sunitinib, tamoxifeno, temsirolimus, tofacitinib, trametinib, vandetanib y vemurafenib o un derivado de los mismos.

También se da a conocer que la molécula pequeña puede ser de menos de aproximadamente 1000 Da, 1100 Da, 1200 Da, 1300 Da, 1400 Da, 1500 Da, 1600 Da, 1700 Da, 1800 Da, 1900 Da, 2000 Da, 2100 Da, 2200 Da, 2300 Da, 2400 Da, 2500 Da, 2600 Da, 2700 Da, 2800 Da, 2900, Da o menos de aproximadamente 3000 Da. El conmutador puede ser de menos de aproximadamente 1200 Da. El conmutador puede ser de menos de aproximadamente 1500 Da. El conmutador de CAR-EC puede ser de menos de aproximadamente 2000 Da.

También se da a conocer que la molécula pequeña puede tener un tamaño del orden de aproximadamente 10-8 m, aproximadamente 10-9 m, aproximadamente 10-10 m. La molécula pequeña puede tener un tamaño de menos de aproximadamente 10-7 m. La molécula pequeña puede tener un tamaño de menos de aproximadamente 10-8 m. La molécula pequeña puede tener un tamaño de menos de aproximadamente 10-9 m. La molécula pequeña puede tener un tamaño de menos de aproximadamente 10-10 m. La molécula pequeña puede tener un tamaño de menos de aproximadamente 10-11 m. La molécula pequeña puede tener menos de aproximadamente 10 nm, menos de aproximadamente 20 nm, menos de aproximadamente 30 nm, menos de aproximadamente 40 nm, menos de aproximadamente 50 nm, menos de aproximadamente 60 nm, menos de aproximadamente 70 nm, menos de aproximadamente 80 nm, menos de aproximadamente 90 nm, menos de aproximadamente 100 nm, menos de aproximadamente 110 nm, menos de aproximadamente 120 nm, menos de aproximadamente 130 nm, menos de aproximadamente 140 nm, menos de aproximadamente 150 nm, menos de aproximadamente 160 nm, menos de aproximadamente 170 nm, menos de aproximadamente 180 nm, menos de aproximadamente 190 nm, o menos de aproximadamente 200 nm de anchura en su dimensión más ancha. La molécula pequeña puede tener menos de aproximadamente 100 nm, menos de aproximadamente 200 nm de anchura, menos de aproximadamente 300 nm, menos de aproximadamente 400 nm, menos de aproximadamente 500 nm, menos de aproximadamente 600 nm, menos de aproximadamente 700 nm, menos de aproximadamente 800 nm, menos de aproximadamente 900 nm, o menos de aproximadamente 1000 nm de anchura, en su dimensión más ancha.

El CAR-ID puede comprender un hapteno. El CAR-ID puede inducir una respuesta inmunitaria cuando se une a una molécula portadora más grande, tal como una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede ser isotiocianato de fluoresceína (FITC) o un derivado del mismo. El CAR-ID puede comprender biotina. El CAR-ID puede comprender dinitrofenol.

Alternativamente, el CAR-ID no comprende un hapteno. El CAR-ID puede seleccionarse de un esteroide, una vitamina, un vitámero, un metabolito, un antibiótico, un monosacárido, un disacárido, un lípido, un ácido graso, un ácido nucleico, un alcaloide, un glicósido, una fenzina, un policétido, un terpeno y un tetrapirrol, y porciones de los mismos, y combinaciones de los mismos. El CAR-ID puede ser un fármaco de penicilina o un derivado del mismo.

El CAR-ID puede unirse y/o conjugarse al resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo de direccionamiento o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de direccionamiento y el CAR-ID puede unirse y/o conjugarse a un aminoácido del anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo. El aminoácido del anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un aminoácido no natural. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo dado a conocer en el presente documento. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-25. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-25 y los aminoácidos no naturales pueden estar ubicados en sitios respectivos mostrados en la tabla 1. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-15 y los aminoácidos no naturales pueden estar ubicados en sitios respectivos mostrados en la tabla 1.

Tabla 1.

El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD20 o fragmento de anticuerpo anti-CD20. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de anticuerpo anti-CD22. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD33 o fragmento de anticuerpo anti-<c>D33. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD123 o fragmento de anticuerpo anti-CD123. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CLL1 o fragmento de anticuerpo anti-CLL1. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CEA o fragmento de anticuerpo anti<c>E<a>. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-Her2 o fragmento de anticuerpo anti-Her2. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-BCMA o fragmento de anticuerpo anti-BCMA. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CS1 o fragmento de anticuerpo anti-CS1. El resto de direccionamiento puede ser un receptor de células T. El resto de direccionamiento puede ser un receptor de células T soluble. El receptor de células T soluble de direccionamiento puede unirse a un péptido de NY-Es O-1 restringido por MHC.

El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267 y los aminoácidos no naturales pueden estar ubicados en sitios respectivos mostrados en la tabla 2. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268. El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268 y los aminoácidos no naturales pueden estar ubicados en sitios respectivos mostrados en la tabla 2.

Tabla 2.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden codificarse por un codón que no codifica para uno de los veinte aminoácidos naturales. El uno o más aminoácidos no naturales pueden codificarse por un codón sin sentido (codón de terminación). El codón de terminación puede ser un codón ámbar. El codón ámbar puede comprender una secuencia UAG. En el presente documento, puede usarse “UAG” y “TAG” de manera intercambiable en referencia a codones ámbar. El codón de terminación puede ser un codón ocre. El codón ocre puede comprender una secuencia UAA. El codón de terminación puede ser un codón ópalo u ocre oscuro. El codón ópalo u ocre oscuro puede comprender una secuencia UGA. El uno o más aminoácidos no naturales pueden codificarse por un codón de cuatro bases.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden ser p-acetilfenilalanina (pAcF o pAcPhe). El uno o más aminoácidos no naturales pueden ser selenocisteína. El uno o más aminoácidos no naturales pueden ser p-fluorofenilalanina (pFPhe). El uno o más aminoácidos no naturales pueden seleccionarse del grupo que comprende p-azidofenilalanina (pAzF), p-azidometilfenilalanina (pAzCH2F), p-benzoilfenilalanina (pBpF), p-propargiloxifenilalanina (pPrF), piodofenilalanina (pIF), p-cianofenilalanina (pCNF), p-carboxilmetilfenilalanina (pCmF), 3-(2-naftil)alanina (NapA), pboronofenilalanina (pBoF), o-nitrofenilalanina (oNiF), (8-hidroxiquinolin-3-il)alanina (HQA), selenocisteína, y (2,2'-bipiridin-5-il)alanina (BipyA). El uno o más aminoácidos no naturales pueden ser 4-(6-metil-s-tetrazin-3-il)aminofenilalanina.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden ser p-aminoácidos (p3 y p2), homo-aminoácidos, derivados de prolina y ácido pirúvico, derivados de alanina sustituidos en 3, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina sustituidos en el anillo, aminoácidos principales lineales, diaminoácidos, D-aminoácidos, N-metil-aminoácidos, o una combinación de los mismos.

Los ejemplos adicionales de aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, 1) diversos análogos de tirosina y fenilalanina sustituidos tales como O-metil-L-tirosina, p-amino-L-fenilalanina, 3-nitro-L-tirosina, p-nitro-L-fenilalanina, m-metoxi-L-fenilalanina y p-isopropil-L-fenilalanina; 2) aminoácidos con grupos aril-azida y benzofenona que pueden fotorreticularse; 3) aminoácidos que tienen reactividad química única incluyendo acetil-L-fenilalanina y m-acetil-L-fenilalanina, O-alil-L-tirosina, O-(2-propinil)-L-tirosina, p-etiltiocarbonil-L-fenilalanina y p-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina; 4) aminoácidos que contienen átomos pesados para puesta en fase en cristalografía de rayos X incluyendo p-yodo y p-bromo-L-fenilalanina; 5) el aminoácido activo para rédox dihidroxi-L-fenilalanina; 6) aminoácidos glicosilados que incluyen b-N-acetilglucosamina-O-serina y a-N-acetilgalactosamina-O-treonina; 7) aminoácidos fluorescentes con cadenas laterales de naftilo, dansilo y 7-aminocumarina; 8) aminoácidos fotoescindibles y fotoisomerizables con cadenas laterales de Cys, Ser y Tyr de azobenceno y nitrobencilo; 9) el compuesto mimético de fosfotirosina pcarboximetil-L-fenilalanina; 10) el homólogo de glutamina homoglutamina; y 11) ácido 2-aminooctanoico. El aminoácido no natural puede modificarse para incorporar un grupo químico. El aminoácido no natural puede modificarse para incorporar un grupo cetona.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden comprender al menos un grupo oxima, carbonilo, dicarbonilo, hidroxilamina o una combinación de los mismos. El uno o más aminoácidos no naturales pueden comprender al menos un grupo funcional carbonilo, dicarbonilo, alcoxi-amina, hidrazina, alqueno acíclico, alquino acíclico, ciclooctino, aril/alquil-azida, norborneno, ciclopropeno, trans-cicloocteno o tetrazina o una combinación de los mismos.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el resto de direccionamiento y/o el CAR-ID mediante métodos conocidos en la técnica. Pueden usarse sistemas basados en células o libres de células para alterar la secuencia genética del resto de direccionamiento y/o el CAR-ID, produciendo de ese modo el resto de direccionamiento y/o el CAR-ID con uno o más aminoácidos no naturales. Pueden usarse cepas auxotróficas en lugar de ARNt y sintetasa modificados por ingeniería. El uno o más aminoácidos no naturales pueden producirse mediante reacción selectiva de uno o más aminoácidos naturales. La reacción selectiva puede estar mediada por una o más enzimas. En un ejemplo no limitativo, la reacción selectiva de una o más cisteínas con enzima de generación de formilglicina (FGE) puede producir una o más formilglicinas (véase Rabukaet al.,Nature Protocols 7: 1052-1067 (2012)).

El uno o más aminoácidos no naturales pueden participar en una reacción química para formar un ligador. La reacción química para formar el ligador puede ser una reacción bioortogonal. La reacción química para formar el ligador puede ser química clic.

Se dan a conocer aminoácidos no naturales adicionales en Liuet al.(Annu Rev Biochem, 79:413-44, 2010), Wanget al.(Angew Chem Int Ed, 44:34-66, 2005) y las solicitudes de PCT números PCT/US2012/039472, PCT/US2012/039468, PCT/US2007/088009, PCT/US2009/058668, PCT/US2007/089142, PCT/US2007/088011, PCT/US2007/001485, PCT/US2006/049397, PCT/US2006/047822 y PCT/US2006/044682.

Segunda región del conmutador de CAR-EC: resto de direccionamiento.

Los conmutadores de CAR-EC comprenden un CAR-ID y un resto de direccionamiento.

El resto de direccionamiento puede unirse a una molécula de superficie celular en una diana. La molécula de superficie celular puede comprender un antígeno. La molécula de superficie celular puede seleccionarse de una proteína, un resto de lípido, una glicoproteína, un glicolípido, un hidrato de carbono, un polisacárido, un ácido nucleico, un péptido unido a MHC o una combinación de los mismos. La molécula de superficie celular puede comprender partes (por ejemplo, cubiertas, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbrinas y toxinas) de bacterias, virus y otros microorganismos. La molécula de superficie celular puede expresarse por la célula diana. La molécula de superficie celular puede no expresarse por la célula diana. A modo de ejemplo no limitativo, la molécula de superficie celular puede ser un ligando expresado por una célula que no es la célula diana y que se une a la célula diana o una molécula de superficie celular de la célula diana. Además, como ejemplo no limitativo, la molécula de superficie celular puede ser una toxina, molécula exógena o proteína viral que se une a una superficie celular o receptor de superficie celular de la célula diana.

El resto de direccionamiento puede ser un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede ser una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser una inmunoglobulina (Ig). La inmunoglobulina puede seleccionarse de una IgG, una IgA, una IgD, una IgE, una IgM, un fragmento de las mismas (por ejemplo, un fragmento o porción de unión a antígeno) o una modificación de las mismas. La inmunoglobulina puede ser IgG. La IgG puede ser IgG1. La IgG puede ser IgG2. La IgG puede tener una o más mutaciones de Fc para modular la unión de FcR de células T endógeno al conmutador de CAR-EC. La IgG puede tener una o más mutaciones de Fc para eliminar la capacidad de unión de Fc al FcR de células positivas para FcR. La eliminación de la capacidad de unión de Fc puede reducir la oportunidad de reticulación de la CAR-EC a células positivas para FcR, en la que la reticulación de la CAR-EC a células positivas para FcR activaría la CAR-EC en ausencia de la célula diana. Como tal, la modulación de la unión de FcR de células T endógeno al conmutador de CAR-EC puede reducir una respuesta inmunitaria ineficaz o indeseable. La una o más mutaciones de Fc pueden eliminar un sitio de glicosilación. La una o más mutaciones de Fc pueden seleccionarse de E233P, L234V, L235A, delG236, A327G, A330S, P331S, N297Q y cualquier combinación de las mismas. La una o más mutaciones de Fc pueden estar en IgG1. La una o más mutaciones de Fc en la IgG1 pueden ser L234A, L235A, o ambas. Alternativa o adicionalmente, la una o más mutaciones de Fc en la IgG1 pueden ser L234A, L235E, o ambas. Alternativa o adicionalmente, la una o más mutaciones de Fc en la IgG1 pueden ser N297A. Alternativa o adicionalmente, la una o más mutaciones pueden estar en IgG2. La una o más mutaciones de Fc en la IgG2 pueden ser V234A, V237A, o ambas.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser una inmunoglobulina nula para Fc o un fragmento de la misma.

El anticuerpo de direccionamiento o porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser un Fab. En algunas realizaciones, un aspecto fundamental de las células sCAR-T descritas en el presente documento es la ortogonalidad de conmutadores con injerto de CAR-ID ya que sólo interaccionan con la célula diana y sCAR y no con otros receptores inmunitarios o tipos de células. La falta de ortogonalidad tiene el potencial de provocar efectos inespecíficos. Por tanto, en algunas realizaciones, pueden ser deseables Fab porque carecer de un dominio Fc elimina la posibilidad de unión inespecífica mediada por receptor de Fc. En algunas realizaciones, el tamaño más pequeño y la semivida más corta (aproximadamente 1-5 h) para Fab frente a 10-20 d para IgG proporciona una mejor penetración en el tumor y un mayor control temporal sobre la activación de células sCAR-T, en traslación clínica. Además, el Fab puede diferir de la IgG en cuanto a la valencia, constante de disociación, o distribución tisular.

El anticuerpo de direccionamiento fragmento puede ser un anticuerpo humano, completamente humano, humanizado, humano modificado por ingeniería, no humano y/o quimérico. El anticuerpo no humano puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Los anticuerpos quiméricos pueden referirse a anticuerpos creados mediante la unión de dos o más genes de anticuerpo que originalmente codificaban para anticuerpos independientes. Un anticuerpo quimérico puede comprender al menos un aminoácido de un primer anticuerpo y al menos un aminoácido de un segundo anticuerpo, en el que el primer y segundo anticuerpos son diferentes. Al menos una porción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de una especie bovina, una especie humana o una especie murina. Al menos una porción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de una rata, una cabra, una cobaya o un conejo. Al menos una porción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de un ser humano. Al menos una porción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de macaco cangrejero.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede basarse en o derivarse de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de un mamífero, ave, pez, anfibio o reptil. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, carnívoros, roedores, elefantes, marsupiales, conejos, murciélagos, primates, focas, osos hormigueros, cetáceos, perisodáctilos y artiodáctilos. El mamífero puede ser un ser humano, primate no humano, ratón, oveja, gato, perro, vaca, caballo, cabra o cerdo.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprendido en los conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento está humanizado. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprendido en los conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento está humanizado, y se une a CD19. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento se une específicamente a CD19 (es decir, no se produce o puede observarse ninguna unión inespecífica sustancial). En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD19, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CD19. En realizaciones particulares, el resto de direccionamiento comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CD19 humanizado (por ejemplo, uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-CD19 humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos dados a conocer en el presente documento). En realizaciones particulares, el resto de direccionamiento comprende una forma humanizada del clon de anticuerpo murino anti-CD19 FMC63. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el resto de direccionamiento comprende un

El anticuerpo de direccionamiento o un fragmento de anticuerpo puede seleccionar como diana un antígeno seleccionado de, como ejemplo no limitativo, CD19, Her2, CLL1, c D33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, CEA o un fragmento de los mismos. El antígeno puede comprender un antígeno de tipo natural. El antígeno puede comprender una o más mutaciones. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un resto de direccionamiento de células B. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD19 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CD19 o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de clon de anticuerpo huB4 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 223-224), FMC63 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 2-15, 17-25, 184-185), y 1D3 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 207-208). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CLL1 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CLL1 o fragmento de anticuerpo puede ser el clon de anticuerpo 1075.7 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 193-194). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD123 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CD123 o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de clon de anticuerpo 32716 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 239-240) y 26292 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 241-242). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CD22 o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de clon de anticuerpo m972 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 211-212) y m971 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 209-210). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD20 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CD20 o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de clon de anticuerpo OFA (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 219-220), RTX (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 215-216), y GA101 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 217-218). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-BCMA o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-BCMA o fragmento de anticuerpo puede ser clon de anticuerpo BCMA-98 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 221-222). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-Her2 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-Her2 o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de clon de anticuerpo trastuzumab (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 187-188). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CS1 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CS1 o fragmento de anticuerpo puede ser clon de anticuerpo elotuzumab (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 243-244). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD33 o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CD33 o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de clon de anticuerpo hM195 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 259-260) y HP67.6 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 237-238). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo puede ser el clon C225 (véase por ejemplo, SEQ ID NO: 191-192). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-EGFRvIII o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-EGFRvIII o fragmento de anticuerpo puede ser el clon Hu806 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 199-200). El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CEA o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CEA o fragmento de anticuerpo puede ser el clon de anticuerpo A5B7 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 225-226). El conmutador de expresión de cada requiere una cadena pesada y cadena ligera. En algunas realizaciones, el conmutador de expresión de cada requiere transfectar conjuntamente un gen de cadena pesada y cadena ligera en una o más células de expresión (por ejemplo, HEK). El CAR-ID puede estar ubicado únicamente en la cadena pesada para proporcionar un conmutador monovalente. El CAR- ID puede estar ubicado únicamente en la cadena ligera para proporcionar un conmutador monovalente. El CAR-ID puede estar ubicado tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera para proporcionar un conmutador bivalente. El CAR- ID puede estar ubicado tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera para proporcionar un conmutador multivalente.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD22. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-BCMA o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CS1 o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-EGFRvIII o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-Her2 o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD20 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender rituximab. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CEA o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CLL1 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD123 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD33 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede no comprender un anticuerpo anti-EpCAM o fragmento del mismo.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de cualquier anticuerpo comercialmente disponible. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de adotrastuzumab emtansina, alemtuzumab, bevacizumab, brentuximab, vedotina, gemtuzumab, ozogamicina, ipilimumab, ibritumomab, tiuxetán, panitumumab, cetuximab, erbitux, rituximab, trastuzumab y fragmentos de los mismos.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia de nucleótidos basada en o derivada de SEQ ID NO: 184. La secuencia de nucleótidos puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 184. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia basada en o derivada de SEQ ID NO: 185. La secuencia de nucleótidos puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 % aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 % aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 % aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 % aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 % aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % SEQ ID NO: 185

La cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia de nucleótidos basada en o derivada de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 207 y 223. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 207 y 223. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia basada en o derivada de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 208 y 224. La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 208 y 224.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento puede comprender una secuencia de aminoácidos basada en o derivada de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 25 y 203. La secuencia de aminoácidos puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 25 y 203. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada de una IgG anti-CD19. La cadena pesada de la IgG anti-CD19 puede comprender una secuencia basada en o derivada de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 204. La secuencia de aminoácidos puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 204. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada de un Fab anti-CD19. La cadena pesada del Fab anti-CD19 puede comprender una secuencia basada en o derivada de SEQ ID NO: 205. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada de un Fab anti-CD19 que comprende o que consiste en de una secuencia de aminoácidos que puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 205.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CLL1 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CLL1 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 193. La cadena ligera del anticuerpo anti-CLL1 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 193. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CLL1 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CLL1 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 194. La cadena pesada del anticuerpo anti-CLL1 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% o aproximadamente el 2 % a Se Q ID NO: 194.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 12, y 14. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 12, y 14.El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo puede ser una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 211, y 213. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de<s>E<q>ID NO: 211,213.

También se da a conocer que el anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 189, 216, 218, y 220. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2% a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 189, 216, 218, y 220 El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo puede ser una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 190, 215, 217, y 219. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 190, 215, 217, y 219. El conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 190, 215, 217, y 219 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 189, 216, 218, y 220, u homólogos de las mismas o fragmentos de las mismas.

También se da a conocer que el anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 187. La cadena ligera del anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 187. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 188.

La cadena pesada del anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 188. El conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 188 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 187, u homólogos de las mismas o fragmentos de las mismas.

También se da a conocer que el anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-BCMA o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-BCMA o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 222. La cadena ligera del anticuerpo anti-BCMA o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 222. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-BCMA o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-BCMA o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 221. La cadena pesada del anticuerpo anti-BCMA o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente , aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente , aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente , aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente , aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente , aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 221. El conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 221 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 222, u homólogos de las mismas o fragmentos de las mismas.

También se da a conocer que el anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CEA o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CEA o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 226. La cadena ligera del anticuerpo anti-CEA o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 226. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CEA o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CEA o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 225.

La cadena pesada del anticuerpo anti-CEA o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 225. El conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 225 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 226, u homólogos de las mismas o fragmentos de las mismas.

También se da a conocer que el anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CS1 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CS1 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 243. La cadena ligera del anticuerpo anti-CS1 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 243. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CS1 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CS1 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 244.

La cadena pesada del anticuerpo anti-CS1 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 aproximadamente el 80 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 aproximadamente el 60 %, aproximadamente el %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 244. El conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 244 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 243, u homólogos de las mismas o fragmentos de las mismas.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD33 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD33 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 195. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD33 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente , aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 aproximadamente el 85 %, aproximadamente , aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 aproximadamente el 65 %, aproximadamente , aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 aproximadamente el 45 %, aproximadamente , aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 aproximadamente el 25 %, aproximadamente , aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 195. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD33 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD33 o fragmento del mismo puede codificarse por SEQ ID NO: 196. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD33 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente , aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 aproximadamente el 95 %, aproximadamente , aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 aproximadamente el 80 %, aproximadamente , aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 aproximadamente el 60 %, aproximadamente , aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 aproximadamente el 40 %, aproximadamente , aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a SEQ ID NO: 196. El conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 196 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 195, u homólogos de las mismas o fragmentos de las mismas.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 184-196, 207-236. El polipéptido de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un nucleótido seleccionado de SEQ ID NO: 184-196, 207-236. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una forma humanizada de una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:

184-196, 207-236.

El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2-15, 17-25, 27-35, 197-206, 237-244, 246-266. El polipéptido de direccionamiento puede basarse en o derivarse de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2-15, 17-25, 27-35, 197-206,

237-244, 246-266. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una forma humanizada de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2-15, 17-25, 27-35, 197-206, 237-244,

246-266.

Por tanto, el resto de direccionamiento puede ser, por ejemplo, una inmunoglobulina (Ig) que se une a CD19. La inmunoglobulina puede seleccionarse de una IgG, una IgA, una IgD, una IgE, una IgM, un fragmento de unión a antígeno de las mismas, y una modificación de las mismas. La inmunoglobulina puede ser IgG. La IgG puede ser

IgG1. La IgG puede ser IgG2. La IgG puede tener una o más mutaciones de Fc para modular la unión de FcR de células T endógeno al conmutador. La IgG puede tener una o más mutaciones de Fc para eliminar la capacidad de unión de Fc al FcR de células positivas para FcR. La eliminación de la capacidad de unión de Fc puede reducir la oportunidad de reticulación de la EC de receptor quimérico a células positivas para FcR, en la que la reticulación de la EC de receptor quimérico a células positivas para FcR activaría la EC de receptor quimérico en ausencia de la célula diana. Como tal, la modulación de la unión de FcR de células T endógeno al conmutador de EC de receptor quimérico puede reducir una respuesta inmunitaria ineficaz o indeseable. La una o más mutaciones de Fc pueden eliminar un sitio de glicosilación. La una o más mutaciones de Fc pueden seleccionarse de E233P, L234V, L235A, delG236, A327G, A330S, P331S, N297Q y cualquier combinación de las mismas. La una o más mutaciones de Fc pueden estar en IgG1. La una o más mutaciones de Fc en la IgG1 pueden ser L234A, L235A, o ambas. Alternativa o adicionalmente, la una o más mutaciones de Fc en la IgG1 pueden ser L234A, L235E, o ambas. Alternativa o adicionalmente, la una o más mutaciones de Fc en la IgG1 pueden ser N297A. Alternativa o adicionalmente, la una o más mutaciones pueden

estar en IgG2. La una o más mutaciones de Fc en la IgG2 pueden ser V234A, V237A, o ambas.

El resto de direccionamiento puede ser una inmunoglobulina nula para Fc que se une a CD19, o un fragmento de unión a antígeno de la misma.

El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo humano, completamente humano, humanizado, humano modificado por ingeniería, no humano y/o quimérico. El anticuerpo no humano puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, al tiempo que se conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Los anticuerpos quiméricos pueden referirse a anticuerpos creados mediante la unión de dos o más genes de anticuerpo que originalmente codificaban para anticuerpos independientes. Un anticuerpo quimérico puede comprender al menos un aminoácido de un primer anticuerpo y al menos un aminoácido de un segundo anticuerpo, en el que el primer y segundo anticuerpos son diferentes. Al menos una porción del resto de direccionamiento puede ser de una especie bovina, una especie humana o una especie murina. Al menos una porción del resto de direccionamiento puede ser de una rata, una cabra, una cobaya o un conejo. Al menos una porción del resto de direccionamiento puede ser de un ser humano. Al menos una porción del resto de direccionamiento puede ser de macaco cangrejero. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo de un solo dominio humanizado. El anticuerpo de un solo dominio puede ser un camélido humanizado.

El resto de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de anticuerpo de unión a CD19, por ejemplo, de un mamífero, ave, pez, anfibio, reptil. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, carnívoros, roedores, elefantes, marsupiales, conejos, murciélagos, primates, focas, osos hormigueros, cetáceos, perisodáctilos y artiodáctilos. El mamífero puede ser un ser humano, primate no humano, ratón, oveja, gato, perro, vaca, caballo, cabra o cerdo.

El resto de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El resto de direccionamiento puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El resto de direccionamiento puede comprender una cadena ligera humanizada del anticuerpo FMC63 (SEQ ID NO: 25) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena ligera humanizada del anticuerpo FMC63, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. La cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El resto de direccionamiento puede comprender una cadena pesada humanizada del anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena pesada humanizada del anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El resto de direccionamiento puede comprender una cadena pesada humanizada del anticuerpo FMC63 (SEQ ID NO: 15) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena pesada humanizada del anticuerpo FMC63, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. La cadena pesada humanizada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada humanizada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión a antígeno puede ser idéntica en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 % a una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El resto de direccionamiento puede comprender una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada del anticuerpo FMC63 (SEQ ID NO: 15). Por ejemplo, el resto de direccionamiento puede comprender una cadena ligera humanizada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NO: 17-24 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-34 y el resto de direccionamiento puede comprender una cadena pesada humanizada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NO: 2-14.

Humanización

En la técnica se conocen numerosos métodos para la humanización y son aceptables para producir los anticuerpos humanizados (por ejemplo, anticuerpos anti-CD19 humanizados, o fragmentos de unión a antígeno o porciones de los mismos) comprendidos en los conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Son las siguientes: (1) determinar la secuencia de n nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de los dominios variables ligero y pesado del anticuerpo de partida; (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región de entramado de anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización; (3) las metodologías/técnicas de humanización reales; y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; y 6.180.370.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpo “humanizadas” que comprenden un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor o de roedor modificadas y sus CDR asociadas fusionadas a dominios constantes humanos. Véanse, por ejemplo, Winteret al.,1991, Nature 349:293-299; Lobuglioet al.,1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shawet al.,1987, J Immunol. 138:4534-4538; y Brownet al.,1987, Cancer Res. 47:3577-3583. Otras referencias describen CDR de roedor injertadas en una región de entramado (FR) de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmannet al.,1988, Nature 332:323-327; Verhoeyenet al.,1988, Science 239:1534-1536; y Joneset al.,1986, Nature 321:522-525. Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones de entramado de roedor modificadas por ingeniería recombinante. Véase, por ejemplo, la publicación de patente europea n.° 0519596. Estas moléculas “humanizadas” están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada frente a moléculas de anticuerpo de roedor anti-ser humano, lo cual limita la duración y eficacia de aplicaciones terapéuticas de estos restos en receptores humanos. Por ejemplo, la región constante de anticuerpo puede modificarse por ingeniería de tal manera que es inmunológicamente inerte (por ejemplo, no desencadena la lisis del complemento). Véanse, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO99/58572; solicitud de patente del R. U. n.° 9809951.8. Otros métodos de humanización de anticuerpos que también pueden usarse se dan a conocer por Daughertyet al.,1991, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 y en las patentes estadounidenses n.os 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; y 6.350.861; yen la publicación PCT n.° WO 01/27160.

En aún otra alternativa, pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos usando ratones comercialmente disponibles que se han modificado por ingeniería para expresar proteínas de inmunoglobulinas humanas específicas. También pueden usarse animales transgénicos que se diseñan para producir una respuesta inmunitaria más deseable o más robusta para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Los ejemplos de tal tecnología son Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, Calif.), HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, N.J.), y el ratón VelocImmune® de Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (Tarrytown, N.Y.).

En una alternativa, pueden producirse anticuerpos de manera recombinante y expresarse usando cualquier método conocido en la técnica. En otra alternativa, pueden producirse anticuerpos de manera recombinante mediante tecnología de presentación en fagos. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; y 6.265.150; y Winteret al.,1994, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Alternativamente, la tecnología de presentación en fagos (McCaffertyet al.,1990, Nature 348:552-553) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpoin vitro,a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en marco en un gen de proteína de la cubierta o bien mayor o bien menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gene que codifica para el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos puede realizarse en una variedad de formatos; véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S, yChiswell, David J., 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571. Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clacksonet al.,1991, Nature 352:624-628 aislaron una matriz diversa de anticuerpos antioxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria al azar de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos frente a una matriz diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Market al.,1991, J. Mol. Biol. 222:581-597, o Griffithet al.,1993, EMBO J. 12:725-734. En una respuesta inmunitaria natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones a una alta tasa (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una afinidad superior, y las células B que presentan inmunoglobulina de superficie de alta afinidad se replican preferentemente y se diferencian durante la exposición a antígeno posterior. Este proceso natural puede imitarse empleando la técnica conocida como “intercambio de cadenas”. (Markset al.,1992, Bio/Technol. 10:779-783). En este método, la afinidad de anticuerpos humanos “primarios” obtenidos mediante presentación en fagos puede mejorarse sustituyendo secuencialmente los genes de la región V de cadena pesada y ligera con repertorios de variantes que se producen de manera natural (repertorios) de genes de dominio V obtenidos a partir de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades en el intervalo pM-nM. Se ha descrito una estrategia para producir repertorios de anticuerpos de fagos muy grandes (también conocidos como “la mayor de las bibliotecas”) por Waterhouseet al.,1993, Nucl. Acids Res.

21:2265-2266. También puede usarse intercambio de genes para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedor, en los que el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo de roedor de partida. Según este método, que también se denomina “ impresión de epítopo”, el gen de dominio V de cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedor obtenidos mediante técnica de presentación en fagos se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras roedor-humano. La selección de antígeno da como resultado el aislamiento de regiones variables humanas que pueden restaurar un sitio de unión a antígeno funcional, es decir, el epítopo rige (imprime) la elección de pareja. Cuando se repite el proceso para sustituir el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la publicación de PCT n.° WO 93/06213). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedor mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de entramado o de CDR de origen de roedor.

En realizaciones particulares, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19) se humaniza según el método descrito en el presente documento en el ejemplo 1. En resumen, en este ejemplo no limitativo, se comparó la secuencia de aminoácidos de FMC63 con secuencias murina y de línea germinal humana usando IgBLAST (NCBl) y se realizaron mutaciones de diferencias de entramado entre los dominios VH y VL de FMC63 murino en comparación con los dominios VH y VL en IGHV4-59 humano en la secuencia de FMC63 para hacer que la secuencia fuera más idéntica a la secuencia de línea germinal humana. Este procedimiento dio como resultado la producción de varias secuencias de cadena pesada (tabla 3) y secuencias de cadena ligera (tabla 4) humanizadas, que después se modificaron para dar conmutadores de CAR-EC mediante la adición de un CAR-ID como fusión N-terminal en el VL. Los conmutadores humanizados que comprenden diversos pares de secuencias de cadena pesada y ligera humanizadas se sometieron a prueba para determinar la afinidad de unión a CD19 y para determinar la eficacia para inducir citotoxicidad de células que expresan CD19, tal como se describe en los ejemplos 3 y 4, respectivamente.

Ligadores

Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más ligadores. Un ligador puede proporcionar un flexibilidad de conmutador, longitud o geometría óptimas para facilitar una interacción o efecto de la célula efectora en la célula diana. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender dos o más ligadores. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender tres o más ligadores. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender cuatro o más ligadores. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ligadores. Los dos o más ligadores pueden ser iguales. Al menos dos de los tres o más ligadores pueden ser iguales. Los dos o más ligadores pueden ser diferentes. Al menos dos de los tres o más ligadores pueden ser diferentes.

El ligador puede comprender un péptido. El ligador puede comprender un péptido rígido (tal como EAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 163)). El ligador puede comprender un péptido flexible tal como Gg Gg S (SEQ ID NO: 93, n=1). El ligador puede comprender una secuencia seleccionada de S<e>Q ID NO: 93-103, 116-137, y 163. Los ligadores flexibles y rígidos los entiende un experto en la técnica y se describen en Chenet al.(Adv Drug Deliv Rev. 201365: 1357-1369). El diseño de ligador de conmutador puede ser crítico para los rendimientos de expresión y la potencia del conmutador. El ligador puede conectar el CAR-ID a la secuencia de anticuerpo de direccionamiento mediante fusión e injerto. El diseño del ligador puede tener un impacto directo sobre la estabilidad (por ejemplo, estabilidad térmica, estabilidad proteolítica) del conmutador. El ligador puede dictar además cómo se presenta el péptido al CAR, especialmente en la distancia y orientación relativa con respecto al conmutador. Por ejemplo, un ligador flexible puede presentar muchas orientaciones diferentes, mientras que un ligador rígido puede formar una hélice alfa y presentar tan sólo una orientación del epítopo peptídico con respecto al anticuerpo.

El ligador puede tener al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10 aminoácidos en longitud. El uno o más ligadores pueden comprender aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 aminoácidos.

El ligador puede estar ubicado en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del CAR-ID (por ejemplo, un CAR-ID de polipéptido) para injertar el CAR-ID en el resto de direccionamiento. Un primer ligador puede estar fusionado al extremo N-terminal del CAR-ID (por ejemplo, un CAR-ID de polipéptido) y un segundo ligador puede estar fusionado al extremo C-terminal del CAR-ID. El CAR-ID puede estar injertado en un sitio interno de un resto de direccionamiento con un ligador en cada extremo del CAR-ID.

El ligador puede estar ubicado en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del resto de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a antígeno del mismo) para injertar el resto de direccionamiento en el CAR-ID. Un primer ligador puede estar fusionado al extremo N-terminal del resto de direccionamiento y un segundo ligador puede estar fusionado al extremo C-terminal del resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede estar injertado en un sitio interno del CAR-ID con un ligador en cada extremo del resto de direccionamiento.

El ligador puede comprender la secuencia (GGGGS)n, (SEQ ID NO: 93), en la que n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o más. El ligador puede comprender la secuencia (GGS)n, (SEQ ID NO: 95), en la que n puede ser 1,2, 3, 4, 5 o más. El ligador puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103. El ligador puede comprender la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 93).

En algunas realizaciones, el ligador está fusionado al resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, el ligador está fusionado al CAR-ID. En algunas realizaciones, el ligador está fusionado al CAR-ID y al resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, el ligador puede comprender la secuencia (GGGGS)n, (SEQ ID NO: 93), en la que n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o más, y en la que en el ligador está fusionado al CAR-ID, fusionado al resto de direccionamiento, o fusionado tanto al CAR-ID como al resto de direccionamiento.

El ligador puede ser un ligador bifuncional. El ligador puede ser un ligador heterobifuncional. El ligador puede ser un ligador homobifuncional. El ligador puede comprender además una o más subunidades de polietilenglicol (PEG). El ligador puede comprender al menos cuatro subunidades de PEG. El ligador puede comprender al menos 10 subunidades de PEG. El ligador puede comprender al menos 20 subunidades de PEG. El ligador puede comprender al menos 30 subunidades de PEG. El ligador puede comprender una azida en un extremo. El ligador puede comprender un aminooxilo en un extremo. El ligador puede ser un ligador de azida-PEG-aminooxilo. El ligador puede comprender ciclooctino en un extremo. El ligador puede ser un ligador de PEG-ciclooctino. El ligador puede comprender triazol. El triazol puede ser un 1,2,3-triazol o un 1,2,4-triazol. El ligador puede ser un ligador de NHS-éster. El ligador puede ser un ligador de TriA. El ligador puede unirse al CAR-ID. El ligador puede unirse al CAR-ID mediante ligación de oxima.

Algunos ligadores y métodos de construcción de ligadores a modo de ejemplo adicionales pueden encontrarse en el documento WO2014/153002.

El ligador puede unirse a un CAR-ID. El ligador puede unirse a un resto de direccionamiento. El ligador puede unir un CAR-ID a un resto de direccionamiento. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento de una manera específica del sitio. La unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el uno o más CAR-ID a un sitio predeterminado en el uno o más restos de direccionamiento. Alternativa o adicionalmente, la unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el uno o más CAR-ID a un aminoácido no natural en el uno o más restos de direccionamiento. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento de una manera independiente del sitio. La unión de una manera independiente del sitio puede comprender unir el uno o más CAR-ID a un sitio aleatorio en el uno o más restos de direccionamiento. El CAR-ID puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de direccionamiento de una manera específica del sitio. El CAR-ID puede unirse a 1,2, 3, 4, 5 o más restos de direccionamiento de una manera independiente del sitio. Alternativamente, el resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más CAR-ID de una manera específica del sitio. La unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el uno o más restos de direccionamiento a un sitio predeterminado en el uno o más CAR-ID. El resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más CAR-ID de una manera independiente del sitio. La unión de una manera independiente del sitio puede comprender unir el uno o más restos de direccionamiento a un sitio aleatorio en el uno o más CAR-ID.

El uno o más ligadores pueden acoplarse al CAR-ID, al resto de direccionamiento o a una combinación de los m ismos. El uno o más ligadores pueden acoplarse al CAR-ID para formar uno o más productos intermedios de conmutador de la fórmula IIA: L1-X o la fórmula II: X-L1, en las que X es el CAR-ID y L1 es el ligador. El uno o más ligadores pueden acoplarse al CAR-ID mediante una oxima. El uno o más ligadores pueden acoplarse al CAR-ID mediante un ciclooctino, ciclopropeno, aril/alquil-azidas, trans-cicloocteno, norboreno, tetrazina o una combinación de los mismos. El uno o más ligadores pueden acoplarse al CAR-ID mediante un enlace covalente, enlace no covalente, enlace iónico o una combinación de los mismos. El uno o más ligadores pueden acoplarse al resto de direccionamiento para formar uno o más productos intermedios de conmutador de la fórmula IIIA: L1-Y o la fórmula III: Y-L1, en las que Y es el resto de direccionamiento y L1 es el ligador. El uno o más ligadores pueden acoplarse al resto de direccionamiento mediante una oxima. El uno o más ligadores pueden acoplarse al resto de direccionamiento mediante un ciclooctino, ciclopropeno, aril/alquil-azidas, trans-cicloocteno, norboreno, tetrazina o una combinación de los mismos. El uno o más ligadores pueden acoplarse al resto de direccionamiento mediante un enlace covalente, enlace no covalente, enlace iónico o una combinación de los mismos.

El resto de direccionamiento puede comprender uno o más aminoácidos. El uno o más aminoácidos pueden comprender un aminoácido natural. El ligador puede acoplarse con uno o más aminoácidos naturales en el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales. El ligador puede acoplarse con uno o más aminoácidos no naturales en el resto de direccionamiento. El ligador puede acoplarse con un aminoácido que es el producto de mutagénesis específica del sitio. El ligador puede acoplarse con una cisteína que es el producto de mutagénesis específica del sitio. El ligador (por ejemplo, maleimida sustituida) puede acoplarse con una cisteína que es el producto de mutagénesis específica del sitio, así como un residuo de cisteína nativo. Dos ligadores, cada uno con grupos funcionales reactivos complementarios, pueden acoplarse entre sí.

El uno o más ligadores pueden ser un ligador escindible. El uno o más ligadores pueden ser un ligador no escindible. El uno o más ligadores pueden ser un ligadorflexible. El uno o más ligadores pueden ser un ligador inflexible. El ligador puede ser un ligador bifuncional. Un ligador bifuncional puede comprender un primer grupo funcional en un extremo y un segundo grupo funcional en el segundo extremo. El ligador bifuncional puede ser ligador heterobifuncional. Un ligador heterobifuncional puede comprender un primer grupo funcional en un extremo y un segundo grupo funcional en el segundo extremo, en el que el primer grupo funcional y el segundo grupo funcional son diferentes. El ligador bifuncional puede ser un ligador homobifuncional. Un ligador homobifuncional puede comprender un primer grupo funcional en un extremo y un segundo grupo funcional en el segundo extremo, en el que el primer grupo funcional y el segundo grupo funcional son iguales.

El ligador puede comprender un enlace químico. El ligador puede comprender un grupo funcional. El ligador puede comprender un polímero. El polímero puede ser un polietilenglicol. El ligador puede comprender un aminoácido.

El ligador puede comprender uno o más grupos funcionales. El ligador puede comprender dos o más grupos funcionales. El ligador puede comprender tres o más grupos funcionales. El ligador puede comprender cuatro o más grupos funcionales. El ligador puede comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más grupos funcionales. El ligador puede ser un ligador de etilenglicol bifuncional.

El ligador puede comprender etilenglicol. El ligador puede comprender aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19 o aproximadamente 20 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 4 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 8 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 10 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 12 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 15 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 20 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 25 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 30 o más subunidades de etilenglicol. El ligador puede comprender 35 o más subunidades de etilenglicol.

El ligador puede comprender PEG. El ligador puede comprender aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19 o aproximadamente 20 o más subunidades de polietilenglicol (PEG). El ligador puede comprender 4 o más subunidades de polietilenglicol (PEG). El ligador puede comprender 8 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 10 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 12 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 15 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 20 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 25 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 30 o más subunidades de PEG. El ligador puede comprender 35 o más subunidades de PEG.

El ligador puede comprender un triazol. El triazol puede ser un 1,2,3-triazol. El triazol puede ser un 1,2,4-triazol.

El ligador puede comprender un arilo o un heteroarilo. El ligador puede comprender un arilo. El arilo puede ser fenilo. El fenilo puede estar disustituido. El fenilo disustituido puede ser fenilo 1,4-disustituido. El fenilo disustituido puede ser fenilo 1,3-disustituido. El fenilo puede estar trisustituido. El fenilo puede estar tetrasustituido. Dos de los sustituyentes del fenilo sustituido pueden ser NO2. En algunos casos, el ligador no comprende un sustituyente bencilo.

El ligador puede comprender una o más unidades de PEG. El ligador puede comprender múltiples unidades de PEG. El ligador puede comprender 2 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 3 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 4 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 5 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 6 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 7 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 8 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 9 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 10 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 11 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 12 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 13 o más unidades de PEG. El ligador puede comprender 14 o más unidades de PEG.

El ligador puede comprender una amida en un extremo. El ligador puede comprender una amida en un extremo y una amina en el otro extremo. El ligador puede comprender una amida en un extremo y un triazol en el otro extremo.

El uno o más ligadores pueden comprender un resto 1,4-dicarboxíllico. El uno o más ligadores pueden comprender un resto fenilo sustituido con 1,3-dinitro.

El uno o más ligadores pueden comprender uno o más grupos funcionales reactivos. El grupo funcional reactivo puede reaccionar con un grupo funcional reactivo complementario en una pareja de acoplamiento. La reacción del grupo funcional reactivo en el ligador con un grupo funcional reactivo complementario en una pareja de acoplamiento puede producirse antes de la incorporación del ligador en el conmutador de CAR-EC.

El ligador puede comprender al menos un grupo funcional reactivo seleccionado de alcoxi-amina, hidrazina, aril/alquilazida, alquino, alqueno, tetrazina, diclorotriazina, tresilato, succinimidil-carbonato, benzotriazol-carbonato, nitrofenilcarbonato, triclorofenil-carbonato, carbonilimidazol, succinimidil-succinato, maleimida, vinilsulfona, haloacetamida y disulfuro. El alqueno puede seleccionarse de norborneno, trans-cicloocteno y ciclopropeno. El ligador puede comprender al menos una alcoxi-amina. El ligador puede comprender al menos una azida. El ligador puede comprender al menos un ciclooctino. El ligador puede comprender al menos una tetrazina.

El uno o más ligadores pueden comprender un grupo alcoxi-amina (o aminooxilo), grupo azida y/o grupo ciclooctino en uno o más extremos terminales. El uno o más ligadores pueden comprender una alcoxi-amina en un extremo terminal y un grupo azida en el otro extremo terminal. El uno o más ligadores pueden comprender una alcoxi-amina en un extremo terminal y un grupo ciclooctino en el otro extremo terminal. La alcoxi-amina puede formar una oxima estable con un grupo cetona en un aminoácido. La alcoxi-amina puede formar una oxima estable con un grupo cetona en un aminoácido no natural. El grupo cetona puede estar en una p-acetil-fenilalanina (pAcF).

Uno o más ligadores pueden formarse mediante reacción de grupo funcional reactivo en el CAR-ID con un grupo funcional reactivo complementario de un ligador que está unido al resto de direccionamiento. Uno o más ligadores pueden formarse mediante reacción de un aminoácido u otro grupo funcional reactivo en el resto de direccionamiento con un grupo funcional reactivo complementario de un ligador que está unido al CAR-ID. Uno o más ligadores pueden formarse mediante reacción de un ligador que está unido al CAR-ID con otro ligador que está unido al resto de direccionamiento.

El ligador puede ser el producto de una reacción bioortogonal. Por ejemplo, aminoácidos que contienen cadenas laterales de cetona, azida, alquino, alqueno y tetrazina pueden codificarse genéticamente en respuesta a codones sin sentido y de desplazamiento del marco. Estas cadenas laterales pueden actuar como asas químicas para reacciones de conjugación bioortogonales (Kimet al.,Curr Opin Chem Bio 17:412-419 (2013)). El ligador puede comprender una oxima, un tetrazol, un aducto de Diels-Alder, un hetero-aducto de Diels-Alder, un producto de reacción de sustitución aromática, un producto de reacción de sustitución nucleófila, un éster, una amida, un carbamato, un éter, un tioéter, o un producto de reacción de Michael. El ligador puede ser un producto de cicloadición, un producto de reacción de metátesis, un producto de reacción de acoplamiento cruzado mediada por metal, un producto de polimerización por radicales, un producto de acoplamiento oxidativo, un producto de reacción de transferencia de acilo o un producto de fotorreacción de clic. La cicloadición puede ser una cicloadición de Huisgen. La cicloadición puede ser una cicloadición de Huisgen [3+2] libre de cobre. La cicloadición puede ser una reacción de Diels-Alder. La cicloadición puede ser una hetero-reacción de Diels-Alder. El ligador puede ser el producto de una reacción mediada por enzima. El ligador puede ser un producto de una reacción mediada por transglutaminasa, ejemplos no limitativos del cual se describen en Linet al.,J. Am. Chem. Soc. 128:4542-4543 (2006) y el documento WO 2013/093809. El ligador puede comprender un puente disulfuro que conecta dos residuos de cisteína, tales como tecnología de ThioBridge™ de PolyTherics. El ligador puede comprender un puente de maleimida que conecta dos residuos de aminoácido. El ligador puede comprender un puente de maleimida que conecta dos residuos de cisteína.

Dos o más ligadores pueden estar unidos. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más reacciones libres de cobre. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más cicloadiciones. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más cicloadiciones de Huisgen. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más cicloadiciones de Huisgen [3+2] libres de cobre. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más reacciones que contienen cobre. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más reacciones de Diels-Alder. Los dos o más ligadores pueden unirse mediante una o más hetero-reacciones de Diels-Alder.

