ES3018861T3 - Method for detection of hydroxymethylation status - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para la detección de 5-hidroximetilcitosina (5hmC) mediante la dilución de la concentración de 5hmC, manteniendo la metilación mediante una enzima metiltransferasa, por ejemplo, DNMT1, DNMT2 o DNMT3. El método puede utilizarse para la detección de 5hmC en ADN genómico, por ejemplo, ADN genómico de mamíferos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la detección del estado de hidroximetilación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para la detección de 5-hidroximetilcitosina (5hmC). En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a procedimientos para la detección de 5hmC en ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN). En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a la detección de 5hmC en ADN genómico, por ejemplo, ADN genómico de mamíferos.

Antecedentes de la invención

La modificación de la 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en el ADN de los mamíferos se descubrió hace más de 30 años1. En ese momento se sugirió que la modificación de 5hmC era una lesión2 de daño del ADN rara y no mutagénica y por eso se le prestó poca atención. A principios de 2009 se identificó nuevamente 5hmC; sin embargo, en este año se comprendió la importancia de 5hmC en la epigenética cuando dos grupos independientes comenzaron la caracterización inicial de la modificación de 5hmC. Un grupo identificó una enzima capaz de catalizar la formación de 5hmC a partir de 5-metilcitosina - Tet13. El otro grupo demostró que 5hmC era una modificación estable presente en neuronas4 de Purkinje especializadas. Investigaciones posteriores han demostrado que Tet1, Tet2 y Tet3 son capaces de catalizar la oxidación de 5meC creando 5hmC5-7.

La función molecular de 5hmC aún no se comprende bien; sin embargo, se ha demostrado que 5hmC está involucrado en una variedad de transacciones de ADN: se ha demostrado que es un intermediario en la desmetilación del ADN38, que tiene una doble función en la transcripción9'11 y, en el caso de patrones aberrantes de 5hmC, que está involucrado en la tumorigénesis7 Si bien la función de la modificación de 5hmC aún no está clara, ha quedado claro que identificar regiones genómicas que contienen 5hmC ayudará a dilucidar la función de esta base. Esta necesidad de identificar regiones genómicas que contengan 5hmC ha llevado al desarrollo de procedimientos adecuados. Actualmente, hay varios procedimientos disponibles para identificar 5hmC; cada procedimiento tiene ciertas limitaciones que se discuten a continuación. El procedimiento descrito aquí permite la resolución específica de bases de (i) 5hmC y (ii) 5meC en el ADN.

Actualmente, existen varios procedimientos que permiten la identificación de 5hmC. Estos procedimientos incluyen anticuerpos generados contra 5hmC92122, anticuerpos generados contra la citosina 5-metilensulfonano (CMS), producto del tratamiento con bisulfito de 5hmC7, 23, secuenciación de moléculas individuales en tiempo real basada en la cinética24 de la ADN polimerasa, enzimas de restricción que son resistentes o sensibles a 5hmC o p-glu-5hmC25'27 y tres procedimientos que aprovechan la pglucosiltransferasa: (i) incorporando una baliza química en el sustrato para el p-gt28, (ii) el procedimiento23 de glucosilación, oxidación de peryodato y biotinilación (GLIB), y (iii) el ensayo de extracción JBP1 dirigido a glu-5hmC12

El uso de anticuerpos parece ser una opción razonable para identificar modificaciones del ADN; sin embargo, nosotros y otros5 hemos observado que algunos de los anticuerpos actualmente disponibles dirigidos contra 5hmC parecen ser incapaces de enriquecerse lo suficiente con a Dn que contiene 5hmC; de hecho, un reporte demuestra que un antisuero particular creado contra 5hmC es incapaz de diferenciar 5hmC de 5meC5 Se ha reportado que los antisueros desarrollados contra 5hmC tienden a preferir regiones genómicas densas en contenido de 5hmC22. Además, el uso de antisueros policlonales dirigidos contra 5hmC planteará un problema inherente, ya que habrá una variación de animal a animal en la especificidad antigénica a 5hmC, que puede afectar la utilidad a largo plazo de dichos antisueros.

Tras el tratamiento con bisulfito de sodio, el 5hmC se convierte en CMS, que después de la secuenciación parece idéntico a la 5meC convertido con bisulfito; por lo tanto, se ha demostrado que el uso de la secuenciación con bisulfito no puede distinguir entre 5meC y 5hmC30. De manera interesante, un grupo ha desarrollado un antisuero dirigido contra el CMS7, 23

La secuenciación de Molécula Única en Tiempo Real (SMRT) aprovecha la técnica de secuenciación original de Sanger; sin embargo, este procedimiento puede distinguir entre citosina, 5meC y 5hmC utilizando la firma cinética o la velocidad con la que la polimerasa pasa sobre cada base24. Este procedimiento, además de ser prohibitivamente costoso, requiere una cantidad significativa de ADN ya enriquecido con 5hmC antes de su uso, lo que lo hace dependiente de un ensayo de enriquecimiento con 5hmC. Debido a que este procedimiento utiliza secuenciación de alto rendimiento, resulta engorroso analizar un solo o unos pocos loci.

Varios grupos de investigación y empresas han identificado enzimas de restricción que son sensibles o resistentes a 5hmC o p-glu-5hmC25-27. El principio detrás de estos sistemas es que, tras el tratamiento con enzimas de restricción, el ADN no modificado se escinde lo que da como resultado una señal reducida en una reacción de qPCR. Esta reducción en la señal se compara luego con una muestra no digerida y la diferencia en las señales de qPCR es proporcional a la cantidad de 5hmC presente en la muestra inicial. Estos procedimientos funcionan bastante bien para regiones genómicas que contienen cantidades significativas de 5hmC; sin embargo, debido a que los sitios de restricción reconocidos por estas enzimas tienen una longitud de 4-6 pb, estos procedimientos basados en endonucleasas de restricción pueden, en el mejor de los casos, reconocer solo 1/16 de todas las modificaciones de 5hmC.

Tres grupos han desarrollado procedimientos que aprovechan la especificidad que tiene la p-gt para 5hmC. El primer grupo28 incorporó un grupo azida al sustrato para la p-gt - UDP-glucosa - creando UDP-6-N3-Glucosa. Después de que la glucosa modificada con azida se incorporó al ADN que contenía 5hmC mediante el p-gt, se pudo agregar un segundo grupo al 6-N3-glu-5hmC utilizando química de "clic". Este segundo grupo químico podría contener una biotina para extracción, una sonda fluorescente para cuantificación y, teóricamente, cualquier grupo que pudiera acoplarse a la glucosa modificada mediante química de "clic". El principal inconveniente de este procedimiento es que UDP-6-N3-glucosa no se produce comercialmente y requiere una gran experiencia en química orgánica para sintetizarla. Además, esta estrategia de focalización de 5hmC se ha combinado con un ensayo de extensión de cebador, y ha mostrado que permite una resolución específica de bases, ya que un grupo químico se puede unir a 6-N3-glu-5hmC que bloquea una ADN polimerasa. Al bloquear la polimerasa, se puede asumir que la base terminal contenía originalmente una modificación de 5hmC. El uso de este procedimiento para la resolución de bases específicas tiene problemas importantes, ya que se tiene que suponer que cada extremo que termina en C, es una 5hmC. Si bien este efecto puede promediarse potencialmente con varias lecturas de secuenciación de alto rendimiento, asumiendo relaciones enzima a ADN altamente optimizadas, sigue siendo problemático para el análisis de un solo gen.

Una segunda aproximación que utiliza p-gt para identificar regiones genómicas, utiliza el procedimiento23 de glucosilación, oxidación de peryodato y biotinilación (GLIB). En este procedimiento, después de la transferencia de glucosa a 5hmC, se oxida el p-glu-5hmC resultante utilizando NalO4 que crea aldehídos reactivos en la unidad estructural de glucosa unida a 5hmC. Estas moléculas de glucosa oxidadas pueden luego reaccionar con sondas reactivas a aldehído disponibles comercialmente, que contienen una modificación de biotina. Esta biotinilación permite la extracción eficiente del ADN que contiene 5hmC.

Finalmente, la tercera aproximación que utiliza la p-gt para la identificación de 5hmC implica el reconocimiento específico de esta base modificada, por una segunda proteína: la proteína de unión a la base J o JBP1. Debido a que la única diferencia entre p-glucosil-5hmC y la base J es un grupo amino, se razonó que JBP1 podría interactuar específicamente con p-glu-5hmC. De hecho, JBP1 pudo interactuar específicamente con p-glu-5hmC12. Por lo tanto, cuando JBP1 se unió covalentemente a perlas magnéticas modificadas con epoxi, permitió la extracción del ADN que contenía p-glu-5hmC. Después de retirar la proteína del ADN extraído, se demostró mediante qPCR específica del gen, que era posible enriquecer el ADN que contenía 5hmC12. Desde el punto de vista mecanístico, este procedimiento proporciona dos grados de especificidad para la identificación de 5hmC en el ADN genómico: primero, la p-gt sólo puede modificar las citosinas en el ADN que están hidroximetiladas y segundo, JBP1 interactúa específicamente con p-glu-5hmC. Como todos los procedimientos de extracción de ADN, la resolución óptima de este procedimiento puede identificar una base 5hmC dentro de aproximadamente 50-100 pares de bases; esta limitación se debe a la incapacidad de identificar de manera confiable fragmentos de ADN de una longitud más corta, utilizando los procedimientos de biología molecular actualmente disponibles. Otra consideración al utilizar este protocolo es que este procedimiento puede sobrerrepresentar regiones de ADN que contienen altos niveles de 5hmC. Esta potencial sobrerrepresentación podría ocurrir posiblemente debido a que en las regiones densas de 5hmC, más JBP1 puede interactuar con el ADN y extraer estas regiones de manera más eficiente.

El documento US-A-2006/257905 es la técnica anterior más cercana. El documento describe un procedimiento en el que una porción del ácido nucleico se replica en presencia de metiltransferasa, preferiblemente DNMT1 y ADN polimerasa con capacidad de desplazamiento de cadena, para copiar patrones de metilación del ADN genómico durante la amplificación isotérmica, y la otra porción se replica sin DNMT1 y se utiliza como control no metilado.

Se necesitan procedimientos mejorados para detectar residuos de 5-hidroximetilcitosina en el ADN. En particular, se necesitan procedimientos que puedan discriminar entre 5meC y 5hmC, así como procedimientos que puedan identificar 5meC y 5hmC con una resolución de base única.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar citosina 5-hidroximetilada en un ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar a un ácido nucleico que está hemimetilado, comprendiendo dicho ácido nucleico citosina, (i) una cadena parental que comprende citosina 5-hidroximetilada y (ii) una cadena hija que no está metilada ni hidroximetilada; b) tratar dicho ácido nucleico con una enzima que añade un grupo metilo a la cadena hija, en donde dicha enzima no añade un grupo hidroximetilo a dicha cadena hija; c) tratar dicho ácido nucleico para convertir la citosina no modificada en uracilo o timidina; d) secuenciar dicha cadena hija; y e) comparar una secuencia de dicha cadena hija con una referencia para detectar citosina 5-hidroximetilada.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática de ciertas realizaciones de la presente invención, que aplica la conversión con bisulfito y la secuenciación del ADN no tratado "A" que se utilizará como referencia, ya que detectará el total de 5meC y 5hmC. El procedimiento implica un ensayo de dilución de 5hmC, diluyendo 5hmC en el conjunto total de fragmentos de ADN, mientras se mantiene 5meC. Esta dilución se logra a través de rondas secuenciales de un ciclo de amplificación (dilución) por PCR y tratamiento del ADN con la metiltransferasa DNMT1 de mantenimiento de ADN, que mantiene enzimática y específicamente la 5meC agregando un grupo metilo únicamente a la cadena no metilada de los productos de<p>C<r>hemimetilados (esta muestra se denomina "B" en la Figura 1). Después de unas cuantas rondas de este ensayo, aplicamos la conversión con bisulfito y la secuenciación de la muestra de ADN tratada, B. Las bases que se leen como citosina de esta muestra deben haber sido protegidas contra la conversión con bisulfito debido a la 5meC y no al 5hmC. Al comparar "B" con la muestra "A" de referencia podemos detectar fácilmente todas las posiciones de base que contienen 5hmC.

