ES3030033T3 - Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis - Google Patents

Abstract

Se proporcionan aquí métodos para mejorar la resolución espacial de un analito mediante un sistema de sandwichera. Los métodos y sistemas utilizados aquí incluyen un primer sustrato con varias sondas que incluyen un dominio de captura y un dominio espacial, y un segundo sustrato con varias sondas que comprenden un dominio de captura y un dominio espacial. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, composiciones, kits y sistemas para mejorar la captura de analitos para el análisis espacial

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para determinar la abundancia y ubicación de múltiples analitos en una muestra biológica mediante el uso de un sistema de preparación de intercalamiento. Los métodos y sistemas usados en la presente descripción incluyen un primer sustrato que incluye una pluralidad de sondas que incluyen un dominio de captura y un dominio espacial y un segundo sustrato que incluye una pluralidad de sondas que comprenden un dominio de captura y un dominio espacial

Antecedentes

Las células dentro de un tejido de un sujeto tienen diferencias en la morfología y/o función celular debido a niveles variados de analito (por ejemplo, expresión génica y/o proteica) dentro de las diferentes células. La posición específica de una célula dentro de un tejido (por ejemplo, la posición de la célula con relación a las células vecinas o la posición de la célula con relación al microentorno del tejido) puede afectar, por ejemplo, la morfología, la diferenciación, el destino, la viabilidad, la proliferación, el comportamiento, y la señalización y el intercambio de la célula con otras células en el tejido.

La heterogeneidad espacial se ha estudiado previamente mediante el uso de técnicas que solo proporcionan datos para un pequeño número de analitos en el contexto de un tejido intacto o una porción de un tejido, o proporcionan muchos datos de analitos para células individuales, pero no proporcionan información con respecto a la posición de la célula individual en una muestra biológica parental (por ejemplo, muestra de tejido).

Conservar la distribución espacial original de la expresión génica (también denominada resolución) es fundamental para los ensayos de expresión génica de transcriptómica espacial. Una opción para analizar la expresión génica es mediante el uso de múltiples sustratos. Por ejemplo, un sustrato (por ejemplo, un portaobjetos) podría comprender una matriz con código de barras mientras que otro incluye un espécimen biológico (tal como una sección de tejido). Esta configuración proporciona la capacidad de capturar analitos en un sustrato. Y aunque la captura de analitos en un sustrato proporciona información espacial, sigue existiendo la necesidad de aumentar la resolución y/o sensibilidad en métodos espaciales que incorporan un sistema que utiliza sondas de captura en múltiples sustratos.

Resumen

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

En la presente descripción se describen métodos y sistemas que utilizan múltiples sustratos (por ejemplo, portaobjetos) para evaluar la heterogeneidad espacial de analitos en una muestra. Los métodos y sistemas descritos en la presente descripción aumentan la resolución y/o sensibilidad de la detección del analito. Los métodos y sistemas aquí utilizan múltiples matrices de sustratos, que incluyen al menos dos portaobjetos a cada lado de una muestra biológica. En la presente descripción se presentan métodos y sistemas que incluyen un primer portaobjetos que incluye una pluralidad de sondas que comprenden una primera sonda de captura y un primer código de barras espacial. Los métodos aquí también presentan un segundo portaobjetos que también incluye una matriz de sondas de captura que incluyen al menos una secuencia del dominio de captura y un código de barras espacial. En algunos casos, la muestra biológica se proporciona en el primer portaobjetos; y después de permeabilizar la muestra biológica, los analitos pueden dispersarse libremente de la muestra biológica. Debido a que los analitos se difunden pasivamente, estos serán capturados por las sondas tanto en el primer como en el segundo portaobjetos, lo que aumenta así el número total de analitos capturados en un punto particular (por ejemplo, o es decir, en comparación con un sistema que utiliza un sustrato).

En un aspecto de la descripción, en la presente descripción se proporciona un método para determinar la abundancia y la ubicación de múltiples analitos en una muestra biológica. En algunos casos, el método comprende: (a) proporcionar un primer sustrato y una muestra biológica montada sobre el mismo, en donde el primer sustrato comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura; (b) alinear un segundo sustrato en el lado opuesto del primer sustrato con relación a la muestra biológica, para intercalar de esta manera el primer sustrato, la muestra biológica y el segundo sustrato, en donde el segundo sustrato comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura; y (c) hibridar un primer analito de los múltiples analitos con el primer dominio de captura e hibridar un segundo analito de los múltiples analitos con el segundo dominio de captura. En algunos casos, el método comprende además (d) (A) determinar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del primer código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del primer analito capturado en el primer dominio de captura, o un complemento de este, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la abundancia y la ubicación del primer analito en la muestra biológica, y/o (B) determinar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo analito capturado en el segundo dominio de captura, o un complemento de este, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la abundancia y la ubicación del segundo analito en la muestra biológica.

En algunos casos, los métodos comprenden además, antes de (a) montar la muestra biológica sobre la pluralidad de primeras sondas de captura del primer sustrato.

En algunos casos, el número total de los múltiples analitos determinados aumenta en aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 100 %, o más en comparación con un método que usa un sustrato.

En algunos casos, los métodos incluyen además añadir un tampón de permeabilización a la muestra biológica, para promover de esta manera la migración del primer analito y el segundo analito de la muestra biológica. En algunos casos, el tampón de permeabilización comprende pepsina o proteinasa K.

En algunos casos, la etapa (b) de los métodos anteriores se realiza con la ayuda de un soporte de muestra que comprende: (i) un primer miembro que comprende un primer mecanismo de retención configurado para recibir el primer sustrato, (ii) un segundo miembro configurado para recibir el segundo sustrato, y (iii) un mecanismo de alineación que se conecta a al menos uno del primer miembro y el segundo miembro y se configura para alinear el primer sustrato y el segundo sustrato. En algunos casos, la etapa (b) de los métodos anteriores comprende (i) retener el primer sustrato en el primer mecanismo de retención del primer sustrato, (ii) retener el segundo sustrato en el segundo mecanismo de retención del segundo sustrato, y (iii) usar el mecanismo de alineación para alinear el segundo sustrato en el lado opuesto del primer sustrato con relación a la muestra biológica, para intercalar de esta manera el primer sustrato, la muestra biológica y el segundo sustrato.

En algunos casos, el primer dominio de captura comprende (i) una secuencia de politimina (poli(T)), (ii) una secuencia complementaria a una secuencia de asa de captura presente en un agente de captura de analitos., o (iii) una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada generada por ligación con plantilla. En algunos casos, la pluralidad de primeras sondas de captura se dispone en una pluralidad de primeras perlas. En algunos casos, la primera sonda de captura comprende además uno o más primeros dominios funcionales, un primer identificador molecular único, un primer dominio de escisión y sus combinaciones.

En algunos casos, los métodos incluyen además generar una primera sonda de captura extendida mediante el uso del primer analito como plantilla. En algunos casos, la primera sonda de captura se extiende en su extremo 3'. En algunos casos, la generación de la primera sonda de captura extendida utiliza una transcriptasa inversa. En algunos casos, la generación de la primera sonda de captura extendida utiliza nucleótidos marcados con fluorescencia.

En algunos casos, los métodos incluyen además amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendida. En algunos casos, la amplificación utiliza una ADN polimerasa, una pluralidad de cebadores y una pluralidad de nucleótidos.

En algunos casos, la etapa de determinación en la etapa (d)(A) en los métodos anteriores comprende la secuenciación. En algunos casos, la etapa de determinación en la etapa (d)(A) comprende secuenciar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del primer código de barras espacial o el complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del primer analito.

En algunos casos, el segundo dominio de captura comprende (i) una secuencia de politimina (poli(T)), (ii) una secuencia complementaria a una secuencia de asa de captura presente en un agente de captura de analitos., o (iii) una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada generada por ligación con plantilla. En algunos casos, la pluralidad de segundas sondas de captura se dispone en una pluralidad de segundas perlas. En algunos casos, la segunda sonda de captura comprende además uno o más segundos dominios funcionales, un segundo identificador molecular único, un segundo dominio de escisión y sus combinaciones.

En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción incluyen además generar una segunda sonda de captura extendida mediante el uso del segundo analito como plantilla. En algunos casos, la segunda sonda de captura se extiende en su extremo 3'. En algunos casos, la generación de la segunda sonda de captura extendida utiliza una transcriptasa inversa. En algunos casos, la generación de la segunda sonda de captura extendida utiliza nucleótidos marcados con fluorescencia.

En algunos casos, los métodos anteriores incluyen además amplificar la sonda de captura extendida para producir una pluralidad de sondas de captura extendida. En algunos casos, la amplificación utiliza una ADN polimerasa, una pluralidad de cebadores y una pluralidad de nucleótidos.

En algunos casos, la etapa determinante en la etapa (d)(B) en los métodos anteriores comprende la secuenciación. En algunos casos, la etapa de determinación en la etapa (d)(B) comprende secuenciar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo código de barras espacial o el complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo analito.

En algunos casos, el primer analito y el segundo analito son moléculas de ARN. En algunos casos, las moléculas de ARN son moléculas de ARNm. En algunos casos, el primer analito y el segundo analito son analitos diferentes. Por ejemplo, el primer analito y el segundo analito pueden ser una proteína y un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN). Adicionalmente, o en la alternativa, el primer analito y el segundo analito pueden ser un agente intermedio o porción de este y ARN. El agente intermedio puede ser una sonda conectada (por ejemplo, sonda RTL) o un agente de captura de analitos (por ejemplo, anticuerpo oligoconjugado). Adicionalmente, o en la alternativa, el primer analito y el segundo analito pueden ser ARN y ADN. Adicionalmente, o en la alternativa, el primer analito y el segundo analito pueden ser un agente intermedio y ADN. Adicionalmente, o en la alternativa, el primer analito y el segundo analito pueden ser una captura dirigida en un portaobjetos y el transcritoma completo o ADN en otro portaobjetos.

En algunos casos, la muestra biológica es una muestra de sección de tejido. En algunos casos, la muestra biológica es una sección de tejido. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra embebida en parafina, fijada con formalina (FFPE), una muestra congelada, una muestra recién congelada o una muestra fresca. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra FFPE.

También se describen en la presente descripción kits. En algunos casos, los kits incluyen (a) un primer sustrato que comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura; (b) un segundo sustrato que comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura; y (c) instrucciones para realizar cualquiera de los métodos anteriores.

En la presente descripción también se describen sistemas. En algunos casos, los sistemas se usan para determinar la abundancia y la ubicación de múltiples analitos en una muestra biológica. En algunos casos, los sistemas incluyen (a) un primer sustrato que comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura; (b) un segundo sustrato que comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura; (c) un soporte de muestra biológica que comprende: (i) un primer miembro que comprende un primer mecanismo de retención configurado para recibir el primer sustrato, (ii) un segundo miembro configurado para recibir el segundo sustrato, y (iii) un mecanismo de alineación que se conecta a al menos uno del primer miembro y el segundo miembro y se configura para alinear el primer sustrato y el segundo sustrato; y (d) la muestra biológica.

Cuando los valores se describen en términos de intervalos, debe entenderse que la descripción incluye la descripción de todos los posibles subintervalos dentro de tales intervalos, así como también valores numéricos específicos que caen dentro de tales intervalos independientemente de si se indica expresamente un valor numérico específico o un subintervalo específico.

El término “cada uno”, cuando se usa en referencia a una recopilación de artículos, pretende identificar un artículo individual en la recopilación pero no necesariamente se refiere a cada artículo en la recopilación, a menos que se indique expresamente de cualquier otra manera, o a menos que el contexto del uso indique claramente de cualquier otra manera.

La forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por ejemplo, el término “una célula” incluye una o más células, que incluyen mezclas de estas. “A y/o B” se usa en la presente descripción para incluir todas las siguientes alternativas: “A”, “B”, “A o B” y “A y B”.

Varias modalidades de las características de esta descripción se describen en la presente descripción. Sin embargo, debe entenderse que tales modalidades se proporcionan simplemente a manera de ejemplo, y pueden producirse numerosas variaciones, cambios, y sustituciones para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de esta descripción. También debe entenderse que varias alternativas a las modalidades específicas descritas en la presente descripción también están dentro del alcance de esta descripción.

Descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos ilustran ciertas modalidades de los elementos y ventajas de esta descripción. Los símbolos de referencia similares en los dibujos indican elementos similares.

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de una sonda de captura con código de barras, como se describe en la presente descripción.

La Figura 2 es un esquema que ilustra una sonda de captura escindible, en donde la sonda de captura escindida puede entrar en una célula no permeabilizada y unirse a analitos objetivo dentro de la muestra.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de un elemento con código de barras espacial múltiple ilustrativo. La Figura 4 es un diagrama esquemático de un agente de captura de analitos ilustrativo.

La Figura 5 es un diagrama esquemático que representa una interacción ilustrativa entre una sonda de captura inmovilizada a un elemento 524 y un agente de captura de analitos. 526.

Las Figuras 6A, 6B y 6C son esquemas que ilustran cómo pueden utilizarse las etiquetas celulares de estreptavidina en un sistema basado en matrices para producir células o contenidos celulares con códigos de barras espaciales.

La Figura 7A muestra un ejemplo esquemático del ensayo de control (imágenes superiores) y del ensayo espacial de intercalamiento (imágenes inferiores) descritos en la presente descripción.

La Figura 7B muestra un método ilustrativo de intercalamiento de dos sustratos con código de barras espacial entre sí.

La Figuras 8A-8C mostrar imágenes de ensayo espaciales representativas en ensayos de control recién congelado y control de intercalamiento (Figura 8A), y en ensayos en los que dos sustratos con código de barras espacial se intercalaron juntos (Figuras 8B-8C).

La Figura 9A muestra patrones de expresión génica representativos en cada uno de los dos sustratos con código de barras espacial de la descripción cuando la muestra biológica es un tejido cerebral de ratón recién congelado.

La Figura 9B muestra una comparación de analitos de una muestra de ratón recién congelado detectada en el sustrato de tejido en comparación con el sustrato de transferencia.

La Figura 9C muestra un gráfico de solapamiento de la expresión de analitos de una muestra de ratón recién congelado entre el sustrato de tejido y el sustrato de transferencia. Un valor de 1,0 demuestra una superposición idéntica.

La Figura 10A muestra patrones representativos de expresión génica en cada uno de los dos matrices de expresión génica de la descripción cuando la muestra biológica es un tejido cerebral de ratón embebido en parafina fijado con formalina (FFPE).

La Figura 10B muestra una comparación de analitos de una muestra de ratón FFPE detectada en el sustrato de tejido en comparación con el sustrato de transferencia.

La Figura 10C muestra un gráfico de solapamiento de la expresión de analitos de una muestra de ratón FFPE entre el sustrato de tejido y el sustrato de transferencia. Un valor de 1,0 demuestra una superposición idéntica.

La Figura 11 representa los resultados de un experimento que compara una condición de permeabilización de una configuración de intercalamiento y un control sin intercalamiento.

La Figura 12 representa una comparación entre un control sin intercalamiento y una condición de permeabilización de configuración intercalamiento.

La Figura 13 representa un análisis de agrupamiento espacial y análisis del transcrito hipocampal Hpca, que compara las condiciones de permeabilización configuración de control sin intercalamiento y de intercalamiento.

La Figura 14 es un diagrama esquemático que representa un proceso de intercalamiento ilustrativo entre un primer sustrato que comprende una muestra biológica y un segundo sustrato que comprende una matriz con código de barras espacial.

La Figura 15A proporciona una vista en perspectiva de un aparato de manipulación de muestras ilustrativo en una posición cerrada.

La Figura 15B proporciona una vista en perspectiva del aparato de manipulación de muestras de ejemplo 1400 en una posición abierta.

La Figura 16A muestra un proceso de intercalamiento ilustrativo donde un primer sustrato y un segundo sustrato se acercan entre sí.

La Figura 16B muestra una configuración de intercalamiento completamente formada que crea una cámara formada a partir de uno o más separadores, un primer sustrato y un segundo sustrato.

La Figuras 17A-17C representan una vista lateral y una vista superior de un flujo de trabajo de cierre en ángulo ilustrativo para intercalar un primer sustrato y un segundo sustrato. La Figura 17A representa el primer sustrato inclinado sobre (superior a) el segundo sustrato. La Figura 17B muestra que a medida que el primer sustrato disminuye y/o a medida que el segundo sustrato aumenta, el lado caído del primer sustrato puede entrar en contacto con la gota del medio reactivo. La Figura 17C representa un cierre completo del intercalamiento entre el primer sustrato y el segundo sustrato con el separador en contacto con el primer sustrato y el segundo sustrato.

La Figuras 18A-18E representan un flujo de trabajo ilustrativo para un ensamble de intercalamiento en ángulo. La Figura 18A muestra un sustrato 1712 colocado y colocado sobre una base con un lado del sustrato soportado por un resorte. La Figura 18B representa una gota de medio reactivo colocada sobre el sustrato. La Figura 18C muestra otro sustrato 1706 posicionado por encima (superior a) el sustrato 1712 y en un ángulo sustancialmente paralelo a la base. En la Figura 18D, el sustrato 1706 se baja hacia el sustrato 1712 de manera que un lado caído del sustrato 1706 entra en contacto primero con la gota. La Figura 18E representa un cierre de intercalamiento completo del sustrato 1706 y el sustrato 1712 con la gota de medio reactivo posicionada entre los dos lados.

La Figura 19A es una vista lateral de un flujo de trabajo de cierre en ángulo.

La Figura 19B es una vista superior de un flujo de trabajo de cierre en ángulo.

Descripción detallada

I. Introducción

En la presente descripción se describen métodos, kits, sistemas y aparatos para detectar múltiples analitos en una muestra biológica. En particular, en la presente descripción se describen métodos, kits, sistemas y aparatos que utilizan dos matrices con código de barras espacial (por ejemplo, expresión génica). Las matrices con código de barras espacial se usan para detectar analitos en una muestra biológica mediante el uso de un proceso de intercalamiento descrito en la presente descripción. En modalidades particulares, ambos sustratos comprenden sondas de captura con código de barras espacial y cada sonda de captura comprende al menos un dominio de captura y un código de barras espacial. El uso de los dos sustratos en un proceso de intercalamiento descrito en la presente descripción aumenta la cantidad de sondas de captura con código de barras espacial para capturar analitos desde una única ubicación en una muestra biológica. Por lo tanto, la descripción proporciona métodos, kits, sistemas y aparatos que conducen a una mayor información recopilada para el análisis espacial.

Las metodologías y composiciones de análisis espacial descritas en la presente descripción pueden proporcionar una gran cantidad de analito y/o datos de expresión para una variedad de analitos dentro de una muestra biológica con alta resolución espacial, mientras se retiene el contexto espacial nativo. Los métodos y composiciones de análisis espacial pueden incluir, por ejemplo, usar una sonda de captura que incluye un código de barras espacial (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la ubicación o posición de un analito dentro de una célula o una muestra de tejido (por ejemplo, una célula de mamífero o una muestra de tejido de mamífero) y un dominio de captura que es capaz de unirse a un analito (por ejemplo, una proteína y/o un ácido nucleico) producido por y/o presente en una célula. Los métodos y composiciones de análisis espacial también pueden incluir usar una sonda de captura que tiene un dominio de captura que captura un agente intermedio para la detección indirecta de un analito. Por ejemplo, el agente intermedio puede incluir una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un código de barras) asociada con el agente intermedio. Por lo tanto, la detección del agente intermedio es indicativa del analito en la muestra de células o tejido.

Los aspectos no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 10,774,374, 10,724,078, 10,480,022, 10,059,990, 10,041,949, 10,002,316, 9,879,313, 9,783,841, 9,727,810, 9,593,365, 8,951,726, 8,604,182, 7,709,198, publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 2020/239946, 2020/080136, 2020/0277663, 2020/024641, 2019/330617, 2019/264268, 2020/256867, 2020/224244, 2019/194709, 2019/161796, 2019/085383, 2019/055594, 2018/216161, 2018/051322, 2018/0245142, 2017/241911, 2017/089811, 2017/067096, 2017/029875, 2017/0016053, 2016/108458, 2015/000854, 2013/171621, WO 2018/091676, WO 2020/176788, Rodriquesy otros,Science 363(6434): 1463-1467, 2019; Leey otros,Nat. Protoc. 10(3):442-458, 2015; Trejo yotros,PLOS ONE 14(2):e0212031, 2019; Cheny otros,Science 348(6233):aaa6090, 2015; Gaoy otros,BMC Biol. 15:50, 2017; y Guptay otros,Nature Biotechnol. 36:1197-1202, 2018; el manual del usuario de los kits de reactivos de expresión génica espacial de Visium (por ejemplo, Rev D, fechado en octubre de 2020), y/o el manual del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejido espacial de Visium (por ejemplo, Rev D, fechado en octubre de 2020), ambos de los cuales están disponibles en el sitio web de documentación de soporte de 10x Genomics, y pueden usarse en la presente descripción en cualquier combinación. El documento US 2021/317524 A1 describe métodos para determinar una ubicación de un elemento en una matriz espacial de elementos que incluye proporcionar una matriz espacial que incluye una pluralidad de elementos sobre un sustrato, donde un elemento de la pluralidad de elementos tiene una sonda de captura, y donde la sonda de captura tiene un código de barras espacial y una secuencia constante; hibridar una primera sonda de secuenciación al código de barras espacial, donde la primera sonda de secuenciación tiene una primera etiqueta y una primera secuencia de nucleótidos; obtener una primera imagen de la primera etiqueta con la primera sonda de secuenciación hibridada al código de barras espacial; determinar, en base a la primera imagen, una primera porción de una secuencia del código de barras espacial; y asociar el elemento con una ubicación en la matriz espacial en base a una ubicación de la primera etiqueta en la primera imagen.

El documento US 2021/130881 A1 describe un soporte de muestra que incluye un primer miembro que presenta un primer mecanismo de retención configurado para retener un primer sustrato que incluye una muestra, un segundo miembro que presenta un segundo mecanismo de retención configurado para retener un segundo sustrato que incluye un medio reactivo, y un mecanismo de alineación conectado a al menos uno del primer y segundo miembros, y configurado para alinear el primer y segundo miembros de manera que la muestra entre en contacto con al menos una porción del medio reactivo cuando el primer y segundo miembros están alineados.

El documento WO 2004/067759 A2 describe un método para producir matrices de ácidos nucleicos correspondientes a un primer conjunto de ácidos nucleicos inmovilizados en un primer soporte sólido que incluye proporcionar en dicho primer conjunto de ácidos nucleicos un segundo conjunto de ácidos nucleicos, cada ácido nucleico del segundo conjunto tiene al menos una porción que es complementaria a al menos una porción del ácido nucleico respectivo del primer conjunto y que se hibrida con él de esta manera. Esto puede implicar el contacto con una solución que contiene una mezcla de ácidos nucleicos, o la síntesis mediante el uso de los primeros ácidos nucleicos como cebadores y plantillas. El segundo conjunto de ácidos nucleicos se inmoviliza a un segundo soporte sólido, ya sea antes o mientras se hibridan con el primer conjunto de ácidos nucleicos. La separación del primer y segundo soportes sólidos proporciona dicho primer soporte que porta la matriz maestra y dicho segundo soporte que porta una matriz complementaria. En la presente descripción se describen aspectos adicionales no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial.

Alguna terminología general que puede usarse en esta descripción puede encontrarse en la Sección (I)(b) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Típicamente, un “código de barras” es una etiqueta o identificador que transmite o es capaz de transmitir información (por ejemplo, información sobre un analito en una muestra, una perla y/o una sonda de captura). Un código de barras puede ser parte de un analito o independiente de un analito. Un código de barras puede unirse a un analito. Un código de barras particular puede ser único con relación a otros códigos de barras. A los efectos de esta descripción, un “analito” puede incluir cualquier sustancia, estructura, resto o componente biológico a analizar. El término “objetivo” puede referirse de manera similar a un analito de interés.

Los analitos pueden clasificarse en términos generales en uno de dos grupos: analitos de ácidos nucleicos y analitos no ácidos nucleicos. Los ejemplos de analitos no ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitarse a, lípidos, carbohidratos, péptidos, proteínas, glicoproteínas (unidas a N o unidas a O), lipoproteínas, fosfoproteínas, variantes específicas de proteínas fosforiladas o acetiladas, variantes de amidación de proteínas, variantes de hidroxilación de proteínas, variantes de metilación de proteínas, variantes de ubiquitinación de proteínas, variantes de sulfatación de proteínas, proteínas virales (por ejemplo, cápside viral, envoltura viral, cubierta viral, accesorio viral, glicoproteínas virales, pico viral, etc.), proteínas extracelulares e intracelulares, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) localizarse en ubicación(ones) subcelular(es), incluidas, por ejemplo, orgánulos, por ejemplo, mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, cloroplastos, vesículas endocíticas, vesículas exocíticas, vacuolas, lisosomas, etc. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) ser péptidos o proteínas, incluidos sin limitación, anticuerpos y enzimas. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de analitos en la Sección (I)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. En algunas modalidades, un analito puede detectarse indirectamente, tal como mediante la detección de un agente intermedio, por ejemplo, una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación) o un agente de captura de analitos (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con oligonucleótido), tales como aquellos descritos en la presente descripción.

Una “muestra biológica” se obtiene típicamente del sujeto para su análisis mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, biopsia, cirugía y microscopía de captura láser (LCM), y generalmente incluye células y/u otro material biológico del sujeto. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una sección de tejido. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una muestra biológica fijada y/o teñida (por ejemplo, una sección de tejido fijada y/o teñida). Los ejemplos no limitantes de tinciones incluyen tinciones histológicas (por ejemplo, hematoxilina y/o eosina) y tinciones inmunológicas (por ejemplo, tinciones fluorescentes). En algunas modalidades, pueden obtenerse imágenes de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra biológica fijada y/o teñida). Las muestras biológicas también se describen en la Sección (I)(d) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663.

En algunas modalidades, una muestra biológica se permeabiliza con uno o más reactivos de permeabilización. Por ejemplo, la permeabilización de una muestra biológica puede facilitar la captura de analitos. Las condiciones y agentes de permeabilización ilustrativos se describen en la Sección (I)(d)(ii)(13) o la Sección de modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663.

Los métodos de análisis espaciales basados en matrices implican la transferencia de uno o más analitos de una muestra biológica a una matriz de elementos en un sustrato, donde cada elemento está asociado con una ubicación espacial única en la matriz. El análisis subsecuente de los analitos transferidos incluye determinar la identidad de los analitos y la ubicación espacial de los analitos dentro de la muestra biológica. La ubicación espacial de un analito dentro de la muestra biológica se determina basándose en el elemento al que está unido el analito (por ejemplo, directa o indirectamente) en la matriz, y la ubicación espacial relativa del elemento dentro de la matriz.

Una “sonda de captura” se refiere a cualquier molécula capaz de capturar (directa o indirectamente) y/o etiquetar un analito (por ejemplo, un analito de interés) en una muestra biológica. En algunas modalidades, la sonda de captura es un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas modalidades, la sonda de captura incluye un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial y/o un identificador molecular único (UMI)) y un dominio de captura). En algunas modalidades, una sonda de captura puede incluir un dominio de escisión y/o un dominio funcional (por ejemplo, un sitio de unión a cebador, tal como para secuenciación de próxima generación (NGS)).

