ES3010371T3 - Artesunate for the treatment of neurodegeneration with brain iron accumulation - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro (NBIA). Mediante el estudio de dos genes novedosos, CRAT, que codifica la carnitina acetiltransferasa, y REPS1, implicada en la endocitosis y el transporte de vesículas, y una serie de genes NBIA conocidos, los inventores informaron sobre la sobrecarga de hierro relacionada con el aumento de los niveles y el reciclaje anormal del receptor de transferrina como una característica común en la NBIA. Atribuyen esta anomalía, al menos en parte, a la alteración de la palmitoilación del receptor como consecuencia común de las diversas mutaciones causantes de la enfermedad. Finalmente, los inventores demuestran que el artesunato mejoró la palmitoilación de TfR1 en fibroblastos NBIA. En particular, la presente invención se refiere a un método para tratar la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco que aumenta la palmitoilación de TfR1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Artesunato para el tratamiento de la neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral

Campo

La presente divulgación se enmarca en el campo de la neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro.

Antecedentes

La neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro (NBIA en sus siglas en inglés) es una afección genéticamente heterogénea que provoca disfunción extrapiramidal progresiva con distonía, rigidez, coreoatetosis y evidencia de acumulación de metales divalentes en el cerebro mediante MRI. Hasta el momento se han identificado once genes de la enfermedad<1>(PANK2,PLA2G6,COASY, FA2H, ATP13A2, C2orF37, WDR45, C19ORF12, CP, FTLyGTPBP22),siendoPLA2G6,que causa distrofia neuroaxonal, yPANK2los genes de enfermedad prevalentes. Sin embargo, solo dos genes de NBIA están claramente relacionados con el metabolismo del hierro, a saber,LTLque codifica la subunidad ligera de la ferritina, la principal proteína de almacenamiento intracelular de hierro, yCPque codifica ceruloplasmina. Por ejemplo, la neuroferritinopatía es una enfermedad causada por una mutación en el gen de la cadena ligera de ferritina 1 (FTL1) que provoca una acumulación excesiva y anormal de hierro en el cerebro(Kumar, Niraj, Philippe Rizek y Mandar Jog. "Neuroferritinopathy: pathophysiology, presentation, differential diagnoses and management". Tremor and other hyperkinetic movements 6 (2016).En dicho artículo también se revela que TfR1 desempeña un papel en la transferencia de hierro. Aún no se sabe bien cómo se relacionan otros genes de NBIA con el metabolismo del hierro.

Por otra parte, la internalización del hierro unido a la transferrina mediante endocitosis mediada por el receptor 1 de transferrina (TfR1) es la principal vía de captación de hierro3. En las células vivas, el hierro recién importado se incorpora a la ferritina, una proteína multimérica formada por dos subunidades, la ferritina H y la ferritina L. La homeostasis del hierro celular está regulada por un mecanismo postranscripcional que involucra a las proteínas sensibles al hierro (IRP en sus siglas en inglés), que representan los principales reguladores del hierro en los vertebrados. En los seres humanos, la aconitasa citosólica (ACO1) se convierte en IRP (IRP1) cuando el hierro citosólico disminuye. Otra IRP desprovista de actividad aconitasa, la IRP2, está regulada principalmente por la degradación dependiente del hierro. Las IRP se unen al 3'UTR del ARNm del receptor de transferrina, lo protegen contra la degradación rápida y permiten que las células importen más hierro por endocitosis de la transferrina (Tf). Las IRP también se unen al extremo 5'UTR de los ARNm de la ferritina, lo que dificulta la síntesis de ferritina. En condiciones de alto contenido de hierro, la IRP1 se convierte en aconitasa y la IRP2 se degrada, lo que permite el almacenamiento de hierro y limita la entrada de este. Hasta ahora, este nivel de regulación postranscripcional era el único mecanismo conocido para regular el TfR1 y la ferritina.

Compendio de la invención

La presente invención se define por la reivindicación. En particular, la presente invención se refiere a un fármaco que aumenta la palmitoilación de TfR1 para su uso en el tratamiento de la neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro (NBIA) en un sujeto que lo necesita, en donde dicho fármaco es artesunato y en donde la NBIA resulta de un gen patológico seleccionado entre PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12, FTL, CRAT y REPS1.

La siguiente descripción detallada, las figuras y los ejemplos no se incluyen dentro del alcance de la presente invención y se incluyen únicamente con fines de comprensión e ilustración. Además, cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.