Figura 2. La conversión de ADN con bisulfito da como resultado la conversión de citosina (C) no modificada en uracilo (U), que se leerá como timina (T) tras la secuenciación del ADN amplificado por PCR. Tanto 5meC como 5hmC están protegidos contra la conversión y no se convertirán en U. Por lo tanto, ambas bases se leerán como C durante la secuenciación. La conversión con bisulfito es una tecnología bien establecida, que durante mucho tiempo se ha considerado como el estándar de oro para la detección de 5meC, y no fue hasta hace poco (2010) que se informó en la literatura científica que la conversión con bisulfito no puede distinguir entre 5meC y 5hmC.

Figura 3. La DNMT1 de ratón, la DNMT1 humano y M. Sssl metilan preferiblemente el ADN hemi-5meC. Se incubaron 100 ng de cada sustrato de ADN con 2 unidades de DNMT1 de ratón, DNMT1 humana o metiltransferasa Sssl como se describe en la sección "Materiales y procedimientos".

Figura 4. Validación de la viabilidad del ensayo de dilución de 5hmC. (A) El oligo de ADN de cadena doble utilizado en la validación contiene tres sitios CpG donde uno es hemi para 5meC, un segundo no tiene modificación y un tercero es hemi para 5hmC. (B) La conversión con bisulfito y la secuenciación de la cadena inferior no modificada del oligo en (A), cuando el oligo no ha sido sometido al tratamiento con DNMT1, mostraron que todas las Cs se convirtieron y se leyeron como T (100 % T es igual a 16 de los 16 clones individuales que se leen como T en la posición C del sitio CpG). (C) El tratamiento con DNMT1 antes de la conversión con bisulfito y la secuenciación resultaron en la adición de un grupo metilo a la C no metilada del hemi del sitio CpG para 5meC en el 87.5 % de los oligos. (La secuenciación leyó una C en la posición C del sitio CpG en 14 de 16 clones). No se observó adición de un grupo metilo frente a C o 5hmC.

Figura 5. Presentación esquemática del procedimiento para la identificación distintiva de 5hmC y 5meC en resolución específica de base. (A) Un esquema que sigue las bases C de los sitios CpG de un oligo ADNds que contiene tres sitios CpG, donde uno tiene 5meC en ambas cadenas, un segundo no tiene ninguna modificación y un tercero tiene 5hmC en ambas cadenas. Los sitios CpG se siguen a través de una ronda de PCR (fusión, hibridación de cebador y elongación) y tratamiento con DNMT1, antes de la visualización del tratamiento con bisulfito y PCR (30 ciclos) que genera las bases que se leerán en la secuenciación. (B) Diagrama de flujo del procedimiento experimental involucrado en el ensayo de dilución de 5hmC.

Figura 6. Mantenimiento preferencial de 5meC sobre 5hmC. El oligo ADN de cadena doble utilizado aquí contiene tres sitios CpG, uno que tiene 5meC en ambas cadenas, un segundo sin modificación y un tercero que tiene 5hmC en ambas cadenas. (A) La conversión con bisulfito y la secuenciación del oligo no tratado mostraron que solo las Cs modificadas estaban protegidas de ser convertidas (100 % tanto para 5meC como para 5hmC), mientras se convirtieron todas las citosinas no modificadas. (B) Al someter el oligo ADN de cadena doble a tres rondas de ensayo de dilución, que incluyó PCR y tratamiento con DNMT1, antes de la conversión con bisulfito y la secuenciación, resultó en mantenimiento preferencial de 5meC sobre 5hmC. No hubo metilación de 5hmC en ninguna de las tres rondas, ya que las cadenas modificadas iniciales de 5hmC representaron solo el 9 % del conjunto total después de tres rondas del ensayo de dilución. (Se esperaría 50 % después de una ronda, 25 % después de dos rondas y 12.5 % después de tres rondas, cuando no hay mantenimiento en absoluto). La base 5meC se mantuvo preferiblemente, lo que dio como resultado una mayor cantidad de Cs protegidas en la conversión con bisulfito y una lectura significativamente mayor que la base 5hmC. No se observó adición de un grupo metilo ni en C ni en 5hmC.

Figura 7. Presentación esquemática del procedimiento para la identificación distintiva de 5hmC y 5meC en una resolución específica de base, haciendo uso de la evaluación específica de cadena. (A) Un esquema que sigue las bases C de los sitios CpG de un oligo ADNds que contiene tres sitios CpG, donde uno tiene 5meC en ambas cadenas, un segundo no tiene ninguna modificación y un tercero tiene 5hmC en ambas cadenas. Los sitios CpG son seguidos a través de una ronda de PCR de extensión de cebador específico de cadena (fusión, hibridación de cebador y elongación) y tratamiento con DNMT1. El cebador utilizado puede contener una baliza de biotina u otra baliza, para permitir la selección/aislamiento de la cadena recién sintetizada. La cadena recién sintetizada se somete a un tratamiento con bisulfito y a una PCR (30 ciclos u otro número) que genera las bases que se leerán en la secuenciación. (B) Diagrama de flujo del procedimiento experimental involucrado en el ensayo de dilución/pérdida de 5hmC aplicando extensión de cebador y evaluación específica de cadena.

Figura 8. Secuencia de aminoácido para DNMT1 (Mus musculus) Recombinante Número de Acceso: Banco Genético: AAH53047.1 (SEQ ID NO: 1).

Figura 9. Secuencia de aminoácidos para DNMT1 (Homo sapiens) Número de acceso: Banco Genético: AAI44094.1 (SEQ ID NO: 2).

Figura 10. Secuencia de aminoácidos para M.Sss1 (Spiroplasmasp. (cepa MQ1)) metiltransferasa de ADN de sitio específico (SEQ ID NO:3).

Figura 11. Representación esquemática de un ensayo de pérdida de 5hmC de la presente invención, que utiliza cebadores biotinilados y perlas de captura de estreptavidina. El panel derecho, arriba, muestra resultados de secuenciación representativos de 10 clones para el ensayo con bisulfito convencional, denominado A, donde tanto 5meC como 5hmC se leerán como citosina después del tratamiento, y resultados de secuenciación de 10 clones para el ensayo de transferencia de metilo/ensayo de pérdida de 5hmC, denominado B, donde solo 5meC se leerá como citosina después del tratamiento. Las citosinas en un contexto (CpG) de secuencia CG protegidas de la conversión con bisulfito, se ilustran como círculos rellenos mientras las citosinas en un contexto de secuencia CG que experimentan desaminación a Uracilo en el tratamiento con bisulfito, se ilustran como círculos abiertos. La combinación de los datos del ensayo con bisulfito estándar, A, donde tanto 5meC como 5hmC se leerán como citosina después del tratamiento y el ensayo de transferencia de metilo, B, donde solo 5meC se leerá como citosina después del tratamiento, permite la determinación de la posición y la cantidad de 5hmC, a partir del simple cálculo: A-B = 5hmC. Esta cuantificación se describe en la parte inferior del panel derecho. Estos resultados experimentales se han reproducido en 15 experimentos independientes.

Figura 12. Esquema y gráficos que muestran la identificación de dos islas CpGs que contienen 5hmC, es decir, 5hmC en una secuencia CG, en el gen TRIM31 en el ADN del cerebro humano utilizando el ensayo representado en la Figura 11. Las posiciones de los CpGs se representan esquemáticamente (no a escala) y la cantidad de 5hmC y 5meC en esas posiciones para citosina se dan en los gráficos de barras.

Figura 13. Gráfico de barras que muestra los resultados de un experimento en el que se bloquea la metiltransferasa mediante la adición de un grupo químico a 5hmC.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen una serie de términos y frases:

Como se utiliza en el presente documento, el término "sensibilidad" se define como una medida estadística del rendimiento de un ensayo (por ejemplo, procedimiento, prueba), calculada dividiendo el número de positivos verdaderos por la suma de los positivos verdaderos y los negativos falsos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "especificidad" se define como una medida estadística del rendimiento de un ensayo (por ejemplo, procedimiento, prueba), calculada dividiendo el número de negativos verdaderos por la suma de negativos verdaderos y positivos falsos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "informativo" o "informatividad" se refiere a una cualidad de un marcador o panel de marcadores, y específicamente a la probabilidad de encontrar un marcador (por ejemplo, marcador epigenético; por ejemplo, 5hmC en una o más ubicaciones particulares) en una muestra positiva.

Como se utiliza en el presente documento, el término "dilución" se refiere a la reducción de residuos de citosina no modificados con 5-metilo (por ejemplo, residuos de 5-hidroximetil citosina) en una muestra de ácido nucleico, en comparación con los residuos de 5-metil citosina, a través de rondas repetidas de replicación de dicha muestra de ADN.

Como se utiliza en el presente documento, el término "residuos de citosina modificados que no son 5-metil citosina" se refiere a residuos de citosina modificados distintos de la 5-metil citosina, por ejemplo, 5-hidroximetil citosina, b-glu-5-hidroximetil citosina, 5-formil-citosina y 5-carboxicitosina.

Como se utiliza en el presente documento, el término "isla CpG" se refiere a una región de ADN genómico que contiene un alto porcentaje de sitios CpG, en relación con la incidencia promedio de CpG genómico (por la misma especie, por el mismo individuo o por subpoblación (por ejemplo, cepa, subpoblación étnica o similar). Existen diversos parámetros y definiciones para las islas CpG; por ejemplo, en algunas realizaciones, las islas CpG se definen como aquellas que tienen un porcentaje de GC mayor que el 50 % y con una relación CpG observada/esperada mayor que el 60 % (Gardiner-Garden et al. (1987) J Mol. Biol. 196:261-282; Baylin et al. (2006) Nat. Rev. Cancer 6:107-116; Irizarry et al. (2009) Nat. Genetics 41:178-186). En algunas realizaciones, las islas CpG pueden tener un contenido de GC >55 % y CpG observado/CpG esperado de 0.65 (Takai et al.

(2007) PNAS 99:3740-3745). También existen diversos parámetros respecto a la longitud de las islas CpG. Como se utiliza en el presente documento, las islas CpG pueden tener menos de 100 pb; 100-200 pb, 200-300 pb, 300-500 pb, 500-750 pb; 750-1000 pb; 1000 o más pb de longitud. En algunas realizaciones, las islas CpG muestran patrones de metilación alterados (por ejemplo, patrones de 5hmC alterados) en relación con los controles (por ejemplo, metilación de 5hmC alterada en sujetos con cáncer, en relación con sujetos sin cáncer; patrones de 5hmC alterados específicos de tejido; patrones de 5hmC alterados en muestras biológicas de sujetos con una neoplasia o un tumor, en relación con sujetos sin una neoplasia o un tumor. En algunas realizaciones, la metilación alterada implica una mayor incidencia de 5hmC. En algunas realizaciones, la metilación alterada implica una menor incidencia de 5hmC.

Como se utiliza en el presente documento, el término "costa de CpG" o "costa de isla de CpG" se refiere a una región genómica externa a una isla de CpG, que tiene o tiene potencial de tener patrones de metilación (por ejemplo, 5hmC) alterados (véase, por ejemplo, Irizarry et al. (2009) Nat. Genetics 41:178-186). Las costas de isla CpG pueden mostrar patrones de metilación (por ejemplo, 5hmC) alterados en relación con los controles (por ejemplo, 5hmC alterado en sujetos con cáncer en relación con sujetos sin cáncer; patrones de 5hmC alterados específicos de tejido; 5hmC alterado en muestras biológicas de sujetos con neoplasia o tumor, en relación con sujetos sin neoplasia o tumor. En algunas realizaciones, la metilación alterada implica una mayor incidencia de 5hmC. En algunas realizaciones, la metilación alterada implica una menor incidencia de 5hmC. Las costas de isla CpG pueden estar ubicadas en diversas regiones en relación con las islas CpG (véase, por ejemplo, Irizarry et al. (2009) Nat. Genetics 41;178-186). En consecuencia, en algunas realizaciones, las costas de isla CpG se ubican a menos de 100 pb; 100-250 pb; 250-500 pb; 500-1000 pb; 1000-1500 pb; 1500-2000 pb; 2000-3000 pb; 3000 pb o más de distancia de una isla CpG.

Como se utiliza en el presente documento, el término "metástasis" se refiere al proceso en el cual las células cancerosas que se originan en un órgano o parte del cuerpo se reubican en otra parte del cuerpo y continúan replicándose. Las células metastásicas posteriormente forman tumores que pueden hacer metástasis aún más. La metástasis se refiere a la propagación del cáncer desde la parte del cuerpo donde se produjo originalmente, a otras partes del cuerpo.