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra una sonda de captura ilustrativa, como se describe en la presente descripción. Como se muestra, la sonda de captura 102 está opcionalmente acoplada a un elemento 101 por un dominio de escisión 103, tal como un enlazador disulfuro. La sonda de captura puede incluir una secuencia funcional 104 que sea útil para su procesamiento subsecuente. La secuencia funcional 104 puede incluir toda o una parte de la secuencia de unión a la celda de flujo específica del secuenciador (por ejemplo, una secuencia P5 o P7), toda o una parte de una secuencia cebadora de secuenciación (por ejemplo, un sitio de unión al cebador R1, un sitio de unión al cebador R2), o sus combinaciones. La sonda de captura también puede incluir un código de barras espacial 105. La sonda de captura también puede incluir una secuencia de identificador molecular único (UMI) 106. Mientras que la Figura 1 muestra el código de barras espacial 105 como ubicado aguas arriba (5') de la secuencia UMI 106, debe entenderse que las sondas de captura en donde la secuencia UMI 106 está ubicada aguas arriba (5') del código de barras espacial 105 también son adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 107 para facilitar la captura de un analito objetivo. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de un analito de ácido nucleico. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una sonda conectada descrita en la presente descripción. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de asa de captura presente en un agente de captura de analitos. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a un oligonucleótido de férula. Tal oligonucleótido de férula, además de tener una secuencia complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura, puede tener una secuencia de un analito de ácido nucleico, una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada descrita y/o una secuencia de asa de captura descrita en la presente descripción.

Las secuencias funcionales generalmente pueden seleccionarse para compatibilidad con cualquiera de una variedad de sistemas de secuenciación diferentes, por ejemplo, Ion Torrent Proton o PGM, instrumentos de secuenciación Illumina, PacBio, Oxford Nanopore, etc., y los requisitos de los mismos. En algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para compatibilidad con sistemas de secuenciación no comercializados. Ejemplos de tales sistemas y técnicas de secuenciación, para los cuales pueden usarse secuencias funcionales adecuadas, incluyen (pero no se limitan a) secuenciación Ion Torrent Proton o PGM, secuenciación Illumina, secuenciación PacBio SMRT y secuenciación Oxford Nanopore. Además, en algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para que sean compatibles con otros sistemas de secuenciación, incluidos sistemas de secuenciación no comercializados.

En algunas modalidades, el código de barras espacial 105 y las secuencias funcionales 104 son comunes a todas las sondas unidas a un elemento dado. En algunas modalidades, la secuencia de UMI 106 de un probar de captura unida a una elemento dada es diferente de la secuencia de UMI de una sonda de captura diferente unida a la elemento dada.

La Figura 2 es un esquema que ilustra una sonda de captura escindible, en donde la sonda de captura escindida puede entrar en una célula no permeabilizada y unirse a analitos dentro de la muestra. La sonda de captura 201 contiene un dominio de escisión 202, un péptido penetrantes en células 203, una molécula indicadora 204, y un enlace disulfuro (-S-S-). 205 representa todas las demás partes de una sonda de captura, por ejemplo, un código de barras espacial y un dominio de captura.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de un elemento con código de barras espacial múltiple ilustrativo. En la Figura 3, el elemento 301 puede acoplarse a sondas de captura con códigos de barras espaciales, en donde las sondas con códigos de barras espaciales de un elemento particular pueden poseer el mismo código de barras espacial, pero tienen diferentes dominios de captura diseñados para asociar el código de barras espacial del elemento con más de un analito objetivo. Por ejemplo, un elemento puede acoplarse a cuatro tipos diferentes de sondas de captura con códigos de barras espaciales, donde cada tipo de sonda de captura con códigos de barras espaciales posee el código de barras espacial 302. Un tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura poli(T) 303, diseñado para capturar analitos objetivo de ARNm. Un segundo tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura N-mer aleatorio 304 para análisis de ADNg. Un tercer tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura complementario a una secuencia de asa de captura de un agente de captura de analitos de interés 305. Un cuarto tipo de sonda de captura asociada con el elemento incluye el código de barras espacial 302 en combinación con un dominio de captura que puede unirse específicamente a una molécula de ácido nucleico 306 que puede funcionar en un ensayo CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas9). Si bien solo se muestran cuatro constructos diferentes con códigos de barras de sonda de captura en la Figura 3, los constructos con código de barras de sonda de captura pueden adaptarse para el análisis de cualquier analito determinado asociado con un ácido nucleico y capaz de unirse a tal constructo. Por ejemplo, los esquemas mostrados en la Figura 3 también pueden usarse para el análisis simultáneo de otros analitos descritos en la presente descripción, incluidos, pero sin limitarse a: (a) ARNm, un constructo de rastreo de linaje, proteínas y metabolitos de la superficie celular o intracelulares, y ADNg; (b) ARNm, cromatina accesible (por ejemplo, ATAC-seq, DNase-seq y/o MNase-seq), proteínas y metabolitos de la superficie celular o intracelulares y un agente de perturbación (por ejemplo, una CRISPR ARNcr/ARNgu, TALEN, nucleasa en dedo de zinc, y/o oligonucleótido antisentido como se describe en la presente descripción); (c) ARNm, proteínas y/o metabolitos de la superficie celular o intracelulares, un agente de etiquetado con código de barras (por ejemplo, los multímeros MHC descritos en la presente descripción) y una secuencia V(D)J de un receptor de células inmunitarias (por ejemplo, receptor de células T). En algunas modalidades, un agente de perturbación puede ser una molécula pequeña, un anticuerpo, un fármaco, un aptámero, un miARN, un entorno físico (por ejemplo, cambio de temperatura) o cualquier otro agente de perturbación conocido. Ver, por ejemplo, la Sección (II)(b) (por ejemplo, las subsecciones (i)-(vi)) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. La generación de sondas de captura puede lograrse mediante cualquier método apropiado, que incluye los descritos en la Sección (II)(d)(ii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663.

En algunas modalidades, puede detectarse más de un tipo de analito (por ejemplo, ácidos nucleicos y proteínas) de una muestra biológica (por ejemplo, simultánea o secuencialmente) mediante el uso de cualquier técnica en formato múltiple apropiada, tales como las descritas en la Sección (IV) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

En algunas modalidades, la detección de uno o más analitos (por ejemplo, analitos proteicos) puede realizarse mediante el uso de uno o más agentes de captura de analitos. Como se usa en la presente, un “agente de captura de analitos” se refiere a un agente que interactúa con un analito (por ejemplo, un analito en una muestra biológica) y con una sonda de captura (por ejemplo, una sonda de captura unida a un sustrato o un elemento) para identificar el analito. En algunas modalidades, el agente de captura de analitos incluye: (i) un resto de unión al analito (por ejemplo, que se une a un analito), por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este; (ii) código de barras del resto de unión al analito; y (iii) una secuencia de asa de captura. Como se usa en la presente, el término “código de barras del resto de unión al analito” se refiere a un código de barras que está asociado con, o de cualquier otra manera, identifica el resto de unión al analito. Como se usa en la presente, el término “secuencia de captura de analito” o “secuencia de asa de captura” se refiere a una región o resto configurado para hibridarse, unirse, acoplarse o interactuar de cualquier otra manera con un dominio de captura de una sonda de captura. En algunas modalidades, una secuencia de asa de captura es complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura. En algunos casos, un código de barras del resto de unión al analito (o una porción del mismo) puede eliminarse (por ejemplo, escindirse) del agente de captura de analitos.

La Figura 4 es un diagrama esquemático de un agente de captura de analitos ilustrativo 402 compuesto de un resto de unión al analito 404 y un dominio de código de barras del resto de unión al analito 408. El resto de unión al analito ilustrativo 404 es una molécula capaz de unirse a un analito 406 y el agente de captura de analitos es capaz de interactuar con una sonda de captura con código de barras espacial. El resto de unión al analito puede unirse al analito 406 con alta afinidad y/o con alta especificidad. El agente de captura de analitos puede incluir un dominio de código de barras del resto de unión al analito 408, una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un oligonucleótido), que puede hibridarse con al menos una porción o una totalidad de un dominio de captura de una sonda de captura. El dominio de código de barras del resto de unión al analito 408 puede comprender un código de barras del resto de unión al analito y una secuencia de asa de captura descrita en la presente descripción. El resto de unión al analito 404 puede incluir un polipéptido y/o un aptámero. El resto de unión al analito 404 puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno).

La Figura 5 es un diagrama esquemático que representa una interacción ilustrativa entre una sonda de captura inmovilizada a un elemento 524 y un agente de captura de analitos. 526. La sonda de captura inmovilizada a un elemento 524 puede incluir un código de barras espacial 508 así como también secuencias funcionales 506 y UMI 510, como se describió en otra parte en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 512 que puede unirse a un agente de captura de analitos 526. El agente de captura de analitos 526 puede incluir una secuencia funcional 518, un código de barras del resto de unión al analito 516 y una secuencia de asa de captura 514 que puede unirse al dominio de captura 512 de la sonda de captura 524. El agente de captura de analitos también puede incluir un enlazador 520 que permite que el dominio de código de barras del agente de captura 516 se acople al resto de unión al analito 522.

Las Figuras 6A, 6B y 6C son esquemas que ilustran cómo pueden utilizarse las etiquetas de células de estreptavidina en un sistema basado en matrices para producir una célula con código de barras espacial o contenidos celulares. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 6A, el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) unido a un péptido puede asociarse individualmente con biotina (p2m) y unirse a un resto de estreptavidina de manera que el resto de estreptavidina comprende múltiples restos de pMHC. Cada uno de estos restos puede unirse a un TCR de manera que la estreptavidina se una a una célula T objetivo a través de múltiples interacciones de unión a MHC/TCR. Múltiples interacciones se sinergizan y pueden mejorar sustancialmente la afinidad de unión. Tal afinidad mejorada puede mejorar el marcaje de las células T y también reducir la posibilidad de que los marcadores se disociarán de las superficies de las células T. Como se muestra en la Figura 6B, un dominio de código de barras del agente de captura 601 puede modificarse con estreptavidina 602 y ponerse en contacto con múltiples moléculas de MHC biotiniladas 603 de manera que las moléculas de MHC biotiniladas 603 se acoplan con el dominio de código de barras del agente de captura conjugado con estreptavidina 601. El resultado es un complejo multimérico de MHC con código de barras 605. Como se muestra en la Figura 6B, la secuencia del dominio de código de barras del agente de captura 601 puede identificar el MHC como su marcador asociado y también incluye secuencias funcionales opcionales tales como secuencias para la hibridación con otros oligonucleótidos. Como se muestra en la Figura 6C, un oligonucleótido de ejemplo es la sonda de captura 606 que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, rGrGrG correspondiente a C C C), una secuencia de código de barras y otras secuencias funcionales, tales como, por ejemplo, un UMI, una secuencia adaptadora (por ejemplo, que comprende una secuencia cebadora de la secuenciación (por ejemplo, R1 o un R1 parcial (“pR1”), R2), una secuencia de unión a la celda de flujo (por ejemplo, P5 o P7 o secuencias parciales de estas)), etc. En algunos casos, la sonda de captura 606 puede estar asociada primero con un elemento (por ejemplo, una perla de gel) y liberarse del elemento. En otras modalidades, la sonda de captura 606 puede hibridar con un dominio de código de barras del agente de captura 601 del complejo MHC-oligonucleótido 605. Los oligonucleótidos hibridados (Separador C C C y Separador rGrGrG) pueden después extenderse en reacciones de extensión del cebador de manera que se generan constructos que comprenden secuencias que corresponden a cada una de las dos secuencias de código de barras espacial (el código de barras espacial asociado con la sonda de captura, y el código de barras asociado con el complejo de MHC-oligonucleótido). En algunos casos, una o ambas de las secuencias correspondientes pueden ser un complemento de la secuencia original en la sonda de captura 606 o el dominio de código de barras del agente de captura 601. En otras modalidades, la sonda de captura y el dominio de código de barras del agente de captura se ligan entre sí. Los constructos resultantes pueden procesarse opcionalmente adicionalmente (por ejemplo, para añadir cualquier secuencia adicional y/o para la limpieza) y someterse a secuenciación. Como se describe en otra parte en la presente descripción, una secuencia derivada de la secuencia de código de barras espacial de la sonda de captura 606 puede usarse para identificar un elemento y la secuencia derivada de la secuencia de código de barras espacial en el dominio de código de barras del agente de captura 601 puede usarse para identificar el complejo de péptido MHC particular 604 unido a la superficie de la célula (por ejemplo, cuando se usan bibliotecas de MHC-péptido para tamizar células inmunitarias o poblaciones de células inmunitarias).

Puede encontrarse una descripción adicional de los agentes de captura de analitos en la Sección (II)(b)(ix) del documento WO 2020/176788 y/o en la Sección (N)(b)(viii) de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

Existen al menos dos métodos para asociar un código de barras espacial con una o más células vecinas, de manera que el código de barras espacial identifique la una o más células, y/o el contenido de la una o más células, como asociado con una ubicación espacial particular. Un método es promover analitos o sustitutos de analitos (por ejemplo, agentes intermedios) fuera de una célula y hacia una matriz con código de barras espacial (por ejemplo, incluidas sondas de captura con código de barras espaciales). Otro método consiste en escindir sondas de captura con códigos de barras espaciales de una matriz y promover las sondas de captura con códigos de barras espaciales hacia y/o dentro o sobre la muestra biológica.

En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para preparar, replicar y, en consecuencia, producir opcionalmente productos de extensión codificados de una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio (por ejemplo, una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación) o un agente de captura de analitos), o una porción de este), o derivados de este (ver, por ejemplo, la sección (M)(b)(vii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2020/0277663 con respecto a las sondas de captura extendidas). En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para formar una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación) con una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio, o una porción de estos), de esta manera se crean productos de ligación que sirven como sustitutos para una plantilla.

Como se usa en la presente, una “sonda de captura extendida” se refiere a una sonda de captura que tiene nucleótidos adicionales añadidos al extremo (por ejemplo, extremo 3' o 5') de la sonda de captura, para extender de esta manera la longitud total de la sonda de captura. Por ejemplo, un “extremo 3' extendido” indica que se añadieron nucleótidos adicionales al nucleótido más cerca de 3' de la sonda de captura para extender la longitud de la sonda de captura, por ejemplo, mediante reacciones de polimerización usadas para extender moléculas de ácido nucleico, incluida la polimerización con plantilla catalizada por una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa o una transcriptasa inversa). En algunas modalidades, extender la sonda de captura incluye añadir a un extremo 3' de una sonda de captura una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de un analito o agente intermedio unido específicamente al dominio de captura de la sonda de captura. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de transcripción inversa. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de una o más ADN polimerasas. Las sondas de captura extendidas incluyen la secuencia de la sonda de captura y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura.

En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas se amplifican (por ejemplo, en solución a granel o en la matriz) para producir cantidades que son suficientes para el análisis aguas abajo, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas (por ejemplo, moléculas de ADN) actúan como plantillas para una reacción de amplificación (por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa).

Variantes adicionales de métodos de análisis espacial, que incluyen, en algunas modalidades, una etapa de obtención de imágenes, se describen en la Sección (II)(a) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Análisis de analitos capturados (y/o agentes intermedios o porciones de los mismos), por ejemplo, incluyendo extracción de muestras, extensión de sondas de captura, secuenciación (por ejemplo, de una sonda de captura extendida escindida y/o una molécula de ADNc complementaria a una sonda de captura extendida), la secuenciación en la matriz (por ejemplo, mediante el uso de, por ejemplo, enfoques de hibridación in situ o ligación in situ), análisis temporal y/o captura de proximidad, se describe en la Sección (II)(g) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Algunas mediciones de control de calidad se describen en la Sección (II)(h) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica y/o médica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: la identificación de uno o más biomarcadores (por ejemplo, de diagnóstico, pronóstico y/o para la determinación de la eficacia de un tratamiento) de una enfermedad o trastorno; identificación de un candidato a objetivo farmacológica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno; identificación (por ejemplo, diagnóstico) de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno; identificación de la etapa y/o pronóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de un sujeto que tiene una mayor posibilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno; seguimiento de la progresión de una enfermedad o trastorno en un sujeto; determinación de la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de una subpoblación de pacientes para la cual un tratamiento es efectivo para una enfermedad o trastorno; modificación de un tratamiento de un sujeto con una enfermedad o trastorno; selección de un sujeto para la participación en un ensayo clínico; y/o selección de un tratamiento para un sujeto con una enfermedad o trastorno.

La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: identificación de perfiles de expresión del transcritoma y/o proteoma (por ejemplo, en tejido sano y/o enfermo); identificación de múltiples tipos de analitos muy cercanos (por ejemplo, análisis del vecino más cercano); determinación de genes y/o proteínas regulados positivamente y/o negativamente en tejido enfermo; caracterización de microambientes tumorales; caracterización de respuestas inmunitarias tumorales; caracterización de tipos celulares y su coubicación en tejido; e identificación de variantes genéticas dentro de los tejidos (por ejemplo, basadas en los perfiles de expresión de genes y/o proteínas asociados con biomarcadores de enfermedades o trastornos específicos).

Típicamente, para los métodos basados en matrices espaciales, un sustrato funciona como un soporte para la unión directa o indirecta de sondas de captura a elementos de la matriz. Un “elemento” es una entidad que actúa como soporte o repositorio para varias entidades moleculares usadas en el análisis espacial. En algunas modalidades, algunos o todos los elementos de una matriz están funcionalizadas para la captura de analitos. Se describen sustratos ilustrativos en la Sección (II)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Pueden encontrarse elementos y atributos geométricos ilustrativos de una matriz en las Secciones (II)(d)(i), (M)(d)(iii) y (II)(d)(iv) del documento WO 2020/176788 y/ o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.

Generalmente, los analitos y/o agentes intermedios (o porciones de los mismos) pueden capturarse cuando se pone en contacto una muestra biológica con un sustrato que incluye sondas de captura (por ejemplo, un sustrato con sondas de captura incrustadas, manchadas, impresas, fabricadas sobre el sustrato, o un sustrato con elementos (por ejemplo, perlas, pocillos) que comprende sondas de captura). Como se usa en la presente descripción, “contactar”, “contactado” y/o “que entra en contacto”, una muestra biológica con un sustrato se refiere a cualquier contacto (por ejemplo, directo o indirecto) de manera que las sondas de captura pueden interactuar (por ejemplo, unirse covalente o no covalentemente (por ejemplo, hibridar)) con analitos de la muestra biológica. La captura puede lograrse activamente (por ejemplo, mediante el uso de electroforesis) o pasivamente (por ejemplo, mediante el uso de difusión). La captura de analitos se describe con más detalle en la Sección (II)(e) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.

En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la unión y/o introducción de una molécula (por ejemplo, un péptido, un lípido o una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial) a una muestra biológica (por ejemplo, a una célula en una muestra biológica). En algunas modalidades, una pluralidad de moléculas (por ejemplo, una pluralidad de moléculas de ácido nucleico) que tienen una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras espaciales) se introducen en una muestra biológica (por ejemplo, en una pluralidad de células en una muestra biológica) para usar en análisis espacial. En algunas modalidades, después de unir y/o introducir una molécula que tiene un código de barras a una muestra biológica, la muestra biológica puede separarse físicamente (por ejemplo, disociarse) en células individuales o grupos de células para su análisis. Algunos de estos métodos de análisis espacial se describen en la Sección (III) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la detección de múltiples oligonucleótidos que se hibridan con un analito. En algunos casos, por ejemplo, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de ligación con plantilla de ARN (RTL). Los métodos de RTL se han descrito anteriormente. Ver, por ejemplo, Credley otros, Nucleic Acids Res.21 de agosto de 2017;45(14):e128. Típicamente, RTL incluye la hibridación de dos oligonucleótidos con secuencias adyacentes en un analito (por ejemplo, una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm). En algunos casos, los oligonucleótidos son moléculas de ADN. En algunos casos, uno de los oligonucleótidos incluye al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3' y/o el otro oligonucleótido incluye un nucleótido fosforilado en el extremo 5'. En algunos casos, uno de los dos oligonucleótidos incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(A), una secuencia no homopolimérica). Después de la hibridación con el analito, una ligasa (por ejemplo, la ligasa SplintR) liga los dos oligonucleótidos juntos, creando una sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación). En algunos casos, los dos oligonucleótidos hibridan con secuencias que no son adyacentes entre sí. Por ejemplo, la hibridación de los dos oligonucleótidos crea un espacio entre los oligonucleótidos hibridados. En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa) puede extender uno de los oligonucleótidos antes de la ligación. Después de la ligación, la sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación) se libera del analito. En algunos casos, la sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación) se libera mediante el uso de una endonucleasa. En algunas modalidades, la endonucleasa es una ARNasa. En algunas modalidades, la endonucleasa es una de ARNasa A, ARNasa C, ARNasa H y ARNasa I. En algunas modalidades, la endonucleasa es ARNasa H. En algunas modalidades, la ARNasa H es ARNasa H1 o ARNasa H2. La sonda conectada (por ejemplo, un producto de ligación) liberada puede entonces capturarse mediante sondas de captura (por ejemplo, en lugar de la captura directa de un analito) en una matriz, opcionalmente amplificada, y secuenciada, lo que determina por lo tanto la ubicación y opcionalmente la abundancia del analito en la muestra biológica.

Durante el análisis de información espacial, se obtiene información de secuencia para un código de barras espacial asociado con un analito, y la información de secuencia puede usarse para proporcionar información sobre la distribución espacial del analito en la muestra biológica. Pueden usarse varios métodos para obtener la información espacial. En algunas modalidades, sondas de captura específicas y los analitos que capturan están asociados con ubicaciones específicas en una matriz de elementos en un sustrato. Por ejemplo, pueden asociarse códigos de barras espaciales específicos con ubicaciones de matriz específicas antes de la fabricación de la matriz, y las secuencias de los códigos de barras espaciales pueden almacenarse (por ejemplo, en una base de datos) junto con información de ubicación de matriz específica, de modo que cada código de barras espacial se asigne de forma única a una ubicación particular de la matriz.

Alternativamente, pueden depositarse códigos de barras espaciales específicos en ubicaciones predeterminadas en una matriz de elementos durante la fabricación, de manera que en cada ubicación, solo esté presente un tipo de código de barras espacial, de modo que los códigos de barras espaciales estén asociados de forma única con un único elemento de la matriz. Cuando sea necesario, las matrices pueden decodificarse mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción de modo que los códigos de barras espaciales se asocien de forma única con las ubicaciones de los elementos de la matriz, y este mapeo puede almacenarse como se describió anteriormente.

Cuando se obtiene información de secuencia para sondas y/o analitos de captura durante el análisis de la información espacial, las ubicaciones de las sondas de captura y/o analitos pueden determinarse al hacer referencia a la información almacenada que asocia de forma única cada código de barras espacial con una ubicación de elementos de la matriz. De esta manera, las sondas de captura específicas y los analitos capturados se asocian con ubicaciones específicas en la matriz de elementos. Cada ubicación de elemento de matriz representa una posición con relación a un punto de referencia de coordenadas (por ejemplo, una ubicación de matriz, un marcador fiducial) para la matriz. En consecuencia, cada ubicación de elemento tiene una “dirección” o ubicación en el espacio de coordenadas de la matriz.

Algunos flujos de trabajo ilustrativos de análisis espacial se describen en la sección modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Ver, por ejemplo, la modalidad ilustrativa que comienza con “En algunos ejemplos no limitantes de los flujos de trabajo descritos en la presente descripción, la muestra puede sumergirse...” del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Ver también, por ejemplo, la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión génica espacial de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev D, con fecha de octubre de 2020). En algunas modalidades, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de hardware y/o software dedicado, tal como cualquiera de los sistemas descritos en las Secciones (II)(e)(ii) y/o (V) de los documentos WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663, o cualquiera de uno o más de los dispositivos o métodos descritos en las seccionesControl Slide for Imaging, Methods of Using Control Slides and Substrates for Systems of Using Control Slides andSubstrates for Imaging,y/oSample and Array Alignment Devices and Methods, Informationallabelsdel documento WO 2020/123320.

Los sistemas adecuados para realizar análisis espacial pueden incluir componentes tales como una cámara (por ejemplo, una celda de flujo o una cámara que pueda sellarse, hermética) para contener una muestra biológica. La muestra biológica puede montarse, por ejemplo, en un soporte de muestra biológicas. Pueden conectarse una o más cámaras de fluido a la cámara y/o al soporte de muestra a través de conductos de fluido, y los fluidos pueden suministrarse a la cámara y/o al soporte de muestra a través de bombas fluídicas, fuentes de vacío u otros dispositivos acoplados a los conductos de fluido que crean un gradiente de presión para impulsar el flujo de fluido. También puede conectarse una o más válvulas a conductos de fluido para regular el flujo de reactivos desde los depósitos hasta la cámara y/o el soporte de muestra.

Los sistemas pueden incluir opcionalmente una unidad de control que incluye uno o más procesadores electrónicos, una interfaz de entrada, una interfaz de salida (tal como una pantalla) y una unidad de almacenamiento (por ejemplo, un medio de almacenamiento de estado sólido tal como, pero sin limitarse a, un medio de almacenamiento magnético, óptico u otro de estado sólido, persistente, grabable y/o regrabable). Opcionalmente, la unidad de control puede conectarse a uno o más dispositivos remotos a través de una red. La unidad de control (y componentes de la misma) generalmente puede realizar cualquiera de las etapas y funciones descritas en la presente descripción. Cuando el sistema está conectado a un dispositivo remoto, el dispositivo (o dispositivos) remotos puede realizar cualquiera de las etapas o características descritas en la presente descripción. Los sistemas pueden incluir opcionalmente uno o más detectores (por ejemplo, CCD, CMOS) usados para capturar imágenes. Los sistemas también pueden incluir opcionalmente una o más fuentes de luz (por ejemplo, basadas en LED, basadas en diodos, láseres) para iluminar una muestra, un sustrato con elementos, analitos de una muestra biológica capturada en un sustrato y diversos medios de control y calibración.

Los sistemas pueden incluir opcionalmente instrucciones de software codificadas y/o implementadas en uno o más medios de almacenamiento tangibles y componentes de hardware tales como circuitos integrados de aplicaciones específicas. Las instrucciones de software, cuando son ejecutadas por una unidad de control (y en particular, un procesador electrónico) o un circuito integrado, pueden hacer que la unidad de control, circuito integrado u otro componente que ejecuta las instrucciones de software realice cualquiera de las etapas o funciones del método descritos en la presente descripción.

En algunos casos, los sistemas descritos en la presente descripción pueden detectar (por ejemplo, registrar una imagen) la muestra biológica en la matriz. Los métodos ilustrativos para detectar la muestra biológica en una matriz se describen en el documento núm. WO 2021/102003 A1 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2021/0150707 A1.