Los conmutadores de CAR-EC humanizados pueden optimizarse tal como se da a conocer en los documentos PCT/US2016/027997 y PCT/US2016/027990. Por ejemplo, los conmutadores de CAR-EC humanizados pueden optimizarse ajustando la longitud de ligador. Los conmutadores de CAR-EC humanizados pueden comprender ligadores de diferentes longitudes. Los ligadores pueden ser relativamente cortos. Los ligadores pueden ser relativamente largos. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente 1 Angstroms (A) aproximadamente 120 A de longitud. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente 5 aproximadamente 105 A de longitud. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente aproximadamente 100 A de longitud. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente aproximadamente 90 A de longitud. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente aproximadamente 80 A de longitud. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente aproximadamente 70 A de longitud. El uno o más ligadores pueden tener entre aproximadamente aproximadamente 45 A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a y/o tener más de aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 27, 30 o más Angstroms de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener más de aproximadamente 10 A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener más de aproximadamente 15 angstroms en A. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener más de aproximadamente 20 A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener menos de aproximadamente 110, 100, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 43, 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30 o menos A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener menos de aproximadamente 100 A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener menos de aproximadamente 80 A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener menos de aproximadamente 60 A de longitud. El uno o más ligadores pueden ser iguales a o tener menos de aproximadamente 40 A de longitud.

La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 1 A y aproximadamente 120 A. La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 5 A y aproximadamente 105 A. La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 10 A y aproximadamente 100 A. La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 10 A y aproximadamente 90 A. La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 10 A y aproximadamente 80 A. La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 10 A y aproximadamente 70 A. La longitud total de los ligadores puede ser de entre aproximadamente 15 A y aproximadamente 45 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o mayor de aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 27, 30 o más A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o mayor de aproximadamente 10 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o mayor de aproximadamente 15 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o mayor de aproximadamente 20 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o menor de aproximadamente 110, 100, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 43, 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30 o menos A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o menor de aproximadamente 100 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o menor de aproximadamente 80 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o menor de aproximadamente 60 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o menor de aproximadamente 40 A. La longitud total de los ligadores puede ser igual a o menor de aproximadamente 25 A. La distancia entre el CAR-ID y el resto de direccionamiento puede ser de aproximadamente 30 A.

Conmutadores injertados/fusionados

En el presente documento se dan a conocer conmutadores, en los que el CAR-ID está injertado o fusionado en el resto de direccionamiento. El CAR-ID puede comprender una proteína distinta de anticuerpo o un péptido distinto de anticuerpo y el resto de direccionamiento puede unirse a una molécula de superficie celular en una diana. La molécula de superficie celular puede comprender un antígeno. El resto de direccionamiento puede ser un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede ser una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser una inmunoglobulina (Ig). La inmunoglobulina puede seleccionarse de una IgG, una IgA, una IgD, una IgE, una IgM, un fragmento del mismo o una modificación de las mismas. El anticuerpo de direccionamiento puede unirse a una diana en la superficie celular de una célula diana. En algunas realizaciones, la diana puede seleccionarse de CD19, Her2, CLL1, CD33, CD123, EGFR, EGFRvIII, CD20, CD22, CS1, BCMA, y CEA. En algunas realizaciones, la divulgación presenta un resto de direccionamiento humanizado injertado con el CAR-ID. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento anti-CD19 o un fragmento de unión a CD19 del mismo. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a CD19 del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de una inmunoglobulina, un Fab, un Fab', un F(ab')2y un scFv. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada.

El CAR-ID puede injertarse en el resto de direccionamiento (por ejemplo, entre aminoácidos elegidos del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo). El CAR-ID puede fusionarse a un extremo terminal del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede injertarse en, o fusionarse al, CAR-ID.

El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de la cadena ligera del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de la cadena ligera del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de un dominio VL del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de un dominio VH del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de un dominio CL del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de un dominio de Fc del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de un dominio VL de una IgG. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de un dominio VH de una IgG. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de un dominio CL de una IgG. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de un dominio de Fc de una IgG. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de un dominio VL de un Fab. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de un dominio VH de un Fab. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de un dominio CL de un Fab. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de un dominio CH1 del Fab.

El CAR-ID puede injertarse en un sitio interno del resto de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo de direccionamiento anti-CD19 o fragmento de anticuerpo de unión a CD19 (por ejemplo, entre aminoácidos elegidos del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo)). El CAR-ID puede injertarse en una cadena pesada de un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede injertarse en una cadena ligera de un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede injertarse en un dominio/región constante de un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede injertarse en un dominio/región variable de un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede injertarse en un sitio interno de un Fab. El CAR-ID puede injertarse en un sitio interno de una inmunoglobulina (por ejemplo, IgG). El CAR-ID puede injertarse en un dominio del anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo seleccionado de un dominio CL, un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio VL, un dominio VH y un dominio bisagra. El CAR-ID puede injertarse entre dos dominios del anticuerpo o fragmento del mismo seleccionados de un dominio CL, un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio VL, un dominio VH y un dominio bisagra, en el que los dos dominios son adyacentes. El CAR-ID puede injertarse en un dominio CL del anticuerpo o fragmento del mismo. El CAR-ID puede injertarse en un dominio CH1 del anticuerpo o fragmento del mismo. El CAR-ID puede injertarse en un dominio bisagra del anticuerpo o fragmento del mismo. El CAR-ID puede injertarse en un bucle del anticuerpo o fragmento del mismo. El CAR-ID puede injertarse en un bucle de dominio CL del anticuerpo o fragmento del mismo.

El CAR-ID puede injertarse en el extremo C-terminal del resto de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo de direccionamiento anti-CD19 humanizado o fragmento de anticuerpo de unión a CD19) y, por tanto, la distancia entre el receptor quimérico y la diana puede diferir sustancialmente dependiendo del tamaño del conmutador de EC de receptor quimérico (aproximadamente 40 A para scFv, 70 A para Fab, y 120 A para IgG). Aunque una distancia más grande puede tener un impacto negativo sobre la eficaciain vitro,el tiempo de residencia aumentado del anticuerpo de longitud completa puede ser superiorin vivo.

Conmutadores multivalentes

En el presente documento se muestran a modo de ejemplo conmutadores que comprenden un CAR-ID y un resto de direccionamiento de unión a CD19 humanizado. También se muestran a modo de ejemplo en el presente documento conmutadores que comprenden un derivado de péptido de GCN4 y un resto de direccionamiento (por ejemplo, un resto de direccionamiento de CD19). Sin embargo, un experto en la técnica entenderá a partir de la divulgación que los conmutadores dados a conocer en el presente documento comprenden además restos de direccionamiento adicionales o alternativos y/o CAR-ID adicionales o alternativos. Uno o más CAR-ID pueden injertarse en uno o más sitios de injerto del resto de direccionamiento, y viceversa. Uno o más CAR-ID pueden fusionarse a uno o más extremos terminales del resto de direccionamiento, y viceversa. Uno o más CAR-ID pueden conjugarse a uno o más extremos terminales del resto de direccionamiento, y viceversa. Esto puede resultar ventajoso, ya que puede predecirse que varios sitios de injerto/fusión proporcionan unión óptima del CAR-ID al receptor quimérico. Por ejemplo, un primer CAR-ID puede injertarse en un primer dominio del resto de direccionamiento y un segundo CAR-ID puede injertarse en un segundo dominio del resto de direccionamiento. El primer dominio y el segundo dominio pueden ser iguales. El primer dominio y el segundo dominio pueden ser diferentes. A modo de ejemplo no limitativo, el primer CAR-ID puede injertarse en una cadena ligera de un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo y un segundo CAR-ID puede injertarse en la cadena pesada del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El primer CAR-ID puede fusionarse a un primer extremo terminal del polipéptido de direccionamiento y un segundo CAR-ID puede fusionarse a un segundo extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. A modo de ejemplo no limitativo, el primer CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal de una cadena ligera de un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo y un segundo CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal de una cadena pesada del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El primer CAR-ID puede fusionarse a un extremo terminal del polipéptido de direccionamiento y un segundo CAR-ID puede injertarse dentro de un dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer CAR-ID y el segundo CAR-ID pueden ser iguales o similares, de tal manera que el conmutador puede usarse con una célula efectora que expresa un receptor quimérico. El primer CAR-ID y el segundo CAR-ID pueden ser diferentes, de tal manera que el conmutador puede usarse con una célula efectora que expresa uno o más receptores quiméricos o múltiples células efectoras que expresan diferentes receptores quiméricos.

Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más CAR-ID. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender dos o más CAR-ID. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender tres o más CAR-ID. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o más CAR-ID. El uno o más CAR-ID pueden fusionarse o injertarse al resto de direccionamiento mediante uno o más ligadores. Por tanto, los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más ligadores. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender dos o más ligadores. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender tres o más ligadores. Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más ligadores.

II. Métodos de producción de conmutadores de CAR-EC

En el presente documento se dan a conocer métodos de producción de conmutadores de CAR-EC humanizados.

También se dan a conocer métodos que comprenden expresar uno o más polipéptidos a partir de uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que tienen una o más secuencias que codifican para un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico o una porción del mismo, en los que el conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento anti-diana.

También se dan a conocer métodos que comprenden expresar uno o más polipéptidos a partir de uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que tienen una o más secuencias que codifican para un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico o una porción del mismo, en los que el conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento anti-CD19 humanizado.

También se dan a conocer métodos que comprenden expresar uno o más polipéptidos a partir de uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que tienen una o más secuencias que codifican para un conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico o una porción del mismo, en los que el conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico comprende un derivado de péptido de GCN4 dado a conocer en el presente documento y un resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento está humanizado. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento selecciona como diana CD19. En algunas realizaciones particulares, el resto de direccionamiento es un resto de direccionamiento anti-CD19 humanizado.

El resto de direccionamiento puede comprender un polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a CD19 de un anticuerpo anti-CD19 humanizado). En general, tales métodos comprenden fusionar o injertar un polinucleótido que codifica para el CAR-ID a un polinucleótido que codifica para un resto de direccionamiento (por ejemplo, un resto de direccionamiento de polipéptido anti-CD19 humanizado (polipéptido de direccionamiento)). La fusión o el injerto pueden llevarse a cabo mediante cualquier método de clonación convencional conocido por un experto en la técnica. Fusionar o injertar los polinucleótidos que codifican para el CAR-ID (por ejemplo, un derivado de péptido de GCN4) y el polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo tal como un anticuerpo frente a c D19 o una porción de unión a antígeno del mismo) puede comprender la digestión enzimática de los polinucleótidos, ligación de los polinucleótidos y/o amplificación de los polinucleótidos.

El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-ID puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo N-terminal del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede fusionarse a un extremo C-terminal del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo.

En algunas realizaciones, el diseño del conmutador (por ejemplo, posición de injerto del CAR-ID en un resto de direccionamiento, longitud de un ligador que conecta el CAR-ID al resto de direccionamiento, etc.) es crítico para la citotoxicidad, activación y liberación de citocinas de las células CAR-EC conmutables por péptido. La posición de injerto de conmutador puede diseñarse empíricamente para la diana basándose en la ubicación de epítopo de un anticuerpo anti-diana (resto de direccionamiento) en la diana con el fin de encontrar una distancia y geometría óptimas (sinapsis inmunológica) entre la CAR-EC y la célula diana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, para anticuerpos que se unen a epítopos de CD19 que están lejos de la membrana (distales con respecto a la membrana), diseños de conmutador que proporcionan una sinapsis inmunológica global corta mediante el uso de una fusión N-terminal del CAR-ID en un resto de direccionamiento anti-CD19 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19 o porción de unión a antígeno del mismo, tal como uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 humanizados dados a conocer en el presente documento) pueden mejorar la actividad (figura 15 (centro)). Los diseños que proporcionan demasiada distancia entre la CAR-EC y la célula diana mediante el uso de una fusión C-terminal pueden dar como resultado una actividad inferior a la óptima (figura 15 (izquierda)). El CAR también puede modificarse para acortar la región bisagra. Esto puede acercar la célula CAR-T y la célula diana (figura 15 (derecha)) lo cual resulta adicionalmente ventajoso. Además, a modo de ejemplo no limitativo, para anticuerpos que se unen a epítopos de CD19 que están cerca de la membrana (proximales con respecto a la membrana), los diseños de conmutador que proporcionan una distancia suficiente (mediante el uso de una fusión C-terminal) para que se forme la sinapsis inmunológica resultan óptimos (figura 16 (centro)). Los diseños que no proporcionan suficiente distancia entre la CAR-EC y la célula diana mediante el uso de fusiones N-terminales pueden dar como resultado una actividad inferior a la óptima o ninguna actividad debido a impedimento estérico (figura 16 (derecha)). Los diseños que proporcionan demasiada distancia entre la CAR-EC y la célula diana (mediante una región bisagra más larga) pueden dar como resultado una actividad inferior a la óptima (figura 16 (izquierda)).

Tal como quedará claro para un experto en la técnica, las secuencias dadas a conocer en el presente documento pueden incluir péptidos líder (o “secuencia líder”, de manera intercambiable), que se escindirán durante la expresión de polipéptido si la expresión se realiza en una célula que comprende una ruta secretora. La ubicación del péptido líder es en el extremo N-terminal de la proteína, y las secuencias líder son fácilmente evidentes para un experto en la técnica y pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el servidor SignalP (disponible en la dirección de Internet: cbs.dtu.dk/services/SignalP/). En una realización no limitativa, el péptido líder puede comprender o consistir en la secuencia líder kappa (por ejemplo, SEQ ID NO: 246).

El CAR-ID puede fusionarse al extremo terminal del polipéptido de direccionamiento sin sustituir o eliminar ningún aminoácido del polipéptido de direccionamiento. Fusionar el CAR-ID al extremo terminal del polipéptido de direccionamiento puede comprender eliminar o sustituir aminoácidos en el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. Eliminar o sustituir aminoácidos en el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento puede comprender eliminar o sustituir de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos en el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-ID puede fusionarse al extremo terminal del polipéptido de direccionamiento mediante un ligador. El ligador puede fusionarse al CAR-ID para producir un producto intermedio de CAR-ID-ligador. El ligador puede fusionarse a un CAR-ID extremo N-terminal para producir el producto intermedio de CAR-ID-ligador. El ligador puede fusionarse a un CAR-ID extremo C-terminal para producir el producto intermedio de CAR-ID-ligador. El producto intermedio de CAR-ID-ligador puede fusionarse al polipéptido de direccionamiento. El producto intermedio de CAR-ID-ligador puede fusionarse al extremo N-terminal del polipéptido de direccionamiento. El producto intermedio de CAR-ID-ligador puede fusionarse al extremo C-terminal del polipéptido de direccionamiento. Un primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede fusionarse al extremo N-terminal del polipéptido de direccionamiento y un segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador puede fusionarse al extremo C-terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-ID del primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede ser igual o similar al CAR-ID del segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador. El CAR-ID del primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede ser diferente del CAR-ID del segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador.

Tal como se usan en el presente documento, los injertos de cadena ligera en el extremo N-terminal pueden denominarse LCNT. Los injertos de cadena ligera en el extremo C-terminal pueden denominarse LCCT. Los injertos de cadena ligera en el dominio C1 pueden denominarse LCC1. Los injertos de cadena pesada en el extremo N-terminal pueden denominarse HCNT. Los injertos de cadena pesada en el extremo C-terminal pueden denominarse HCCT. Los injertos de cadena pesada en el dominio C1 pueden denominarse HCC1. Los conmutadores expresados con injertos N-terminales en la cadena ligera y pesada pueden denominarse NTBV. Los conmutadores expresados con injertos C-terminales en la cadena ligera y pesada pueden denominarse CTBV. Los conmutadores expresados con injertos en el dominio C1 de la cadena ligera y pesada pueden denominarse C1BV.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ injertado” puede referirse a insertar un CAR-ID dentro de un polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, entre dos aminoácidos del polipéptido de direccionamiento). El CAR-ID puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento sin sustituir o eliminar ningún aminoácido del polipéptido de direccionamiento. Injertar el CAR-ID dentro del polipéptido de direccionamiento puede comprender eliminar o sustituir aminoácidos dentro del polipéptido de direccionamiento. Eliminar o sustituir aminoácidos dentro del polipéptido de direccionamiento puede comprender eliminar o sustituir de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos dentro del polipéptido de direccionamiento. El CAR-ID puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento mediante un ligador. El CAR-ID puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento mediante dos ligadores. El ligador puede fusionarse al CAR-ID extremo N-terminal para producir un producto intermedio de CAR-ID-ligador. El ligador puede fusionarse al CAR-ID extremo C-terminal para producir un producto intermedio de CAR-ID-ligador. Un primer ligador puede fusionarse al extremo N-terminal de CAR-ID y un segundo ligador puede fusionarse al extremo C-terminal de CAR-ID para producir un producto intermedio de CAR-ID-ligador. El producto intermedio de CAR-ID-ligador puede injertarse con en el polipéptido de direccionamiento. Un primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento y un segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento. El primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede injertarse dentro de un primer dominio del polipéptido de direccionamiento y un segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador puede injertarse dentro de un segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer dominio del polipéptido de direccionamiento puede ser igual que el segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer dominio del polipéptido de direccionamiento puede ser diferente del segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El CAR-ID del primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede ser igual o similar al CAR-ID del segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador. El CAR-ID del primer producto intermedio de CAR-ID-ligador puede ser diferente del CAR-ID del segundo producto intermedio de CAR-ID-ligador. A menos que se especifique lo contrario, los términos “injertar” e “ insertar”, tal como se usan en el presente documento, se usan de manera intercambiable.

El resto de direccionamiento puede unirse a una diana en la superficie celular de una célula diana. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a CD19 del mismo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-CD19 humanizados o fragmentos de los mismos dados a conocer en el presente documento). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera o fragmentos de las mismas. Los métodos pueden comprender expresar una cadena pesada en la que el CAR-ID está fusionado a un extremo terminal de la cadena pesada. Los métodos pueden comprender expresar una cadena pesada en la que el CAR-ID está injertado dentro de la cadena pesada. Los métodos pueden comprender expresar una cadena ligera en la que el CAR-ID está fusionado a un extremo terminal de la cadena ligera. Los métodos pueden comprender expresar una cadena ligera en la que el CAR-ID está injertado dentro de la cadena ligera.

Los métodos pueden comprender además clonar uno o más polinucleótidos que codifican para el polipéptido de direccionamiento y/o el CAR-ID en un vector de expresión. Los métodos pueden comprender además la ligación del uno o más polinucleótidos que codifican para el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID en un vector de expresión. El vector de expresión puede ser un vector de expresión procariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión eucariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión de mamífero. El vector de expresión puede ser un vector de expresión viral. El vector de expresión puede ser un vector pFUSE. Los métodos pueden comprender además validar la clonación del uno o más polinucleótidos que codifican para el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID en el vector de expresión, comprendiendo secuenciar el vector de expresión, realizar electroforesis en gel del vector y/o visualizar el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID en un gel de SDS-PAGE.

Los métodos pueden comprender además amplificar un polinucleótido que codifica para el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID y clonar el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID en el vector de expresión. Amplificar el polinucleótido que codifica para el polipéptido de direccionamiento y/o el CAR-ID puede comprender sintetizar oligonucleótidos al menos parcialmente complementarios al gen. Los oligonucleótidos pueden ser suficientemente complementarios al gen como para hibridarse con el polinucleótido. Los oligonucleótidos pueden comprender secuencias de ligador. En la técnica se conocen muchos ligadores adecuados y son adecuados para su uso en la presente invención. En algunas realizaciones, el ligador es un ligador dado a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, las secuencias de ligador pueden seleccionarse de SEQ ID NO: 93-103, 116 137, y 164-168.

Los métodos pueden comprender transfectar o infectar una célula con el vector de expresión. Los métodos pueden comprender además expresar el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID en la célula. Los métodos pueden comprender además expresar el polipéptido de direccionamiento y/o CAR-ID en un sistema libre de células. Los métodos pueden comprender además producir un virus que comprende el vector de expresión. Los métodos pueden comprender además propagar el virus. Los métodos pueden comprender además infectar una célula con el virus que comprende el vector de expresión. Los métodos pueden comprender además propagar la célula.

El conmutador puede expresarse como dos vectores, uno de la cadena pesada del anticuerpo y uno para la cadena ligera del anticuerpo. Los dos vectores pueden transfectarse conjuntamente en una célula de expresión. La célula de expresión puede seleccionarse de una célula procariota y una célula eucariota. La célula de expresión puede seleccionarse de una célula HEK y una célula CHO. La expresión puede llevarse a cabo en células HEK a lo largo de 7 o más días con recogida rutinaria de medios para recoger y aislar el conmutador de anticuerpo de interés. La expresión puede llevarse a cabo en menos de 7 días. El conmutador también puede expresarse a partir de células c Ho de una manera análoga usando los mismos plásmidos. Los medios pueden recogerse o no a intervalos o pueden recogerse al final de la expresión. La recogida a intervalos puede ser preferible para prevenir la degradación proteolítica del conmutador.

El conmutador puede expresarse enE. coli.El conmutador puede expresarse enE. colia partir de un vector, tal como el vector pBAD, a modo de ejemplo no limitativo. El vector pBAD puede albergar tanto la cadena ligera como la cadena pesada del anticuerpo. Esto puede requerir la transformación deE. colicon tan sólo un plásmido. Esto puede resultar ventajoso dado que la expresión enE. colies generalmente más económica y más rápida que la expresión en células de mamífero (por ejemplo, células HEK). En algunas realizaciones, los conmutadores expresados enE. coli.pueden comprender CAR-ID modificados y/o restos de direccionamiento modificados en los que se eliminan motivos de dilisina para evitar la escisión del péptido por proteasa OmpT. En algunas realizaciones, para expresar el conmutador enE. coli,se presta cuidadosa atención al genotipo de la cepa usada. En algunas realizaciones, los genotipos preferibles incluyen, pero no se limitan a, aquellos con el genompT(una proteína proteasa VII de membrana externa que puede proteolizar la proteína expresada) alterado. Esto incluye BL21(E. coliB F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(AS)), OverExpress(tm)C41(DE3) (Lucigen) (F- ompT gal dcm hsdSB(rB- mB-)(DE3)), y otras. Las cepas no preferibles para la expresión incluyen DH10B (F- endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL AlacX74 080lacZAM15 araD139 A(ara,leu)7697 mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) A-), DH5alpha (F-endA1 glnv44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG O80dlacZAM15 A(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), A-) o otras cepas que no incluyen la desactivación deompT.Puede hacerse que cepas tales como DH10B y DH5alpha sean preferibles mediante alteración del genompT.En el presente documento se dan a conocer métodos de injerto del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el CAR-ID o el péptido de direccionamiento para producir un conmutador de CAR-EC. El método puede comprender injertar el CAR-ID en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El método puede comprender injertar el CAR-ID en un extremo N-terminal, extremo C-terminal o sitio interno del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede injertarse en un dominio CL del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede injertarse en un bucle del dominio CL del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El método puede comprender injertar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el CAR-ID. El método puede comprender injertar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en un extremo N-terminal, extremo C-terminal o sitio interno del CAR-ID. El método puede comprender injertar el CAR-ID en el péptido de direccionamiento. El método puede comprender injertar el CAR-ID en un extremo N-terminal, extremo C-terminal o sitio interno del péptido de direccionamiento. El método puede comprender injertar el péptido de direccionamiento en el CAR-ID. El método puede comprender injertar el péptido de direccionamiento en un extremo N-terminal, extremo C-terminal o sitio interno del CAR-ID.

El CAR-ID, péptido de direccionamiento, anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueden comprender uno o más ligadores, en los que el ligador está ubicado en el extremo N-terminal y/o extremo C-terminal del CAR-ID, péptido de direccionamiento, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El método puede comprender injertar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el CAR-ID o el péptido de direccionamiento a través del ligador. El ligador puede comprender (GSSSS)n. El ligador puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103, 116-137, y 164-168. El ligador puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50 % a una secuencia seleccionada de s Eq ID NO: 93-103, 116-137, y 164-168. El ligador puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103, 116-137, y 164-168.

Injertar puede comprender producir un ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC. Producir el ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC puede comprender una o más reacciones en cadena de la polimerasa. Producir el ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC puede comprender una o más digestiones enzimáticas de ácido nucleico. La digestión enzimática puede ser específica del sitio. Producir el ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC puede comprender una o más ligaciones. Los métodos de producción del conmutador de CAR-EC pueden comprender incorporar el ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC en un conmutador de CAR-EC vector. El vector puede ser un vector de expresión. El vector de expresión puede comprender un promotor constitutivo, un promotor inducible y/o un promotor condicional. El ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC o el vector de conmutador de CAR-EC pueden expresarse en una célula y aislarse y purificarse el conmutador de CAR-EC resultante. La célula puede ser una célula procariota. La célula puede ser unaE. coli.La célula puede ser una célula eucariota. La célula puede ser una célula de mamífero. El ácido nucleico que codifica para conmutador de CAR-EC o el vector de conmutador de CAR-EC pueden expresarse en un sistema libre de células. Alternativa o adicionalmente, el conmutador de CAR-EC puede sintetizarse a partir de aminoácidos libres.

En algunas realizaciones, el método comprende unir un CAR-ID a un resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, el método puede comprender unir un producto intermedio de conmutador que comprende un CAR-ID y un ligador a un resto de direccionamiento. El método puede comprender unir un producto intermedio de conmutador que comprende un resto de direccionamiento y un ligador a un CAR-ID. El método puede comprender unir un primer producto intermedio de conmutador que comprende un CAR-ID y un primer ligador a un segundo conmutador que comprende un resto de direccionamiento y un segundo ligador. La unión del CAR-ID al resto de direccionamiento puede producirse de una manera específica del sitio. La unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el CAR-ID a un sitio predeterminado en el resto de direccionamiento. La unión de una manera específica del sitio puede comprender unir el resto de direccionamiento a un sitio predeterminado en el CAR-ID. La unión del CAR-ID al resto de direccionamiento puede producirse de una manera independiente del sitio. La unión de una manera independiente del sitio puede comprender unir el CAR-ID a un sitio aleatorio en el resto de direccionamiento. La unión de una manera independiente del sitio puede comprender unir el resto de direccionamiento a un sitio aleatorio en el CAR-ID. El método puede comprender además unir uno o más CAR-ID adicionales al resto de direccionamiento. El método puede comprender además unir uno o más restos de direccionamiento adicionales al CAR-ID. El método puede comprender además usar uno o más ligadores adicionales para conectar el resto de direccionamiento al CAR-ID. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender llevar a cabo una o más reacciones químicas.

El método de producción de un conmutador puede comprender unir un resto de direccionamiento basado en o derivado de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo a un CAR-ID o un producto intermedio de conmutador que comprende un CAR-ID para producir un conmutador de CAR-EC que comprende (a) el resto de direccionamiento; (b) uno o más ligadores; y (c) el CAR-ID, el uno o más ligadores pueden unir el resto de direccionamiento al CAR-ID. La unión del resto de direccionamiento al CAR-ID puede producirse de una manera específica del sitio. El CAR-ID puede unirse a un sitio predeterminado en el resto de direccionamiento mediante el uno o más ligadores. El resto de direccionamiento puede unirse a un sitio predeterminado en el CAR-ID mediante el uno o más ligadores.

Los conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales. El uno o más CAR-ID pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales. El uno o más restos de direccionamiento pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales. El uno o más ligadores pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales. La unión del CAR-ID al resto de direccionamiento puede producirse mediante el uno o más aminoácidos no naturales. El uno o más ligadores pueden unir el uno o más CAR-ID al uno o más restos de direccionamiento de manera específica del sitio a través del uno o más aminoácidos no naturales. Alternativa o adicionalmente, el uno o más ligadores pueden unir el uno o más restos de direccionamiento al uno o más restos de direccionamiento de manera específica del sitio, en el que no se requiere un aminoácido no natural para unir el uno o más restos de direccionamiento al uno o más restos de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede unirse a 1,2, 3, 4, 5 o más aminoácidos no naturales en el resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos no naturales en el resto de direccionamiento de manera específica del sitio. Alternativamente, el resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos no naturales en el resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede unirse a 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos no naturales en el resto de direccionamiento de manera específica del sitio.

El CAR-ID puede comprender uno o más aminoácidos no naturales. Los CAR-ID dados a conocer en el presente documento pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales. El resto de direccionamiento puede comprender uno o más aminoácidos no naturales. Los anticuerpos de direccionamiento o fragmentos de anticuerpo dados a conocer en el presente documento pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales. El aminoácido no natural puede reaccionar con el ligador para crear un enlace químico.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden insertarse entre dos aminoácidos que se producen de manera natural en el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a uno o más aminoácidos que se producen de manera natural en el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el extremo N-terminal del resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el extremo C-terminal del resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en un sitio interno del resto de direccionamiento. El aminoácido no natural puede incorporarse de manera distal a la región del resto de direccionamiento que interacciona con una molécula en o de una diana. El aminoácido no natural puede incorporarse de manera proximal a la región del resto de direccionamiento que interacciona con una molécula en o de una diana. El aminoácido no natural puede incorporarse en un sitio intermedio con respecto a la región del resto de direccionamiento que interacciona con una molécula en o de una diana. El aminoácido no natural puede incorporarse en la región del resto de direccionamiento que interacciona con una molécula en o de una diana.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a uno o más aminoácidos en el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a cualquier aminoácido natural en el resto de direccionamiento.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en una cadena pesada de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en una cadena pesada y una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a un aminoácido en la cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a un aminoácido en una cadena pesada de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a un aminoácido en una cadena pesada y una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una glicina de una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una arginina de una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una serina de una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una treonina de una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una alanina de una cadena ligera de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una alanina de una cadena pesada de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una serina de una cadena pesada de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una lisina de una cadena pesada de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una prolina de una cadena pesada de la inmunoglobulina en la que se basa o de la que se deriva el resto de direccionamiento.

En algunas realizaciones, el uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a un aminoácido del resto de direccionamiento, en el que el resto de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a CD19 del mismo. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una glicina de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una treonina de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una serina de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una serina de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una alanina de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a una lisina de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo, en el que el uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a uno o más aminoácidos de una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o porción de unión a CD19 del mismo puede comprender una de SEQ ID NO: 17-25; 27-35. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a uno o más aminoácidos de una de SEQ ID NO: 17-25; 27-35. En algunas realizaciones, el uno o más aminoácidos de una de SEQ ID NO: 17-25; 27-35 pueden seleccionarse de G68 y K107. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a uno o más aminoácidos de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede comprender una de SEQ ID NO: 2-15. El uno o más aminoácidos no naturales pueden sustituir a uno o más aminoácidos de una de SEQ ID NO: 2-15. El uno o más aminoácidos de una de SEQ ID NO: 2-15 pueden ser S74.

En el presente documento se dan a conocer métodos de producción de un conmutador de fórmula I: X-L1-Y o fórmula IA: Y-L1-X, en las que X es un CAR-ID, Y es un resto de direccionamiento y L1 es un ligador. X puede ser una molécula pequeña de unión a CAR e Y puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. X puede ser una molécula pequeña de unión a CAR que no comprende un péptido e Y puede ser un péptido que no comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. X puede ser una molécula pequeña de unión a CAR que no comprende un péptido e Y puede ser una molécula pequeña de direccionamiento que no comprende un péptido. El método puede comprender llevar a cabo una o más reacciones para unir el CAR-ID a un sitio predeterminado en el resto de direccionamiento. Llevar a cabo la una o más reacciones para unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender mezclar una pluralidad de los CAR-ID con una pluralidad de restos de direccionamiento. El método puede comprender unir un extremo del ligador al resto de direccionamiento, seguido por la unión del otro extremo del ligador al CAR-ID. El método puede comprender unir un extremo del ligador al CAR-ID, seguido por la unión del otro extremo del ligador al resto de direccionamiento. La unión del ligador al resto de direccionamiento puede producirse de una manera específica del sitio. El ligador puede unirse a un aminoácido predeterminado del resto de direccionamiento. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural. El ligador puede comprender un grupo funcional que interacciona con el aminoácido. La unión del ligador al resto de direccionamiento puede producirse de una manera independiente del sitio. El ligador puede unirse de manera aleatoria al resto de direccionamiento. El ligador puede comprender un grupo funcional que reacciona con un grupo funcional en el resto de direccionamiento. La unión del ligador al CAR-ID puede producirse de una manera específica del sitio. La unión del ligador al CAR-ID puede producirse de una manera independiente del sitio. El ligador puede comprender un grupo funcional que reacciona con un grupo funcional en el CAR-ID. Llevar a cabo la una o más reacciones para unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender llevar a cabo una ligación de oxima.

Alternativa o adicionalmente, el método puede comprender llevar a cabo una reacción para unir el ligador o un precursor del ligador al CAR-ID para producir un producto intermedio de conmutador que comprende el ligador conjugado al CAR-ID. El producto intermedio de conmutador puede tener la fórmula II: X-L1 o la fórmula IIA: L1-X, en las que X es el CAR-ID y L1 es el ligador o precursor del ligador. El ligador puede conjugarse al CAR-ID de una manera específica del sitio. El ligador puede conjugarse al CAR-ID de una manera independiente del sitio. Llevar a cabo la una o más reacciones para unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender unir la porción de ligador del producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento. Llevar a cabo la una o más reacciones para unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender poner en contacto una pluralidad de productos intermedios de conmutador que comprenden el ligador o precursor de ligador conjugado al CAR-ID con una pluralidad de restos de direccionamiento. La unión de la porción de ligador del producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede producirse de una manera específica del sitio. El resto de direccionamiento puede comprender uno o más aminoácidos no naturales. La porción de ligador del conmutador puede unirse al resto de direccionamiento mediante el uno o más aminoácidos no naturales. La unión de la porción de ligador del producto intermedio de conmutador puede producirse de una manera independiente del sitio.

Alternativa o adicionalmente, el método puede comprender llevar a cabo una reacción para unir el ligador o un precursor del ligador al resto de direccionamiento para producir un producto intermedio de conmutador que comprende el ligador o precursor del ligador conjugado al resto de direccionamiento. El producto intermedio de conmutador puede ser de fórmula III: Y-L1 o fórmula IIIA: L1-Y, en las que Y es el resto de direccionamiento y L1 es el ligador o precursor de ligador. El ligador puede conjugarse al resto de direccionamiento de una manera específica del sitio. El ligador puede conjugarse al resto de direccionamiento de una manera independiente del sitio. Llevar a cabo la una o más reacciones para unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender unir la porción de ligador del producto intermedio de conmutador al CAR-ID. Llevar a cabo la una o más reacciones para unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender poner en contacto una pluralidad de productos intermedios de conmutador que comprenden el ligador o precursor de ligador conjugado al resto de direccionamiento con una pluralidad de los CAR-ID. La unión de la porción de ligador del producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede producirse de una manera específica del sitio. La unión de la porción de ligador del producto intermedio de conmutador puede producirse de una manera independiente del sitio.

El método puede comprender acoplar uno o más ligadores al resto de direccionamiento para producir un producto intermedio de conmutador de fórmula III: Y-L1 o fórmula IIIA: L1-Y, en las que Y es el resto de direccionamiento y L1 es el ligador; y conjugar el producto intermedio de conmutador al CAR-ID, produciendo de ese modo el conmutador de CAR-EC. El producto intermedio de conmutador puede conjugarse al CAR-ID de una manera específica del sitio. El producto intermedio de conmutador puede conjugarse al CAR-ID de una manera independiente del sitio. El método puede comprender además incorporar uno o más aminoácidos no naturales en el CAR-ID y/o resto de direccionamiento. El producto intermedio de conmutador puede conjugarse al CAR-ID de una manera específica del sitio mediante el uso del aminoácido no natural.

El método puede comprender acoplar uno o más ligadores al CAR-ID para producir un producto intermedio de conmutador de fórmula II: X-L1 o fórmula IIA: L1-X, en las que X es el CAR-ID y L1 es el ligador; y conjugar el producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento, produciendo de ese modo el conmutador de CAR-EC. El producto intermedio de conmutador puede conjugarse al resto de direccionamiento de una manera específica del sitio. El producto intermedio de conmutador puede conjugarse al resto de direccionamiento de una manera independiente del sitio. El método puede comprender además incorporar uno o más aminoácidos no naturales en el CAR-ID y/o resto de direccionamiento. El producto intermedio de conmutador puede conjugarse al resto de direccionamiento de una manera específica del sitio mediante el uso del aminoácido no natural.

Conjugar el producto intermedio de conmutador de fórmula II: X-L1 o fórmula IIA: L1-X, en las que X es el CAR-ID y L1, al resto de direccionamiento puede comprender formar una oxima. Conjugar el producto intermedio de conmutador de fórmula III: Y-L1 o fórmula IIIA: L1-Y, en las que Y es el resto de direccionamiento y L1, al CAR-ID puede comprender formar una oxima. Formar una oxima puede comprender llevar a cabo una o más reacciones en condiciones ácidas. Formar una oxima puede comprender llevar a cabo una o más reacciones en condiciones ligeramente ácidas. Formar una oxima puede comprender llevar a cabo una o más reacciones en condiciones ligeramente neutras.

Un método de producción de un conmutador puede comprender (a) producir un resto de direccionamiento que comprende un aminoácido no natural; (b) unir un primer ligador al resto de direccionamiento para producir un primer producto intermedio de conmutador que comprende el resto de direccionamiento y el primer ligador; (c) unir un segundo producto intermedio de conmutador que comprende un CAR-ID y un segundo ligador al primer producto intermedio de conmutador, produciendo de ese modo el conmutador. El aminoácido no natural puede ser pacetilfenalanina (pAcF). El aminoácido no natural puede ser p-azidofenilalanina (pAzF). El resto de direccionamiento puede comprender un polipéptido basado en o derivado de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD19. El resto de direccionamiento puede comprender un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 17-25 y 27-35. El primer ligador puede ser un ligador bifuncional. El ligador puede ser un ligador heterobifuncional. El ligador puede comprender una o más subunidades de polietilenglicol (PEG). El primer ligador puede comprender ciclooctino. El primer ligador puede ser un ligador de PEG-ciclooctino. El ligador puede comprender una azida. El primer ligador puede comprender triazol. El triazol puede ser 1,2,3-triazol. El triazol puede ser 1,2,4-triazol. El primer ligador puede comprender un ligador de azida-PEG-aminoxilo. El primer ligador puede unirse a una cetona del aminoácido no natural. El primer ligador puede unirse al resto de direccionamiento mediante ligación de oxima. El CAR-ID puede comprender una molécula pequeña. El CAR-ID puede comprender FITC. El segundo ligador puede ser un ligador bifuncional. El ligador puede ser un ligador heterobifuncional. El ligador puede comprender una o más subunidades de polietilenglicol (PEG). El segundo ligador puede comprender ciclooctino. El segundo ligador puede ser un ligador de PEG-ciclooctino. El ligador puede comprender una azida. El segundo ligador puede comprender triazol. El triazol puede ser 1,2,3-triazol. El triazol puede ser 1,2,4-triazol. El segundo ligador puede ser un ligador de PEG-ciclooctino. El segundo producto intermedio de conmutador puede unirse al primer producto intermedio de conmutador mediante una reacción de química clic. El segundo producto intermedio de conmutador puede unirse al primer producto intermedio de conmutador mediante una reacción de cicloadición. La reacción de cicloadición puede ser una reacción de cicloadición [3+2].

Conjugar el ligador al CAR-ID para producir el conmutador puede comprender formar uno o más enlaces entre el ligador y el CAR-ID. Conjugar el ligador al resto de direccionamiento para producir el conmutador puede comprender formar uno o más enlaces entre el ligador y el resto de direccionamiento. El uno o más enlaces pueden comprender un enlace iónico, un enlace covalente, un enlace no covalente o una combinación de los mismos. Pueden realizarse métodos adicionales de conjugación del ligador, el CAR-ID y el resto de direccionamiento tal como se describe en Robertset al.,Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476 (2002).

El CAR-ID puede comprender cualquiera de los CAR-ID dados a conocer en el presente documento. Por ejemplo, el CAR-ID puede comprender una molécula pequeña. El CAR-ID puede comprender FITC. El CAR-ID puede seleccionarse del grupo que consiste en DOTA, dinitrofenol, quinona, biotina, anilina, atrazina, un derivado de anilina, ácido o-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, hidralazina, halotano, digoxigenina, arsonato de benceno, lactosa, trinitrofenol, biotina y derivados de los mismos.

El CAR-ID puede comprender un hapteno. El CAR-ID puede inducir una respuesta inmunitaria cuando se une a una molécula portadora más grande, tal como una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-ID puede ser FITC o un derivado del mismo. El CAR-ID puede comprender biotina. El CAR-ID puede comprender dinitrofenol.

El CAR-ID puede unirse y/o conjugarse al dominio de interacción con diana. El dominio de interacción con diana puede ser un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo y el CAR-ID puede unirse y/o conjugarse a un aminoácido del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El aminoácido del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede ser un aminoácido no natural. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera y/o cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 10 31 y los aminoácidos no naturales pueden estar ubicados en sitios respectivos mostrados en la tabla 1. A menos que se indique lo contrario, los aminoácidos se cuentan desde el aminoácido del extremo N-terminal de cada región variable hasta el extremo C-terminal de la región constante.

El resto de direccionamiento puede comprender cualquiera de los restos de direccionamiento dados a conocer en el presente documento. El ligador puede comprender cualquiera de los ligadores dados a conocer en el presente documento. Por ejemplo, el ligador puede comprender un grupo aminooxilo, grupo azida, grupo ciclooctino, o una combinación de los mismos en uno o más extremos terminales. El ligador puede ser un ligador bifuncional. El ligador puede ser un ligador heterobifuncional. El ligador puede comprender una o más subunidades de PEG.

En el presente documento se dan a conocer métodos de producción de un conmutador de fórmula IV: X- L1-L2-Y, en la que en X es un CAR-ID, L1 es un primer ligador, L2 es un segundo ligador e Y es un resto de direccionamiento. El método puede comprender (a) acoplar L1 a X para producir un primer producto intermedio de conmutador de fórmula II: X- L1; (b) acoplar L2 a Y para producir un segundo producto intermedio de conmutador de fórmula V: L2-Y; y (c) unir el primer producto intermedio de conmutador de fórmula II al segundo producto intermedio de conmutador de fórmula: V, produciendo de ese modo el conmutador de fórmula IV.

En el presente documento se dan a conocer métodos de producción de un conmutador de fórmula IVA: Y-L2-L1-X, en la que Y es un resto de direccionamiento, L1 es un primer ligador, L2 es un segundo ligador y X es un CAR-ID. El método puede comprender (a) acoplar L1 a X para producir un primer producto intermedio de conmutador de fórmula IIA: L1-X; (b) acoplar L2 a Y para producir un segundo producto intermedio de conmutador de fórmula VA: Y-L2; y (c) unir el primer producto intermedio de fórmula IIA al segundo producto intermedio de fórmula VA, produciendo de ese modo el conmutador de CAR-EC de fórmula IVA.

Los métodos pueden comprender además incorporar uno o más aminoácidos no naturales en X y/o Y. L1 puede acoplarse a X de una manera específica del sitio. L1 puede acoplarse a X de una manera específica del sitio a través del uno o más aminoácidos no naturales. L2 puede acoplarse a Y de una manera específica del sitio. L2 puede acoplarse a Y de una manera específica del sitio a través del uno o más aminoácidos no naturales. El método puede comprender además modificar un ácido nucleico que codifica para X para producir uno o más codones ámbar en X. El método puede comprender además modificar un ácido nucleico que codifica para Y para producir uno o más codones ámbar en Y.

Conjugar el ligador al CAR-ID para producir el primer producto intermedio de conmutador puede comprender formar uno o más enlaces entre el ligador y el CAR-ID. Conjugar el ligador al resto de direccionamiento para producir el segundo producto intermedio de conmutador puede comprender formar uno o más enlaces entre el ligador y el resto de direccionamiento. El uno o más enlaces pueden comprender un enlace iónico, un enlace covalente, un enlace no covalente o una combinación de los mismos. Pueden realizarse métodos adicionales de conjugación del ligador, el CAR-ID y el resto de direccionamiento tal como se describe en Robertset al.,Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002), que se incluye como referencia en su totalidad.

También se da a conocer que unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender una cicloadición de Huisgen, una reacción de Diels-Halder, una hetero-reacción de Diels-Alder o una reacción mediada por enzima. La unión del primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede producir una oxima, un tetrazol, un aducto de Diels-Alder, un hetero-aducto de Diels-Alder, un producto de reacción de sustitución aromática, un producto de reacción de sustitución nucleófila, un éster, una amida, un carbamato, un éter, un tioéter, un producto de reacción de Michael, un producto de cicloadición, un producto de reacción de metátesis, un producto de reacción de acoplamiento cruzado mediada por metal, un producto de polimerización por radicales, un producto de acoplamiento oxidativo, un producto de reacción de transferencia de acilo, o un producto de fotorreacción de clic. La unión del primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede producir un puente disulfuro o un puente de maleimida. L1 y/o L2 pueden comprender un ligador seleccionado de un ligador bifuncional, un ligador escindible, un ligador no escindible, un ligador de etilenglicol, un ligador de etilenglicol bifuncional, un ligador flexible o un ligador inflexible. L1 y/o L2 pueden comprender un ligador seleccionado del grupo que comprende ciclooctino, ciclopropeno, aril/alquilazidas, trans-cicloocteno, norboreno y tetrazinas. Un extremo terminal de L1 y/o un extremo terminal de L2 pueden comprender una alcoxi-amina. Un extremo terminal de L1 y/o un extremo terminal de L2 pueden comprender un grupo azida o ciclooctino. X puede acoplarse a L1 mediante un grupo químico seleccionado de un ciclooctino, ciclopropeno, aril/alquil-azida, trans-cicloocteno, norboreno y tetrazina. La unión del primer producto intermedio de conmutador (X-L1 o L1-X) y segundo producto intermedio de conmutador (Y-L2 o L2-Y) puede comprender llevar a cabo una o más reacciones libres de cobre. La unión del primer producto intermedio de conmutador (X-L1 o L1-X) y segundo producto intermedio de conmutador (Y-L2 o L2-Y) puede comprender llevar a cabo una o más reacciones que contienen cobre. La unión del primer producto intermedio de conmutador (X-L1 o L1-X) y segundo producto intermedio de conmutador (Y-L2 o L2-Y) puede comprender una o más cicloadiciones. La unión del primer producto intermedio de conmutador (X-L1 o L1-X) y segundo producto intermedio de conmutador (Y-L2 o L2-Y) puede comprender una o más cicloadiciones de Huisgen. La unión del primer producto intermedio de conmutador (X-L1 o L1-X) y segundo producto intermedio de conmutador (Y-L2 o L2-Y) puede comprender una o más reaccione de Diels-Alder. La unión del primer producto intermedio de conmutador (X-L1 o L1-X) y segundo producto intermedio de conmutador (Y-L2 o L2-Y) puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder.

Los métodos dados a conocer en el presente documento pueden comprender acoplar uno o más ligadores a uno o más dominios de interacción con diana, CAR-ID o combinaciones de los mismos para producir uno o más productos intermedios de conmutador. El producto intermedio de conmutador puede comprender un resto de direccionamiento unido a un ligador (por ejemplo, producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento). El producto intermedio de conmutador puede comprender un CAR-ID unido a un ligador (por ejemplo, productos intermedios de conmutador de CAR-ID). Los métodos pueden comprender acoplar un primer ligador al resto de direccionamiento para producir un producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento. Los métodos pueden comprender acoplar un ligador a un CAR-ID para producir un producto intermedio de conmutador de CAR-ID.

El acoplamiento del uno o más ligadores al resto de direccionamiento y al CAR-ID puede producirse simultáneamente. El acoplamiento del uno o más ligadores al resto de direccionamiento y al CAR-ID puede producirse de manera secuencial. El acoplamiento del uno o más ligadores al resto de direccionamiento y al CAR-ID puede producirse en un único volumen de reacción. El acoplamiento del uno o más ligadores al resto de direccionamiento y al CAR-ID puede producirse en dos o más volúmenes de reacción.

El acoplamiento de uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender formar una o más oximas entre el ligador y el resto de direccionamiento y/o el CAR-ID. El acoplamiento de uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces estables entre el ligador y el resto de direccionamiento y/o el CAR-ID. El acoplamiento de uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces covalentes entre el ligador y el resto de direccionamiento y/o el CAR-ID. El acoplamiento de uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces no covalentes entre el ligador y resto de direccionamiento y/o el CAR-ID. El acoplamiento de uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces iónicos entre el ligador y el resto de direccionamiento y/o el CAR-ID.

El acoplamiento de uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender acoplar de manera específica del sitio uno o más ligadores al resto de direccionamiento y/o el CAR-ID. El acoplamiento específico del sitio puede comprender unir el uno o más ligadores al aminoácido no natural del resto de direccionamiento y/o el CAR-ID. La unión del uno o más ligadores al aminoácido no natural del resto de direccionamiento y/o el CAR-ID puede comprender la formación de una oxima. La unión del uno o más ligadores al aminoácido no natural del resto de direccionamiento y/o al CAR-ID puede comprender, a modo de ejemplo no limitativo, hacer reaccionar una hidroxilamina del uno o más ligadores con un aldehído o cetona de un aminoácido. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural.