Como se utiliza en el presente documento, "se sospecha que un individuo es susceptible a padecer cáncer metastásico" se refiere a un individuo que tiene un riesgo superior al promedio, de desarrollar cáncer metastásico. Ejemplos de individuos con un riesgo particular de desarrollar cáncer de un tipo particular (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de próstata) son aquellos cuyos antecedentes médicos familiares indican una incidencia superior a la media de ese tipo de cáncer entre los miembros de la familia y/o aquellos que ya han desarrollado cáncer y han recibido un tratamiento efectivo y, por lo tanto, enfrentan un riesgo de recaída y recurrencia. Otros factores que pueden contribuir a un riesgo superior al promedio de desarrollar cáncer metastásico, que llevaría a la clasificación de un individuo como sospechoso de ser susceptible al cáncer metastásico, pueden basarse en los antecedentes y características genéticas, médicas y/o conductuales específicos del individuo.

El término "neoplasma", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier crecimiento nuevo y anormal de tejido. Así pues, un neoplasma puede ser un neoplasma premaligno o un neoplasma maligno. El término "marcador específico de neoplasma" se refiere a cualquier material biológico que pueda utilizarse para indicar la presencia de un neoplasma. Los ejemplos de materiales biológicos incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos, polipéptidos, carbohidratos, ácidos grasos, componentes celulares (por ejemplo, membranas celulares y mitocondrias) y células enteras.

Como se utiliza en el presente documento, el término "amplicón" se refiere a un ácido nucleico generado utilizando pares de cebador. El amplicón es típicamente ADN de cadena simple (por ejemplo, el resultado de una amplificación asimétrica), aunque también puede ser ARN o ADNds.

El término "amplificar" o "amplificación", en el contexto de los ácidos nucleicos, se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o una porción del polinucleótido, típicamente a partir de una pequeña cantidad del polinucleótido (por ejemplo, una sola molécula de polinucleótido), donde los productos de amplificación o amplicones son generalmente detectables. La amplificación de polinucleótidos abarca una variedad de procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula de ADN objetivo o patrón durante una reacción (PCR) en cadena de la polimerasa o una reacción en cadena de la ligasa (LCR; véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,494,810) son formas de amplificación. Otros tipos de amplificación incluyen, pero sin limitarse a, PCR específica de alelos (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,639,611),<p>C<r>de ensamble (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,965,408), amplificación dependiente de helicasa (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. No.

7,662,594), PCR de inicio en caliente (véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. No. 5,773,258 y 5,338,671), PCR intersecuencial específica, PCR inversa (véase, por ejemplo, Triglia, et al. (1988) Nucleic Acids Res.

16:8186), PCR mediada por ligadura (véase, por ejemplo, Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997)); Patente de EE.UU. No. 5,508,169), PCR específica de metilación (véase, por ejemplo, Herman, et al., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826), PCR con minicebador, amplificación de sonda dependiente de ligación multiplex (véase, por ejemplo, Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57), PCR multiplex (véase, por ejemplo, Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio, et al., (l990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden et al. (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR de superposición-extensión (véase, por ejemplo, Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367), PCR en tiempo real (véase, por ejemplo, Higuchi, et al., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030),<p>C<r>de transcripción inversa (véase, por ejemplo, Bustin, SA (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193), PCR en fase sólida, PCR entrelazada asimétrica térmica y PCR de aterrizaje (ver, por ejemplo, Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812 814; Hecker, et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485). La amplificación de polinucleótidos también se puede lograr mediante PCR digital (ver, por ejemplo, Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci<e>E. UU. 96; 9236-41, (1999); Publicación de patente internacional No. WO05023091A2; Publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 20070202525).

Como se utilizan en el presente documento, los términos "complementario" o "complementariedad" se utilizan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-A-G-T-3'," es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A-5'." La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden según las reglas de apareamiento de bases. O, puede haber complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos en la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea que ocurra de forma natural como en un producto de digestión de restricción purificado o se produzca sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor como un biocatalizador (por ejemplo, una ADN polimerasa o similar) y a una temperatura y pH adecuados). El cebador es típicamente de cadena simple para lograr la máxima eficiencia en la amplificación, pero también puede ser de cadena doble. Si es de cadena doble, generalmente se trata primero el cebador para separar sus cadenas antes de usarse para preparar productos de extensión. En algunas realizaciones, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador es lo suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión, en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y el uso del procedimiento. En ciertas realizaciones, el cebador es un cebador de captura.

Como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula que contenga ácido nucleico, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos conocidos de bases de ADN y ARN, incluyendo, pero no limitado a, 4 acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, b-glucosil-5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxicitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

Como se utiliza en el presente documento, el término "nucleobase" es sinónimo de otros términos en uso en la técnica, incluyendo "nucleótido," "desoxinucleótido," "residuo de nucleótido," "residuo de desoxinucleótido," " trifosfato de nucleótido (NTP)" o trifosfato (dNTP) de desoxinucleótido.

Un "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos), típicamente más de tres unidades monoméricas y, más típicamente, más de diez unidades monoméricas. El tamaño exacto de un oligonucleótido generalmente depende de diversos factores, incluyendo la función o el uso final del oligonucleótido. Para ilustrarlo mejor, los oligonucleótidos tienen típicamente menos de 200 residuos de longitud (por ejemplo, entre 15 y 100), sin embargo, como se utiliza en el presente documento, el término también pretende abarcar cadenas de polinucleótidos más largas. Los oligonucleótidos son denominados frecuentemente por su longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos se denomina "24-mero". Típicamente, los monómeros de nucleósido están unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos, incluyendo fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares, incluyendo contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, Na+, y similares, si tales contraiones están presentes. Además, los oligonucleótidos tienen típicamente cadena simple. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación de ADN, la transcripción inversa, la clonación y la digestión por restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un procedimiento tal como el procedimiento del fosfotriéster. Narang et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99; el procedimiento del fosfodiéster Brown et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151; el procedimiento de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; el procedimiento del triéster Matteucci et al. (1981) J Am Chem Soc.

103:3185-3191; procedimientos de síntesis automatizados; o el procedimiento de soporte sólido de Patente de EE.UU. No. 4,458,066, titulado "PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES", expedido el 3 de julio de 1984 a Caruthers et al., u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Una "secuencia" de un biopolímero se refiere al orden y la identidad de las unidades monoméricas (por ejemplo, nucleótidos, etc.) en el biopolímero. La secuencia (por ejemplo, la secuencia de bases) de un ácido nucleico se lee típicamente en la dirección 5' a 3'.

Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal(por ejemplo,un mamífero), incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que será el receptor de un tratamiento en particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento, en referencia a un sujeto humano.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, a Rn (por ejemplo, incluyendo pero no limitado a, ARNm, ARNt y ARNr) o precursor. El polipéptido, ARN o precursor puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante, en tanto se retengan la actividad o las propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, actividad enzimática, unión de ligando, transducción de señal, etc.) de la longitud completa o del fragmento. El término también abarca la región codificante de un gen estructural y las secuencias que la incluyen, ubicadas adyacentes a la región codificante en los extremos 5' y 3' por una distancia de aproximadamente 1 kb en cada extremo, de modo que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias que se encuentran a 5' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que se encuentran 3' o corriente abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm, se denominan secuencias 3' no traducidas. El término "gen" abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante, interrumpida con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores como potenciadores. Los intrones se retiran o se "rebanan" de la transcripción nuclear o primaria; por lo tanto, los intrones están ausentes en la transcripción procesada del ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a procedimientos para la detección de 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN). En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a la detección de 5hmC en ADN genómico, por ejemplo, ADN genómico de mamíferos. Los procedimientos actuales disponibles para identificar 5hmC tienen un límite de resolución de aproximadamente 50-200 pares de bases. Muchos de los procedimientos actuales están limitados por el paso de conversión con bisulfito, que no puede distinguir entre 5-metilcitosina (5meC) y 5hmC. La presente invención aborda ambos problemas. Primero, la presente invención permite la discriminación entre las modificaciones 5meC y 5hmC del ADN. Segundo, la presente invención permite la detección tanto de 5meC como de 5hmC con una resolución de base única.

El procedimiento descrito aquí identifica 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en el ADN con resolución de base única. Además, este procedimiento puede identificar 5meC en una resolución de base específica simultáneamente con 5hmC. El procedimiento empleado aprovecha el hecho de que la metiltransferasa DNMT1 no puede metilar a través de una 5hmC (o 5hmC modificado; como es el caso de la p-glucosil-5-hidroximetilcitosina) y metila preferiblemente a través de 5-metilcitosina (5meC). Después de rondas secuenciales de un ciclo de amplificación por PCR y tratamiento del ADN con DNMT1, la población de ADNs que contiene 5hmC se diluye por un factor de dos, mientras la población que contiene 5meC permanece estable. Esta dilución acoplada con la conversión con bisulfito permite la identificación específica de bases de los residuos de ADN que contienen 5hmC (Figura 1).

La conversión de ADN con bisulfito da como resultado la conversión de citosina (C) no modificada en uracilo (U) que se leerá como timina (T), tras la secuenciación del ADN amplificado por PCR. Tanto 5meC como 5hmC están protegidos contra la conversión y no se convertirán en U. Por lo tanto, ambos se leerán como C durante la secuenciación (ver Figura 2). La conversión con bisulfito es una tecnología bien establecida que durante mucho tiempo ha sido considerada como el estándar de oro para la detección de 5meC, y no fue hasta hace poco (2010) que se reportó en la literatura científica, que no puede distinguir entre 5meC y 5hmC30. Sin embargo, el procedimiento descrito aquí aprovecha este hecho para crear un conjunto de datos de referencia (denominado "A" en la Figura 1).

En la presente invención, 5hmC se diluye en el conjunto total de ADN mientras se mantiene 5meC. Esta dilución se logra a través de rondas secuenciales de un ciclo de amplificación por PCR y tratamiento del ADN con la metiltransferasa DNMT1 de mantenimiento de ADN, que mantiene enzimática y específicamente 5meC solo agregando un grupo metilo a la cadena no metilada de los productos de PCR hemimetilados (esta muestra se denomina "B" en la Figura 1). Después de una o más rondas de este ensayo, se realiza la conversión con bisulfito seguida de la secuenciación de la muestra de ADN tratada, donde 5meC ahora es la modificación predominante. Se contempla que todas o la mayoría de las bases leídas como C de esta muestra deben haber sido protegidas contra la conversión debida a 5meC y no a 5hmC. Comparándolo con la muestra "A" de referencia es posible detectar todas las posiciones de base que contienen 5hmC. La dilución puede lograrse a nivel de todo el genoma o respecto a un locus genético particular o a una porción de un gen. En realizaciones preferidas, la región de dilución está definida por cebadores utilizados para la replicación y/o amplificación de una región objetivo de interés.

De acuerdo con ello, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona procesos para detectar o determinar el estado de 5hmC de una muestra de ácido nucleico y, en realizaciones particularmente preferidas, el estado de 5hmC o una región predeterminada de una muestra de ADN genómico. En algunas realizaciones preferidas, la región predeterminada (o región objetivo de interés) corresponde a un locus genético de interés o a una porción de un gen. En algunas realizaciones, la región predeterminada está definida por cebadores de ácido nucleico utilizados para la replicación o amplificación de la región predeterminada.

En algunas realizaciones preferidas, la muestra de ácido nucleico se divide en al menos dos porciones para su posterior análisis. La primera porción se replica en condiciones tales que los residuos de citosina 5-metilada se mantienen y los residuos de citosina 5-hidroximetilada se diluyen. La presente invención no está limitada a ningún nivel particular de dilución. Por ejemplo, los residuos de citosina 5-hidroximetilada pueden diluirse por un factor de 1.5, 2, 5, 10, 20, 40, 100, 200, 400, 800, 1600 o más.

De acuerdo con la invención, la dilución de los residuos de citosina 5-hidroximetilada se logra replicando el ácido nucleico (preferiblemente replicando la región predeterminada) con una polimerasa, para proporcionar ácido nucleico replicado y luego tratando el ácido nucleico replicado con una enzima que agrega un grupo metilo a la cadena no metilada del ácido nucleico hemimetilado, pero que no agrega un grupo hidroximetilo a la cadena no hidroximetilada del ácido nucleico hemihidroximetilado. La presente invención no se limita al uso de ninguna enzima en particular. En algunas realizaciones, la enzima es una enzima que mantiene el estado de metilación del ADN de un ácido nucleico, por ejemplo, una metiltransferasa (DNMT) de ADN. Los ejemplos de metiltransferasas de ADN incluyen, pero sin limitarse a, DNMT1 de ratón (<s>E<q>ID NO:1; Figura 7), D<n>M<t>1 humana (SEQ ID NO:2, Figura 8) o D<n>M<t>de M.Sssl(Spiroplasmasp.) (SEQ ID NO:3, Figura 9), o un homólogo o variante de ellas. En algunas realizaciones, los homólogos o variantes tienen la actividad de agregar un grupo metilo a la cadena no metilada de un ácido nucleico hemimetilado. En algunas realizaciones, los homólogos o variantes tienen al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad con las SEQ ID NO: 1, 2 0 3 y/o tienen la actividad de agregar un grupo metilo a la cadena no metilada de un ácido nucleico hemimetilado.