Antes de transferir analitos desde la muestra biológica hasta la matriz de elementos en el sustrato, la muestra biológica puede alinearse con la matriz. La alineación de una muestra biológica y una matriz de elementos que incluyen sondas de captura pueden facilitar el análisis espacial, que puede usarse para detectar diferencias en la presencia y/o nivel de analito dentro de diferentes posiciones en la muestra biológica, por ejemplo, para generar un mapa tridimensional de la presencia y/o nivel del analito. Los métodos ilustrativos para generar un mapa bidimensional y/o tridimensional de la presencia y/o nivel del analito se describen en el documento núm. WO 2021/067514 A1 y los métodos de análisis espacial se describen generalmente en el documento núm. WO 2020/061108 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2021/0155982 A1.

En algunos casos, un mapa de presencia y/o nivel de analito puede alinearse con una imagen de una muestra biológica mediante el uso de uno o más marcadores de referencia, por ejemplo, objetos colocados en el campo de visión de un sistema de obtención de imágenes que aparecen en la imagen producida, como se describe en la Sección deAtributos del sustrato,Sección dePortaobjetos de control para la obtención de imágenesdel documento núm. WO 2020/123320, WO 2021/102005 A1 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2021/0158522 A1. Los marcadores fiduciales pueden usarse como punto de referencia o escala de medición para la alineación (por ejemplo, para alinear una muestra y una matriz, para alinear dos sustratos, para determinar la ubicación de una muestra o matriz en un sustrato con relación a un marcador fiducial) y/o para mediciones cuantitativas de tamaños y/o distancias.

II. Métodos, composiciones, kits y sistemas para mejorar la captura de analitos para el análisis espacial

(a) Introducción

En la presente descripción se describen métodos, kits, sistemas y aparatos que utilizan un sistema de matriz espacial para evaluar la heterogeneidad espacial de analitos en una muestra. Los métodos y sistemas descritos en la presente descripción aumentan la resolución y el número de analitos detectados de uno o más analitos en una muestra biológica. Los métodos y sistemas aquí utilizan matrices espaciales, que incluyen al menos dos sustratos (por ejemplo, portaobjetos de expresión génica) en lados opuestos de una muestra biológica.

En la presente descripción se presentan métodos, kits, sistemas y aparatos para determinar la abundancia y ubicación de múltiples analitos en una muestra biológica. En algunos casos, los múltiples analitos (por ejemplo, un primer analito y un segundo analito) son analitos diferentes. Por ejemplo, los diferentes analitos pueden ser proteínas y ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN o ADN). Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden ser agentes intermedios o porción de estos y ARN. El agente intermedio puede ser una sonda conectada (por ejemplo, sonda RTL) o un agente de captura de analitos (por ejemplo, anticuerpo oligoconjugado). Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden ser a Rn y ADN. Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden ser agentes intermedios y ADN. Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden capturarse de forma dirigida en un portaobjetos y el transcritoma completo o ADN en otro portaobjetos. En algunos casos, los métodos incluyen (a) proporcionar un primer sustrato y una muestra biológica montada sobre el mismo, en donde el primer sustrato comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura; (b) alinear un segundo sustrato en el lado opuesto del primer sustrato con relación a la muestra biológica, para intercalar de esta manera el primer sustrato, la muestra biológica y el segundo sustrato, en donde el segundo sustrato comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura; y (c) hibridar un primer analito de los múltiples analitos con el primer dominio de captura e hibridar un segundo analito de los múltiples analitos con el segundo dominio de captura.

En algunos casos, los métodos incluyen además determinar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del uno o más analitos capturados en el segundo dominio de captura, o un complemento de este, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la abundancia y la ubicación del analito en la muestra biológica.

También se presentan en la presente descripción métodos, kits, sistemas y aparatos que incluyen un primer sustrato que incluye una pluralidad de sondas de captura. Las sondas de captura en el primer sustrato se disponen como una matriz e incluyen un dominio de captura descrito en la presente descripción (por ejemplo, una secuencia de dominio de captura tal como una secuencia poli(T) (por ejemplo, una secuencia de poli-timina o un oligo d(T))) y un código de barras espacial (lo que permite un análisis espacial). El segundo sustrato también incluye una matriz a través del sustrato o un área del sustrato de sondas de captura, y las sondas de captura en el segundo sustrato también incluyen al menos una secuencia del dominio de captura y un código de barras espacial. En algunos casos, la muestra biológica se proporciona en el primer sustrato; después de permeabilizar los analitos de la muestra biológica, estos se dispersan libremente de la muestra biológica. A medida que los analitos se difunden pasivamente, pueden capturarse por las sondas tanto en el primer sustrato como en el segundo sustrato o en áreas de sustratos.

Por lo tanto, en algunos casos, esta descripción describe un enfoque para aumentar el captación general de analitos mediante el uso de dos matrices de expresión génica (cada una que comprende sondas de captura que tienen dominios de captura y códigos de barras espaciales) en una configuración de intercalamiento. En algunos casos, esta configuración puede aplicarse a matrices codificados con barras hechos con puntos impresos, perlas o microesferas.

(b) Métodos y sistemas que usan dos sustratos con código de barras espacial

La siguiente sección proporciona orientación sobre las etapas de realización de los métodos para mejorar la resolución espacial y detectar un analito en una muestra biológica mediante el uso de la configuración de intercalamiento descrita en la presente descripción. Los métodos adicionales de análisis espacial se encuentran en los documentos núms. WO 2020/176788, W<o>2020/123320 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

Como se usa en la presente descripción, el primer sustrato (que comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura) y el segundo sustrato (que comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura) puede denominarse en la presente descripción “sustratos con códigos de barras espaciales”. La pluralidad de sondas de captura en un sustrato con código de barras espacial puede ordenarse como una matriz de sondas de captura. Las sondas de captura de la matriz pueden ordenarse en elementos. Las sondas de captura de una elemento de la matriz pueden comprender un código de barras espacial particular (por ejemplo, un código de barras espacial específico de la elemento), mientras que las sondas de captura de una elemento diferente de la matriz pueden comprender un código de barras espacial diferente (por ejemplo, un código de barras espacial específico de la elemento diferente). En consecuencia, un sustrato con código de barras espacial puede denominarse en la presente descripción como una matriz con código de barras espacial o un sustrato que comprende una matriz de sondas de captura. Los sustratos con códigos de barras espaciales con dominios de captura configurados para hibridar con analitos de ARNm pueden denominarse en la presente descripción “sustratos de expresión génica”, “portaobjetos de expresión génica”, “portaobjetos de GEx” o “matrices de expresión génica”. A menos que se indique explícitamente, los términos son intercambiables.

(i) Proporcionar los dos sustratos con código de barras espacial y generar la configuración de intercalamiento

En algunos casos, la muestra biológica se proporciona en un primer sustrato (por ejemplo, un primer sustrato con código de barras espacial (por ejemplo, un primer sustrato de expresión génica)). En algunos casos, una muestra biológica se coloca en el primer sustrato. Como se usa en la presente descripción, el primer sustrato es un sustrato que permite que la muestra biológica se adhiera al sustrato. En algunos casos, el primer sustrato es un sustrato de vidrio. En algunos casos, el primer sustrato incluye materiales formados a partir de diversos vidrios, sustratos formados a partir de diversos polímeros, hidrogeles, capas y/o películas, membranas (por ejemplo, membranas porosas), células de flujo, obleas, placas o sus combinaciones. En algunos casos, las sondas de captura en el primer sustrato incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura. En algunos casos, una sonda de captura en el primer sustrato incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(T)), un identificador molecular único, una secuencia funcional tal como un cebador, un código de barras espacial, o sus combinaciones. En algunos casos, el dominio de captura en el primer sustrato incluye una secuencia de politimina (por ejemplo, también llamada poli(T), poli-d(T) u oligo d(T) en todo) que es complementaria a una secuencia de poliadenilación. En algunos casos, las sondas de captura se distribuyen en el primer sustrato inferior a la muestra biológica. En algunos casos, una sonda de captura en la pluralidad es de aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100 o más nucleótidos de una sola hebra de longitud. En algunos casos, una sonda de captura incluye uno o más nucleótidos de origen no natural. En algunos casos, las sondas de captura se distribuyen por igual en la matriz del primer sustrato. En algunos casos, las sondas de captura en el primer sustrato se adhieren directamente (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, las sondas de captura se colocan mediante el uso de puntos impresos (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos, un segundo sustrato (por ejemplo, un segundo sustrato con código de barras espacial (por ejemplo, un segundo sustrato de expresión génica)) se coloca superior al muestra biológica opuesta al primer sustrato, creando una configuración de intercalamiento en donde la muestra biológica y el tampón de permeabilización se ubican entre los dos sustratos. En algunos casos, el segundo sustrato se coloca debajo de la muestra biológica, opuesto al primer sustrato que crea una configuración de intercalamiento en donde la muestra biológica y el tampón de permeabilización se ubican entre los dos sustratos. En algunos casos, el segundo sustrato es un sustrato de vidrio. En algunos casos, el segundo sustrato incluye diversos vidrios, sustratos formados a partir de diversos polímeros, hidrogeles, capas y/o películas, membranas (por ejemplo, membranas porosas), células de flujo, obleas, placas o sus combinaciones. En algunos casos, el segundo sustrato incluye una pluralidad de sondas (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, una o más sondas en la pluralidad incluyen un código de barras espacial y un dominio de captura. En algunos casos, una sonda en el segundo sustrato incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(T)), un identificador molecular único, una secuencia funcional tal como un cebador, un código de barras espacial, o sus combinaciones. Por ejemplo, una sonda en el segundo sustrato puede ser una sonda como se describe en la Figura 1. En algunos casos, las sondas en el segundo sustrato se adhieren directamente al sustrato (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, las sondas en el segundo sustrato se colocan mediante el uso de puntos impresos (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos, el sistema incluye una muestra biológica intercalada entre dos sustratos. Con referencia a Figura 7A (imagen inferior izquierda), una muestra biológica 724 que comprende una o más células se coloca sobre un primer sustrato 720. Se aprecia que la imagen inferior derecha de Figura 7A representa una situación en la que la muestra biológica se coloca en el sustrato inferior (en comparación con el sustrato superior en Figura 7A, esquina inferior izquierda). Por lo tanto, los términos similares para cada uno pueden trasladarse a cada imagen.

Con referencia a la imagen de la parte inferior izquierda de Figura 7A, el primer sustrato 720 incluye una matriz de sondas 722 que incluyenentre otrosun dominio de captura (por ejemplo, una secuencia de politimina) y un código de barras espacial. La matriz (por ejemplo, pluralidad) de sondas de captura puede asociarse con un sustrato completo, partes de un sustrato o regiones definidas en un sustrato. El sistema incluye un tampón de permeabilización que se añade a la muestra biológica 724, lo que permite que los analitos 726 para difundir 728 de la muestra biológica 724. Analitos 726 se difunden desde la célula pasivamente en cualquier dirección, por ejemplo, verticalmente, horizontalmente o lateralmente, (por ejemplo, flechas representadas como 728). En algunos casos, los analitos se difunden desde la célula hasta la matriz de sondas 726 en el primer sustrato 720. Los analitos también migran a un segundo sustrato 730, que incluye una segunda matriz (por ejemplo, o es decir, pluralidad) de sondas de captura 732. Una sonda o perla de captura (que comprende sondas) en el segundo conjunto incluye una secuencia de dominio de captura (por ejemplo, una secuencia de politimina) y un código de barras espacial. En algunos casos, el analito migra al segundo sustrato en un vector, por ejemplo, como se muestra por 728. Después de migrar al segundo sustrato, el analito puede extenderse, amplificarse y secuenciarse mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción.

En algunos casos, aún con referencia a la Figura 7 imagen inferior izquierda, el primer sustrato 720 y el segundo sustrato 730 se intercalan y forman planos sustancialmente paralelos. En algunos casos, el ángulo de migración del analito se mide como un ángulo desde el primer sustrato 720. En algunos casos, el ángulo es de 90 grados con relación al primer sustrato 720. En algunos casos, el ángulo es de aproximadamente 85, aproximadamente 80, aproximadamente 75, aproximadamente 70, aproximadamente 65, aproximadamente 60, aproximadamente 55, aproximadamente 50 o aproximadamente 45 grados con relación al primer sustrato 720.

En algunas modalidades, el primer sustrato 720 y el segundo sustrato 730 se intercalan entre sí en un proceso de intercalamiento. Como se muestra en la Figura 7 imagen inferior izquierda, durante el proceso de intercalamiento ilustrativo, el primer sustrato se alinea con el segundo sustrato, de manera que al menos una porción de la muestra biológica se alinea con al menos una porción de la matriz (por ejemplo, alineado en una configuración de intercalamiento). En algunas modalidades, el primer sustrato se alinea con el segundo sustrato de manera que al menos una porción de la muestra biológica se alinea verticalmente con al menos una porción de la matriz. Como se muestra, el segundo sustrato está en una posición superior al primer sustrato. En algunas modalidades, el primer sustrato puede colocarse superior al segundo sustrato (como se representa en la Figura 7, imagen inferior izquierda). En algunas modalidades, el primer y segundo sustratos se alinean para mantener un espacio o distancia de separación entre los dos sustratos. Cuando el primer y segundo sustratos se alinean, se liberan uno o más analitos de la muestra biológica y migran activa o pasivamente a la matriz para la captura. En algunas modalidades, la migración ocurre mientras las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz se ponen en contacto con un medio reactivo (por ejemplo, tampón de permeabilización). El uno o más analitos liberados pueden migrar activa o pasivamente a través del espacio a través del medio reactivo hacia las sondas de captura o perlas en el segundo sustrato 730, y ser capturado por las sondas de captura 732.

En algunas modalidades, la distancia de separación entre el primer y el segundo sustrato se mantiene entre 2 micras y 1 mm (por ejemplo, entre 2 micras y 800 micras, entre 2 micras y 700 micras, entre 2 micras y 600 micras, entre 2 micras y 500 micras, entre 2 micras y 400 micras, entre 2 micras y 300 micras, entre 2 micras y 200 micras, entre 2 micras y 100 micras, entre 2 micras y 25 micras, entre 2 micras y 10 micras), medida en una dirección ortogonal a la superficie del primer sustrato que soporta la muestra. En algunos casos, la distancia es de 2 micras. En algunos casos, la distancia es de 2,5 micras. En algunos casos, la distancia es de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25 micras. En algunas modalidades, el segundo sustrato se coloca en contacto directo con la muestra sobre el primer sustrato lo que asegura que no haya pérdidas difusivas de resolución espacial. En algunas modalidades, la distancia de separación se mide en una dirección ortogonal a una superficie del primer sustrato que soporta la muestra biológica.

En algunas modalidades, el primer y segundo sustratos se colocan en un soporte de sustrato, (por ejemplo, un dispositivo de alineación de matrices) configurado para alinear el primer sustrato y la matriz. En algunas modalidades, el dispositivo comprende un soporte de muestra. En algunas modalidades, el soporte de muestra incluye un primer y un segundo miembros que comprenden un primer y un segundo mecanismos de retención configurados para retener el primer y el segundo sustratos, respectivamente. El dispositivo puede incluir un mecanismo de alineación que se conecta a al menos uno de los miembros y alinea el primer y segundo miembros. Por lo tanto, los dispositivos de la descripción pueden alinear ventajosamente el primer sustrato y el segundo sustrato y cualquier muestra, sonda con código de barras o reactivo de permeabilización que pueda estar en la superficie del primer y segundo sustratos.

En algunos casos, se proporciona un soporte de muestra como parte del mecanismo de intercalamiento (por ejemplo, aparato de intercalamiento) usado en los métodos descritos en la presente descripción. En algunos casos, el soporte de muestra incluye un primer miembro que incluye un primer mecanismo de retención que retiene el sustrato con la muestra. En algunos casos, el soporte de muestra también incluye un segundo miembro que incluye un segundo mecanismo de retención que retiene el segundo sustrato con una matriz de elementos. Un mecanismo de alineación se conecta a al menos uno del primer y segundo miembros o a ambos el primer y segundo miembros. Durante un procedimiento de alineación y contacto, un mecanismo de alineación funciona para alinear el primer y segundo miembros, de esta manera se asegura que la muestra y la matriz de elementos también estén alineadas y se pongan en contacto para facilitar el análisis de la muestra.

En algunas modalidades, el mecanismo de alineación puede implementarse como un actuador giratorio conectado al primer y segundo miembros. Un ejemplo de tal actuador giratorio es una bisagra. En algunos casos, una vez que una muestra montada en sustrato se coloca en el primer miembro y una matriz de elementos montada en sustrato se coloca en el segundo miembro, la rotación de uno de los miembros alrededor del eje de bisagra alinea los miembros y, además, alinea la muestra y la matriz de elementos. Los miembros pueden girarse alrededor del eje de bisagra hasta que la muestra y la matriz de elementos estén alineadas y en contacto. En algunos casos, el actuador giratorio se implementa como un miembro de plegamiento. El miembro de plegamiento puede formarse a partir de una variedad de materiales, que incluyen materiales flexibles tales como caucho y vinilo, metales y aleaciones metálicas, y plásticos.

En ciertas modalidades, el actuador giratorio puede incluir al menos un brazo. En algunos casos, el actuador giratorio puede incluir múltiples brazos (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, o incluso más). En algunos casos, el soporte de muestra se implementa como un dispositivo unitario (por ejemplo, es decir, de una sola pieza). En algunos casos, el soporte de muestra también puede implementarse como un dispositivo de dos piezas, con el primer y el segundo miembros que son separados pero conectables de manera reproducible a través del mecanismo de alineación. Cuando el primer y el segundo miembros se acercan, los conectores se acoplan con los receptores, alineando el primer y el segundo miembros, y también alineando la muestra con la matriz de elementos. Se debe señalar que, si bien los conectores se colocan en el segundo miembro y los receptores se colocan en el primer miembro, lo contrario también podría ser cierto. Además, el primer y el segundo miembros podrían tener cada uno uno o más conectores y uno o más receptores.

El primer mecanismo de retención puede implementarse de varias maneras. En algunas modalidades, el primer mecanismo de retención puede corresponder a un rebaje dimensionado para recibir el primer sustrato. Además, una junta puede colocarse opcionalmente dentro del rebaje para mantener un ajuste a presión entre los bordes del rebaje y el primer sustrato. En ciertas modalidades, el primer mecanismo de retención puede corresponder a uno o más miembros posicionados para aplicar una fuerza al primer sustrato, en particular, para mantener el contacto entre el primer sustrato y el primer miembro. Los ejemplos de tales miembros incluyen, pero no se limitan a, clips, tornillos y otros sujetadores de retención roscados, y miembros que se sujetan a presión o se acoplan de cualquier otra manera con el primer miembro. Los miembros pueden aplicar una fuerza a la superficie de soporte de la muestra del primer sustrato y/o a una o más superficies laterales del primer sustrato.

En general, el segundo mecanismo de retención puede corresponder a cualquiera de los diferentes tipos de mecanismos de retención analizados anteriormente en relación con el primer mecanismo de retención. El primer y el segundo mecanismos de retención pueden ser diferentes o iguales.

En algunas modalidades, el primer miembro incluye una primera abertura. La primera abertura puede colocarse, por ejemplo, de manera que cuando el primer sustrato se retiene en el primer miembro, la primera abertura se alinea con una región de muestra (por ejemplo, una región donde la muestra se ubica típicamente, o que se designa para la colocación de la muestra) en el primer sustrato. La abertura puede colocarse de manera que la muestra pueda verse desde la superficie posterior del primer miembro (por ejemplo, o es decir, la superficie opuesta a la superficie que soporta el primer sustrato) a través de la primera abertura, y una o más imágenes de la muestra pueden obtenerse a través de la primera abertura.

Como se describió anteriormente, un medio reactivo puede colocarse sobre un primer o segundo sustrato. Más generalmente, sin embargo, el primer o segundo sustrato puede comprender además un medio reactivo colocado sobre él. En determinadas modalidades, el medio reactivo incluye un reactivo de permeabilización (por ejemplo, un reactivo de permeabilización sólido, líquido, gel o seco). En algunas modalidades, el medio reactivo incluye uno o más componentes adicionales. Por ejemplo, los componentes adicionales pueden incluir un compuesto o capa de hidrogel con un reactivo de permeabilización incorporado.

En algunas modalidades, el segundo miembro incluye al menos una abertura. Más generalmente, el segundo miembro puede incluir una o más (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 8 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o incluso más) segundas aberturas. En ciertas modalidades, la segunda abertura se alinea con al menos una porción de la región de muestra sobre el sustrato cuando el primer y segundo miembros y se alinean. Puede usarse una segunda abertura para diversos propósitos. En algunas modalidades, por ejemplo, la matriz de elementos y/o la muestra pueden verse o visualizarse a través de una segunda abertura. La visualización/obtención de imágenes puede usarse para ajustar las posiciones relativas de la matriz de elementos y la muestra para mejorar la alineación, por ejemplo.

En determinadas modalidades, una o más superficies delimitadoras de la segunda abertura y una superficie trasera del segundo sustrato (por ejemplo, o es decir, una superficie del segundo sustrato que es opuesta a la superficie del segundo sustrato que mira a la muestra y que admite la matriz de elementos) cooperan para formar un pocillo de reactivo. Una solución de reactivo (por ejemplo, que comprende un reactivo de permeabilización) añadida al pocillo de reactivo está contenida por las superficies limitantes de la segunda abertura. Si el segundo sustrato se forma a partir de un material permeable o semipermeable, la solución de reactivo puede penetrar (por ejemplo, por difusión) a través de la superficie posterior del segundo sustrato y entrar en contacto con la muestra.

En algunas modalidades, el soporte de muestra incluye un primer mecanismo de ajuste conectado al primer miembro. El primer mecanismo de ajuste traslada el primer sustrato en al menos una dirección paralela a la superficie del primer sustrato que soporta la muestra. En algunas modalidades, el primer mecanismo de ajuste traslada el primer sustrato en dos direcciones paralelas a la superficie del primer sustrato.

El primer mecanismo de ajuste puede implementarse de varias maneras. En algunas modalidades, por ejemplo, el primer mecanismo de ajuste incluye uno o más tornillos de presión o actuadores lineales que pueden usarse para trasladar el primer sustrato.

Además de alinear el primer y segundo miembros, el mecanismo de alineación también se configura para mantener una separación entre el primer y segundo sustratos (y el primer y segundo miembros) cuando los sustratos (y miembros) están alineados. Por ejemplo, la separación puede mantenerse de manera que al menos una porción de la muestra entre en contacto con el medio reactivo (por ejemplo, la matriz de elementos del medio reactivo).

En determinadas modalidades, el mecanismo de alineación mantiene el primer y segundo sustratos en una relación aproximadamente paralela cuando los sustratos (y el primer y segundo miembros) están alineados. Un ángulo incluido entre el primer y el segundo sustrato en tales circunstancias puede ser de 2 grados o menos (por ejemplo, 1 grado o menos, 0,5 grados o menos, 0,25 grados o menos).

En algunas modalidades, el soporte de muestra puede incluir uno o más miembros de separación que ayudan a mantener la separación y/o la disposición aproximadamente paralela del primer y segundo sustratos. Los miembros de separación pueden conectarse a uno o ambos del primer y segundo miembros.

En ciertas modalidades, el soporte de muestra incluye un segundo mecanismo de ajuste. El segundo mecanismo de ajuste ajusta una distancia de la separación entre el primer y segundo sustrato (por ejemplo, o es decir, en una dirección ortogonal a la superficie del primer sustrato que soporta la muestra). En ciertas modalidades, el mecanismo de ajuste se conecta a ambos miembros.

El segundo mecanismo de ajuste puede implementarse de varias maneras. En algunas modalidades, el segundo mecanismo de ajuste incluye uno o más tornillos de presión o pasadores o postes ajustables. En determinadas modalidades, el segundo mecanismo de ajuste incluye uno o más actuadores lineales. En algunas modalidades, el segundo mecanismo de ajuste incluye una membrana, junta o capa hinchable o expandible colocada entre el primer y segundo miembros.

Como etapa posterior en un flujo de trabajo analítico, después de que el soporte de muestra y el matriz de elementos se hayan puesto en contacto por el soporte de muestra, el soporte de muestra puede introducirse en un termociclador para promover la captura de analitos de la muestra por el matriz de elementos. El soporte de muestra puede insertarse directamente en un termociclador adecuado para este propósito. Alternativamente, en algunas modalidades, el soporte de muestra puede acoplarse a un adaptador de termociclador y el contenedor y el adaptador acoplados insertarse en un termociclador. Los dispositivos ilustrativos y los soporte de muestra ilustrativos se describen en la publicación de solicitud de patente PCT núm. WO 2020/123320.

En algunos casos, las sondas en el primer y/o segundo sustrato se adhieren a perlas (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, las sondas se colocan en el primer y/o segundo sustrato mediante el uso de microesferas (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, las perlas o microesferas que incluyen sondas se asocian con, o se fijan al primer y/o segundo sustrato. Por ejemplo, en algunos casos, las sondas de captura que contienen perlas o microesferas se fijan directa o indirectamente a un sustrato a través de las químicas de superficie, hidrogel y similares.

En algunos casos, el diámetro de una perla que está adherida a la sonda en el segundo sustrato es de aproximadamente 1 |jm, aproximadamente 2 |jm, aproximadamente 3 |jm, aproximadamente 4 |jm, aproximadamente 5 jim, aproximadamente 6 jim, aproximadamente 7 jim, aproximadamente 8 jim, aproximadamente 9 jim, aproximadamente 10 jim, aproximadamente 15 jim, aproximadamente 20 jim o más.

El soporte de sustrato es compatible con una variedad de esquemas diferentes para poner en contacto las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz con el medio reactivo para promover la captura de analitos. En algunas modalidades, el medio reactivo se deposita directamente sobre el segundo sustrato (por ejemplo, formando un medio reactivo que incluye el reactivo de permeabilización y la matriz de elementos), y/o directamente sobre el primer sustrato. En algunas modalidades, el medio reactivo se deposita sobre el primer y/o segundo sustrato, y después el primer y segundo sustratos se alinean en la configuración de intercalamiento de manera que el medio reactivo entra en contacto con las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz. En algunas modalidades, el medio reactivo se introduce en el espacio mientras que el primer y segundo sustratos se alinean en la configuración de intercalamiento.

En ciertas modalidades un reactivo de permeabilización seco se aplica o se forma como una capa sobre el primer sustrato o el segundo sustrato o ambos antes de entrar en contacto con la muestra y la matriz de elementos. Por ejemplo, un reactivo puede depositarse en solución sobre el primer sustrato o el segundo sustrato o ambos y luego secarse. Los métodos de secado incluyen, pero no se limitan a, recubrir mediante centrifugación una solución delgada del reactivo y luego evaporar un solvente incluido en el reactivo o el propio reactivo. Alternativamente, en otras modalidades, el reactivo puede aplicarse en forma seca directamente sobre el primer sustrato o el segundo sustrato o ambos. En algunas modalidades, el proceso de recubrimiento puede realizarse antes del flujo de trabajo analítico y el primer sustrato y el segundo sustrato pueden almacenarse recubiertos previamente. Alternativamente, el proceso de recubrimiento puede realizarse como parte del flujo de trabajo analítico. En algunas modalidades, el reactivo es un reactivo de permeabilización. En algunas modalidades, el reactivo es una enzima de permeabilización, un tampón, un detergente o cualquiera de sus combinaciones. En algunas modalidades, la enzima de permeabilización es pepsina. En algunas modalidades, el reactivo es un reactivo seco (por ejemplo, un reactivo libre de humedad o líquido). En algunos casos, el sustrato que incluye la muestra (por ejemplo, una sección histológica de tejido) se hidrata. La muestra puede hidratarse al poner en contacto la muestra con un medio reactivo, por ejemplo, un tampón que no incluye un reactivo de permeabilización. En algunas modalidades, la hidratación se realiza mientras el primer y segundo sustratos se alinean en una configuración de intercalamiento.