Descripción detallada

Estudiando dos genes nuevos, a saber,CRATque codifica la carnitina acetiltransferasa yREPS1implicado en la endocitosis y el transporte de vesículas y una serie de genes de NBIA conocidos, los autores de la presente invención informan aquí sobre la sobrecarga de hierro relacionada con el aumento de los niveles y el reciclaje anormal del receptor de transferrina como una característica común en la NBIA. Atribuyen esta anomalía, al menos en parte, a la palmitoilación alterada del receptor como una consecuencia común de las diversas mutaciones que causan la enfermedad. Por último, los autores de la presente invención muestran que el Artesunato mejoró la palmitoilación de TfR1 en fibroblastos NBIA.

En consecuencia, el primer objeto divulgado en el presente documento se refiere a un método para tratar la neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco que aumenta la palmitoilación de TfR1.

Como se emplea en el presente documento, la expresión "neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro" o "NBIA" tiene su significado general en la técnica y se refiere a un grupo de trastornos neurológicos genéticos raros caracterizados por una acumulación anormal de hierro en los ganglios basales. Las manifestaciones clínicas distintivas de la NBIA se relacionan con la función muscular del cuerpo y presentan un trastorno progresivo del movimiento, que incluye distonía, coreoatetosis, rigidez en los brazos y las piernas y Parkinsonismo. La mayoría de las formas de NBIA implican enfermedades oculares. Los problemas más comunes son la degeneración de la retina y la atrofia óptica. También se observa con frecuencia una pérdida general de células y tejido cerebrales, afecciones denominadas atrofia cerebral y atrofia cerebelosa. El inicio de la NBIA varía desde la infancia hasta la edad adulta. La progresión puede ser rápida o lenta con largos períodos de estabilidad. En particular, la NBIA es el resultado de un gen de enfermedad seleccionado entrePANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12, FTL, CRATyREPS1.

Como se emplea en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren al tratamiento tanto profiláctico como preventivo, así como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluido el tratamiento de pacientes en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que han contraído la enfermedad, así como de pacientes que están enfermos o han sido diagnosticados de padecer una enfermedad o afección médica, e incluyen la supresión de la recaída clínica. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que padece un trastorno médico o que en última instancia puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Por "régimen terapéutico" se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, p. ej., el patrón de dosificación utilizado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. Las frases "régimen de inducción" o "período de inducción" se refieren a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se utiliza para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un paciente durante el período inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un "régimen de carga", que puede incluir la administración de una dosis mayor del fármaco que la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, la administración de un fármaco con mayor frecuencia que la que un médico utilizaría para administrar el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambas cosas. Las frases "régimen de mantenimiento" o "período de mantenimiento" se refieren a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se utiliza para el mantenimiento de un paciente durante el tratamiento de una enfermedad, p. ej., para mantener al paciente en remisión durante largos períodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear una terapia continua (p. ej., administrar un fármaco a intervalos regulares, p. ej., semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.) o una terapia intermitente (p. ej., tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en caso de recaída o tratamiento al alcanzar un criterio predeterminado particular [p. ej., manifestación de la enfermedad, etc.]).

En particular, el fármaco es artesunato. Como se emplea en el presente documento, el término "artesunato" tiene su significado general en la técnica y se refiere a (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahidro-3,6,9-trimetil-3,12-epoxi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol, succinato de hidrógeno. El término abarca cualquiera de los enantiómeros individuales del artesunato. En particular, el término se puede referir solo a un enantiómero individual o a una mezcla racémica o no racémica de los enantiómeros. El término también incluye polimorfos e hidratos de artesunato. El término también incluye sales y ésteres de artesunato. El término también incluye profármacos de artesunato y enantiómeros, mezclas racémicas, mezclas no racémicas, polimorfos, hidratos, sales y ésteres de dichos profármacos.

Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" del fármaco como se ha descrito anteriormente se entiende una cantidad suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de los compuestos y composiciones divulgados en el presente documento será decidido por el médico a cargo dentro del alcance de un criterio médico sólido. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto en particular dependerá de una variedad de factores, incluidos el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados de manera combinada o coincidente con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está dentro del conocimiento práctico de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto por día. Típicamente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto que se vaya a tratar. Un medicamento contiene típicamente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Una cantidad efectiva del fármaco se suministra ordinariamente a un nivel de dosificación de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por día.