En algunas realizaciones, el paso de replicación se realiza a través de una o más rondas de reacción en cadena de la polimerasa. En realizaciones preferidas, una región predeterminada se replica mediante extensión a partir de cebadores de ácido nucleico que definen los límites 5' y 3' de la región predeterminada. Luego, el ácido nucleico replicado se trata con una enzima de metilación de ADN, como se describió anteriormente, para mantener la metilación de 5-metilcitosina de la región predeterminada y luego se repite el proceso hasta que se logra un nivel deseado de dilución de residuos de citosina 5-hidroximetilada, en comparación con los residuos 5-metilados. En algunas realizaciones, el nivel de dilución por ciclo es preferiblemente aproximadamente el doble, pero puede ser tan bajo como 1.1. En algunas realizaciones, el nivel de mantenimiento de los residuos de 5-metilcitosina es de aproximadamente 100 %, pero puede ser tan bajo como 10 % y todavía proporcionar una determinación de y discriminación efectivas entre los residuos de 5meC y 5hmC en la región predeterminada. En algunas realizaciones, el número de ciclos de replicación y tratamiento con la enzima de metilación de ADN puede ser de 1, 2, 3, 5, 7, 10 o 20 ciclos o más, o entre aproximadamente 1 y 20 ciclos.

En algunas realizaciones, se utilizan cebadores marcados en el paso de replicación, para que los productos de extensión marcados del paso de replicación puedan aislarse utilizando un reactivo de unión de balizas y usarse en pasos posteriores, como para el tratamiento con una metiltransferasa de ADN. En realizaciones preferidas, solo las cadenas recién sintetizadas (es decir, las cadenas marcadas por el cebador marcado) se utilizan y analizan en los pasos posteriores. La Figura 11 proporciona una representación esquemática del uso de cebadores marcados en el proceso. En esta figura, "A" muestra el ensayo convencional de conversión y secuenciación con bisulfito, y "B" muestra el ensayo dependiente de metiltransferasa. Como se muestra en el panel izquierdo para el ensayo "B", el uso de la extensión del cebador a partir de un cebador biotinilado y el aislamiento posterior con perlas de estreptavidina, garantiza que todas las cadenas inferiores en el análisis serán de las recién sintetizadas. Por lo tanto, al realizar el tratamiento con DNMT1 (u otra metiltransferasa) y luego analizar las cadenas inferiores aisladas con biotina-estreptavidina, se obtendrá una cuantificación directa y precisa del nivel de 5meC de la cadena complementaria. El panel derecho, arriba, muestra resultados de secuenciación representativos de 10 clones para el ensayo con bisulfito estándar, "A", donde tanto 5meC como 5hmC se leerán como citosina después del tratamiento, y resultados de secuenciación representativos de 10 clones para el ensayo "B" de transferencia de metilo, donde solo 5meC se leerá como citosina después del tratamiento. La combinación de los datos del ensayo con bisulfito estándar, "A", donde tanto 5meC como 5hmC se leerán como citosina después del tratamiento y el ensayo de transferencia de metilo "B", donde solo 5meC se leerá como citosina después del tratamiento, permite la determinación de la posición y la cantidad de 5hmC (a partir del cálculo simple: A-B = 5hmC). Esta cuantificación se describe en la parte inferior del panel derecho. Para las réplicas experimentales con este resultado cuantitativo exacto tenemos n = 15.

La presente invención no se limita al uso de ningún cebador marcado o reactivo de unión a baliza en particular, para el aislamiento del cebador marcado. En algunas realizaciones preferidas, el cebador está biotinilado y el reactivo de unión a la baliza es un reactivo de estreptavidina, tal como una perla de estreptavidina. Las cadenas de ácido nucleico replicadas que comprenden el cebador biotinilado (es decir, el producto de extensión del cebador resultante de la extensión del cebador biotinilado) se aíslan poniendo en contacto las cadenas con las perlas de estreptavidina. Se puede utilizar cualquier combinación de cebador marcado y reactivo de unión a baliza. Otros ejemplos adecuados incluyen cebadores haptenilados y perlas u otros reactivos que comprenden un anticuerpo u otra proteína de unión a antígeno que se une al hapteno. Los haptenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, pirazoles, particularmente nitropirazoles; compuestos de nitrofenilo; benzofurazanos; triterpenos; ureas y tioureas, particularmente fenilureas, e incluso más particularmente feniltioureas; rotenona y derivados de rotenona, también denominados en el presente documento rotenoides; oxazol y tiazoles, particularmente oxazol y tiazol sulfonamidas; cumarina y derivados de cumarina; ciclolignanos, ejemplificados por Podofilotoxina y derivados de Podofilotoxina; y combinaciones de los mismos. Los ejemplos específicos de haptenos incluyen, pero sin limitarse a, 2,4-Dintrofenilo (DNP), Biotina, derivados de Fluoresceína (FITC, TAMRA, Rojo Texas, etc.), Digoxigenina (DIG), 5-Nitro-3-pirozolcarbamida (nitropirazol, NP), 4,5,-Dimetoxi-2-nitrocinamida (nitrocinamida, NCA), 2-(3,4-Dimetoxifenil)-quinolina-4-carbamida (fenilquinolona, DPQ), 2,1,3-Benzoxadiazol-5-carbamida (benzofurazano, BF), 3-Hidroxi-2-quinoxalinacarbamida (hidroxiquinoxalina, HQ), 4-(Dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), Rotenona isoxazolina (Rot), (E)-2-(2-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-4-il)fenozi)acetamida (benzodiazepina, BD), ácido 7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromeno-3-carboxílico (cumarina 343, CDO), 2-Acetamido-4-metil-5-tiazolsulfonamida (tiazolsulfonamida, TS) y p-Metoxifenilpirazopodofilamida (Podo).

En algunas realizaciones, los grupos 5hmC en la muestra se modifican con un grupo de bloqueo, para aumentar la relación de la eficiencia de la metiltransferasa entre 5meC y 5hmC. Como se utiliza en el presente documento, un "grupo de bloqueo" es cualquier grupo químico que se puede agregar a 5hmC (o citosina en la posición de carbono 5) que hace que el grupo total sea demasiado grande o esté desfavorablemente cargado para el bolsillo de la metiltransferasa de ADN y, por lo tanto, bloquea la actividad de una metiltransferasa de ADN en el residuo 5hmC. Se contempla que el uso de grupos de bloqueo aumenta la relación de especificidad y/o eficiencia de la metiltransferasa DNMT1, para catalizar la transferencia de un grupo metilo a través de una 5meC y una 5hmC en ADNds. La presente invención no se limita al uso de ningún grupo de bloqueo particular. Los grupos de bloqueo adecuados incluyen, pero sin limitarse a, Glucosa (beta-glucosa y alfa-glucosa); Gentiobiosa (6-O-p-D-glucopiranosil-D-glucosa) (y cualquier otro estereoisómero, el enlace alfa también es posible: 6-O-alfa-D-glucopiranosil-D-glucosa); ceto-glucosa; azida-glucosa (por ejemplo, N3Glucosa); un grupo químico unido a la glucosa o azida-glucosa mediante, por ejemplo, química clic, por ejemplo, biotina (biotina-N3Glucosa-5hmC); JBP1 (proteína 1 de unión a J) unida a glu-5hmC (versiones de longitud completa y truncada); las proteínas TET (por ejemplo, TET1, TET2 y TET3) (versiones de longitud completa y truncada) se unen a 5hmC; otras proteínas de unión a 5hmC o Glu-5hmC y/o dominios de unión a proteínas; (versiones nativa y entrecruzada de proteínas); cualquier producto de oxidación de glucosa o glucosa modificada, por ejemplo, glucosa oxidada con peryodato; cualquier grupo químico que pueda reaccionar con la glucosa oxidada para unirse a la glucosa o modificarla; y cualquier proteína o complejo proteico que pueda identificar específicamente 5meC, 5hmC y variantes modificadas de estas bases (por ejemplo, JBP1 y proteínas de la clase MBP (por ejemplo, MBP1 y MeCP2)).

Sin bloqueo, es posible lograr una transferencia de metilo de 100 % frente a 0 % frente a 0 % a través de 5meC, C y 5hmC respectivamente, aunque el procedimiento también es aplicable a una transferencia de metilo de menos de 100 % a través de 5meC y de más del 0 % a través de C y 5hmC. En tales casos, se puede obtener una mayor precisión en la cuantificación, cuando se añade un control conocido a la muestra, para poder determinar la eficiencia dentro de la muestra. Con el bloqueo es posible lograr una transferencia de metilo del 100 % frente a 0 % frente a 0 % a través de 5meC, C y 5hmC respectivamente, aunque el procedimiento también es aplicable a una transferencia de metilo de menos de 100 % a través de 5meC y transferencia de más del 0 % a través de C y 5hmC. El bloqueo puede ser útil para el ensayo "estándar", ya que permitirá lograr de manera más robusta 100 % frente a 0 % frente a 0 % con el ensayo con DNMT1 con una tasa de éxito mayor, en comparación con sin bloqueo.

Con el bloqueo, se puede lograr una transferencia de metilo de 100 % frente a 100 % frente a 0 % a través de 5meC, C, 5hmC respectivamente para M.Sssl (o DNMT1, preferiblemente un exceso molar grande de DNMT1). La metilación a través de 5meC y C es una vía alternativa para transferir la información del estado de modificación de la cadena progenitora a la cadena extendida del cebador/replicada, para ayudar a identificar las posiciones y cantidades de 5meC, 5hmC y C. Esto puede permitir la lectura directa de 5hmC como citosinas no modificadas que no están protegidas de la conversión con bisulfito o, en comparación con la conversión estándar con bisulfito, y la secuenciación puede revelar información cuantitativa para 5meC, C y 5hmC en la secuencia de ácido nucleico. Esto permitirá que el cálculo simple revele la posición y cantidad de cada uno de 5meC, C y 5hmC.

Es probable que se pueda lograr la identificación de 5meC, 5hmC y C si se realiza el bloqueo en los residuos 5hmC y C. Los agentes bloqueadores de los residuos de citosina podrían ser, por ejemplo, proteínas que contengan motivos CXXC o cualquier proteína o fragmento de la misma que pueda unirse a CpG no modificado.

En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico diluido con 5hmC y una porción sin diluir, se tratan para convertir residuos de citosina no modificada en residuos de timidina. En realizaciones preferidas, las porciones se tratan con bisulfito para convertir residuos de citosina no modificada, en residuos de uracilo. Luego, el ácido nucleico tratado con bisulfito se replica con una polimerasa para convertir dichos residuos de uracilo en residuos de timidina. En algunas realizaciones, el paso de replicación se realiza a través de una o más rondas de reacción en cadena de la polimerasa (vea, por ejemplo, las Figuras 1 y 5) o reacción de extensión del cebador (vea, por ejemplo, la Figura 5). En realizaciones preferidas, una región predeterminada se replica mediante extensión a partir de cebadores de ácido nucleico que definen los límites 5' y 3' de la región predeterminada. En algunas realizaciones, el número de ciclos de replicación puede ser mayor que 2, 3, 5, 7, 10 o 20 ciclos o entre aproximadamente 2 y 20 ciclos.

El proceso descrito en los párrafos anteriores proporciona dos porciones de ácido nucleico diferentes. En la primera porción, los residuos 5-hidroximetilados se han diluido en comparación con los residuos de citosina 5-metilada, que se han mantenido. En la segunda porción, los residuos 5-hidroximetilados no se han diluido. Cuando las porciones se tratan con bisulfito, todos los residuos de citosina no modificada se convierten en residuos de uracilo y luego en residuos de timidina, después de 1 o más rondas de replicación o extensión del cebador. En realizaciones preferidas, ambas porciones se secuencian, preferiblemente utilizando cebadores que permiten la secuenciación de la región predeterminada. En realizaciones preferidas, la comparación de las secuencias de la primera y segunda porciones permite la identificación de residuos de 5meC y 5hmC en la región predeterminada. Los residuos de 5hmC se identifican como residuos que se leen mediante secuenciación, como un residuo de timidina en la primera porción (es decir, la porción en la que se han diluido los residuos de 5hmC) y como un residuo de citosina en la posición correspondiente en la segunda porción de ácido nucleico y los residuos de 5meC se identifican como residuos que se leen como residuos de citosina, tanto en la primera como en la segunda porciones de ácido nucleico.