Llevar a cabo la una o más reacciones para unir de manera específica del sitio el CAR-ID al resto de direccionamiento, para unir de manera específica del sitio el ligador o un precursor del ligador al CAR-ID, para unir de manera específica del sitio el ligador o un precursor del ligador al resto de direccionamiento, para unir de manera específica del sitio el producto intermedio de conmutador de CAR-ID al resto de direccionamiento, para unir de manera específica del sitio el producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento al CAR-ID o para unir de manera específica del sitio el producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento al producto intermedio de conmutador de CAR-ID, puede comprender llevar a cabo una o más reacciones seleccionadas de una reacción libre de cobre, una cicloadición, una cicloadición de Huisgen, una cicloadición de Huisgen [3+2] libre de cobre, una reacción que contiene cobre, una reacción de Diels-Alder, una hetero-reacción de Diels-Alder, reacción de metátesis, una reacción de acoplamiento cruzado mediada por metal, una polimerización por radicales, un acoplamiento oxidativo, una reacción de transferencia de acilo, una fotorreacción de clic, una reacción mediada por enzima, una reacción mediada por transglutaminasa.

Los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden comprender un CAR-ID que comprende FITC o un derivado del mismo. El método de producción de tales conmutadores puede comprender acoplar un ligador o precursor del mismo, un producto intermedio de conmutador que comprende un resto de direccionamiento (por ejemplo, producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento), o un resto de direccionamiento al CAR-iD. El acoplamiento del ligador o precursor del mismo, el producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento al CAR-ID puede comprender la conjugación de un isotiocianato de FITC al ligador o precursor del mismo, producto intermedio de conmutador de resto de direccionamiento o resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un polipéptido. El polipéptido puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El acoplamiento de un resto de direccionamiento al CAR-ID puede comprender conjugar el isotiocianato de FITC a un aminoácido del resto de direccionamiento. El aminoácido puede ser una lisina. El método puede comprender acoplar uno o más CAR-ID al resto de direccionamiento. El método puede comprender conjugar FITC de dos o más CAR-ID a dos o más aminoácidos del resto de direccionamiento. Los dos o más aminoácidos pueden ser lisina.

Producir un conmutador dado a conocer en el presente documento puede comprender un acoplamiento de éster. Acoplamiento de éster puede comprender formar un enlace amida entre el CAR-ID y el resto de direccionamiento. Acoplamiento de éster puede comprender formar un enlace amida entre un producto intermedio de conmutador y el resto de direccionamiento. El producto intermedio de conmutador puede comprender un CAR-ID unido a un ligador. El enlace amida puede formarse entre el ligador del producto intermedio de conmutador y el resto de direccionamiento. El ligador puede ser un ligador de NHS-éster. El enlace amida puede formarse entre el ligador del producto intermedio de conmutador y un aminoácido del resto de direccionamiento. El CAR-ID puede comprender una molécula pequeña. La molécula pequeña puede ser FITC. El resto de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un polipéptido. El polipéptido puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El resto de direccionamiento puede comprender una molécula pequeña.

El método de producción de un conmutador dado a conocer en el presente documento puede comprender: (a) obtener un producto intermedio de conmutador que comprende (i) un CAR-ID; y (ii) un ligador; y (b) poner en contacto el producto intermedio de conmutador con un resto de direccionamiento, produciendo de ese modo el conmutador. Poner en contacto el producto intermedio de conmutador con el resto de direccionamiento puede comprender realizar una reacción de acoplamiento de éster. El ligador puede comprender un ligador de NHS-éster. El resto de direccionamiento puede comprender uno o más aminoácidos. Realizar la reacción de acoplamiento de éster puede comprender formar un enlace amida entre el ligador de NHS-éster del producto intermedio de conmutador y el uno o más aminoácidos del resto de direccionamiento. El método puede comprender además producir una pluralidad de conmutadores. Dos o más conmutadores de la pluralidad de conmutadores pueden comprender dos o más productos intermedios de conmutador unidos a dos o más aminoácidos diferentes del resto de direccionamiento. Por ejemplo, un primer producto intermedio de conmutador puede unirse a un residuo de lisina de un primer resto de direccionamiento y un segundo producto intermedio de conmutador puede unirse a un residuo de glicina de un segundo resto de direccionamiento. Dos o más conmutadores de la pluralidad de conmutadores pueden comprender dos o más productos intermedios de conmutador unidos al mismo aminoácido del resto de direccionamiento. Por ejemplo, los dos o más productos intermedios de conmutador pueden unirse a un residuo de lisina de un primer y segundo resto de direccionamiento. Dos o más conmutadores de la pluralidad de conmutadores pueden comprender dos o más productos intermedios de conmutador unidos al mismo aminoácido ubicado en dos o más posiciones diferentes en el resto de direccionamiento. Por ejemplo, un primer producto intermedio de conmutador puede unirse a la lisina 10 de un primer resto de direccionamiento y el segundo producto intermedio de conmutador puede unirse a la lisina 45 de un segundo resto de direccionamiento. Dos o más conmutadores de la pluralidad de conmutadores pueden comprender dos o más productos intermedios de conmutador unidos al mismo aminoácido ubicado en la misma posición en el resto de direccionamiento. Por ejemplo, un primer producto intermedio de conmutador puede unirse a la lisina 10 de un primer resto de direccionamiento y el segundo producto intermedio de conmutador puede unirse a la lisina 10 de un segundo resto de direccionamiento.

Los métodos de producción de un conmutador dado a conocer en el presente documento pueden comprender usar uno o más aminoácidos no naturales. El método puede comprender incorporar uno o más aminoácidos no naturales en el CAR-ID. El CAR-ID puede basarse en o derivarse de un polipéptido que puede interaccionar con un CAR en una célula efectora. El polipéptido puede ser un polipéptido no basado en anticuerpo. Generalmente, un polipéptido no basado en anticuerpo es un polipéptido que no comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El aminoácido no natural puede incorporarse en el polipéptido no basado en anticuerpo. El aminoácido no natural puede sustituir a un aminoácido del polipéptido no basado en anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el método puede comprender incorporar uno o más aminoácidos no naturales en el resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un polipéptido. El polipéptido puede ser un anticuerpo. El polipéptido puede ser un polipéptido no basado en anticuerpo. El aminoácido no natural puede incorporarse en el polipéptido. El aminoácido no natural puede sustituir a un aminoácido del polipéptido.

El método de producción del conmutador puede comprender además modificar uno o más residuos de aminoácido en el polipéptido en el que se basa o del que se deriva el CAR-ID. El método de producción del conmutador puede comprender modificar uno o más residuos de aminoácido en el polipéptido en el que se basa o del que se deriva el resto de direccionamiento. Modificar el uno o más residuos de aminoácido puede comprender mutar uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido. Mutar el uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos codificante puede comprender alterar un codón que codifica para un aminoácido para dar un codón sin sentido.

La incorporación de uno o más aminoácidos no naturales en el polipéptido en el que se basa o del que se deriva el CAR-ID puede comprender modificar uno o más residuos de aminoácido en el polipéptido para producir uno o más codones ámbar en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Incorporar uno o más aminoácidos no naturales en el polipéptido en el que se basa o del que se deriva el resto de direccionamiento puede comprender modificar uno o más residuos de aminoácido en el polipéptido para producir uno o más codones ámbar en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el polipéptido en respuesta a un codón ámbar. El uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse de manera específica del sitio en el polipéptido.

La incorporación de uno o más aminoácidos no naturales en el polipéptido en el que se basan o del que se derivan el CAR-ID y el resto de direccionamiento puede comprender el uso de uno o más aminoácidos no naturales genéticamente codificados con reactividad química ortogonal con respecto a los veinte aminoácidos canónicos para modificar de manera específica del sitio el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o péptido de direccionamiento. La incorporación de uno o más aminoácidos no naturales puede comprender el uso de una o más ARNt sintetasas. La ARNt sintetasa puede ser una aminoacilo ARNt sintetasa. La ARNt sintetasa puede ser una ARNt sintetasa mutante. La incorporación de uno o más aminoácidos no naturales puede comprender un par de ARNt/ARNt sintetasas. El par de ARNt/ARNt sintetasas puede comprender un par de ARNt/aminoacil-ARNt sintetasas. El par de ARNt/ARNt sintetasas puede comprender un par de ARNt-Tyr/tirosil-ARNt sintetasas. La incorporación del uno o más aminoácidos no naturales puede comprender el uso de un par de ARNt/aminoacil-ARNt sintetasas evolucionado para incorporar de manera específica del sitio uno o más aminoácidos no naturales en sitios definidos en el polipéptido en respuesta a uno o más codones sin sentido ámbar.

Los métodos adicionales para incorporar aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, métodos dados a conocer en Chatterjeeet al.(A Versatile Platform for Single- and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli, Biochemistry, 2013), Kazaneet al.(J Am Chem Soc, 135(1):340-6, 2013), Kimet al.(J Am Chem Soc, 134(24):9918-21, 2012), Johnsonet al.(Nat Chem Biol, 7(11):779-86, 2011) y Hutchinset al.(J Mol Biol, 406(4):595-603, 2011).

Un método de producción de un conmutador para activar una célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) puede comprender (a) obtener un resto de direccionamiento que comprende un aminoácido no natural; y (b) unir un dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID) al resto de direccionamiento, produciendo de ese modo el conmutador. Por tanto, en algunas realizaciones el método comprende unir un CAR-ID a un aminoácido no natural comprendido en un resto de direccionamiento que es un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a CD19 del mismo.

Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender una o más cicloadiciones. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición libre de cobre. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender una reacción libre de cobre. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones que contienen cobre. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones de Diels-Alder. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender uno o más acoplamientos de éster. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender uno o más acoplamientos de isotiocianato. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender unir el CAR-ID a un aminoácido de resto de direccionamiento. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural. Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones bioortogonales. El CAR-ID puede unirse al resto de direccionamiento de una manera específica del sitio. El CAR-ID puede unirse a un sitio predeterminado en el resto de direccionamiento. El CAR-ID puede unirse al resto de direccionamiento de una manera independiente del sitio.

El método puede comprender además unir un primer ligador al resto de direccionamiento para producir un primer producto intermedio de conmutador. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender una o más cicloadiciones. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender una reacción libre de cobre. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones que contienen cobre. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones de Diels-Alder. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender uno o más acoplamientos de éster. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender ligación de oxima. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender formar una o más oximas entre el primer ligador y el resto de direccionamiento. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender formar uno o más enlaces estables entre el primer ligador y el resto de direccionamiento. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender formar uno o más enlaces covalentes entre el primer ligador y el resto de direccionamiento. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender formar uno o más enlaces no covalentes entre el primer ligador y el resto de direccionamiento. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender formar uno o más enlaces iónicos entre el primer ligador y el resto de direccionamiento. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender unir el ligador a un aminoácido de resto de direccionamiento. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural. Unir el primer ligador al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones bioortogonales.

Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender una o más cicloadiciones. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición libre de cobre. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender una reacción libre de cobre. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender una o más reacciones que contienen cobre. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender una o más reacciones de Diels-Alder. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender uno o más acoplamientos de éster. Unir el primer producto intermedio de conmutador al CAR-ID puede comprender uno o más acoplamientos de isotiocianato.

El método puede comprender además unir un segundo ligador al CAR-ID para producir un segundo producto intermedio de conmutador. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender una o más cicloadiciones. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender una reacción libre de cobre. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender una o más reacciones que contienen cobre. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender una o más reacciones de Diels-Alder. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender uno o más acoplamientos de éster. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender ligación de oxima. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender formar una o más oximas entre el segundo ligador y el CAR-ID. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces estables entre el segundo ligador y el CAR-ID. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces covalentes entre el segundo ligador y el CAR-ID. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces no covalentes entre el segundo ligador y el CAR-ID. Unir el segundo ligador al CAR-ID puede comprender formar uno o más enlaces iónicos entre el segundo ligador y el CAR-ID.

Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender una o más cicloadiciones. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición libre de cobre. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender una reacción libre de cobre. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones que contienen cobre. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones de Diels-Alder. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender uno o más acoplamientos de éster. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender uno o más acoplamientos de isotiocianato. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender unir el ligador a un aminoácido de CAR-ID. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural. Unir el segundo producto intermedio de conmutador al resto de direccionamiento puede comprender una o más reacciones bioortogonales.

Unir el CAR-ID al resto de direccionamiento puede comprender unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender una o más cicloadiciones. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición de Huisgen [3+2]. La una o más cicloadiciones pueden comprender una cicloadición libre de cobre. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender una reacción libre de cobre. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender una o más reacciones que contienen cobre. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender una o más reacciones de Diels-Alder. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender una o más hetero-reacciones de Diels-Alder. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender uno o más acoplamientos de éster. Unir el primer producto intermedio de conmutador al segundo producto intermedio de conmutador puede comprender uno o más acoplamientos de isotiocianato.

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de CAR-EC que comprenden (a) un CAR-ID que comprende un péptido de un péptido de factor de transcripción de levadura; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento). El péptido de factor de transcripción de levadura puede ser un péptido de GCN4. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En el presente documento también se da a conocer un CAR anti-GCN4 y una CAR-EC que expresa un CAR anti-GCN4. En algunas realizaciones, el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de un péptido de factor de transcripción de levadura (por ejemplo, un péptido de GCN4 dado a conocer en el presente documento); y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR anti-GCN4, da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de CAR-EC que comprenden (a) un CAR-ID que comprende un péptido de Flag; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento). El péptido de Flag puede comprender una cualquiera de las siguientes secuencias: DYKDDDDK (SEQ ID NO: 40) y DYKDDDDKP (SEQ ID NO: 39). El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo f Mc 63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En el presente documento también se da a conocer un CAR anti-Flag y una CAR-EC que expresa un CAR anti-Flag. En algunas realizaciones, el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de Flag; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-E<c>que expresa un CAR anti-Flag, da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de CAR-EC que comprenden (a) un CAR-ID que comprende FITC; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento). El FITC puede conjugarse al anticuerpo FMC63 humanizado de manera no específica. El FITC puede conjugarse al anticuerpo FMC63 humanizado de manera específica del sitio. La conjugación específica del sitio puede ser a un aminoácido artificial comprendido en el anticuerpo FMC63 humanizado. La conjugación puede ser mediante un ligador que une el anticuerpo FMC63 humanizado al FITC. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En el presente documento también se da a conocer un CAR anti-FITC y una CAR-EC que expresa un CAR anti-FITC. En algunas realizaciones, el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un FITC; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR anti-FITC, da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa c D19.

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de CAR-EC que comprenden (a) un CAR-ID que comprende un péptido de K4 o un péptido de E4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento). El péptido de K4 puede comprender la secuencia de aminoácidos: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE (SEQ ID NO: 43). El péptido de E4 puede comprender la secuencia de aminoácidos: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK (SEQ ID NO: 44). El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En el presente documento también se da a conocer un CAR que comprende un dominio extracelular de K4. En el presente documento también se da a conocer un CAR que comprende un dominio extracelular de E4. En el presente documento también se da a conocer una CAR-EC que expresa un CAR que comprende un dominio extracelular de K4. En el presente documento también se da a conocer una CAR-EC que expresa un CAR que comprende un dominio extracelular de E4.

También se da a conocer el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de K4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR que comprende un dominio extracelular de E4, que da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19. En algunas realizaciones, el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de E4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR que comprende un dominio extracelular de K4, da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

111. Purificación de conmutadores de CAR-EC y porciones de los mismos

En el presente documento se dan a conocer métodos de purificación de conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento, que comprenden separar los conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento a partir de componentes de un sistema de producción de conmutadores de CAR-EC (por ejemplo, residuos celulares, aminoácidos libres). Purificar el conmutador de CAR-EC puede comprender el uso de una o más columnas concentradoras, electroforesis, filtración, centrifugación, cromatografía o una combinación de las mismas. La cromatografía puede comprender cromatografía de exclusión molecular. Los métodos de cromatografía adicionales incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, unión a metal, cromatografía de inmunoafinidad, y cromatografía de líquidos de alta resolución o cromatografía de líquidos de alta presión. La electroforesis puede comprender electroforesis desnaturalizante o electroforesis no desnaturalizante.

Los conmutadores de CAR-EC humanizados pueden comprender una o más etiquetas de péptido. Los métodos de purificación de conmutadores de CAR-EC humanizados pueden comprender unir una o más etiquetas de péptido de los conmutadores de CAR-EC humanizados a un agente de captura. El agente de captura puede seleccionarse de un anticuerpo, una columna, una perla y una combinación de los mismos. La una o más etiquetas pueden escindirse mediante una o más proteasas. Los ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, etiqueta FLAG®, HA, c-myc, V5, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP), y glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta de péptido puede ser el CAR-ID. La etiqueta de péptido puede ser HTP. La etiqueta de péptido puede ser factor de transcripción de levadura GCN4.

Los métodos pueden comprender además la liofilización o ultracentrifugación de los CAR-ID, polipéptidos de direccionamiento y/o los conmutadores de CAR-EC humanizados.

La pureza de los CAR-ID, polipéptidos de direccionamiento y/o los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más. La pureza de los CAR-ID, polipéptidos de direccionamiento y/o los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 85 %. La pureza de los CAR-ID, polipéptidos de direccionamiento y/o los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 90 %. La pureza de los CAR-ID, polipéptidos de direccionamiento y/o los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 95 %. La pureza de los CAR-ID, polipéptidos de direccionamiento y/o los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 97 %. Un conmutador de CAR-EC humanizado purificado según tales métodos de purificación de conmutadores de CAR-EC humanizados se denomina en el presente documento “conmutador de CAR-EC purificado” o a “conmutador de CAR-EC humanizado purificado”. Los conmutadores de CAR-EC purificados pueden estar libres de endotoxinas o sustancialmente libres de endotoxinas.

Los métodos de producción de conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento pueden comprender producir conmutadores de CAR-EC humanizados que son estructuralmente homogéneos. El método de producción del conmutador de CAR-EC a partir de un polinucleótido puede dar como resultado uno o más conmutadores de CAR-EC humanizados que tienen una forma, características, afinidades de unión (por ejemplo, para el CAR o la diana), geometría y/o tamaño iguales o similares. La homogeneidad de los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más. La homogeneidad de los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 85 %. La homogeneidad de los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 90 %. La homogeneidad de los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 95 %. La homogeneidad de los conmutadores de CAR-EC humanizados puede ser igual o superior al 97 %. La homogeneidad puede ser una homogeneidad estructural. La homogeneidad puede ser una homogeneidad estructural antes de administrar la célula a un sujeto. La homogeneidad puede ser una homogeneidad estructural antes de realizar modificaciones en el conmutador de CAR-EC mediante actividades celulares (metilación, acetilación, glicosilación, etc.). Estos altos porcentajes de homogeneidad pueden proporcionar un efecto más predecible del conmutador de CAR-EC. Estos altos porcentajes de homogeneidad pueden proporcionar menos efectos inespecíficos del conmutador de CAR-EC, cuando se combina con una CAR-EC para tratar un estado en un sujeto.

IV. Composiciones farmacéuticas

En el presente documento se da a conocer una composición farmacéutica que comprende uno o más de los conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento. Uno o más de los conmutadores de CAR-EC pueden ser un conmutador de CAR-EC purificado. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende uno o más conmutadores de CAR-EC humanizados purificados dados a conocer en el presente documento. Las composiciones pueden comprender además una o más sales, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden estar libres de endotoxinas o sustancialmente libres de endotoxinas.

También se da a conocer una composición farmacéutica que comprende una, un excipiente, un vehículo, o una combinación de los mismos, farmacéuticamente aceptables y un conmutador de CAR-EC que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en la que la cadena ligera comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena ligera de conmutador dada a conocer en el presente documento y la cadena pesada comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena pesada de conmutador dada a conocer en el presente documento. Tales secuencias de cadena pesada y/o ligera pueden estar humanizadas. También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC comprendido en la composición farmacéutica está humanizado y comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un CAR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC comprendido en la composición farmacéutica puede estar humanizado y comprender una secuencia de cadena ligera que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99% auna secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 17-25 y una secuencia de cadena pesada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2-15, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un CAR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). También se da a conocer que la secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-35 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-15. También se da a conocer que la secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 27-35 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2-15. También se da a conocer que el conmutador puede ser un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, que presenta combinaciones de cadena pesada / cadena ligera comprendidas en varios de los conmutadores dados a conocer en el presente documento. También se da a conocer que el conmutador puede ser idéntico a un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, excepto porque el CAR-ID comprendido en el conmutador está modificado para tener una secuencia de estructura I. También se da a conocer que la secuencia de estructura I puede seleccionarse de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, y 154 163. También se da a conocer que la composición farmacéutica puede comprender un único conmutador. También se da a conocer que la composición farmacéutica puede comprender una pluralidad de conmutadores. También se da a conocer que la pluralidad de conmutadores pueden comprender, cada uno, el mismo CAR-ID. Dos o más de la pluralidad de conmutadores pueden comprender, cada uno, un CAR-ID diferente. La pluralidad de conmutadores pueden estar unidos, cada uno, al mismo CAR en una CAR-EC. El CAR-ID puede ser un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento.

Las sales, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso en las presentes composiciones farmacéuticas incluyen portadores, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservantes, agentes colorantes, aromatizantes y de dilución, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes espesantes, tampones, vehículos de administración, agentes de tonicidad, codisolventes, agentes humectantes, agentes complejantes, agentes tamponantes, antimicrobianos, y tensioactivos.

Solución salina tamponada neutra o solución salina mixta con albúmina de suero son portadores apropiados a modo de ejemplo. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosea, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, compuestos de tipo Pluronic, o polietilenglicol (PEG). También a modo de ejemplo, los agentes potenciadores de la tonicidad adecuados incluyen haluros de metales alcalinos (preferiblemente cloruro de sodio o potasio), manitol, sorbitol, y similares. Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y similares. También puede usarse peróxido de hidrógeno como conservante. Los codisolventes adecuados incluyen glicerina, propilenglicol y PEG. Los agentes complejantes adecuados incluyen cafeína, polivinilpirrolidona, betaciclodextrina o hidroxi-propil-beta-ciclodextrina. Los tensioactivos o agentes humectantes adecuados incluyen ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal, y similares. Los tampones pueden ser tampones convencionales tales como acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato o Tris-HCl. El tampón de acetato puede ser de aproximadamente pH 4-5,5, y el tampón de Tris puede ser de aproximadamente pH 7-8,5. Se exponen agentes farmacéuticos adicionales en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990.

La composición puede estar en forma líquida o en una forma liofilizada o secada por congelación y puede incluir uno o más lioprotectores, excipientes, tensioactivos, aditivos estructurales de alto peso molecular y/o agentes espesantes (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.685.940, 6.566.329, y 6.372.716). En una realización, se incluye un lioprotector, que es un azúcar no reductor tal como sacarosa, lactosa o trehalosa. La cantidad de lioprotector generalmente incluida es de tal manera que, tras la reconstitución, la formulación resultante será isotónica, aunque también pueden ser adecuadas formulaciones hipertónicas o ligeramente hipotónicas. Además, la cantidad de lioprotector debe ser suficiente para prevenir una cantidad inaceptable de degradación y/o agregación de la proteína tras la liofilización. Las concentraciones de lioprotector a modo de ejemplo para azúcares (por ejemplo, sacarosa, lactosa, trehalosa) en la formulación previamente liofilizada son de desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 400 mM. En otra realización, se incluye un tensioactivo, tal como, por ejemplo, tensioactivos no iónicos y tensioactivos iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); fenil éteres de polietilenglicol (por ejemplo, Triton); dodecilsulfato de sodio (SDS); laurilsulfato de sodio; octilglicósido de sodio; lauril, miristil, linoleil o estearil-sulfobetaína; lauril, miristil, linoleil o estearilsarcosina; linoleil, miristil o cetil-betaína; lauroamidopropil, cocamidopropil, linoleamidopropil, miristamidopropil, palmidopropil o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil, palmidopropil o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil-cocoil-taurato de sodio o metil-oleil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilen y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68. etc). Las cantidades a modo de ejemplo de tensioactivo que pueden estar presentes en la formulación previamente liofilizada son de desde aproximadamente el 0,001-0,5%. Los aditivos estructurales de alto peso molecular (por ejemplo, cargas, aglutinantes) pueden incluir, por ejemplo, goma arábiga, albúmina, ácido algínico, fosfato de calcio (dibásico), celulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, dextrano, dextrina, dextratos, sacarosa, tilosa, almidón pregelatinizado, sulfato de calcio, amilosa, glicina, bentonita, maltosa, sorbitol, etilcelulosa, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de disodio, pirosulfito de disodio, poli(alcohol vinílico), gelatina, glucosa, goma guar, glucosa líquida, azúcar compresible, silicato de magnesio y aluminio, maltodextrina, poli(óxido de etileno), polimetacrilatos, povidona, alginato de sodio, goma tragacanto, celulosa microcristalina, almidón y zeína. Las concentraciones a modo de ejemplo de aditivos estructurales de alto peso molecular son de desde el 0,1 % hasta el 10 % en peso. En otras realizaciones, puede incluirse un agente espesante (por ejemplo, manitol, glicina).

Las composiciones pueden ser estériles. Las composiciones pueden estar libres de pirógenos o sustancialmente libres de pirógenos. Las composiciones pueden estar libres de endotoxinas o sustancialmente libres de endotoxinas. Las composiciones pueden ser disoluciones acuosas isotónicas. Las composiciones pueden contener conservantes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones pueden ser adecuadas para administración parenteral. Las composiciones a modo de ejemplo son adecuadas para inyección o infusión en un animal mediante cualquier vía disponible para el experto, tal como vías intraarticular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional. Una formulación parenteral será normalmente una disolución acuosa isotónica, estéril, libre de pirógenos, que contiene opcionalmente conservantes farmacéuticamente aceptables.

Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, disolución de dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, disolución de Ringer con lactato, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolito, tales como los basados en disolución de dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Véase, de manera general, Remington's Pharmaceutical Science, 16a ed., Mack Eds., 1980.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden formularse para administración controlada o sostenida de una manera que proporciona una concentración local del producto (por ejemplo, bolo, efecto depósito) y/o estabilidad o semivida aumentada en un entorno local particular. Las composiciones pueden comprender la formulación de conmutadores, polipéptidos, ácidos nucleicos o vectores dada a conocer en el presente documento con preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), etc., así como agentes tales como una matriz biodegradable, microesferas inyectables, partículas microcapsulares, microcápsulas, perlas de partículas bioerosionables, liposomas y dispositivos de administración implantables que proporcionan la liberación controlada o sostenida del agente activo, que entonces pueden administrarse como una inyección de depósito. Se conocen técnicas para formular tales medios de administración sostenida o controlada y se ha desarrollado y usado una variedad de polímeros para la liberación y administración controlada de fármacos. Tales polímeros son normalmente biodegradables y biocompatibles. Los hidrogenes poliméricos, incluyendo los formados mediante complejación de polímero enantiomérico o segmentos de polipéptidos, e hidrogeles con propiedades sensibles a la temperatura o pH, pueden ser deseables para proporcionar un efecto de depósito de fármaco debido a las condiciones leves y acuosas implicadas en atrapar agentes de proteínas bioactivas (por ejemplo, anticuerpos que comprenden una CDR3 ultralarga). Véase, por ejemplo, la descripción de micropartículas poliméricas porosas de liberación controlada para la administración de composiciones farmacéuticas en el documento WO 93/15722. Los materiales adecuados para este fin incluyen polilactidas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 3.773.919), polímeros de poli-(ácidos a-hidroxicarboxíllicos), tales como poli-(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico) (documento EP 133.988A), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-L-glutamato de etilo (Sidmanet al.,Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langeret al.,J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), etileno-acetato de vinilo, o poli(ácido D(-)-3-hidroxibutírico). Otros polímeros biodegradables incluyen polilactonas, poliacetales, poliortooésteres y poliortocarbonatos. Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Eppsteinet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985)). El propio portador, o sus productos de degradación, no debe ser tóxico en el tejido diana y no debe agravar adicionalmente el estado. Esto puede determinarse mediante selección de rutina en modelos de animales del trastorno diana o, si no se dispone de tales modelos, en animales normales. La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida se ha realizado satisfactoriamente con hormona del crecimiento humana (rhGH), interferón-(rhlFN-), interleucina 2 y MN rgp120. Johnsonet al.,Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Horaet al.,Bio/Technology. 8:755-758 (1990); Cleland, “Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”, en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: Nueva York, 1995), págs. 439-462; los documentos WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y la patente estadounidense n.° 5.654.010. Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas se desarrollaron usando polímero de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden eliminarse rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede depender de su peso molecular y composición. Lewis, “Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”, en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), págs.

1-41. Ejemplos adicionales de composiciones de liberación sostenida incluyen, por ejemplo, el documento EP 58.481A, la patente estadounidense n.° 3.887.699, el documento EP 158.277A, la patente canadiense n.° 1176565, U. Sidmanet al.,Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langeret al.,Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinhaet al.,J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhuet al.,Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000], y Daiet al.,Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005].

También se contemplan polímeros bioadhesivos para su uso en o con composiciones de la presente divulgación. Los bioadhesivos son materiales sintéticos y que se producen de manera natural que pueden adherirse a sustratos biológicos durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, tanto carbopol como policarbófilo son derivados reticulados sintéticos de poli(ácido acrílico). Los sistemas de administración bioadhesivos basados en sustancias que se producen de manera natural incluyen, por ejemplo, ácido hialurónico, también conocido como hialuronano. El ácido hialurónico es un mucopolisacárido que se produce de manera natural que consiste en residuos de compuesto D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. El ácido hialurónico se encuentra en la matriz tisular extracelular de vertebrados, incluyendo en tejidos conjuntivos, así como en líquido sinovial y en el humor vítreo y acuoso del ojo. Los derivados esterificados de ácido hialurónico se han usado para producir microesferas para su uso en la administración que son biocompatibles y biodegradables (véase, por ejemplo, Cortivoet al.,Biomaterials (1991) 12:727-730; documentos EP 517.565; WO 96/29998; Illumet al.,J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141).

Pueden usarse matrices poliméricas tanto biodegradables como no biodegradables para administrar composiciones de la presente divulgación, y tales matrices poliméricas pueden comprender polímeros naturales o sintéticos. Se prefieren matrices biodegradables. El periodo de tiempo a lo largo del cual se produce la liberación se basa en la selección del polímero. Normalmente, la liberación a lo largo de un periodo que oscila entre unas pocas horas y de tres a doce meses es lo más deseable. Los polímeros sintéticos a modo de ejemplo que pueden usarse para formar el sistema de administración biodegradable incluyen: polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(vinil éteres), poli(ésteres vinílicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, polianhídridos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, sal sódica de sulfato de celulosa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, polietilenglicol, poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), poliestireno y polivinilpirrolidona. Los polímeros natrales a modo de ejemplo incluyen alginato y otros polisacáridos incluyendo dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones, y otras modificaciones realizadas de manera rutinaria por los expertos en la técnica), albúmina y otras proteínas hidrófilas, zeína y otras prolaminas y proteínas hidrófobas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan o bien mediante hidrólisis enzimática o bien mediante exposición a aguain vivo,mediante erosión de superficie o en volumen. El polímero está opcionalmente en forma de un hidrogel (véanse, por ejemplo, los documentos WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney,et al.,Macromolecules, 1993, 26, 581-587) que puede absorber hasta aproximadamente el 90 % de su peso en agua y, además, opcionalmente se reticula con iones multivalentes u otros polímeros.

Los sistemas de administración también incluyen sistemas no poliméricos que son lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono, di y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos sometidos a compresión usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fundidos; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que el producto está contenido en una forma dentro de una matriz, tales como los descritos en las patentes estadounidenses n.os 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152 y (b) sistemas de difusión en los que un producto penetra a una tasa controlada a partir de un polímero, tal como se describen en las patentes estadounidenses n.os 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Pueden prepararse liposomas que contienen el producto mediante métodos conocidos, tales como, por ejemplo, (documento DE 3.218.121; Epsteinet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwanget al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; JP 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324).

Alternativa o adicionalmente, las composiciones pueden administrarse de manera local mediante implantación en la zona afectada de una membrana, esponja u otro material apropiado en el que un conmutador dado a conocer en el presente documento se ha absorbido o encapsulado. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de un conmutador, ácido nucleico o vector dado a conocer en el presente documento puede realizarse directamente a través del dispositivo mediante bolo, o mediante administración continua, o mediante catéter usando infusión continua.

Una composición farmacéutica que comprende un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, una CAR-EC que comprende un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o un fragmento de unión a CD19 del mismo, y/o una CAR-EC que comprende un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento) puede formularse para su inhalación, tal como, por ejemplo, como un polvo seco. También pueden formularse disoluciones de inhalación en un propelente licuado para administración de aerosol. En aún otra formulación, pueden nebulizarse disoluciones. Las composiciones farmacéuticas adicionales para administración pulmonar incluyen las descritas, por ejemplo, en el documento WO 94/20069, que da a conocer la administración pulmonar de proteínas químicamente modificadas. Para la administración pulmonar, el tamaño de partícula debe ser adecuado para su administración a la parte distal del pulmón. Por ejemplo, el tamaño de partícula puede ser de desde 1 pm hasta 5 pm; sin embargo, pueden usarse partículas más grandes, por ejemplo, si cada partícula es bastante porosa.

Determinadas formulaciones que contienen conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, los conmutadores de CAR-EC anti-CD19 humanizados) pueden administrarse por vía oral. Las formulaciones administradas de esta manera pueden formularse con o sin los portadores habitualmente usados en la fabricación de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de un agente de unión selectiva. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.

Otra preparación puede implicar una cantidad eficaz de un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, una CAR-EC anti-CD19 tal como una CAR-EC anti-CD19 humanizada y/o una CAR-EC que comprende un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento) en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes de unión, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Pueden determinarse formulaciones farmacéuticas adecuadas y/o preferidas en vista de la presente divulgación y el conocimiento general de la tecnología de formulación, dependiendo de la vía de administración prevista, el formato de administración y la dosificación deseada. Independientemente de la manera de administración, puede calcularse una dosis eficaz según el peso corporal del paciente, el área de superficie corporal o el tamaño del órgano. En la técnica se realiza de manera rutinaria un refinamiento adicional de los cálculos para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento que implica cada una de las formulaciones descritas en el presente documento y está dentro del ámbito de las tareas realizadas de manera rutinaria en la técnica. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante el uso de datos apropiados de dosis-respuesta.

V. Dianas

En el presente documento se dan a conocer receptores quiméricos y conmutadores de receptores quiméricos que interaccionan con una molécula de superficie celular en una célula diana. Generalmente, la unión de la célula efectora y la célula diana al conmutador pone la célula diana en proximidad con la célula efectora lo suficientemente cerca como para que una actividad de la célula efectora tenga un efecto en la célula diana.

En algunas realizaciones, la proximidad entre la célula diana y la célula efectora se optimiza según un método dado a conocer en los documentos PCT/US2016/027997 o PCT/US2016/027990.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tamaño de cualquier ligador que conecta el CAR-ID al resto de direccionamiento puede modificarse aumentando o reduciendo su longitud, para optimizar la proximidad entre la célula diana y la célula efectora. Además, la ubicación del CAR-ID en el resto de direccionamiento puede hacerse variar para optimizar la proximidad entre la célula diana y la célula efectora.

En diversas realizaciones, cuando la célula efectora (por ejemplo, célula T) y la célula diana se unen al conmutador, la célula T puede producir una respuesta inmunitaria que tiene un efecto citotóxico en la célula diana.

Los conmutadores pueden interaccionar con una pluralidad de células diana que expresan CD19. La célula diana puede ser una célula infectada. La célula diana puede ser una célula infectada de manera patogénica. La célula diana puede ser una célula enferma. La célula diana puede ser una célula genéticamente modificada. La célula diana puede no ser una célula huésped. En el presente documento se dan a conocer además conmutadores de CAR-EC que interaccionan con una molécula en una diana no celular. La diana no celular puede ser un virus o una porción del mismo. La diana no celular puede ser un fragmento de una célula. La diana no celular puede ser un componente o proteína de matriz extracelular.

La célula diana puede derivarse de un tejido. El tejido puede seleccionarse de cerebro, esófago, mama, colon, pulmón, glía, ovario, útero, testículos, próstata, tracto gastrointestinal, vesícula, hígado, timo, hueso y piel. La célula diana puede derivarse de una o más glándulas endocrinas. Alternativa o adicionalmente, la célula diana puede derivarse de una o más glándulas endocrinas. La glándula endocrina puede ser una glándula linfática, glándula pituitaria, glándula tiroidea, glándula paratiroidea, páncreas, gónada o glándula pineal.

La célula diana puede seleccionarse de una célula madre, una célula pluripotente, una célula madre hematopoyética o una célula progenitora. La célula diana puede ser una célula en circulación. La célula diana puede ser una célula inmunitaria.

La célula diana puede ser una célula madre cancerosa. La célula diana puede ser una célula cancerosa. La célula cancerosa puede derivarse de un tejido. El tejido puede seleccionarse, a modo de ejemplo no limitativo, de cerebro, esófago, mama, colon, pulmón, glía, ovario, útero, testículo, próstata, tracto gastrointestinal, vesícula, hígado, tiroides y piel. La célula cancerosa puede derivarse de hueso. La célula cancerosa puede derivarse de sangre. La célula cancerosa puede derivarse de una célula B, una célula T, un monocito, un trombocito, un leucocito, un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo, un linfocito, una célula madre hematopoyética o una célula progenitora endotelial. La célula cancerosa puede derivarse de un linfocito B positivo para CD19. La célula cancerosa puede derivarse de una célula madre. La célula cancerosa puede derivarse de una célula pluripotente. La célula cancerosa puede derivarse de una o más glándulas endocrinas. La glándula endocrina puede ser una glándula linfática, glándula pituitaria, glándula tiroidea, glándula paratiroidea, páncreas, gónada o glándula pineal.

La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD19. La célula cancerosa puede ser un linfocito B positivo para CD19. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para Her2. La célula positiva para Her2 puede ser una célula de cáncer de mama positiva para Her2. La célula positiva para Her2 puede ser una célula de cáncer de páncreas positiva para Her2. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para BCMA. La célula cancerosa puede ser una célula de mieloma múltiple positiva para BCMA. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CS1. La célula positiva para CS1 puede ser una célula de mieloma múltiple. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para EGFRvIII. La célula positiva para EGFRvIII puede ser una célula de glioblastoma. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD20. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD22. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD33. La célula positiva para CD33 puede ser una célula de leucemia mieloide aguda. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD123. La célula positiva para CD123 puede ser una célula de leucemia mieloide aguda. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CLL1. La célula positiva para CD123 puede ser una célula de leucemia linfoide aguda. La célula positiva para CLL1 puede ser una célula de leucemia mieloide aguda. La célula cancerosa puede ser una célula de leucemia mieloide aguda que es (i) positiva para CD33, (ii) positiva para CD123, (iii) positiva para CLL1; o (iv) una combinación de dos o más de (i), (ii) y (iii).

La molécula de superficie celular puede ser un antígeno. El antígeno puede ser al menos una porción de un antígeno de superficie o un marcador de superficie celular en una célula. El antígeno puede ser un receptor o un co-receptor en una célula. El antígeno puede referirse a una molécula o fragmento molecular que puede unirse a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y presentarse a un receptor de células T. El término “antígeno” también puede referirse a un inmunógeno. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria adaptativa si se inyecta por sí mismo en un sujeto. El inmunógeno puede inducir una respuesta inmunitaria por sí mismo. El antígeno puede ser un superantígeno, un antígeno dependiente de células T o un antígeno independiente de células T. El antígeno puede ser un antígeno exógeno. Los antígenos exógenos son normalmente antígenos que han entrado en el organismo desde el exterior, por ejemplo mediante inhalación, ingestión o inyección. Algunos antígenos pueden empezar como antígenos exógenos, y posteriormente convertirse en endógenos (por ejemplo, virus intracelulares). El antígeno puede ser un antígeno endógeno. El antígeno endógeno puede ser un antígeno que se ha generado dentro de células como resultado de metabolismo celular normal, o debido a infecciones patógenas (por ejemplo, virales, bacterianas, fúngicas, parasitarias). El antígeno puede ser un autoantígeno. El autoantígeno puede ser una proteína normal o complejo de proteínas (y algunas veces ADN o ARN) que se reconoce por el sistema inmunitario de pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria específica. En condiciones normales, estos antígenos no deberían ser la diana del sistema inmunitario, pero, debido a factores genéticos y/o ambientales, la tolerancia inmunológica normal para un antígeno de este tipo no está presente en estos pacientes. El antígeno puede estar presente o sobreexpresarse debido a un estado o enfermedad. El estado o enfermedad puede ser un cáncer o una leucemia. El estado puede ser una enfermedad o estado inflamatorio. El estado o enfermedad puede ser una enfermedad metabólica. El estado puede ser un trastorno genético.

La molécula de superficie celular puede ser un antígeno que se ha designado como antígeno tumoral. Los antígenos tumorales o neoantígenos pueden ser antígenos que se presentan por moléculas del MHC I o MHC II en la superficie de células tumorales. Estos antígenos pueden presentarse algunas veces por células tumorales y nunca por las normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor (TSA) y, en general, resultan de una mutación específica de tumor. Son más comunes los antígenos que se presentan por células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumor (TAA). Los linfocitos T citotóxicos que reconocen estos antígenos pueden ser capaces de destruir las células tumorales antes de que proliferen o experimenten metástasis. Los antígenos tumorales también pueden estar en la superficie del tumor en forma, por ejemplo, de un receptor mutado, en cuyo caso pueden reconocerse por células B. A menos que se especifique lo contrario, los términos “antígeno tumoral”, “antígeno específico de tumor” y “antígeno asociado con tumor”, se usan de manera intercambiable en el presente documento.

La molécula de superficie celular puede ser un receptor. El receptor puede ser un receptor extracelular. El receptor puede ser un receptor de superficie celular. A modo de ejemplo no limitativo, el receptor puede unirse a una hormona, un neurotransmisor, una citocina, un factor de crecimiento o una molécula de reconocimiento celular. El receptor puede ser un receptor transmembrana. El receptor puede ser un receptor unido a enzima. El receptor puede ser un receptor acoplado a proteína G (GPCR). El receptor puede ser un receptor de factor de crecimiento. A modo de ejemplo no limitativo, el receptor de factor de crecimiento puede seleccionarse de un receptor de factor de crecimiento epidérmico, un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos, un receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, un receptor de factor de crecimiento nervioso, un receptor de factor de crecimiento transformante, un receptor de factor de crecimiento de proteína morfogénica ósea, un receptor de factor de crecimiento de hepatocitos, un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular, un receptor de factor de células madre, un receptor de factor de crecimiento de insulina, un receptor de somatomedina, un receptor de eritropoyetina y homólogos y fragmentos de los mismos. El receptor puede ser un receptor hormonal. El receptor puede ser un receptor de insulina. A modo de ejemplo no limitativo, el receptor puede seleccionarse de un receptor eicosanoide, un receptor de prostaglandina, un receptor de estrógenos, un receptor de hormona estimulante del folículo, un receptor de progesterona, un receptor de hormona del crecimiento, un receptor de hormona de liberación de gonadotropina, homólogos de los mismos y fragmentos de los mismos. El receptor puede ser un receptor adrenérgicos. El receptor puede ser una integrina. El receptor puede ser un receptor de Eph. El receptor puede ser un receptor de hormona luteinizante. La molécula de superficie celular puede ser homóloga en al menos aproximadamente el 50 % a un receptor de hormona luteinizante. El receptor puede ser un receptor inmunitario. A modo de ejemplo no limitativo, el receptor inmunitario puede seleccionarse de un receptor de reconocimiento de patrones, un receptor de tipo Toll, un receptor de tipo NOD, un receptor activado por linfocitos citolíticos, un receptor inhibidor de linfocitos citolíticos, un receptor de Fc, un receptor de células B, un receptor del complemento, un receptor de quimiocina y un receptor de citocina. A modo de ejemplo no limitativo, el receptor de citocina puede seleccionarse de un receptor de interleucina, un receptor de interferón, un receptor de factor de crecimiento transformante, un receptor de factor de necrosis tumoral, un receptor de factor de estimulación de colonias, homólogos de los mismos y fragmentos de los mismos. El receptor puede ser una cinasa receptora. La cinasa receptora puede ser un receptor de tirosina cinasa. La cinasa receptora puede ser un rector de serina cinasa. La cinasa receptora puede ser un receptor de treonina cinasa. A modo de ejemplo no limitativo, la cinasa receptora puede activar una proteína de señalización seleccionada de Ras, Raf, PI3K, proteína cinasa A, proteína cinasa B, proteína cinasa C, AKT, AMPK, fosfolipasa, homólogos de las mismas y fragmentos de las mismas. La cinasa receptora puede activar una ruta de señalización de MAPK/ERK. La cinasa receptora puede activar Jak, Stat o Smad.

La molécula de superficie celular puede ser una proteína de superficie celular distinta de receptor. La molécula de superficie celular puede ser una proteína de cúmulo de diferenciación. A modo de ejemplo no limitativo, la molécula de superficie celular puede seleccionarse de CD34, CD31, CD117, CD45, CD11b, CD15, CD24, CD114, CD182, CD14, CD11a, CD91, CD16, CD3, CD4, CD25, CD8, CD38, CD22, CD61, CD56, CD30, CD13, CLL1, CD33, CD123, CD19, CD20, fragmentos de las mismas, y homólogos de las mismas.

La molécula de superficie celular puede ser una molécula que no comprende un péptido. La molécula de superficie celular puede comprender un lípido. La molécula de superficie celular puede comprender un resto de lípido o un grupo de lípido. El resto de lípido puede comprender un esterol. El resto de lípido puede comprender un ácido graso. El antígeno puede comprender un glicolípido. La molécula de superficie celular puede comprender un hidrato de carbono.

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de CAR-EC que comprenden (a) un receptor de antígeno quimérico que se une a un antígeno peptídico que comprende un péptido de un péptido de factor de transcripción de levadura; y (b) un polipéptido de direccionamiento. El péptido de factor de transcripción de levadura puede ser un péptido de GCN4. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-Her2 o un fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD123 y fragmentos de los mismos.

En el presente documento se dan a conocer además conmutadores de CAR-EC que comprenden (a) una región de unión a CAR que comprende una etiqueta de péptido diana hidrófilo (HTP); y (b) un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-Her2 o un fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD33, y un anticuerpo anti-CD123 y fragmentos de los mismos.

La diana (por ejemplo, CD19) puede estar presente o sobreexpresarse en la superficie celular de una célula diana. La diana (por ejemplo, CD19) puede estar presente o sobreexpresarse debido a una enfermedad o estado. La enfermedad o estado puede ser un cáncer o leucemia. La enfermedad o estado puede ser una enfermedad o estado inflamatorio. La enfermedad o estado puede ser una enfermedad metabólica. La enfermedad o estado puede ser un trastorno genético.

VI. Receptores quiméricos

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de células efectoras de receptor quimérico (CAR-EC) que regulan las actividades de una célula que expresa un receptor quimérico. Tal como se usan en el presente documento, los términos “receptor quimérico” y “receptor de antígeno quimérico” (CAR) se usan de manera intercambiable (a pesar del hecho de que el término receptor de “antígeno” quimérico implica que la porción extracelular es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo), al igual que los términos “célula efectora de receptor quimérico” y “célula efectora de receptor de antígeno quimérico”. El receptor de antígeno quimérico puede comprender un dominio extracelular, dominio transmembrana y dominio intracelular. En algunas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico puede comprender un dominio extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y dominio intracelular. Por tanto, los términos “receptor de antígeno quimérico” y “CAR” pueden abarcar, en algunas realizaciones, receptores quiméricos que no comprenden un dominio extracelular de anticuerpo y los términos pueden abarcar, en algunas realizaciones, receptores quiméricos que comprenden un dominio extracelular que comprende o consiste en un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo.

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de CAR-EC que regulan las actividades de una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). La presente divulgación proporciona receptores de antígenos quiméricos, cuya actividad se regula mediante conmutadores de CAR-EC. El receptor de antígeno quimérico puede comprender un dominio extracelular, dominio transmembrana y dominio intracelular. El dominio extracelular puede unirse al CAR-ID (por ejemplo, un péptido de GCN4, Flag, K4, o E4, o una molécula pequeña tal como FITC) del conmutador de CAR-EC.

El CAR puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para seres humanos. El CAR puede comprender un dominio extracelular que está humanizado. La humanización puede reducir la inmunogenicidad del CAR para seres humanos al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del dominio extracelular por el conmutador de CAR-EC. El CAR puede ser una versión humanizada de una cualquiera de las secuencias de CAR proporcionadas en la tabla 13 o puede ser una versión humanizada de una cualquiera de SEQ ID NO: 270-289. El<c>A<r>puede comprender una secuencia humanizada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una cualquiera de las secuencias de CAR proporcionadas en la tabla 13 o puede comprender una secuencia humanizada que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 270-289.