En algunos casos, las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz están en contacto con el medio reactivo durante aproximadamente 1 minuto. En algunos casos, las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz están en contacto con el medio reactivo durante aproximadamente 5 minutos. En algunos casos, las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz están en contacto con el medio reactivo en el espacio durante aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 12 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 18 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 25 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 36 minutos, aproximadamente 45 minutos o aproximadamente una hora. En algunos casos, las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz están en contacto con el medio reactivo durante aproximadamente 1-60 minutos. En algunos casos, las porciones alineadas de la muestra biológica y la matriz están en contacto con el medio reactivo durante aproximadamente 30 minutos.

En algunas modalidades, después del contacto inicial entre la muestra y un agente de permeabilización, el agente de permeabilización puede eliminarse del contacto con la muestra (por ejemplo, abriendo el soporte de sustrato). En algunas modalidades, el soporte de sustrato se abre antes de la permeabilización completa de la muestra. Por ejemplo, en algunas modalidades, solo una porción de la muestra se permeabiliza, y solo una porción de los analitos en la muestra puede capturarse mediante la matriz de elementos. En algunos casos, la cantidad reducida de analito capturado y disponible para su detección puede compensarse mediante la reducción de la difusión lateral que resulta de la permeabilización incompleta de la muestra. En general, la resolución espacial del ensayo se determina por el grado de difusión del analito en la dirección transversal (por ejemplo, o es decir, ortogonal a la dirección normal a la superficie de la muestra). Cuanto mayor sea la distancia entre la muestra en el primer sustrato y la matriz de elementos en el segundo sustrato, mayor será la extensión de la difusión en la dirección transversal, y la pérdida concomitante de resolución. Los analitos liberados de una porción de la muestra más cercana a la matriz de elementos tienen una trayectoria de difusión más corta y, por lo tanto, no se difunden tanto lateralmente como los analitos de las porciones de la muestra más alejadas de la matriz de elementos. Como resultado, en algunos casos, la permeabilización incompleta de la muestra (al reducir el intervalo de contacto entre el agente de permeabilización y la muestra) puede usarse para aumentar aún más la resolución espacial en el ensayo. En algunas modalidades, el soporte de sustrato se abre después de la permeabilización completa o sustancialmente completa de la muestra.

En algunos casos, el dispositivo se configura para controlar una temperatura del primer y segundo sustratos. En algunas modalidades, la temperatura del primer y segundo miembros se reduce a una primera temperatura que está por debajo de la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 grados centígrados) (por ejemplo, 20 grados centígrados o menos, 15 grados centígrados o menos, 10 grados centígrados o menos, 5 grados centígrados o menos, 4 grados centígrados o menos, 3 grados centígrados o menos, 2 grados centígrados o menos, 1 grado centígrados o menos, 0 grados centígrados o menos, -1 grados centígrados o menos, -5 grados centígrados o menos). En algunas modalidades, el dispositivo incluye un sistema de control de temperatura (por ejemplo, bobinas conductoras de calentamiento y enfriamiento) para controlar la temperatura del soporte de muestra. Alternativamente, en otras modalidades, la temperatura del soporte de muestra se controla externamente (por ejemplo, por refrigeración o por una placa caliente). En una primera etapa, el segundo miembro, establecido a o a la primera temperatura, entra en contacto con el primer sustrato, y el primer miembro, establecido a o a la primera temperatura, entra en contacto con el segundo sustrato, y baja de esta manera la temperatura del primer sustrato y el segundo sustrato a una segunda temperatura. En algunas modalidades, la segunda temperatura es equivalente a la primera temperatura. En algunas modalidades, la primera temperatura es menor que la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 grados Celsius). En algunas modalidades, la segunda temperatura varía de aproximadamente -10 grados Celsius a aproximadamente 4 grados Celsius. En algunas modalidades, la segunda temperatura está más abajo de la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 grados Celsius) (por ejemplo, 20 grados Celsius o inferior, 15 grados Celsius o inferior, 10 grados Celsius o inferior, 5 grados Celsius o inferior, 4 grados Celsius o inferior, 3 grados Celsius o inferior, 2 grados Celsius o inferior, 1 grado Celsius o inferior, 0 grados Celsius o inferior, -1 grados Celsius o inferior, -5 grados Celsius o inferior).

En una modalidad ilustrativa, el segundo sustrato se pone en contacto con el reactivo de permeabilización. En algunas modalidades, el reactivo de permeabilización se seca. En algunas modalidades, el reactivo de permeabilización es un gel o un líquido. Además, en la modalidad ilustrativa, la muestra biológica se pone en contacto con el tampón. Tanto el primero como el segundo sustratos se colocan a una temperatura más baja para ralentizar la difusión y la eficiencia de permeabilización. Alternativamente, en algunas modalidades, la muestra puede ponerse en contacto directamente con un reactivo de permeabilización líquido sin inducir un inicio no deseado de la permeabilización debido a que los sustratos están a la segunda temperatura. En algunas modalidades, la baja temperatura ralentiza o evita el inicio de la permeabilización. En una segunda etapa, mantener el soporte de muestra y los sustratos a una temperatura fría (por ejemplo, a la primera o a la segunda temperaturas) continúa la ralentización o prevención de la permeabilización de la muestra. En una tercera etapa, el soporte de muestra (y consecuentemente el primer y segundo sustratos) se calientan para iniciar la permeabilización. En algunas modalidades, el soporte de muestra se calienta hasta una tercera temperatura. En algunas modalidades, la tercera temperatura está por encima de la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 grados Celsius) (por ejemplo, 30 grados Celsius o superior, 35 grados Celsius o superior, 40 grados Celsius o superior, 50 grados Celsius o superior, 60 grados Celsius o superior). En algunas modalidades, los analitos que se liberan del tejido permeabilizado de la muestra se difunden a la superficie del segundo sustrato y se capturan en la matriz (por ejemplo, sondas con código de barras) del segundo sustrato. En una cuarta etapa, el primer sustrato y el segundo sustrato se separan (por ejemplo, se apartan) y se detiene el control de temperatura.

En algunas modalidades, donde el primer sustrato o el segundo sustrato (o ambos) incluye pocillos, una solución de permeabilización puede introducirse en algunos o todos los pocillos, y después la muestra y el matriz de elementos pueden ponerse en contacto cerrando el soporte de muestra para permeabilizar la muestra. En ciertas modalidades, una solución de permeabilización puede empaparse en una película de hidrogel que se aplica directamente a la muestra, y/o empaparse en los elementos (por ejemplo, perlas) de la matriz. Cuando el primer y segundo sustratos se alinean en la configuración de intercalamiento, la solución de permeabilización promueve la migración de analitos desde la muestra a la matriz.

En ciertas modalidades, pueden infundirse diferentes agentes de permeabilización o diferentes concentraciones de agentes de permeabilización en elementos de la matriz (por ejemplo, perlas) o en una capa de hidrogel como se describió anteriormente. Al variar localmente la naturaleza del(de los) reactivo(s) de permeabilización, el proceso de captura de analitos de la muestra puede ajustarse espacialmente.

En algunos casos, la migración del analito desde la muestra biológica al segundo sustrato es pasiva (por ejemplo, por difusión). Alternativamente, en ciertas modalidades, la migración del analito desde la muestra biológica se realiza activamente (por ejemplo, electroforética, mediante la aplicación de un campo eléctrico para promover la migración). En algunos casos, el primer y segundo sustratos pueden incluir un epoxi conductor. Los alambres eléctricos de un suministro de energía pueden conectarse al epoxi conductor, y permitir de esta manera que un usuario aplique una corriente y genere un campo eléctrico entre el primer y segundo sustratos. En algunas modalidades, la migración electroforética da como resultado una mayor eficiencia de captura de analitos y una mejor fidelidad espacial de los analitos capturados (por ejemplo, en una matriz de elementos) que la difusión aleatoria sobre sustratos coincidentes sin la aplicación de un campo eléctrico (por ejemplo, mediante alineación manual de los dos sustratos). Los métodos ilustrativos de migración electroforética se describen en el documento WO 2020/176788.

La pérdida de resolución espacial puede producirse cuando los analitos migran desde la muestra a matriz de elementos y un componente de migración difusiva se produce en la dirección transversal (por ejemplo, lateral), aproximadamente paralela a la superficie del primer sustrato en el cual se monta la muestra. Para abordar esta pérdida de resolución, en algunas modalidades, un agente de permeabilización depositado o infundido en un material con difusión anisotrópica puede aplicarse a la muestra o a la matriz de elementos. El primer y segundo sustratos se alinean por el soporte de muestra y entran en contacto. Una capa de permeabilización que incluye una solución de permeabilización infundida en un material anisotrópico se coloca sobre el segundo sustrato.

En algunas modalidades, la matriz de elementos puede construirse sobre una capa de hidrogel infundida con un agente de permeabilización. La capa de hidrogel puede montarse sobre el segundo sustrato, o alternativamente, la capa de hidrogel en sí misma puede funcionar como el segundo sustrato. Cuando el primer y segundo sustratos se alinean, el agente de permeabilización se difunde fuera de la capa de hidrogel y a través o alrededor de la matriz de elementos para alcanzar la muestra. Los analitos de la muestra migran a la matriz de elementos. El contacto directo entre la matriz de elementos y la muestra ayuda a reducir la difusión lateral de los analitos, al mitigar la pérdida de resolución espacial que ocurriría si la trayectoria de difusión de los analitos fuera más larga.

En algunas modalidades, el flujo de trabajo incluye la provisión del primer sustrato que comprende la muestra biológica. En algunas modalidades, el flujo de trabajo incluye, montar la muestra biológica sobre el primer sustrato. En algunas modalidades en donde la muestra biológica es una muestra de tejido, el flujo de trabajo incluye la sección de la muestra de tejido (por ejemplo, la sección de criostato). En algunas modalidades, el flujo de trabajo incluye una etapa de fijación. En algunos casos, la etapa de fijación puede incluir la fijación con metanol. En algunos casos, la etapa de fijación incluye formalina (por ejemplo, formalina al 2 %).

En algunas modalidades, la muestra biológica en el primer sustrato se tiñe mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. En algunos casos, se obtienen imágenes de la muestra biológica, y se captura el patrón de tinción creado durante la etapa de tinción. En algunos casos, la muestra biológica se decolora antes del proceso de intercalamiento.

En algunos casos, después del proceso de intercalamiento, el primer sustrato y el segundo sustrato se separan (por ejemplo, de manera que ya no estén alineados en una configuración de intercalamiento, también denominada en la presente descripción como abrir el intercalamiento). En algunas modalidades, el análisis posterior (por ejemplo, transcripción inversa, síntesis de ADNc, preparación de la biblioteca y secuencias) puede realizarse en los analitos capturados después de que se separen el primer sustrato y el segundo sustrato.

En algunas modalidades, el proceso de transferencia de un analito del primer sustrato al segundo sustrato se denomina indistintamente en la presente descripción “proceso de intercalamiento”, “proceso de intercalamiento” o “intercalamiento”. El proceso de intercalamiento se describe además en la publicación de solicitud de patente PCT núm. WO 2020/123320.

En algunos casos, el tampón de permeabilización incluye proteinasa K, pepsina, colagenasa, un detergente, uno o más inhibidores de ribonucleasa, o sus combinaciones. En algunos casos, el detergente se selecciona de dodecil sulfato de sodio (SDS), éter de polietilenglicol terc-octilfenilo, polisorbato 80, polisorbato 20, N-lauroilsarcosina (o una sal de sodio de la misma), o sus combinaciones. En algunos casos, el tampón de permeabilización comprende un hidrogel.

Antes de la captura de analitos, en algunos casos, las muestras biológicas pueden teñirse mediante el uso de una amplia variedad de tintes y técnicas de tinción. En algunos casos, la muestra biológica es una sección de tejido sobre un sustrato (por ejemplo, un portaobjetos; por ejemplo, una sección biológica de 10 |jm). En algunos casos, la sección de tejido tiene aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25 jm de grosor.

En algunos casos, la muestra biológica se seca después de colocarla sobre el primer sustrato. En algunos casos, la muestra biológica se seca a 42 °C. En algunos casos, el secado ocurre durante aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, o hasta que las secciones se vuelven transparentes. En algunos casos, la muestra biológica puede secarse durante la noche (por ejemplo, en un secador a temperatura ambiente).

En algunas modalidades, una muestra puede teñirse mediante el uso de cualquier número de tinciones biológicas, que incluyen, pero no se limitan a, naranja acridina, marrón Bismarck, carmín, azul de Coomassie, cresil violeta, DAPI, eosina, bromuro de etidio, fucsina ácida, hematoxilina, tinciones Hoechst, yodo, verde metilo, azul de metileno, rojo neutro, azul Nilo, rojo Nilo, tetróxido de osmio, yoduro de propio, rodamina o safranina. En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción incluyen obtener imágenes de la muestra biológica. En algunos casos, la obtención de imágenes de la muestra se produce antes de desaminar la muestra biológica. En algunos casos, la muestra puede teñirse mediante el uso de técnicas de tinción conocidas, que incluyen Can-Grunwald, Giemsa, hematoxilina y eosina (H y E), Jenner, Leishman, tricrómica de Masson, Papanicolaou, Romanowsky, plata, Sudán, Wright, y/o técnicas de tinción con ácido periódico Schiff (PAS). La tinción con PAS se realiza típicamente después de la fijación de formalina o acetona. En algunos casos, la tinción es una tinción de H y E.

En algunas modalidades, la muestra biológica puede teñirse mediante el uso de una etiqueta detectable (por ejemplo, radioisótopos, fluoróforos, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y colorantes) como se describió en otra parte en la presente descripción. En algunas modalidades, una muestra biológica se tiñe mediante el uso de solo un tipo de tinción o una técnica. En algunas modalidades, la tinción incluye técnicas de tinción biológica tales como la tinción con H&E. En algunas modalidades, la tinción incluye identificar analitos mediante el uso de anticuerpos conjugados con fluorescencia. En algunas modalidades, una muestra biológica se tiñe mediante el uso de dos o más tipos diferentes de tinciones, o dos o más técnicas diferentes de tinción. Por ejemplo, una muestra biológica puede prepararse mediante tinción y obtención de imágenes mediante el uso de una técnica (por ejemplo, tinción con H&E y obtención de imágenes de campo claro), seguido de tinción y obtención de imágenes mediante el uso de otra técnica (por ejemplo, tinción con IHC/IF y microscopía de fluorescencia) para la misma muestra biológica.

En algunas modalidades, las muestras biológicas pueden decolorarse. Los métodos para desteñir o decolorar una muestra biológica se conocen en la técnica, y generalmente dependen de la naturaleza de la(s) tinción(es) aplicada(s) a la muestra. Por ejemplo, la tinción con H&E puede decolorarse al lavar la muestra en HCl, o cualquier otro ácido (por ejemplo, ácido selénico, ácido sulfúrico, ácido hidroyódico, ácido benzoico, ácido carbónico, ácido málico, ácido fosfórico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido sulfuroso, ácido tricloroacético, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido ortofosfórico, ácido arsénico, ácido selenoso, ácido crómico, ácido cítrico, ácido fluorhídrico, ácido nitroso, ácido isociánico, ácido fórmico, selenuro de hidrógeno, ácido molíbdico, ácido láctico, ácido acético, ácido carbónico, sulfuro de hidrógeno, o sus combinaciones). En algunas modalidades, la decoloración puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o más lavados en un ácido (por ejemplo, HCl). En algunas modalidades, la decoloración puede incluir añadir HCl a una solución aguas abajo (por ejemplo, solución de permeabilización). En algunas modalidades, la decoloración puede incluir disolver una enzima usada en los métodos descritos (por ejemplo, pepsina) en una solución ácida (por ejemplo, HCl). En algunas modalidades, después de decolorar la hematoxilina con un ácido, pueden añadirse otros reactivos a la solución de decoloración para elevar el pH para usar en otras aplicaciones. Por ejemplo, puede añadirse SDS a una solución ácida de decoloración con el fin de elevar el pH en comparación con la solución de decoloración de ácido sola. Como otro ejemplo, en algunas modalidades, se aplican una o más tinciones de inmunofluorescencia a la muestra mediante acoplamiento de anticuerpos. Tales tinciones pueden eliminarse mediante el uso de técnicas tales como escisión de enlaces disulfuro mediante el tratamiento con un agente reductor y lavado con detergente, tratamiento con sal caotrópica, tratamiento con solución de recuperación de antígeno y tratamiento con un tampón de glicina ácida. Los métodos para teñir y desteñir multiplexados se describen, por ejemplo, en Bolognesi y otros, J. Histochem. Cytochem. 2017; 65(8): 431-444, Lin y otros, Nat Commun. 2015; 6:8390, Pirici y otros, J. Histochem. Cytochem. 2009; 57:567-75, y Glass y otros, J. Histochem. Cytochem. 2009; 57:899-905.

En algunas modalidades, los protocolos de inmunofluorescencia o inmunohistoquímica (técnicas de tinción directa e indirecta) pueden realizarse como parte de, o además de, los flujos de trabajo espaciales ilustrativos presentados en la presente descripción. Por ejemplo, las secciones de tejido pueden fijarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción. La muestra biológica puede transferirse a una matriz (por ejemplo, una matriz de sondas de captura), en donde los analitos (por ejemplo, proteínas) se detectan mediante el uso de protocolos de inmunofluorescencia. Por ejemplo, la muestra puede rehidratarse, bloquearse y permeabilizarse (SSC 3X, BSA 2 %, Tritón X 0,1 %, inhibidor de ARNasa 1 U/|jl durante 10 minutos a 4 °C) antes de teñirse con anticuerpos primarios fluorescentes (1:100 en 3XSSC, BSA 2 %, Tritón X 0,1 %, inhibidor de ARNasa 1 U /jl durante 30 minutos a 4 °C). La muestra biológica puede lavarse, cubrirse con cubreobjetos (en glicerol inhibidor de ARNasa de 1 U/jl), obtener imágenes (por ejemplo, mediante el uso de un microscopio confocal u otro aparato capaz de detección fluorescente), lavarse y procesarse de acuerdo con la captura de analitos o flujos de trabajo espaciales descritos en la presente descripción.

En algunos casos, puede añadirse a la muestra una solución de glicerol y un cubreobjetos. En algunos casos, la solución de glicerol puede incluir una contratinción (por ejemplo, DAPI).

Como se usa en la presente descripción, un tampón de recuperación de antígeno puede mejorar la captura por anticuerpos en protocolos IF/IHC. Un protocolo ilustrativo para la recuperación de antígeno puede ser precalentar el tampón de recuperación de antígeno (por ejemplo, a 95 °C), sumergir la muestra biológica en el tampón de recuperación de antígeno calentado durante un tiempo predeterminado y luego eliminar la muestra biológica del tampón de recuperación de antígeno y lavar la muestra biológica.

En algunas modalidades, la optimización de la permeabilización puede usarse para identificar analitos intracelulares. La optimización de la permeabilización puede incluir la selección de agentes de permeabilización, la concentración de agentes de permeabilización y la duración de la permeabilización. La permeabilización tisular se discute en otra parte en la presente descripción.

En algunas modalidades, bloquear una matriz y/o una muestra biológica en preparación para marcar la muestra biológica disminuye la unión inespecífica de los anticuerpos a la matriz y/o muestra biológica (disminuye el ruido de fondo). Algunas modalidades proporcionan tampones de bloqueo/soluciones de bloqueo que pueden aplicarse antes y/o durante la aplicación del marcador, en donde el tampón de bloqueo puede incluir un agente de bloqueo y opcionalmente un surfactante y/o una solución salina. En algunas modalidades, un agente de bloqueo puede ser albúmina sérica bovina (BSA), suero, gelatina (por ejemplo, gelatina de pescado), leche (por ejemplo, leche seca sin grasa), caseína, polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), o polivinilpirrolidona (PVP), reactivo de bloqueo de biotina, un reactivo de bloqueo de peroxidasa, levamisol, solución de Carnoy, glicina, lisina, borohidruro de sodio, azul cielo de pontamina, negro de Sudán, azul de tripán, agente de bloqueo de FITC y/o ácido acético. El tampón de bloqueo/solución de bloqueo puede aplicarse a la matriz y/o muestra biológica antes y/o durante el marcaje (por ejemplo, la aplicación de anticuerpos conjugados con fluoróforo) a la muestra biológica.

En algunas modalidades de la configuración de intercalamiento descrita en la presente descripción, uno o más analitos de la muestra biológica se liberan de la muestra biológica y migran a un sustrato que comprende una matriz de sondas de captura para unirse a las sondas de captura de la matriz. En algunas modalidades, la liberación y migración de los analitos al sustrato que comprende la matriz de sondas de captura se produce de una manera que preserva el contexto espacial original de los analitos en la muestra biológica. En algunas modalidades, la muestra biológica se monta en un primer sustrato y el sustrato que comprende la matriz de sondas de captura es un segundo sustrato. En algunas modalidades, el método se facilita mediante un proceso de intercalamiento. Los procesos de intercalamiento se describen en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20210189475, WO 2021/252747 A1 y WO 2022/061152 A2. En algunas modalidades, el proceso de intercalamiento puede facilitarse mediante un dispositivo, soporte de muestra, aparato de manipulación de muestras, o sistema descrito en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

20210189475, WO 2021/252747 A1 o WO 2022/061152 A2.

La Figura 14 es un diagrama esquemático que representa un proceso de intercalamiento ilustrativo 104 entre un primer sustrato que comprende una muestra biológica (por ejemplo, una sección de tejido 302 en un portaobjetos 303) y un segundo sustrato que comprende una matriz con código de barras espacial, por ejemplo, un portaobjetos 304 que se puebla con sondas de captura con código de barras espacial 306. Durante el proceso de intercalamiento ilustrativo, el primer sustrato se alinea con el segundo sustrato, de manera que al menos una porción de la muestra biológica se alinea con al menos una porción de la matriz (por ejemplo, alineada en una configuración de intercalamiento). Como se muestra, el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304) está en una posición superior al primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303). En algunas modalidades, el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) puede colocarse superior al segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304). Un medio reactivo 305 (por ejemplo, solución de permeabilización) dentro de un espacio 307 entre el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) y el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304) crea un tampón de permeabilización que permeabiliza o digiere la muestra 302 y los analitos (por ejemplo, los diferentes analitos descritos en la presente descripción, tales como, proteína, ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN), agente intermedio (por ejemplo, sonda conectada (por ejemplo, sonda RTL) o agente de captura de analitos (por ejemplo, anticuerpo conjugado con oligo)) o porción de este, captura dirigida, y/o transcritoma completo) 308 de la muestra biológica 302 puede liberar, migrar activa o pasivamente (por ejemplo, difundir) a través del espacio 307 hacia las sondas de captura 306, y unirse a las sondas de captura 306.

Después de que los analitos (por ejemplo, transcritos) 308 se unan a las sondas de captura 306, puede ocurrir una reacción de extensión, lo que genera de esta manera una biblioteca con código de barras espacial. Por ejemplo, en el caso de transcritos de ARNm, la transcripción inversa puede usarse para generar una biblioteca de ADNc asociada con un código de barras espacial particular. Las bibliotecas de ADNc con código de barras pueden mapearse de nuevo a un punto específico en un área de captura de las sondas de captura 306. Estos datos pueden superponerse subsecuentemente sobre una imagen de microscopio de alta resolución de la muestra biológica, lo que hace posible visualizar los datos dentro de la morfología del tejido de una manera espacialmente resuelta. En algunas modalidades, la reacción de extensión puede realizarse por separado del aparato de manipulación de muestras descrito en la presente descripción que se configura para realizar el proceso de intercalamiento de ejemplo 104. La configuración de intercalamiento de la muestra 302, el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) y el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304) pueden proporcionar ventajas sobre otros métodos de análisis espacial y/o captura de analitos. Por ejemplo, la configuración de intercalado puede reducir una carga de que los usuarios se desarrollen en el interior de la experiencia en seccionamiento de tejidos y/o montaje de tejidos. Además, la configuración de intercalado puede desacoplar la preparación de muestras/obtención de imágenes de tejido de la matriz con código de barras (por ejemplo, sondas de captura con código de barras espaciales 306) y permitir la selección de una región particular de interés del análisis (por ejemplo, para una sección de tejido mayor que la matriz con código de barras). La configuración de intercalamiento también permite de manera beneficiosa el análisis espacial sin tener que colocar una muestra biológica (por ejemplo, sección de tejido) 302 directamente sobre el segundo sustrato (por ejemplo, portaobjetos 304).

En algunas modalidades, el proceso de intercalamiento comprende: montar el primer sustrato en un primer miembro de un dispositivo de soporte, el primer miembro configurado para retener el primer sustrato; montar el segundo sustrato en un segundo miembro del dispositivo de soporte, el segundo miembro configurado para retener el segundo sustrato, aplicar un medio reactivo al primer sustrato y/o al segundo sustrato, el medio reactivo que comprende un agente de permeabilización, operar un mecanismo de alineación (también denominado en la presente descripción mecanismo de ajuste) del dispositivo de soporte para mover el primer miembro y/o el segundo miembro de manera que una porción de la muestra biológica se alinee (por ejemplo, alineado verticalmente) con una porción de la matriz de sondas de captura y dentro de una distancia umbral de la matriz de sondas de captura, y de manera que la porción de la muestra biológica y la sonda de captura entren en contacto con el medio reactivo, en donde el agente de permeabilización libera el analito de la muestra biológica.

Los métodos de proceso de intercalamiento descritos anteriormente pueden implementarse mediante el uso de una variedad de componentes de hardware. Por ejemplo, los métodos de proceso de intercalamiento se pueden implementar mediante el uso de un soporte de muestra (también denominado en la presente descripción un dispositivo de soporte, un aparato de manipulación de muestras y un dispositivo de alineación de matrices). En algunas modalidades de un soporte de muestra, el soporte de muestra puede incluir un primer miembro que incluye un primer mecanismo de retención configurado para retener un primer sustrato que comprende una muestra. El primer mecanismo de retención puede configurarse para retener el primer sustrato dispuesto en un primer plano. El soporte de muestra puede incluir además un segundo miembro que incluye un segundo mecanismo de retención configurado para retener un segundo sustrato dispuesto en un segundo plano. El soporte de muestra puede incluir además un mecanismo de alineación conectado a uno o ambos del primer miembro y el segundo miembro. El mecanismo de alineación puede configurarse para alinear el primer y segundo miembros a lo largo del primer plano y/o el segundo plano de manera que la muestra entre en contacto con al menos una porción del medio reactivo cuando el primer y segundo miembros se alinean y dentro de una distancia umbral a lo largo de un eje ortogonal al segundo plano. El mecanismo de ajuste puede configurarse para mover el segundo miembro a lo largo del eje ortogonal al segundo plano y/o mover el primer miembro a lo largo de un eje ortogonal al primer plano.