La secuenciación de las muestras de ácido nucleico puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los procedimientos de secuenciación adecuados incluyen, pero sin limitarse a, procedimientos de secuenciación de terminación de cadena (por ejemplo, procedimientos de secuenciación de Sanger) y procedimientos de secuenciación de ADN de próxima generación que utilizan sistemas proporcionados por Illumina (San Diego, CA), Pacific Biosciences (Menlo Park, CA) y otros. En las realizaciones que utilizan procedimientos de secuenciación de próxima generación, el paso de replicación con una polimerasa antes de la secuenciación (que convierte el residuo de uracilo en un residuo de timidina) es opcional y el residuo de uracilo puede leerse directamente.

En algunas realizaciones, los procesos descritos anteriormente se utilizan para predecir una predisposición a una enfermedad en un sujeto, diagnosticar una enfermedad en un sujeto, predecir la probabilidad de recurrencia de enfermedad en un sujeto, proporcionar un pronóstico para un sujeto con una enfermedad o seleccionar un sujeto con una enfermedad, para el tratamiento con una terapia particular. Estos procesos comprenden preferiblemente proporcionar una muestra de ADN genómico de un sujeto; y detectar el estado de metilación de regiones predeterminadas de la muestra de ADN genómico, mediante los procesos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, un nivel alterado de metilación de 5-hidroximetilcitosina (es decir, un nivel más alto o más bajo) de las regiones predeterminadas del ADN genómico respecto a un estado de metilación de referencia, proporciona una indicación seleccionada del grupo que consiste en una indicación de una predisposición del sujeto a una enfermedad, una indicación de que el sujeto tiene una enfermedad, una indicación de la probabilidad de recurrencia de una enfermedad en el sujeto, una indicación de supervivencia del sujeto y una indicación de que el sujeto es candidato para el tratamiento con una terapia particular.

De acuerdo con ello, en algunos aspectos, los procedimientos de la presente divulgación implican la determinación (por ejemplo, evaluación, constatación, cuantificación) del nivel de modificación de 5hmC de un indicador de una condición de interés, tal como un neoplasma en una muestra. Un técnico experto entiende que un nivel de modificación de 5meC y/o 5hmC aumentado, disminuido, informativo o de otro modo distinguiblemente diferente, se articula respecto a una referencia (por ejemplo, un nivel de referencia, un nivel de control, un nivel de umbral o similar). Por ejemplo, el término "nivel elevado de 5hmC o 5meC", como se utiliza en el presente documento, respecto al estado de 5hmC o 5meC de un locus genético, es cualquier nivel de 5hmC y/o 5meC que esté por encima de una mediana de nivel de 5hmC o 5meC en una muestra de una población aleatoria de mamíferos (por ejemplo, una población aleatoria de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 500 mamíferos) que no tienen un neoplasma (por ejemplo, un cáncer) u otra condición de interés. Los niveles elevados de modificación de 5meC y/o 5hmC pueden ser de cualquier nivel, siempre que el nivel sea mayor que un nivel de referencia correspondiente. Por ejemplo, un nivel elevado de 5meC y/o 5hmC de un locus de interés puede ser 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces mayor que el nivel de referencia de 5meC y/o 5hmC observado en una muestra normal. Se observa que un nivel de referencia puede ser cualquier cantidad. El término "puntuación elevada de 5meC y/o 5hmC", como se utiliza en el presente documento, respecto a eventos de 5meC y/o 5hmC detectados en un panel de matriz de marcadores de ácidos nucleicos particulares, es cualquier puntuación de 5meC y/o 5hmC que esté por encima de una mediana de puntuación de 5meC y/o 5hmC en una muestra de una población aleatoria de mamíferos (por ejemplo, una población aleatoria de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 500 mamíferos) que no tienen un neoplasma (por ejemplo, un cáncer). Una puntuación elevada de 5hmC en un panel de matriz de marcadores de ácido nucleico particulares puede ser cualquier puntuación, siempre que sea mayor que una puntuación de referencia correspondiente. Por ejemplo, una puntuación elevada de 5meC y/o 5hmC en un locus de interés puede ser 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces mayor que la puntuación de referencia de 5meC y/o 5hmC observada en una muestra normal. Se observa que una puntuación de referencia puede ser cualquier cantidad que se utilice para la comparación.

Se aplican consideraciones similares a los ensayos para detectar niveles disminuidos de modificaciones de 5hmC en una muestra, un locus objetivo, una región genómica objetivo y similares. Por ejemplo, el término "nivel disminuido de 5meC y/o 5hmC", como se utiliza en el presente documento, respecto al estado de 5meC y/o 5hmC de un locus genético, es cualquier nivel de 5meC y/o 5hmC que esté por debajo de una mediana de nivel de 5meC y/o 5hmC en una muestra de una población aleatoria de mamíferos (por ejemplo, una población aleatoria de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 500 mamíferos) que no tienen un neoplasma (por ejemplo, un cáncer). Los niveles disminuidos de modificación de 5meC y/o 5hmC pueden ser de cualquier nivel siempre que el nivel sea menor que un nivel de referencia correspondiente. Por ejemplo, un nivel disminuido de 5meC y/o 5hmC de un locus de interés puede ser 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces menor que el nivel de referencia de 5meC y/o 5hmC observado en una muestra normal. Se observa que un nivel de referencia puede ser cualquier cantidad. El término "puntuación de 5hmC disminuida", como se utiliza en el presente documento, respecto a eventos de 5meC y/o 5hmC detectados en un panel de matriz de marcadores de ácido nucleico particulares, es cualquier puntuación de 5meC y/o 5hmC que esté por debajo de una puntuación mediana de 5meC y/o 5hmC en una muestra de una población aleatoria de mamíferos (por ejemplo, una población aleatoria de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 500 mamíferos) que no tienen un neoplasma (por ejemplo, un cáncer). Una puntuación disminuida de 5meC y/o 5hmC en un panel de matriz de marcadores de ácido nucleico particulares puede ser cualquier puntuación siempre que la puntuación sea mayor que una puntuación de referencia correspondiente. Por ejemplo, una puntuación disminuida de 5meC y/o 5hmC en un locus de interés puede ser 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces menor que la puntuación de referencia de 5meC y/o 5hmC observada en una muestra normal. Se observa que una puntuación de referencia puede ser cualquier cantidad que se utilice para la comparación.

Los procedimientos no se limitan a un tipo particular de mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones, el neoplasma es premaligno. En algunas realizaciones, el neoplasma es maligno. En algunas realizaciones, el neoplasma es cáncer sin tener en cuenta la etapa (por ejemplo, etapa I, II, III o IV).

La presente invención también proporciona procedimientos y materiales para ayudar a los profesionales médicos o de investigación a determinar si un mamífero tiene o no un neoplasma (por ejemplo, cáncer). Los profesionales médicos pueden ser, por ejemplo, médicos, enfermeras, tecnólogos de laboratorio médico y farmacéuticos. Los profesionales de investigación pueden ser, por ejemplo, investigadores principales, técnicos de investigación, becarios postdoctorales y estudiantes de posgrado. Se puede ayudar a un profesional (1) determinando la proporción de 5hmC y/u otros marcadores en una muestra y (2) comunicándole información sobre la proporción, por ejemplo.

Después de reportar el nivel (por ejemplo, puntuación o frecuencia) de modificación particular de 5hmC en una muestra, un profesional médico puede tomar una o más acciones que pueden afectar la atención al paciente. Por ejemplo, un profesional médico puede registrar los resultados en el historial médico de un paciente. En algunos casos, un profesional médico puede registrar un diagnóstico de un neoplasma o transformar de otro modo el historial médico del paciente para reflejar la condición médica del paciente. En algunos casos, un profesional médico puede revisar y evaluar todo el historial médico de un paciente y evaluar múltiples estrategias de tratamiento para la intervención clínica de la condición de un paciente. En algunos casos, un profesional médico puede registrar una predicción de la aparición de un tumor con los indicadores reportados. En algunos casos, un profesional médico puede revisar y evaluar todo el historial médico de un paciente y evaluar múltiples estrategias de tratamiento, para la intervención clínica de la condición de un paciente.

Un profesional médico puede iniciar o modificar el tratamiento de un neoplasma, después de recibir información sobre el nivel (puntuación, frecuencia) asociado con el nivel de 5hmC en la muestra de orina de un paciente. En algunos casos, un profesional médico puede comparar reportes anteriores y el nivel recientemente comunicado (puntuación, frecuencia) de modificación de 5hmC, y recomendar un cambio en la terapia. En algunos casos, un profesional médico puede inscribir a un paciente en un ensayo clínico para una nueva intervención terapéutica de un neoplasma. En algunos casos, un profesional médico puede optar por esperar para comenzar la terapia hasta que los síntomas del paciente requieran intervención clínica.

Un profesional médico puede comunicar los resultados del ensayo a un paciente o a su familia. En algunos casos, un profesional médico puede proporcionar a un paciente y/o a su familia, información sobre neoplasia, incluyendo opciones de tratamiento, pronóstico y remisiones a especialistas, por ejemplo, oncólogos y/o radiólogos. En algunos casos, un profesional médico puede proporcionar una copia de los registros médicos de un paciente, para comunicar los resultados del ensayo a un especialista. Un profesional de investigación puede aplicar la información sobre los resultados de los ensayos de un sujeto, para avanzar en la investigación sobre neoplasmas. Por ejemplo, un investigador puede recopilar datos sobre los resultados de un ensayo, con información sobre la eficacia de un medicamento para el tratamiento de la neoplasia para identificar un tratamiento efectivo. En algunos casos, un profesional de investigación puede obtener resultados de ensayos para evaluar la inscripción de un sujeto o su participación continua en un estudio de investigación o ensayo clínico. En algunos casos, un profesional de investigación puede clasificar la gravedad de la condición de un sujeto, basándose en los resultados del ensayo. En algunos casos, un profesional de investigación puede comunicar los resultados del ensayo de un sujeto a un profesional médico. En algunos casos, un profesional de investigación puede remitir a un sujeto, a un profesional médico para la evaluación clínica de la neoplasia y su tratamiento. Se puede utilizar cualquier procedimiento apropiado para comunicar información a otra persona (por ejemplo, un profesional). Por ejemplo, la información puede ser proporcionada directa o indirectamente a un profesional. Por ejemplo, un técnico de laboratorio puede ingresar los resultados del ensayo en un registro basado en un ordenador. En algunos casos, la información se comunica realizando una alteración física en los registros médicos o de investigación. Por ejemplo, un profesional médico puede hacer una anotación permanente o marcar un registro médico para comunicar un diagnóstico a otros profesionales médicos que revisen el registro. Además, se puede utilizar cualquier tipo de comunicación para comunicar la información. Por ejemplo, se pueden utilizar el correo postal, el correo electrónico, el teléfono y las interacciones cara a cara. La información también puede comunicarse a un profesional poniéndola a su disposición electrónicamente. Por ejemplo, la información puede comunicarse a un profesional colocándola en una base de datos de ordenador, de modo que el profesional pueda acceder a ella. Además, la información puede comunicarse a un hospital, clínica o centro de investigación que actúe como agente del profesional.

Se observa que una sola muestra puede analizarse para un marcador específico de neoplasma o para múltiple marcador específico de neoplasma. En realizaciones preferidas, se analiza una única muestra para detectar múltiples marcadores específicos de neoplasma, por ejemplo, utilizando ensayos de múltiples marcadores. Además, se pueden recolectar múltiples muestras de un solo mamífero y analizarlas, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una muestra se divide en una primera y una segunda porciones, donde la primera porción se somete a un análisis citológico y la segunda porción se somete a una purificación o procesamiento adicional (por ejemplo, paso(s) de captura específicos de la secuencia (por ejemplo, para el aislamiento de loci específicos para el análisis de los niveles de 5hmC). En algunas realizaciones, la muestra se somete a uno o más pasos de preprocesamiento, antes de dividirse en porciones. En algunas realizaciones, la muestra se trata, manipula o conserva de una manera que promueve la integridad del ADN y/o inhibe la degradación del ADN (por ejemplo, mediante el uso de amortiguadores de almacenamiento con agentes estabilizantes (por ejemplo, agentes quelantes, inhibidores de la ADNasa) o técnicas de manipulación o procesamiento que promueven la integridad del ADN (por ejemplo, procesamiento inmediato o almacenamiento a baja temperatura (por ejemplo, -80 grados C)).