Según la invención, el fármaco se administra al sujeto en forma de una composición farmacéutica. Típicamente, el fármaco se puede combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas. "Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según corresponda. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables se refieren a una carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación sólidos, semisólidos o líquidos no tóxicos de cualquier tipo. En las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o combinado con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitaria adecuadas comprenden formas de administración por vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal. Típicamente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación susceptible de ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil capacidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las soluciones que comprenden compuestos divulgados en el presente documento como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. El fármaco se puede formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden obtener de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio o calcio, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. El portador también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles. Los métodos típicos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente filtrada de manera estéril. También se contempla la preparación de soluciones más o altamente concentradas para inyección directa, donde se prevé que el uso de DMSO como disolvente dé como resultado una penetración extremadamente rápida, que proporcione altas concentraciones de los agentes activos. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero se debe volver isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que se pueden emplear a la luz de la presente divulgación. Se producirán necesariamente algunas variaciones en la dosificación en función de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.

La invención se ilustrará con más detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deben interpretar en ningún caso como limitantes del alcance de la presente divulgación.

Figura

Figura 1: Contenido de hierro y regulación de la homeostasis del hierro en fibroblastos de sujetos con NBIA. Efecto de la complementación con CoA sobre la palmitoilación de TfR1 en fibroblastos PANK2 y CRAT. Los fibroblastos fueron tratados con o sin CoA 25 pM durante 72 h, y la proteína TfR1 fue inmunoprecipitada con anticuerpo anti-TfR1 de ratón para realizar el ensayo de palmitoilación. En cada condición, el panel superior muestra el nivel de TfR1 palmitoilado (IB: Biotina) y la cantidad de TfR1 inmunoprecipitado (IB: TfR1).

Ejemplo 1:

Material y métodos

Pacientes

Paciente 1, una niña nacida de padres turcos, primos hermanos, después de un embarazo a término y parto normal (peso al nacer: 3,5 kg, altura: 51 cm, OFC: 35 cm) caminó a los 14 meses, pero pronto desarrolló un retraso en el habla, atribuido inicialmente a una pérdida auditiva leve. A los 3 años se observaron desequilibrio en la marcha y ataxia cerebelosa de progresión lenta. Poco a poco perdió la capacidad de permanecer de pie, caminar y escribir. El temblor, la dismetría, la hipotonía, los reflejos osteotendinosos intensos y la neuropatía sensorial sugerían una degeneración espinocerebelosa de progresión lenta. La resonancia magnética cerebral mostró evidencia de atrofia cerebelosa y leucodistrofia posterior. La hiperintensidad de los ganglios basales y la hipointensidad del globo pálido y la sustancia negra en las secuencias T2* sugerían una importante acumulación de hierro.

Paciente 2, tercer hijo de padres sanos no emparentados de origen francés (peso al nacer: 2,6 kg, altura: 46,5 cm, OFC: 33,5 cm) presentó retraso motor y del habla. Caminó sola a los 18 meses, pero desarrolló ataxia cerebelosa progresiva y síndrome piramidal y perdió la capacidad de caminar a los 9 años. A esa edad, presentó nistagmo, disartria, dismetría, espasticidad de las extremidades inferiores y pie cavo. La biopsia del músculo esquelético reveló tinción negativa de SDH y COX en numerosas fibras, pero el estudio metabólico y las actividades enzimáticas de la cadena respiratoria mitocondrial fueron normales. La MRI cerebral mostró atrofia cerebral y cerebelosa progresiva y evidencia en T2* de acumulación de hierro cerebral en los palidi y pedúnculos. Falleció a los 20 años después de un empeoramiento gradual de su estado durante 10 años.

La paciente 3, hermana de la paciente 2, tuvo una evolución clínica similar, aunque un poco más leve. A sus 14 años, todavía puede caminar con ayuda, sostener un lápiz, practicar bicicleta estática y nadar.

Curiosamente, los padres mencionaron algunas fluctuaciones en sus condiciones neurológicas y un empeoramiento significativo después de las menstruaciones mensuales en las pacientes 2-3.

Se obtuvo el consentimiento informado para estudios de diagnóstico e investigación de todos los sujetos según los protocolos de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional locales en París.