Tabla 13:

Secuencias de sCAR murino

Secuencia SEQ ID Nombre NO

M G V P T Q L L G L L L L W IT D A IC D IQ M T Q S P A SL S T S L G E T V T IQ C Q A S E 270. >1D3_CAR D IY SG LA W Y Q Q KPGKSPQLLIYGASDLQD GVPSR FSGSGSG TQYSLK ITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKGGGG5GGGGSGGGG

S EVQLQQSGAE LVRP GT SVKL SCKVSGD T I T FYYMH FVKQRP GQGLE W IG R ID P ED E S TK Y SE K F K N K A T LT A D T SS N T A Y L K LS S L TS ED TA T Y FCIY G G Y Y FD Y W G Q G V M V TV SSIEFM Y PPPY L D N E R SN G T IIH IK E KHLCHTQSSPK LFW ALVW AGVLFCYGLLVTVALCVIW TNSRRNRGG QSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANL QDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYN ALQKDKMAEAYS E IG T KGERRRGKGHDGLFQGL STAT KDT FDALHMQ TLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 271. >IH-1-109 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL VAPSQSLSITC TVSGFLLTDYGVNW V RQSPGKGLEW LGVIW GDGITD YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSIQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G T T L T V S S IE F M Y P P P Y L D N E R S N G T IIH IK E K H L C H T Q S S P K L F W A L W V A G V L FCYGL LVTVALCVIWTNS RRNRGGQ SD YMNMT P RRP GLT RKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRR EEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIG TKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDT FDALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 272. >SV-285-064 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSBVQLQESGPGL VAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVTW GDGITD YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G TTLTV SSE SK Y G PPC PPC PFW A LV W A G V LFC Y G LL V T V A LC V IW T NSRRNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSR SAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRR EPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKD TFDALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 273. >SV-319-029 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGG3GGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL

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PG LTR K PYQ PY APA RDFAAYR PK W IR KKFPHIFKQPFKKTTG AAQEE DACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLG RREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSE IGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 284. >SV-319-164 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL VAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVW W VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITD YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G T T L T V S S E S K Y G P P C P P C P IY IW A P L A G IC V A L L L S L I I T L I C N S R RNRGGQSDYMNMTPRRPGLT RKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAE TAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQ EGVYNALQKDKMAEAYSEIGT KGERRRGKGHDGLFQGLSTAT KDT FE ALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 285. >SV-1-001 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL VAPSQSLSITC TVSGFLLTDYGVNW V RQSPGKGLEW LGVIW GDGITD YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G T T L T V S S E S K Y G P P C P P C P IY I W A P L A G I C V A L L L S L I IT L I C K W I RKK FPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCR CPQEEEGGGGGYELR AKFS RSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRR RNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATK DTFDALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 286. >SV-319-165 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL VAPSQSLSTVCTVñGFLTTDYGVNWVRQñPGKGT.ETÁIT.GVTWGnGTCn YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G T T L T V S S E S K Y G P P C P P C P IY I W A P L A G I C V A L L L S L I IT L I C N S R RNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPKWIRKKFPH IFK Q PFK KTTGAAQEEDAC SCRC PQEEEGGG GGYELRAKFSR SA ETA ANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEG VYNALQKDKMAEAYS ElGTKGERRRGKGHDGL FQGLSTAT KDT FDAL

HMQTLAPR

D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 287. >SV-319-166 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A L TIT G A Q TE B E A IY FC V L W Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL V A PSQSLSITC TVSGFLLTDYGVNW V RQSPGKGLEW LGVIW GBGITD YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFBYWGQ GTTLTVS S E S K Y G P P C P P C P IY IW A P L A G IC V A L L L S L I I T L I C N S R RNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAE TAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQ EGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 288. >SV-1-002 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGG3GGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL

VAPSQSLSITC TVSGFLLTDYGVNW V RQSPGKGLEW LGVIW GDGITD YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G T T L T V S S E S K Y G P P C P P C P IY IW A P L A G IC V A L L L S L I I T L I C K W I RKK FPHIFK Q PFK K TTG A A Q EED A CSCR CPQ EEEG G G G G Y ELPA K FS RSAETAANLQDPNQLYKELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRR RNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQTLAPR D A W T Q ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FT 289. >SV-319-167 G LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SDHWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGL VAPSQñLSTTCTVñGFTJ.TnYGVNWVRQSPGKGT.F.WT.GVTWGnGTTn YNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQ G T T L T V S S E S K Y G P P C P P C P IY I W A P L A G I C V A L L L S L I IT L I C N S R RNRGGQSDYMNMTPRRPGLT RKPYQPYAPARDFAAYRPKWIRKKFPH IFK QPFK KTTGAAQEEDAC SCRC PQEEEGGG GGYELRAKFSR SA ETA ANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEG VYNALQKDKMAEAYS E IG T KGERRRGKGHDGL YQGLSTAT KDT YDAL HMQTLAPR

El dominio extracelular puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al CAR-ID del conmutador de CAR-EC (un anticuerpo frente a CAR). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar humanizado. El anticuerpo frente a CAR puede comprender al menos una porción de un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo frente a CAR no es un anticuerpo de longitud completa. El anticuerpo frente a CAR puede comprender al menos una porción de una inmunoglobulina o fragmento de la misma. La inmunoglobulina o fragmento de la misma puede seleccionarse del grupo que consiste en un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un Fab, un Fc, un F(ab')2, un pFc', un nanocuerpo, un aficuerpo, un DARPin, un diacuerpo, un camélido, un receptor de células T modificado por ingeniería y un monocuerpo. La inmunoglobulina puede seleccionarse del grupo que consiste en una IgA1, una IgA2, una IgD, una IgM, una IgE, una IgG1, una IgG2, una IgG3, y una IgG4. Tal inmunoglobulina o fragmentos de la misma puede estar humanizada. El anticuerpo frente a CAR puede comprender al menos una porción de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). La porción puede ser una porción de unión a antígeno. El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena ligera-ligador-cadena pesada. El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena pesada-ligador-cadena ligera. El scFv humanizado puede comprender una secuencia de VH humanizada (cadena pesada variable) con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) injertadas en un entramado de inmunoglobulina humana. El entramado puede ser IGHJ4-59. La secuencia de VH humanizada puede comprender CDR murinas trasplantadas sobre el entramado de IGHJ4-59 de tipo natural. La secuencia de VH humanizada puede comprender CDR murinas trasplantadas sobre un entramado de IGHJ4-59 modificado que comprende uno o más cambios de entramado (es decir, modificación de aminoácido tal como una sustitución). Los cambios de entramado pueden estar en la posición 71 (Kabat H71), posición 73 (Kabat H73), posición 93 (Kabat H90), posición 94 (Kabat H91), o combinaciones de tales posiciones. El scFV humanizado puede comprender adicional o alternativamente una secuencia de VL humanizada (cadena ligera variable) con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre entramado de cadena ligera de inmunoglobulina humana. El entramado de cadena ligera puede ser el entramado de IGLV7-46. La secuencia de VL humanizada puede comprender CDR murinas trasplantadas sobre el entramado de IGLV7-46 de tipo natural. La secuencia de VL humanizada puede comprender CDR murinas trasplantadas sobre un entramado de IGLV7-46 modificado que comprende uno o más cambios de entramado (es decir, modificación de aminoácido tal como una sustitución). El anticuerpo frente a CAR puede ser un anticuerpo humano, completamente humano, humanizado, humano modificado por ingeniería, no humano y/o quimérico.

El dominio extracelular del CAR puede comprender un anticuerpo anti-GCN4 o una porción de unión a GCN4 del mismo. El dominio extracelular puede comprender un scFv anti-GCN4 humanizado (por ejemplo, clon 52SR4, que es un scFv anti-GCN4 mutante de alta afinidad y se describe en Zahnd, C.,et al.,(2004), The Journal of Biological Chemistry 279, 18870-18877). El scFV anti-GCN4 humanizado (por ejemplo, una versión humanizada del clon 52SR4) puede comprender una cadena ligera humanizada, una cadena pesada humanizada, o una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. El anticuerpo anti-GCN4 humanizado (por ejemplo, una versión humanizada del clon 52SR4) puede comprender una secuencia de VH humanizada (cadena pesada variable) con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de inmunoglobulina humana. El entramado puede ser el entramado de IGHJ4-59. La secuencia de VH humanizada puede comprender CDR murinas de un anticuerpo anti-GCN4 trasplantadas sobre el entramado de IGHJ4-59 de tipo natural. La secuencia de VH humanizada puede comprender las CDR de 52SR4 trasplantadas sobre el entramado de IGHJ4-59 de tipo natural. La secuencia de VH humanizada puede comprender las CDR del anticuerpo 52SR4 trasplantadas sobre un entramado de IGHJ4-59 modificado que comprende uno o más cambios de entramado (es decir, una modificación de aminoácido tal como una sustitución, deleción o adición). El cambio de entramado puede afectar a la conformación de CDR-H2, la conformación de CDR-H3, mejorar el empaquetamiento interno del dominio VH y/o puede mejorar la afinidad de unión. El cambio de entramado puede estar en la posición 71 (Kabat H71), posición 73 (Kabat H73), posición 93 (Kabat H90), posición 94 (Kabat H91), o combinaciones de tales posiciones. El anticuerpo anti-GCN4 humanizado (por ejemplo, una versión humanizada del clon 52SR4) puede comprender adicional o alternativamente una secuencia de Vl humanizada (cadena ligera variable) con<c>D<r>no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de cadena ligera de inmunoglobulina humana. El entramado de cadena ligera puede ser el entramado de IGLV7-46. La secuencia de VL humanizada puede comprender CDR murinas de un anticuerpo anti-GCN4 trasplantadas sobre el entramado de IGLV7-46 de tipo natural. La secuencia de VH humanizada puede comprender las CDR del anticuerpo 52SR4 trasplantadas sobre el entramado de IGLV7-46 de tipo natural. La secuencia de VH humanizada puede comprender las CDR de 52SR4 trasplantadas sobre un entramado de IGLV7-46 modificado que comprende uno o más cambios de entramado (es decir, una modificación de aminoácido tal como a sustitución, deleción o adición). El cambio de entramado puede dar como resultado una secuencia con una baja propensión a la desamidación, puede afectar a la conformación de CDR, mejorar el empaquetamiento interno y/o puede mejorar la afinidad de unión. El cambio de entramado puede estar en cualquier posición incluyendo las posiciones mostradas en el presente documento, o combinaciones de tales posiciones. El scFV anti-GCN4 humanizado puede codificarse por una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 169-174. El scFV anti-GCN4 humanizado puede codificarse por una secuencia de polinucleótido seleccionada de SEQ ID NO: 175-180. El scFV anti-GCN4 humanizado puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 169-174. El scFV anti-GCN4 humanizado puede codificarse por una secuencia de polinucleótido que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 175-180.

También se da a conocer que el dominio extracelular del CAR puede comprender un scFv humanizado codificado por una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las tablas 14-16, o cualquier secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 290-388, y 423. El dominio extracelular del CAR puede comprender un scFv humanizado codificado por una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia proporcionada en una cualquiera de las tablas 14-16, o una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423.

En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del CAR comprende una secuencia que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 322.

En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del CAR consiste en una secuencia que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 322.

Según la invención, el dominio extracelular del CAR comprende SEQ ID NO: 322. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del CAR consiste en SEQ ID NO: 322.

El CAR puede codificarse por una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la tabla 17. El CAR puede codificarse por una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 389-397. El CAR puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la tabla 17. El CAR puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a una cualquiera de SEQ ID NO: 389-397.

En realizaciones particulares de la invención, el CAR puede codificarse por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411. En realizaciones particulares, el CAR puede codificarse por la secuencia de polinucleótido SEQ ID NO: 412.

Tabla 14

Candidatos de scFV frente a sCAR humanizado (LH) I

Secuencia SEQ ID NO Nombre

D A W TQ ESA LTSSPG ETV TLTC R SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFTG 290. >52SR4_LH

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP

SQSLSITC TVSGFLLTBYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

QA W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC R SSTG A V TTSN Y A SW FQ Q K PG Q A PR T 291. >L1, H1

LIYGTNNRAPW TPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCVLWYSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SET LSLTC TV SG FLLTD Y G V N W IRQ PPG K G LEW IG V IW G D G ITD Y N PS LKSRVTISVDTSKNQFSIKLSSVTAADTAVYY'CARGLFDYWGQGTLVT

V SS

Q A W T Q E P S 1 T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 292. >L2, H2

LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSL TC TV SG F11T B Y G V N W IR Q PPG K G LE W IG V IW G D G IT D Y N PS LKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS Q A W T Q E P S 1 T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 293. >L2, H2b LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SET LSLTC TV SG FLLTBY G V N W IR Q PPG K G LEW IG V IW G D G ITD Y N PS LKSRVTISKDNSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS

Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 294. >L2, H3

LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 295. >L2, H3b LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS

Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 296. >L2, H4

LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 297. >L2, H4 (A87D)

LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 298. >L2, H5

LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS

Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCGS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 299. >L2, H6

LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP S E T L S I T C T V S G F S L T Ei YGVNWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTDYNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFBYWGQGTLLT V SS

Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCRS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 300. >L2 (G23R), H3b LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCRS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 301. >L2 (G23R), H5 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFBYWGQGTLLT V SS Q A W T Q E P S L T V S P GGTVTLTCRS ST GAVTT SNYASWVQQKP GQAP RG 302. >L2 (G23R), H6 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFSLTBYGVNW VRQPPGKGLEW LGVIW GDGSTDYNPS LKSRLTVS KDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS Q A W TQEPSLTVSPGGTVTLTC GSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGQAFR G 303. >L3, H2 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSLTC TV SG FLLTD Y G V N W IRQ PPG K G LEW IG V IW G D G ITD Y N PS L K S R V T I SKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY'CVTGLFDYWGQGTLVT

V SS Q A W TQEPSLTVSPGGTVTLTC GSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGQAFR G 304. >L3, H3 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS Q A W TQEPSLTVSPGGTVTLTC GSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGQAFR G 305. >L3, H4 (A87D) LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFRG 306. >L4, H2 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SET LSLTC TV SG FLLTBY G V N W IR Q PPG K G LEW IG V IW G D G ITD Y N PS LKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFRG 307. >L4, H3 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFRG 308. >L4, H4 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP S E T L S I T C T V S G F L L T Ei YGVNWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGITDYNPS

LK SR LTV S KDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFRG 309. >L4, H4 (A87D) LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDT SKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TITC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 310. >L4 (L67I, G69D), H4 LIG G TN N R A PG V PA RFSGSLIGDKAALTISGAQPEDEAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDT SKNQVSLKMSSLTAADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS

QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC RSSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFRG 311. >L4 (G23R, L67I, G69D), LIG G TN N R A PG V PA RFSGSLIGDKAALTISGAQPEDEAEYYCVLW YSD H4 HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPS1TV SPG G TV TLTC R SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 312. >L4 (G23R), H4 LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPS1TV SPG G TV TLTC R SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 313. >L4 (G23R), H4 (E6Q) LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

S ET LS ITC TV SG FIITD Y G V N W V R Q PPG K G LEW LG V IW G D G ITD Y N PS LKSRLTVS KDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 314. >L5, H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDT SKNQVSLKMSSLTAADTAR Y Y'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W T Q EPS1TV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 315. >L5, H4 (E6Q) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 316. >L5, H4 (A87D) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 317. >L5, H4 (E6Q, A87D) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 318. >L5 (V12S), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 319. >L5 (V12S), H4 (A87D) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDTSKNQVSLKMSSLTDADTAR Y Y'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 320. >L5 (L109D), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDT SKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 321. >L5 (L109D), H4 (A87D) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 322. >L5 (L109D), H4 (E6Q, L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD A87D) HWVEGGGTK1TVDGGGGGSGGGG5GGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPS1T SSPG G TV T LT C G SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFR G 323. >L5 (V12S, L109D), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD (A87D) HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 324. >L5 (V12S, L109D), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD (E6Q, A87D) HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 325. >L5(V12S, E40Q, L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD L109D), H4 (E6Q, A87D) HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDT SKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 326. >L5 (V12S, I87E, LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYFCVLW YSD L109D), H4 (E6Q, A87D) HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSR LTVSKDT SKNQVSLKMSSLTDADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W T Q EPS1T SSPG G TV T LT C G SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFR G 327. >L5 (V12S, F89Y, LIG G TN N R A PG V PA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAIYYCVLW YSD L109D), H4 (E6Q, A87D) HWVFGGGTK1TVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDT SKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPS1TSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 328. >L5 (V12S, E40Q, I87E, LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYFCVLW YSD L109D), H4 (E6Q, A87D) HWVFGGGTK1TVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPS1TSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 329. >L5 (V12S, E40Q, F89Y, LIG G TN N R A PG V PA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAIYYCVLW YSD L109D), H4 (E6Q, A87D) HWVFGGGTK1TVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTDYGVHW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 330. >L5 (V12S, I87E, F89Y, LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD L109D), H4 (E6Q, A87D) HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSR LTVSKDT SKNQVSLKMSSLTDADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W T Q EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q Q K PD H LFR G 331. >L5 (V12S, E40Q, I87E, LIGGTNNRA PG VPA RFSGSLLGGKAALTISGAQPED EAEYYCVLW YSD F 89Y, L109D), H4 (E6Q, HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP A87D) SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDT SKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS QAW TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 332. >L5 (L109D), L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD muH_52SR4 HWVFGGGTKLTVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

Q A W T Q EP SLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 333. >L5(V12S, L109D), L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD muH_ 52SR4 HWVFGGGTK1TVDGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQE3GPGIVAP

SQSLSITC TVSGFLLTBYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPS1T SSPG G TV T LT C G SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFR G 334. >L5 (V12S, L69D, LIGGTNNRA PG VPA RFSG SLD G G K A A LTISG A Q PED EA IY FC V LW Y SD L109S), H4 (A87D) HWVFGGGTK1TVSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPSL TSSPG G T V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q EK PD H LFR G 335. >L5 (V12S, G23R), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPSL TSSPG G T V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q EK PD H LFR G 336. >L5 (V12S, G23R), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD (A87D) HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVS KDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 337. >L5 (V12S, L69D), H4 LIGGTNNRA PG VPA RFSG SLD G G K A A LTISG A Q PED EA IY FC V LW Y SD (A87D) HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LK SR LTV S KDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYY'CVTGLFDYWGQGTTLT

V SS Q A W T Q EPSL TV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 338. >L5 (AL109), H4 L IG G TN N R A PG V PA R FSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVGGGGG3GGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPS

ETLSITCTV SG FLLTBYG VNW VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPSL KSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLTV SS Q A W T Q EPSL TV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 339. >L5 (AL109), H4 (A87D) L IG G TN N R A PG V PA R FSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVGGGGG3GGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPS

ETLSITCTV SG FLLTBYG VNW VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPSL

K3RLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLTV

SS Q A W T Q EP SLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 340. >L5 (V12S, L69D, LIGGTNNRA PG VPA RFSG SLD G G K A A LTISG A Q PED EA IY FC V LW Y SD L109S), muH_52SR4 HWVFGGGTKLTVSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITC TV3GFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EP SLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 341. >L5 (V12S), muH_52SR4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVXGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 342. >L5 (V12S), H4 (E6Q) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYY'CVTGLFD YWGQGTTLT

V SS Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 343. >L5 (V12S, L69D, LIGGTNNRA PG VPA RFSG SLD G G K A A LTISG A Q PED EA IY FC V LW Y SD L109S), H4 (A87S) HWVFGGGTKLTVSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTSADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

Q A W TQ EPSLTSSPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 344. >L5 (V12S, L109S), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTK1TVSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP

S ET LS ITC TV SG FIITD Y G V N W V R Q PPG K G LEW LG V IW G D G ITD Y N PS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPS1T SSPG G TV T LT C G SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFR G 345. >L5 (V12S, L69D), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPS1T SSPG G TV T LT C G SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFR G 346. >L5 (V12S), H4 (A87S) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTSADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W T Q EPSLTV SPG G TV TLTC R SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFR G 347. >L5 (G23R), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 348. >L5, H6 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFSLTBYGVNW VRQPPGKGLEW LGVIW GDGSTDYNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS Q A W TQ EPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PD H LFRG 349. >L5, H6 (N73T) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFSLTDYGVNW VRQPPGKGLEW LGVIW GDGSTDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG Q A FRG 350. >L6 (P46F), H4 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG Q A FRG 351. >L6 (P46F), H4 (E6Q) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTBYGVN W VRQPPGKGLEW LGVIW GDGITD YNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG Q A PRG 352. >L6, H4 (A87D) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG Q A FRG 353. >L6 (P46F), H4 (A87D) L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP

SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS QAW TQEPSLTV SPG G TV TLTC G SSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG Q A PRG 354. >L6, H6 L IG G TN N RA PG V PA RFSG SLLG G K A A LTISG A Q PED EA IY FCV LW Y SD HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

SETLSITCTVSGFSLTDYGVNW VRQPPGKGLEW LGVIW GDGSTDYNPS LKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS

DAW TQ ESA LTTSPG ETV TLTCRSSTG A V TTSN Y A N W V Q EK PD H LFTG 355. >c11 LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC A LW Y SN HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP

SQSLSITC TVSGFSLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS D A W T Q ESA 1T SSPG ET V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFT G 356. >muL 52SR4, H4

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SD (A87D)

HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS D A W T Q ESA 1T SSPG ET V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFT G 357. >muL 52SR4, H4 (E6Q,

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SD A87D)

HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKP

S ET LS ITC TV SG FIITD Y G V N W V R Q PPG K G LEW LG V IW G D G ITD Y N PS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTDADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS D A W T Q ESA 1T SSPG ET V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFT G 358. >mul_52SR4, H4 (A87S) LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTSADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS D A W TQ ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FTG 359. >muL_52SR4, H4 LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKP SETLSITCTVSGFLLTDYGVNW V RQPPGKGLEW LGVIW GDGITDYNPS LKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SS

Tabla 15

Candidatos de scFV frente a sCAR humanizado (HL) II

Secuencia SEQ ID NO Nombre QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 360. >H4, L5 GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG

QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 423. >H4, L5V12S)

GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT SSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRA PG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG

QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 361. >H4 (E6Q, A87S), L5

GVIW GDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTSADTARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG

QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 362. >H4 (E6Q, A87S), L5

GVIW GDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTSADTARYYCV (G23R)

TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCRSSTGAV TTSN YASW VQEK PD HLFRGLIGGTNN RAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 363. >H6, L2 GVIWGDGSTDYNPSLKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCV TGLFDYW GQGTLLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASWVQQKPGQAPRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYYCVLWYSDHWVFGGGTKLT VLG

QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 364. >H3b, L2 GVIW GDGITDYNPSLKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCV TGLFDYW GQGTLLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASWVQQKPGQAPRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYYCVLWYSDHWVFGGGTKLT VLG QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 365. >H5, L2 GVIW GDGITDYNPSLKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCV TGLFDYW GQ GTLITVSSGGGG5GGGGSGG GGSGGGG5QAW TQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASWVQQKPGQAPRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSL1GGKAALTISGAQPEDEAEYYCVLWYSDHWVFGGGTKLT

VLG QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 366. >H4, L5 (G23R) GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT

V3PGGTVTLTCRSSTGA VTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTN NRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 367. >H6, L2 (G23R) GVIWGDGSTDYNPSLKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCV TGLFDYW GQGTLLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQQKPGQAPRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYYCVLWYSDHWVFGGGTKLT VLG QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 368. >H3b, L2 (G23R) * GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDNSKWQVSLKMSSLTAADTAVYYCV TGLFDYW GQ GTLLTVSSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSL TVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYASW VQQKPGQAPRGLIGGTNNRAP GVPARFSG3LLGGKAALTISGAQPEDEAEYYCVLWYSDHWVFGGGTKL

TVL QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 369. >H5, L2 (G23R) * GVIW GDGITDYNPSLKSRLTVSKDNSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCV TGLFDYW GQ GTLLTVSSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSL TVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYASW VQQKPGQAPRGLIGGTNNRAP G V PA R FSG SL LG G K A A LT IS GAQPEDEAEYYCVLWYS DHWVFGGGT KL TVL QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQPPGKGLEW L 370. >H4 (A87S), L5 (V12S, GVIW GDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTSADTARYYCV L69D, L109S) TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT SSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRA PG VPARFSGSLDGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLWYSDHWVFGGGTKLT VSG QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 371. >H4 (E6Q), L5 GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGIÍAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 372. >H4 (E6Q), L5 (L109D) GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VDG DVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKGLEWL 373. >52SR4_HL GVIW GDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCV TGLFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAWTQESALT SSPG ETV TLTC RSSTGA VTTSNYASW VQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLIGDK AALTITGAQTEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQPPGKGLEWL 374. >H4 (E6Q), m GVIWGDGITDYNPSLKSRLTVSKDTSKNQVSLKMSSLTAADTARYYCV uL_52SR4 TGLFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAWTQESALT SSPG ETV TLTC RSSTGA VTTSNYASW VQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLIGDK AALTITGAQTEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG

DVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKGLEWL 375. >muH_52SR4, L5 GVIW GDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCV TGLFDYW GQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAWTQEPSLT VSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYASW VQEKPDHLFRGLIGGTNNRAPG VPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAIYFCVLW YSDHW VFGGGTKLT VLG

Tabla 16

Candidatos de scFV frente a sCAR humanizado (omega) III

Secuencia SEQ ID NO Nombre D IV M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RSSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG K LFK 376. >Lambda G L IG G T N N R A P G V P SR F S G S LIG D K A T LT IS S LQ PE D F A T Y F C A L W Y S NHWVFGQGTKVELKRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLV QPGGSLKLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGRGLEWIGVIWGDGITDYN SALKDRFIISKDNGKNTVYLQMSKVRSDDTALYYCVTGLFDYWGQGTL VTVSS D IV M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RSSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG K LFK 377. >Omega G L IG G T N N R A P G V P SR F S G S LIG D K A T LT IS S LQ PE D F A T Y F C A L W Y S NHWVFGQGTKVELKRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLV QPGGSLKLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGRGLEWIGVIWGDGITDYN SALKDRFIISKDDCENTVYLQMSKVRSDDTALYYCVTGLFDYWGQGTL VTVSS D IV M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RSSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG K LFK 378. >Omega_m3 G L IG G T N N R A PG V PSR FSG SLIG D K A T LT ISSLQ PE D FA T Y Y C A L W Y S NHWVFGQGTKVELKRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLV QPGGSLKLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGRGLEWIGVIWGDGTTDYN S A L K D R F I I S KDDCENTVYLQMSKVRSDDTALYYCVTGLFDYWGQGTL VTVSS D IV M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RSSTG A V TTSN Y A SW V Q EK PG K LFK 379. >Omega_m3S G L IG G T N N R A PG V PSR FSG SLIG D K A T LT ISSLQ PE D FA T Y Y C A L W Y S NHWVFGQGTKVELKRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLV QPGGSLKLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGRGLEWIGVIWGDGTTDYN SALKDRFIISKDDSENTVYLQMSKVRSDDTALYYCVTGLFDYWGQGTL VTVSS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 380. >Omega2 G L IG G T N N R A P G V P SR F S G S G SG T D A T L T I SSLQ PE D FA T Y YCALWY’S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWIGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDDSKNTVYLQMNSVRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 381. >Omega3 G L IG G T N N R A P G V PSR FSG SLIG D K A T LT ISSLQ PE D FA T Y Y C A L W Y S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWIGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDDSKNTVYLQMNSVRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 382. >Omega4 G L IG G T N N R A PG V PSR FSG SLLG G K A TLTISSLQ PED FA TY Y C A LW Y S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWIGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDDSKNTVYLQMNSVRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 383. >Omega5 G LIG G TN N R A PG V PSR FSG SLSG G K A TLTISSLQ PED FA TY Y C A LW Y S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWIGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDDSKNTVYLQMNSVRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLVT V SS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 384. >Omega6 GL IG G TN N R A PG V PSR FSG SG SG TD A TLT I SSLQ PE D FA T Y YCALWY’S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWLGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS

D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 385. >Omega7 G LIG G TN N R A P G V P SR F S G 3LIG D K A T LT IS S L Q P ED F A T Y Y C A L W Y S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWLGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDNSKNTVYXQMNSLRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 386. >Omega8 GLIGGTNNR A PG V PSF.FSG SLLG G K A TLTISSLQ PED FA TY Y C A LW Y S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWLGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS D IQM TQSPSSLSASVGDRV TITC RSSTGAVTTSNY ASW VQQKPGKAFK 387. >Omega9 G LIG G TN N R A PG V PSR FSG SLSG G K A TLTISSLQ PED FA TY Y C A LW Y S NHWVFGQGTKVELKGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAVSGFSLTDYGYNWVRQAPGKGLEWLGVIWGDGTTDYADS LKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTGLFDYWGQGTLLT V SS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVNWVRQAPGKGLEWV 388. >Omega10 (H L) SVIWGDGTTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGLFDYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSDIQMTQSPSSL SASVGDRVTITCRSSTGAV TTSN YfiSW YQQ KPG KAPKLLIY GTNNRAP GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED FA TYYC ALW YSNH W VFGQGTK V E I K

Tabla 17

Constructos de sCAR de segunda y tercera generación

Secuencia SEQ ID NO Nombre

D A W TQ ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FTG 389. >TSY-2-193

LIG G TN IÍR A PG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTK1TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP

SQSLSITC TVSGFLLTDYGVNW VR QS PGKGLEWLGVIWGDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V S S E S K Y G PP C PP C P D IY IW A P L A G T C G V L L L SL V IT L Y C K R G R K K L L Y IFK Q PFM R PV Q TTQ EED G C SC R FPEEEEG G C ELR V K F3R SA D A PA Y K QGQNQLYNEINLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL QKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR

D A W TQ ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FTG 390. >MM-02-107

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A L TITG A Q TE D EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V SSESK Y G PPC PPC PD FW V LW V G G V LA C Y SLLV TV A F11FW V K RG R K

K L LY IFK Q PFM R PV Q TTQ EED G C SC R FPEEEEG G C ELR V K FSR SA D A P AYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY RELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT KDTYDALHMQ A L P P R

D A W TQ ESA L TSSPG E TV T LT C R SST G A V T TSN Y A SW V Q EK PD H L FTG 391. >MM-02-083

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A L TITG A Q TE D EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V S S E S K Y G P P C P P C P D F W V L V W G G V L A C Y S L L V T V A F II FWVRSKRS RLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPA YKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEAYSElGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA

L P P R

D A W T Q ESA 1T SSPG ET V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFT G 392. >MM-02-085

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A L TITG A Q TE D EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITC TVSGFLLTDYGVNW VR QS PGKGLEWLGVIWGDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V S S IE V M Y P P P Y L D N E K S N G T IIH V K G K H L C P S P L F P G P S K P F W V L W VGGVLACY SLLVTVAFIIFW VRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPGPTRKHY QPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

D A W T Q ESA 1T SSPG ET V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFT G 393. >MM-02-084

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A L TITG A Q TE D EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT V S S E S K Y G PP C PP C P D F W V L W V G G V L A C Y S L L V T V A F IIF W V R S K R S RLLH SDY M NM TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK MAEAYSEIGMKGE RRRGKGHDGL YQGLS TAT KDTYDALHMQAL P P R

D A W T Q ESA 1T SSPG ET V TL TC R SSTG A V TT SN Y A SW V Q E K PD H LFT G 394. >MM-02-086

LIG G TN N R A PG V PA R FSG SLIG D K A A L TITG A Q TE D EA IY FC V LW Y SD HWVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVAP SQSLSITCTVSGFLLTDYGVNW VRQSPGKGLEW LGVIW GDGITDYNSA LKSR LSVTKDNSKSQVFLKM NSLQSGDSAR’i YCVTGLFDYWGQGTTLT

V S S IE V M Y P P P Y L D N E K S N G T IIH V K G K H L C P S P L F P G P S K P F W V L W VGGVLACY SLLVTVAFIIFW VRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPGPTRKHY Q PYAPPRDFAAY RSKRGR KKLLYIFKQPFM RPVQTTQ EEDGCSCR FPE EEEGGGELRV KFSRSADAPAYKQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

DIQMTQTT S S LS A S L G B R V TISC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PD G TV K LLI 395. >MM-02-109

Y H TSR LH SG V PSR FSG SG SG TD Y SLT ISN LEQ ED IA TY 'F CQ Q G N TLPY

TFGG GTKLEITG GGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTC T V SG V S LPD Y G V SW IR Q PPR K G LEW LG V IW G SETTY Y N SA LK SR LTII KDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV S S T T T P A P R P P T P A P T IA S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D F WVLVWGGVLAC YSLLVTVAFIIFW VRSKRSRLLHSDYM NMT PRRPGP TRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEKGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK GERRRGKGHDGLYQGL STAT KDT YDALHMQALPPR

DIQMTQTT S SLSA SLG D R V TISC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PD G TV K LLI 396. >MM-02-110

Y H T S R L H SG V P SR F SG SG SG T D Y S L T IS N L E Q E D IA T Y F C Q Q G N T L PY TFGG GTKLEITG GGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTC T V SG V S LPD Y G V SW IR Q PPR K G LEW LG V IW G SETTY Y N SA LK SR LTII KDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV S S T T T P A P R P P T P A P T IA S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D F WVLVWGGVLAC Y S L L V T V A FI I FWVRSKRSRLLHSDYMNMT PRRPGP TRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCS CRFPFEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKETYDALHMQALPPR

D IQ M T Q TT S SLSA SLG D R V TISC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PD G TV K LLI 397. >CART 19

Y H TSR LH SG V PSR FSG SG SG TD Y SLT ISN LEQ ED IA TY 'F CQ Q G N TLPY

TFG G G TKLEITG GGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTC TV SG V SLPD Y G V SW IR Q PPR K G LEW LG V IW G SETTY Y N SA LK SR LTII KDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV S S T T T P A P R P P T PA PTIA SQ PLSL R PE A C R PA A G G A V H T R G L D FA C D I Y IW A PLA G TCG V LLLSLV ITLY C K RG R K K LLY IFK Q PFM RPV Q TTQ EE DGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

El anticuerpo frente a CAR puede tener una afinidad de unión por el CAR-ID de menos de aproximadamente 0,01 pM, aproximadamente 0,02 pM, aproximadamente 0,03 pM, aproximadamente 0,04 pM, 0,05 pM, aproximadamente 0,06 pM, aproximadamente 0,07 pM, aproximadamente 0,08 pM, aproximadamente 0,09 pM, aproximadamente 0,1 pM, aproximadamente 0,2 pM, 0,3 pM, aproximadamente 0,4 pM, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 0,6 pM, aproximadamente 0,7 pM, aproximadamente 0,8 pM, aproximadamente 0,9 pM o aproximadamente 1 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 7 pM, aproximadamente 8 pM, aproximadamente 9 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 0,01 nM, aproximadamente 0,02 nM, aproximadamente 0,03 nM, aproximadamente 0,04 nM, aproximadamente 0,05 nM, aproximadamente 0,06 nM, aproximadamente 0,07 nM, aproximadamente 0,08 nM, aproximadamente 0,09 nM, aproximadamente 0,1 nM, aproximadamente 0,2 nM, aproximadamente 0,3 nM, aproximadamente 0,4 nM, aproximadamente 0,5 nM, aproximadamente 0,6 nM, aproximadamente 0,7 nM, aproximadamente 0,8 nM, aproximadamente 0,9 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 2,5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 6 nM, aproximadamente 7 nM, aproximadamente 8 nM, aproximadamente 9 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 12nM, aproximadamente 14 nM, aproximadamente 16 nM, aproximadamente 18 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 22 nM, aproximadamente 24 nM, aproximadamente 26 nM, aproximadamente 28 nM o aproximadamente 30 nM.

El dominio extracelular puede comprender un anticuerpo anti-isotiocianato de fluoresceína (FITC) o una porción de unión a FITC del mismo. El anticuerpo anti-FITC puede ser un scFv anti-FITC. El scFv anti-FITC puede seleccionarse de 4-4-20, 4D5Flu, 4M5.3 y FITC-E2. El scFv anti-FITC puede codificarse por una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 87-90.

El anticuerpo frente a CAR puede reconocer un péptido sintético (que no se produce de manera natural). El anticuerpo frente a c Ar puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce una etiqueta FLAG® o un fragmento de la misma. El anticuerpo frente a CAR puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce un GCN4 de factor de transcripción de levadura o un fragmento del mismo. El anticuerpo frente a CAR puede comprender un anticuerpo anti-HTP o un fragmento del mismo.

El dominio transmembrana y/o el dominio intracelular pueden comprender al menos una porción de un dominio de señalización citoplasmático. El dominio transmembrana puede comprender una secuencia transmembrana de CD8. El dominio transmembrana puede comprender una secuencia transmembrana de CD28. El dominio transmembrana puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 398 o SEQ ID NO: 417. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de una molécula de señalización seleccionada del grupo que comprende CD3Z, CD28, y 4-1BB. El dominio intracelular puede comprender (i) la secuencia de CD3Z SEQ<i>D<n>O: 420, (ii) la secuencia de C<d>28 SEQ ID NO: 418, (iii) la secuencia de 4-1BB SEQ ID NO: 419, o una combinación de (i) y (ii), (i) y (iii), (ii) y (iii), o la totalidad de (i)-(iii). El dominio intracelular puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia de CD3Z SEQ ID NO: 420. El dominio intracelular puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia de CD28 SEQ ID NO: 418. El dominio intracelular puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a la secuencia de 4-1BB SEQ ID NO: 419. El dominio intracelular puede comprender un receptor de Fc o una porción del mismo. El receptor de Fc o porción del mismo puede ser CD16 o una porción del mismo. La molécula de señalización puede comprender CD3Z. La molécula de señalización puede comprender CD28. La molécula de señalización puede comprender 4-1BB. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD3Z. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD28, el dominio intracelular puede comprender al menos una porción de 4-1BB, el dominio intracelular puede comprender al menos una porción de OX-40, el dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD30, el dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD40, el dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD2. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD27. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de PD-1. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de ICOS. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de antígeno asociado a la función linfocitaria 1 (LFA-1). El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de CD7. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de idéntica a linfotoxinas, expresión inducible, compite con glicoproteína D del virus del herpes para el mediador de entrada de virus del herpes, un receptor expresado en linfocitos T (LIGHT). El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de NKG2C. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de B7-H3. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de un dominio de señalización citoplasmático de una o más moléculas de señalización. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de dos o más dominios de señalización citoplasmáticos. Los dos o más dominios de señalización citoplasmáticos pueden ser de dos o más moléculas de señalización diferentes. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de tres o más dominios de señalización citoplasmáticos. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de cuatro o más dominios de señalización citoplasmáticos. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de un ligando que se une a una o más moléculas de señalización. El dominio intracelular puede comprender al menos una porción de un ligando que se une a CD83.

El CAR puede comprender una bisagra. La bisagra puede estar ubicada entre el dominio transmembrana y el dominio extracelular. La bisagra puede comprender una porción del dominio transmembrana. La bisagra puede comprender una porción del dominio extracelular. La bisagra puede proporcionar una longitud, orientación, geometría o flexibilidad al<c>A<r>que es necesaria para una sinapsis inmunológica óptima. La sinapsis inmunológica óptima puede proporcionar una distancia y/u orientación óptimas entre la CAR-EC y la célula diana. La sinapsis inmunológica óptima puede proporcionar una citotoxicidad óptima y/o máxima contra la célula diana. Tal como se muestra en el ejemplo 15 del documento PCT/US2016/027990, los conmutadores dirigidos a CD19 con FITC injertado de manera proximal a la superficie de contacto de unión a antígeno del Fab de FMC63, pueden ser superiores a los conmutadores con FITC injertado en el extremo C-terminal. Aunque se desconoce el epítopo del anticuerpo anti-CD19 FMC63 y la estructura correspondiente del antígeno CD19, esto puede deberse a una distancia reducida entre la célula diana y la célula sCAR-T. En la sinapsis inmunológica fisiológica formada por el receptor de células T (TCR) nativo, la distancia entre la célula T y la célula presentadora de antígeno es de aproximadamente 150 A. Esta distancia es crítica para excluir de manera estérica de la sinapsis fosfatasas inhibidoras tales como CD45 y CD148 que actúan para desfosforilar moléculas de señalización y regular por disminución la activación de células T. Es probable que la sinapsis más larga aportada por los conmutadores C-terminales (65 A más larga que los conmutadores N-terminales por la longitud de Fab) no pueda excluir de manera estérica estas moléculas inhibidoras, dando como resultado una señalización de sCAR menos productiva. Por tanto, los métodos dados a conocer en el presente documento pueden comprender modular la distancia de la sinapsis inmunológica modulando la longitud del conmutador y/o el dominio extracelular de CAR de tal manera que la distancia de la sinapsis inmunológica no es mayor de aproximadamente 100 A, aproximadamente 150 A, aproximadamente 175 A o aproximadamente 200 A.

También se da a conocer que la sinapsis inmunológica óptima puede ser, por ejemplo, no mayor de aproximadamente 100 A, aproximadamente 150 A, aproximadamente 175 A o aproximadamente 200 A.

La bisagra puede derivarse del dominio extracelular de una proteína transmembrana endógena específica para células T tal como CD28 o 4-1BB, o componentes de CD3. La bisagra puede derivarse de una secuencia derivada de manera sintética (tal como las indicadas para ligadores relevantes para el diseño de conmutadores). La bisagra puede derivarse de una proteína humana. La bisagra puede ser contigua con el dominio transmembrana. Esta bisagra puede comprender parte de la región constante de cadena pesada 1 del scFv. Esta bisagra puede comprender parte de la región constante de cadena ligera 1 del scFv.

La longitud de bisagra puede ser de entre aproximadamente 1 aminoácido y aproximadamente 10 aminoácidos. La longitud de bisagra puede ser de entre 1 aminoácido y aproximadamente 20 aminoácidos. La longitud de bisagra puede ser de entre aproximadamente 1 aminoácido y aproximadamente 50 aminoácidos. La longitud de bisagra puede ser de entre aproximadamente 1 aminoácido y aproximadamente 100 aminoácidos. La longitud de bisagra puede ser de entre 10 aminoácidos y aproximadamente 50 aminoácidos. La longitud de bisagra puede ser de aproximadamente 12 aminoácidos. La longitud de bisagra puede ser de aproximadamente 45 aminoácidos.

La bisagra puede ser una bisagra larga. La bisagra larga puede tener una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 aminoácidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 aminoácidos, o de aproximadamente 45 a aproximadamente 100 aminoácidos.

La bisagra puede ser una bisagra corta. La bisagra corta puede tener una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos.

La bisagra puede comprender una porción de una proteína CD8. La porción de la proteína CD8 puede ser de entre aproximadamente 4 aminoácidos y aproximadamente 100 aminoácidos. La porción de la proteína CD8 puede ser de aproximadamente 45 aminoácidos. La bisagra puede comprender una porción de una inmunoglobulina. La inmunoglobulina puede ser una IgG. La inmunoglobulina puede ser una IgG4. La IgG4 puede estar mutada (denominada en el presente documento IgG4m). La porción de la inmunoglobulina puede ser de entre aproximadamente 1 aminoácido y aproximadamente 20 aminoácidos. La porción de la inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 12 aminoácidos.

La bisagra puede ser flexible. La bisagra puede estar estructurada.

Tal como se usa en el presente documento haciendo referencia a una secuencia de péptido (por ejemplo, una bisagra o ligador dado a conocer en el presente documento), el término “flexible” significa una secuencia de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos lineal con poca o ninguna estructura secundaria conocida. Tales secuencias flexibles pueden comprender secuencias de aminoácidos lineales en las que los ángulos de torsión o la rotación alrededor de los enlaces de la estructura principal de polipéptido tienen libertad para ocupar muchas orientaciones diferentes. En algunas realizaciones, la referencia a una “bisagra flexible” significa que una bisagra comprende una secuencia de péptido flexible que permite que un CAR se una a CAR-ID mediante diversas orientaciones de unión, aliviando por tanto el impedimento estérico que de lo contrario habría sido perjudicial para la unión de CAR-ID al dominio extracelular de CAR.

Tal como se usa en el presente documento haciendo referencia a una secuencia de péptido (por ejemplo, una bisagra o ligador dado a conocer en el presente documento), el término “estructurado” significa una secuencia de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos lineal que forma una estructura secundaria definida. Tales secuencias estructuradas pueden comprender una secuencia de aminoácidos lineal en la que los ángulos de torsión o la rotación alrededor de los enlaces de la estructura principal de polipéptido tienen preferencias definidas para ocupar un número limitado de orientaciones. En algunas realizaciones, una bisagra estructurada puede comprender una secuencia de péptido que define la sinapsis inmunológica y reduce los costes entrópicos de hallar una orientación más productiva. Dicho de otra manera, una bisagra estructurada es, en algunas realizaciones, una bisagra que no es flexible. En diversas realizaciones, los términos “rígida” y “estructurada” se usan de manera intercambiable en referencia a una secuencia de péptido (por ejemplo, una bisagra o ligador dado a conocer en el presente documento).

La bisagra puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103. La bisagra puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93 103. La bisagra puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 165-168. La bisagra puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50 % a una secuencia seleccionada de 165-168. La bisagra puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 421. La bisagra puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos el 50 % a SEQ ID NO: 421. La bisagra puede comprender una secuencia que es idéntica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o al menos el 99 % a cualquier secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 165-168, y 421. El CAR que tiene una región bisagra puede codificarse por una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 181-183. El CAR que tiene una región bisagra puede codificarse por una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50 % a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 181-183. La bisagra puede consistir en SEQ ID NO: 165. La bisagra puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 167. La bisagra puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 168. La bisagra de SEQ ID NO: 168 puede comprender además un residuo D C-terminal. La bisagra puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 421. La bisagra puede comprender o consistir en una secuencia que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos, el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, o SEQ ID NO: 421.

La bisagra puede comprender una secuencia que es idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 165, 167, 168 o 421 y la bisagra puede comprender además una secuencia de SEQ ID NO: 166. Por ejemplo, la secuencia bisagra de IgG4m SEQ ID<n>O: 168, puede comprender además un residuo D C-terminal (SEQ ID NO: 166).

El CAR puede expresarse a niveles relativamente bajos en la CAR-EC. El CAR puede expresarse a niveles relativamente altos en la CAR-EC. El CAR puede expresarse a una densidad celular de menos de aproximadamente 2*106 receptores por célula. El CAR puede expresarse a una densidad celular de aproximadamente 0,5*106 receptores por célula. El CAR puede expresarse a una densidad celular de más de aproximadamente 0,05*106 por célula El CAR puede expresarse bajo el control de un promotor seleccionado de EF1a, IL-2, CMV, y promotores sintéticos diseñados para aumentar o reducir la expresión de CAR. El promotor puede ser constitutivo. El promotor puede ser inducible.

También se da a conocer que el CAR puede comprender (a) un dominio extracelular que comprende o consiste en un scFv, (b) una bisagra, (c) un dominio transmembrana, y (d) un dominio intracelular, en el que

a. el scFv se selecciona de

i. un scFv codificado por una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las tablas 14-17; ii. un scFv codificado por una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423;

b. la bisagra se selecciona de

i. una bisagra de IgG4, una bisagra de IgG4m, una bisagra de CD28, y una bisagra de CD8;

ii. una bisagra que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 165, 167, 168, y 421; y

iii. una bisagra que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO: 165, 167,168, y 421;

c. el dominio transmembrana se selecciona de

i. un dominio transmembrana de CD8 o una porción del mismo o un dominio transmembrana de CD28 o una porción del mismo;

ii. un dominio transmembrana que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 398 y 417

iii. un dominio transmembrana que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO: 398 y 417 y

d. el dominio intracelular se selecciona de:

i. un dominio intracelular que comprende una molécula de señalización de CD3Z;

ii. un dominio intracelular que comprende una molécula de señalización de CD3Z y una molécula de señalización de CD28;

iii. un dominio intracelular que comprende una molécula de señalización de CD3Z y una molécula de señalización de 4-1BB; y

iv. un dominio intracelular que comprende una molécula de señalización de CD3Z, una molécula de señalización de CD28, y una molécula de señalización de 4-1BB.

En algunas realizaciones particulares, el CAR comprende una estructura seleccionada de los constructos A-H en la figura 24A. En determinadas realizaciones, el CAR comprende una estructura según el constructo E en la figura 24A. En determinadas realizaciones, el CAR se selecciona de los CAR descritos en la tabla 11. En determinadas realizaciones particulares, el CAR se selecciona de los CAR descritos en la tabla 12. En determinadas realizaciones particulares, el CAR comprende una secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, y 415. En determinadas realizaciones particulares, el CAR comprende una secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 389-397. En determinadas realizaciones particulares, el CAR consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 389-397, 401,403, 405, 407, 409, 411,413, y 415. En determinadas realizaciones particulares, el CAR comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % a una secuencia. En determinadas realizaciones particulares, el CAR se codifica por una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, y 416.