En algunas modalidades, el mecanismo de ajuste incluye un accionador lineal. En algunas modalidades, el accionador lineal se configura para mover el segundo miembro a lo largo de un eje ortogonal al plano o al primer miembro y/o al segundo miembro. En algunas modalidades, el actuador lineal se configura para mover el primer miembro a lo largo de un eje ortogonal al plano del primer miembro y/o el segundo miembro. En algunas modalidades, el actuador lineal se configura para mover el primer miembro, el segundo miembro, o tanto el primer miembro como el segundo miembro a una velocidad de al menos 0,1 mm/s. En algunas modalidades, el actuador lineal se configura para mover el primer miembro, el segundo miembro, o tanto el primer miembro como el segundo miembro con una cantidad de fuerza de al menos 0,1 lb.

Figura 15A es una vista en perspectiva de un aparato de manipulación de muestras de ejemplo 1400 en una posición cerrada de acuerdo con algunas implementaciones de ejemplo. Como se muestra, el aparato de manipulación de muestras 1400 incluye un primer miembro 1404, un segundo miembro 1410, opcionalmente un dispositivo de captura de imágenes 1420, un primer sustrato 1406, opcionalmente una bisagra 1415 y opcionalmente un espejo 1416. La bisagra 1415 puede configurarse para permitir que el primer miembro 1404 se posicione en una configuración abierta o cerrada abriendo y/o cerrando el primer miembro 1404 a manera concha a lo largo de la bisagra 1415.

La Figura 15B es una vista en perspectiva del aparato de manipulación de muestras de ejemplo 1400 en una posición abierta de acuerdo con algunas implementaciones de ejemplo. Como se muestra, el aparato de manipulación de muestras 1400 incluye uno o más primeros mecanismos de retención 1408 configurados para retener uno o más primeros sustratos 1406. En el ejemplo de Figura 15B, el primer miembro 1404 se configura para retener dos primeros sustratos 1406, sin embargo el primer miembro 1404 puede configurarse para retener más o menos primeros sustratos 1406.

En algunos aspectos, cuando el aparato de manipulación de muestras 1400 está en una posición abierta (como en Figura 15B), el primer sustrato 1406 y/o el segundo sustrato 1412 pueden cargarse y posicionarse dentro del aparato de manipulación de muestras 1400, tal como dentro del primer miembro 1404 y el segundo miembro 1410, respectivamente. Como se indicó, la bisagra 1415 puede permitir que el primer miembro 1404 se cierre sobre el segundo miembro 1410 y forme una configuración de intercalamiento (por ejemplo, la configuración de intercalamiento que se muestra en Figura 14).

En algunos aspectos, después de que el primer miembro 1404 se cierra sobre el segundo miembro 1410, un mecanismo de ajuste (no mostrado) del aparato de manipulación de muestras 1400 puede accionar el primer miembro 1404 y/o el segundo miembro 1410 para formar la configuración de intercalado para la etapa de permeabilización (por ejemplo, acercar el primer sustrato 1406 y el segundo sustrato 1412 entre sí y dentro de una distancia umbral para la configuración de intercalado). El mecanismo de ajuste puede configurarse para controlar una velocidad, un ángulo, una fuerza, o similares de la configuración de intercalamiento.

En algunas modalidades, la muestra biológica (por ejemplo, la muestra 302) puede alinearse dentro del primer miembro 1404 (por ejemplo, a través del primer mecanismo de retención 1408) antes de cerrar el primer miembro 1404 de manera que una región de interés deseada de la muestra 302 se alinee con la matriz con código de barras del segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304), por ejemplo, cuando el primer y segundo sustratos se alinean en la configuración de intercalamiento. Tal alineación puede lograrse manualmente (por ejemplo, por un usuario) o automáticamente (por ejemplo, mediante un mecanismo de alineación automatizado). Después o antes de la alineación, los separadores pueden aplicarse al primer sustrato 1406 y/o al segundo sustrato 1412 para mantener una separación mínima entre el primer sustrato 1406 y el segundo sustrato 1412 durante el intercalamiento. En algunos aspectos, la solución de permeabilización (por ejemplo, la solución de permeabilización 305) puede aplicarse al primer sustrato 1406 y/o al segundo sustrato 1412. El primer miembro 1404 puede entonces cerrarse sobre el segundo miembro 1410 y formar la configuración de intercalamiento. Los analitos (por ejemplo, los diferentes analitos descritos en la presente descripción, tales como, transcritos de ARNm) 308 pueden capturarse mediante las sondas de captura 306 y pueden procesarse para el análisis espacial.

En algunas modalidades, durante la etapa de permeabilización, el dispositivo de captura de imágenes 1420 puede capturar imágenes del área de solapamiento (por ejemplo, el área de solapamiento 710) entre el tejido 302 y las sondas de captura 306. Si más de un primer sustrato 1406 y/o segundo sustrato 1412 están presentes dentro del aparato de manipulación de muestras 1400, el dispositivo de captura de imágenes 1420 puede configurarse para capturar una o más imágenes de una o más áreas de solapamiento 710. Más detalles sobre dispositivos de soporte, soportes de muestra, aparatos de manipulación de muestras, o sistemas para implementar un proceso de intercalamiento se describen en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.

20210189475 y WO 2022/061152 A2.

Los analitos dentro de una muestra biológica pueden liberarse a través de la interrupción (por ejemplo, permeabilización, digestión, etc.) de la muestra biológica o pueden liberarse sin interrupción. En la presente descripción se describen varios métodos de permeabilización (por ejemplo, cualquiera de los reactivos y/o condiciones de permeabilización descritos en la presente descripción) de una muestra biológica, que incluyen, por ejemplo, el uso de varios detergentes, tampones, proteasas y/o nucleasas durante diferentes períodos de tiempo y a varias temperaturas. Adicionalmente, en la presente descripción se describen varios métodos para suministrar fluidos (por ejemplo, un tampón, una solución de permeabilización) a una muestra biológica, que incluyen el uso de un soporte de sustrato (por ejemplo, para el ensamble de intercalamiento, la configuración de intercalamiento, como se describe en la presente descripción).

En la presente descripción se proporcionan métodos para suministrar un fluido a una muestra biológica dispuesta en un área de un primer sustrato y una matriz dispuesta en un segundo sustrato.

En algunas modalidades y con referencia a la Figura 14, la configuración de intercalamiento descrita en la presente descripción entre un primer sustrato que comprende una muestra biológica (por ejemplo, el portaobjetos 303) y un segundo sustrato que comprende una matriz con código de barras espacial (por ejemplo, el portaobjetos 304 con sondas de captura codificadas 306) puede incluir un medio reactivo (por ejemplo, un medio reactivo líquido, por ejemplo, una solución de permeabilización 305 u otra solución de captura y liberación de moléculas objetivo) para llenar un espacio (por ejemplo, el espacio 307). Puede ser conveniente que el medio reactivo esté libre de burbujas de aire entre los portaobjetos para facilitar la transferencia de moléculas objetivo con información espacial. Adicionalmente, las burbujas de aire presentes entre los portaobjetos pueden oscurecer al menos una porción de una captura de imagen de una región de interés deseada. En consecuencia, puede ser conveniente garantizar o fomentar la supresión y/o eliminación de burbujas de aire entre los dos sustratos (por ejemplo, el portaobjetos 303 y el portaobjetos 304) durante una etapa de permeabilización (por ejemplo, la etapa 104).

En algunos aspectos, puede ser posible reducir o eliminar la formación de burbujas entre los portaobjetos mediante el uso de una variedad de métodos de llenado y/o métodos de cierre.

Los flujos de trabajo descritos en la presente descripción pueden incluir poner en contacto una gota del medio reactivo (por ejemplo, medio reactivo líquido, por ejemplo, una solución de permeabilización 305) dispuesta sobre un primer sustrato o un segundo sustrato con al menos una porción del segundo sustrato o primer sustrato, respectivamente. En algunas modalidades, el contacto comprende acercar los dos sustratos de manera que la muestra en el primer sustrato se alinee con la matriz de códigos de barras de las sondas de captura en el segundo sustrato.

En algunas modalidades, la gota incluye reactivos de permeabilización (por ejemplo, cualquiera de los reactivos de permeabilización descritos en la presente descripción). En algunas modalidades, la velocidad de permeabilización de la muestra biológica se modula mediante el suministro de los reactivos de permeabilización (por ejemplo, un fluido que contiene reactivos de permeabilización) a varias temperaturas.

En los flujos de trabajo de la máquina de intercalamiento ilustrados en la presente descripción, el medio reactivo (por ejemplo, medio reactivo líquido, solución de permeabilización 305) puede llenar un espacio (por ejemplo, el espacio 307) entre un primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) y un segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 con las sondas de captura codificadas 306) para garantizar o permitir la transferencia de moléculas objetivo con información espacial. En la presente descripción se describen ejemplos de métodos de llenado que pueden suprimir la formación de burbujas y suprimir el flujo no deseado de transcritos y/o moléculas objetivo o analitos. La fluidicidad robusta en la fabricación de intercalamientos descrita en la presente descripción puede preservar la información espacial al reducir o evitar la desviación de las moléculas a medida que se mueven desde el portaobjetos de tejido hasta el portaobjetos de captura.

La Figura 16A muestra un proceso de intercalamiento ilustrativo 3600 donde un primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303), que incluye una muestra biológica 302 (por ejemplo, una sección de tejido), y un segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 que incluye las sondas de captura con código de barras espacial 306) se acercan entre sí. Como se muestra en la Figura 16A, se introduce una gota de reactivo líquido (por ejemplo, solución de permeabilización 305) sobre el segundo sustrato cerca de las sondas de captura 306 y entre la muestra biológica 302 y el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 que incluye las sondas de captura 306 con código de barras espacial). La solución de permeabilización 305 puede liberar analitos que pueden capturarse mediante las sondas de captura 306 de la matriz. Como se muestra además, uno o más separadores 3610 pueden colocarse entre el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) y el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 que incluye las sondas de captura con código de barras espacial 306). El uno o más separadores 3610 pueden configurarse para mantener una distancia de separación entre el primer sustrato y el segundo sustrato. Si bien el uno o más separadores 3610 se muestran dispuestos en el segundo sustrato, el separador puede estar dispuestos adicional o alternativamente en el primer sustrato.

En algunas modalidades, el uno o más separadores 3610 se configuran para mantener una distancia de separación entre el primer y el segundo sustrato que está entre aproximadamente 2 micras y 1 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 2 micras y 800 micras, entre aproximadamente 2 micras y 700 micras, entre aproximadamente 2 micras y 600 micras, entre aproximadamente 2 micras y 500 micras, entre aproximadamente 2 micras y 400 micras, entre aproximadamente 2 micras y 300 micras, entre aproximadamente 2 micras y 200 micras, entre aproximadamente 2 micras y 100 micras, entre aproximadamente 2 micras y 25 micras, o entre aproximadamente 2 micras y 10 micras), medida en una dirección ortogonal a la superficie del primer sustrato que soporta la muestra. En algunos casos, la distancia de separación es de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 micras. En algunas modalidades, la distancia de separación es menor que 50 micras. En algunas modalidades, la distancia de separación es menor que 25 micras. En algunas modalidades, la distancia de separación es menor que 20 micras. La distancia de separación puede incluir una distancia de al menos 2 |jm.

La Figura 16B muestra una configuración de intercalamiento completamente formada que crea una cámara 3650 formada a partir del uno o más separadores 3610, el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) y el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 que incluye las sondas de captura con código de barras espacial 306) de acuerdo con algunas implementaciones ilustrativas. En el ejemplo de la Figura 16B, el reactivo líquido (por ejemplo, la solución de permeabilización 305) llena el volumen de la cámara 3650 y puede crear un tampón de permeabilización que permite que los analitos (por ejemplo, transcritos de ARNm y/u otras moléculas) se difundan desde la muestra biológica 302 hacia las sondas de captura 306 del segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304). En algunos aspectos, el flujo del tampón de permeabilización puede desviar los transcritos y/o moléculas de la muestra biológica 302 y puede afectar la transferencia difusiva de analitos para el análisis espacial. Una cámara parcialmente o completamente sellada 3650 resultante de uno o más separadores 3610, el primer sustrato y el segundo sustrato pueden reducir o evitar el flujo del movimiento convectivo no deseado de transcritos y/o moléculas sobre la transferencia difusiva de la muestra biológica 302 a las sondas de captura 306.

En algunos casos, el primer sustrato y el segundo sustrato se disponen en un ensamble de intercalamiento en ángulo como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, durante el intercalamiento de los dos sustratos (por ejemplo, el portaobjetos 303 y el portaobjetos 304), puede usarse un flujo de trabajo de cierre en ángulo para suprimir o eliminar la formación de burbujas.

Las Figuras 17A-17C representan una vista lateral y una vista superior de un flujo de trabajo de cierre en ángulo ilustrativo 4000 para intercalar un primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303) que tiene una muestra biológica 302 y un segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 que tiene sondas de captura 306) de acuerdo con algunas implementaciones ilustrativas.

La Figura 17A representa el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303 que incluye la muestra biológica 302) en ángulo sobre (superior a) el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304). Como se muestra, una gota del medio reactivo (por ejemplo, solución de permeabilización) 305 se ubica en el separador 3610 hacia el lado derecho de la vista lateral en la Figura 17A. Mientras la Figura 17A representa el medio reactivo en el lado derecho de la vista lateral, debe entenderse que tal representación no pretende ser limitante en cuanto a la ubicación del medio reactivo en el separador.

La Figura 17B muestra que a medida que el primer sustrato disminuye y/o a medida que el segundo sustrato aumenta, el lado caído del primer sustrato (por ejemplo, un lado del portaobjetos 303 inclinado hacia el segundo sustrato) puede entrar en contacto con la gota del medio reactivo 305. El lado caído del primer sustrato puede empujar el medio reactivo 305 hacia la dirección opuesta (por ejemplo, hacia un lado opuesto del separador 3610, hacia un lado opuesto del primer sustrato con relación al lado caído). Por ejemplo, en la vista lateral de la Figura 17B el medio reactivo 305 puede empujarse de derecha a izquierda a medida que se forma el intercalamiento.

En algunas modalidades, el primer sustrato y/o el segundo sustrato se mueven además para lograr una disposición aproximadamente paralela del primer sustrato y el segundo sustrato.

La Figura 17C representa un cierre completo del intercalamiento entre el primer sustrato y el segundo sustrato con el espaciador 3610 en contacto con el primer sustrato y el segundo sustrato y que mantiene una distancia de separación y, opcionalmente, la disposición aproximadamente paralela entre los dos sustratos. Como se muestra en la vista superior de la Figura 17C, el separador 3610 encierra y rodea completamente la muestra biológica 302 y las sondas de captura 306, y el separador 3610 forma los lados de la cámara 3650 que contiene un volumen del medio reactivo 305.

Debe entenderse que mientras la Figuras 17A-17C representar el primer sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 303 que incluye la muestra biológica 302) en ángulo sobre (superior a) el segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304) y el segundo sustrato que comprende el separador 3610, debe entenderse que un flujo de trabajo de cierre en ángulo ilustrativo puede incluir el segundo sustrato en ángulo sobre (superior a) el primer sustrato y el primer sustrato que comprende el separador 3610.

Las Figuras 18A-18E representan un flujo de trabajo 1700 ilustrativo para un ensamble de intercalamiento en ángulo de acuerdo con algunas implementaciones ilustrativas. Como se muestra en la Figura 18A, un sustrato 1712 (por ejemplo, un primer sustrato tal como el portaobjetos 303 o un segundo sustrato tal como el portaobjetos 304 que comprende las sondas de captura con códigos de barras espaciales 306) puede colocarse y colocarse sobre una base 1704 (por ejemplo, un primer miembro o un segundo miembro de un soporte de muestra descrito en la presente descripción) con un lado del sustrato 1712 soportado por un resorte 1715. El resorte 1715 puede extenderse desde la base 1704 en una dirección superior y puede configurarse para disponer el sustrato 1712 a lo largo de un plano en ángulo diferente al de la base 1704. El ángulo del sustrato 1712 puede ser de manera que una gota de medio reactivo 1705 (por ejemplo, una gota de medio reactivo líquido) colocada en la superficie del sustrato 1712 (por ejemplo, una superficie de un separador unido al sustrato) no se caiga de la superficie (por ejemplo, debido a la gravedad). El ángulo puede determinarse en base a una fuerza gravitacional frente a cualquier fuerza superficial para mover la gota lejos y fuera del sustrato 1712.

La Figura 18B representa una gota 1705 de medio reactivo colocada sobre el sustrato 1712. Como se muestra, la gota 1705 se ubica en el lado del sustrato 1712 que contacta con el resorte 1715 y se ubica en proximidad y por encima (superior a) del resorte 1715.

Como se muestra en la Figura 18C, otro sustrato 1706 puede colocarse encima (superior a) el sustrato 1712 y en un ángulo sustancialmente paralelo con la base 1704. Por ejemplo, en los casos en donde el sustrato 1712 es un segundo sustrato descrito en la presente descripción (por ejemplo, el portaobjetos 304 que comprende las sondas de captura con código de barras espacial), el sustrato 1706 puede ser un primer sustrato descrito en la presente descripción (por ejemplo, el portaobjetos 303). En los casos en donde el sustrato 1712 es un primer sustrato descrito en la presente descripción (por ejemplo, el portaobjetos 303), el sustrato 1706 puede ser un segundo sustrato (por ejemplo, el portaobjetos 304 que comprende sondas de captura con código de barras espacial).

En algunos casos, otra base (no mostrada) que soporta el sustrato 1706 (por ejemplo, un primer miembro o un segundo miembro de un soporte de muestra descrito en la presente descripción) puede configurarse para retener el sustrato 1706 en el ángulo sustancialmente paralelo a la base 1704.

Como se muestra en la Figura 18D, el sustrato 1706 puede bajarse hacia el sustrato 1712 de manera que un lado caído del sustrato 1706 entre en contacto primero con la gota 1705. En algunos aspectos, el lado caído del sustrato 1706 puede empujar la gota 1705 hacia el lado opuesto del sustrato 1706. En algunas modalidades, el sustrato 1712 puede moverse hacia arriba hacia el sustrato 1706 para lograr el contacto del lado caído del sustrato 1706 con la gota 1705.

La Figura 18E representa un cierre de intercalamiento completo del sustrato 1706 y el sustrato 1712 con la gota de medio reactivo 1705 colocada entre los dos lados. En algunos aspectos y como se muestra, a medida que el sustrato 1706 se baja sobre la gota 1705 y hacia el sustrato 1712 (y/o a medida que el sustrato 1712 se eleva hacia el sustrato 1706), el resorte 1715 puede comprimirse y el sustrato 1712 puede bajarse a la base 1704 y volverse sustancialmente paralelo al sustrato 1706.

La Figura 19A es una vista lateral del flujo de trabajo de cierre en ángulo 1700 de acuerdo con algunas implementaciones ilustrativas. La Figura 19B es una vista superior del flujo de trabajo de cierre en ángulo 1700 de acuerdo con algunas implementaciones ilustrativas. Como se muestra en 1805 y de acuerdo con las Figuras 18C-D, la gota de medio reactivo 1705 se coloca al lado del sustrato 1712 en contacto con el resorte 1715.

En la etapa 1810, el lado caído del sustrato en ángulo 1706 contacta primero con la gota del medio reactivo 1705. El contacto del sustrato 1706 con la gota de medio reactivo 1705 puede formar un frente de flujo lineal o de baja curvatura que se llena uniformemente con los portaobjetos cerrados.

En la etapa 1815, el sustrato 1706 se baja aún más hacia el sustrato 1712 (o el sustrato 1712 se eleva hacia el sustrato 1706) y el lado caído del sustrato 1706 puede entrar en contacto y puede empujar el reactivo líquido hacia el lado opuesto al lado caído y crear un frente de flujo lineal o de baja curvatura que puede evitar o reducir el atrapamiento de burbujas entre los portaobjetos. Como se muestra además, el resorte 1715 puede comenzar a comprimirse a medida que se baja el sustrato 1706.

En la etapa 1820, la gota de medio reactivo 1705 llena el espacio (por ejemplo, el espacio 307) entre el sustrato 1706 y el sustrato 1712. El frente de flujo lineal del reactivo líquido puede formarse al exprimir el volumen de la gota 1705 a lo largo del lado de contacto del sustrato 1712 y/o el sustrato 1706. Adicionalmente, el flujo capilar también puede contribuir a llenar el área de espacio. Como se muestra además en la etapa 1820, el resorte 1715 puede comprimirse completamente de manera que el sustrato 1706, el sustrato 1712 y la base 1704 sean sustancialmente paralelos entre sí.

En algunos aspectos, un flujo de trabajo de cierre en ángulo descrito en la presente descripción (por ejemplo, las Figuras 17A-17C, 18A-18E, 19A-19B) puede realizarse mediante un aparato de manipulación de muestras (por ejemplo, como se describe en el documento núm. WO 2022/061152 A2.

Más detalles sobre los flujos de trabajo de cierre en ángulo, y dispositivos y sistemas para implementar un flujo de trabajo de cierre en ángulo, se describen en los documentos WO 2021/252747 A1 y WO 2022/061152 A2. Las configuraciones adicionales para reducir o eliminar la formación de burbujas, y/o para reducir el flujo de fluido no deseado, se describen en el documento núm. WO 2021/252747 A1.

(ii) Preparación de la muestra biológica para la captura de analitos

La descripción proporciona métodos, kits, sustratos y aparatos que examinan la expresión espacial del analito en múltiples tipos de tejidos. En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente descripción se realizan en una muestra FFPe . En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente descripción se realizan en una muestra recién congelada.

En algunos casos (por ejemplo, en una muestra FFPE), la muestra biológica se desparafina. La desparafinación puede lograrse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunos casos, las muestras biológicas se tratan con una serie de lavados que incluyen xileno y varias concentraciones de etanol. En algunos casos, los métodos de desparafinación incluyen el tratamiento de xileno (por ejemplo, tres lavados a 5 minutos cada uno). En algunos casos, los métodos incluyen además tratamiento con etanol (por ejemplo, 100 % de etanol, dos lavados de 10 minutos cada uno; 95 % de etanol, dos lavados de 10 minutos cada uno; 70 % de etanol, dos lavados de 10 minutos cada uno; 50 % de etanol, dos lavados de 10 minutos cada uno). En algunos casos, después de los lavados con etanol, la muestra biológica puede lavarse con agua desionizada (por ejemplo, dos lavados durante 5 minutos cada uno). Se aprecia que un experto en la técnica puede ajustar estos métodos para optimizar la desparafinación.

En algunos casos, la muestra biológica se desentrecruza. En algunos casos, la muestra biológica se desentrecruza en una solución que contiene tampón TE (que comprende Tris y EDTA). En algunos casos, el tampón TE es básico (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 9). En algunos casos, el desentrecruzamiento ocurre a aproximadamente 50 °C a aproximadamente 80 °C. En algunos casos, el desentrecruzamiento se produce a aproximadamente 70 °C. En algunos casos, el desentrecruzamiento ocurre por aproximadamente 1 hora a 70 °C. Justo antes del desentrecruzamiento, la muestra biológica puede tratarse con un ácido (por ejemplo, HCl 0,1 M durante aproximadamente 1 minuto). Después de la etapa de desentrecruzamiento, la muestra biológica puede lavarse (por ejemplo, con PBST 1x).

En algunos casos, los métodos para preparar una muestra biológica para la captura de analitos incluyen etapas de equilibrado y bloqueo de la muestra biológica. En algunos casos, el equilibrio se realiza mediante el uso de un tampón de prehibridación (pre-Hib). En algunos casos, el tampón pre-Hib está libre de ARNasa. En algunos casos, el tampón pre-Hib no contiene albúmina sérica bovina (BSA), soluciones como la de Denhardt u otros materiales biológicos potencialmente contaminados con nucleasas.

En algunos casos, la etapa de equilibrio se realiza múltiples veces (por ejemplo, 2 veces a 5 minutos cada una; 3 veces a 5 minutos cada una). En algunos casos, la muestra biológica se bloquea con un tampón de bloqueo. En algunos casos, el tampón de bloqueo incluye un portador tal como ARNt, por ejemplo ARNt de levadura tal como de levadura de aparato (por ejemplo, a una concentración final de 10-20 |jg/ml). En algunos casos, el bloqueo puede realizarse durante 5, 10, 15, 20, 25 o 30 minutos.

Cualquiera de las etapas anteriores puede optimizarse para el rendimiento. Por ejemplo, uno puede variar la temperatura. En algunos casos, los métodos de prehibridación se realizan a temperatura ambiente. En algunos casos, los métodos de prehibridación se realizan a 4 °C (en algunos casos, al variar los plazos proporcionados en la presente descripción).

(iii) Captura simultánea en el primer sustrato y el segundo sustrato

En algunos casos, los métodos para preparar una muestra biológica para la captura de analitos incluyen la permeabilización de la muestra. En algunos casos, la muestra biológica se permeabiliza mediante el uso de un tampón fosfato. En algunos casos, el tampón fosfato es PBS (por ejemplo, p Bs 1x). En algunos casos, el tampón fosfato es PBST (por ejemplo, PBST 1x). En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza múltiples veces (por ejemplo, 3 veces a 5 minutos cada una).

En algunos casos, se añade un tampón de permeabilización (por ejemplo, cualquier tampón de permeabilización descrito en la presente descripción) a la muestra biológica. Las soluciones de permeabilización pueden incluir, a manera de ejemplo solamente, enzimas (por ejemplo, proteinasa K, pepsina y colagenasa), detergentes (por ejemplo, N-laurilsarcósido o una sal de sodio del mismo, dodecil sulfato de sodio (SDS), éter de polietilenglicol terc-octilfenilo, polisorbato 80 y polisorbato 20), inhibidores de ribonucleasa, tampones optimizados para electroforesis, tampones optimizados para permeabilización, tampones optimizados para hibridación o sus combinaciones. El tampón de permeabilización libera el analito de la muestra, lo que permite que se difunda desde la muestra. En algunos casos, la muestra biológica puede tratarse con una proteinasa. En algunos casos, la proteinasa es la proteinasa K.

En algunas modalidades, la permeabilización se produce mediante el uso de una proteasa. En algunas modalidades, la proteasa es una endopeptidasa. Las endopeptidasas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, tripsina, quimotripsina, elastasa, termolisina, pepsina, clostripán, glutamil endopeptidasa (GluC), ArgC, peptidil-asp endopeptidasa (ApsN), endopeptidasa LysC y endopeptidasa LysN. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina. En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza antes de la captura de los analitos en el primer sustrato o el segundo sustrato (o ambos).

En algunos casos, la etapa de permeabilización incluye la aplicación de un tampón de permeabilización a la muestra biológica. En algunos casos, el tampón de permeabilización incluye un tampón (por ejemplo, Tris pH 7,5), MgCl2, detergente sarkosyl (por ejemplo, lauroil sarcosinato de sodio), enzima (por ejemplo, proteinasa K y agua libre de nucleasas. En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza a 37 °C. En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza durante aproximadamente 20 minutos a 2 horas (por ejemplo, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1,5 horas o aproximadamente 2 horas). En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente 40 minutos.

En algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción incluyen una etapa de permeabilización para liberar el analito. En algunas modalidades, la permeabilización se produce mediante el uso de una proteasa. En algunas modalidades, la proteasa es una endopeptidasa. Las endopeptidasas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, tripsina, quimotripsina, elastasa, termolisina, pepsina, clostripán, glutamil endopeptidasa (GluC), ArgC, peptidil-asp endopeptidasa (ApsN), endopeptidasa LysC y endopeptidasa LysN. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina. En algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción incluyen la permeabilización de la muestra biológica de manera que la sonda de captura pueda unirse más fácilmente al analito (por ejemplo, o es decir, en comparación con ninguna permeabilización).

En algunos casos, la etapa de permeabilización incluye la aplicación de un tampón de permeabilización a la muestra biológica. En algunos casos, el tampón de permeabilización incluye un tampón (por ejemplo, Tris pH 7,5), MgCl<2>, detergente sarkosyl (por ejemplo, lauroil sarcosinato de sodio), enzima (por ejemplo, proteinasa K) y agua libre de nucleasas. En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza a 37 °C. En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza durante aproximadamente 20 minutos a 2 horas (por ejemplo, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1,5 horas o aproximadamente 2 horas). En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente 40 minutos.

En algunas modalidades, el analito se libera mediante el uso de una endorribonucleasa. En algunas modalidades, la endorribonucleasa es una ARNasa. La ARNasa puede ser ARNasa H, ARNasa A, ARNasa C o ARNasa I. En algunas modalidades, la ARNasa H es ARNasa H1, ARNasa H2 o ARNasa H1, o ARNasa H2.

En algunos casos, la etapa de liberación se realiza mediante el uso de un tampón de liberación. En algunos casos, el tampón de liberación incluye uno o más de un tampón (por ejemplo, Tris pH 7,5), enzima (por ejemplo, ARNasa H) y agua libre de nucleasas. En algunos casos, la etapa de liberación se realiza a 37 °C. En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente 20 minutos a 2 horas (por ejemplo, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1,5 horas o aproximadamente 2 horas). En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente 30 minutos.

En algunos casos, la etapa de liberación ocurre después de la etapa de permeabilización. En algunos casos, la etapa de liberación se produce al mismo tiempo que la etapa de permeabilización (por ejemplo, en el mismo tampón).

En algunas modalidades, el medio reactivo (por ejemplo, el tampón de permeabilización) comprende uno o más de dodecil sulfato de sodio (SDS), proteinasa K, pepsina, N-laurilsarcosina o una sal de sodio de la misma, ARNasa y una sal de sodio de la misma.

En algunos casos, se usa un hidrogel para mejorar la resolución espacial. En algunas modalidades, una muestra biológica (por ejemplo, sección de tejido) se incluye en un hidrogel. En algunas modalidades, las subunidades de hidrogel se difunden en la muestra biológica, y la polimerización del hidrogel se inicia mediante un estímulo externo o interno. Un “hidrogel” como se describe en la presente descripción puede incluir una red 3D reticulada de cadenas poliméricas hidrófilas. Una “subunidad de hidrogel” puede ser un monómero hidrófilo, un precursor molecular, o un polímero que puede polimerizarse (por ejemplo, reticular) para formar una red de hidrogel tridimensional (3D). La descripción adicional de hidrogeles se encuentra en el documento núm. WO 2020/176788 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.

En algunos casos, los analitos migran a través de la muestra biológica. En algunos casos, los analitos migran de la muestra biológica a la primera y/o segunda sonda. En algunos casos, la migración descrita en la presente descripción es migración pasiva. Como parte de la migración es pasiva, los analitos (por ejemplo, ARNm) pueden migrar en cualquier dirección. En algunos casos, las sondas en el primer sustrato capturan analitos que migran pasivamente. En algunos casos, las sondas en el segundo sustrato capturan analitos que migran pasivamente.

En algunas modalidades, después de un cierto período de tiempo (por ejemplo, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 45 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 15 minutos, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 45 minutos, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 45 minutos, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1.5 horas, de aproximadamente 1.5 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 1.5 horas a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 1.5 horas a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 2,5 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 2,5 horas a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 2,5 horas a aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 10 horas, o de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas), uno o más analitos han migrado pasivamente y se han capturado por la(s) sonda(s) de captura en el primer sustrato. En algunas modalidades, después de un cierto período de tiempo como se enumeró anteriormente, uno o más analitos han migrado pasivamente y se han capturado por la(s) sonda(s) de captura en el segundo sustrato. En algunos casos, al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 90 % de todos los analitos se capturan mediante sondas en el segundo sustrato. Se contempla que, mientras una porción de los analitos, por ejemplo, los que están muy cerca de las primeras sondas de captura del sustrato, migrarán y se capturarán pasivamente en el primer sustrato, mientras que la mayoría de los analitos, los que no están muy cerca del primer sustrato, migrarán pasivamente al segundo sustrato y serán capturados por las sondas de captura con códigos de barras.

En algunas modalidades, existe un espacio (por ejemplo, un espacio) entre el primer sustrato/muestra biológica y el segundo sustrato que se llena con una o más soluciones. En algunas modalidades, la una o más soluciones entre el primer sustrato/muestra biológica y el segundo sustrato pueden incluir un tampón de permeabilización (por ejemplo, cualquiera de los tampones de permeabilización descritos en la presente descripción). En algunas modalidades, la una o más soluciones pueden incluir un tampón que puede mantener el pH en un valor relativamente constante. En algunos casos, el espacio entre la muestra biológica y el segundo sustrato con el segundo conjunto de sondas de captura es de aproximadamente 0,5 |jm, aproximadamente 1,0 |jm, aproximadamente 1,5 jm , aproximadamente 2,0 jm , aproximadamente 2,5 jm , aproximadamente 3,0 jm , aproximadamente 3,5 jm , aproximadamente 4,0 jm , aproximadamente 4,5 jm , aproximadamente 5,0 jm o más. En algunos casos, la distancia entre la muestra biológica y el segundo conjunto de sondas de captura es de aproximadamente 2,5 jm .

En algunas modalidades, el método descrito en la presente descripción comprende además separar el primer sustrato y los segundos sustratos después de la captura de los analitos. En algunas modalidades, el primer sustrato y el segundo sustrato se desalinean.

En algunos casos, en comparación con una configuración de intercalamiento que no incluye sondas en el primer sustrato, se aumenta la resolución espacial de los analitos de una muestra biológica. Por lo tanto, en algunos casos, la resolución de la detección de analitos aumenta en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, o más en comparación con una configuración de intercalamiento que no incluye sondas en el primer sustrato.

En algunos casos, la resolución de detección de un analito puede determinarse midiendo el ancho de la zona del analito capturado. En algunos casos, el aumento de la resolución de detección del analito corresponde a la disminución del ancho de la zona del analito capturada. En algunos casos, el ancho de la zona del analito capturada se disminuye en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 100 % o más en comparación con una configuración de intercalamiento que no incluye sondas en el primer sustrato.

(iv) Análisis de analito en el primer sustrato y el segundo sustrato

En algunas modalidades, como se describe en la presente descripción, los analitos de la muestra biológica se hibridan con la sonda de captura tanto en el primer sustrato como en el segundo sustrato. Como se representa en la imagen inferior izquierda de la Figura 7, una o más analitos de la muestra biológica pueden capturarse mediante sondas de captura 722 del primer sustrato 720, y uno o más analitos de la muestra biológica pueden capturarse mediante segundas sondas de captura 732 del segundo sustrato 730. Después de la captura de los analitos en el primer sustrato o el segundo sustrato, en algunos casos, los métodos proporcionados en la presente descripción incluyen determinar la expresión espacial (por ejemplo, abundancia y ubicación) de los analitos en la muestra biológica mediante el uso de los analitos capturados en el primer sustrato y/o el segundo sustrato. Por ejemplo, los analitos pueden capturarse mediante las primeras sondas de captura o las segundas sondas de captura de una manera que retiene el contexto espacial de los analitos en la muestra biológica. Generalmente, después de la hibridación del analito con la sonda de captura en el primer sustrato y/o el segundo sustrato, la sonda de captura se extiende en el extremo 3' y se sintetiza una copia de los componentes adicionales de la sonda de captura (por ejemplo, el código de barras espacial) de la sonda de captura. En algunas modalidades, los reactivos de transcripción inversa (RT) pueden añadirse a las muestras biológicas permeabilizadas. La incubación con los reactivos de RT puede producir ADNc de longitud completa con código de barras espacial a partir de los analitos capturados (por ejemplo, ARNm poliadenilado). Los reactivos de la segunda hebra (por ejemplo, cebadores de la segunda hebra, enzimas) pueden añadirse adicionalmente para iniciar la síntesis de la segunda hebra.

En algunas modalidades, uno o más analitos migran a través de una solución y se unen específicamente (por ejemplo, se hibridan) a los dominios de captura en las sondas de captura del primer sustrato y/o el segundo sustrato. En algunas modalidades, uno o más ARNm migran a través de una solución que incluye un tampón de permeabilización y se unen (por ejemplo, se hibridan) a los dominios de captura en las sondas de captura en el primer sustrato y/o el segundo sustrato. En algunas modalidades, se determina la secuencia de la totalidad o una porción de las sondas de captura (por ejemplo, el código de barras espacial o una porción de este) o un complemento de este, en el primer sustrato y/o el segundo sustrato y la totalidad o una porción de la secuencia del analito capturado correspondiente (o un complemento de este). En algunas modalidades, la ubicación del uno o más analitos en la muestra biológica se determina en base a la totalidad o una porción de la secuencia de las sondas de captura (por ejemplo, el código de barras espacial o una porción de este) en la matriz, o un complemento de este, y la totalidad o una porción de la secuencia del uno o más analitos capturados correspondientes, o un complemento de este. En algunas modalidades, determinar la ubicación del uno o más analitos en la muestra biológica incluye determinar la totalidad o una porción de la secuencia de las sondas de captura (por ejemplo, el código de barras espacial, o una porción de este) en la matriz, o un complemento de este, y la totalidad o una porción de la secuencia del uno o más analitos capturados correspondientes, o un complemento de este, y correlacionar dicha información de secuencia con una imagen de la muestra biológica. Algunas modalidades de estos métodos incluyen además obtener una imagen de la muestra biológica.

En algunas modalidades, después de que un analito de la muestra se haya hibridado o asociado de cualquier otra manera con una sonda de captura en el primer sustrato y/o el segundo sustrato de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente en relación con la metodología analítica basada en células espaciales general, se analizan los constructos codificados por barras que resultan de la hibridación/asociación.

En algunas modalidades, después de poner en contacto una muestra biológica con el primer sustrato y/o el segundo sustrato que incluye sondas de captura, puede realizarse opcionalmente una etapa de eliminación para eliminar la totalidad o una porción de la muestra biológica del sustrato. En algunas modalidades, la etapa de eliminación incluye la degradación enzimática y/o química de las células de la muestra biológica. Por ejemplo, la etapa de eliminación puede incluir tratar la muestra biológica con una enzima (por ejemplo, una proteinasa, por ejemplo, proteinasa K) para eliminar al menos una porción de la muestra biológica del sustrato. En algunas modalidades, la etapa de eliminación puede incluir la ablación del tejido (por ejemplo, ablación láser).

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporcionan métodos para detectar espacialmente un analito (por ejemplo, detectar la ubicación de un analito, por ejemplo, un analito biológico) a partir de una muestra biológica (por ejemplo, presente en una muestra biológica), el método comprende: (a) opcionalmente teñir y/u obtener imágenes de una muestra biológica sobre un sustrato; (b) permeabilizar (por ejemplo, proporcionar una solución que comprende un reactivo de permeabilización a) la muestra biológica sobre el sustrato; (c) poner en contacto la muestra biológica con el primer sustrato y/o el segundo sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad captura el analito biológico; y (d) analizar el analito biológico capturado, detectar espacialmente de esta manera el analito biológico; en donde la muestra biológica se elimina total o parcialmente del sustrato.

En algunas modalidades, una muestra biológica no se elimina del sustrato. Por ejemplo, la muestra biológica no se elimina del sustrato antes de liberar una sonda de captura (por ejemplo, una sonda de captura unida a un analito) del sustrato. En algunas modalidades, tal liberación comprende la escisión de la sonda de captura del sustrato (por ejemplo, mediante un dominio de escisión). En algunas modalidades, tal liberación no comprende liberar la sonda de captura del sustrato (por ejemplo, puede realizarse una copia de la sonda de captura unida a un analito y la copia puede liberarse del sustrato, por ejemplo, mediante desnaturalización). En algunas modalidades, la muestra biológica no se elimina del sustrato antes del análisis de un analito unido a una sonda de captura después de que se libera del sustrato. En algunas modalidades, la muestra biológica permanece en el sustrato durante la eliminación de una sonda de captura del sustrato y/o el análisis de un analito unido a la sonda de captura después de que se libera del sustrato. En algunas modalidades, la muestra biológica permanece en el sustrato durante la eliminación (por ejemplo, mediante desnaturalización) de una copia de la sonda de captura (por ejemplo, complemento). En algunas modalidades, el análisis de un analito unido a la sonda de captura del sustrato puede realizarse sin someter la muestra biológica a degradación enzimática y/o química de las células (por ejemplo, células permeabilizadas) o ablación del tejido (por ejemplo, ablación láser).

En algunas modalidades, al menos una porción de la muestra biológica no se elimina del sustrato. Por ejemplo, una porción de la muestra biológica puede permanecer en el sustrato antes de liberar una sonda de captura (por ejemplo, una captura se demuestra unida a un analito) del sustrato y/o analizar un analito unido a una sonda de captura liberada del sustrato. En algunas modalidades, al menos una porción de la muestra biológica no se somete a degradación enzimática y/o química de las células (por ejemplo, células permeabilizadas) o ablación del tejido (por ejemplo, ablación láser) antes del análisis de un analito unido a una sonda de captura del sustrato.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporcionan métodos para detectar espacialmente un analito (por ejemplo, detectar la ubicación de un analito, por ejemplo, un analito biológico) de una muestra biológica (por ejemplo, presente en una muestra biológica) que incluyen: (a) opcionalmente teñir y/u obtener imágenes de una muestra biológica sobre un sustrato; (b) permeabilizar (por ejemplo, proporcionar una solución que comprende un reactivo de permeabilización a) la muestra biológica sobre el sustrato; (c) poner en contacto la muestra biológica con un primer sustrato y/o un segundo sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, en donde una sonda de captura de la pluralidad captura el analito biológico; y (d) analizar el analito biológico capturado, detectar espacialmente de esta manera el analito biológico; donde la muestra biológica no se retira del sustrato.

En algunas modalidades, se proporcionan en la presente descripción métodos para detectar espacialmente un analito biológico de interés a partir de una muestra biológica que incluyen: (a) teñir y obtener imágenes de una muestra biológica sobre un sustrato; (b) proporcionar una solución que comprende un reactivo de permeabilización a la muestra biológica sobre el sustrato; (c) poner en contacto la muestra biológica con una matriz sobre un sustrato, en donde la matriz comprende una o más pluralidades de sondas de captura, lo que permite de esta manera que una o más pluralidades de sondas de captura capturen el analito biológico de interés; y (d) analizar el analito biológico capturado, detectar espacialmente de esta manera el analito biológico de interés; donde la muestra biológica no se elimina del sustrato.

En algunas modalidades, el método incluye además someter al menos una porción de la muestra biológica a análisis ómicos espaciales (por ejemplo, análisis transcriptómico espacial). En algunas modalidades, el método incluye además someter una región de interés en la muestra biológica a un análisis ómico espacial (por ejemplo, análisis transcriptómico espacial). En algunas modalidades, una o más de las sondas de captura incluyen un dominio de captura. En algunas modalidades, una o más de las sondas de captura comprenden un identificador molecular único (UMI). En algunas modalidades, una o más de las sondas de captura comprenden un dominio de escisión. En algunas modalidades, el dominio de escisión comprende una secuencia reconocida y escindida por una uracilo-ADN glucosilasa, apurínica/apirimidínica (AP) endonucleasa (APE1), reactivo de escisión específico de uracilo U (USER) y/o una endonucleasa VIII. En algunas modalidades, una o más sondas de captura no comprenden un dominio de escisión y no se escinden de la matriz.

En algunas modalidades, una sonda de captura puede extenderse (una “sonda de captura extendida,” por ejemplo, como se describe en la presente descripción). Por ejemplo, la extensión de una sonda de captura puede incluir generar ADNc a partir de un ARN capturado (hibridado). Este proceso involucra la síntesis de una hebra complementaria del ácido nucleico hibridado, por ejemplo, que genera ADNc en base a la plantilla de ARN capturada (el ARN que se hibrida con el dominio de captura de la sonda de captura). Por lo tanto, en una etapa inicial de extensión de la sonda de captura, por ejemplo, la generación de ADNc, el ácido nucleico capturado (hibridado), por ejemplo, ARN, actúa como una plantilla para la etapa de extensión, por ejemplo, transcripción inversa.

En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de transcripción inversa. Por ejemplo, la transcripción inversa incluye sintetizar ADNc (ADN complementario o copia) a partir de ARN, por ejemplo, (ARN mensajero), mediante el uso de una transcriptasa inversa. En algunas modalidades, la transcripción inversa se realiza mientras el tejido aún está en su lugar, lo que genera una biblioteca de analitos, donde la biblioteca de analitos incluye los códigos de barras espaciales de las sondas de captura adyacentes. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de una o más ADN polimerasas.

En algunas modalidades, un dominio de captura de una sonda de captura incluye un cebador para producir la hebra complementaria de un ácido nucleico hibridado con la sonda de captura, por ejemplo, un cebador para la ADN polimerasa y/o la transcripción inversa. Las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ADN y/o ADNc, generadas por la reacción de extensión incorporan la secuencia de la sonda de captura. La extensión de la sonda de captura, por ejemplo, una reacción de ADN polimerasa y/o transcripción inversa, puede realizarse mediante el uso de una variedad de enzimas y protocolos adecuados.

En algunas modalidades, se genera una molécula de ADN de longitud completa (por ejemplo, ADNc). En algunas modalidades, una molécula de ADN de “longitud completa” se refiere a la totalidad de la molécula de ácido nucleico capturada. Sin embargo, si un ácido nucleico (por ejemplo, ARN) se degrada parcialmente en la muestra de tejido, entonces las moléculas de ácido nucleico capturadas no tendrán la misma longitud que el ARN inicial en la muestra de tejido. En algunas modalidades, se modifica el extremo 3' de las sondas extendidas, por ejemplo, las moléculas de ADNc de la primera hebra. Por ejemplo, un enlazador o adaptador puede ligarse al extremo 3' de las sondas extendidas. Esto puede lograrse mediante el uso de enzimas de ligación de una sola hebra tales como ligasa de ARN de T4 o Circligase™ (disponible de Lucigen, Middleton, WI). En algunas modalidades, los oligonucleótidos de conmutación de plantilla se usan para extender el ADNc con el fin de generar un ADNc de longitud completa (o lo más cerca posible de un ADNc de longitud completa). En algunas modalidades, una sonda auxiliar de síntesis de la segunda hebra (una molécula de ADN de doble hebra parcialmente capaz de hibridarse con el extremo 3' de la sonda de captura extendida), puede ligarse al extremo 3' de la sonda extendida, por ejemplo, molécula de ADNc de la primera hebra, mediante el uso de una enzima de ligación de doble hebra tal como ligasa de ADN de T4. Otras enzimas apropiadas para la etapa de ligación se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, Tth ADN ligasa, Taq ADN ligasa, ADN ligasa deThermococcussp. (cepa 9oN) (ADN ligasa 9oNTM New England Biolabs), Ampligase™ (disponible de Lucigen, Middleton, WI), y SplintR (disponible de New England Biolabs, Ipswich, MA). En algunas modalidades, una cola de polinucleótido, por ejemplo, una cola poli(A), se incorpora en el extremo 3' de las moléculas de sonda extendida. En algunas modalidades, la cola de polinucleótido se incorpora mediante el uso de una enzima activa terminal transferasa.

En algunas modalidades se tratan las sondas de captura extendidas de doble hebra para eliminar cualquier sonda de captura no extendida antes de la amplificación y/o el análisis, por ejemplo, el análisis de secuencias. Esto puede lograrse mediante una variedad de métodos, por ejemplo, mediante el uso de una enzima para degradar las sondas no extendidas, tales como, una enzima exonucleasa o columnas de purificación.

En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas se amplifican para producir cantidades que son suficientes para el análisis, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. En algunas modalidades, la primera hebra de las sondas de captura extendidas, (por ejemplo moléculas de ADN y/o ADNc) actúa como una plantilla para la reacción de amplificación (por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa).

En algunas modalidades, la reacción de amplificación incorpora un grupo de afinidad sobre la sonda de captura extendida (por ejemplo, el híbrido ARN-ADNc) mediante el uso de un cebador que incluye el grupo de afinidad. En algunas modalidades, el cebador incluye un grupo de afinidad y las sondas de captura extendida incluyen el grupo de afinidad. El grupo de afinidad puede corresponder a cualquiera de los grupos de afinidad descritos anteriormente.

En algunas modalidades, las sondas de captura extendida que incluyen el grupo de afinidad pueden acoplarse a un sustrato específico para el grupo de afinidad. En algunas modalidades, el sustrato puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas modalidades, el sustrato incluye avidina o estreptavidina y el grupo de afinidad incluye biotina. En algunas modalidades, el sustrato incluye maltosa y el grupo de afinidad incluye proteína de unión a maltosa. En algunas modalidades, el sustrato incluye proteína de unión a maltosa y el grupo de afinidad incluye maltosa. En algunas modalidades, la amplificación de las sondas de captura extendida puede funcionar para liberar las sondas extendidas de la superficie del sustrato, en la medida en que las copias de las sondas extendidas no se inmovilizan en el sustrato.

En algunas modalidades, se libera la sonda de captura extendida o complemento o amplicón de la misma. La etapa de liberación de la sonda de captura extendida o complemento o amplicón de la misma de la superficie del sustrato puede lograrse de varias maneras. En algunas modalidades, una sonda de captura extendida o un complemento de la misma se libera de la matriz mediante escisión de ácido nucleico y/o por desnaturalización (por ejemplo, mediante calentamiento para desnaturalizar una molécula de doble hebra).

En algunas modalidades, la sonda de captura extendida o complemento o amplicón de la misma se libera de la superficie del sustrato (por ejemplo, matriz) por medios físicos. Por ejemplo, cuando la sonda de captura extendida se inmoviliza indirectamente en el sustrato de la matriz, por ejemplo, mediante hibridación con una sonda de superficie, puede ser suficiente para interrumpir la interacción entre la sonda de captura extendida y la sonda de superficie. Los métodos para interrumpir la interacción entre moléculas de ácido nucleico incluyen desnaturalizar moléculas de ácido nucleico de doble hebra que se conocen en la técnica. Un método directo para liberar las moléculas de ADN (por ejemplo, o es decir, de desprender la matriz de sondas extendidas) es usar una solución que interfiera con los enlaces de hidrógeno de las moléculas de doble hebra. En algunas modalidades, la sonda de captura extendida se libera mediante una solución calentada aplicada, tal como agua o tampón, de al menos 85 °C, por ejemplo, al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 °C. En algunas modalidades, se añade una solución que incluye sales, surfactantes, etc. que puede desestabilizar aún más la interacción entre las moléculas de ácido nucleico para liberar la sonda de captura extendida del sustrato.

En algunas modalidades, donde la sonda de captura extendida incluye un dominio de escisión, la sonda de captura extendida se libera de la superficie del sustrato por escisión. Por ejemplo, el dominio de escisión de la sonda de captura extendida puede escindirse mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, la sonda de captura extendida se libera de la superficie del sustrato, por ejemplo, mediante la escisión de un dominio de escisión en la sonda de captura extendida, antes de la etapa de amplificar la sonda de captura extendida.

En algunas modalidades, las sondas complementarias a la sonda de captura extendida pueden ponerse en contacto con el sustrato. En algunas modalidades, la muestra biológica puede estar en contacto con el sustrato cuando las sondas se ponen en contacto con el sustrato. En algunas modalidades, la muestra biológica puede eliminarse del sustrato antes de poner en contacto el sustrato con sondas. En algunas modalidades, las sondas pueden marcarse con una etiqueta detectable (por ejemplo, cualquiera de las etiquetas detectables descritas en la presente descripción). En algunas modalidades, las sondas que no se unen especialmente (por ejemplo, se hibridan) a una sonda de captura extendida pueden lavarse. En algunas modalidades, las sondas complementarias a la sonda de captura extendida pueden detectarse en el sustrato (por ejemplo, obtención de imágenes, cualquiera de los métodos de detección descritos en la presente descripción).

En algunas modalidades, las sondas complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las sondas (por ejemplo, sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden ser de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las sondas (por ejemplo, sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden ser de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las sondas (por ejemplo, sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden ser de aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las sondas (por ejemplo, sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden ser de aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las sondas (por ejemplo, sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden ser de aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, y aproximadamente 99 nucleótidos de longitud.

En algunas modalidades, aproximadamente 1 a aproximadamente 100 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 10 a aproximadamente 100 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 sondas (por ejemplo, sondas detectables) pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida. En algunas modalidades, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, y aproximadamente 99 sondas pueden ponerse en contacto con el sustrato y unirse específicamente (por ejemplo, hibridar) a una sonda de captura extendida.

En algunas modalidades, las sondas pueden ser complementarias a un único analito (por ejemplo, un único gen). En algunas modalidades, las sondas pueden ser complementarias a uno o más analitos (por ejemplo, analitos en una familia de genes). En algunas modalidades, las sondas (por ejemplo, sondas detectables) pueden ser para un panel de genes asociados con una enfermedad (por ejemplo, cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson).

En algunos casos, el analito y la sonda de captura pueden amplificarse o copiarse, para crear una pluralidad de moléculas de ADNc. En algunas modalidades, el ADNc puede desnaturalizarse de la plantilla de la sonda de captura y transferirse (por ejemplo, a un tubo limpio) para la amplificación, y/o construcción de biblioteca. El ADNc con código de barras espacial puede amplificarse mediante PCR antes de la construcción de la biblioteca. El ADNc puede entonces fragmentarse enzimáticamente y seleccionarse por tamaño para optimizar el tamaño del amplicón del ADNc. Las secuencias P5 y P7 dirigidas a capturar los amplicones en una celda de flujo de secuenciación (instrumentos de secuenciación Illumina) pueden añadirse a los amplicones, i7 e i5 pueden usarse como índices de muestra, y TruSeq Lectura 2 puede añadirse a través de reparación final, adición de cola de poliA, ligación adaptadora y PCR. Los fragmentos de ADNc pueden secuenciarse después mediante el uso de secuenciación de extremos apareados mediante el uso de TruSeq Lectura 1 y TruSeq Lectura 2 como sitios cebadores de la secuenciación. Las secuencias adicionales se dirigen a instrumentos de secuenciación Illumina o instrumentos de secuenciación que utilizan esas secuencias; sin embargo, un experto en la técnica comprenderá que las secuencias adicionales o alternativas usadas por otros instrumentos o tecnologías de secuenciación también son igualmente aplicables para su uso en los métodos mencionados anteriormente.