Secuenciación del exoma

La secuenciación del exoma se realizó en ADN genómico (1 pg) aislado de leucocitos sanguíneos. Los exones se capturaron mediante la metodología de enriquecimiento en solución (SureSelect Human All Exon Kits Version 3, Agilent, Massy, Francia) utilizando la biblioteca de sondas de oligonucleótidos biotinilados de la empresa (Human All Exon v3 50 Mb, Agilent). A continuación, cada ADN genómico se secuenció en un secuenciador como 75 bases de extremos emparejados (Illumina HISEQ2000, Illumina, San Diego, EE. UU.). Los análisis de imágenes y la determinación de bases se realizaron con Real Time Analysis (RTA) Pipeline versión 1.9 con parámetros predeterminados (Illumina). Las secuencias se alinearon con la secuencia de referencia del genoma humano (ensamblaje hg 19), los SNP se determinaron en función de las determinaciones de alelos y la profundidad de lectura utilizando el canal de datos "pipeline" CASAVA (Consensus Assessment of Sequence and Variation 1.8, Illumina). Se excluyeron los SNP conocidos notificados en dbSNP, 1000 genomas, Exome Variant Server y la base de datos de SNP interna, así como las variantes intergénicas, no codificantes de ARN y UTR.

Cultivo celular

Se aislaron fibroblastos de la piel de los pacientes 1-2 y de cuatro pacientes con NBIA portadores de mutaciones bialélicasPANK2, PLA2G6, C19ORF12yFA2H.Los fibroblastos se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato 2,5 mM, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina a 37°C. Para el tratamiento con citrato de amonio férrico (FAC), se incubaron células confluentes al 90% durante 72 h con o sin FAC 100 pM en DMEM sin suero (es decir, sin Tf). Las células HeLa se cultivaron en el mismo medio.

Modelado de la mutación CRAT humana

Se utilizó el conjunto de coordenadas de 1,6 Á para CRAT humana (código pdb: 1 nm8) para mapear el resto Arg321. Se utilizó Swiss-Pdb Viewer 3.7 (http://www.expasy.org/spdbv) para analizar la información estructural sobre la mutación de CRAT y visualizar las estructuras.

p-oxidación de palmitoil-CoA

Las células sembradas en placas de 6 pocillos se incubaron cuando eran confluentes con palmitato marcado con 13C<16>250 pM, albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (razón molar palmitato/albúmina: 4/1) y 0,4 mmoles/L de carnitina durante 6 h. Las células se retiraron mediante tripsinización y, después de lavarlas con PBS, se almacenaron a -80°C hasta su análisis. Para el análisis de acilcarnitina, los sedimentos se resuspendieron en 60 pL de agua desionizada y se sometieron a sonicación brevemente. Se añadieron patrones internos mezclados (20 pl de 2Hg-L-carnitina 20 pM, 2H3-octanoilcarnitina 4 pM, 2H3-octadecanoilcarnitina 1 pM a 45 pL de producto homogeneizado celular. Las proteínas se precipitaron mediante la adición de 400 pL de etanol y el sobrenadante se extrajo dos veces con 400 pL de hexano. La capa acuosa se transfirió a un vial, se secó bajo nitrógeno y se reconstituyó con 100 pL de acetonitrilo/agua (1:1 v/v, ácido fórmico al 0,025%). Las acilcarnitinas se analizaron en un espectrómetro de masas de triple cuadripolo API 3000 (Applied Biosystem), detectando precursores de m/z 85 y se cuantificaron mediante comparación con patrones internos deuterados. Las proteínas se midieron mediante el método de Lowry.

Transferencia Western

Los fibroblastos de piel cultivados o las células HeLa se recogieron en hielo raspándolos en un tampón de lisis celular reductor o no reductor. Se realizó SDS-PAGE en extractos de proteínas de células completas. Las inmunodetecciones se realizaron en PBS con 5% de leche, 0,05 Tween20 (SIGMA) utilizando los siguientes anticuerpos: anti-CRAT de conejo (HPA022815, Sigma), anti-ACOT8 de conejo (SAB4500009 SIGMA), anti-REPS1 de ratón (ab69221), anti-SOD1 de ratón (ab86454), anti-TfR1 de ratón (Zymed 136890), anti-ferritina de conejo (ab75973), anti-IRP1 de conejo (ab126595), anti-IRP2 de conejo (ab80339), anti-GRIM19 de ratón (ab110240), anti-catalasa de conejo (ab16731), anti-FBXL5 de conejo (ab140175), anti-LC3B de conejo (ab51520) y anticuerpos anti-actina de ratón (ab8226). Se utilizaron anticuerpos de cabra anti-H y L de IgG de ratón conjugados con HRP (ab6789) o de cabra anti-H y L de IgG de ratón (ab6789) como anticuerpos secundarios antes de la detección basada en ECL (SuperSignal® West Dura, Thermo Scientific). Las imágenes se visualizaron y trataron utilizando una cámara CCD (BioRad) y el soporte lógico ImageLab (BioRad).