Fuera del alcance de la invención reivindicada, todos los materiales y reactivos esenciales básicos, necesarios para detectar neoplasia mediante la detección tanto del nivel (presencia, ausencia, puntuación, frecuencia) de marcadores en una muestra obtenida del mamífero, se reúnen juntos en un kit. Dichos kits generalmente comprenden, por ejemplo, reactivos útiles, suficientes o necesarios para detectar y/o caracterizar uno o más marcadores (por ejemplo, marcadores epigenéticos; modificaciones de 5hmC) específicos para un neoplasma. En algunos aspectos, los kits contienen enzimas adecuadas para amplificar ácidos nucleicos, incluyendo diversas polimerasas, desoxinucleótidos y amortiguadores, para proporcionar la mezcla de reacción necesaria para la amplificación. En algunos aspectos, los kits incluyen un medio para contener los reactivos en un espacio reducido para su venta comercial, como, por ejemplo, recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado, en los que se retienen los reactivos deseados. También se pueden proporcionar otros recipientes adecuados para llevar a cabo determinados pasos de los procedimientos descritos.

En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento son útiles para monitorear el tratamiento de la neoplasia (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los procedimientos pueden realizarse inmediatamente antes, durante y/o después de un tratamiento, para monitorear el éxito del tratamiento. En algunas realizaciones, los procedimientos se realizan a intervalos en pacientes libres de enfermedad, para garantizar el éxito del tratamiento.

Fuera del alcance de la invención reivindicada, la presente divulgación también proporciona una variedad de aspectos relacionados con ordenador. Específicamente, en algunos aspectos la divulgación proporciona programación de ordenador, para analizar y comparar un patrón de resultados de detección de marcador específico de neoplasma en una muestra obtenida de un sujeto con, por ejemplo, una biblioteca de dichos patrones de marcador, de los que se sabe que son indicativos de la presencia o ausencia de un neoplasma, o una etapa particular de neoplasma.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una programación por ordenador, para analizar y comparar un primer y un segundo patrones de resultados de detección de marcador específico de neoplasma, de una muestra tomada al menos en dos puntos de tiempo diferentes. En algunos aspectos, el primer patrón puede ser indicativo de una condición precancerosa y/o una condición de bajo riesgo de cáncer y/o progresión de una condición precancerosa a una condición cancerosa. En tales aspectos, la comparación permite monitorear la progresión de la condición, desde el primer punto temporal hasta el segundo punto de tiempo.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona una programación por ordenador para analizar y comparar un patrón de resultados de detección de marcador específico de neoplasma de una muestra, con una biblioteca de patrones de marcador específico de neoplasma, de los que se sabe que son indicativos de la presencia o ausencia de un cáncer, en donde la comparación proporciona, por ejemplo, un diagnóstico diferencial entre un neoplasma benigno y un neoplasma agresivamente maligno (por ejemplo, el patrón de marcador permite la asignación de la etapa y/o grado de la condición cancerosa).

Los procedimientos y sistemas aquí divulgados se pueden implementar de numerosas maneras. En un aspecto, los procedimientos implican el uso de una infraestructura de comunicaciones, por ejemplo internet. Puede implementarse en diversas formas de hardware, software, firmware, procesadores, servidores distribuidos (por ejemplo, como los que se utilizan en la computación en la nube) o una combinación de ellos. Los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento pueden implementarse como una combinación de hardware y software. El software se puede implementar como un programa de aplicación incorporado de forma tangible en un dispositivo de almacenamiento de programa, o diferentes partes del software implementado en el ambiente de computación del usuario (por ejemplo, como un subprograma) y en el ambiente de computación del revisor, donde el revisor puede estar ubicado en un sitio remoto (por ejemplo, en una instalación de un proveedor de servicios).

Por ejemplo, durante o después de la entrada de datos por parte del usuario, partes del procesamiento de datos se pueden realizar en el ambiente de computación del lado del usuario. Por ejemplo, el ambiente de computación del lado del usuario se puede programar para proporcionar códigos de prueba definidos para indicar la plataforma, la prueba de diagnóstico/portador o ambas; el procesamiento de datos utilizando indicadores definidos y/o la generación de configuraciones de indicador, donde las respuestas se transmiten como respuestas procesadas o parcialmente procesadas al ambiente de computación del revisor en forma de código de prueba, y configuraciones de indicadores para la ejecución posterior de uno o más algoritmos para proporcionar resultados y/o generar un informe en el ambiente de computación del revisor.

El programa de aplicación para ejecutar los algoritmos descritos en el presente documento puede cargarse a y ejecutarse en una máquina que comprenda cualquier arquitectura adecuada. En general, la máquina implica una plataforma por ordenador que tiene hardware, tal como una o más unidades (CPU) centrales de procesamiento, una memoria (RAM) de acceso aleatorio e interfaz(ces) de entrada/salida (E/S). La plataforma por ordenador también incluye un sistema operativo y un código de microinstrucción. Los diversos procesos y funciones descritos en el presente documento pueden ser parte del código de microinstrucción o parte del programa de aplicación (o una combinación de ambos) que se ejecuta a través del sistema operativo. Además, se pueden conectar varios otros dispositivos periféricos a la plataforma por ordenador, como un dispositivo de almacenamiento de datos adicional y un dispositivo de impresión.

Como un sistema por ordenador, el sistema generalmente incluye una unidad de procesador. La unidad de procesador funciona para recibir información, que generalmente incluye datos de pruebas (por ejemplo, productos genéticos específicos analizados) y datos de resultados de pruebas (por ejemplo, el patrón de resultados de detección de marcador específico de neoplasma (por ejemplo, marcador epigenético, modificación de 5hmC) de una muestra). Esta información recibida se puede almacenar al menos temporalmente en una base de datos, y los datos se pueden analizar en comparación con una biblioteca de patrones de marcador de los que se sabe son indicativos de la presencia o ausencia de una condición precancerosa, o de los que se sabe son indicativos de una etapa y/o grado de cáncer.

Parte o la totalidad de los datos de entrada y salida también se pueden enviar electrónicamente; ciertos datos de salida (por ejemplo, reportes) se pueden enviar electrónica o telefónicamente (por ejemplo, por fax, por ejemplo, utilizando dispositivos como elfax back).Los dispositivos receptores de salida ejemplares pueden incluir un elemento de visualización, una impresora, un dispositivo de fax y similares. Las formas electrónicas de transmisión y/o visualización pueden incluir el correo electrónico, la televisión interactiva y similares. En algunas realizaciones, la totalidad o una parte de los datos de entrada y/o la totalidad o una parte de los datos de salida (por ejemplo, usualmente al menos la biblioteca del patrón de resultados de detección de marcador específicos de neoplasma, de los que se sabe son indicativos de la presencia o ausencia de una condición precancerosa) se mantienen en un servidor para acceso, por ejemplo, acceso confidencial. Se podrá acceder a los resultados o enviarlos a profesionales según se desee.

Un sistema para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento generalmente incluye al menos un procesador de ordenador (por ejemplo, cuando el procedimiento se lleva a cabo en su totalidad en un solo sitio) o al menos dos procesadores de ordenador en red (por ejemplo, cuando los datos de marcador detectados para una muestra obtenida de un sujeto, deben ser ingresados por un usuario (por ejemplo, un técnico o alguien que realiza los ensayos)) y transmitidos a un sitio remoto a un segundo procesador de ordenador para su análisis (por ejemplo, cuando el patrón de resultados de detección de marcador específico de neoplasma) se compara con una biblioteca de patrones, de los que se sabe son indicativos de la presencia o ausencia de una condición precancerosa), donde el primer y el segundo procesadores de ordenador están conectados por una red, por ejemplo, a través de una intranet o internet). El sistema también puede incluir componente(s) de usuario para la entrada; y componente(s) de revisor para la revisión de datos y la generación de reportes, incluyendo la detección de una condición precancerosa, la asignación de etapa y/o clasificación de un neoplasma, o el monitoreo de la progresión de una condición precancerosa o un neoplasma. Los componentes adicionales del sistema pueden incluir componente(s) de servidor; y base(s) de datos para almacenar datos (por ejemplo, como en una base de datos de elementos de informe, por ejemplo, una biblioteca de patrones de marcador de los que se sabe son indicativos de la presencia o ausencia de una condición precancerosa y/o de los que se sabe son indicativos de un grado y/o una etapa de un neoplasma, o una base (RDB) de datos relacional que puede incluir datos ingresados por el usuario y datos de salida. Los procesadores de ordenador pueden ser procesadores que típicamente se encuentran en ordenadores personales de escritorio (por ejemplo, IBM, Dell, Macintosh), ordenadores portátiles, unidades centrales, miniordenadores u otros dispositivos de ordenador.

Los componentes de entrada pueden ser ordenadores personales completos e independientes que ofrecen una gama completa de potencia y rasgos para ejecutar aplicaciones. El componente de usuario usualmente opera bajo cualquier sistema operativo deseado e incluye un elemento de comunicación (por ejemplo, un módem u otro hardware para conectarse a una red), uno o más dispositivos de entrada (por ejemplo, un teclado, ratón, teclado numérico u otro dispositivo utilizado para transferir información o comandos), un elemento de almacenamiento (por ejemplo, un disco duro u otro medio de almacenamiento legible por ordenador y que puede ser grabado por ordenador) y un elemento de visualización (por ejemplo, un monitor, televisor, LCD, LED u otro dispositivo de visualización que transmite información al usuario). El usuario ingresa comandos de entrada en el procesador del ordenador, a través de un dispositivo de entrada. Generalmente, la interfaz de usuario es una interfaz (GUI) gráfica de usuario escrita para aplicaciones de navegador web.

El(los) componente(s) del servidor puede(n) ser un ordenador personal, un miniordenador o una unidad central, o estar distribuidos entre múltiples servidores (por ejemplo, como en aplicaciones de computación en la nube) y ofrecen administración de datos, intercambio de información entre clientes, administración de red y seguridad. La aplicación y cualquier base de datos utilizada pueden estar en el mismo servidor o en servidores diferentes. Se contemplan otros arreglos informáticos para el usuario y el(los) servidor(es), incluyendo el procesamiento en una sola máquina, como una unidad central, una colección de máquinas u otra configuración adecuada. En general, las máquinas de usuario y servidor trabajan juntas para lograr el procesamiento de la presente invención.

Cuando se utiliza(n), la(s) base(s) de datos generalmente está(n) conectada(s) al componente del servidor de base de datos y pueden ser cualquier dispositivo que contenga datos. Por ejemplo, la base de datos puede ser cualquier dispositivo de almacenamiento magnético u óptico para una ordenador (por ejemplo, CDROM, disco duro interno, unidad de cinta). La base de datos puede estar ubicada de forma remota al componente del servidor (con acceso a través de una red, módem, etc.) o localmente al componente del servidor.

Cuando se utiliza en el sistema y en los procedimientos, la base de datos puede ser una base de datos relacional, que se organiza y a la que se accede de acuerdo con las relaciones entre los elementos de datos. La base de datos relacional generalmente se compone de una pluralidad de tablas (entidades). Las filas de una tabla representan registros (colecciones de información sobre elementos separados) y las columnas representan campos (atributos particulares de un registro). En su concepción más simple, la base de datos relacional es una colección de entradas de datos que se "relacionan" entre sí a través de al menos un campo común.

Se pueden utilizar estaciones de trabajo adicionales equipadas con ordenadores e impresoras en el punto de servicio para ingresar datos y, en algunas realizaciones, generar reportes apropiados, si se desea. El(los) ordenador(es) pueden tener un acceso directo (por ejemplo, en el escritorio) para iniciar la aplicación y facilitar el inicio del ingreso de datos, la transmisión, el análisis, la recepción de informes, etc., según se desee.