CAR multivalentes

También puede modificarse la valencia por ingeniería para dar una bisagra de CAR (figura 17C). A modo de ejemplo no limitativo, un conmutador monovalente puede reclutar dos CAR mediante un disulfuro que se forma en la región bisagra del CAR. La bisagra puede ser una bisagra derivada de CD8 (SEQ ID NO: 165) que se espera que sea monovalente. La bisagra puede derivarse de la región bisagra de una molécula de IgG. La molécula de IgG puede seleccionarse de IgG1, IgG4 o IgG4m (mutada). La bisagra de IgG4 (SEQ ID NO: 167) puede no participaren disulfuros entre cadenas, sino que en vez de eso tiene enlaces disulfuro dentro de la cadena que no dimerizan el CAR. Puede considerarse que la bisagra es funcionalmente monovalente. La bisagra de IgG1 y de IgG4m (SEQ ID NO: 168) puede contener una mutación de serina a prolina que le permite participar en enlaces disulfuro entre cadenas, lo cual dimeriza de manera covalente la región bisagra (figura 17). Estas bisagras pueden usarse para estudiar tanto las restricciones de distancia de una sinapsis inmunológica (sometiendo a prueba la bisagra derivada de CD8 larga frente a la bisagra derivada de IgG4 corta) y el efecto de valencia (sometiendo a prueba la bisagra derivada de IgG4 corta frente a un CAR derivado de IgG4m) del CAR y/o conmutador. Otras bisagras pueden comprender CH2 y/o CH3 de moléculas de IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4, o porciones de las mismas, o combinaciones de las mismas. La bisagra puede derivarse de CD28. La bisagra puede dimerizarse.

coCAR/iCAR

Los CAR conmutables y los conmutadores dados a conocer en el presente documento pueden abarcar conmutadores de células T de receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) y células iCAR-T conmutables para seleccionar como diana una respuesta inmunitaria frente a células específicas (por ejemplo, células enfermas) y minimizar un ataque inmunitario sobre células sanas. Los CAR conmutables y conmutadores dados a conocer en el presente documento también pueden abarcar conmutadores de células T de receptor de antígeno quimérico coestimulante (coCAR) para su uso con células coCAR-T conmutables para seleccionar como diana una respuesta inmunitaria frente a células diana (por ejemplo, células enfermas) y maximizar un ataque inmunitario sobre estas células. Los conmutadores de células iCAR-T y los conmutadores de células coCAR-T comprenden un dominio de unión a CAR y un dominio de unión a diana. Las composiciones dadas a conocer en el presente documento pueden comprender una pluralidad de conmutadores para modular una célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC), en las que un primer conmutador que interacciona con un primer antígeno en una primera célula diana y un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) en la CAR-EC; y un segundo conmutador que interacciona con un segundo antígeno en una segunda célula diana y un segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) en la CAR-EC. La pluralidad de conmutadores pueden usarse con células CAR-T existentes y con CAR-EC que expresan un CAR canónico y/o un CAR inhibidor (iCAR). La pluralidad de conmutadores pueden usarse con células CAR-T existentes y con CAR-EC que expresan un CAR canónico y/o un CAR coestimulante (coCAR).

El células CAR-EC conmutables dadas a conocer en el presente documento pueden comprender un primer CAR conmutable y un segundo CAR conmutable. El primer c Ar conmutable puede ser un CAR canónico y el segundo CAR conmutable puede ser un iCAR. El primer CAR conmutable puede ser un CAR canónico y el segundo CAR conmutable puede ser un co-CAR.

El iCAR puede comprender un receptor quimérico que proporciona una señal inhibidora a células CAR-T. El iCAR puede comprender un dominio citoplasmático seleccionado de PD-1 o CTLA-4. El iCAR puede expresarse por la misma célula que un CAR canónico (de activación). La activación del iCAR puede reducir una señal y/o actividad de CAR canónico. La especificidad del iCAR puede usarse para proteger tejidos en los que no se desea la actividad de células CAR-T. La actividad de iCAR puede controlarse mediante un conmutador, denominado “conmutador de iCAR” en el presente documento. De manera similar, la actividad de CAR canónico puede controlarse mediante el primer y/o segundo conmutador, denominado “conmutador de aCAR” en el presente documento. Una célula iCAR-T conmutable permite seleccionar como diana antígenos que puede no ser seguro seleccionar como diana con una célula CAR-T o canónica.

Para montar una respuesta inmunitaria, el conmutador de aCAR se une a un antígeno positivo, o “A”, en una célula diana que tiene que atacarse (por ejemplo, célula cancerosa) y al CAR canónico, estimulando la actividad citotóxica hacia la célula diana mediante activación del CAR canónico. Para proteger el tejido normal, el conmutador de iCAR se une a un antígeno negativo, o “B”, en una célula que tiene que evitarse por las células T (por ejemplo, una célula sana) y el iCAR, inhibiendo la actividad inmunitaria mediante señalización del iCAR. El antígeno “B” puede expresarse de manera ubicua en tejido normal pero regularse por disminución en la mayoría de las células malignas. El antígeno “A” puede sobreexpresarse en células malignas con respecto a tejido normal. El antígeno B puede ser gen de tipo proteína de unión a opioide/molécula de adhesión celular (OPCML). El antígeno B puede seleccionarse de hialuronidasa 2 (HYAL2), deleción en cáncer colorrectal (DCC), y SMAR1.

El coCAR puede comprender un receptor quimérico que proporciona una señal coestimulante a células CAR-T. El coCAR puede comprender un dominio citoplasmático seleccionado de CD137 y/o CD28. El coCAR puede expresarse por la misma célula que un CAR canónico (de activación). La activación del coCAR puede potenciar y/o sinergizar una señal y/o actividad de CAR canónico. El coCAR puede aumentar la citotoxicidad hacia una célula diana con respecto a la citotoxicidad hacia una célula diana generada por una célula CAR-T que sólo expresa una célula CAR-T canónica. La actividad de coCAR puede controlarse mediante un conmutador, denominado “conmutador de coCAR” en el presente documento. De manera similar, la actividad de CAR canónico puede controlarse mediante el primer y/o segundo conmutador, denominado “conmutador de aCAR” en el presente documento.

CAR distintos de anticuerpo

En algunas realizaciones, a diferencia de los CAR convencionales, los receptores de antígenos quiméricos dados a conocer en el presente documento pueden comprender un dominio extracelular distinto de anticuerpo que interacciona con el CAR-ID. Es decir, el dominio extracelular puede comprender una proteína distinta de anticuerpo o un péptido distinto de anticuerpo que interacciona con el CAR-ID. Por tanto, el receptor de antígeno quimérico puede no reconocer realmente un antígeno en una diana en el sentido tradicional de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce un antígeno, sino interaccionar con la diana de maneras en las que lo hará una proteína o péptido distinto de anticuerpo. En estos casos, el receptor de antígeno quimérico puede denominarse de manera más precisa “receptor quimérico”. Un experto en la técnica entenderá que, en muchos ejemplos y descripciones a lo largo de esta divulgación, el receptor de antígeno quimérico puede ser un receptor quimérico. La pareja de unión a receptor quimérico del conmutador puede ser una proteína o péptido distinto de anticuerpo. Por tanto, el receptor quimérico y el conmutador pueden tener una interacción proteína-proteína o una interacción proteína-péptido.

Interacciones proteína-proteína

El CAR puede comprender un dominio extracelular distinto de anticuerpo, en el que el dominio extracelular comprende una proteína distinta de anticuerpo. La proteína distinta de anticuerpo puede interaccionar con la pareja de unión a receptor quimérico, en la que la pareja de unión a receptor quimérico comprende una proteína de unión a receptor quimérico, que constituye una interacción proteína-proteína. La interacción proteína-proteína puede ser aproximada. Una interacción aproximada puede ser una interacción en la que la pareja de unión a receptor quimérico y el péptido distinto de anticuerpo se unen con una KD de aproximadamente 1°'4 M, aproximadamente 1°'3 M, aproximadamente 10'2 M, aproximadamente 1°'1 M, o con una KD que es mayor de aproximadamente 1°'1 M. La interacción proteínaproteína puede ser una interacción estrecha. Una interacción estrecha puede ser una interacción en la que la pareja de unión a receptor quimérico y el péptido distinto de anticuerpo se unen con una KD de aproximadamente 1°'5 M, aproximadamente 1°'6 M, aproximadamente 1°'7 M, aproximadamente 1°'8 M, aproximadamente 10'9 M, aproximadamente 10'1° M, aproximadamente 1°'11 M o aproximadamente 1°'12 M. La interacción proteína-proteína puede comprender una interacción proteína-proteína covalente. La interacción proteína-proteína puede comprender una interacción proteína-proteína no covalente. La proteína distinta de anticuerpo y/o la proteína de unión a receptor quimérico pueden comprender una enzima. La enzima puede ser una nucleasa. La nucleasa puede ser una ribonucleasa. La ribonucleasa puede ser procariota. La proteína distinta de anticuerpo y/o la proteína de unión a receptor quimérico pueden comprender un sustrato. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender barnasa y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender barstar. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender barstar y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender barnasa. Barnasa es una aminoácido ribonucleasa deBacillus amyloliquefaciens.Barstar es un inhibidor intracelular natural de barnasa. Barnasa interacciona con barstar con alta afinidad, teniendo una constante de asociación de unión proteína-proteína de 10A8/s/M (Buckle AM, Schreiber G, Fersht AR; Biochemistry 33 (30): 8878-8 (agosto de 1994). Barnasa, barstar, y sus interacciones se describen en Mossakowska DE, Nyberg K, Fersht AR; Biochemistry 28 (9): 3843-5° (mayo de 1989).

Interacciones proteína-péptido

La proteína distinta de anticuerpo puede interaccionar con la pareja de unión a receptor quimérico, en la que la pareja de unión a receptor quimérico comprende un CAR-ID, que constituye una interacción proteína-péptido. Alternativamente, el dominio extracelular distinto de anticuerpo puede comprender un péptido distinto de anticuerpo que interacciona con la pareja de unión a receptor quimérico, en el que la pareja de unión a receptor quimérico comprende una proteína de unión a receptor quimérico, que constituye la interacción proteína-péptido. La interacción proteína-péptido puede ser una interacción aproximada. Una interacción aproximada puede ser una interacción en la que la pareja de unión a receptor quimérico y el péptido distinto de anticuerpo se unen con una KD de aproximadamente 10<-4>M, aproximadamente 10<-3>M, aproximadamente 10<-2>M, aproximadamente 10<-1>M, o con una KD que es mayor de aproximadamente 10<-1>M. La interacción proteína-péptido puede ser una interacción estrecha. Una interacción estrecha puede ser una interacción en la que la proteína de unión a receptor quimérico y el péptido distinto de anticuerpo (o el CAR-ID y la proteína distinta de anticuerpo) se unen con una KD de aproximadamente 10-<5>M, aproximadamente 10<-6>M, aproximadamente 10<-7>M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10<-9>M, aproximadamente 10<-10>M, aproximadamente 10<-11>M o aproximadamente 10’12 M. La proteína distinta de anticuerpo y/o proteína de unión a receptor quimérico puede seleccionarse de una proteína fibrosa, una proteína de molécula de adhesión y una proteína de membrana.

La interacción proteína-péptido puede comprender una interacción proteína-péptido covalente. Por ejemplo, la proteína distinta de anticuerpo puede comprender una proteína pilina deStreptococcus pyogenesy el CAR-ID puede comprender una etiqueta isopeptag. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender una etiqueta isopeptag y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína pilina deStreptococcus pyogenes.Las interacciones entre la etiqueta isopeptag y la proteína pilina deStreptococcus pyogenesse describen en Kang, H.J., Coulibaly, F., Clow, F., Proft, T., y Baker, E.N. Science 318, 1625-l628 (2007) y Zakeri, B. y Howarth, M.; J. Am. Chem. Soc. 132, 4526-4527 (201°). La secuencia de la etiqueta isopeptag es Se Q ID NO: 41. Además, a modo de ejemplo no limitativo, la proteína distinta de anticuerpo puede comprender una proteína de unión a fibronectina deStreptococcus pyogenes(SpyCatcher), y el CAR-ID puede comprender una etiqueta SpyTag. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender una etiqueta SpyTag y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína de unión a fibronectina deStreptococcus pyogenes(SpyCatcher). La interacción covalente entre SpyCatcher y la etiqueta SpyTag se describen en Zakeri B, Howarth M, JACS, vol. 109, n.° 12 (2012).

La interacción proteína-péptido puede comprender una interacción proteína-péptido no covalente. Por ejemplo, una proteína distinta de anticuerpo puede seleccionarse de una sinaptobrevina, una SNAP25 y una sintaxina, y porciones de las mismas (por ejemplo, hélice alfa), y el CAR-ID puede comprender un SNARE. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender un SNARE y la proteína de unión a receptor quimérico puede seleccionarse de una sinaptobrevina, una SNAP25 y una sintaxina, y porciones de las mismas (por ejemplo, hélice alfa). Las interacciones entre SNARE y sinaptobrevina, SNAP25 y una sintaxina se describen en Sollner T,et al.,Nature 362:318-324 (1993); Sutton RB , Fasshauer D, Jahn R, Brunger AT, Nature 395:347-353 (1998); y Darios, F, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18197-18201 (2010). Además, a modo de ejemplo no limitativo, la proteína distinta de anticuerpo puede comprender una ARNasa I y el CAR-ID puede comprender una etiqueta Hu. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender una etiqueta Hu y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una ARNasa I. Además, a modo de ejemplo no limitativo, la proteína distinta de anticuerpo puede comprender una proteína adaptadora de HuS y el CAR-ID puede comprender una etiqueta Hu. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender una etiqueta Hu y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender una proteína adaptadora de HuS. Interacciones entre etiqueta Hu y ARNasa I y entre etiqueta Hu y proteína adaptadora de HuS se describen en Backer, M. V.,et al.,Adapter protein for site-specific conjugation of payloads for targeted drug delivery. Bioconjugate Chem. 15, 1021-1029 (2004).

Interacciones péptido-péptido

El CAR puede comprender un dominio extracelular distinto de anticuerpo, en el que el dominio extracelular comprende un péptido distinto de anticuerpo. El péptido distinto de anticuerpo puede interaccionar con la pareja de unión a receptor quimérico, en el que la pareja de unión a receptor quimérico comprende un CAR-ID, que constituye una interacción péptido-péptido. La interacción péptido-péptido puede ser una interacción aproximada. Una interacción aproximada puede ser una interacción en la que la pareja de unión a receptor quimérico y el péptido distinto de anticuerpo se unen con una KD de aproximadamente 10<-4>M, aproximadamente 10<-3>M, aproximadamente 10<-2>M, aproximadamente 10<-1>M, o con una KD que es mayor de aproximadamente 10<-1>M. La interacción péptido-péptido puede ser una interacción estrecha. Una interacción estrecha puede ser una interacción en la que el CAR-ID y el péptido distinto de anticuerpo (o el CAR-ID y el péptido distinto de anticuerpo) se unen con una KD de aproximadamente 10<-5>M, aproximadamente 10<-6>M, aproximadamente 10<-7>M, aproximadamente 10<-8>M, aproximadamente 10<-9>M, aproximadamente 10<-10>M, aproximadamente 10<-11>M o aproximadamente 10<-12>M. El péptido distinto de anticuerpo y/o CAR-ID pueden comprender seleccionarse de una estructura secundaria de una proteína (por ejemplo, hélice alfa, lámina beta), un dominio de proteína, un dominio de enzima, un dominio de dimerización y un dominio de multimerización.

La interacción péptido-péptido puede comprender una interacción péptido-péptido no covalente. El péptido distinto de anticuerpo puede comprender una primera hélice alfa de una proteína, y el CAR-ID puede comprender una segunda hélice alfa de una proteína. La primera hélice alfa y la segunda hélice alfa pueden formar una estructura superenrollada. Por ejemplo, pero sin ser de ningún modo limitativo, el primer péptido puede seleccionarse de uno cualquiera de los péptidos de E/K dados a conocer en Litowski, J. R. (2002) (por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO: 46-44, y 45-46, 47-58), y el segundo péptido puede seleccionarse de cualquier péptido que puede formar una hélice alfa con el primer péptido. El segundo péptido puede ser un péptido de E/K dado a conocer en Litowski (2002) (por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO: 43-44, 45-46, 47-58). La proteína distinta de anticuerpo puede comprender el péptido de K4 (SEQ ID NO: 43) y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender el péptido de E4 (SEQ ID NO: 44). La proteína distinta de anticuerpo puede comprender el péptido de E4 (<s>E<q>ID NO: 44) y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender el péptido de K4 (SEQ ID NO: 43). Las interacciones entre los péptidos de K4 y E4 se describen en Litowski, J. R., y R. S. Hodges. J Biol Chem, 277: 37272-9 (2002) y Woolfson, D. N., Adv Protein Chem, 70: 79-112 (2005). La proteína distinta de anticuerpo puede comprender un péptido de K4 modificado y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido de E4 modificado. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender un péptido de E4 modificado y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido de K4 modificado. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender un péptido de K4 modificado y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender el péptido de E4 (SEQ ID NO: 44). La proteína distinta de anticuerpo puede comprender un péptido de E4 modificado y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido de K4 (SEQ ID NO: 43). La proteína distinta de anticuerpo puede comprender el péptido de K4 (SEQ ID NO: 33) y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido de E4 modificado. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender el péptido de E4 (SEQ ID NO: 44) y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido de K4 modificado. La proteína distinta de anticuerpo puede consistir o consistir esencialmente en un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 43 y la proteína de unión a receptor quimérico puede consistir o consistir esencialmente en un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 44. La proteína distinta de anticuerpo puede consistir o consistir esencialmente en un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 44 y la proteína de unión a receptor quimérico puede consistir o consistir esencialmente en un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 43. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a SEQ ID NO: 43 y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a SEQ ID NO: 44. La proteína distinta de anticuerpo puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a SEQ ID NO: 44 y la proteína de unión a receptor quimérico puede comprender un péptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más de identidad con respecto a SEQ ID NO: 43.

Además, a modo de ejemplo no limitativo, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender una primera hélice alfa de una proteína coronina 1A de ratón, y el CAR-ID puede comprender una segunda hélice alfa de una proteína coronina 1A de ratón. Las interacciones superenrolladas de proteínas coronina 1A de ratón se describen en Kammerer RA,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 102:13891-13896 (2005).

Además, a modo de ejemplo no limitativo, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender un dominio de anclaje (AD) de una proteína de anclaje de cinasa A (AKAP) y el CAR-ID puede comprender un dominio de dimerización y acoplamiento (DDD) de proteína cinasa A dependiente de cAMP. La interacción de AD con DDD, conocida como sistema de acoplamiento y bloqueo, se han descrito en Rossi EA, Goldenberg DM, Chang CH, Bioconjug Chem. Mar 21; 23(3): 309-23 (2012); Rossi EA,et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 2 de mayo; 103(18): 6841-6 (2006); y Backer MV, Patel V, Jehning BT, Backer JM., Bioconjug Chem., julio-agosto; 17(4): 912-9 (2006).

Por tanto, a modo de ejemplo no limitativo, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender un dominio de anclaje (AD1) de una proteína de anclaje de cinasa A y el CAR-ID puede comprender un dominio de dimerización y acoplamiento (DDD1) de proteína cinasa A dependiente de cAMP. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender el DDD1 y el CAR-ID puede comprender el dominio de anclaje (AD1).

La interacción péptido-péptido puede comprender una interacción péptido-péptido covalente. A modo de ejemplo no limitativo, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender un dominio de anclaje (AD2) de una proteína de anclaje de cinasa A y el CAR-ID puede comprender un dominio de dimerización y acoplamiento (DDD2) de proteína cinasa A dependiente de cAMP, en el que el AD2 y el DDD2 se han modificado con cisteínas que forman enlaces disulfuro entre el AD y el DDD. Alternativamente, el péptido distinto de anticuerpo puede comprender el DDD2 y el CAR-ID puede comprender el AD2, en el que el AD2 y el DDD2 se han modificado con cisteínas que forman enlaces disulfuro entre el AD2 y el DDD2. Estos enlaces disulfuro pueden formar una interacción covalente entre el AD2 y el DDD2. Esto puede resultar ventajoso para aumentar la afinidad del péptido distinto de anticuerpo por el CAR-ID, o viceversa.

La célula efectora puede comprender una pluralidad de receptores quiméricos. Dos o más de la pluralidad de receptores quiméricos pueden ser iguales. Dos o más de la pluralidad de receptores quiméricos pueden ser diferentes. Dos o más de la pluralidad de receptores quiméricos pueden comprender, cada uno, un dominio extracelular que comprende un DDD (por ejemplo, DDD1 o d DD2). Los DDD de los dos o más de la pluralidad de receptores quiméricos pueden auto-homo-multimerizarse, para producir DDD multimerizados. Los DDD pueden auto-homo-dimerizarse, para producir DDD dimerizados. Los DDD multimerizados o dimerizados pueden unirse a uno o más AD. Los DDD multimerizados o dimerizados unidos a uno o más AD pueden aumentar la transducción de señales y/o activación de la célula efectora, con respecto a un receptor quimérico que comprende uno o ningún DDD.

El receptor quimérico puede comprender un dominio extracelular, en el que el dominio extracelular comprende el AD. El conmutador puede comprender el DDD. El conmutador puede ser bivalente para el AD porque el DDD se autohomo-dimeriza tras la unión al AD (por ejemplo, véase la figura 17). La auto-homo-dimerización del DDD tras la unión al AD puede aumentar la avidez del conmutador por la célula diana y puede mejorar la sensibilidad del conmutador por la diana. Esto puede ser relevante para células diana con baja densidad (o expresión) de superficie de la molécula de superficie celular.

El conmutador puede comprender el AD y el receptor quimérico puede comprender el DDD (por ejemplo, véase la figura 18) o el conmutador puede comprender el DDD y el receptor quimérico puede comprender el AD, dando como resultado un par de DDD/AD (por ejemplo, véase la figura 17). El par de DDD/Ad puede ser más pequeño que un par de scFcv/péptido resultante de un receptor de antígeno quimérico que comprende un scFv y un conmutador que comprende un péptido, proporcionando un tamaño y geometría al par que son óptimos para la unión del receptor quimérico a la pareja de unión a receptor quimérico y la posterior activación/señalización de receptor quimérico.

La célula efectora de receptor quimérico puede activarse mediante multimerización de múltiples conmutadores de reticulación a múltiples antígenos en la célula diana. El número mínimo de conmutadores para provocar la activación puede ser mayor de dos. Los DDD multimerizados o dimerizados pueden tener una señalización generalmente potenciada porque requiere menos reticulaciones con conmutadores que un receptor de antígeno quimérico canónico (por ejemplo, sin un dominio extracelular dimerizado/multimerizado o porción del mismo) para lograr la activación.

CAR de épsilon

En el presente documento también se dan a conocer receptores de antígenos quiméricos que comprenden: un dominio extracelular que interacciona con un anticuerpo anti-CD3 o fragmento del mismo en el conmutador; un dominio transmembrana; y un dominio intracelular, en los que al menos una porción del dominio transmembrana o al menos una porción del dominio intracelular no se basa en o se deriva de una proteína de CD3. El dominio extracelular puede comprender un dominio extracelular de CD3 o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender un dominio extracelular de CD3 épsilon o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender un dominio extracelular de CD3 delta o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender un dominio extracelular de CD3 gamma o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender un dominio extracelular de CD3 zeta o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender una cadena alfa de dominio extracelular de TCR o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender una pre-cadena alfa de dominio extracelular de TCR o porción del mismo. El dominio extracelular puede comprender una cadena beta de dominio extracelular de TCR o porción del mismo.

VII. Kits, vectores y polinucleótidos

En el presente documento también se dan a conocer kits que comprenden uno o más conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. La divulgación puede proporcionar un kit que comprende un conmutador anti-CD19 dado a conocer en el presente documento que comprende un CAR-ID. La divulgación puede proporcionar un kit que comprende un conmutador anti-CD19 humanizado dado a conocer en el presente documento que comprende un CAR-ID. La divulgación puede proporcionar un kit que comprende un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento que comprende un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento. La divulgación puede proporcionar un kit que comprende un conmutador anti-CD19 dado a conocer en el presente documento que comprende un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento. La divulgación puede proporcionar un kit que comprende un conmutador anti-CD19 humanizado dado a conocer en el presente documento que comprende un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento. También se da a conocer que el kit puede comprender un conmutador de CAR-EC que comprende un resto de direccionamiento seleccionado de un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD123, porciones de unión a antígeno de los anticuerpos anteriormente mencionados, y, opcionalmente, formas humanizadas de los anticuerpos anteriormente mencionados (tal como, por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 humanizados dados a conocer en el presente documento).

También se da a conocer que el kit puede comprender un conmutador de CAR-EC o una composición farmacéutica que comprende un conmutador de este tipo, en el que el conmutador de CAR-EC comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena ligera de conmutador dada a conocer en el presente documento y la cadena pesada comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena pesada de conmutador dada a conocer en el presente documento. Tales secuencias de cadena pesada y/o ligera pueden estar humanizadas. También se da a conocer que el conmutador de CAR-EC comprendido en el kit puede estar humanizado y puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un CAR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). También se da a conocer que la secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. También se da a conocer que el conmutador puede ser un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, que presenta combinaciones de cadena pesada / cadena ligera comprendidas en varios de los conmutadores dados a conocer en el presente documento. También se da a conocer que el conmutador puede ser idéntico a un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, excepto porque el CAR-ID comprendido en el conmutador se modifica para tener una secuencia de estructura I. También se da a conocer que la secuencia de estructura I puede seleccionarse de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, y 154-163. También se da a conocer que el kit puede comprender un único conmutador o una composición farmacéutica que comprende un único conmutador. También se da a conocer que el kit puede comprender una pluralidad de conmutadores o una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de conmutadores.

También se da a conocer que el kit puede comprender dos o más conmutadores. El kit puede comprender tres conmutadores. El kit puede comprender aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 35, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 120, 150, 200, 300, 384, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 conmutadores. El kit puede emplearse para investigación biológica. El kit puede usarse para diagnosticar una enfermedad o un estado. El kit puede usarse para tratar una enfermedad o estado. Los conmutadores del kit pueden usarse con células efectoras dadas a conocer en el presente documento (por ejemplo, CAR-EC) o células<c>AR-T existentes clínicamente usadas o sometidas a prueba. El kit puede comprender una o más células efectoras. La célula efectora puede ser una CAR-EC. La célula efectora puede ser una célula T. La célula T puede expresar uno o más receptores quiméricos. La célula T puede ser una célula CAR-T. La CAR-EC puede unirse al CAR-ID en el conmutador. La CAR-EC puede unirse a un CAR-ID en el conmutador que es un péptido (por ejemplo, un péptido de GCN4 dado a conocer en el presente documento, un péptido de Flag dado a conocer en el presente documento, un péptido de hélice alfa que forma una estructura superenrollada con otro péptido de hélice alfa dado a conocer en el presente documento). La CAR-EC puede unirse a un CAR-ID que es una molécula pequeña (por ejemplo, FITC). La célula CAR-T puede unirse al CAR-ID en el conmutador. La célula CAR-T puede unirse a un CAR-ID en el conmutador que es un péptido (por ejemplo, un péptido de GCN4 o derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento, un péptido de Flag dado a conocer en el presente documento, un péptido de hélice alfa que forma una estructura superenrollada con otro péptido de hélice alfa dado a conocer en el presente documento). La célula CAR-T puede unirse a un CAR-ID que es una molécula pequeña (por ejemplo, FITC).

También se da a conocer que el kit puede comprender un polinucleótido que codifica para uno o más receptores quiméricos (por ejemplo, uno o más receptores quiméricos descritos en el presente documento). El kit puede comprender un polinucleótido que codifica para uno o más receptores de antígenos quiméricos (por ejemplo, uno o más receptores de antígenos quiméricos descritos en el presente documento). El kit puede comprender un vector que comprende un polinucleótido que codifica para uno o más receptores quiméricos. El receptor quimérico puede seleccionarse de cualquiera de los receptores quiméricos dados a conocer en el presente documento. El receptor quimérico puede seleccionarse de cualquiera de los receptores de antígenos quiméricos dados a conocer en el presente documento. El receptor quimérico puede tener cualquier secuencia de CAR dada a conocer en el presente documento. El CAR puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para seres humanos. El CAR puede comprender un dominio extracelular que está humanizado. La humanización puede reducir la inmunogenicidad del CAR para seres humanos al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del dominio extracelular por el conmutador de CAR-EC. El CAR puede ser una versión humanizada de una cualquiera de las secuencias de CAR proporcionadas en la tabla 13. El CAR puede ser una versión humanizada de una cualquiera de SEQ ID NO: 270-289. El CAR puede ser un CAR humanizado que comprende un dominio extracelular que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un CAR-ID de un conmutador de CAR-EC. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar humanizado. El fragmento de anticuerpo puede ser un scFv (por ejemplo, un scFv humanizado). El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena ligera-ligador-cadena pesada. El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena pesada-ligador-cadena ligera. El scFv humanizado puede comprender una secuencia de VH (cadena pesada variable) humanizada con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones particulares, el CAR comprende una estructura seleccionada de los constructos A-H en la figura 24A. También se da a conocer que el CAR puede comprender una estructura según el constructo A, el constructo B o el constructo C en la figura 24. También se da a conocer que el CAR puede seleccionarse de los CAR descritos en la tabla 11. También se da a conocer que el CAR puede seleccionarse de los CAR descritos en la tabla 12. El kit puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican para un conmutador de EC de receptor quimérico dado a conocer en el presente documento o una porción del mismo (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido).

En el presente documento también se dan a conocer vectores y polinucleótidos que codifican para conmutadores y porciones de los mismos, en los que el conmutador comprende un derivado de GCN4 y un resto de direccionamiento de polipéptido (por ejemplo, una proteína de direccionamiento o péptido de direccionamiento). En el presente documento se dan a conocer y vectores y polinucleótidos que codifican para conmutadores humanizados y porciones de los mismos, en los que el conmutador comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento de polipéptido humanizado (por ejemplo, una proteína de direccionamiento o péptido de direccionamiento). En el presente documento se dan a conocer vectores y polinucleótidos que codifican para conmutadores y porciones de los mismos, en los que el conmutador comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento de polipéptido humanizado (por ejemplo, una proteína de direccionamiento o péptido de direccionamiento), en los que el resto de direccionamiento de polipéptido se une a CD19 en una célula diana. En el presente documento se dan a conocer vectores y polinucleótidos que codifican para conmutadores y porciones de los mismos, en los que el conmutador comprende un derivado de GCN4 y un resto de direccionamiento de polipéptido humanizado (por ejemplo, una proteína de direccionamiento o péptido de direccionamiento), en los que el resto de direccionamiento de polipéptido se une a CD19 en una célula diana. Los polinucleótidos pueden ser a Dn (por ejemplo, ADNc). Los polinucleótidos pueden ser ARN. En algunas realizaciones, el polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión a CD19 del mismo. En algunas realizaciones, el CAR- ID es un derivado de péptido de GCN4 dado a conocer en el presente documento. El vector puede comprender una secuencia que codifica para una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 humanizado o el fragmento de unión a CD19 del mismo. El vector puede comprender una secuencia que codifica para una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 humanizado o el fragmento de unión a CD19 del mismo. Los vectores pueden comprender una secuencia que codifica para una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 humanizado o el fragmento de unión a CD19 del mismo y una secuencia que codifica para una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 humanizado o el fragmento de unión a CD19 del mismo. La cadena ligera y la cadena pesada pueden expresarse a partir del mismo vector. La cadena ligera y la cadena pesada pueden expresarse a partir de dos vectores independientes. La cadena pesada puede comprender una secuencia humanizada. La cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada. La cadena pesada y la cadena ligera pueden comprender una secuencia humanizada.

También se da a conocer que los kits pueden proporcionar vectores y polinucleótidos que codifican para receptores quiméricos (por ejemplo, CAR), en los que los CAR comprenden un dominio extracelular que se une a un péptido de un conmutador de CAR-EC. El dominio extracelular puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un CAR-ID de una CAR-EC. El CAR-ID puede ser una molécula pequeña. El CAR-ID puede ser un hapteno. El CAR-ID puede ser FITC o un derivado del mismo. El CAR-ID puede ser un péptido. El CAR-ID puede ser un péptido de GCN4. El CAR-ID puede ser un péptido de GCN4 que no experimenta dimerización. El CAR-ID puede ser un péptido de GCN4 dado a conocer en el presente documento. El CAR-ID puede ser un derivado de péptido de GCN4. El CAR-ID puede comprender una secuencia de estructura I: X1NYHLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son opcionalmente cualquier aminoácido o están ausentes. El CAR-ID puede comprender la secuencia: NYHLEn Ev ARLK (Se Q ID NO: 145). También se da a conocer que el CAR-ID comprende o consiste en una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 139, 154-163.

También se da a conocer que los kits pueden proporcionar vectores y polinucleótidos que codifican para receptores quiméricos, en los que los receptores quiméricos comprenden un dominio extracelular distinto de anticuerpo. El dominio extracelular distinto de anticuerpo puede no comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El dominio extracelular distinto de anticuerpo puede comprender una proteína distinta de anticuerpo. El dominio extracelular distinto de anticuerpo puede comprender un péptido distinto de anticuerpo. En algunas realizaciones polinucleótido puede tener una secuencia seleccionada de Se Q ID NO: 68- 84, 87-90, 104, y 181-183.

Los vectores que comprenden secuencias que codifican para receptores quiméricos y/o conmutadores de células efectoras de receptor quimérico y porciones de los mismos, dados a conocer en el presente documento, pueden seleccionarse de cualquier vector de expresión comercialmente disponible. El vector de expresión puede ser un vector de expresión procariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión eucariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión de mamífero. El vector de expresión puede ser un vector de expresión viral. El vector de expresión puede tener un promotor constitutivo para la expresión constitutiva de las secuencias que codifican para receptor quimérico y/o conmutador. El vector de expresión puede tener un promotor inducible para la expresión condicional de las secuencias que codifican para receptor quimérico y/o conmutador.

También se da a conocer que el kit puede comprender (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de un péptido de GCN4 de factor de transcripción de levadura; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR anti-GCN4. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El GCN4 puede comprender una secuencia de estructura I: X1NYHLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son todos cualquier aminoácido o están ausentes. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el uso del kit comprende el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de un péptido de factor de transcripción de levadura (por ejemplo, un péptido de GCN4 dado a conocer en el presente documento); y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR antiGCN4, en el que el tratamiento da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

También se da a conocer que el kit comprende (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de Flag; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR anti-péptido de Flag. El péptido de Flag puede comprender una cualquiera de las siguientes secuencias: DYKDDDDK y DYKDDDDKP. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. También se da a conocer que el uso del kit puede comprender el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de Flag; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR anti-Flag, en el que el tratamiento da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

También se da a conocer que el kit puede comprender (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende FITC; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una<c>AR-EC que expresa un CAR anti-péptido de FITC. El FITC puede conjugarse al anticuerpo FMC63 humanizado de manera no específica. El FITC puede conjugarse al anticuerpo FMC63 humanizado de manera específica del sitio. La conjugación específica del sitio puede ser a un aminoácido artificial comprendido en el anticuerpo FMC63 humanizado. La conjugación puede ser mediante un ligador que une el anticuerpo FMC63 humanizado al FITC. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el uso del kit comprende el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un FITC; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una<c>AR-EC que expresa un CAR anti-FITC, en el que el tratamiento da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

También se da a conocer que el kit puede comprender (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de K4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) un CAR que comprende un dominio extracelular de E4. El péptido de K4 puede comprender la secuencia de aminoácidos: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE. El péptido de E4 puede comprender la secuencia de aminoácidos: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el uso del kit comprende el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de K4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR que comprende un dominio extracelular de E4, en el que el tratamiento da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

También se da a conocer que el kit puede comprender (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de E4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) un CAR que comprende un dominio extracelular de K4. El péptido de K4 puede comprender la secuencia de aminoácidos: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE. El péptido de E4 puede comprender la secuencia de aminoácidos: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena ligera un anticuerpo FMC63 humanizado. La secuencia de cadena ligera puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un Fab de un anticuerpo FMC63 humanizado. El anticuerpo FMC63 humanizado o fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo FMC63 humanizado de longitud completa o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el uso del kit comprende el tratamiento conjunto de un sujeto con (i) un conmutador de CAR-EC que comprende (a) un CAR-ID que comprende un péptido de E4; y (b) un anticuerpo FMC63 humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos FMC63 humanizados descritos en el presente documento) y (ii) una CAR-EC que expresa un CAR que comprende un dominio extracelular de K4, en el que el tratamiento da como resultado citotoxicidad mediada por conmutador de una célula diana que expresa CD19.

VIII. Uso terapéutico

En el presente documento se dan a conocer conmutadores de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) y una primera CAR-EC que expresa un CAR para su uso en métodos para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar dicho conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el conmutador de CAR-EC comprende: un CAR-ID y un resto de direccionamiento. Tales métodos pueden comprender además administrar una CAR-EC que expresa un CAR que es complementario al conmutador de CAR-EC. El conmutador de CAR-EC puede estar humanizado.

También se dan a conocer métodos para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el conmutador de CAR-EC comprende: un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento y un resto de direccionamiento (un “conmutador de GCN4”). Tales métodos pueden comprender además administrar una CAR-EC que expresa un CAR que es complementario al conmutador de GCN4. El conmutador de CAR-EC puede estar humanizado.

También se dan a conocer métodos, plataformas y kits para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el conmutador de CAR-EC comprende: un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento y un resto de direccionamiento que comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a CD19 del mismo (un “conmutador de GCN4 anti-CD19”). La porción de unión a CD19 del anticuerpo anti-CD19 puede ser un scFv. El conmutador de GCN4 anti-CD19 puede ser un conmutador de LCNT. El conmutador de GCN4 anti-CD19 puede comprender una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena ligera de conmutador dada a conocer en el presente documento y la cadena pesada comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena pesada de conmutador dada a conocer en el presente documento. Tales secuencias de cadena pesada y/o ligera pueden estar humanizadas.

En el presente documento se dan a conocer métodos, plataformas y kits para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el conmutador de CAR-EC comprende: un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento y un resto de direccionamiento que comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a CD19 del mismo. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC está humanizado y comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un CAR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). En realizaciones particulares, la secuencia de cadena ligera comprende una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27 34 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. En realizaciones particulares, el conmutador es un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, que presenta combinaciones de cadena pesada / cadena ligera comprendidas en varios de los conmutadores dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el conmutador es idéntico a un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, excepto porque el CAR-ID comprendido en el conmutador está modificado para tener una secuencia de estructura I. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura I se selecciona de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, y 154-163. Tales métodos pueden comprender además administrar una CAR-EC que expresa un CAR que es complementario al conmutador de GCN4 anti-CD19. El CAR puede estar humanizado.

En el presente documento se dan a conocer métodos, plataformas y kits para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el conmutador de CAR-EC comprende: un CAR-ID y un resto de direccionamiento que comprende o consiste en un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a CD19 del mismo (un “conmutador de CAR-EC anti-CD19”). La porción de unión a CD19 del anticuerpo anti-CD19 puede ser un scFv. El conmutador de CAR-EC anti-CD19 puede ser un conmutador de LCNT que comprende un CAR-ID N-terminal. El conmutador de CAR-EC anti-CD19 puede comprender una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena ligera de conmutador dada a conocer en el presente documento y la cadena pesada comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena pesada de conmutador dada a conocer en el presente documento. Tales secuencias de cadena pesada y/o ligera pueden estar humanizadas. Tales métodos pueden comprender además administrar una CAR-EC que expresa un CAR que es complementario al conmutador de CAR-EC anti-CD19. El CAR puede estar humanizado.

En el presente documento se dan a conocer métodos de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar uno cualquiera de los conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. En el presente documento se dan a conocer métodos de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar uno cualquiera de los conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento y administrar además una CAR-EC que comprende un CAR que es complementario al conmutador de CAR-EC (es decir, el CAR comprende un dominio extracelular con afinidad de unión por el CAR-ID comprendido en el conmutador de CAR-EC complementario).

En cualquiera de los métodos dados a conocer en el presente documento de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, el CAR puede ser un CAR dado a conocer en el presente documento. El CAR puede tener cualquier secuencia de CAR dada a conocer en el presente documento. El CAR puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para seres humanos. El CAR puede comprender un dominio extracelular que está humanizado. La humanización puede reducir la inmunogenicidad del CAR para seres humanos al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del dominio extracelular por el conmutador de CAR-EC. El CAR puede ser una versión humanizada de una cualquiera de las secuencias de CAR proporcionadas en la tabla 13 o puede ser una versión humanizada de una cualquiera de SEQ ID NO: 270-289. El Ca R puede ser un CAR humanizado que comprende un dominio extracelular que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un CAR-ID de un conmutador de CAR-EC. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar humanizado. El fragmento de anticuerpo puede ser un scFv (por ejemplo, un scFv humanizado). El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena ligera-ligador-cadena pesada. El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena pesada-ligador-cadena ligera. El scFv humanizado puede comprender una secuencia de VH (cadena pesada variable) humanizada con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de inmunoglobulina humana. El scFv humanizado puede comprender una secuencia de VL (cadena ligera variable) humanizada con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de inmunoglobulina humana. También se da a conocer que el CAR comprende una estructura seleccionada de los constructos A-H en la figura 24A. En determinadas realizaciones, el CAR comprende una estructura según el constructo A, el constructo B o el constructo C en la figura 24. En determinadas realizaciones, el CAR se selecciona de los CAR descritos en la tabla 11. En determinadas realizaciones particulares, el CAR se selecciona de los CAR descritos en la tabla 12. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del CAR comprende una secuencia de scFv humanizada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423.

En cualquiera de los métodos dados a conocer en el presente documento de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, la enfermedad o estado puede ser cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a CD19 del mismo, comprende una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a CD19 del mismo, comprende un anticuerpo FMC63 humanizado, o porción de unión a CD19 del mismo. En algunas realizaciones, la secuencia de cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a CD19 del mismo, puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 17-25 o una cualquiera de SEQ ID NO: 27-35 y, alternativa o adicionalmente, la secuencia de cadena pesada puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15.

Los métodos dados a conocer en el presente documento de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita pueden comprender administrar una célula CAR-EC y uno o más conmutadores de CAR-EC. Los métodos pueden comprender administrar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 35, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 120, 150, 200, 300, 384, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más conmutadores de CAR-EC. Los métodos pueden comprender administrar dos o más conmutadores de CAR-EC. Los dos o más conmutadores de CAR-EC pueden comprender el mismo CAR-ID. Los dos o más conmutadores de CAR-EC pueden comprender el mismo resto de direccionamiento anti-CD19 humanizado. Los dos o más conmutadores de CAR-EC pueden comprender uno o más CAR-ID diferentes. Los dos o más conmutadores de CAR-EC pueden comprender uno o más restos de direccionamiento anti-CD19 humanizados diferentes. Los métodos pueden comprender administrar una pluralidad de células CAR-EC y uno o más conmutadores de CAR-EC. Administrar la célula CAR-EC puede comprender la administración de CAR-EC intravenosa. Administrar la célula CAR-EC puede comprender la administración de CAR-EC intraperitoneal. Administrar la célula CAR-EC puede comprender la administración de CAR-EC intravenosa y la administración de CAR-EC intraperitoneal. La administración de la célula CAR-EC puede producirse una vez. La administración de la célula CAR-EC puede producirse más de una vez (por ejemplo, inyección repetida). Las CAR-EC pueden clasificarse para enriquecer una población de memoria de CAR-EC antes de administrar las CAR-EC. Las CAR-EC pueden someterse a estimulación iterativa para enriquecer la población de memoria, en contraposición a la estimulación recursiva que fomenta el agotamiento, proporcionando un fenotipo persistente de larga duración. Este fundamento se basa en infecciones agudas naturales con células de memoria de larga duración enriquecidas a través de una fase de contracción de 1-2 semanas de duración que se produce tras haberse eliminado la exposición. De manera similar, el sistema de células sCAR-T en el que células transferidas de manera adoptiva se someten a reposo tras la estimulación puede resumir más de cerca una duración fisiológica de activación de células T.

En el presente documento se dan a conocer métodos de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el conmutador de CAR-EC comprende: un dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID); y un resto de direccionamiento humanizado que se une a CD19 en una diana. El CAR-ID, como ejemplo no limitativo, puede seleccionarse de una etiqueta FLAG®, un factor de transcripción de levadura GCN4 (por ejemplo, GCN4 de 7p14p, un péptido diana hidrófilo (HTP), un péptido que forma una hélice alfa. El resto de direccionamiento, como ejemplo no limitativo, puede seleccionarse de cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 humanizados dados a conocer en el presente documento.

Los métodos pueden comprender administrar una o más células efectoras de receptor de antígeno quimérico a un sujeto que lo necesita y después administrar uno o más conmutadores de CAR-EC a un sujeto que lo necesita. La cantidad o dosis de conmutador de CAR-EC puede afectar a la magnitud de las células efectoras de receptor de antígeno quimérico hacia las células diana, por tanto la cantidad o dosis del conmutador de CAR-EC puede ajustarse para un efecto deseado. Por ejemplo, pueden seleccionarse tumores como diana mediante ajuste de la dosis de conmutador de CAR-EC para lograr un índice terapéutico adecuado. La respuesta puede ajustarse a “activada” para evitar acontecimientos de CRS (síndrome de liberación de citocinas) y TLS (síndrome de lisis tumoral), proporcionando terapia personalizada. Además, la administración de un conmutador puede terminarse en caso de un acontecimiento adverso, control de actividad de células CAR-EC, ajuste de reactividad específica de diana inespecífica de tumor o reactividad inespecífica de diana, eliminación de síndrome de lisis tumoral (TLS), o atenuación de síndrome de liberación de citocinas (CRS). La cantidad o dosis puede empezar a un nivel durante un periodo de tiempo especificado y después la cantidad o dosis puede aumentarse o reducirse hasta un segundo nivel durante un segundo periodo de tiempo especificado. Por ejemplo, la cantidad o dosis inicial del conmutador de CAR-EC puede ser la dosis más baja necesaria para eliminar el tumor. Entonces puede aumentarse la cantidad o dosis del conmutador de CAR-EC hasta una dosis más grande con el fin de eliminar cualquier célula tumoral restante. Los métodos pueden comprender terminar la administración del conmutador de CAR-EC una vez que se eliminan las células tumorales. Los métodos pueden comprender volver a administrar el conmutador de CAR-EC si vuelven a producirse las células tumorales en el paciente o si el paciente experimenta recidiva

Los métodos pueden comprender ajustar el conmutador de CAR-EC para un efecto deseado. Ajustar el conmutador de CAR-EC puede permitir discriminación de densidad de antígeno. Por ejemplo, la reactividad específica de diana, inespecífica de tumor, mortal para células CAR-T dirigidas a Her2 frente a bajos niveles de expresión de Her2 en el pulmón ha moderado la aplicación de células CAR-T a tumores sólidos en la clínica. El uso de un conmutador basado en Fab que se espera que tenga una semivida de aproximadamente 10h en el ser humano permite una reducción más rápida de la actividad que moléculas basadas en IgG de larga duración. Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender ajustar un conmutador hasta un nivel óptimo en el que la actividad de conmutador puede verse afectada por la densidad del antígeno diana en la célula diana, discriminando o distinguiendo de ese modo el antígeno diana (y la actividad de conmutador) en células cancerosas con respecto al antígeno diana en tejido sano. En la clínica, esto puede usarse para ajustar la terapia a un índice terapéutico apropiado. Adicionalmente, puede ser posible, en pacientes, separar la infusión de células sCAR-T de la activación mediante la administración del conmutador únicamente después de que las células sCAR-T transferidas de manera adoptiva hayan despejado un tejido, mitigando por tanto posibles toxicidades para el tejido. Por ejemplo, estudios han mostrado que células T citotóxicas transferidas se acumulan inmediatamente en el pulmón, pero la acumulación se despeja a lo largo de 72 horas. Una ventaja de las células sCAR-T es que pueden transferirse y puede retrasarse la dosis de conmutador hasta que las células sCAR-T han despejado el pulmón, tiempo durante el cual las células sCAR-T son inertes. Una vez despejadas, puede administrarse el conmutador para activar las sCAR-T tras la unión del conmutador al CAR y al antígeno diana. Un experto en la técnica entenderá fácilmente cómo este concepto se aplicará a otros antígenos además de Her2 que se expresan en células a densidades variables.

Los métodos pueden comprender administrar una o más células efectoras de receptor de antígeno quimérico. Los métodos pueden comprender administrar una o más células T. La una o más células efectoras pueden seleccionarse de una célula T virgen, una célula T de célula madre de memoria, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora, una célula T cooperadora, una célula T CD4+, una célula T CD8+ (célula T citotóxica), una célula T CD8/CD4+, una célula T ap, una célula T<y>§, una célula T linfocítica natural, un linfocito citolítico natural, un macrófago.