La detección de grupos carbonilo se realizó utilizando el Kit de Detección de Oxidación de Proteínas OxyBlot (S7150 Chemicon) según las recomendaciones del fabricante.

Reducción de la expresión mediante modificación genética "knockdown" de CRAT y ACOT8

Las células HeLa se sembraron a 80% de confluencia en placas de 6 pocillos el día anterior a la transfección. Las células se transfectaron con Dharmafect 1 (Dharmacon) y ARNip 50 nM por diana en OPTIMEM sin antibióticos con FBS al 10% según lo recomendado por el fabricante. Se realizaron la p-oxidación de palmitoil-CoA y la transferencia Western dos días después de la transfección. Los ARNip adquiridos de Dharmacon fueron los siguientes: ARNip deCRAThumano (ON-TARGETplus SMARTpool L-009524-00-0005), ARNip deACOT8humano (ON-TARGETplus SMARTpool L-009600-01-0005) y ARNip de reserva no dirigido humano (ON-TARGETplus Non-targeting Pool).

Expresión anormalmente alta de CRAT y REPS1

Los ADNc de longitud completa deCRAToREPS1se clonaron en el vector de expresión pLenti7.3. Para la producción del virus, las células HEK293FT se sembraron tres días antes de la transfección en DMEM complementado con 10% de FBS inactivado por calor (Invitrogen, 10270106) a una confluencia de 80%. Las células HEK293FT se cotransfectaron utilizando 30 pL de reactivos JetPRIME PolyPLUS con los tres plásmidos de empaquetamiento REV, VSVG, PAX2 y el vector de expresión pLenti7.3 que contenía ADNc deCRAToREPS1con una razón de ADN de 1:3:6:10. El sobrenadante que contenía las partículas virales se recogió cada 12 h durante 3 días, se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min, se filtró a través de un filtro de 0,8 pm y se centrifugó durante 2 h a 19000 rpm a 4°C. Los sedimentos se recogieron y se resuspendieron en 200 pL de DMEM. A continuación, los fibroblastos se transdujeron al 60-70% de confluencia con una multiplicidad de infección de 5.

Cuantificación de los transcritos de TFRC

El ARN total se extrajo utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) y la ADNasa se trató con el conjunto de ADNasa libre de ARNasa (Qiagen) según el protocolo del fabricante. La concentración y pureza del ARN total se evaluaron utilizando el espectrofotómetro Nanodrop-8000 (Thermo Fisher Scientific) antes del almacenamiento a -80°C. Después, los ARNm se transcribieron de forma inversa a partir de 2 pg de ARN total utilizando el kit High-Capacity RNA-to-cDNA (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante utilizando cebado aleatorio. La RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) se realizó con PCR digital de gotas (ddPCR) utilizando el sistema de PCR digital de gotas QX200 (Bio-Rad Laboratories). Los ADNc deTFRCse amplificaron utilizando cebadores específicos. Se utilizaron proteína de unión a la caja TATA(TBP,NM_003194) y p-glucuronidasa(GUSB,NM_000181.3) para la normalización. Los datos de los triplicados se analizaron en un citómetro de flujo de gotas, QX200 Droplet Reader, utilizando el soporte lógico de análisis Quantasoft (Bio-Rad Laboratories). Los niveles de expresión deTFRCse normalizaron al número medio de copias de genes constitutivos deTBPyGUSB.

Contenido de hierro y citometría de imágenes en flujo (Imagestream)

El contenido total de hierro se midió utilizando un ensayo de hierro basado en ferrozina modificado de 35.