La presente invención es útil tanto para diagnosticar enfermedades y trastornos en un sujeto, como para determinar el pronóstico de un sujeto. Los procedimientos de la presente invención son aplicables a una amplia variedad de enfermedades y trastornos. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para obtener el perfil de riesgo de un sujeto de desarrollar un neoplasma (por ejemplo, cáncer). En algunas realizaciones, dichos procedimientos implican obtener una muestra de un sujeto (por ejemplo, un ser humano en riesgo de desarrollar cáncer; un ser humano que se somete a un examen físico de rutina), detectar la presencia, ausencia o nivel (por ejemplo, frecuencia o puntuación de modificación de 5hmC) de uno o más marcadores específicos para un neoplasma en o asociados con la muestra (por ejemplo, específicos para un neoplasma) en la muestra, y generar un perfil de riesgo de desarrollar neoplasma (por ejemplo, cáncer), basado en el nivel detectado (puntuación, frecuencia) o la presencia o ausencia de los indicadores de neoplasia. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un perfil de riesgo generado cambiará, dependiendo de marcadores específicos y detectados como presentes o ausentes o en niveles de umbral definidos. La presente invención no se limita a una manera particular de generar el perfil de riesgo. En algunas realizaciones, se utiliza un procesador (por ejemplo, un ordenador) para generar dicho perfil de riesgo. En algunas realizaciones, el procesador utiliza un algoritmo (por ejemplo, software) específico para interpretar la presencia y ausencia de modificaciones específicas de 5hmC, según lo determinado con los procedimientos de la presente invención. En algunas realizaciones, la presencia y ausencia de marcadores específicos según lo determinado con los procedimientos de la presente invención se ingresan en dicho algoritmo, y el perfil de riesgo se reporta en base a una comparación de dicha entrada con normas establecidas (por ejemplo, norma establecida para condición precancerosa, norma establecida para diversos niveles de riesgo de desarrollar cáncer, norma establecida para sujetos diagnosticados con varias diversas etapas de cáncer). En algunas realizaciones, el perfil de riesgo indica el riesgo de un sujeto de desarrollar cáncer o el riesgo de un sujeto de volver a desarrollar cáncer. En algunas realizaciones, el perfil de riesgo indica que un sujeto tiene, por ejemplo, una probabilidad muy baja, baja, moderada, alta y muy alta de desarrollar o volver a desarrollar cáncer. En algunas realizaciones, un proveedor de atención médica (por ejemplo, un oncólogo) utilizará dicho perfil de riesgo para determinar un curso de tratamiento o intervención (por ejemplo, biopsia, espera y observación, remisión a un oncólogo, remisión a un cirujano, etc.).

Otras enfermedades y trastornos que pueden diagnosticarse o pronosticarse con los procedimientos, reactivos y sistemas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Angelman, síndrome de Beckwith-Wiedemann, pseudohipoparatiroidismo, síndrome de Russell-Silver, síndrome de ICF, síndrome de Rett, a-talasemia/retardo mental, ligado aX (ATR-X), displasia Inmunoósea, tipo Schimke, síndrome de Rubinstein-Taybi, deficiencia de MTHFR, mola hidatidiforme Recurrente, síndrome de retraso mental X Frágil,

Eliminación LCR y§P- y 6p-talasemia, distrofia FSH, trastornos del XIC, displasia inmunoósea de Schimke (SIOD), síndrome de Sotos, Atrichia, distrofia muscular de Emery-Dreifuss ligada a X (EDMD), EDMD Autosómica, CMT2B1, displasia mandibuloacral, distrofia tipo 1B muscular de cintura-extremidad, lipodistrofia parcial familiar, miocardiopatía 1A dilatada, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford y anomalía de Pelger-Huet.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar aún más ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1

El procedimiento descrito aquí se basa en la dilución sucesiva por PCR de la modificación de 5hmC, junto con el mantenimiento de la modificación de 5meC dado que DNMT1 no puede metilar a través de 5hmC y citosina; sin embargo, DNMT1 puede metilar ADN a través de 5meC. Las Figuras 3 y 4 demuestran que DNMT1 no puede catalizar la transferencia de un grupo metilo desde S-adenosil-metilmetionina cuando el sustrato de ADN es una citosina, 5hmC o un□-glucosil-5hmC. Por lo tanto, es posible diluir la modificación de 5hmC mediante PCR seguido de tratamiento con DNMT1 mientras que la modificación de 5meC se mantendrá a través de múltiples rondas de PCR y tratamiento con DNMT1.

Nuestro procedimiento aplica la conversión con bisulfito y la secuenciación de la muestra “A”, ADN sin tratar, que se utilizará como referencia, ya que detectará el total de 5meC y 5hmC. El procedimiento implica un ensayo de dilución de 5hmC, diluyendo 5hmC en el conjunto total de fragmentos de ADN mientras se mantiene 5meC. Esta dilución se logra a través de rondas secuenciales de un ciclo de amplificación por PCR (dilución) y tratamiento del ADN con la metiltransferasa DNMT1 de mantenimiento de ADN, que mantiene enzimática y específicamente la 5meC agregando un grupo metilo únicamente a la cadena no metilada de los productos de PCR hemimetilados (esta muestra se denomina muestra "B" en la Figura 1). Después de algunas rondas de este ensayo, aplicamos la conversión con bisulfito y la secuenciación de la muestra de ADN tratada, muestra B, donde 5meC ahora es la única modificación presente (o la única modificación altamente mantenida). Por lo tanto, todas (o la mayoría) de las bases que se leen como C de esta muestra tienen que haber sido protegidas contra la conversión debida a 5meC y no a 5hmC. Al comparar "B" con la muestra de referencia "A" podemos detectar fácilmente todas las posiciones de base que contienen 5hmC.

Debería notarse que este procedimiento, si bien diluye efectivamente el 5hmC, mantiene la señal de 5meC. Por lo tanto, este procedimiento puede servir para dos propósitos: (i) la identificación de 5hmC en el ADN y (ii) la identificación de 5meC en el a Dn . La prueba de la viabilidad del ensayo descrito anteriormente se demuestra en la Figura 4.

Diseño experimental

El procedimiento descrito aquí se basa en la dilución sucesiva por PCR de la modificación de 5hmC junto con el mantenimiento de la modificación de 5meC, dado que DNMT1 no puede metilar a través de 5hmC y citosina; sin embargo, DNMT1 puede metilar ADN a través de 5meC. Las Figuras 3. A y 4 demuestran que DNMT1 no puede catalizar la transferencia de un grupo metilo desde S-adenosil-metilmetionina cuando el sustrato de ADN es una citosina, 5hmC o un b-glucosil-5hmC. Por lo tanto, es posible diluir la modificación de 5hmC mediante PCR seguido de tratamiento con DNMT1, mientras que la modificación de 5meC se mantendrá a través de múltiples rondas de PCR y tratamiento con DNMT1. De modo importante, las enzimas DNMT1, así como otras metiltransferasas, podrían emplearse para distinguir entre 5meC y 5hmC incluso cuando estas enzimas metilan a través de 5hmC y citosina, siempre que las enzimas tengan una preferencia por el hemi 5meC sobre 5hmC, b-glucosil-5hmC o citosina en los sitios CpG (Figura 3. B y C). Además, una enzima DNMT1 o metiltransferasa puede permitir la identificación de 5meC y 5hmC en el ensayo descrito aquí, incluso si la transferencia de un grupo metilo de S-adenosil-metilmetionina es de una tasa mucho menor al 100 %. El requisito para distinguir 5meC de 5hmC es que exista una preferencia por 5meC sobre 5hmC, b-glucosil-5hmC o citosina en los sitios CpG (Figura 3B y C).

Nuestro procedimiento aplica la conversión con bisulfito y la secuenciación de la muestra “A”, ADN sin tratar (Figura 1), que se utilizará como referencia ya que detectará el total de 5meC y 5hmC. El procedimiento implica un ensayo de dilución de 5hmC, diluyendo 5hmC en el conjunto total de fragmentos de ADN mientras se mantiene 5meC. Esta dilución se logra a través de rondas secuenciales de un ciclo de amplificación por PCR (dilución) y tratamiento del ADN con la metiltransferasa DNMT1 de mantenimiento de ADN, que mantiene enzimática y específicamente la 5meC, agregando un grupo metilo únicamente a la cadena no metilada de los productos de<p>C<r>hemimetilados (esta muestra se denomina muestra "B" en la Figura 1). Después de algunas rondas de este ensayo, aplicamos la conversión con bisulfito y la secuenciación de la muestra de ADN tratada, muestra B, donde 5meC ahora es la única modificación presente (o la única modificación altamente mantenida). Por lo tanto, todas (o la mayoría de) las bases que se leen como C de esta muestra, tienen que haber sido protegidas contra la conversión debida a 5meC y no a 5hmC. Al comparar "B" con la muestra de referencia "A" podemos detectar fácilmente todas las posiciones de base que contienen 5hmC.

Debería notarse que este procedimiento, si bien diluye efectivamente el 5hmC, mantiene la señal de 5meC. Por lo tanto, este procedimiento puede servir para dos propósitos: (i) la identificación de 5hmC en el ADN y (ii) la identificación de 5meC en el a Dn . La prueba de la viabilidad del ensayo descrito anteriormente se demuestra en la figura 4.

Además, debería notarse que los kits de conversión con bisulfito del estado de la técnica actual presentan limitaciones en cuanto a sensibilidad. Por ejemplo, el kit MethylEasy Xceed (Human Genetic Signatures, no. de cat. ME002) permite el análisis de 5meC de tan solo 8 células, pero no permite el análisis de células individuales. El procedimiento descrito aquí, al tiempo que diluye efectivamente la 5hmC y mantiene la señal de la 5meC, permitirá una sensibilidad aumentada de detección tanto de la 5meC como de la 5hmC, con un potencial obvio para el análisis de células individuales como resultado de la amplificación por PCR de la muestra de ADN (con amplificación específica del gen o del genoma completo).

Materiales y procedimientos

Sustratos

Sustratos de ADN creados mediante la hibridación del oligonucleótido complementario apropiado (consulte la Tabla 1 Suplementaria) calentando a 95°C y enfriando a 1°C/min hasta que la reacción alcanzó los 25°C. El ensayo de especificidad de la metiltransferasa utilizó oligonucleótidos creados mediante la hibridación de la parte superior de 5hmC, la parte superior de 5meC o la parte superior de citosina con la parte inferior de citosina. El sustrato utilizado para simular una ronda de PCR seguida del tratamiento con DNMT1 se creó mediante la hibridación de la parte superior 5hmC:C:5meC con la parte inferior sin modificar. El sustrato utilizado para el ensayo completo se creó mediante el recocido de 5hmC:C:5meC en la parte superior con 5hmC:C:5meC en la parte inferior.

Ensayo de especificidad de la metiltransferasa

Se incubaron a 37°C reacciones (50 □I) que contienen 100 ng de sustrato de ADN (citosina, hemi-5meC o hemi-5hmC), Tris-HCl 50 mM, Ditiotreitol 1 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0, Glicerol 5 % (v/v), S-[metil-14C]-Adenosil-L-Metionina con 2 unidades de DNMT1 de ratón recombinante, DNMT1 humano recombinante o Sssl Metiltransferasa durante 30 minutos. Las reacciones se terminaron con la adición de 200 □I de amortiguador TE. El ADN de las reacciones se precipitó con etanol y se lavó tres veces con etanol al 70 % helado. Las pellas de ADN se secaron y se suspendieron en 20 □I de amortiguador TE. Toda la reacción se transfirió a un vial de centelleo de 5 ml que contenía 2 ml de Ecosinct A. Las fracciones insolubles en ácido se contaron por centelleo utilizando una ventana abierta durante 10 minutos.

Conversión con bisulfito, clonación y secuenciación

La conversión con bisulfito se llevó a cabo de acuerdo con la guía del usuario del kit MethylEasy Xceed (Human Genetic Signatures, no. de cat. ME002). La clonación se realizó utilizando el kit TOPO TA (Invitrogen, no. de cat. K4595-40). La secuenciación se realizó utilizando el procedimiento descrito por Sanger.

Prueba de principio para el ensayo de dilución de 5hmC

Se utilizó un oligo ADNds de 112 pb que contenía tres sitios CpG, donde uno era hemi-5meC, el segundo CpG no contenía ninguna modificación y el tercer CpG era hemi-5hmC, para una prueba de principio del ensayo de dilución de 5hmC. Se añadió el oligo (65 ng) a una mezcla de 5.0 j l de amortiguador Dn m T i 10x (NEB), 2.5 |jl de SAM 3.2 mM, 0.5 j l de BSA (N<e>B, no. de cat. B9001S) y 10 Unidades de DNMT1 de ratón, en un volumen total de 50 j l ajustado con MqH2O. Las reacciones de DNMT1 se incubaron en un Thermomixer a 37 °C, 600 rpm durante 4 h. Los oligos de ADN se purificaron posteriormente con un Kit MinElute Reaction Cleanup. La conversión con bisulfito y la secuenciación de la cadena inferior no modificada del oligo se llevaron a cabo antes y después del tratamiento con DNMT1.