El conmutador de CAR-EC puede tener un efecto terapéutico que depende al menos parcialmente de poner una célula efectora en proximidad a una célula diana. El efecto terapéutico sobre la indicación pretendida del conmutador de CAR-EC puede deberse al menos parcialmente a que el conmutador de CAR-EC reclute una célula efectora para la célula diana. El efecto terapéutico sobre la indicación pretendida del conmutador de CAR-EC puede deberse predominantemente a que el conmutador de CAR-EC reclute una célula efectora para la célula diana. El efecto terapéutico del conmutador de CAR-EC puede depender al menos parcialmente de la estimulación de una respuesta inmunitaria en la célula CAR-EC.

La administración del conmutador de CAR-EC puede no tener ningún efecto terapéutico sin la administración adicional de una célula efectora. El conmutador de CAR-EC puede no tener un efecto terapéutico significativo, deseable y/o pretendido sin la administración adicional de una célula efectora. El conmutador de CAR-EC puede no tener ningún efecto terapéutico hacia una indicación pretendida de la plataforma de CAR-EC sin la administración adicional de una célula efectora. Una porción o componente del conmutador de CAR-EC (por ejemplo, CAR-ID o resto de direccionamiento) puede no tener un efecto terapéutico hacia la indicación pretendida del conmutador de CAR-EC sin conjugarse a una segunda porción o componente del conmutador de CAR-EC (por ejemplo, CAR-ID o resto de direccionamiento). La dosis de una porción o componente del conmutador de CAR-EC (por ejemplo, CAR-ID o resto de direccionamiento) cuando se administra como parte de la plataforma de CAR-EC para proporcionar un efecto terapéutico puede no tener un efecto terapéutico cuando la porción o componente del conmutador de CAR-EC se administra por sí solo a esa dosis. Puede no pretenderse que la porción o componente del conmutador de CAR-EC tenga ningún efecto terapéutico además de reclutar la célula T para la célula diana. La administración de la porción o componente del conmutador de CAR-EC por sí solo puede tener un efecto terapéutico en la célula diana, en el que el efecto terapéutico es despreciable con respecto al efecto terapéutico de administrar el conmutador de CAR-EC y la célula CAR-EC. La administración de la porción o componente del conmutador de CAR-EC puede tener un efecto terapéutico en la célula diana, en el que el efecto terapéutico es menor que el efecto terapéutico de administrar el conmutador de CAR-EC y la célula CAR-EC.

En el presente documento se dan a conocer usos de conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita. En el presente documento se dan a conocer además usos de conmutadores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

En el presente documento se da a conocer el uso de un conmutador que comprende un antígeno peptídico que se une a un CAR (CAR-ID) en una célula efectora; y un polipéptido de direccionamiento que se une a un antígeno en una diana para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita. En el presente documento se da a conocer además el uso de un conmutador que comprende un antígeno peptídico (CAR-ID) que se une a un CAR en una célula efectora, en el que el CAR-ID; y un polipéptido de direccionamiento que se une a un antígeno en una diana en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

En el presente documento se da a conocer el uso de un conmutador de CAR-EC que comprende un CAR-ID, en el que el CAR-ID comprende un péptido de baja inmunogenicidad (por ejemplo, FLAg ) o derivado del mismo, y un polipéptido de direccionamiento, en el que el polipéptido de direccionamiento comprende un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo; y una célula efectora que comprende un CAR, en el que el CAR comprende un anticuerpo antipéptido de baja inmunogenicidad, en el que el anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo se une a CD19 en una célula B, para tratar un mieloma múltiple. De manera notable, ningún sistema de control basado en anticuerpo anteriormente notificado ha notificado la selección como diana de CD19in vivo.Tal como se notifica en el presente documento, las plataformas de células sCAR-T pudieron eliminar Nalm-6Luc/GFPin vivocon una eficacia comparable a CART-19 convencional. La eficacia se basaba en una participación de célula diana óptima. Más específicamente, diferencias en la actividad líticain vitrode diseños de conmutadores/bisagras que generalmente eran de menos de 10 veces en CE50 fueron decisivas para la eliminación tumoralin vivo.

En el presente documento se da a conocer el uso de un conmutador de CAR-EC que comprende un CAR-ID, en el que el CAR-ID comprende un GCN4 de factor de transcripción de levadura o derivado del mismo y un polipéptido de direccionamiento, en el que el polipéptido de direccionamiento comprende un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo; y una célula efectora que comprende un CAR, en el que el CAR comprende un anticuerpo anti-GCN4, en el que el anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo se une a CD19 en un linfoblasto, linfocito o célula B, para tratar una leucemia linfoblástica aguda, una leucemia linfocítica crónica o un linfoma de células B.

La enfermedad o estado puede ser un trastorno de proliferación celular. El trastorno de proliferación celular puede seleccionarse de un tumor sólido, un linfoma, una leucemia y un liposarcoma. El trastorno de proliferación celular puede ser agudo, crónico, recurrente, no responder al tratamiento, acelerado, en remisión, de estadio I, de estadio II, de estadio III, de estadio IV, juvenil o de adulto. El trastorno de proliferación celular puede seleccionarse de leucemia mielógena, leucemia linfoblástica, leucemia mieloide, una leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica, leucemia neutrofílica, síndrome mielodisplásico, linfoma de células B, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes, linfoma de células mixtas, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Hodgkin, linfoma linfocítico pequeño recurrente, leucemia de células pilosas, mieloma múltiple, leucemia basofílica, leucemia eosinofílica, leucemia megacarioblástica, leucemia monoblástica, leucemia monocítica, eritroleucemia, leucemia eritroide y carcinoma hepatocelular. El trastorno de proliferación celular puede comprender una neoplasia hematológica. La neoplasia hematológica puede comprender una neoplasia de células B. El trastorno de proliferación celular puede comprender una leucemia linfocítica crónica. El trastorno de proliferación celular puede comprender una leucemia linfoblástica aguda. El trastorno de proliferación celular puede comprender un linfoma de Burkitt positivo para CD19.

La enfermedad o estado puede ser un cáncer, una infección patógena, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria o trastorno genético.

En algunos casos, la una o más enfermedades comprenden un cáncer. El cáncer puede comprender un cáncer recurrente y/o que no responde al tratamiento. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, sarcomas, carcinomas, linfomas o leucemias.

El cáncer puede comprender un cáncer neuroendocrino. El cáncer puede comprender un cáncer pancreático. El cáncer puede comprender un cáncer pancreático exocrino. El cáncer puede comprender un cáncer de tiroides. El cáncer de tiroides puede comprender un cáncer de tiroides medular. El cáncer puede comprender un cáncer de próstata.

El cáncer puede comprender un cáncer epitelial. El cáncer puede comprender un cáncer de mama. El cáncer puede comprender un cáncer endometrial. El cáncer puede comprender un cáncer de ovarios. El cáncer de ovarios puede comprender un cáncer de ovarios estromal. El cáncer puede comprender un cáncer de cuello uterino.

El cáncer puede comprender un cáncer de piel. El cáncer de piel puede comprender un cáncer de piel neo-angiogénico. El cáncer de piel puede comprender un melanoma.

El cáncer puede comprender un cáncer de riñón.

El cáncer puede comprender un cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede comprender un cáncer de pulmón de células pequeñas. El cáncer de pulmón puede comprender un cáncer de pulmón de células no pequeñas.

El cáncer puede comprender un cáncer colorrectal. El cáncer puede comprender un cáncer gástrico. El cáncer puede comprender un cáncer de colon.

El cáncer puede comprender un cáncer de cerebro. El cáncer de cerebro puede comprender un tumor de cerebro. El cáncer puede comprender un glioblastoma. El cáncer puede comprender un astrocitoma.

El cáncer puede comprender un cáncer de sangre. El cáncer de sangre puede comprender una leucemia. La leucemia puede comprender una leucemia mieloide. El cáncer puede comprender un linfoma. El linfoma puede comprender un linfoma no Hodgkin.

El cáncer puede comprender un sarcoma. El sarcoma puede comprender un sarcoma de Ewing.

Los sarcomas son cánceres del hueso, cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos u otro tejido conjuntivo o de soporte. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, cáncer de hueso, fibrosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, schwannoma vestibular bilateral, osteosarcoma, sarcomas de tejidos blandos (por ejemplo, sarcoma alveolar de partes blandas, angiosarcoma, cistosarcoma filoides, dermatofibrosarcoma, tumor desmoide, sarcoma epitelioide, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, linfosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma y sarcoma sinovial).

Los carcinomas son cánceres que comienzan en las células epiteliales, que son células que cubren la superficie del cuerpo, producen hormonas y constituyen glándulas. A modo de ejemplo no limitativo, los carcinomas incluyen cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vesícula, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de ovarios, cáncer de cerebro, cáncer vaginal, cáncer de vulva, cáncer uterino, cáncer bucal, cáncer de pene, cáncer testicular, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer estromal gastrointestinal, adenocarcinoma, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de la región anal, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, cáncer de la uretra, cáncer de la pelvis renal, cáncer del uréter, cáncer de endometrio, cáncer del cuello uterino, cáncer de la glándula pituitaria, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma del SNC primario, glioma del tronco encefálico, y tumores del eje espinal. En algunos casos, el cáncer es un cáncer de piel, tal como un carcinoma de células basales, escamoso, melanoma, distinto de melanoma, o queratosis actínica (solar).

En algunos casos, el cáncer es un cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede empezar en las vías respiratorias que se bifurcan de la tráquea para alimentar a los pulmones (bronquios) o los pequeños sacos de aire del pulmón (los alveolos). Los cánceres de pulmón incluyen carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de pulmón de células pequeñas y mesoteliomia. Los ejemplos de NSCLC incluyen carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. El mesotelioma puede ser un tumor canceroso del revestimiento del pulmón y la cavidad torácica (pleura) o del revestimiento del abdomen (peritoneo). El mesotelioma puede deberse a exposición a amianto. El cáncer puede ser un cáncer de cerebro, tal como un glioblastoma.

Alternativamente, el cáncer puede ser un tumor del sistema nervioso central (SNC). Los tumores del SNC pueden clasificarse como gliomas o distintos de gliomas. El glioma puede ser glioma maligno, glioma de grado alto, glioma pontino intrínseco difuso. Los ejemplos de gliomas incluyen astrocitomas, oligodendrogliomas (o mezclas de elementos de oligodendroglioma y de astocitoma), y ependimomas. Los astrocitomas incluyen, pero no se limitan a, astrocitomas de grado bajo, astrocitomas anaplásicos, glioblastoma multiforme, astrocitoma pilocítico, xantoastrocitoma pleomórfico, y astrocitoma de células gigantes subependimario. Los oligodendrogliomas incluyen oligodendrogliomas de grado bajo (u oligoastrocitomas) y oligodendriogliomas anaplásicos. Los distintos de gliomas incluyen meningiomas, adenomas pituitarios, linternas del SNC primarios y meduloblastomas. En algunos casos, el cáncer es un meningioma.

La leucemia puede ser una leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, o leucemia mielocítica crónica. Los tipos adicionales de leucemias incluyen leucemia de células pilosas, leucemia mielomonocítica crónica, y leucemia mielomonocítica juvenil.

Los linfomas son cánceres de los linfocitos y pueden desarrollarse a partir de linfocitos o bien B o bien T. Los dos tipos principales de linfoma son linfoma de Hodgkin, anteriormente conocido como enfermedad de Hodgkin, y linfoma no Hodgkin. El linfoma de Hodgkin está marcado por la presencia de la célula de Reed-Sternberg. Los linfomas no Hodgkin son todos ellos linfomas que no son linfoma de Hodgkin. Los linfomas no Hodgkin pueden ser linfomas indolentes y linfomas agresivos. Los linfomas no Hodgkin incluyen, pero no se limitan a, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa (MALT), linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes mediastinal, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B de la zona marginal nodal (NMZL), linfoma de la zona marginal esplénica (SMZL), linfoma de células B de la zona marginal extranodal, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusión primario, y granulomatosis linfomatoide.

El cáncer puede comprender un tumor sólido. El cáncer puede comprender un sarcoma. El cáncer puede seleccionarse de un grupo que consiste en un cáncer de vesícula, un cáncer de mama, un cáncer de colon, un cáncer rectal, un cáncer endometrial, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, melanoma, un mieloma, un cáncer de tiroides, un cáncer pancreático, un glioma, un glioma maligno del cerebro, un glioblastoma, un cáncer de ovarios y un cáncer de próstata. El cáncer puede tener una expresión de antígeno no uniforme. El cáncer puede tener una expresión de antígeno modulada. El antígeno puede ser un antígeno de superficie. El cáncer puede no comprender un mieloma. El cáncer puede no comprender un melanoma. El cáncer puede no comprender un cáncer de colon. El cáncer puede ser leucemia linfoblástica aguda (ALL). El cáncer puede ser ALL con recidiva. El cáncer puede ser ALL que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser ALL con recidiva que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser leucemia linfocítica crónica (CLL). El cáncer puede ser CLL con recidiva. El cáncer puede ser CLL que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser CLL con recidiva que no responde al tratamiento.

El cáncer puede comprender un cáncer de mama. El cáncer de mama puede ser cáncer de mama triple positivo (positivo para receptor de estrógenos, receptor de progesterona y Her2). El cáncer de mama puede ser cáncer de mama triple negativo (negativo para receptor de estrógenos, receptor de progesterona y Her2). El cáncer de mama puede ser positivo para receptor de estrógenos. El cáncer de mama puede ser negativo para receptor de estrógenos. El cáncer de mama puede ser positivo para receptor de progesterona. El cáncer de mama puede ser negativo para receptor de progesterona. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama negativo para Her2. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama con baja expresión de Her2. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama positivo para Her2. Las líneas celulares que expresan Her2 se han caracterizado bien con respecto a la densidad de antígeno, reflejando la caracterización de inmunohistoquímica clínica que clasifica los tumores malignos como 0 (<20.000 antígenos de Her2 por célula), 1+ (100.000 antígenos de Her2 por célula), 2+ (500.000 antígenos de Her2 por célula), y 3+ (>2.000.000 antígenos de Her2 por célula). La presente invención proporciona métodos de tratamiento de cánceres de mama de estas clasificaciones. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her2 0. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her2 1+. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her22+. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her23+.

La enfermedad o estado puede ser una infección patógena. Las infecciones patógenas pueden estar provocadas por uno o más patógenos. En algunos casos, el patógeno es una bacteria, hongo, virus o protozoo.

Los patógenos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a:Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio,oYersinia.En algunos casos, la enfermedad o estado provocado por el patógeno es tuberculosis y la muestra heterogénea comprende moléculas foráneas derivadas de la bacteriaMycobacterium tuberculosisy moléculas derivadas del sujeto. En algunos casos, la enfermedad o estado que está provocado por una bacteria es tuberculosis, neumonía, que puede estar provocada por bacterias tales comoStreptococcusyPseudomonas, una enfermedad transmitida por alimentos, que puede estar provocada por bacterias tales comoShigella, CampylobacterySalmonella,y una infección tal como tétanos, fiebre tifoidea, difteria, sífilis y lepra. La enfermedad o estado puede ser vaginosis bacteriana, una enfermedad de la vagina provocada por un desequilibrio de la flora bacteriana que se produce de manera natural. Alternativamente, la enfermedad o estado es una meningitis bacteriana, una inflamación bacteriana de las meninges (por ejemplo, las membranas protectoras que cubren el cerebro y la médula espinal). Otras enfermedades o estados provocados por bacterias incluyen, pero no se limitan a, neumonía bacteriana, una infección del tracto urinario, gastroenteritis bacteriana e infección de la piel bacteriana. Los ejemplos de infecciones de la piel bacterianas incluyen, pero no se limitan a, impétigo que puede estar provocado porStaphylococcus aureusoStreptococcus pyogenes;erisipela que puede estar provocada por una infección bacteriana por estreptococos de la epidermis profunda con dispersión linfática; y celulitis que puede estar provocada por la flora de la piel normal o por bacterias exógenas.

El patógeno puede ser un hongo, tal como,Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis,yStachybotrys.Los ejemplos de enfermedades o estados provocados por un hongo incluyen, pero no se limitan a, tiña inguinal, infección por levadura, dermatofitosis y pie de atleta.

El patógeno puede ser un virus. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a, adenovirus, virus de Coxsackie, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, B y C), virus del herpes simple (tipo 1 y 2), citomegalovirus, virus del herpes, VIH, virus influenza, virus del sarampión, virus de las paperas, papilomavirus, virus parainfluenza, poliovirus, virus sincitial respiratorio, virus de la rubeola, y virus varicela-zóster. Los ejemplos de enfermedades o estados provocados por virus incluyen, pero no se limitan a, resfriado, gripe, hepatitis, SIDA, varicela, rubeola, paperas, sarampión, verrugas y poliomielitis.

El patógeno puede ser un protozoo, tal comoAcanthamoeba(por ejemplo,A. astronyxis, A. castellanii, A. culbertsoni, A. hatchetti, A. polyphaga, A. rhysodes, A. healyi, A. divionensis), Brachiola(por ejemplo,B connori, B. vesicularum), Cryptosporidium(por ejemplo,C. parvum), Cyclospora(por ejemplo,C. cayetanensis), Encephalitozoon(por ejemplo,E. cuniculi, E. hellem, E. intestinalis), Entamoeba(por ejemplo,E. histolytica), Enterocytozoon(por ejemplo,E. bieneusi), Giardia(por ejemplo,G. Lamblia), Isospora(por ejemplo,I. belli), Microsporidium(por ejemplo,M. africanum, M. ceylonensis), Naegleria(por ejemplo,N. fowleri), Nosema(por ejemplo,N. algerae, N. ocularum), Pleistophora, Trachipleistophora(por ejemplo,T. anthropophthera, T. hominis),yVittaforma(por ejemplo,V. corneae).

La enfermedad o estado puede ser una enfermedad autoinmunitaria o enfermedad relacionada con el sistema autoinmunitario. Un trastorno autoinmunitario puede ser un mal funcionamiento del sistema inmunitario del organismo que provoca que el organismo ataque a sus propios tejidos. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípidos (APS), anemia aplásica autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, fasciitis eosinófila, eritema nudoso, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía de IgA, artritis juvenil, diabetes, diabetes juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, lupus (SLE), enfermedad mixta del tejido conjuntivo (MCTD), esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, poliarteritis nudosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarios de tipo I, II y III, polimialgia reumática, polimiositis, psoriasis, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunidad espermática y testicular, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitiligo y granulomatosis de Wegener.

La enfermedad o estado puede ser una enfermedad inflamatoria. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, alveolitis, amiloidosis, angeítis, espondilitis anquilosante, necrosis avascular, enfermedad de Basedow, parálisis de Bell, bursitis, síndrome del túnel carpiano, enfermedad celíaca, colangitis, condromalacia rotuliana, hepatitis activa crónica, síndrome de fatiga crónica, síndrome de Cogan, displasia de cadera congénita, costocondritis, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, tendinitis de De Quervain, artritis asociada con diabetes, hiperostosis esquelética idiopática difusa, lupus discoide, síndrome de Ehlers-Danlos, fiebre del Mediterráneo familiar, fascitis, fibrositis/fibromialgia, hombro congelado, quistes de ganglios, arteritis de células gigantes, gota, enfermedad de Graves, síndromes de enfermedad reumática asociada con VIH, artritis asociada con hiperparatiroidismo, artritis infecciosa, síndrome del intestino inflamatorio/síndrome del intestino irritable, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Lyme, síndrome de Marfan, enfermedad de Mikulicz, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, síndrome de dolor miofascial, osteoartritis, osteomalacia, osteoporosis y osteoporosis inducida por corticosteroides, enfermedad de Paget, reumatismo palindrómico, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Plummer, polimialgia reumática, polimiositis, pseudogota, artritis psoriásica, fenómeno/síndrome de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, ciática (radiculopatía lumbar), esclerodermia, escorbuto, artritis de células falciformes, síndrome de Sjogren, estenosis espinal, espondilolistesis, enfermedad de Still, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Takayasu (pulso débil), tendinitis, codo de tenista / codo de golfista, artritis asociada con la tiroides, dedo en gatillo, colitis ulcerosa, granulomatosis de Wegener, y enfermedad de Whipple.

Los métodos de tratamiento dados a conocer en el presente documento pueden comprender actividad inespecífica de diana tal como se mide mediante niveles de citocinas. El método puede reducir la actividad inespecífica de diana, tal como se mide mediante niveles de citocinas, en comparación con otras terapias de CAR-EC. El método puede reducir la actividad inespecífica de diana tal como se mide mediante niveles de interferón gamma. Otras actividades inespecíficas de diana que pueden reducirse incluyen linfopenia tóxica, citolisis mortal de dianas de tumor sólido e hipogammaglobulinemia crónica para dianas hematológicas. Los métodos de tratamiento y composiciones dados a conocer en el presente documento pueden usarse para tratar un cáncer que comprende aplasia de células B mediada por CD19. Los métodos y composiciones pueden minimizar la aplasia de células B mediada por CD19. El método puede evitar la aplasia de células B a largo plazo.

Las plataformas de CAR-EC, métodos y composiciones dados a conocer en el presente documento pueden usarse para tratar un tumor heterogéneo o una neoplasia de células sanguíneas heterogénea en un sujeto que lo necesita. El marcador de “células pan-B” CD20 es el antígeno seleccionado como diana de manera más prevalente para neoplasias de células B y el anticuerpo aprobado por la FDA rituximab es un componente vital en el tratamiento de muchas leucemias y linfomas. Sin embargo, se producen mecanismos de resistencia relacionados con la modulación de la expresión de antígeno CD20 en un número significativo de pacientes. Queda claro que la selección como diana con antígeno CD19 o CD20 por sí sola es insuficiente para una terapia curativa. Los métodos dados a conocer en el presente documento proporcionan la construcción y administración de dos o más conmutadores con diferentes especificidades (por ejemplo, un conmutador de CAR-EC de anticuerpo anti-CD19 y un conmutador de CAR-EC de anticuerpo anti-CD20). Los métodos dados a conocer en el presente documento proporcionan la construcción y administración de dos o más conmutadores con diferentes especificidades (por ejemplo, un conmutador de CAR-EC de anticuerpo anti-CD19 y un conmutador de CAR-EC de anticuerpo anti-CD22). Esta metodología puede ofrecer una ventaja significativa frente a la propensión de recidiva en la clínica al tiempo que se evita la pérdida persistente de células B. Un tumor heterogéneo o neoplasia de células sanguíneas heterogénea también puede tratarse con un conmutador de CAR-EC de anticuerpo anti-CD19 y un conmutador de CAR-EC de anticuerpo anti-CD22. Pueden administrarse uno o más conmutadores de CAR-EC de manera secuencial o simultánea. Un segundo conmutador que selecciona como diana una segunda molécula de superficie celular en la célula diana puede administrarse después de la regulación por disminución de una primera molécula de superficie celular en la célula diana que se selecciona como diana por un primer conmutador.

El conmutador de CAR-EC puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden seleccionarse de un grupo que consiste en una inmunoterapia, una quimioterapia y un esteroide. El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden ser un fármaco quimioterápico. El fármaco quimioterápico puede ser un agente alquilante, un antimetabolito, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa, un inhibidor mitótico, un corticosteroide o un agente de diferenciación. El fármaco quimioterápico puede seleccionarse de actinomicina D, bleomicina, altretamina, bortezomib, busulfano, carboplatino, capecitabina, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, etopósido, estramustina, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitbina (Gemzar), hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecán (Camptosar), ixabepilona, L-asparaginasa, lomustina, mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitomicina C, paclitaxel (Taxol), pemetrexed, pentostatina, estreptozocina, temozolomida, tenipósido, tioguanina, tiotepa, topotecán (Hycamtin), vincristina, vinblastina, vinorelbina, retinoides, tretinoína (ATRA o Atralin®), bexaroteno (Targretin®) y trióxido de arsénico (Arsenox®). La quimioterapia puede administrarse como una pastilla para tragar, como una inyección en el músculo o tejido graso, por vía intravenosa, por vía tópica o directamente en una cavidad corporal.

El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden comprender un inhibidor de la angiogénesis. El inhibidor de la angiogénesis puede seleccionarse de bevacizumab, itraconazol, carboxiamidotriazol, TNP-470, CM101, IFN alfa, IL-12, factor de plaquetas 4, suramina, SU5416, thrombospondina, un antagonista de VEGFR, un esteroide angiostático con heparina, factor inhibidor de la angiogénesis derivado de CAR-EC, inhibidores de metaloproteasa de la matriz, angiostatina, endostatina, sorafenib, sunitinib, pazopanib, everolimus, 2-metoxiestradiol, tecogalán, tetratiomolibdato, talidomida, prolactina, inhibidor de avp3, linomida, tasquinimod, VEGFR-1 soluble, NRP-1 soluble, angiopoyetina 2, vasostatina, calreticulina, TIMP, CDAI, Met-1, Met-2, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, CXCL10, IL-4, IL-12, IL-18, protrombina, fragmento antitrombina III, prolactina, VEGI, SPARC, osteopontina, maspina, canstatina, proteína relacionada con proliferina y restina.

El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden comprender una terapia hormonal. La terapia hormonal puede seleccionarse de un compuesto anti-estrógeno (por ejemplo, fulvestrant (Faslodex®), tamoxifeno, toremifeno (Fareston®)); un inhibidor de aromatasa (por ejemplo, anastrozol (Arimidex®), exemestano (Aromasin®), letrozol (Femara®)); una progestina (por ejemplo, acetato de megestrol (Megace®)); un estrógeno; un compuesto antiandrógeno (por ejemplo, bicalutamida (Casodex®), flutamida (Eulexin®), nilutamida (Nilandron®)); un agonista o análogo de hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) o de hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH) (por ejemplo, leuprolida (Lupron®), goserelina (Zoladex®)).

El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden comprender un esteroide. El esteroide puede ser un corticosteroide. El esteroide puede ser cortisol o un derivado del mismo. El esteroide puede seleccionarse de prednisona, metilprednisolona (Solumedrol®) o dexametasona.

El conmutador de CAR-EC puede administrarse con una o más terapias adicionales. La una o más terapias adicionales pueden comprender terapia por láser. La una o más terapias adicionales pueden comprender terapia por radiación. La una o más terapias adicionales pueden comprender cirugía.

En el presente documento también se dan a conocer plataformas, kits y métodos para tratar una enfermedad o estado en un sujeto. El sujeto puede ser un sujeto sano. El sujeto puede padecer una enfermedad o estado. El sujeto puede padecer más de una enfermedad o estado. El sujeto puede padecer leucemia linfocítica crónica. El sujeto puede padecer leucemia linfoblástica aguda. El sujeto puede ser un animal. El sujeto puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un chimpancé, un gorila, un mono, un bovino, un caballo, un burro, una mula, un perro, un gato, un cerdo, un conejo, una cabra, una oveja, una rata, un hámster, una cobaya o un ratón. El sujeto puede ser un ave o un pollo. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un niño. El niño puede padecer leucemia linfoblástica aguda. El sujeto puede tener menos de 6 meses de edad. El sujeto puede tener aproximadamente 1 año de edad, aproximadamente 2 años de edad, aproximadamente 3 años de edad, aproximadamente 4 años de edad, aproximadamente 5 años de edad, aproximadamente 6 años de edad, aproximadamente 7 años de edad, aproximadamente 8 años de edad, aproximadamente 9 años de edad, aproximadamente 10 años de edad, aproximadamente 11 años de edad, aproximadamente 12 años de edad, aproximadamente 13 años de edad, aproximadamente 14 años de edad, aproximadamente 15 años de edad, aproximadamente 18 años de edad, aproximadamente 20 años de edad, aproximadamente 25 años de edad, aproximadamente 30 años de edad, aproximadamente 35 años de edad, aproximadamente 40 años de edad, aproximadamente 45 años de edad, aproximadamente 50 años de edad, aproximadamente 55 años de edad, aproximadamente 60 años de edad, aproximadamente 65 años de edad, aproximadamente 70 años de edad, aproximadamente 75 años de edad, aproximadamente 80 años de edad, aproximadamente 85 años de edad, aproximadamente 90 años de edad, aproximadamente 95 años de edad, aproximadamente 100 años de edad o aproximadamente 105 años de edad.

También se da a conocer un método de tratamiento de una enfermedad o estado dado a conocer en el presente documento que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR humanizado dado a conocer en el presente documento y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. También se da a conocer un método de tratamiento de una enfermedad o estado dado a conocer en el presente documento que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 63-92, 104, 115, y 181-183 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. También se da a conocer un método de tratamiento de una enfermedad o estado dado a conocer en el presente documento que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR con un dominio extracelular que es un scFv que tiene una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. La administración puede ser en cualquier orden. Por ejemplo, en algunas realizaciones, pueden administrarse las células CAR-EC antes que la administración de conmutador de CAR-EC administración. En algunas realizaciones, puede administrarse el conmutador de CAR-EC antes que la administración de célula CAR-EC. También se da a conocer que las células CAR-EC pueden administrarse simultáneamente con la administración de conmutador de CAR-EC. En algunas realizaciones, la enfermedad o estado es una enfermedad o estado en el que células CD19+ están implicadas en la patología. En algunas realizaciones, la enfermedad o estado se selecciona de tumores heterogéneos y neoplasias de células sanguíneas. En algunas realizaciones, la enfermedad o estado se selecciona de leucemia linfoblástica aguda y leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, la enfermedad o estado se selecciona de mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, y leucemia de células pilosas (HCL).

IX. Métodos de destrucción o activación de células diana

En el presente documento también se dan a conocer métodos de destrucción de una célula diana, que comprenden poner en contacto una célula efectora de receptor quimérico dada a conocer en el presente documento con un conmutador de células efectoras de receptor quimérico dado a conocer en el presente documento, en los que la célula efectora de receptor quimérico expresa un receptor quimérico con un dominio extracelular distinto de anticuerpo que se une a un CAR-ID en el conmutador de células efectoras de receptor quimérico, y en los que el conmutador de células efectoras de receptor quimérico comprende el dominio de unión que se une al dominio extracelular distinto de anticuerpo del receptor quimérico y el conmutador comprende un resto de direccionamiento que se une a un antígeno en la célula diana.

En el presente documento también se dan a conocer métodos de destrucción de una célula diana, que comprenden poner en contacto una CAR-EC dada a conocer en el presente documento con un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento, en los que la CAR-Ec expresa un CAR con un dominio extracelular que se une a un CAR-ID en el conmutador de CAR-EC, y en los que el conmutador de CAR-EC comprende un CAR que se une a un dominio extracelular del CAR y el conmutador comprende un resto de direccionamiento que se une a un antígeno (por ejemplo, un antígeno asociado con tumor) en la célula diana.

En el presente documento también se dan a conocer métodos de lisis de una célula diana, que comprenden poner en contacto una CAR-EC dada a conocer en el presente documento con un conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento, en los que la CAR-EC expresa un CAR con un dominio extracelular que se une a un CAR-ID en el conmutador de CAR-EC, y en los que el conmutador de CAR-EC comprende un CAR que se une a un dominio extracelular del CAR y el conmutador comprende un resto de direccionamiento que se une a un antígeno (por ejemplo, un antígeno asociado con tumor) en la célula diana.

La puesta en contacto puede producirsein vitro.La puesta en contacto puede producirsein vivoen un sujeto. El sujeto puede ser cualquiera de los sujetos dados a conocer en el presente documento. El sujeto puede tener una enfermedad. La enfermedad puede ser una cualquiera o más de las enfermedades dadas a conocer en el presente documento. La enfermedad puede ser cáncer. La puesta en contacto puede realizarse mediante administración, mediante los métodos descritos en el presente documento. La administración puede comprender administrar el conmutador de CAR-EC a un sujeto al que ya se le han administrado células efectoras de receptor quimérico que expresan un receptor quimérico que se une al conmutador. La administración puede comprender administrar a un sujeto el conmutador de CAR-EC y administrar además al sujeto una CAR-EC que expresa un receptor quimérico que se une al conmutador de CAR-EC.

La puesta en contacto puede inducir la lisis de la célula seleccionada como diana. La puesta en contacto puede destruir la célula diana. La puesta en contacto puede destruir células diana con una CE50 para la destrucción que oscila desde aproximadamente 1 pM hasta aproximadamente 100 pM. La puesta en contacto puede destruir células diana con una CE50 para la destrucción que es inferior a 1 pM. La puesta en contacto puede destruir una célula que tiene una enfermedad. La célula puede tener cualquier enfermedad dada a conocer en el presente documento. La enfermedad puede ser cáncer.

El conmutador puede ser cualquier conmutador dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender un péptido de K4 fusionado a, injertado en, o unido a, un resto de direccionamiento. El conmutador puede comprender un E4 fusionado a, injertado en, o unido a, un resto de direccionamiento. El conmutador puede comprender un péptido de GCN4 fusionado a, injertado en, o unido a, un resto de direccionamiento. El péptido de G<c>N4 puede comprender una secuencia de estructura I: X1NYHLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son todos cualquier aminoácido o están ausentes. El péptido de GCN4 puede comprender un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO: 139-153 y 245). El conmutador puede comprender una etiqueta de Flag fusionada a, injertada en, o unida a, un resto de direccionamiento. El conmutador puede comprender un FITC unido a un resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede unirse a CD19. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD19, o una porción de unión a antígeno del mismo. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo. El resto de direccionamiento puede unirse a CD20, CD22, EGFR, EGFRvIII, Her2, CS1, BCMA, CEA, CLL1, CD33, o CD123. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL1, un anticuerpo anti-CD123, o un anticuerpo anti-CD33. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD20 humanizado, un anticuerpo anti-CD22 humanizado, un anticuerpo anti-EGFR humanizado, un anticuerpo anti-EGFRvIII humanizado, un anticuerpo anti-Her2 humanizado, un anticuerpo anti-CS1 humanizado, un anticuerpo anti-BCMA humanizado, un anticuerpo anti-CEA humanizado, un anticuerpo anti-CLL1 humanizado, un anticuerpo anti-CD123 humanizado, o un anticuerpo anti-CD33 humanizado.

También se da a conocer en el presente documento un método de destrucción de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR humanizado dado a conocer en el presente documento y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. También se da a conocer un método de destrucción de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 63-92, 104, 115, y 181-183 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. También se da a conocer un método de destrucción de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR seleccionado de los CAR descritos en la tabla 11o la tabla 12 o un CAR que tiene un dominio extracelular humanizado que es un scFv que tiene una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14.

En el presente documento se dan a conocer además métodos de activación de una célula diana, que comprenden poner en contacto una célula efectora de receptor quimérico dada a conocer en el presente documento con un conmutador de células efectoras de receptor quimérico dado a conocer en el presente documento, en los que la célula efectora de receptor quimérico sólo se activa si la puesta en contacto incluye tanto (i) la unión del<c>AR-ID en el conmutador de células efectoras de receptor quimérico al dominio extracelular distinto de anticuerpo del receptor quimérico expresado en la célula efectora de receptor quimérico como (ii) la unión simultánea del resto de direccionamiento en el conmutador de células efectoras de receptor quimérico a su antígeno diana.

También se dan a conocer métodos de lisis de una célula diana. También se da a conocer un método de lisis de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR humanizado dado a conocer en el presente documento y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. También se da a conocer un método de lisis de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 63-92, 104, 115, y 181-183 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. También se da a conocer un método de lisis de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR seleccionado de los CAR descritos en la tabla 11o la tabla 12 o un CAR que tiene un dominio extracelular humanizado que es un scFv que tiene una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14.

En el presente documento también se dan a conocer métodos de activación de una CAR-EC (por ejemplo, una CAR-EC dada a conocer en el presente documento), que comprenden poner en contacto la CAR-EC (por ejemplo, la CAR-EC dada a conocer en el presente documento) con un conmutador de CAR-EC complementario dado a conocer en el presente documento, en los que la CAR-EC se activa únicamente si la puesta en contacto incluye tanto (i) la unión del CAR-ID en el conmutador de CAR-EC al dominio extracelular del receptor quimérico (por ejemplo, CAR) expresado en la CAR-EC como (ii) la unión simultánea del resto de direccionamiento en el conmutador de CAR-EC a su antígeno diana. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método de activación de una CAR-EC que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR humanizado dado a conocer en el presente documento y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. También se da a conocer un método de activación de una CAR-EC que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR que tiene una secuencia seleccionada de S<e>Q ID NO: 63-92, 104, 115, y 181-183 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de<s>E<q>ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método de destrucción de una célula diana que comprende administrar (i) una CAR-EC que comprende un CAR seleccionado de los CAR descritos en la tabla 11 o la tabla 12 o un CAR que tiene un dominio extracelular humanizado que es un scFv que tiene una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423 y (ii) un conmutador de CAR-EC humanizado complementario dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y un CAR-ID dado a conocer en el presente documento. La secuencia de cadena ligera puede comprender una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34. El conmutador puede comprender una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14.

La puesta en contacto puede producirsein vitro.La puesta en contacto puede producirsein vivoen un sujeto. El sujeto puede ser cualquiera de los sujetos dados a conocer en el presente documento. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede tener una enfermedad. La enfermedad puede ser una cualquiera o más de las enfermedades dadas a conocer en el presente documento. La enfermedad puede ser cáncer. La puesta en contacto puede realizarse mediante administración (o “administrando”). La administración puede realizarse mediante uno cualquiera o más de los métodos descritos en el presente documento. La administración puede comprender administrar el conmutador de CAR-EC a un sujeto al que ya se le ha administrado una CAR-EC que expresa un receptor quimérico que se une al conmutador (es decir, una CAR-EC que expresa un CAR complementario). La administración puede comprender administrar a un sujeto el conmutador de CAR-EC y administrar además al sujeto una CAR-EC que expresa un CAR que se une al conmutador de CAR-EC.

El conmutador puede ser cualquier conmutador dado a conocer en el presente documento. El conmutador puede comprender un péptido de K4 fusionado a, injertado en, o unido a, un resto de direccionamiento. El conmutador puede comprender un E4 fusionado a, injertado en, o unido a, un resto de direccionamiento. El conmutador puede comprender un péptido de GCN4 fusionado a, injertado en, o unido a, un resto de direccionamiento. El péptido de Gc N4 puede comprender una secuencia de estructura I: X1NYHLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son todos cualquier aminoácido o están ausentes. El péptido de GCN4 puede comprender un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO: 139-153 y 245). El conmutador puede comprender una etiqueta de Flag fusionada a, injertada en, o unida a, un resto de direccionamiento. El conmutador puede comprender un FITC unido a un resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede unirse a CD19. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD19 humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo.

El conmutador de CAR-EC puede comprender un resto de direccionamiento que es un anticuerpo FMC63, o una porción de unión a CD19 del mismo, que comprende (i) una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-25 y (ii) una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-15. El conmutador de CAR-EC puede comprender un péptido de GCN4 fusionado a un resto de direccionamiento que es un anticuerpo FMC63, o una porción de unión a CD19 del mismo, que comprende (i) una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16-25 y (ii) una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-15, en el que el péptido de GCN4 comprende una secuencia de estructura I: X1NYHLENEVARLKX2X3 (SEQ ID NO: 269), en la que X1, X2, y X3 son todos cualquier aminoácido o están ausentes. El péptido de GCN4 puede comprender un derivado de GCN4 dado a conocer en el presente documento. El péptido de GCN4 puede seleccionarse de una cualquiera de SEQ ID NO: 139-153 y 245.

X. Plataforma de CAR-EC

En el presente documento también se dan a conocer plataformas de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) humanizadas que comprenden (i) una célula efectora, en las que la célula efectora comprende un polinucleótido que codifica para un receptor de antígeno quimérico (CAR); y (ii) un conmutador de célula efectora de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC), en las que el conmutador de CAR-EC comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento y en las que el conmutador de<c>AR-EC se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, y en las que uno o ambos del CAR y el conmutador de CAR-EC están humanizados. También se dan en el presente documento plataformas de CAR-Ec humanizadas que comprenden (i) una célula efectora, en las que la célula efectora expresa un CAR; y (ii) un conmutador de CAR-EC, en las que el conmutador de CAR-EC comprende un CAR-ID y un resto de direccionamiento y en las que el resto de direccionamiento del conmutador de CAR-EC se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, y en las que uno o ambos del CAR y el conmutador de CAR-EC están humanizados. El conmutador de CAR-EC puede seleccionarse de cualquier conmutador de CAR-EC dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un conmutador de CAR-EC humanizado dado a conocer en el presente documento). Tal como se usan en el presente documento, los términos “plataforma de CAR conmutable”, “plataforma de CAR-EC”, “plataforma de sCAR-T”, “plataforma de células sCAR-T”, “plataforma de receptor de antígeno quimérico conmutable”, “plataforma de células efectoras de receptor de antígeno quimérico”, “plataforma de conmutador de CAR-T”, “plataforma de sCAR”, “plataforma de conmutador” y “plataforma conmutable” se usan de manera intercambiable.

También se da a conocer que la plataforma de CAR-EC puede comprender un primer conmutador de CAR-EC. La plataforma de CAR-EC un primer conmutador de CAR-EC y al menos un segundo conmutador de CAR-EC. En algunas realizaciones, la plataforma de CAR-EC comprende al menos dos conmutadores de CAR-EC humanizados. Las plataformas de CAR-EC pueden comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más conmutadores de CAR-EC humanizados. Las plataformas de CAR-EC pueden comprender más de 20, más de 25, más de 30, más de 35, más de 40, más de 45 o más de 50 conmutadores de CAR-EC humanizados. Los dos o más conmutadores pueden seleccionarse de uno o más conmutadores de CAR-EC humanizados dados a conocer en el presente documento o una combinación de los mismos.

También se da a conocer que las plataformas de CAR-EC dadas a conocer en el presente documento pueden comprender además un primer conmutador de CAR-EC y un segundo conmutador de CAR-EC, en las que el primer conmutador de CAR-EC comprende un primer CAR-ID y un primer resto de direccionamiento y el segundo conmutador de CAR-EC comprende un segundo CAR-ID y un segundo resto de direccionamiento. El primer CAR-ID y el segundo CAR-ID pueden ser iguales. El primer CAR-ID y el segundo CAR-ID pueden ser diferentes. El primer CAR- ID y el segundo CAR- ID pueden ser idénticos en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 %. El primer resto de direccionamiento y el segundo resto de direccionamiento pueden ser iguales. El primer resto de direccionamiento y el segundo resto de direccionamiento pueden ser diferentes. El primer resto de direccionamiento y el segundo resto de direccionamiento pueden ser idénticos en aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 2 %.

El conmutador de CAR-EC puede tener cualquier secuencia de conmutador dada a conocer en el presente documento. Por ejemplo, puede comprender una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena ligera de conmutador dada a conocer en el presente documento y la cadena pesada comprende o consiste en cualquier secuencia de cadena pesada de conmutador dada a conocer en el presente documento. Tales secuencias de cadena pesada y/o ligera pueden estar humanizadas. En algunas realizaciones, el conmutador de CAR-EC está humanizado y comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 17-24 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14, en el que una o ambas de las cadenas pesada y ligera comprenden un<c>AR-ID dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, un CAR-ID de GCN4). En realizaciones particulares, la secuencia de cadena ligera comprende una secuencia humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2-14. En realizaciones particulares, el conmutador es un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, que presenta combinaciones de cadena pesada / cadena ligera comprendidas en varios de los conmutadores dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el conmutador es idéntico a un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, excepto porque el CAR-ID comprendido en el conmutador está modificado para tener una secuencia de estructura I. También se da a conocer que la secuencia de estructura I se selecciona de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139-163, y 245.

Las plataformas de CAR-EC dadas a conocer en el presente documento pueden comprender además una primera CAR-EC. La primera CAR-EC puede comprender un primer CAR. El primer CAR puede estar humanizado. El primer CAR puede ser un CAR dado a conocer en el presente documento. El primer CAR puede tener cualquier secuencia de<c>A<r>dada a conocer en el presente documento. El primer CAR puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para seres humanos. El primer CAR puede comprender un dominio extracelular que está humanizado. La humanización puede reducir la inmunogenicidad del CAR para seres humanos al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del dominio extracelular por el conmutador de CAR-EC. El primer CAR puede ser una versión humanizada de una cualquiera de las secuencias de CAR proporcionadas en la tabla 13 o puede ser una versión humanizada de una cualquiera de SEQ ID NO: 270-289. El primer CAR puede ser un CAR humanizado que comprende un dominio extracelular que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un CAR-ID de un conmutador de CAR-EC. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar humanizado. El fragmento de anticuerpo puede ser un scFv (por ejemplo, un scFv humanizado). El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena ligera-ligador-cadena pesada. El scFv o scFv humanizado puede comprender o consistir en la estructura general de cadena pesada-ligador-cadena ligera. El scFv humanizado puede comprender una secuencia de VH (cadena pesada variable) humanizada con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de inmunoglobulina humana. El scFv humanizado puede comprender una secuencia de VL (cadena ligera variable) humanizada con CDR no humanas (por ejemplo, murinas) trasplantadas sobre un entramado de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones particulares, el primer CAR comprende una estructura seleccionada de los constructos A-H en la figura 24A. En determinadas realizaciones, el primer CAR comprende una estructura según el constructo A, el constructo B o el constructo C en la figura 24. En determinadas realizaciones, el primer CAR se selecciona de los CAR descritos en la tabla 11. En determinadas realizaciones particulares, el primer CAR se selecciona de los CAR descritos en la tabla 12. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del primer CAR comprende una secuencia de scFv humanizada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423.

También se da a conocer que la plataforma de CAR-EC puede comprender

a. un primer conmutador de CAR-EC:

i. que comprende una secuencia de cadena ligera humanizada seleccionada de SEQ ID NO: 27-34 (que comprenden un CAR-ID de GCN4 N-terminal) y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 2 14;

ii. tal como se describe en la tabla 6 o la tabla 8, que presenta combinaciones de cadena pesada / cadena ligera comprendidas en varios de los conmutadores dados a conocer en el presente documento; o

iii. que es idéntico a un conmutador descrito en la tabla 6 o la tabla 8, excepto porque el CAR-ID comprendido en el conmutador está modificado para tener una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, 36, 139, y 154-163; y

b. y una primera CAR-EC que expresa un primer CAR complementario; en la que el CAR

i. comprende una estructura seleccionada de los constructos A-H en la figura 24A;

ii. comprende una estructura según el constructo E en la figura 24A;

iii. se selecciona de los CAR descritos en la tabla 11;

iv. se selecciona de los CAR descritos en la tabla 12; o

v. el dominio extracelular comprende una secuencia de scFv humanizada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 290-388, y 423;

y opcionalmente

c. uno o más segundos conmutadores de CAR-EC, al menos uno de los cuales comprende un resto de direccionamiento diferente que se une a una diana diferente del resto de direccionamiento en el primer conmutador de CAR-EC; y en la que el CAR-ID en cada segundo conmutador de CAR-EC es opcionalmente igual o diferente del CAR-ID en el primer conmutador de CAR-EC; en la que, en algunas realizaciones, cuando el CAR-ID en el primer conmutador es diferente del CAR-ID en el segundo conmutador, y el primer CAR no puede unirse al segundo CAR-ID, la plataforma también puede comprender una segunda CAR-EC que se une al CAR-ID en el segundo conmutador.