En algunas modalidades, donde una muestra se codifica directamente mediante hibridación con sondas de captura o agentes de captura de analitos hibridados, unidos o asociados con ya sea la superficie celular, o introducidos en la célula, como se describió anteriormente, la secuenciación puede realizarse en la muestra intacta.

Puede usarse una amplia variedad de métodos de secuenciación diferentes para analizar un analito codificado por barras o derivado de este. En general, los polinucleótidos secuenciados pueden ser, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), que incluyen variantes o derivados de estos (por ejemplo, ADN de una sola hebra o híbridos ADN/ARN, y moléculas de ácido nucleico con un análogo de nucleótido).

La secuenciación de polinucleótidos puede realizarse mediante varios sistemas. Más generalmente, la secuenciación puede realizarse mediante el uso de amplificación de ácido nucleico, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (por ejemplo, PCR digital y PCR digital de gotas (ddPCR), PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR múltiple, métodos de plexo único basados en PCR, PCR de emulsión) y/o amplificación isotérmica. Los ejemplos no limitantes de métodos para la secuenciación de material genético incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación de ADN (por ejemplo, transferencia Southern), métodos de digestión de enzimas de restricción, métodos de secuenciación Sanger, métodos de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, secuenciación en tiempo real de molécula única, secuenciación de nanoporos y secuenciación de Polony), métodos de ligación y métodos de micromatriz.

(v) Análisis de analito en el primer sustrato y el segundo sustrato mediante el uso de ligación con plantilla

En algunos casos, en lugar de capturar los analitos, se captura un derivado de un analito. En algunos casos, el derivado del analito es un producto de ligación que comprende dos o más secuencias de ácido nucleico que se hibridan con secuencias adyacentes del analito. Una vez realizada la ligación con plantilla, la muestra biológica puede permeabilizarse y ambos sustratos pueden capturar el producto de ligación (similar a la captura de un analito). La captura del producto de ligación es similar a la captura del analito porque el producto de ligación comprende una cola de poli(A) similar a un analito de ARNm. Ahora se proporcionan características adicionales de la ligación con plantilla.

La ligación con plantilla o la ligación con plantilla de ARN (RTL) es un proceso que incluye múltiples oligonucleótidos (también llamados “probetas de oligonucleótidos” o simplemente “probetas”, y un par de probetas puede denominarse indistintamente “primeras probetas” y “segundas probas”, o “oligonucleótidos de la primera sonda” y “oligonucleótidos de la segunda sonda”,) que se hibridan con secuencias de analitos complementarios adyacentes (por ejemplo, ARNm). Tras la hibridación, los dos oligonucleótidos se ligan entre sí, creando un producto de ligación en el caso de que ambos oligonucleótidos se hibriden con sus respectivas secuencias complementarias. En algunos casos, al menos uno de los oligonucleótidos incluye una secuencia (por ejemplo, una secuencia de poliadenilación) que puede hibridarse con una sonda en una matriz descrita en la presente descripción (por ejemplo, la sonda comprende una secuencia de poli-timina en algunos casos). En algunos casos, antes de la hibridación de la politimina a la secuencia de poli(A), una endonucleasa digiere el analito que se hi bridó al producto de ligación. Esta etapa libera el producto de ligación recién formado para hibridarse con una sonda de captura en una matriz espacial. De esta manera, la ligación con plantilla proporciona un método para realizar la captura de ARN dirigida en una matriz espacial.

La captura de ARN dirigida permite el examen de un subconjunto de analitos de ARN de todo el transcritoma. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye un ARN objetivo individual. En algunos casos, la presencia del producto de ligación que se crea como resultado de los métodos de ligación con plantilla descritos en la presente descripción indica que el ARN objetivo individual está presente. En algunos casos, la ausencia del producto de ligación que se crea como resultado de los métodos de ligación con plantilla descritos en la presente descripción indica que el ARN objetivo individual no está presente. En algunos casos, la ausencia del producto de ligación se debe a que una de las sondas de oligonucleótidos no se hibridó con el analito. En algunos casos, la ausencia del producto de ligación se debe a que ambas (por ejemplo, dos) de las sondas de oligonucleótidos no se hibridaron con el analito.

En algunas modalidades, el subconjunto de analitos detectados mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción incluye dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) ARN dirigidos. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye uno o más ARNm transcritos por un solo gen. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye uno o más ARNm transcritos por más de un gen objetivo. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye una o más variantes de corte y empalme de ARNm de uno o más genes dirigidos. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye ARN no poliadenilados en una muestra biológica. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye la detección de ARNm que tienen uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en una muestra biológica.

En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye ARNm que median la expresión de un conjunto de genes de interés. Por ejemplo, en algunos casos, el subconjunto de analitos detectados mediante el uso de los métodos de ligación con plantilla descritos en la presente descripción incluye analitos que se traducen en factores de transcripción que controlan una o más vías celulares. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye ARNm que comparten secuencias idénticas o sustancialmente similares, cuyos ARNm se traducen en polipéptidos que tienen grupos funcionales o dominios proteicos similares. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye ARNm que no comparten secuencias idénticas o sustancialmente similares, cuyos ARNm se traducen en proteínas que no comparten grupos funcionales o dominios de proteínas similares. En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye ARNm que se traducen en proteínas que funcionan en vías biológicas iguales o similares. En algunas modalidades, las vías biológicas se asocian con una enfermedad patológica. Por ejemplo, la captura de ARN dirigida puede detectar genes que se sobreexpresan o se expresan menos en una muestra de cáncer.

En algunas modalidades, el subconjunto de analitos incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 225, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450, aproximadamente 475, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1000, o más analitos.

En algunas modalidades, el subconjunto de analitos detectados mediante métodos de captura de ARN dirigidos proporcionados en la presente descripción incluye una gran proporción del transcritoma de una o más células. Por ejemplo, el subconjunto de analitos detectados mediante métodos de captura de ARN dirigido proporcionados en la presente descripción puede incluir al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o más de los ARNm presentes en el transcritoma de una o más células.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse en cualquier tipo de muestra. En algunas modalidades, la muestra es un tejido fresco. En algunas modalidades, la muestra es una muestra congelada. En algunas modalidades, la muestra se congeló previamente. En algunas modalidades, la muestra es una muestra embebida en parafina fijada con formalina (FFPE). Las muestras de FFPE generalmente se reticulan y fragmentan en gran medida, y por lo tanto este tipo de muestra permite una recuperación limitada del ARN mediante el uso de técnicas de detección convencionales. En ciertas modalidades, los métodos de captura de ARN dirigido proporcionados en la presente descripción se ven menos afectados por la degradación del ARN asociada con la fijación de FFPE que otros métodos (por ejemplo, métodos que aprovechan la captura oligo-dT y la transcripción inversa del ARNm). En ciertas modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción permiten la medición sensible de genes específicos de interés que de cualquier otra manera podrían omitirse con un enfoque transcriptómico completo.

En algunas modalidades, una muestra biológica (por ejemplo, una sección de tejido) se puede fijar con metanol, teñir con hematoxilina y eosina, y se puede tomar imágenes de ella. En algunas modalidades, la fijación, tinción y obtención de imágenes se producen antes de que una o más sondas de oligonucleótidos se hibriden con la muestra. Algunas modalidades de cualquiera de los flujos de trabajo descritos en la presente descripción pueden incluir además una etapa de decoloración (por ejemplo, una etapa de decoloración con hematoxilina y eosina), después de la obtención de imágenes de la muestra y antes de permeabilizar la muestra. Por ejemplo, la decoloración puede realizarse al realizar una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco) etapas de lavado (por ejemplo, una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco) etapas de lavado realizadas mediante el uso de un tampón que incluye HCl). Las imágenes pueden usarse para mapear patrones de expresión génica espacial de regreso a la muestra biológica. Una enzima de permeabilización puede usarse para permeabilizar la muestra biológica directamente en el portaobjetos.

En algunas modalidades, los métodos de captura de ARN dirigido como se describe en la presente descripción incluyen la hibridación de oligonucleótidos de sonda múltiples. En algunas modalidades, los métodos incluyen 2, 3, 4 o más oligonucleótidos de sonda que se hibridan con uno o más analitos de interés. En algunas modalidades, los métodos incluyen dos oligonucleótidos de sonda. En algunas modalidades, el oligonucleótido de sonda incluye secuencias complementarias que son complementarias o sustancialmente complementarias a un analito. Por ejemplo, en algunas modalidades, el oligonucleótido de sonda incluye una secuencia que es complementaria o sustancialmente complementaria a un analito (por ejemplo, un ARNm de interés (por ejemplo, a una porción de la secuencia de un ARNm de interés)). Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden aplicarse a una única molécula de ácido nucleico o a una pluralidad de moléculas de ácido nucleico. Un método para analizar una muestra que comprende una molécula de ácido nucleico puede comprender proporcionar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARN), donde cada molécula de ácido nucleico comprende una primera región objetivo (por ejemplo, una secuencia que está 3' de una secuencia objetivo o una secuencia que está 5' de una secuencia objetivo) y una segunda región objetivo (por ejemplo, una secuencia que está 5' de una secuencia objetivo o una secuencia que está 3' de una secuencia objetivo), una pluralidad de primeros oligonucleótidos de sonda, y una pluralidad de segundos oligonucleótidos de sonda.

En algunas modalidades, los métodos de ligación con plantilla que permiten el captura de ARN dirigido como se proporciona en la presente descripción incluyen un primer oligonucleótido de sonda y un segundo oligonucleótido de sonda. El primer y el segundo oligonucleótidos de sonda incluyen cada uno secuencias que son sustancialmente complementarias a la secuencia de un analito de interés. Por sustancialmente complementario, se entiende que el primer y/o segundo oligonucleótido de sonda es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % complementario a una secuencia en un analito. En algunos casos, el primer oligonucleótido de sonda y el segundo oligonucleótido de sonda se hibridan con secuencias adyacentes en un analito.

En algunas modalidades, la primera y/o segunda sonda como se describe en la presente descripción incluye una de al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3'; una secuencia funcional; un nucleótido fosforilado en el extremo 5'; y/o un dominio de unión a sonda de captura. En algunas modalidades, la secuencia funcional es una secuencia cebadora. El dominio de unión a la sonda de captura es una secuencia que es complementaria a un dominio de captura particular presente en una sonda de captura. En algunas modalidades, el dominio de unión a la sonda de captura incluye una secuencia poli(A). En algunas modalidades, el dominio de unión de la sonda de captura incluye una secuencia de poliuridina, una secuencia de politimidina o ambas. En algunas modalidades, el dominio de unión de la sonda de captura incluye una secuencia aleatoria (por ejemplo, un hexámero u octámero aleatorio). En algunas modalidades, el dominio de unión a la sonda de captura es complementario a un dominio de captura en una sonda de captura que detecta un(os) objetivo(s) particular(es) de interés.

En algunas modalidades, se proporciona un resto de bloqueo del dominio de unión a la sonda de captura que interactúa con el dominio de unión a la sonda de captura. En algunos casos, el resto de bloqueo del dominio de unión de la sonda de captura incluye una secuencia de ácido nucleico. En algunos casos, el resto de bloqueo del dominio de unión de la sonda de captura es un oligonucleótido de ADN. En algunos casos, el resto de bloqueo del dominio de unión de la sonda de captura es un oligonucleótido de ARN. En algunas modalidades, un resto de bloqueo del dominio de unión a la sonda de captura incluye una secuencia que es complementaria o sustancialmente complementaria a un dominio de unión a la sonda de captura. En algunas modalidades, un resto de bloqueo del dominio de unión a la sonda de captura evita que el dominio de unión a la sonda de captura se una a la sonda de captura cuando está presente. En algunas modalidades, una porción de bloqueo del dominio de unión de la sonda de captura se elimina previo a la unión del dominio de unión de la sonda de captura (por ejemplo, presente en una sonda ligada) a una sonda de captura. En algunas modalidades, una porción de bloqueo del dominio de unión de la sonda de captura comprende una secuencia de poliuridina, una secuencia de politimidina o ambas.

En algunas modalidades, la primera sonda oligonucleotídica se hibrida con un analito. En algunas modalidades, la segunda sonda oligonucleotídica se hibrida con un analito. En algunas modalidades, tanto la primera sonda oligonucleotídica como la segunda sonda oligonucleotídica se hibridan con un analito. La hibridación puede ocurrir en un objetivo que tiene una secuencia que es 100 % complementaria a la(s) sonda(s) oligonucleotídica(s). En algunas modalidades, la hibridación puede ocurrir en un objetivo que tiene una secuencia que es al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 80 %, al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 85 %, al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 90 %, al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 95 %, al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 96 %, al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 97 %, al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 98 % o al menos (por ejemplo, al menos aproximadamente) 99 % complementaria a la(s) sonda(s) oligonucleotídica(s).

Después de la hibridación del primer y segundo oligonucleótidos de sonda, en algunas modalidades, el primer oligonucleótido de sonda se extiende. Después de la hibridación, en algunas modalidades, se extiende el segundo oligonucleótido sonda. Las sondas de extensión pueden lograrse mediante el uso de cualquier método descrito en la presente descripción. En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, una polimerasa de ADN) extiende el primer y/o segundo oligonucleótido.

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción incluyen una etapa de lavado. En algunos casos, la etapa de lavado ocurre después de hibridar el primer y el segundo oligonucleótidos de sonda. La etapa de lavado elimina cualquier oligonucleótido no unido y puede realizarse mediante el uso de cualquier técnica o solución descrita en la presente descripción o conocida en la técnica. En algunas modalidades, se realizan múltiples etapas de lavado para eliminar oligonucleótidos no unidos.

En algunas modalidades, después de la hibridación de la sonda oligonucleotídica (por ejemplo, la primera y la segunda sonda oligonucleotídica) con el analito, las sondas oligonucleotídicas (por ejemplo, la primera sonda oligonucleotídica y la segunda sonda oligonucleotídica) se ligan juntas, lo que crea una única sonda ligada que es complementaria al analito. La ligación puede realizarse enzimática o químicamente, como se describe en la presente descripción.

(c) Muestras biológicas y analitos

Los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse en cualquier tipo de muestra. En algunas modalidades, la muestra es una muestra de tejido sólido. En algunas modalidades, la muestra es un tejido fresco. En algunas modalidades, la muestra es una muestra congelada. En algunas modalidades, la muestra se congeló previamente, por ejemplo, es una muestra recién congelada. En algunas modalidades, la muestra es una muestra embebida en parafina fijada con formalina (FFPE). Como se usa en la presente, los términos “muestra” y “muestra biológica” son intercambiables.

Una “muestra biológica” puede obtenerse del sujeto para su análisis mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, biopsia, cirugía y microscopía de captura con láser (LCM), y generalmente incluye células y/u otro material biológico del sujeto. Además de los sujetos descritos anteriormente, puede obtenerse una muestra biológica de organismos no mamíferos (por ejemplo, una planta, un insecto, un arácnido, un nematodo (por ejemplo,Caenorhabditis elegans),un hongo, un anfibio o un pescado (por ejemplo, pez cebra)). Una muestra biológica puede obtenerse a partir de un procariota tal como una bacteria, por ejemplo,Escherichia coli, StaphylococcioMycoplasma pneumoniae;una archaea; un virus tal como el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana; o un viroide. Puede obtenerse una muestra biológica de un eucariota, tal como un organoide derivado del paciente (PDO) o un xenoinjerto derivado del paciente (PDX). La muestra biológica puede incluir organoides, una versión miniaturizada y simplificada de un órgano producido in vitro en tres dimensiones que muestran una microanatomía realista. Los organoides pueden generarse a partir de una o más células de un tejido, células madre embrionarias y/o células madre pluripotentes inducidas, que pueden autoorganizarse en cultivo tridimensional debido a sus capacidades de autorrenovación y diferenciación. En algunas modalidades, un organoide es un organoide cerebral, un organoide intestinal, un organoide estomacal, un organoide lingual, un organoide tiroideo, un organoide tímico, un organoide testicular, un organoide hepático, un organoide pancreático, un organoide epitelial, un organoide pulmonar, un organoide renal, un gastruloide, un organoide cardiaco o un organoide retiniano. Los sujetos a partir de los cuales se pueden obtener muestras biológicas pueden ser individuos sanos o asintomáticos, individuos que tienen o se sospecha que tienen una enfermedad (por ejemplo, cáncer) o una predisposición a una enfermedad, y/o individuos que necesitan terapia o se sospecha que necesitan terapia.

Las muestras biológicas pueden derivarse de un cultivo o población homogénea de los sujetos u organismos mencionados en la presente descripción o alternativamente de una recopilación de varios organismos diferentes, por ejemplo, en una comunidad o ecosistema.

Las muestras biológicas también pueden incluir células fetales. Por ejemplo, puede realizarse un procedimiento tal como la amniocentesis para obtener una muestra de células fetales de la circulación materna. La secuenciación de células fetales puede usarse para identificar cualquiera de una serie de trastornos genéticos, que incluyen, por ejemplo, aneuploidía tal como síndrome de Down, síndrome de Edwards y síndrome de Patau. Además, los elementos de superficie celular de las células fetales pueden usarse para identificar cualquiera de una serie de trastornos o enfermedades.

Las muestras biológicas también pueden incluir células inmunitarias. El análisis de secuencias del repertorio inmunitario de tales células, que incluye elementos genómicos, proteómicos y de superficie celular, puede proporcionar una gran cantidad de información para facilitar la comprensión del estado y función del sistema inmunitario. A manera de ejemplo, determinar el estado (por ejemplo, negativo o positivo) de la enfermedad de residuos mínimos (EMR) en un paciente con mieloma múltiple (MM) después de un trasplante autólogo de células madre se considera un factor predictivo de EMR en el paciente con MM (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2018/0156784).

Los ejemplos de células inmunitarias en una muestra biológica incluyen, pero no se limitan a, linfocitos B, linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T asesinos naturales, linfocitos T reguladores y linfocitos T colaboradores), células asesinas naturales, células asesinas inducidas por citocinas (CIK), células mieloides, tales como granulocitos (granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos neutrófilos/neutrófilos hipersegmentados), monocitos/macrófagos, mastocitos, trombocitos/megacariocitos y células dendríticas.

La muestra biológica puede incluir cualquier número de macromoléculas, por ejemplo, macromoléculas celulares y organelos (por ejemplo, mitocondrias y núcleos). La muestra biológica puede ser una muestra de ácido nucleico y/o una muestra de proteína. La muestra biológica puede ser una muestra de carbohidratos o una muestra de lípidos. La muestra biológica puede obtenerse como una muestra de tejido, tal como una sección de tejido, biopsia, una biopsia con aguja gruesa, aspirado con aguja, o aspirado con aguja fina. La muestra puede ser una muestra de fluido, tal como una muestra de sangre, una muestra de orina, o una muestra de saliva. La muestra puede ser una muestra de piel, una muestra de colon, un raspado bucal, una muestra de histología, una muestra de histopatología, una muestra de plasma o suero, una muestra de tumor, células vivas, células cultivadas, una muestra clínica tal como, por ejemplo, sangre completa o productos derivados de la sangre, células sanguíneas, o tejidos o células cultivados, lo que incluye suspensiones celulares.

Las muestras biológicas libres de células pueden incluir polinucleótidos extracelulares. Los polinucleótidos extracelulares pueden aislarse a partir de una muestra corporal, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, saliva, excreciones mucosales, esputo, heces y lágrimas.

Como se discutió anteriormente, una muestra biológica puede incluir un único analito de interés, o más de un analito de interés. Los métodos para realizar ensayos multiplexados para analizar dos o más analitos diferentes en una única muestra biológica se discutirán en una sección posterior de esta descripción.

Los sujetos a partir de los cuales se pueden obtener muestras biológicas pueden ser individuos sanos o asintomáticos, individuos que tienen o se sospecha que tienen una enfermedad (por ejemplo, cáncer) o una predisposición a una enfermedad, y/o individuos que necesitan terapia o se sospecha que necesitan terapia. Las muestras biológicas pueden incluir una o más células enfermas. Una célula enferma puede tener propiedades metabólicas, expresión génica, expresión proteica y/o elementos morfológicos alterados. Los ejemplos de enfermedades incluyen trastornos inflamatorios, trastornos metabólicos, trastornos del sistema nervioso y cáncer. Las células cancerosas pueden derivarse de tumores sólidos, neoplasias hematológicas, líneas celulares u obtenerse como células tumorales circulantes. Una célula enferma puede tener propiedades metabólicas, expresión génica, expresión proteica y/o elementos morfológicos alterados. Los ejemplos de enfermedades incluyen trastornos inflamatorios, trastornos metabólicos, trastornos del sistema nervioso y cáncer. En algunos casos, la muestra biológica incluye células tumorales o cancerosas. Las células cancerosas pueden derivarse de tumores sólidos, neoplasias hematológicas, líneas celulares u obtenerse como células tumorales circulantes. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra heterogénea. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra heterogénea que incluye células tumorales o cancerosas y/o células estromales,

En algunos casos, el cáncer es cáncer de mama. En algunos casos, el cáncer de mama es cáncer de mama triple positivo (TPBC). En algunos casos, el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo (TNBC).

En algunos casos, el cáncer es cáncer colorrectal. En algunos casos, el cáncer es cáncer de ovario. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin o no hodgkiniano, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, mieloma, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer de esófago, o un tipo de cáncer de cabeza o cuello. En ciertas modalidades, el cáncer tratado es melanoma desmoplásico, cáncer de mama inflamatorio, timoma, cáncer rectal, cáncer anal, o glioma de tallo cerebral tratable quirúrgicamente o no tratable quirúrgicamente. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.

Las muestras de FFPE generalmente se reticulan y fragmentan en gran medida, y por lo tanto este tipo de muestra permite una recuperación limitada del ARN mediante el uso de técnicas de detección convencionales. En ciertas modalidades, los métodos de captura de ARN dirigido proporcionados en la presente descripción se ven menos afectados por la degradación del ARN asociada con la fijación de FFPE que otros métodos (por ejemplo, métodos que aprovechan la captura oligo-dT y la transcripción inversa del ARNm). En ciertas modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción permiten la medición sensible de genes específicos de interés que de cualquier otra manera podrían omitirse con un enfoque transcriptómico completo.

En algunos casos, las muestras de FFPE se tiñen (por ejemplo, mediante el uso de H y E). Los métodos descritos en la presente descripción son compatibles con H y E y permitirán el contexto morfológico superpuesto con el análisis transcriptómico. Sin embargo, en dependencia de la necesidad, algunas muestras pueden teñirse solo con una tinción nuclear, tal como teñir una muestra solo con hematoxilina y no eosina, cuando se necesita la ubicación de un núcleo celular.

En algunas modalidades, una muestra biológica (por ejemplo, sección de tejido) puede fijarse con metanol, teñirse con hematoxilina y eosina, y obtener imágenes. En algunas modalidades, la fijación, tinción y obtención de imágenes se producen antes de capturar uno o más analitos. Algunas modalidades de cualquiera de los flujos de trabajo descritos en la presente descripción pueden incluir además una etapa de decoloración (por ejemplo, una etapa de decoloración con hematoxilina y eosina), después de la obtención de imágenes de la muestra y antes de permeabilizar la muestra. Por ejemplo, la decoloración puede realizarse al realizar una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco) etapas de lavado (por ejemplo, una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco) etapas de lavado realizadas mediante el uso de un tampón que incluye HCl). Las imágenes pueden usarse para mapear patrones de expresión génica espacial de regreso a la muestra biológica. Puede usarse una enzima de permeabilización para permeabilizar la muestra biológica directamente sobre el sustrato.

En algunas modalidades, la muestra FFPE se desparafina, se permeabiliza, se equilibra y se bloquea antes de la captura de analitos. En algunas modalidades, la desparafinación es mediante el uso de xilenos. En algunas modalidades, la desparafinación incluye múltiples lavados con xilenos. En algunas modalidades, la desparafinación incluye múltiples lavados con xilenos seguidos de la eliminación de xilenos mediante el uso de múltiples rondas de alcohol graduado seguido de lavado de la muestra con agua. En algunos aspectos, el agua es agua desionizada. En algunas modalidades, equilibrar y bloquear incluye incubar la muestra en un tampón pre-Hib. En algunas modalidades, el tampón pre-Hib incluye ARNt de levadura. En algunas modalidades, la permeabilización de una muestra incluye lavar la muestra con un tampón fosfato. En algunas modalidades, el tampón es PBS. En algunas modalidades, el tampón es PBST.

En algunos casos, los métodos descritos en la presente descripción incluyen la preparación de una muestra biológica. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra de tejido. En algunos casos, la muestra biológica es una sección de tejido. En algunos casos, el tejido es una muestra fresca. En algunos casos, la muestra fresca se ha seccionado. En algunos casos, el tejido es una muestra congelada. En algunos casos, la muestra congelada se ha seccionado. En algunos casos, el tejido es una muestra fijada. En algunos casos, el tejido es un tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE), una muestra fijada con PFA o una muestra fijada con acetona. Cualquier otra muestra de tejido adecuada descrita en la presente descripción también puede usarse en los métodos.

En algunos casos, la muestra biológica es una muestra viva. En algunos casos, la muestra biológica es una sección de una muestra de tejido vivo. En algunos casos, la muestra biológica es un cultivo de células (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). Una muestra viva como se usa en la presente descripción se refiere a una muestra que mantiene al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de viabilidad. En algunos casos, el tejido vivo se secciona mediante el uso de un vibrátomo.

Los aparatos, sistemas, métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar y analizar una amplia variedad de analitos diferentes. A los efectos de esta descripción, un “analito” puede incluir cualquier sustancia, estructura, resto o componente biológico a analizar. El término “objetivo” puede referirse de manera similar a un analito de interés. En algunos casos, los diferentes analitos (por ejemplo, el primer analito y el segundo analito) pueden ser proteínas y ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN o ADN). Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden ser agentes intermedios o porción de estos y ARN. El agente intermedio puede ser una sonda conectada (por ejemplo, sonda RTL) o un agente de captura de analitos (por ejemplo, anticuerpo oligoconjugado). Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden ser ARN y a Dn . Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden ser agentes intermedios y ADN. Adicionalmente, o en la alternativa, los diferentes analitos pueden capturarse de forma dirigida en un portaobjetos y el transcritoma completo o ADN en otro portaobjetos.

Los analitos pueden clasificarse en términos generales en uno de dos grupos: analitos de ácidos nucleicos y analitos no ácidos nucleicos. Los ejemplos de analitos que no son ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, lípidos, carbohidratos, péptidos, proteínas, glucoproteínas (unidas a N o unidas a O), lipoproteínas, fosfoproteínas, variantes fosforiladas o acetiladas de proteínas específicas, variantes de amidación de proteínas, variantes de hidroxilación de proteínas, variantes de metilación de proteínas, variantes de ubiquitinación de proteínas, variantes de sulfatación de proteínas, proteínas de recubrimiento viral, proteínas extracelulares e intracelulares, anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el analito puede ser un orgánulo (por ejemplo, núcleos o mitocondrias).