El ensayo de dilución de 5hmC

Se utilizó un oligo de ADNds de 112 pb que contenía tres sitios CpG, uno con 5meC en ambas cadenas, un segundo sin modificación y un tercero con 5hmC en ambas cadenas, para demostrar el ensayo de dilución de 5hmC. Para producir oligonucleótidos hemimodificados, se configuró y ejecutó una PCR de la siguiente manera: Se añadió el oligonucleótido (65 ng) a una mezcla de 4.0 j l de amortiguador HF Phusion 5x, 1.6 jl de dNTPs 2.5 mM, 1 j l de cada uno de los cebadores directo e inverso 10 jM , 0.2 j l de polimerasa Phusion en un volumen total de 20 j l ajustado con MqH.2O. La fusión de las cadenas de ADN se llevó a cabo durante 3 min a 98 °C, seguida de hibridación de cebador durante 2 min a 56 °C y elongación durante 8 min a 72 °C. A continuación, se purificó el ADN con un Kit MinElute Reaction Cleanup, se midió la concentración fluorimétricamente en un instrumento Qubit y se realizó el tratamiento con DNMT1 de acuerdo con la siguiente configuración: Se añadió la cantidad total de oligo recuperado a una mezcla de 5.0 j l de amortiguador DNMT1 10x (NEB), 2.5 j l de SAM 3.2 mM, 0.5 j l de BSA (NEB, no. de cat. B9001S) y 10 Unidades de DNMT1 de ratón, en un volumen total de 50 j l ajustado con MqH2O. Se incubaron las reacciones de DNMT1 en un Thermomixer a 37 °C, 600 rpm durante 4 h. Posteriormente, se añadió 1 j l de Proteinasa K (14-22 mg/ml) (Roche) y se realizó una incubación adicional a 50 °C en un Thermomixer, 600 rpm durante 1 h. A continuación, los oligos de ADN se precipitaron con etanol y se purificaron con un Kit MinElute Reaction Cleanup. Se midió nuevamente la concentración de ADN fluorimétricamente en un instrumento Qubit. La configuración descrita en esta sección se puede llevar a cabo una o más veces para obtener un rango de dilución de 5hmC y conservación de 5meC.

El ensayo de dilución/pérdida de 5hmC que permite la evaluación específica de la cadena

Se utilizó un oligo de ADNds de 112 pb que contenía tres sitios CpG, uno con 5meC en ambas cadenas, un segundo sin modificación y un tercero con 5hmC en ambas cadenas, para demostrar el ensayo de dilución de 5hmC (también denominado ensayo de pérdida de 5hmC y ensayo de extensión de cebador (de biotina)), haciendo uso de evaluación específica de la cadena. Para crear oligonucleótidos hemimodificados, se configuró una PCR de extensión de cebador de cadena específica y se ejecutó de la siguiente manera: El oligonucleótido (65 ng) se añadió a una mezcla de 4.0 j l de amortiguador HF Phusion 5x, 1.6 jl de dNTPs 2.5 mM, 1 j l de solo uno de los cebadores 10 jM directos e inversos que contiene una molécula/baliza de biotina 5', 0.2 j l de polimerasa Phusion, en un volumen total de 20 j l ajustado con MqH2O. La fusión de las cadenas de ADN se llevó a cabo durante 3 min a 98 °C, seguida de la hibridación de cebador durante 2 min a 56 °C y la elongación durante 8 min a 72 °C. A continuación, se purificó el ADN con perlas magnéticas recubiertas con Estreptavidina y se realizó el tratamiento con DNMT1 de acuerdo con la siguiente configuración: Se añadió la cantidad total de oligo recuperado, a una mezcla de 5.0 j l de amortiguador DNMT1 10x (NEB), 2.5 j l de SAM 3.2 mM, 0.5 j l de BSA (N<e>B, no. de cat. B9001S) y 10 Unidades de DNMT1 de ratón, en un volumen total de 50 j l ajustado con MqH2O. Se incubaron las reacciones de DNMT1 en un Thermomixer a 37 °C, 600 rpm durante 4 h. Los oligonucleótidos botinilados fueron purificados posteriormente, utilizando perlas magnéticas de estreptavidina y se convirtieron en bisulfato, se utilizaron como plantillas en PCR y se secuenciaron.

Resultados

En la Figura 1 se muestra un esquema del procedimiento. Para demostrar la viabilidad y el éxito del procedimiento, demostraremos que (i) las metiltransferasas específicas modifican preferiblemente los sustratos de ADN hemi-5meC, (ii) que esta preferencia se puede identificar mediante secuenciación con bisulfito, después del tratamiento con la metiltransferasa adecuada y (iii) la modificación de 5hmC se puede diluir mediante rondas sucesivas de amplificación de ADN, seguidas de un tratamiento con la metilasa de ADN adecuada.

Las metiltransferasas DNMT1 de ratón, DNMT1 humana y M. Sssl metilan preferiblemente sustratos hemi-5meC.

Se incubaron metiltransferasas DNMT1 de ratón, DNMT1 de humano y M. Sssl con 100 ng de hemi-5meC, hemi-5hmC o hemi-beta-glucosil-5hmC, sin modificar. La DNMT1 de ratón fue capaz de catalizar la transferencia de un grupo metilo exclusivamente al sustrato hemi-5meC, sin mostrar actividad en los otros sustratos (Figura 3A). La DNMT1 humana muestra una preferencia enzimática por hemi-5meC mientras muestra una actividad limitada en los otros sustratos (Figura 3B). Finalmente, la metilasa M. Sssl (Spiroplasma sp.) también mostró una preferencia por el ADN que contiene hemi-5meC; (Figura 3C). Este resultado nos llevó a la conclusión de que cualquiera de estas metiltransferasas podría ser suficiente para el ensayo de dilución descrito en la Figura 1.

La DNMT1 del ratón prefiere fuertemente la hemi-5meC como sustrato

Se incubó un sustrato de ADNds que contenía un hemi-5meC, citosina no modificada y hemi-5hmC con DNMT1 de ratón, en presencia de S-adenosil metilmetionina. Se limpió el ADN y se le sometió a secuenciación con bisulfito, como se describe en "Materiales y procedimientos". Después de la secuenciación con bisulfito pudimos demostrar que casi todas (87.5 %) las hemi-5meC estaban completamente metiladas, mientras que el CpG no modificado y la hemi-5hmC no fueron modificados por DNMT1 de ratón (Figura 4). Como el sustrato utilizado para este ensayo imita el ADN completamente 5hmC o completamente-5hmC después de una ronda de amplificación, determinamos que este ensayo funcionaría si se utiliza con múltiples rondas de amplificación de ADN y tratamiento con DNMT1 de ratón.

Las rondas sucesivas de tratamiento con DNMT1 y amplificación por PCR pueden diluir 5hmC mientras se mantiene 5meC.

Se amplificó un sustrato de ADNds que contenía 5meC, CpG y 5hmC completas, utilizando la polimerasa Taq o Phusion seguido de un tratamiento con DNMT1 de ratón. Este procedimiento se llevó a cabo tres veces como se describe en "Materiales y procedimientos". La figura 6B demuestra la dilución efectiva de 5hmC mientras se mantiene 5meC. Se puede observar que antes de la dilución (Figura 6A) no se puede distinguir la identidad de 5hmC y 5meC; sin embargo, después del tratamiento de dilución (Figura 6B); se pueden distinguir claramente 5hmC y 5meC ya que 5hmC está presente en una cantidad muy reducida en comparación con 5meC.

La PCR de extensión de cebador específico de cadena, combinada con el uso de cebadores biotinilados, permite la evaluación de la tasa de transferencia de grupos metilo de DNMT1 a sitios CpG en una cadena recién sintetizada en sitios a través de 5hmC, 5meC o C.

Se utilizó un sustrato de ADNds que contenía 5meC, CpG y 5hmC completas, como plantilla para la PCR de extensión de cebador específico de cadena, con cebadores que contenían una baliza de biotina 5' y seguido de un tratamiento con DNMT1 de ratón. Se aislaron los oligonucleótidos recién sintetizados, para asegurarse de que cualquier metilación/-señal en los tres sitios CpG de análisis de la cadena elegida para el estudio, no provendría de la copia parental de la misma cadena. La estrategia permite la detección y cuantificación directas del nivel de 5meC y 5hmC, sin necesidad de realizar más rondas de ensayo. Un ensayo de este tipo que contiene el oligonucleótido descrito en la sección de materiales y procedimientos, también puede ser utilizado como referencia interna y control, para ayudar en el cálculo del contenido de bases C modificadas en muestras de ADN genómico.

Un protocolo representativo para el ensayo dependiente de metiltransferasa (ensayo "B" en la Figura 11) es el siguiente:

• Extensión del cebador de biotina: PCR de "una ronda" con cebador biotinilado

• Productos de PCR de grupo (de oligo de control y muestra genómica)

• Purificación por PCR MinElute

• Purificación con biotina y estreptavidina con perlas MyOne™ de Estreptavidina T1

• Tratamiento con DNMT1 en perlas, 0.6-1 □I de DNMT1 0.5 mg/ml, SAM 1.6 mM, 37°C en 30 min.

• Lavados y elución en 50 pl de MQ-H2O 95°C en 10 min.

• MinElute Reaction Cleanup (opcional)

• Tratamiento con bisulfito

• PCR con bisulfito

• Clonación con TOPO TA, transformación y selección en placas LB y X-gal

• Secuenciación

Como se muestra en la Figura 12, el ensayo HyLo dependiente de metiltransferasa/DNMT1 identificó dos CpGs 5hmC en el genTRIM31en el ADN del cerebro humano. El ensayo delineado en la Figura 11 fue utilizado con ADN genómico al que se añadió un oligo de control que contenía sitios CpG conocidos para cada una de 5meC, C y 5hmC. De esta manera, pudimos garantizar una cuantificación precisa del ADN genómico ya que, con el uso del oligo, monitoreamos la eficiencia de la metiltransferasa en la muestra.

Ejemplo 2

Se puede agregar un grupo químico a 5hmC, como glucosa, para aumentar la relación de eficiencia de la metiltransferasa entre 5meC y 5hmC. Vea la Figura 13. El bloqueo estérico de la metiltransferasa en la posición 5hmC modificada puede ser aprovechado para aumentar la robustez del ensayo dependiente de la metiltransferasa. Aquí mostramos el efecto de bloqueo de la adición de glucosa a 5hmC, en un ensayo de metiltransferasa radiactiva. Tanto DNMT1 como M.Sssl se pueden bloquear eficientemente, mediante la adición de un grupo químico con un tamaño mayor que el que puede caber en el bolsillo de la metiltransferasa, por ejemplo mediante la adición de glucosa. Por razonamiento lógico a partir de nuestros datos y la demostración previa de que un grupo de carbono 5 de la citosina de -CCCH3 (tamaño de 6.1 A) no cabe en el bolsillo de la metiltransferasa (Valinkluck y Sovers, Cancer Res, 2007), se puede asumir que la adición a 5hmC de cualquier grupo químico que haga que el grupo total sea demasiado grande para el bolsillo de la metiltransferasa, será útil para aumentar la relación de la eficiencia de la metiltransferasa entre 5meC y 5hmC.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectar citosina 5-hidroximetilada en un ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar un ácido nucleico que está hemimetilado, comprendiendo dicho ácido nucleico citosina, (i) una cadena parental que comprende citosina 5-hidroximetilada y (ii) una cadena hija que no está metilada ni hidroximetilada;

b) tratar dicho ácido nucleico con una enzima que añade un grupo metilo a la cadena hija, en donde dicha enzima no añade un grupo hidroximetilo a dicha cadena hija;

c) tratar dicho ácido nucleico para convertir la citosina no modificada en uracilo o timidina;

d) secuenciar dicha cadena hija; y

e) comparar una secuencia de dicha cadena hija con una referencia para detectar citosina 5-hidroximetilada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico hemimetilado se produce replicando una molécula de ácido nucleico con una polimerasa, preferiblemente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha enzima es una metiltransferasa de ADN.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde dicha metiltransferasa de ADN es DNMT1.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en donde dicho DNMT1 comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde dicha metiltransferasa de ADN es DNMT M.Sssl.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en donde dicho DNMT M.Sssl comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 3.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde (c) comprende tratar dicho ácido nucleico con bisulfito.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha citosina 5-hidroximetilada es beta-glu-5-hidroximetilcitosina.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha citosina 5-hidroximetilada es 5-hidroximetilcitosina.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha secuenciación comprende un procedimiento de secuenciación de próxima generación.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho ácido nucleico se deriva de una molécula de ácido nucleico obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o afección.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en donde dicha enfermedad o afección comprende cáncer.