Tabla 3: secuencias

Tabla de secuencias

Secuencia SEQ Nombre ID

ID NO Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G G S I S S Y Y W S W I R Q P P 1 h4-59_01 Aminoá G K G L E W I G Y I Y Y S G S T N Y N P S L K S R V T I S V D T S K N Q F S L K L cido S S V T A A D T A V Y Y C A R Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 2 hFMCH1 Aminoá G K G L E W I G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R V T I S V D T S K N Q F S L K L cido S S V T A A D T A V Y Y C A R H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 3 hFMCH2 Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R L T I S K D T S K N Q V S L K M cido S S L T A A D T A V Y Y C A R H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 4 hFMCH3 Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M cido S S L T A A D T A V Y Y C A R H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 5 hFMCH4a Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R L T I S K D T S K N Q V S L K M cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 6 hFMCH4b Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 7 hFMCH4c Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N S A L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 8 hFMCH4z Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N S S L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 9 hFMCH4b- Aminoá G K G L E W I G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R V T I S K D N S K N Q F S L K L x cido S S V T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 10 hFMCH4c- Aminoá G K G L E W I G V I W G S E T T Y Y N S A L K S R V T I S K D N S K N Q F S L K L x cido S S V T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S E V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 11 hFMCH4c- Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N S A L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M 20L-E cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S E V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 12 hFMCH4b- Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M E cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S E V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 13 hFMCH4c- Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N S A L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M E cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q GT L V T V S S E V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 14 hFMCH4b- Aminoá G K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N P S L K S R L T I S K D N S K N Q V S L K M 20L-E cido S S L T A A D T A V Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T L V T V S S E V K L Q E S G P G L V A P S Q S L S V T C T V S G V S L P D Y G V S W I R Q P P 15 mFMC63H Aminoá R K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N S A L K S R L T I I K D N S K S Q V F L K M cido N S L Q T D D T A I Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T S V T V S S

DIQMTQS PS SLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPG 16 IGKV1-39 Aminoá KAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED cido FATYYCQQSYSTPP DIQMTQS PS SLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 17 hFMCL1 Aminoá KAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED cido FAT YYCQQGNT L P YT FGQ GT KL EIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 18 hFMCL2 Aminoá KAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED cido FATYYCQQGATLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 19 hFMCL2a Aminoá KAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED cido FATYYCQQGATLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 20 hFMCL2b Aminoá KAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED cido FATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 21 hFMCL2b- Aminoá KAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED 1 cido FATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 22 hFMCL2b( Aminoá KALKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED V4 4L) cido FATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 23 hFMCL2b Aminoá KAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED (A9 2N) cido FATYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPG 24 hFMCL2c Aminoá KAIKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPED cido FATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD 25 mFMC63L Aminoá GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQED cido IATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIK NYHLENEVARLKKL 26 péptido de Aminoá unión cido truncado a GCN4 de factor de transcripci ón de levadura NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT 27 hFMCL1- Aminoá CRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFS LCNT cido GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKL E IK NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT 28 hFMCL2- Aminoá CRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFS LCNT cido GSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGATLPYTFGQGTKL E IK NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT 29 hFMCL2a- Aminoá CRASQDISKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFS LCNT cido GSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGATLPYTFGQGTKL E IK NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT 30 hFMCL2b- Aminoá CRASQDISKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFS LCNT cido GSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKL E IK NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT 31 hFMCL2b- Aminoá CRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFS 1-LCNT cido GSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKL E IK NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT 32 hFMCL2b Aminoá CRASQDISKYLNWYQQKPGKALKLLIYHTSRLHSGVPSRFS (V4 4L) - cido GSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKL LCNT E IK

N Y H L E N E V A R L K K L G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T 33 hFMCL2b Aminoá C R A S Q D I S K Y L N W Y Q Q K P G K A V K L L I Y H T S R L H S G V P S R F S (A9 2N) - cido G S G S G T D Y T L T I S S L Q P E D F A T Y F C Q Q G N T L P Y T F G Q G T K L LCNT E I K N Y H L E N E V A R L K K L G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T 34 hFMCL2c- Aminoá C R A S Q D I S K Y L N W Y Q Q K P G K A V K L L I Y H T S R L H S G V P S R F S LCNT cido G S G S G T D Y T L T I S S L Q P E D F A T Y F C Q Q G A T L P Y T F G Q G T K L E I K N Y H L E N E V A R L K K L G G G G S D I Q M T Q T T S S L S A S L G D R V T I S 35 mFMC63- Aminoá C R A S Q D I S K Y L N W Y Q Q K P D G T V K L L I Y H T S R L H S G V P S R F S LCNT cido G S G S G T D Y S L T I S N L E Q E D I A T Y F C Q Q G N T L P Y T F G G G T K L E I K RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER 36 GCN4 de Aminoá factor de cido transcripci ón de levadura (7P14P) GGGGSNYHLENEVARLKKLGGGGS 37 péptido de Aminoá unión cido truncado a GCN4 de factor de transcripci ón de levadura con ligadores GGGGSDYKDDDDK 38 Péptido Aminoá diana cido hidrófilo (HTP) GGGGSDYKDDDDKP 39 Péptido Aminoá diana cido hidrófilo (HTP) P DYKDDDDK 40 FLAG® Aminoá cido C A G G T G G C A C T T T T C G G G G A A A T G T G C G C G G A A C C C C T A T T 63 LV-EF1a- ADN T G T T T A T T T T T C T A A A T A C A T T C A A A T A T G T A T C C G C T C A T GCN4(52S G A G A C A A T A A C C C T G A T A A A T GC T T C A A T A A T A T T G A A A A A R4) -BBZ G G A A G A G T A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G T C G C C C T T A T T C C C T T T T T T G C G G C A T T T T G C C T T C C T G T T T T T G C T C A C C C A G A A A C G C T G G T G A A A G T A A A A G A T GC T G A A G A T C A G T T GG G T G C A C G A G T G G G T T A C A T C G A A C T G G A T C T C A A C A G C G G T A A G A T C C T T G A G A G T T T T C G C C C C G A A G A A C G T T T T C C A A T G A T G A G C A C T T T T A A A G T T C T G C T A T G T G G C G C G G T A T T A T C C C G T A T T G A C G C C G G G C A A G A G C A A C T C G G T C G C C G C A T A C A C T A T T C T C A G A A T G A C T T G G T T G A G T A C T C A C C A G T C A C A G A A A A G C A T C T T A C G G A T G G C A T G A C A G T A A G A G A A T T A T G C A G T G C T G C C A T A A C C A T G A G T G A T A A C A C T G C G G C C A A C T T A C T T C T G A C A A C G A T C G G A G G A C C G A A G G A G C T A A C C GC T T T T T T G C A C A A C A T G G G G G A T C A T G T A A C T C G C C T T G A T C G T T G G G A A C C G G A G C T G A A T G A A G C C A T A C C A A A C G A C G A G C G T G A C A C C A C G A T G C C T G T A G C A A T G G C A A C A A C G T T G C G C A A A C T A T T A A C T G G C G A A C T A C T T A C T C T A G C T T C C C G G C A A C A A T T A A T A G A C T G G A T G G A G G C G G A T A A A G T T G C A G G A C C A C T T C T G C G C T C G G C C C T T C C G G C T G G C T G G T T T A T T G C T G A T A A A T C T G G A G C C G G T G A G C G T G G G T C T C G C G G T A T C A T T G C A G C A C T G G G G C C A G A T G G T A A G C C C T C C C G T A T C G T A

GTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG

AAATAGACAGAT C GCT GAGATAGGTGCCTCACT GAT TAAGC ATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG ATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGT GAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAAC GTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG ATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAAT CTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGG TTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAG GTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCT TCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTG TAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTT GGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGA ACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATG AGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGT ATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGG GAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGT CGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGAT GCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAAC GCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGC TCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATA ACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGC AGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC GGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTT GGCCGAT T CAT TAAT GCAGC T GGCACGACAGGTT T C CC GAC T GGAAAGC GGGCAGT GAGCGCAAC GCAAT TAAT GT GAGTTA GCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC CGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT CACACAGGAAACAGC TAT GACCAT GAT TACGCCAAGCGCGC AATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTGCAAG CTTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACA T GGTAAC GAT GAGT TAGCAACAT GC C T TACAAGGAGAGAAA AAGCACC GT GCAT GC C GAT T GGT GGAAGTAAGGT G GTAC GA TCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGA T TGGACGAACC ACTGAATT GC C GCATT GCAGAGATAT T GTA TTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGT TAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGG AACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACT AGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCT AGCAGT GGC GC CC GAACAGGGAC CT GAAAGC GAAAGGGAAA CCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCG CACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAA AAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGAT GGGTGC GAGAGCGT CAGTAT TAAGC GGGGGAGAATTAGATC GC GAT G GGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATA AATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGA T T C GCAGT TAAT CCT GGCC TGT TAGAAACAT CAGAAGGCT G TAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAG GATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACC CTCTAT T GT GT GCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAA GGAAGC T T T AGACAAGAT AGAGGAAGAGCAAAACAAAAGT A AGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGG AGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATA AATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCC ACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGC AGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAG CAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTA CAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAA CAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGC AACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATC CTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGG GATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTG TGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAG ATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATT AACAATT ACACAAGCTTAATACACTCCTTAATT GAAGAATC GCAAAACCAGCAAGAAAAGAAT GAACAAGAATTAT T GGAAT TAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACA AATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGG AGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTA TAGT GAATAGAGTTAGGCAGGGATATT CACCAT TAT C GT T T CAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGA AGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGAT CCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTTAACTTTTAAA AGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAAT AGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTAC AAAAACAAAT T ACAAAAATT CAAAATTTTATCGAGCTTTGC AAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC TAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGCCTCGTGAGGC TCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGT CCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTG CCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTC GTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACC GTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCA ACGGGTTTGCC GCCAGAACACAGGTAAGT GCCGT GT GT GGT TCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGT GCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTG ATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGG CCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGA GGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGT GGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTA GCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTT CTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCT GCACA CTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCC CGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCG AGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTG GCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATC GCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGT TGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAG GGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCG GGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTC AGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGT CCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCG TCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCC CCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGC ACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTT GGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCGGTACC GCGGCCGCCCGGGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTT GCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGG ACGCCGTTGTGACCCAGGAATCCGCTCTGACCTCTTCTCCA GGCGAAACCGTGACTCTGACTTGCCGTAGTAGCACCGGGGC TGTGACCACATCTAACTATGCCAGTTGGGTCCAGGAAAAAC CGGATCACCTGTTTACTGGCCTGATTGGCGGCACCAACAAT CGCGCACCGGGTGTGCCCGCTCGTTTCAGCGGTTCCCTGAT TGGGGACAAGGCAGCACTGACTATCACCGGCGCCCAGACCG AAGATGAGGCGAT CTAT TTTTGCGTCCTGT GGTACAGCGAC CATTGGGTGTTCGGGGGAGGCACCAAACTGACAGTGCTGGG CGGAGGAGGAGGTTCAGGAGGAGGAGGTAGCGGGGGAGGCG GTTCCGGGGGAGGCGGTTCTGATGTGCAGCTGCAAGAATCC GGGCCAGGACTGGTTGCGCCTTCTCAGAGTCTGTCAATTAC ATGTACTGTTAGTGGCTTTCTGCTGACCGACTATGGTGTGA ACTGGGTTCGTCAGAGCCCAGGCAAGGGTCTGGAGTGGCTG GGAGTGATTTGGGGGGATGGAATCACAGACTACAATAGCGC ACTGAAATCTCGGCTGAGTGTTACCAAAGATAACAGCAAGT CCCAGGTCTTCCTGAAGATGAACAGCC T GCAAAGCGGCGAC TCCGCTCGCTATTACTGCGTTACCGGACTGTTTGATTATTG GGGGCAGGGGACAACTCTGACTGTTTCCTCCACCACGACGC CAGC GC C GC GACCACCAACACC GGCGC CCACCAT C GC GT C G CAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGC GGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTG ATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTC CTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGG CAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGA GACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGC C GAT T T C CAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGT GAACTGAGAGT 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CGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGAT CTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCT AATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTA CTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTC TCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAG CTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGT GTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCA GT GT GGAAAAT CTCTAGCAGTAGTAGT TCATGTCATCTTAT TAT T CAGTAT T TATAACT T GCAAAGAAATGAATAT CAGAGA GTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAA TAAAGCAATAGCAT CACAAAT T T CACAAATAAAGCAT T T T T TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATG TATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTC CGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATT TTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGA GCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAG GCTTTTGCGTCGAGACGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGT CGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGT GACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGC A G C A C A T C C C C C T T T C G C C A G C T G G C G T A A T A G C G A A G A G G

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D A V V T Q E S A L T S S P G E T V T L T C R S S T G A V T T S N Y A S W V Q E K 85 CAR- Aminoá P D H L F T G L I G G T N N R A P G V P A R F S G S L I G D K A A L T I T G A Q T GCN4 cido E D E A I Y F C V L W Y S D H W V F G G G T K L T V L G G G G G S G G G G S G G G (bisagra de G S G G G G S D V Q L Q E S G P G L V A P S Q S L S I T C T V S G F L L T D Y G V CD8) N W V R Q S P G K G L E W L G V I W G D G I T D Y N S A L K S R L S V T K D N S K S Q V F L K M N S L Q S G D S A R Y Y C V T G L F D Y W G Q G T T L T V S S T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T L Y C K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y K Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R D A V V T Q E S A L T S S P G E T V T L T C R S S T G A V T T S N Y A S W V Q E K 86 CAR- Aminoá P D H L F T G L I G G T N N R A P G V P A R F S G S L I G D K A A L T I T G A Q T GCN4 cido E D E A I Y F C V L W Y S D H W V F G G G T K L T V L G G G G G S G G G G S G G G (bisagra de G S G G G G S D V Q L Q E S G P G L V A P S Q S L S I T C T V S G F L L T D Y G V IgG4m) N W V R Q S P G K G L E W L G V I W G D G I T D Y N S A L K S R L S V T K D N S K S Q V F L K M N S L Q S G D S A R Y Y C V T G L F D Y W G Q G T T L T V S S E S K Y G P P C P P C P D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T L Y C K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y K Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R GGGGS 93 Ligador Aminoá GGGGS cido GGGS 94 Ligador Aminoá GGGS cido GGS 95 Ligador Aminoá GGS cido GS 96 Ligador Aminoá GS cido (XmS)n, n es al menos 1, m es al menos 1 y X es un aminoácido 97 Ligador XS Aminoá cido LVGEAAAKEAAAKA 98 Ligador de Aminoá fusión/injer cido to de conmutado r rígido 3 AEAAAKEAAAKA 99 Ligador de Aminoá fusión/injer cido to de conmutado r rígido 4 EAAAKEAAAKEAAAKA 100 Ligador de Aminoá fusión/injer cido to de conmutado r rígido 4a EGKSSGSGSESKST 101 Ligador de Aminoá fusión/injer cido to de conmutado r flexible -profético GSAGSAAGSGEF 102 Ligador de Aminoá fusión/injer cido to de conmutado r rígido 5 APAPAPAPAPAPAP 103 Ligador de Aminoá fusión/injer cido to de

conmutado

r de prolilo - profético t c g a g a a g c t t g c c a c c a t g g g t g t c c c t a c c c a g c t c c t g 104 GCN4- ADN g g a c t g c t c c t g c t g t g g a t c a c c g a c g c c a t c t g c G A C G C CD28-CGTTGTGACCCAGGAATCCGCTCTGACCTCTTCTCCAGGCG CD3z (1-3) AAACCGTGACTCTGACTTGCCGTAGTAGCACCGGGGCTGTG ACCACATCTAACTATGCCAGTTGGGTCCAGGAAAAACCGGA TCACCTGTTTACTGGCCTGATTGGCGGCACCAACAATCGCG CACCGGGTGTGCCCGCTCGTTTCAGCGGTTCCCTGATTGGG GACAAGGCAGCACTGACTATCACCGGCGCCCAGACCGAAGA TGAGGCGATCTATTTTTGCGTCCTGTGGTACAGCGACCATT GGGTGTTCGGGGGAGGCACCAAACTGACAGTGCTGGGCGGA GGAGGAGGTTCAGGAGGAGGAGGTAGCGGGGGAGGCGGTTC CGGGGGAGGCGGTTCTGATGTGCAGCTGCAAGAATCCGGGC CAGGACTGGTTGCGCCTTCTCAGAGTCTGTCAATTACATGT ACTGTTAGTGGCTTTCTGCTGACCGACTATGGTGTGAACTG GGTTCGTCAGAGCCCAGGCAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAG T GAT T T GGGGGGAT GGAAT CACAGACTACAATAGC GCAC T G AAATCTCGGCTGAGTGTTACCAAAGATAACAGCAAGTCCCA GGTCTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAAAGCGGCGACTCCG CTCGCTATTACTGCGTTACCGGACTGTTTGATTATTGGGGG C A G G G G A C A A C T C T G A C T G T T T C C T C C a t c g a g t t c a t g t a

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a t t a g g a a g c a g c c c a g t a g t a g g t t g a g g c c g t t g a g c a c cgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgccca acagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccg aaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc cccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcac ctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtag aggcgatttaaagacaggatatcagtggtccaggctctagt tttgactcaacaatatcaccagctgaagcctatagagtacg agccatagataaaataaaagattttatttagtctccagaaa aaggggggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagct agettaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacata actgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagaga gacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagca gttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccag atgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagat gtttccagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctgtgcc ttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttc gcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaac ccctcactcggcgcgccagtcctccgatagactgcgtcgcc cgggtacccgtattcccaataaagcctcttgctgtttgcat ccgaatcgtggactcgctgatccttgggagggtctcctcag attgattgactgcccacctcgggggtctttcatttggaggt tccaccgagatttggagacccctgcctagggaccaccgacc cccccgccgggaggtaagctggccagcggtcgtttcgtgtc tgtctctgtctttgtgcgtgtttgtgccggcatctaatgtt tgcgcctgcgtctgtactagttagctaactagctctgtatc tggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccgg ccgcaaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtt tttgtggcccgacctgagtccaaaaatcccgatcgttttgg actctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttc tggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtct gaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcg tcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctga ctgtgtttctgtatttgtctgagaatatgggcccgggctag cetgttaccáeteccttaagtttgaccttaggtcactggaa agatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtca agaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggcca acctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccg agacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctg gcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacc tgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagcc ctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccg ccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcct cgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgc ceceatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgc cccttgtaaacttccctgaccctgacatgacaagagttact aacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctactt agtccagcacgaagtctggagacctctggcggcagcctacc aagaacaactggaccgaccggtggtacctcacccttaccga gtcggcgacacagtgtgggtccgccgacaccagactaagaa cctagaacctcgctggaaaggaccttacacagtcctgctga ccacccccaccgccctcaaagtagacggcatcgcagcttgg atacacgccgcccacgtgaaggctgccgaccccgggggtgg

accatcctctagactgc

AYHLENEVARLKKL 105 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN4 1 AAHLENEVARLKKL 106 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN4 2 AAALENEVARLKKL 107 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN43 AAAAENEVARLKKL 108 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN44 NYHLENEVARLKKA 109 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN45 NYHLENEVARLKAA 110 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN46 NYHLENEVARLAAA 111 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN47 NYHLENEVARAAAA 112 Mutante de Aminoá alanina de cido epítopo de GCN48 LLPKNYHLENEVARLKKL 113 Epítopo de Aminoá GCN4 cido extendido

1 DLPQKYHLENEVARLKKL 114 Epítopo de Aminoá GCN4 cido extendido

2 LVGEAAAKEAAAKA 116 Ligador de Aminoá cadena cido pesada HCNT3 AEAAAKEAAAKA 117 Ligador de Aminoá cadena cido pesada HCNT4 ggcgggggcggaagt 118NT1FlexGGTGGGGGAGGGAGCGGTGGAGGTGGTTCT 119NT2Flex2AEAAAKEAAAKA 120 NT4 rígido Aminoá cido GCGGAAGCAGCCGCCAAAGAGGCTGCCGCGAAAGCG 121 NT4 rígido GSAGSAAGSGEF 122 NT5: Aminoá flexible cido GGTTCCGCCGGTTCCGCAGCCGGCTCCGGAGAGTTC 123 NT5:

flexible KESGSVSSEQLAQFRSLD 124NT7:Aminoáflexible,cidode scFvA A G G A A T C C G G G A G C G T G T C T T C C G A A C A G C T G G C T C A G T T 125NT7:

C C G C A G C C T G G A Tflexible,

de scFv

EGKSSGSGSESKST 126 NT8: Aminoá flexible de cido scFv G A G G G G A A G T C C T C C G G C T C T G G G T C C G A G T C C A A G T C C A C 127 NT8:

A flexible de scFv

APAPAPAPAPAPAP 128 NT9:

Prolilo

G C T C C C G C C C C T G C C C C A G C T C C T G C C C C C G C A C C C G C A C C 129 NT9:

C Prolilo

GG 130 NT10: Aminoá corto cido ggcggg 131 NT10:

corto GSTSGSGKPGSGEGSTKG 132 Sin ligador Aminoá de péptido cido (scFv) GSTSGSGKPGSGEGSTKG 133CooperAminoáLJNcido(2003) en CAR de FMC63ASTKGPSVFPLAP 134 LL - Aminoá pesada cido TVAAPSVFIFPP 135 LL- ligera Aminoá cido ASTKGP 136 SS - Aminoá pesada cido TVAAP 137 SS - ligera Aminoá cido NYHLENEVARLKKL 138 GCN4 en Aminoá LCNT1 cido LLPKNYHLENEVARLKKL 139 GCN4 en Aminoá LCNT1-A cido DLPKQYHLENEVARLKKL 140 GCN4 en Aminoá LCNT1-B cido LLPKNYHLENEVARLK 141 GCN4 en Aminoá LCNT1-C cido LPKNYHLENEVARLK 142 GCN4 en Aminoá LCNT1-D cido PKNYHLENEVARLK 143 GCN4 en Aminoá LCNT1-E cido KNYHLENEVARLK 144 GCN4 en Aminoá LCNT1-F cido NYHLENEVARLK 145 GCN4 en Aminoá LCNT1-G cido NYHLENEVARLKA 146 GCN4 en Aminoá LCNT1-H cido LLPKNYHLENEVARLKAL 147 GCN4 en Aminoá LCNT1-I cido KNYHLENEVARLKAL 148 GCN4 en Aminoá LCNT1-J cido NYHLENEVARLKAL 149 GCN4 en Aminoá LCNT1-K cido NYHLENEVARLKGL 150 GCN4 en Aminoá LCNT1-L cido NYHLENEVARLKAA 151 GCN4 en Aminoá LCNT1-M cido KNYHLENEVARLKGL 152 GCN4 en Aminoá LCNT1-N cido KNYHLENEVARLKAA 153 GCN4 en Aminoá LCNT1-O cido KNYHLENEVARLKKL 154 Variante Aminoá de GCN4 cido KNYHLENEVARLKAL 155 Variante Aminoá de GCN4 cido KNYHLENEVARLKGL 156 Variante Aminoá de GCN4 cido KNYHLENEVARLKAA 157 Variante Aminoá de GCN4 cido KNYHLENEVARLKGG 158 Variante Aminoá de GCN4 cido NYHLENEVARLKKL 159 Variante Aminoá de GCN4 cido NYHLENEVARLKAL 160 Variante Aminoá de GCN4 cido NYHLENEVARLKGL 161 Variante Aminoá de GCN4 cido NYHLENEVARLKAA 162 Variante Aminoá de GCN4 cido NYHLENEVARLKGG 163 Variante Aminoá de GCN4 cido EAAAKEAAAKEAAAKA 164 Ligador Aminoá rígido cido T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D 165 Bisagra de Aminoá F A C D CD8 cido

D 166 Aminoá cido ESKYGPPCPSCP 167 Bisagra de Aminoá IgG4 cido ESKYGPPCPPCP 168 Bisagra de Aminoá IgG4m cido X1NYHLENEVARLKX2X3 269 Estructura Aminoá I cido IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP 421 Bisagra de Aminoá CD28 cido

Ejemplos

Ejemplo 1

Diseño de conmutadores de CAR-EC humanizados

Antecedentes:

Se usó el clon murino anti-CD19, FMC63, como prueba de concepto en estudios preliminares como conmutador para el programa de CAR-EC conmutables. El clon FMC63 se describió originalmente en 1991 por H. Zola y colaboradores (1) y se usa en la célula CAR-T convencional mejor estudiada de Carl June y colaboradores (2-4). Para reducir el potencial de inmunogenicidad en aplicación en seres humanos, se sustituyeron parcialmente las regiones de entramado murinas del anticuerpo FMC63 por secuencias humanas.

Procedimiento general:

En resumen, el procedimiento de humanización se llevó a cabo de la siguiente manera: se presentaron las secuencias de FMC63 murinas para dominios ligero variable (VL) y pesado variable (VH) al programa IgBLAST disponible en el sitio web de NCBI en la dirección de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/igblast/; véase también Ye,et al.,Nucleic Acids Res., julio de 2013; 41 (Web Server Issue). Se comparó cada secuencia murina con secuencias de línea germinal murina y después se comparó con secuencias de línea germinal humana.

Análisis de cadena pesada

Se alineó VH murina de FMC63 con IGHV4-59 de línea germinal humana (tabla 4). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se definen generalmente usando AbYsis de AbM (disponible en la dirección de Internet bioinf.org.uk/abs/); en este informe se usará la numeración de AbM. De las numerosas diferencias de entramado entre VH de FMC murina e IGHV4-59 humana, se identificaron nueve que pueden influir en la conformación del dominio VH y sus CDR y que se decidió investigar para determinar su posible impacto.

El diseño hFMCH2 (tabla 4) tiene un entramado de IGHV4-59 humana (“h4-59_01”) completo con siete alteraciones, residuos murinos en las posiciones 20, 48, 67, 71, 78, 82, y 82c.

El diseño hFMCH3 (tabla 4) tiene Thr73 cambiado por Asn73 de ratón además de todos los cambios en hFMCH2.

También se investigó un cambio adicional en la posición 94: el diseño hFMCH4a tiene el cambio en la posición 94 además de todos los cambios incluidos en hFMCH2; el diseño hFMCH4b tiene el cambio en la posición 94 además de todos los cambios incluidos en hFMCH3.

Además, se mutó el residuo N-terminal para dar Glu en lugar de Gln en diversos constructos dado que esto elimina la formación de piroGln. En la figura 1A y en la figura 1B se proporcionan alineaciones de las secuencias de cadena pesada de diversos constructos a modo de ejemplo.

Tabla 4: secuencias de cadena pesada (véanse también la figura 1A y la figura 1B)

SEQ ID NO NOMBRE SECUENCIA

1 h4-59_01Q V Q LQ ESG PG L V K PSET LSL TC TV SG G SISSY Y W SW IR Q PPG K G L EW I

G Y IY Y SG STN Y N PSLK SR V TISV D TSK N Q FSLK LSSV TA A D TA V Y Y C A

R

2 hFMCH1Q V Q IQ E S G P G L V K P S E T L S IT C T V S G V S L P D Y G V S W IR Q P P G K G IE W I GVIW GSETTY Y N PSLK SRV TISV D TSK N Q FSLK LSSV TA A D TA V Y Y CA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

3 hFMCH2Q VQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGV SW IRQPPG KGLEW L GVIW GSETTY YNPSLKSRLTISKDTSK NQVSLKM SSLTAADTA VYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

4 hFMCH3 Q VQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGV SW IRQPPG KGLEW L

G V IW G SETTY YNPSLKSRLTISKDNSKNQVSLKM SSLTAAD TñVYYC A

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

5 hFMCH4aQ VQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGV SW IRQPPG KGLEW L GVIW GSETTY YNPSLKSRLTISKDTSK NQVSLKM SSLTAADTA VYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

6 hFMCH4bQ VQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGV SW IRQPPG KGLEW L GVIWGSETTY YNPSLKSRLTISKDNSKNQVSLKM SSLTAAD TAVYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

7 hFMCH4cQ VQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGV SW IRQPPG KGLEW L GVIWGSETT Y YNSALKSRLTISEDNSK1IQVSLKMSSLTAADTAVYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

8 hFMCH4zQ VQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGV SW IRQPPG KGLEW L GVIWGSETT Y YNSSLKSRLTISEDNSK1IQVSLKM SSLTAADTAVYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

9 hFMCH4b-xQ V Q L Q ESG PG LV K PSETLSLTC TV SG V SLPD Y G V SW IR Q PPG K G LEW I

G V IW G SETTY YNPSLKSRVTISK DNSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC A

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

10 hFMCH4c-xQ V Q IQ E S G P G L V K P S E T L S IT C T V S G V S L P D Y G V S W IR Q P P G K G IE W I GVIW GSETTY YNSALKSRVTISKDNSKNQFSLK LSSVTA ADTAVY YCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

11 hFMCH4c-20L-E EV Q LQ ESG PG LV K PSETLSLTC TV SG V SLPD Y G V SW IR Q PPG K G IEW L GVIW GSETTY YNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKM SSLTAADTAVYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

12 hFMCH4b-EEV Q LQESGPGLVK PSETLSVTC TVSGVSLPDYGVSW IRQPPGKGLEW L GVIW GSETTYYNPSLKSRLTISKDNSKW QVSLKMSSLTAADTAVYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

13 hFMCH4c-EEV Q LQESGPGLVK PSETLSVTC TVSGVSLPDYGVSW IRQPPGKGLEW L GVIW GSETTY YNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKM SSLTAADTAVYYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

14 hFMCH4b-20L-EEV Q LQ ESG PG LV K PSETLSLTC TV SG V SLPD Y G V SW IR Q PPG K G IEW L GVIW GSETTY YNPSLKSRLTISKDNSKNQVSLRM SSLTA ADTAV YYCA

RHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

15 mFMC63HE V K LQ E SG PG LV A PSQ SLSV TC TV SG V SLPD Y G V SW IR Q PPR K G IEW L

G V IW G S ET TY Y N SA LK SR LTIIK D N SK SQ V FLK M N SLQ TD D TA IY Y C A

RHYYYGGSYAMDYWGQGTSVT VS S

Análisis de cadena ligera

Se alineó VL de FMC murina con IGKV1-39 de línea germinal humana (tabla 5). Las definiciones de CDR usadas son las de AbM (disponible en la dirección de Internet bioinf.org.uk/abs/). De las numerosas diferencias de entramado entre VL de FMC murina e IGKV1-39 humana, sólo la posición 71 era probable que influyera en la conformación del dominio VL y sus CDR.

El diseño hFMCL2 incluye el cambio de Phe71Tyr.

La CDR-L3 de FMC tiene un residuo de Asn (Asn92) que tiene baja propensión a la desamidación, por tanto este residuo puede cambiarse por alanina. En la figura 2A y en la figura 2B se proporcionan alineaciones de las secuencias de cadena ligera.

Tabla 5: secuencias de cadena ligera (véanse también la figura 2A y la figura 2B)

SEQ ID NO NOMBRE SECUENCIA

16 IGKV1-39D IQ M TQ SPS SL S A S V G D R V TITC R A S Q S IS S Y L N W Y Q Q K P G K A P K LL I

Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T IS S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S Y S T P P

17 hFMCL1D IQ M T Q S P SSLSA SV G D R V TITC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PG K A PK LLI

Y H T S R L H SG V P SR F SG SG SG T D F T L T IS S L Q PE D F A T Y Y C Q Q G N T L PY

T FG Q G T K L E IK

18 hFMCL2D IQ M T Q S P SSLSA SV G D R V TITC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PG K A PK LLI

Y H T3R LH SG V P S R F S G S G S G TD Y T LT ISS L Q P ED F A T Y Y C Q Q G A TL P Y

T FG Q G T K L E IK

19 hFMCL2aDIQ M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RA SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PG K A V K LLI

Y H T S R L H SG V PSR FSG SG SG TD Y T LT ISSL Q PED FA T Y Y C Q Q G A TL PY

T FG Q G T K L E IK

20 hFMCL2bDIQ M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RA SQ D ISK Y LH W Y Q Q K PG K A V K LLI

Y H T S R L H SG V P SR F SG SG SG T D Y T L T IS S L Q P E D F A T Y F C Q Q G A T L PY

T FG Q G T K L E IK

21 hFMCL2b-1D IQ M T Q S P SSLSA SV G D R V TITC R A SQ D ISK Y LH W Y Q Q K PG K A PK LLI

T FG Q G T K L E IK

22 hFMCL2b (V44L)D IQ M TQ SPSSLSA SV G D R V TITC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PG K A LK LLI

T FG Q G T K L E IK

23 hFMCL2b (A92N)DIQ M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RA SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PG K A V K LLI

Y H T S R L H SG V P SR F SG SG SG T D Y T L T IS S L Q P E D F A T Y F C Q Q G N T L PY

T FG Q G T K L E IK

24 hFMCL2cDIQ M TQ SPSSLSA SV G D RV TITC RA SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PG K A V K LLI

T FG Q G T K L E IK

25 mFMC63LD IQ M T Q TT S S LSA SLG D R V TISC R A SQ D ISK Y LN W Y Q Q K PD G TV K LLI

Y H T S R L H SG V P SR F SG SG SG T D Y S L T IS N L E Q E D IA T Y F C Q Q G N T L PY

T FG G G T K L E IK

Producción de conmutador

Se produjeron conmutadores de CAR-EC que contenían las secuencias humanizadas anteriores de “VH de FMC63” y/o “VL de FMC63” fusionando genéticamente un péptido de GCN4 al extremo N-terminal de la cadena ligera (LCNT) conectado con un ligador GGGGS tal como se describe en Rodgers DT,et al.,PNAS, 2016; 113(4): E459-68. doi: 10.1073/pnas.1524155113. PubMed PMID: 26759369; PMCID: PMC4743815. En estos ejemplos no limitativos, se usó un péptido de GCN4 que comprendía la secuencia NYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 26). Por tanto, los constructos de LCNT comprendían la siguiente estructura: NYHLENEVARLKKL-[GGGGS]-[secuencia de VL de FMC63 o variantes humanizadas de la misma].

(5). Se expresaron conmutadores con una cadena pesada y una cadena ligera (por ejemplo, VL de FMC63 o una variante de LCNT fusionada a péptido de GNC4) y se purificaron para obtener la homogeneidad tal como se describe en el ejemplo 2.

La tabla 6 muestra 21 ejemplos no limitativos de variantes de conmutador de CAR-EC humanizado. Las combinaciones de cadena pesada / cadena ligera usadas para producir estos conmutadores se muestran en las filas de la tabla 6. Por ejemplo, el conmutador de CAR-EC marcado a continuación como combinación 2 incluía la cadena pesada variable humanizada H2 de FMC63 (es decir, hFMCH2 mostrada en la figura 1A y la figura 1B) y la cadena ligera variable humanizada L2 (es decir, hFMCL2 mostrada en la figura 2A y la figura 2B). Tal como se comentó anteriormente, todas las cadenas ligeras incluidas en los conmutadores de CAR-EC mostrados a modo de ejemplo en este ejemplo comprendían además la fusión de péptido de GCN4 en su extremo N-terminal, unida mediante el ligador GGGGS. Por tanto, la combinación 2 comprendía hFMCH2 y una cadena ligera marcada con etiqueta que tenía la estructura general (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal o “de N a C” para abreviar) NYHLENEVARLKKL-[GGGGS]-[hFMCL2]; la combinación 3 comprendía hFMCH3 y una cadena ligera marcada con etiqueta que tenía la estructura general de N a C de NYHLENEVARLKKL-[GGGGS]-[hFMCL2]; la combinación 7 comprendía hFMCH4b y una cadena ligera marcada con etiqueta que tenía la estructura general de NYHLENEVARLKKL-[GGGGS]-[hFMCL2b]; y así sucesivamente. Estas secuencias de conmutador N-terminal de cadena ligera (LCNT) se indican a continuación en la tabla 7.

Tabla 6: variantes de FMC63 humanizadas

Tabla 7: secuencias de cadena ligera de LCNT

SEQ ID NO NOMBRE SECUENCIA

27 hFMCL1-LCNT NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFAT Y'YCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK

28 hFMCL2-LCNT NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHT3RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYYCQQGATLPYTFGQGTKLEIK

29 hFMCL2a-LCNT NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYYCQQGATLPYTFGQGTKLEIK

30 hFMCL2b-LCNTNYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK

31 hFMCL2b-1-LCNTNYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK

32 hFMCL2b (V44L) -LCNT NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKALKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK

33 hFMCL2b (A92N) -LCNT NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK

34 hFMCL2c-LCNTNYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDI SKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISS LQPEDFATYFCQQGATLPYTFGQGTKLEIK

35 mFMC63-LCNT NYHLENEVARLKKLGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDI SKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISN LEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIK

Ejemplo 2

Expresión y purificación de conmutadores de CAR-EC humanizados

En resumen, para expresar y purificar conmutadores de CAR-EC humanizados, se emparejó una variante de cadena pesada, tal como se describe en la tabla 4, con una variante de cadena ligera, tal como se describe en la tabla 5, según el esquema mostrado en la tabla 6, en el que la cadena ligera comprendía el péptido de GCN4 unido mediante el ligador GGGGS en el formato de LCNT, tal como se muestra en la tabla 7, y se expresó y se purificó el conmutador resultante según el siguiente método de expresión de proteínas.

Expresión de proteínas en células Expi293F (volumen de cultivo de 30 ml)

Se llevaron a cabo transfecciones de células Expi293F (ThermoFisher, Waltham, MA, número de catálogo A14527) usando una versión modificada del protocolo del fabricante proporcionado con el kit de transfección ExpiFectamine 293 (ThermoFisher, Waltham, MA, número de catálogo A14524).

En resumen, 24 horas antes de la transfección, se sembraron células Expi293F (ThermoFisher, Waltham, MA, número de catálogo A14527) a 1,5*10® células/ml en medio de expresión Expi293 previamente calentado (ThermoFisher, Waltham, MA, número de catálogo A1435101). En el día de la transfección, se contaron las células, se comprobaron para determinar la viabilidad, y después se diluyeron en medio de expresión Expi293 previamente calentado hasta una densidad final igual a 2,9*10® células/ml. Se devolvió el matraz al agitador orbital en una incubadora a 37°C/5 % de CO2 durante un mínimo de 1 h.

Se realizaron transfecciones con ADN que codificaba para las proteínas de conmutador de CAR-EC con una razón de 1:1 de cadena pesada con respecto a ligera (15 |jg de ADN para cada cadena). Se diluyó ADN en medio de suero reducido OptiMEM I hasta un volumen final de 1,5 ml. Se diluyeron 80 j l de ExpiFectamine en 1,5 ml de medio de suero reducido OptiMEM I y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadió la mezcla de ExpiFectamine/OptiMEM I al tubo que contenía ADN y después se agitó suavemente con una pipeta y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Se retiraron las células Expi293F de la incubadora a 37°C/5 % de CO2 y se añadieron 3 ml de la mezcla de ADN/ExpiFectamine a las células y se incubaron en un agitador orbital a ~120 rpm en una incubadora a 37°C/5 % de CO2. 16-18 h tras la transfección, se añadieron 150 j l de potenciador 1 y 1,5 ml de potenciador 2 (proporcionados en el kit de transfección ExpiFectamine 293) a cada pocillo. El volumen final era de aproximadamente 30 ml. Finalmente, 72 h tras la transfección, se recogieron las células y se purificaron los conmutadores según el protocolo descrito a continuación.

Purificación de proteína G (volumen de lecho sedimentado de 0,6 ml)

72 h tras la transfección, se recogieron los cultivos de células de 30 ml que contenían los conmutadores de CAR-EC, y se transfirieron las células / medios a un tubo cónico de 50 ml y se centrifugaron 5 minutos a 400 x g (~1.000 rpm), se esterilizaron por filtración y se mezclaron con un volumen de 1/40 (0,75 ml) de 20x tampón de unión a proteína G (acetato de sodio 1 M), pH 5,2, para reducir el pH de las disoluciones de conmutador de CAR-EC en bruto para una unión óptima a proteína G-Sepharose.

Se preparó una suspensión al 50 % de Sepharose de flujo rápido de proteína G (GE Healthcare, código de producto 17-0618-01) en 1x tampón de unión a proteína G, y se añadieron 1,2 ml de la suspensión al 50 % a una columna de cromatografía Poly Prep de 12 ml y después se lavó con 6 ml de 1x tampón de unión a proteína G. Se hizo pasar el sobrenadante que contenía proteína de conmutador de CAR-EC expresada sobre la columna, y se recogió el flujo pasante en tubos cónicos de 50 ml. Se lavó la columna con 12 ml (20 VC) de 1x tampón de unión a proteína G, y después se eluyeron proteínas de conmutador de CAR-EC en 1,8 ml de glicina 100 mM, pH 2,8, y después se añadieron 0,2 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8, a los eluatos para neutralizar el pH.

Tras la elución, se añadió 1x PBS, pH 7,4, a fracciones de elución para producir un volumen final igual a 2,5 ml. Se sometió el tampón a intercambio con 1x PBS, pH 7,4, usando columnas de desalación PD10 de la siguiente manera: se equilibraron columnas PD10 con 25 ml de 1x PBS, pH 7,4. Se añadieron 2,5 ml de la disolución de proteína purificada a la columna PD10. Se eluyó la proteína a partir de la columna de desalación PD10 en 3,5 ml de 1x PBS, pH 7,4, y se concentraron las fracciones de proteína hasta aproximadamente 0,200 ml en 4 ml de concentradores de centrifugación Amicon con un punto de corte de 10 K.

Se midió la concentración de proteína mediante NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA) según el protocolo del fabricante, y después se visualizaron 2 jg de proteína mediante SDS-PAGE en un gel con gradiente de Bis-Tris del 4-12 %. La figura 3 y la figura 4 muestran fotografías de los geles con 2 jg de proteína cargados en cada carril, y se analizaron en dos condiciones: sin reducción (lado izquierdo) y con reducción mediante la adición de DTT 10 mM (lado derecho).

Todas las variantes de conmutador de CAR-EC humanizado se expresaron bien.

Ejemplo 3

Determinación de la eficiencia de unión de conmutador de CAR-EC

Para determinar la eficiencia de unión relativa de variantes humanizadas, se llevó a cabo unión basada en citometría de flujo de la siguiente manera:

Preparación de células para análisis por citometría de flujo de eficiencia de unión de conmutador de CAR-EC.

Se recogieron células RS4;11 CD19+ (ATCC® CRL-1873™) y se centrifugaron a 300 x g durante 5 min a 4°C y después volvieron a suspenderse las células en tampón de FACS helado (PBS, suero de ternero fetal al 5 %, EDTA 1 mM) a una concentración de 5 x 106 células/ml. Se dispensaron 100 pl de suspensión de células por pocillo de una placa de 96 pocillos, y después se lavaron las células usando el siguiente método de lavado: a) se añadieron 200 pl de tampón de FACS a cada pocillo de la placa; b) se centrifugó la placa a 300 x g durante 5 min a 4°C; c) se retiró el sobrenadante de la placa mediante movimiento de “golpecitos” en un desagüe; d) se soltaron los sedimentos celulares mediante agitación suave con vórtex de la placa; y e) volvieron a suspenderse los sedimentos celulares en un volumen apropiado tampón (tal como se describe a continuación).

Para la unión de conmutador de CAR-EC inicial, volvieron a suspenderse cada uno de los sedimentos celulares de la etapa e) del método de lavado con 50 pl de proteína de conmutador de CAR-EC de “prueba” primaria diluida en tampón de FACS. Se usó un intervalo de concentraciones de conmutador de CAR-EC para someter a prueba la unión, por ejemplo que oscilaron desde 10'1 hasta 103 pM de conmutador de CAR-EC.

Se incubaron las células con los conmutadores de CAR-EC a 4°C, en la oscuridad, durante 30 minutos, y después se lavaron las células 3 veces usando el método de lavado descrito anteriormente. Volvieron a suspenderse cada uno de los sedimentos celulares de la etapa e) del método de lavado con 50 pl de anticuerpo de detección diluido 1/100 en tampón de FACS (el anticuerpo de detección era anticuerpo de cabra conjugado con PE anti-kappa humana: Southern Biotech, n.° de cat. 2060-09). Se incubaron las células a 4°C, en la oscuridad, durante 30 minutos, se lavaron 3 veces usando el método de lavado descrito anteriormente, y después volvieron a suspenderse cada uno de los sedimentos celulares de la etapa e) del método de lavado con 100 pl de tampón de FACS.

Se adquirieron datos en un citómetro de flujo configurado para una placa de 96 pocillos con fondo en U, con un ajuste de láser de 3 de azul y 1 de rojo. Se establecieron compuertas para identificar la población de células de interés, células individuales y células positivas para PE, y se adquirieron 30.000 acontecimientos.

Análisis de datos

Se analizaron datos de citometría de flujo usando el software FlowJo V10 (FlowJo, LLC, Ashland, OR). En resumen, se obtuvo una señal de intensidad de fluorescencia media (MFI) de PE en todos los acontecimientos, pero no se reguló para detectar células positivas para PE. Se creó una tabla de XY en GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) y se introdujeron los datos para representar gráficamente MFI de PE frente a la concentración de conmutador de CAR-EC. Se transformaron los datos usando la función X=log y después ajustando usando la función “ log (agonista) frente a respuesta (tres parámetros)”. La figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8 y la figura 9 muestran los gráficos de datos para los diversos conmutadores de CAR-EC sometidos a prueba. Se muestran los valores de CE50 junto a los gráficos.

Ejemplo 4

Determinación de eficacia de conmutador de CAR-EC para inducir citotoxicidad de célula diana

Para determinar la eficacia de las variantes de FMC63 humanizadas como conmutadores para la plataforma de células CAR-T conmutables, se expresaron variantes con el péptido de GCN4 en el extremo N-terminal de la cadena ligera (LCNT) conectado con un ligador GGGGS tal como se describió en el ejemplo 1, anteriormente, y se expresaron los conmutadores y se purificaron con una variante de cadena pesada y una de cadena ligera-LCNT y se purificaron para obtener la homogeneidad tal como se describió anteriormente en los ejemplos 1 y 2.

Se construyó la célula sCAR-T tal como se describió anteriormente en Rodgers DT (2016), citado anteriormente. El constructo se describe brevemente como scFv anti-GCN4 - bisagra de IgG4m - dominio transmembrana de CD8 -dominio coestimulante de CD137 (también conocido como 4-1BB) - dominio de activación de CD3z.

Método de ensayo de citotoxicidad

Se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad de la siguiente manera. En el día 1, se preparó una dilución en serie de 6 puntos de los conmutadores en RPMI-5 frío en una placa de 96 pocillos de fondo plano usando 1 columna para cada conmutador. Opcionalmente, se almacenaron las placas de conmutador a 4°C durante 1 semana, o se sometieron a congelación inmediata en hielo seco se almacenaron a -80°C a largo plazo. Se hicieron pasar las muestras por duplicado o por triplicado. Adicionalmente, se incluyeron los siguientes controles:

i. Destrucción máxima - sólo células diana, que se sometieron a lisis 45 min antes del final del ensayo para proporcionar un valor para el nivel de LDH máximo / el 100 % de citotoxicidad. La destrucción máxima también se denomina “valor de LDH máximo”.

ii. Destrucción espontánea - sólo células diana, que actúan como lisis de células diana de fondo.

iii. Células efectoras solas - este control indica la señal de LDH de fondo de células efectoras, para su uso en el diagnóstico si el ensayo no funciona.

iv. Células efectoras y diana solas - control sin conmutador para determinar la citotoxicidad de fondo como resultado del cultivo conjunto de células.

v. Medios solos - control para medios para su uso en el diagnóstico si el ensayo no funciona, y para calcular la citotoxicidad de células CAR-T convencionales.

Se centrifugaron las células a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se sembraron en medio RPMI-5 previamente calentado a una concentración de 2x106/ml para las células efectoras de CAR y a 2x105/ml para las células diana. Las células diana y efectoras de CAR tenían >95 % de viabilidad para reducir el fondo. Para ensayos convencionales, se usaron 100.000 células efectoras (E) y 10.000 células diana (T), dando una razón de E:T de 10:1. Los ensayos usaron 50 pl de células efectoras y 50 pl de células diana en cada pocillo, y después se completaron los pocillos con medios para garantizar un volumen igual en todos los pocillos. Finalmente, se añadieron 2 pl de diluciones de conmutador de CAR-EC a los pocillos relevantes y después se incubaron las placas durante 20-24 horas.

Método de ensayo de LDH: día 2, realización del ensayo de LDH:

Se llevaron a cabo ensayos de LDH usando el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, G1780) según el protocolo del fabricante. Todos los tampones y reactivos indicados a continuación en este ensayo son componentes de este kit de CytoTox 96®. En resumen, en el día 2, 45 minutos antes del final del ensayo, se añadieron 10 pl de 10x tampón de lisis a los pocillos de control de “destrucción máxima”, y se sometieron manualmente las células a lisis mediante múltiples acciones de pipeteado.

Se preparó una mezcla maestra de LDH añadiendo 12 ml de tampón de ensayo descongelado en un baño de agua a 37°C a 1 vial de reactivo de trabajo de ensayo de LDH. Tras la incubación de 45 minutos de los pocillos de control de destrucción máxima con el tampón de lisis, se centrifugó la placa a 400 x g durante 5 minutos y se transfirieron 30 pl de los sobrenadantes a pocillos idénticos en una nueva placa de 96 pocillos (de fondo plano). Se añadieron 30 pl de reactivo de trabajo de LDH a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después, se añadieron 30 pl de la disolución de parada a cada pocillo y se leyó la absorbancia a DO495 y se exportaron los datos como archivos.txt o .xlsx.

Análisis de datos del ensayo de LDH:

Se transfirieron datos sin procesar a Microsoft Excel y se calculó un valor del 100 % de citotoxicidad para el ensayo usando la siguiente fórmula: DO de destrucción máxima menos DO de destrucción espontánea.

Se restó el valor de “células efectoras y diana solas” (es decir, lectura de DO495) a partir de todos los valores de muestras.

Se calculó el porcentaje de citotoxicidad usando la siguiente fórmula:

100 x (DO495 de muestra / valor de LDH máx.)

Se representaron gráficamente los valores en GraphPad Prism. Se transformaron los datos usando la función X=log y se calcularon los valores de CE50 usando la función de ajuste “log (agonista) frente a respuesta (tres parámetros)”.

Resultados del ensayo de citotoxicidad de LDH:

Los resultados del ensayo de citotoxicidad de LDH se muestran en las figuras 10-11. Específicamente, la figura 10 muestra la citotoxicidad de LDH de células sCAR-EC (por ejemplo, células sCAR-T) frente a células RS4;11, que son positivas para CD19, y la figura 11 muestra la citotoxicidad de LDH de células sCAR-EC (por ejemplo, células sCAR-T) frente a células K562, que son negativas para CD19. En ambos casos, las células sCAR-EC (por ejemplo, células sCAR-T) eran positivas al 80 % para la expresión del CAR conmutable, y se trataron las células con uno de las diversas variantes de conmutador de CAR-EC humanizado indicadas en las leyendas.