Los elementos de superficie celular que corresponden a analitos pueden incluir, pero no se limitan a, un receptor, un antígeno, una proteína de superficie, una proteína transmembrana, un conglomerado de proteínas de diferenciación, un canal proteico, una bomba de proteínas, una proteína portadora, un fosfolípido, una glucoproteína, un glucolípido, un complejo proteico de interacción célula-célula, un complejo presentador de antígenos, un complejo mayor de histocompatibilidad, un receptor de linfocitos T manipulado genéticamente, un receptor de linfocitos T, un receptor de linfocitos B, un receptor de antígeno quimérico, una proteína de la matriz extracelular, una modificación postraduccional (por ejemplo, fosforilación, glucosilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación o lipidación) del estado de una proteína de superficie celular, una unión en hendidura, y una unión adherente.

Los analitos pueden derivarse de un tipo específico de célula y/o de una región subcelular específica. Por ejemplo, los analitos pueden derivarse del citosol, de núcleos celulares, de mitocondrias, de microsomas, y más generalmente, de cualquier otro compartimiento, orgánulo, o porción de una célula. Los agentes permeabilizantes que se dirigen específicamente a ciertos compartimentos celulares y organelos pueden usarse para liberar selectivamente analitos de las células para su análisis.

Los ejemplos de analitos de ácido nucleico incluyen analitos de ADN tales como ADN genómico, ADN metilado, secuencias de ADN metilado específicas, ADN fragmentado, ADN mitocondrial, productos de PCR sintetizados in situ y ADN viral.

Los ejemplos de analitos de ácidos nucleicos incluyen además analitos de ARN tales como diversos tipos de ARN codificante y no codificante. Los ejemplos de los diferentes tipos de analitos de ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), a Rn ribosómico (ARNr), A r N de transferencia (ARNt), microARN (miARN) y ARN viral. El ARN puede ser un transcrito (por ejemplo, presente en una sección de tejido). El ARN puede ser pequeño (por ejemplo, menor que 200 bases de ácido nucleico de longitud) o grande (por ejemplo, ARN mayor que 200 bases de ácido nucleico de longitud). Los ARN pequeños incluyen principalmente ARN ribosómico (ARNr) 5.8S, ARNr 5S, ARN de transferencia (ARNt), microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN nucleolar pequeño (ARNnp), ARN de interacción Piwi (ARNp), ARN derivado de ARNt pequeño (ARNatp) y ARN derivado de ADNr pequeño (ARNarp). El ARN puede ser a Rn bicatenario o ARN monocatenario. El ARN puede ser ARN circular. El ARN puede ser un ARNr bacteriano (por ejemplo, ARNr 16s o ARNr 23s).

Los ejemplos adicionales de analitos incluyen ARNm y elementos de superficie celular (por ejemplo, mediante el uso de los agentes de marcaje descritos en la presente descripción), ARNm y proteínas intracelulares (por ejemplo, factores de transcripción), ARNm y estado de metilación celular, ARNm y cromatina accesible (por ejemplo, ATAC-seq, DNase-seq y/o MNase-seq), ARNm y metabolitos (por ejemplo, mediante el uso de los agentes de marcaje descritos en la presente descripción), un agente de marcaje con código de barras (por ejemplo, los anticuerpos etiquetados con oligonucleótidos descritos en la presente descripción) y una secuencia V(D)J de un receptor de células inmunitarias (por ejemplo, receptor de linfocitos T), ARNm y un agente de perturbación (por ejemplo, un ARNcr/ARNgc CRISPR, TALEN, nucleasa con dedos de zinc, y/u oligonucleótido antisentido como se describe en la presente descripción). En algunas modalidades, un agente de perturbación puede ser una molécula pequeña, un anticuerpo, un fármaco, un aptámero, un miARN, un entorno físico (por ejemplo, cambio de temperatura) o cualquier otro agente de perturbación conocido.

En ciertas modalidades, un analito puede extraerse a partir de una célula viva. Las condiciones de procesamiento pueden ajustarse para asegurar que una muestra biológica permanezca viable durante el análisis, y que los analitos se extraigan (o se liberen) de células vivas de la muestra. Los analitos derivados de células vivas pueden obtenerse solo una vez a partir de la muestra, o pueden obtenerse a intervalos a partir de una muestra que permanece en una condición viable.

En general, los sistemas, aparatos, métodos y composiciones pueden usarse para analizar cualquier número de analitos. Por ejemplo, la cantidad de analitos que se analizan puede ser al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 11, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 14, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 10 000, al menos aproximadamente 100000 o más analitos diferentes presentes en una región de la muestra o dentro de una elemento individual del sustrato.

Como se usa en la presente, los analitos capturados mediante el uso del sistema de matriz de expresión génica de dos sustratos pueden ser analitos en la misma ubicación y que tienen la misma o una secuencia similar. En algunos casos, los analitos capturados en un punto particular son diferentes (por ejemplo, son genes diferentes o tienen secuencias diferentes y/o no conservadas). Se aprecia que debido a que el número de analitos detectados se duplica al menos porque se usan dos ensayos de expresión génica, entonces pueden detectarse analitos tanto similares como no similares (por ejemplo, no conservados).

(d) Kits, sistemas y composiciones

En algunas modalidades, también se proporcionan en la presente descripción kits, sistemas y aparatos, cada uno configurado para realizar los métodos descritos en la presente descripción.

En algunos casos, los kits y sistemas incluyen uno o más reactivos para detectar uno o más analitos descritos en la presente descripción. En algunos casos, los kits y sistemas incluyen un primer sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, cada una de las cuales incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(T). En algunos casos, los kits y sistemas incluyen un segundo sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, cada una de las cuales incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(T) y un código de barras espacial. Se aprecia que cualquiera de las sondas de captura descritas en la presente descripción puede diseñarse de manera que un usuario pueda detectar cualquier analito de interés.

Un ejemplo no limitante de un kit usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye: (a) un primer sustrato que comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende un primer dominio de captura y un primer código de barras espacial; (b) un segundo sustrato que comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura; y (c) instrucciones para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.

Un ejemplo no limitante de un kit usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye: (a) un primer sustrato que comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende un primer dominio de captura y un primer código de barras espacial; (b) un segundo sustrato que comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura; y (c) la muestra biológica.

Se aprecia además que los kits, sistemas y aparatos pueden incluir uno o más reactivos necesarios para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. Además, los kits, sistemas y aparatos también pueden incluir una o más enzimas (por ejemplo, polimerasa; transcriptasa inversa; ligasa) necesarias para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Detección de múltiples analitos en una muestra biológica mediante el uso de dos matrices de expresión génica

Este ejemplo proporciona un método ilustrativo para la detección de múltiples analitos en una muestra biológica mediante el uso de dos matrices de expresión génica.

a. Configuración experimental y de control

Se utilizaron dos configuraciones de control. En la primera muestra de control, como se muestra en la Figura 7A (arriba izquierda), una muestra biológica 704 se colocó directamente sobre un sustrato con código de barras espacial (por ejemplo, sustrato de expresión génica) 702. Analitos 706 se capturaron como se describe más abajo. En la segunda muestra de control, como se muestra en la Figura 7A (parte superior derecha), una muestra biológica 710 se coloca sobre un sustrato de tejido (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio) 708. El sustrato de tejido 708 después se intercaló con un sustrato con código de barras espacial (por ejemplo, sustrato de expresión génica) 712. Después del intercalamiento, los analitos 714 de la muestra biológica 710 migran 716 a las sondas de captura 718 en el sustrato con código de barras espacial (por ejemplo, sustrato de expresión génica) 712. Las sondas de captura 718 comprende (i) un dominio de captura (por ejemplo, o es decir, una secuencia de politimina) que hibrida con la cola poli(A) de un analito 714 y (ii) un código de barras espacial.

Se ejecutaron dos condiciones de prueba, cada una de las cuales usó dos sustratos de expresión génica. En una condición de prueba, como se muestra en la Figura 7A (parte inferior izquierda), la muestra biológica 724 se colocó en el sustrato de expresión génica superior 720, que comprende un césped de sondas de captura 722, cada uno que comprende un dominio de captura y un código de barras espacial. El sustrato de expresión génica superior 720 después se intercaló con un segundo sustrato de expresión génica inferior 730, que comprendía su propio césped de sondas de captura 732, cada uno que comprende un dominio de captura y un código de barras espacial. Analitos 726 de la muestra biológica 724 migró 728 del sustrato de expresión génica superior 720 al sustrato de expresión génica inferior 730. Al mismo tiempo, los analitos 724 se capturaron en el sustrato de expresión génica superior 720 mediante sondas de captura 722.

En una segunda condición de prueba, como se muestra en la Figura 7A (parte inferior derecha), la muestra biológica 742 se colocó en el sustrato de expresión génica inferior 738, que comprende un césped de sondas de captura 740, cada uno comprende un dominio de captura y un código de barras espacial. El sustrato de expresión génica inferior 738 después se intercaló con un segundo sustrato de expresión génica superior 734, que comprendía su propio césped de sondas de captura 736, cada uno que comprende un dominio de captura y un código de barras espacial. Los analitos 744 de la muestra biológica 742 migraron 746 del sustrato de expresión génica inferior 738 al sustrato de expresión génica superior 734. Al mismo tiempo, los analitos 744 se capturaron en el sustrato de expresión génica inferior 738 mediante sondas de captura 740.

Como vista alternativa, como se muestra en la Figura 7B, una muestra biológica 752 se colocó en un primer sustrato de expresión génica 750. Un segundo sustrato de expresión génica 756 se intercaló 754 con el primer sustrato de expresión génica 750. Los analitos de la muestra biológica 752 se capturaron mediante las sondas de captura 758 y 760 en cada sustrato de expresión génica. Después, se separaron los sustratos de expresión génica y se realizaron métodos de análisis espacial para identificar la ubicación y abundancia de analitos en la muestra biológica 752.

b. Detección de múltiples analitos en una muestra biológica recién congelada mediante el uso de dos matrices de expresión génica

Mediante el uso de los montajes de control y experimentales descritos en el Ejemplo 1(a) anterior, una muestra de cerebro de ratón recién congelado de 10 |jm se seccionó y se colocó en uno de los cuatro sustratos (dos sustratos de control y dos sustratos de prueba).

En los ensayos de intercalamiento, después de colocar la muestra biológica sobre el primer sustrato (ya sea superior o inferior). Brevemente, una muestra de tejido de 10 jm se seccionó y se colocó en un primer sustrato. Después de colocar la muestra biológica en el primer sustrato, se coloca un segundo sustrato (A) encima, superior al primer sustrato, o (B) debajo, o inferior al primer sustrato, creando una configuración de intercalamiento con la muestra biológica entre el primer sustrato y el segundo sustrato. Cada sustrato en el intercalamiento tiene una pluralidad de sondas de captura, cada una de las cuales incluye tanto un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia de politimina) como un dominio espacial. Se añadió un tampón de permeabilización que comprendía proteinasa K a la muestra biológica, lo que permitió que los analitos migraran desde la muestra biológica.

Los analitos migraron pasivamente hacia ambos sustratos y se capturaron mediante sondas de captura de cada uno de los dos sustratos. Los analitos capturados en cada sustrato se prepararon para el análisis. En resumen, los analitos capturados en el primer y segundo sustrato se inmovilizaron en cada sustrato a través de la cola poli(A) del analito (por ejemplo, o es decir, la cola poli(A) hibridada a la secuencia de politimina de la sonda de captura). Después de la hibridación, se rompió la configuración de intercalamiento. Es decir, cada sustrato se separó y se realizaron experimentos adicionales. En particular, después de la separación, los analitos capturados se copiaron, mediante el uso del analito como plantilla; y el producto de extensión se liberó de la matriz espacial. Brevemente, los tejidos se incubaron con una mezcla de extensión de la segunda hebra que comprendía la ADN polimerasa durante 25 minutos a 53 °C. Después de la incubación, la mezcla de extensión de la segunda hebra se eliminó de los tejidos y los tejidos se lavaron con 2X SSC. Se añadió una solución de KOH al tejido a temperatura ambiente durante 10 minutos para liberar el producto de extensión de cada matriz espacial y el sobrenadante de cada pocillo de tejido se transfirió para su cuantificación y preparación de la biblioteca. La cuantificación de muestras se realizó mediante el uso de qPCR y la mezcla maestra de qPCR KAPA SYBR FAST de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la preparación de la biblioteca, las muestras se indexaron mediante el uso de una mezcla Amp que incluía cebadores de indexación dual y una mezcla Amp. Después, se secuenciaron y analizaron los ácidos nucleicos de la reacción de amplificación. Se generó una imagen de la muestra en base a la detección del analito. Como se muestra en las Figuras 8A-8C, los analitos se detectaron en cada uno de los controles (Figura 8A) y cada una de las muestras de prueba (Figuras 8B y 8C). En particular, en la condición de prueba, los analitos se detectaron fácilmente tanto en el sustrato de tejido (por ejemplo, o es decir, el primer sustrato de expresión génica) como en el sustrato de expresión génica de transferencia (por ejemplo, o es decir, el segundo sustrato de expresión génica). Figura 9A. Además, las lecturas se compararon entre el sustrato de tejido (por ejemplo, o es decir, el primer sustrato de expresión génica) y el sustrato de expresión génica de transferencia (por ejemplo, o es decir, el segundo sustrato de expresión génica). Como se muestra en las Figuras 9B y 9C, la eficiencia de captura fue relativamente la misma tanto en el sustrato de tejido (por ejemplo, o es decir, el primer sustrato de expresión génica) como en el sustrato de expresión génica de transferencia (por ejemplo, o es decir, el segundo sustrato de expresión génica). Estos datos son consistentes con códigos de barras válidos similares, UMI válidas, por ciento de lecturas mapeadas con confianza al transcritoma, por ciento de lecturas de fracciones que no se mapearon, por ciento de lecturas con secuencia poli(A) completa, por ciento de lecturas de fracciones con cualquier secuencia de oligo de conmutación, la mediana de genes por punto, la mediana de recuentos de UMI por punto y la saturación de secuenciación, tanto entre los dos sustratos en las condiciones de la prueba de intercalamiento como en comparación con el recién congelado (control sin intercalamiento) y el control de intercalamiento. Ver las Tablas 1 y 2. En conjunto, estos datos demuestran que una muestra recién congelada puede usarse como un ensayo de intercalamiento que comprende dos sustratos de expresión génica. Por lo tanto, los experimentos ilustran que múltiples analitos pueden examinarse en la misma posición en una muestra biológica recién congelada mediante el uso de dos sustratos de expresión génica.

Tabla 1. Análisis de la ex resión es acial en muestra recién con elada.

Tabla 2. Análisis de la ex resión es acial en muestra recién con elada.

c. Detección de múltiples analitos en una muestra biológica FFPE mediante el uso de dos matrices de expresión génica

Mediante el uso de los montajes de control y experimentales descritos en el Ejemplo 1(a) anterior (los montajes de control contenían solo el oligonucleótido poliT con código de barras espacial mientras que los montajes de prueba contenían dos secuencias de captura: oligonucleótidos poliT con código de barras espacial, y oligonucleótidos con código de barras espacial que contenían la secuencia de captura 1, que se configura para hibridar con oligonucleótidos de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos), un cerebro de ratón fijado en formalina (FFPE) se seccionó a un grosor de 10 |jm y se colocó sobre su respectivo montaje. Las secciones de tejido cerebral de ratón FFPE se desparafinaron, se desreticularon y se equilibraron con un tampón de prehibridación. La desreticulación de la muestra se realizó mediante el uso de un reactivo de desreticulación TE (tampón TE pH 9,0, 70 oC) (Genemed 10-0046). Después de la desreticulación, las muestras se hibridaron con sondas específicas de genes durante la noche, seguido de etapas de lavado, una etapa de ligación y lavado adicional para eliminar los errores de ligación. Después, la muestra biológica se incubó con anticuerpos conjugados con oligonucleótidos, seguido de lavados mediante el uso de PBST para eliminar los anticuerpos en exceso. Después, la muestra biológica se montó sobre el primer sustrato (ya sea superior o inferior). Una vez colocada la muestra biológica en el primer sustrato, se colocó un segundo sustrato (A) en la parte superior, superior al primer sustrato, o (B) debajo, o inferior al primer sustrato, creando una configuración de intercalamiento con la muestra biológica entre el primer sustrato y el segundo sustrato. Cada sustrato en el intercalamiento tiene una pluralidad de sondas de captura, cada una de las cuales incluye tanto un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia de politimina, secuencia de captura 1) como un dominio espacial. Se añadió un tampón de permeabilización que comprendía proteinasa K a la muestra biológica, lo que permitió que los analitos migraran desde la muestra biológica.

Los analitos migraron pasivamente hacia ambos sustratos y se capturaron mediante sondas de captura de cada uno de los dos sustratos. Los analitos capturados en cada sustrato se prepararon para el análisis. En resumen, los analitos capturados en el primer y segundo sustrato se inmovilizaron en cada sustrato a través de la cola poli(A) del analito (por ejemplo, o es decir, la cola poli(A) hibridada a la secuencia de politimina de la sonda de captura). Después de la hibridación, se rompió la configuración de intercalamiento. Es decir, cada sustrato se separó y se realizaron experimentos adicionales. En particular, después de la separación, los analitos capturados se copiaron, mediante el uso del analito como plantilla; y el producto de extensión se liberó de la matriz espacial. Brevemente, los tejidos se incubaron con una mezcla de extensión de la segunda hebra que comprendía la ADN polimerasa durante 25 minutos a 53 °C. Después de la incubación, la mezcla de extensión de la segunda hebra se eliminó de los tejidos y los tejidos se lavaron con 2X SSC. Se añadió una solución de KOH al tejido a temperatura ambiente durante 10 minutos para liberar el producto de extensión de cada matriz espacial y el sobrenadante de cada pocillo de tejido se transfirió para su cuantificación y preparación de la biblioteca. La cuantificación de muestras se realizó mediante el uso de qPCR y la mezcla maestra de qPCR KAPA SYBR FAST de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la preparación de la biblioteca, las muestras se indexaron mediante el uso de una mezcla Amp que incluía cebadores de indexación dual y una mezcla Amp. Después, se secuenciaron y analizaron los ácidos nucleicos de la reacción de amplificación. Se generó una imagen de la muestra en base a la detección del analito.

Como se muestra en las Figuras 10A-10B, los analitos se detectaron fácilmente tanto en el sustrato de tejido (por ejemplo, o es decir, el primer sustrato de expresión génica) como en el sustrato de expresión génica de transferencia (por ejemplo, o es decir, el segundo sustrato de expresión génica). Además, las lecturas se compararon entre el sustrato de tejido (por ejemplo, o es decir, el primer sustrato de expresión génica) y el sustrato de expresión génica de transferencia (por ejemplo, o es decir, el segundo sustrato de expresión génica). Como se muestra en las Figuras 10B y 10C, la eficiencia de captura fue relativamente la misma tanto en el sustrato de tejido (por ejemplo, o es decir, el primer sustrato de expresión génica) como en el sustrato de expresión génica de transferencia (por ejemplo, o es decir, el segundo sustrato de expresión génica). Estos datos son consistentes con códigos de barras válidos similares, UMI válidos, por ciento de lecturas mapeadas con confianza al transcritoma, por ciento de lecturas de fracciones que no se mapearon, por ciento de lecturas con secuencia poli(A) completa, por ciento de lecturas de fracciones con cualquier secuencia de oligo de conmutación, la mediana de genes por punto, la mediana de recuentos de UMI por punto y la saturación de secuenciación, tanto entre los dos sustratos en las condiciones de la prueba de intercalamiento como en comparación con el FFPE (control sin intercalamiento) y el control de intercalamiento. Ver las Tablas 3 y 4. Además, como se indicó en la Tabla 3, los oligonucleótidos de anticuerpos estaban presentes en las configuraciones mostradas. En conjunto, estos datos demuestran que una muestra FFPE puede usarse en un ensayo de intercalamiento que comprende dos sustratos de expresión génica.

Por lo tanto, los experimentos ilustran que múltiples analitos pueden examinarse en la misma posición en una muestra biológica FFPE mediante el uso de dos sustratos de expresión génica.

Tabla 3. Análisis de la expresión espacial en muestras FFPE.

*

Tabla 4. Análisis de la ex resión es acial en muestras FFPE.

Ejemplo 2: Captura eficiente de analitos a partir de secciones de cerebro de ratón recién congeladas montadas en portaobjetos con matriz espacial

La captura de analitos en matrices con código de barras espacial y el posterior secuenciación se demostró en condiciones de intercalamiento y sin intercalamiento. Para la condición de prueba (intercalamiento), se usaron portaobjetos de vidrio estándar montados en tejido archivados que contenían secciones de cerebro de ratón recién congeladas teñidas con hematoxilina/eosina. Para la condición de control (sin intercalamiento), se usaron portaobjetos de matriz GEx con secciones de cerebro de ratón recién congeladas teñidas con hematoxilina/eosina montadas directamente en el área de la matriz. En ambas condiciones, las secciones de tejido se sometieron a una etapa de decoloración de la hematoxilina. Los portaobjetos procesados de acuerdo con la condición de “intercalado” se secaron brevemente a 37 °C, después se montaron en un instrumento junto con un portaobjetos GEx y un tampón de permeabilización que comprendía sarkosyl y proteinasa K. Tras el cierre del intercalamiento en el instrumento, las secciones de tejido se permeabilizaron durante 1 minuto. Para los portaobjetos de GEx montados en tejido procesados de acuerdo con la condición sin intercalamiento, las secciones se permeabilizaron durante 5 minutos mediante el uso del mismo tampón de permeabilización sin intercalamiento. Para ambas condiciones, después de la permeabilización, los transcritos de ARNm que contienen poliA capturados en los portaobjetos de GEx se transcribieron inversamente en ADNc, seguido de la preparación de la biblioteca de secuenciación estándar y la secuenciación.

Los resultados que representan la mediana de genes por punto y la mediana de recuentos de UMI por punto se muestran en la Figura 11.

Los resultados del mapa de calor visual que muestran el log10 de UMI se muestran en la Figura 12. Los patrones espaciales de los Log10 de recuentos de UMI fueron similares en las condiciones de intercalamiento y sin intercalamiento.

El análisis de agrupamiento espacial (fila superior 1305) y el análisis del transcrito hipocampal Hpca (fila inferior 1310) se representan en Figura 13. Los patrones espaciales fueron comparables entre las condiciones de intercalamiento y sin intercalamiento.

Otras modalidades

Debe entenderse que, si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la descripción.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la abundancia y la ubicación de múltiples analitos en una muestra biológica, el método comprende:

(a) proporcionar un primer sustrato y una muestra biológica montada sobre el mismo, en donde el primer sustrato comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura;

(b) alinear un segundo sustrato en el lado opuesto del primer sustrato con relación a la muestra biológica, para intercalar de esta manera el primer sustrato, la muestra biológica y el segundo sustrato,

en donde el segundo sustrato comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura;

(c) añadir un tampón de permeabilización a la muestra biológica, para promover de esta manera la migración del primer analito y el segundo analito de la muestra biológica; y

(d) hibridar un primer analito de los múltiples analitos al primer dominio de captura e hibridar un segundo analito de los múltiples analitos al segundo dominio de captura.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

(e)

(A) determinar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del primer código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del primer analito capturado en el primer dominio de captura, o un complemento de esta, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la abundancia y la ubicación del primer analito en la muestra biológica, y/o

(B) determinar (i) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo código de barras espacial, o un complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo analito capturado en el segundo dominio de captura, o un complemento de esta, y usar las secuencias de (i) y (ii) para determinar la abundancia y la ubicación del segundo analito en la muestra biológica.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende además, antes de (a), montar la muestra biológica sobre la pluralidad de primeras sondas de captura del primer sustrato.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el tampón de permeabilización comprende pepsina o proteinasa K.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde (b) se realiza con la ayuda de un soporte de muestra que comprende: (i) un primer miembro que comprende un primer mecanismo de retención configurado para recibir el primer sustrato, (ii) un segundo miembro que comprende un segundo mecanismo de retención configurado para recibir el segundo sustrato, y (iii) un mecanismo de alineación que se conecta a al menos uno del primer miembro y el segundo miembro y se configura para alinear el primer sustrato y el segundo sustrato.

6. El método de la reivindicación 5, en donde (b) comprende (i) retener el primer sustrato en el primer mecanismo de retención del primer sustrato, (ii) retener el segundo sustrato en el segundo mecanismo de retención del segundo sustrato, y (iii) usar el mecanismo de alineación para alinear el segundo sustrato en el lado opuesto del primer sustrato con relación a la muestra biológica, para intercalar de esta manera el primer sustrato, la muestra biológica y el segundo sustrato.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el primer dominio de captura y/o el segundo dominio de captura comprende (i) una secuencia poli(T), (ii) una secuencia complementaria a una secuencia de asa de captura presente en un agente de captura de analitos, o (iii) una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada generada por ligación con plantilla.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además generar una primera sonda de captura extendida mediante el uso del primer analito como plantilla y/o generar una segunda sonda de captura extendida mediante el uso del segundo analito como plantilla.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la primera sonda de captura y/o la segunda sonda de captura se extiende/n en su/sus extremo/s 3', opcionalmente, que comprende además una etapa de amplificación de las sondas de captura extendidas para producir una pluralidad de sondas de captura extendidas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde la etapa de determinación en la etapa (e)(A) comprende secuenciar (i) la secuencia del primer código de barras espacial o el complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del primer analito.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en donde la etapa de determinación en la etapa (e)(A) y/o (e)(B) comprende secuenciación.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en donde la etapa de determinación en la etapa (e)(B) comprende secuenciar (i) la secuencia del segundo código de barras espacial o el complemento de esta, y (ii) la totalidad o una porción de la secuencia del segundo analito.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde:

(i) el primer analito y el segundo analito son moléculas de ARN, opcionalmente en donde las moléculas de ARN son moléculas de ARNm; o

(ii) el primer analito y el segundo analito son analitos diferentes.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la muestra biológica es una sección de tejido, opcionalmente en donde la sección de tejido es una sección de tejido embebida en parafina, fijada con formalina (FFPE), una sección de tejido congelado, una sección de tejido recién congelado o una sección de tejido fresco.

15. Un sistema para determinar la abundancia y la ubicación de múltiples analitos en una muestra biológica, el sistema comprende:

(a) un primer sustrato que comprende una pluralidad de primeras sondas de captura, en donde una primera sonda de captura de la pluralidad de primeras sondas de captura comprende (i) un primer código de barras espacial y (ii) un primer dominio de captura;

(b) un segundo sustrato comprende una pluralidad de segundas sondas de captura, en donde una segunda sonda de captura de la pluralidad de segundas sondas de captura comprende (i) un segundo código de barras espacial y (ii) un segundo dominio de captura;

(c) un soporte de muestra biológica que comprende: (i) un primer miembro que comprende un primer mecanismo de retención configurado para recibir el primer sustrato, (ii) un segundo miembro configurado para recibir el segundo sustrato, y (iii) un mecanismo de alineación que se conecta a al menos uno del primer miembro y el segundo miembro y se configura para alinear el primer sustrato y el segundo sustrato;

(d) la muestra biológica; y

(e) un tampón de permeabilización.