Se observó una fuerte inducción dependiente de la dosis de la citotoxicidad de células RS4;11 positivas para CD19 mediante tratamiento con la combinación de sCAR/conmutador humanizado (figura 10, tabla 8). La tabla 8 muestra los valores de CE50 para el ensayo de citotoxicidad de LDH con diversos conmutadores humanizados repetidos a lo largo de 4 ensayos. Los ensayos se numeran DTR-5-15 (mostrado en la figura 10), DTR-5-16, DTR-5-50, DTR-5-51. Los ensayos en los que las células se etiquetan como PBMC son células CAR-T conmutables derivadas de la transducción de PBMC no clasificadas, y los ensayos en los que las células se etiquetan como CD4:CD8 son células CAR-T conmutables derivadas de células T CD4 y CD8 clasificadas, transducidas y usadas en razones iguales en el ensayo de citotoxicidad. muFMC63-LCNT indica el conmutador basado en FMC63 murino.

Tabla 8: valores de CE50 para el ensayo de citotoxicidad con conmutadores humanizados (4 ensayos repetidos).

En contraposición a la fuerte inducción dependiente de la dosis de la citotoxicidad de células RS4;11 positivas para CD19 observada mediante tratamiento con la combinación de sCAR/conmutador humanizado (figura 10), se observó de poca a ninguna citotoxicidad de LDH de células sCAR-EC (por ejemplo, células sCAR-T) frente a células K562 negativas para CD19 mediante tratamiento con la combinación de sCAR/conmutador humanizado (figura 11). Por tanto, la citotoxicidad inducida por combinaciones de sCAR/conmutador humanizado es específica para células que expresan el antígeno diana (CD19), y no se produce activación de citotoxicidad no específica debida simplemente a la unión del conmutador a su célula sCAR-T.

Para determinar si existía una correlación entre la afinidad de unión (mediante citometría de flujo) y la actividad (mediante citotoxicidadin vitro),se representaron gráficamente las afinidades junto con la liberación de citocinas y la CE50 de citotoxicidad para cada candidato (gráfico en cascada de la citotoxicidad mostrado en la figura 22A, correlaciones mostradas en la figura 22B). Se encontró una relación lineal entre la afinidad y la CE50 así como entre la liberación de citocinas y la CE50in vitrocon r2 mostradas en la figura: las CE50 de potencia superior (inferiores) proporcionaron una liberación de citocinas superior (medida a 0,1 nM de conmutador) y se encontró que las CE50 de potencia superior (inferiores) se correlacionaban con candidatos humanizados de afinidad superior.

Para someter a ensayo cómo funcionaban estos candidatosin vivo,se realizó un ensayo de NALM-6 usando las presentes condiciones convencionales (figura 22C). En el primer experimento, se sometieron a prueba cuatro candidatos, L2b/H4b, L2b/H4c, L2c/H4b, L2c/H4c, en este modelo usando el candidato de CAR-T de 52SR4 murino basado en 4-1BB original (TSY-2-193). En el segundo experimento, se repitió el candidato de CAR-T de 52SR4 murino basado en 4-1BB original y se comparó con la célula sCAR-T candidata de L5H4 de 28BB de tercera generación. En conjunto, el candidato de conmutador humanizado L2b/H4c eliminó tumores en 5 de 9 ratones. Esto fue superior a otros candidatos. La alineación de este candidato con las regiones de entramado humanizadas y la secuencia de FMC63 murina original se proporciona en la figura 23.

El candidato de conmutador humanizado L2b/H4c tenía características biofísicas favorables mediante un análisis de capacidad de desarrollo que incluyó EM de alta resolución, estabilidad térmica, análisis de epítopos de células Tin silico(inmunogenicidad), y cromatografías CIC, SIC, HIC, SEC. Específicamente, L2b/H4c tenía una estabilidad térmica y rendimientos mejorados con respecto al conmutador basado en FMC63 quimérico (figura 22D). La exclusión molecular analítica mostró que el candidato L2b/H4c era un monómero.

Ejemplo 5

Análisis de inmunogenicidad del clon hfmc2b-lcnt/hfmch4c

Usando el sistema EpiMatrix (EpiVax, Inc, Providence, RI), se analizaron la secuencia de aminoácidos de huFMCL2b-LCNT de cadena ligera (obsérvese que, en algunas realizaciones, se usan “hu” y “h” de manera intercambiable en diversos constructos, por ejemplo, huFMCL2b y hFMCL2b, para designar que el constructo está al menos parcialmente humanizado), y las secuencias de hFMCH4c de cadena pesada para determinar potenciales inmunogénicos tanto global como regional. Además, se examinaron estas secuencias frente a las bases de datos de proteínas humanas no redundantes en Genbank para determinar epítopos de clase II de MHC y la base de datos de epítopos inmunitarios en La Jolla Institute for Allergy and Immunology, disponible at la dirección de Internet: iedb.org/. Finalmente, se combinaron dominios variables de cadena pesada y ligera con el fin de evaluar el potencial inmunogénico del anticuerpo huFMC completo.

Siendo todos los demás factores iguales, cuantos más ligandos de HLA (es decir, coincidencias de EpiMatrix) están contenidos en una proteína dada, más probable es que esa proteína induzca una respuesta inmunitaria. Para capturar este concepto, se usó la puntuación de proteínas de EpiMatrix. La puntuación de proteínas de EpiMatrix es la diferencia entre el número de epítopos de células T predichos que se esperaría encontrar en una proteína de un tamaño dado y el número de epítopos supuestos predichos por el sistema EpiMatrix. La puntuación de proteínas de EpiMatrix se correlaciona con la inmunogenicidad observada. Las puntuaciones de proteínas de EpiMatrix se “normalizan” y pueden representarse gráficamente en una escala normalizada. La puntuación de proteínas de EpiMatrix de una proteína “promedio” es cero. Las puntuaciones de proteínas de EpiMatrix por encima de cero indican la presencia de un exceso de ligandos de MHC y designan un potencial superior de inmunogenicidad, mientras que las puntuaciones por debajo de cero indican la presencia de menos ligandos de MHC posibles de lo esperado y un potencial inferior de inmunogenicidad. Se considera que las puntuaciones de proteínas por encima de 20 tienen un potencial inmunogénico significativo.

Ajuste para la presencia de epítopos de células T regulatorias. Los anticuerpos son proteínas únicas ya que las secuencias de aminoácidos de sus dominios variables, especialmente sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR), pueden variar en un grado extraordinario. Esta variabilidad es lo que permite que los anticuerpos reconozcan una amplia variedad de antígenos. Sin embargo, esta flexibilidad tiene un coste. Los acontecimientos de recombinación y mutación que controlan la maduración de anticuerpos también pueden producir nuevos o neo-epítopos de células T. Estos neo-epítopos pueden parecer “foráneos” a las células T en circulación. La presencia de neo-epítopos en secuencias de anticuerpo puede conducir a la formación de una respuesta humana frente a anticuerpos humanos; la denominada respuesta HAHA.

Las células T regulatorias desempeñan un papel importante en la supresión de las respuestas inmunitarias frente a proteínas completamente humanas en la periferia, incluyendo las que contienen secuencias mutadas y/o altamente variables tales como las CDR de anticuerpos. Las células T regulatorias participan y se activan por epítopos de células T regulatorias. Se cree que el riesgo inherente asociado con la presencia de neo-epítopos en secuencias de anticuerpo está equilibrado por la presencia de epítopos de células T regulatorias que se producen de manera natural.

Examinando las secuencias de muchos aislados de anticuerpos humanos, se han identificado varios ligandos de HLA altamente conservados que se cree que tienen potencial regulador. Las evidencias experimentales sugieren que muchos de estos péptidos son, de hecho, activamente tolerogénicos en muchos sujetos. A estos fragmentos altamente conservados se les denomina tregitopos. La observación de tregitopos se ha publicado en Blood (De Groot, AS,et al.,Blood (2008), 15 de octubre; 112(8): 3303-11), y muchos tregitopos candidatos están con patentes en tramitación. En muchos casos, el potencial inmunogénico de neo-epítopos contenidos en anticuerpos humanizados puede controlarse eficazmente en presencia de números significativos de tregitopos. Para los fines de análisis de inmunogenicidad de anticuerpos, se desarrolló una puntuación de EpiMatrix ajustada para tregitopos y la predicción correspondiente de la respuesta de anticuerpos anti-producto terapéutico. Para calcular la puntuación de EpiMatrix ajustada para tregitopos, se dedujeron las puntuaciones de los tregitopos a partir de la puntuación de proteínas de EpiMatrix de los dominios variables combinados del anticuerpo. En la experiencia de los presentes inventores, las puntuaciones ajustadas para tregitopos se correlacionaron bien con la respuesta inmunitaria clínica observada.

Tras ajustar para la presencia de tregitopos, las puntuaciones de proteínas de EpiMatrix de dominios variables de anticuerpos tienden a reducirse. La puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos promedio de 22 anticuerpos autorizados es de -20,71. Evidentemente, no todos los anticuerpos se crean iguales. Algunos contienen muchos tregitopos mientras que otros contienen pocos o ninguno en absoluto. La puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos promedio de 10 anticuerpos que se sabe que inducen anticuerpos anti-producto terapéutico en más del 5 % de los sujetos expuestos es de -4,77. La puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos promedio de 12 anticuerpos que se sabe que inducen anticuerpos anti-producto terapéutico en menos del 5 % de los sujetos expuestos es de -34,01. La presencia de números significativos de tregitopos se correlaciona bien con una baja inmunogenicidad observada. Teniendo en cuenta todos los anticuerpos en la presente muestra, el coeficiente de correlación entre la puntuación de EpiMatrix ajustada para tregitopos y la inmunogenicidad observada es de 0,76 (véase la figura 12).

Resulta interesante indicar la aparente contradicción entre la puntuación promedio ajustada para tregitopos relativamente baja de anticuerpos inmunogénicos (-4,77) y la incidencia relativamente alta de respuesta inmunitaria anti-producto terapéutico observada. Se sugiere que los neo-epítopos contenidos en las CDR de anticuerpos son factores de riesgo significativos incluso en anticuerpos de puntuación por lo demás baja. Tal como se sugirió anteriormente, se cree que el alto riesgo asociado con las CDR de anticuerpos es probablemente el factor de impulsión evolutivo detrás del desarrollo y la retención de tregitopos dentro de la línea germinal de anticuerpos humanos.

Resultados.

Al analizar las secuencias de cadena pesada y ligera presentadas, se realizó un total de 3.520 evaluaciones de marco por alelo. A continuación en la tabla 9 se presenta un resumen de los hallazgos.

Tabla 9: potencial inmunogénico global de secuencias de hFMC2b-LCNT / hFMCH4c

La figura 13 presenta los presentes hallazgos en una escala gráfica y también muestra cómo se clasifican las secuencias presentadas frente a una serie de controles convencionales.

hFMCH4c contiene un total de 104 coincidencias de EpiMatrix. Su puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos es de -22,51. Esta puntuación se encuentra en el extremo inferior de la presente escala e indica un potencial limitado de inmunogenicidad. hFMC2b-LCNT contiene un total de 111 coincidencias de EpiMatrix. Su puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos es de -15,70. Esta puntuación se encuentra en el intervalo neutro de la presente escala e indica un potencial ligeramente reducido de inmunogenicidad. Mirando a los dominios variables de huFMC combinados, se calculó una puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos de -13,73, y, basándose en una regresión de la puntuación de proteínas de EpiMatrix ajustada para tregitopos frente a la inmunogenicidad clínica observada en un conjunto de productos de anticuerpo monoclonal autorizados, se predijo una tasa de anticuerpos anti-fármaco del 5,7 %. En comparación con otros anticuerpos autorizados que se sabe que no son inmunogénicos, estas puntuaciones son ligeramente elevadas, indicando al menos cierto potencial de respuesta anti-producto terapéutico.

Ejemplo 6

Modificación del epítopo del péptido de GCN4

Para determinar el epítopo óptimo para la unión al CAR de 52SR4 (anti-GCN4), se modificó la secuencia de péptido de GCN4 (SEQ ID NO: 138) en diversas posiciones, creando por tanto derivados de péptido de GCN4.

En SEQ ID NO: 139, se expandió el epítopo de GCN4 en 3 residuos en el extremo N-terminal y 1 residuo en el extremo C-terminal.

En SEQ ID NO: 140, se mutó el residuo L1 para dar D y se mutó N5 para dar Q. Esto se basó en una secuencia alternativa del péptido de GCN4 encontrada en la bibliografía en la que los cinco primeros residuos del péptido de GCN4 son DLP<k>Q (Zahnd C,et al.The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, n.° 18, número del 30 de abril, págs.

18870-18877, 2004).

En SEQ ID NO: 141, se eliminaron los residuos K y L del extremo C-terminal para determinar si una secuencia más corta, truncada a partir del extremo C-terminal, todavía era activa.

En SEQ ID NO: 142, se eliminó L1 para determinar si este residuo estaba implicado en la actividad.

En SEQ ID NO: 143, se eliminaron L1 y L2 para determinar si estos residuos estaban implicados en la actividad y para entender la viabilidad de la expresión para una secuencia que comienza con prolina.

En SEQ ID NO: 144, se eliminaron L1, L2 y P3 para truncar adicionalmente la proteína para determinar el impacto sobre la actividad.

En SEQ ID NO: 145, se eliminaron L1, L2, P3 y K4 para truncar adicionalmente la proteína para determinar el impacto sobre la actividad.

En SEQ ID NO: 146, se eliminaron L1, L2, P3, K4 y L18; se sustituyó K17 por A para extender el péptido a partir del extremo C-terminal (separando el ligador GGGGS a partir del péptido) al tiempo que se eliminó el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 147, se sustituyó K17 por A para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 148, se eliminaron L1, L2 y P3; se sustituyó K17 por A para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original y para someter a prueba esto en combinación con el motivo de péptido extendido mostrado en A.

En SEQ ID NO: 149, se eliminaron L1, L2, P3 y K4; se sustituyó K17 por A para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 150, se eliminaron L1, L2, P3 y K4; se sustituyó K17 por G para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 151, se eliminaron L1, L2, P3 y K4; se sustituyó K17 por A y se sustituyó L18 por A para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 152, se eliminaron L1, L2, y P3; se sustituyó K17 por G para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 153, se eliminaron L1, L2, y P3; se sustituyó K17 por A y se sustituyó L18 por A para eliminar el motivo de doble lisina (KK) que existía en la secuencia de péptido original.

En SEQ ID NO: 245, se eliminaron L1, L2, P3 y K4 y se expandió el epítopo en 1 residuo en el extremo C-terminal. Se crearon conmutadores que contenían cada uno de los péptidos indicados en la tabla 10 mediante expresión de dichos péptidos en el formato de LCNT en el clon de anticuerpo anti-CD19 FMC63 murino en formato de FAB.

Se sometió a prueba la unión de los conmutadores de epítopos modificados a células CAR-T conmutables (sCAR de 52SR4) usando el mismo ensayo de unión (detallado anteriormente en el ejemplo 3) (figura 20).

Se sometió a prueba la actividad de los conmutadores de epítopo modificados en un ensayo de citotoxicidad de LDH tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4, y se determinaron los valores de CE50 tal como se describió anteriormente (figura 21).

Tabla 10: secuencias de epítopo de GCN4

Ejemplo 7

Comparación de dominios coestimulantes

Para determinar el efecto del dominio coestimulante sobre la actividad de células sCAR-T, se subclonó el scFv de sCAR anti-péptido de GCN4 (clon 52SR4) a partir del presente constructo basado en 4-1BB de segunda generación anteriormente notificado [Rodgers, D.T. (2016)] en vectores que albergaban un dominio coestimulante (coestimulación) de CD28 de segunda generación o un dominio de coestimulación de CD28/4-1BB (28BB) de tercera generación [Zhang (2007); Zhong (2010)]. Se conservaron los dominios de bisagra de IgG4m (SEQ ID NO: 168) y transmembrana de CD8 (TM) (IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC; SEQ ID NO: 398) para ser compatibles con los presentes diseños anteriores. La transducción de estas construcciones en células T derivadas de donantes sanos no logró demostrar la expresión en superficie del scFv (datos no mostrados). Dado que los constructos de segunda generación y tercera generación se han usado ampliamente en otras partes, se planteó la hipótesis de que el fallo de los presentes constructos se debía a una incompatibilidad en la fusión de la región de CD8TM o bisagra de IgG4m con la coestimulación de CD28. Para someter a prueba esta hipótesis, se usó CD28 TM o CD28 TM con bisagra de CD28 para sustituir CD8 TM y bisagra de IgG4m para producir los constructos de sCAR A-F (figura 24A). La transducción en células derivadas de donantes sanos demostró que tanto la coestimulación con bisagra de IgG4m/CD28TM/CD28 como la coestimulación con bisagra de CD28/CD28TM/CD28 expresó scFv en la superficie de la célula, confirmando la incompatibilidad de la coestimulación de CD8 TM con CD28 en los constructos iniciales. Las secuencias de los diversos dominios extracelulares, transmembrana e intracelulares incluidos en los constructos de CAR se muestran en la figura 24C.

Experimentos de unión de flujo usando péptido de GCN4 marcado con Alexa Fluor 647 (se une estrechamente al, y etiqueta el, scFv anti-GCN4) demostraron que el constructo de 28BB (E) proporcionaba una expresión en superficie inferior en comparación con constructos que albergan dominios coestimulantes de CD28 (C) o 4-1BB (A) solos (figura 25A). Los ensayos de citotoxicidadin vitrodemostraron que los constructos de 28BB (E) también tenían una CE50 de citotoxicidad marginalmente más débil usando titulación de un conmutador anti-CD19 frente a células RS4;11 CD19+ n comparación con el constructo original (A) (de la figura 25B a la figura 25D). No se observó ninguna actividad frente a células negativas para antígeno con cambios ni de bisagra ni de transmembrana, indicando que la especificidad de la célula sCAR-T no se veía corrompida (datos no mostrados). En línea con la hipótesis anterior de que una sinapsis inmunológica más corta da como resultado una citotoxicidad más potente, los constructos con la bisagra de IgG4m corta de 12 aminoácidos (A, B y C) tenían una citotoxicidad más potente en estos ensayos que los constructos con la bisagra de CD28 más larga de 39 aminoácidos correspondientes (D y F) (figuras 25C y 25D). Este efecto fue sistemático a lo largo de múltiples donadores. En cambio, no se encontró ninguna diferencia en la CE50 de citotoxicidad entre los dominios transmembrana basados en CD8 (A) y CD28 (B).

A continuación se sometieron a prueba los constructos en un modelo de xenoinjerto de NALM-6in vivoen el que se proporcionó una única dosis de células sCAR-T (iv) a ratones NSG con carga tumoral establecida, seguido por dosificación cada dos días del conmutador (iv) durante 14 días y monitorización de ratones para determinar la recidiva. Este modelo empleó la mitad del número de células CAR-T que el informe anterior [Rodgers (2016)] para crear un modelo más difícil con el fin de enfatizar la diferencia entre constructos. Para aumentar la robustez de la comparación, se realizó el modelo con células T de tres donantes independientes. En estas condiciones, el constructo basado en 4-1BB original (A) proporcionó una eliminación variable de la enfermedad. En este modelo, el constructo de 28BB (E) eliminó el tumor (7 de 9 ratones con eliminación tras la dosificación) más eficazmente que 4-1BB (A) (3 de 7 ratones con eliminación tras la dosificación) (figura 25E). El constructo basado en CD28 (C) demostró recidiva durante el periodo de dosificación y no logró la eliminación en ningún ratón (0 de 8 ratones con eliminación). En línea con los resultados anteriores, la bisagra de IgG4m era un requisito para la actividadin vivo,dado que los constructos (D) y (F), que empleaban la bisagra de CD28 con dominios coestimulantes de CD28 y/o BB28, respectivamente, no lograron controlar significativamente la carga tumoral en ningún animal (figura 26).

La liberación de citocinas aguda, medida 24 h tras la primera dosis de conmutador, fue similar entre los constructos de 4-1BB (A), CD28 (C) y 28BB (E), mostrando tan sólo el constructo de CD28 (C) niveles de IFNg inferiores a los del constructo de 4-1BB original (A) (figura 25F). Esto se comparó con el constructo de CAR-T convencional modelado según Kymriah (CART19) recientemente aprobado que emplea el dominio coestimulante de 4-1BB y CD8TM y bisagra. CART19 mostró una liberación de citocinas de IL-2 y TNF significativamente mayor en estas condiciones. De manera notable, el constructo de BB28 con la bisagra de IgG4m (E) mostró un aumento de 24 veces de CD4 y un aumento de 5 veces de la expansión de células CD8 directamente tras el periodo de dosificación en comparación con el constructo basado en 4-1BB original (A) (figura 25G). Esta expansión fue aproximadamente 41 veces y 15 veces mayor que CD4 y CD8 en CART19, respectivamente. La mayor expansión de células CD4 con respecto a CD8 en comparación con el dominio coestimulante de 4-1BB concuerda con informes anteriores de que la adición de la estimulación de CD28 puede aumentar la expansión de CD4 [Kagoya (2017)]. Por tanto, el constructo basado en 28BB de tercera generación (E) puede producir una expansión de células T significativamente mayor, dando como resultado una mayor eficacia en la plataforma de CAR-T conmutable, pero con una liberación de citocinas notablemente inferior.

Ejemplo 8

Humanización del sCAR

El scFv de 52SR4 que dirige la especificidad del sCAR por el péptido de PNE del conmutador se derivó de la evolución dirigida de una biblioteca de anticuerpos murinos [Hanes (1998); Zahnd (2004)]. Estas secuencias murinas tienen el potencial de ser inmunogénicas en seres humanos. La inmunogenicidad del transgén en células T modificadas por ingeniería ha provocado anafilaxia en pacientes y se ha mostrado que es un factor contribuyente al rechazo de las células a partir del paciente [Berger (2006); Jensen (2010); Maus (2013)]. Por estos motivos, se humanizó el scFv de 52SR4.

En resumen, se presentaron secuencias de 52SR4 murino para dominios pesado variable (VH) y ligero variable (VL) al programa de IgBLAST en el sitio web de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Se comparó cada secuencia murina con secuencias de línea germinal murina y después se compararon con secuencias de línea germinal humana. La secuencia de VH murina se deriva de la línea germinal de IGHV2-6-7 murina y la secuencia de VL murina se deriva de la línea germinal de IGLV1 murina (figura 27A). La VH murina es la más próxima a la línea germinal de VH humana IGHV4-59 y la VL murina es la más próxima a la línea germinal de VL kappa humana IGLV7-46.

Se alineó la secuencia de VH murina con IGHJ4-59VH humana; la definición de CDR se proporciona en la figura 27A (dirección de Internet: bioinf.org.uk/abs/). Se usaron cuatro entramados de VH humanizados diferentes para generar secuencias humanizadas: h52SR4H1-H4 (figura 28). h52SR4H1 (constructos denominados H1, 2, 3, 4 ... etc., a lo largo de todo el documento) es un intercambio de CDR en el que se han trasplantado las CDR murinas en entramado de IGHJ4-59 humano (es decir, sin cambios en el entramado). h52SR4H2 añadió cambios en el entramado en las posiciones 71 (numeración secuencial), lo cual afecta a la conformación de CDR-H2, y en las posiciones 93-94, lo cual puede afectar a la conformación de CDR-H3. h52SR4H3 añadió cambios en el entramado enterrados adicionales para mejorar el empaquetamiento interno del dominio VH. h52SR42b/3b sometió a prueba la adición de Asn73. Basándose en Zahndet al.[Zahnd (2004)], LeuH28Ser (H30 en Zahndet al.,numeración de anticuerpos de AHo) e IleH56Ser/Thr (H67 en Zahndet al.,numeración de anticuerpos de AHo) mejoraron la afinidad de unión. En ambas posiciones, la cadena lateral hidrófoba está completamente expuesta al disolvente. LeuH30 no tendrá una interacción directa con la diana en la estructura cristalina p Db 1P4B, mientras que IleH56 sólo tiene una interacción minoritaria con la diana.

Se alineó la VL murina con IGLV-7-46 humana; la definición de CDR se proporciona en la figura 27A (www.bioinforg.uk/abs/). Se usaron varios entramados de VL humanizados diferentes para generar secuencias humanizadas: h52SR4VL1-3 (constructos denominados L1, 2, 3 ... etc., a lo largo de todo el documento) (figura 29). CDR-L1 y CDR-L2 incluyen secuencias que tienen una baja propensión a la desamidación (figura 2AVL). Se construyeron modelos gráficos informáticos de los pares de v H:VL de 5F11 murino y humanizado para ayudar en la humanización. A partir de esta alineación y análisis, se construyeron secuencias de scFv humanizado únicas y se clonaron en lugar de scFv de 52SR4 murino en el constructo basado en 4-1BB de segunda generación original (A en la figura 24; SEQ ID NO: 389).

Basándose en los presentes resultados iniciales comparando los dominios coestimulantes, ni los niveles de expresión de CAR ni la eficaciain vitropodían predecir de manera suficiente la eficaciain vivosuperior del constructo de 28BB. Además, se ha mostrado que los<c>A<r>de CD19 y GD2 convencionales que tienen una eficaciain vitroequivalente tienen actividades antitumoralesin vivomuy diferentes debido a diferencias en la señalización tónica [Gargett (2016)]. Por este motivo, para identificar candidatos humanizados para su investigación adicional, se realizó un examenin vivoen el modelo de ratón con xenoinjerto NALM-6.

Se sometieron cuarenta y cinco candidatos humanizados (tabla 11) en los vectores de 4-1BB (véase el constructo A, figura 24A) a transducción individual en células T derivadas de donantes humanos sanos y se inyectaron (iv) en ratones NSG independientes (mínimo N=3 para cada candidato). Figura 24.

Tabla 11: variantes de CAR humanizado usadas en la figura 27B

Se llevó a cabo el tratamiento con conmutador cada dos días durante 14 días según el presente protocolo convencional (figura 27B). Se seleccionaron clones que proporcionaban una eliminación tumoral completa (<104 de radiancia mediante IVIS, aproximadamente el límite de detección de tumor en este modelo, en el día 50, 30 días después de la última dosificación de conmutador) para su estudio adicional (tabla 12).

Tabla 12: variantes de CAR humanizado usadas en la figura 27B

Estos clones se derivaron de la secuencia de cadena ligera L5 y la secuencia de cadena pesada H4 del clon de base con mutaciones en la cadena ligera en V12S o L109D, y en la cadena pesada en E6Q o A87D (figura 30).

Aunque estas mutaciones no interaccionan directamente con la unión al péptido, se ha notificado o planteado la hipótesis de que tienen otros efectos, incluyendo cambios de conformación de largo alcance, o impactos sobre el plegamiento de proteína que pueden afectar a la estructura de scFv y correlativamente a la actividad de células sCAR-T. Además, con la excepción del residuo E6Q de HC enterrado, los residuos estaban expuestos en la superficie, sugiriendo que también pueden desempeñar un papel en las interacciones proteína-proteína mediante interacciones hidrófobas no específicas. Esto puede ser significativo en el caso de scFv que tienen ciertos residuos de la superficie de contacto de región variable/región constante de Fab anterior expuestos, dando como resultado una frecuencia superior de hidrofobia en moléculas de scFv en comparación con Fab [Nieba (1997)].

El mutante LC V12S se identificó en Zahndet al.(2004) (denominado LC T13S en la publicación usando el esquema de numeración de AHo) como mutación que surgió a partir de la evoluciónin vitrodel scFv de 52SR4 a partir del clon de base C11L34 original. Es posible que esta mutación aumente la afinidad del scFv; sin embargo, basándose en los datos existentes, no puede excluirse que sea un pasajero en la evolución de alta afinidad en el clon 52SR4. El residuo de LC 109 es el penúltimo aminoácido de la cadena ligera, siendo el aminoácido final glicina, seguido por un ligador GGGGS. Aunque este residuo no se identificó mediante los estudios de evoluciónin vitroanteriores y se conserva a lo largo de los entramados humano y de ratón, sobresale a partir de la estructura, formando una superficie hidrófoba que puede aumentar las interacciones con otras proteínas no específicas. Por tanto, la mutación de LC L109D puede ser beneficiosa para reducir la hidrofobia de superficie.

Según Zahndet al.(2004), la “mutación de HC H6(de Glu a Gln) mejoró la afinidad, en un factor de 2, hasta 20 pM en comparación con el clon C11L34”, respaldando el estudio de esta mutación en la HC. En la publicación se planteó la hipótesis de que esta mutación ejercía un efecto mediante “ interacciones de largo alcance o “cuña molecular”, influyendo en la orientación o flexibilidad de un bucle o dominio”. En otra referencia, se ha mostrado que este residuo influye en la conformación de la porción N-terminal de la cadena pesada [Honegger (2001)]. Por tanto, había un buen respaldo para una investigación adicional del impacto de este residuo sobre la actividad de células sCAR-T. Finalmente, el residuo 87 de HC expuesto en superficie se ha estudiado anteriormente en el desarrollo del scFv anti-FITC 4-4-20 [Nieba (1997)]. En este estudio, Nieba,et al.encontraron que la mutación de este residuo para dar D (84D en la numeración de Kabat) reducía la agregación en el plegamiento de proteína, mientras que no alteraba significativamente la afinidad de unión o la estabilidad térmica del scFv. Por tanto, existía un buen respaldo para estudiar estas mutaciones.

Para someter a prueba el efecto de estas mutaciones sobre la función de células sCAR-T, se crearon 7 variantes de scFv humanizado a partir del clon de base L5H4 junto con las mutaciones comentadas anteriormente (figura 27C). Para someter a prueba su actividad entre diferentes dominios coestimulantes, se subclonaron los CAR en vectores basados en 4-1BB, CD28 o 28BB (A, C o E, respectivamente, en la figura 24) para crear 21 vectores totales. El fundamento para realizar pruebas en múltiples antecedentes de dominios coestimulantes era someter a prueba con presión los sCAR con el contexto en el que se ha mostrado que los dominios coestimulantes basados en CD28 aumentan la señalización tónica mientras que 4-1BB puede enmascarar la señalización tónica [Long (2015)]. Por tanto, someter a prueba la actividad de células sCAR-T en el contexto de un único dominio coestimulante puede no ser suficiente para diferenciar la actividad. Ensayos de citotoxicidadin vitrodemostraron que las variantes tenían diferencias insignificantes en la CE50 de citotoxicidad frente a células RS4;11 CD19+ con titulación del conmutador anti-CD19 (figura 27D).

A continuación se compararon los candidatos con el constructo de sCAR de 52SR4 murino para determinar su capacidad para eliminar tumores de NALM-6in vivo(figura 27E). Durante la expansión de células para estos modelos, se clasificaron células T CAR+ mediante columna de afinidad para normalizar posibles diferencias en la expresión de CAR que resultaran de la variante de scFv. De manera correspondiente, se encontró que la eliminación de tumor en estos modelos se mejoraba ligeramente en comparación con modelos anteriores mostrados en la figura 25. Los vectores de CAR con dominios coestimulantes basados en 4-1BB o CD28 tenían una eliminación de tumor variable, sin embargo, la clasificación había mejorado la capacidad de CAR basados en CD28 para controlar la carga tumoral en comparación con los presentes modelos iniciales. Debido a la potencia del dominio coestimulante de 28BB de tercera generación, todos los candidatos y el CAR murino eliminaron completamente el tumor tras el periodo de dosificación. Para someter a prueba con presión este modelo de manera adicional, volvió a exponerse de nuevo a los ratones en el día 30 a NALM-6. No se proporcionó ninguna célula CAR-T adicional, y se inició la dosificación de conmutador 6 días tras la exposición (día 36) según el protocolo convencional. En el día 36, la carga tumoral en estos animales era comparable a la exposición inicial, lo que sugiere que las células sCAR-T no tenían ningún efecto sobre el crecimiento tumoral en ausencia de dosificación de conmutador. El segundo periodo de dosificación se llevó a cabo como con el primero, cada dos días durante 14 días, tras lo cual volvió a eliminarse el tumor en todos los grupos. La mayoría de los ratones permanecieron libres hasta el final del estudio con recidiva en un pequeño número de ratones individuales aparente en el día 60.

Todos los sCAR en estos experimentos mostraron niveles prometedores de eliminación de tumor. Para diferenciar los candidatos más prometedores, se calculó el promedio de la funciónin vivodel scFv humanizado a lo largo de múltiples formatos de dominios coestimulantes (CD28+CD3z, 4-1BB+CD3z y CD28+41BB+CD3z) para eliminar el sesgo introducido por las características de señalización respectivas de cada constructo. Los términos “CD3z”; “CD3 zeta”; y “CD3Z” se usan de manera intercambiable, en el presente documento. Se calculó el promedio de los siguientes parámetrosin vivoa lo largo de cada constructo de CAR-T: (A) valor de IVIS de tumor en el día 10, 20, 31 y 45 tras la exposición a tumor; (B) expansión de células T medida 2 días tras el final de la dosificación de conmutador, y (C) día de recidiva de tumor (ROI de IVIS >104). Se clasificó cada serie de parámetro para determinar la relevancia de enfermedad: (A) que representa eliminación/recidiva de tumor, se clasificó de bajo a alto; (B) que representa la expansión de células T mediante activación, se clasificó de alto a bajo; y (C) que representa el nivel de eliminación de tumor inicial, se clasificó de bajo a alto. Por tanto, mediante este análisis los mejores constructos de CAR tendrán una baja carga tumoral (A) con fuerte expansión de células T (B) y recidiva poco frecuente (C). Se clasificó cada parámetro dentro de cada cohorte de dominio coestimulante y después se calculó el promedio para producir una puntuación de rango total. Se calculó la desviación estándar de los rangos como medida de la varianza de rango. Usando este sistema de clasificación, el sCAR E (L5-L109D, H4-E6Q, A87D) era el candidato más prometedor (figura 31). La adición de LC L109D, HC E6Q, y HC A87D al clon de base L5H4 aumentó significativamente la expansión de células Tin vivo.Las citocinas eran marginalmente diferentes entre los candidatos de sCAR (figura 32). Tal como se encontró anteriormente con la comparación de dominios coestimulantes, la liberación de citocinas a las 24 h no era predictiva de la eficaciain vivoy, por tanto, no se incluyó en la clasificación de candidatos de sCAR. Sin embargo, debe indicarse que los CAR de 28BB liberan más TNFalpha que sus homólogos de 4-1BB, aunque no de manera significativa en la figura 25. De manera similar, el candidato de sCAR E liberó más TNFa que otros clones, correlacionándose con su actividadin vivo.

Se investigaron adicionalmente estos candidatos usando una expansiónex vivoextendida (figura 33). En resumen, se llevaron a cabo los ensayos transduciendo de manera individual células T derivadas de donantes sanos con cada candidato de CAR. Se activaron los cultivos en el día cero con perlas de CD3/CD28 y se proporcionó IL-2 a lo largo de todo el procedimiento de cultivo, pero no volvió a estimularse a las células. Se clasificaron los candidatos para células CAR+ en el día 5 y se expandieron en matraces de cultivo durante 33 días con análisis del número de células, eficiencia de transducción (células CAR+) y citotoxicidadin vitrocada semana. Tal como se ha notificado en otra parte, los candidatos de CAR con dominios coestimulantes basados en 4-1BB se expandieron casi 103 veces tras la clasificación, mientras que los CAR de CD28 y de tercera generación tenían una expansión notablemente inferior (figura 33). La eficiencia de transducción para CAR basados en 4-1BB siguió siendo constante mientras que los CAR basados en CD28 tuvieron una pérdida notable de células CAR+. No se determinó si esto se debía a pérdida de expresión de CAR o se debía a que la expansión de células negativas para CAR sobrepasaba a las células CAR+ en cultivo celular. Los CAR basados en 28BB de tercera generación perdieron algo de eficiencia de transducción tras la clasificación, pero parecieron normalizarse cerca del 50 %.

Se sometió a prueba la citotoxicidadin vitrocada semana para cada candidato (figura 34 y figura 35). A lo largo de todo el transcurso del ensayo de expansiónex vivoextendida, los candidatos basados en 4-1BB tenían una CE50 de citotoxicidad similar y niveles de citotoxicidad máximos (definido por el % de células diana sometidas a lisis usando una cantidad saturante de molécula de conmutador). De manera similar, los candidatos de BB-28 tenían CE50 similares y lisis de células diana máxima a lo largo de todo el transcurso de tiempo. De manera interesante, los candidatos basados en CD28 perdieron potencia, mostrado por un aumento de CE50 de citotoxicidad junto con una reducción de la lisis de células diana máxima. Esto fue lo más evidente para clones que albergaban la mutación V12S. DE manera correspondiente, estos clones presentaron la puntuación más débil en cuanto a su capacidad para controlar la carga tumoralin vivo.

Ejemplo 8

Combinación de conmutador humanizado y CAR humanizado

Para determinar la eficacia del candidato de conmutador humanizado L2b/H4c con los candidatos de sCAR humanizado L5H4 (figuras 27C-27E, candidato A), L5H4-A87D (figuras 27C-27E, candidato B), L5H4-E6Q,A87D (figuras 27C-27E, candidato C), y L5-L109D-H4-E6Q,A87D (figuras 27C-27E, candidato E), se llevó a cabo un modelo de NALM-6 tal como se describió anteriormente, excepto porque se usaron 5 millones de células sCAR-T en lugar de 20 millones de células (figura 36). En estas condiciones, se sometió a prueba la eficacia de células CAR-T, dando como resultado una reducción, pero no una eliminación, del tumor. Por tanto, estas condiciones permiten la resolución de diferencias minoritarias entre los candidatos de sCAR humanizado. En este modelo, el candidato E proporcionó el mayor control de la carga tumoral. La actividad de este sCAR, cuando se emparejó con el conmutador humanizado L2b/H4c, fue comparable al CART-19 convencional.

Ejemplo 9

Tumores heterogéneos

Se sometió a prueba la capacidad de las células sCAR-T para seleccionar como diana más de un antígeno tumoral al mismo tiempo o en momentos diferentes, en un modelo de tumor de xenoinjerto de Raji heterogéneo. Se modificaron células Raji, de manera natural positivas para CD19 y CD20, mediante desactivación de CRISPR del gen para CD19, dando como resultado una línea de células Raji CD19- CD20+. Se mezclaron células Raji de tipo natural con esta línea celular a razones de 1:1, 4:1 o 49:1, respectivamente, y se inyectaron i.v. en ratones<n>S<g>para establecer tumores diseminados (figura 37). Se trataron ambas líneas celulares con luciferasa para realizar un seguimiento de la carga tumoral mediante IVIS. Después de 3 días, se trataron los ratones con células sCAR-T o CART-19. En el grupo de 1:1, la dosificación de conmutador con conmutador anti-CD19 y conmutador anti-CD20 mixtos comenzó en el día 3, cuatro horas después de la administración de las células sCAR-T (figura 37A). En este modelo, CART-19 ralentizó de manera moderada la carga tumoral, pero no pudo eliminar el tumor completamente. Se planteó la hipótesis de que esto se debía a la capacidad de CART-19 para eliminar las células Raji de tipo natural sin tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento de las células Raji negativas para CD19. El grupo de células sCAR-T eliminó el tumor en 3 de 3 ratones usando una mezcla de conmutadores anti-CD19 y anti-CD20. Se observó recidiva del tumor y se trató con conmutador anti-CD20. Este tratamiento con conmutador posterior eliminó el tumor en 2 de los 3 ratones. Este experimento demostró que la misma célula sCAR-T puede redirigirse frente a múltiples antígenos tumorales de manera simultánea.

Se llevo a cabo un segundo modelo usando una mezcla 4:1 (figura 37B) de células Raji de tipo natural con respecto a células Raji negativas para CD19 de manera similar al modelo de 1:1, excepto porque, en este modelo, la dosificación comenzó únicamente con el conmutador anti-CD19. Cuando la carga tumoral (supuestamente procedente de la población negativa para CD19) aumentó hasta una radiancia de 105 (promedio), se trataron los ratones con el conmutador anti-CD20 usando la pauta posológica convencional cada dos días durante 14 días. Esto fue eficaz para eliminar el tumor en todos los ratones. Se trató la recidiva con conmutador anti-CD20 adicional, lo cual eliminó el tumor en 1 de 3 ratones. El grupo de CART-19 tenía actividad marginal frente a la mezcla de células, sucumbiendo en última instancia los animales a la carga tumoral de Raji negativa para CD19 como en el modelo uno.

Se llevó a cabo un tercer modelo usando una mezcla de 49:1 (figura 37C) de células Raji de tipo natural con respecto a células Raji negativas para CD19 de manera similar al modelo de 4:1. Cuando la carga tumoral (supuestamente procedente de la población negativa para CD19) aumentó hasta una radiancia de 105 (promedio), se trataron los ratones con el conmutador anti-CD20 usando la pauta posológica convencional cada dos días durante 14 días. En este grupo, la dosificación con conmutador anti-CD20 comenzó un día tras completarse las dosificaciones de compuesto anti-CD19. De manera similar al primer y segundo modelos, las células CART19 eliminaron las células Raji de tipo natural, pero no las células Raji negativas para CD19, presentando todos los tumores recidiva en este grupo. A la inversa, 5 de 6 ratones tratados con células sCAR-T y conmutadores anti-CD19 y anti-CD20 no presentaron tumor tras el periodo de dosificación, con una recidiva cerca del final del modelo. En conjunto, el segundo y tercer modelos demostraron que las mismas células sCAR-T pueden redirigirse frente a diferentes antígenos de manera secuencial en vez de simultáneamente.

Ejemplo 10

Sistema singénico

Se desarrolló una plataforma de células CAR-T conmutables singénica, completamente murina, para someter a prueba la actividad de células sCAR-T en el contexto de un modelo de animales inmunocompetentes. En estos modelos, se usaron ratones inmunocompetentes C3H con la línea de células tumorales 38c13. En resumen, se inoculó a los ratones tumor s.c. en el día cero y se dejó que se establecieran los tumores hasta entre 500-1000 mm3 Después se preacondicionaron los ratones con ciclofosfamida y se administraron células sCAR-T murinas 24 horas después, comenzando las dosis de conmutador 4 horas tras las células sCAR-T y continuando cada dos días durante 14 días. Tan sólo se proporcionó una única dosis de células sCAR-T a los animales.

La actividad diferencial basada en la longitud de bisagra se encontró en los presentes informes preliminares para células sCAR-T humanas. Para determinar si este efecto se observaba en el sistema de ratón, se construyeron sCAR murinos que albergaban la bisagra dimérica corta de IgG4 (sCAR murino SV-319-092) o con la bisagra de CD8 de ratón (sCAR murino SV-319-089). Los constructos se describen en la figura 38.In vivo,SV-319-092 proporcionó la eliminación completa del tumor, mientras que SV-319-089 tuvo un control notablemente más débil, respaldando las conclusiones anteriores de que las bisagras más cortas proporcionan una mayor eficacia en células sCAR-T debido a una sinapsis inmunológica más corta (figura 39A). Por tanto, el sistema murino es una plataforma fisiológicamente similar al presente sistema humano y es adecuada para estudiar la actividad de células sCAR-T.

A continuación se sometieron a prueba diferentes constructos de bisagra. En resumen, se construyeron células sCAR-T murinas con dominios coestimulantes murinos de CD28 (SV-319-090), 4-1BB (SV-391-091), o BB28 (SV-319-092) (grupo 2 en la figura 38) y se sometieron a prueba en el modelo de 38c13 en ratones C3H. El constructo SV-319-090 con el dominio coestimulante murino no logró controlar la carga tumoral, sucumbiendo todos los ratones a enfermedad antes del día 35 (datos no mostrados). Tanto SV-391-091 como SV-319-092 eliminaron el tumor en todos los ratones (datos no mostrados). Se proporcionaron un segundo y tercer ciclos de dosificación en estos animales tras la eliminación del tumor como en la figura 39B y se midieron periódicamente las poblaciones de células sCAR-T. En este experimento, las células sCAR-T murinas se expandieron después de cada dosificación, expandiéndose las células sCAR-T murinas basadas en 28BB de SV-319-092 marginalmente mejor que las células sCAR-T murinas basadas en 4-1BB de SV-391-091. Por tanto, este experimento demostró el potencial de expansión del dominio coestimulante basado en 28BB. Se excluyeron las células sCAR-T con dominio coestimulante basado en CD28 murino de este análisis debido a que no lograron sobrevivir más allá del día 35.

Las células sCAR-T murinas basadas en 28BB de SV-319-092 también pudieron eliminar de manera eficiente las células B. En un modelo en el que se midieron tanto células B como células T (figura 39C), las células sCAR-T murinas se expandieron después de cada dosis y presentaron una relación inversas con las poblaciones de células B. Se incluyó una fase de reposo entre cada periodo de dosificación. La fase de reposo permitió que las células B volvieran a poblar al ratón tal como se muestra en la figura 39C.

Para determinar si la dosificación de conmutador tenía un impacto sobre la memoria del modelo de células sCAR-T murinas, se inyectaron células SV-319-092 en ratones previamente acondicionados sin tumor. Después se proporcionó la dosificación en cuatro pautas diferentes (figura 39D): alta (5 mg/kg) o baja (0,2 mg/kg) durante periodos de dosificación corto (4 dosis) o largo (12 dosis), usando una inyección i.v. cada dos días. Se comparó esto con la pauta posológica existente de 8 dosis cada dos días. Estos periodos de dosificación estuvieron seguidos por una fase de reposo mostrada en la figura 39D. Tras la fase de reposo, se reanudó la dosificación, recibiendo cada grupo la misma pauta que anteriormente, todavía con dosificación cada dos días. Después de 4 dosis (6 días en total), se midieron los recuentos de células T y fenotipos. De manera notable, el grupo de dosis alta, periodo corto, demostró una expansión de 103 veces en comparación con los otros grupos. Esta expansión fue transitoria y disminuyó tras detenerse la dosificación. Este hallazgo demuestra que las células sCAR-T murinas tienen memoria de su pauta posológica previa y, cuando vuelven a sincronizarse tras una fase de reposo, puede recuperarse esa memoria, creando grandes expansiones de células. El fenotipado de las células en la figura 39E ilustra que la expansión era dominantemente de células CD8 de memoria efectoras en el día 35. Tras detenerse la dosificación, en el día 53, se observó una contracción de la población de memoria efectora, mientras que la población de memoria central era comparativamente similar al día 35. Este hallazgo destaca la utilidad del control temporal sobre la actividad de células sCAR-T, proporcionado por un conmutador.

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Las diversas realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse para proporcionar realizaciones adicionales.

Pueden modificarse aspectos de las realizaciones, si es necesario, para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar aún otras realizaciones adicionales.

Pueden realizarse estos y otros cambios a las realizaciones a la vista de la descripción anteriormente detallada. En general, en las siguientes reivindicaciones, no debe interpretarse que los términos usados limiten las reivindicaciones a las realizaciones específicas dadas a conocer en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, sino que debe interpretarse que incluyen todas las posibles realizaciones junto con el alcance completo de equivalentes al que tienen derecho tales reivindicaciones. Por consiguiente, las reivindicaciones no se limitan por la divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un receptor de antígeno quimérico (CAR) humanizado que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular; en el que el dominio extracelular comprende un scFv anti-GCN4 humanizado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 322.
2. El CAR según la reivindicación 1, en el que el CAR comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

411.
3. El CAR según la reivindicación 1, en el que (i) el dominio extracelular comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos: ESKYGPPCPPCPD o una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 93-103 y 165-168; (ii) el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 398 y 417; y/o (iii) en el que el dominio de señalización intracelular comprende (a) un dominio CD3-zeta y (b) un dominio CD28; un dominio 4-1BB; o un dominio CD28 y un dominio 4-1BB.
4. El CAR según la reivindicación 3, en el que el dominio CD28, si está presente, comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 418; en el que el dominio 4-1BB, si está presente, comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 419; en el que el dominio CD3-zeta comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 420; y/o en el que el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 417.
5. Un primer conmutador de células efectoras de receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) y primera CAR-EC que expresa un CAR para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o estado seleccionado de (i) tumores heterogéneos o neoplasias de células sanguíneas; (ii) leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda o leucemia linfocítica crónica; y (iii) mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfomas foliculares, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt o leucemia de células pilosas (HCL);

en el que la primera CAR-EC expresa un CAR seleccionado de uno cualquiera de los CAR expuestos en las reivindicaciones 1-4; y

en el que el primer conmutador de CAR-EC comprende:

a. un dominio de interacción con receptor de antígeno quimérico (CAR-ID) que comprende un péptido derivado de GCN4 que interacciona con un receptor de antígeno quimérico anti-GCN4 en la CAR-EC; y

b. un resto de direccionamiento;

en el que el resto de direccionamiento es un anticuerpo de direccionamiento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 25, 27-35, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, y 267 y una secuencia de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, y 268.
6. El primer conmutador de CAR-EC y primer CAR para su uso según la reivindicación 5, en el que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 411.
7. El primer conmutador de CAR-EC y primer CAR para su uso según la reivindicación 5 o 6, en el que el conmutador de CAR-EC comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 7.
8. Un polinucleótido que codifica para el CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un vector que comprende dicho polinucleótido.
9. Una célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 8 (i) o el vector según la reivindicación 8 (ii); en el que la célula huésped es una célula T.