Para la citometría de imágenes en flujo, los fibroblastos (1 a 2x106) se privaron de nutrientes durante una hora en medio DMEM sin FBS, se trataron con EDTA 5 mM para recolectarlos sin alterar el TfR1 ubicado en la superficie celular, como lo hace la tripsina, se lavaron 3 veces con PBS frío y después se marcaron con anticuerpos anti-TfR1 (A24)36 durante 1 h en hielo para evitar la internalización de TfR1. En este estado, solo se cuantifica el TfR1 unido a la membrana. La tinción secundaria se realizó utilizando el anticuerpo de cabra anti-ratón Alexa fluor 488 durante 30 min en hielo. Las células se lavaron y tiñeron con Hoechst durante 5 min en un volumen total de 50 pl y las adquisiciones se realizaron directamente. El análisis celular se basó en la señal positiva de Hoechst, lo que permitió seleccionar células vivas. Las muestras se procesaron en un Imagestream ISX mkII (Amnis Corp, Millipore, Seattle, WA) que combina citometría de flujo con imágenes celulares detalladas y estudios funcionales y se utilizó un aumento de 40X para todas las adquisiciones. Los datos se adquirieron utilizando el soporte lógico INSPIRE (Amnis Corp) y se analizaron utilizando el soporte lógico IDEAS™ (versión 6.2 Amnis Corp). Se recogieron al menos 20.000 eventos en todos los experimentos. Se ejecutaron controles de tinción única para cada fluorocromo utilizado y se realizó una compensación espectral. Se establecieron ventanas citométricas de las células para las células individuales utilizando el área y la razón de aspecto de la imagen de campo claro y se establecieron ventanas citométricas para las células enfocadas utilizando la característica de gradiente RMS. Se diseñó una máscara específica para el análisis de la localización en la membrana de TfR1. Los resultados se expresaron como valor de intensidad media de píxel, que es la intensidad normalizada al área de superficie. Los análisis de datos se realizaron utilizando el soporte lógico IDEAS (Amnis Corporation). Los datos se compensaron utilizando una matriz de compensación generada utilizando muestras teñidas individualmente. Los datos seleccionados se utilizaron para generar histogramas que miden la intensidad de fluorescencia (suma de todos los píxeles en una imagen) ubicada en la membrana plasmática utilizando una máscara específica. Esta máscara fue el resultado de una máscara de campo claro completa menos una máscara brillante erosionada de 10 píxeles, lo que dio como resultado una máscara con forma de rosquilla. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPadPrism (versión 5.0; GraphPad Software). Los datos se obtuvieron de al menos 2.104 células en tres experimentos independientes y se notificaron como un histograma de píxeles promedio para cada muestra y una media de 3 controles. Se utilizaron pruebastde Student de dos colas no pareada o pruebasUde Mann-Whitney según correspondiera. Los valores P<0,001 se consideraron significativos.

Microscopía confocal

Para el reciclaje de Tf, los fibroblastos se esparcieron a una confluencia de 40% en placas de 12 pocillos que contenían portaobjetos de vidrio 48 h antes del experimento. A continuación, las células se privaron de nutrientes en un medio DMEM sin FBS durante 1 h a 37°C. Después, se añadió Tf-RED (25 pg/mL) durante 30 min. Las células se lavaron 3 veces con PBS y a continuación se incubaron durante 0, 5, 10 o 30 min en medio DMEM sin FBS. Finalmente, las células se lavaron en PBS y se fijaron en PFA frío al 4%. Los portaobjetos se montaron en un medio de montaje Diamond Prolong que contenía DAPI (Thermofisher Scientific). Los portaobjetos se examinaron con un microscopio láser confocal (SP8 SMD). El análisis de imágenes se realizó utilizando el soporte lógico ImageJ. Para cada experimento independiente, se recolectaron al menos 30 células por portaobjetos. Cada campo se seleccionó al ver la tinción positiva para DAPI que se utilizó para definir la región nuclear (NR). Cada NR se amplió en 10 píxeles para generar la región perinuclear de interés (PNROI). A continuación, la calculadora de imágenes aplicó máscaras de PNROI en el canal RED para obtener la intensidad de partículas de fluorescencia media cuantitativa. Solo se consideraron partículas de al menos 8 píxeles de tamaño. Los umbrales de intensidad de fluorescencia roja se determinaron según células Tf-RED no incubadas. El número de células analizadas es superior a 30 en tres experimentos independientes. Los datos se analizaron con pruebastde Student de dos colas no pareadas con GraphPadPrism (versión 5.0; GraphPad Software). Los valores P<0,05 se consideraron significativos.

Para el tráfico de Tf y TfR1, los fibroblastos se esparcieron a una confluencia de 40% en placas de 12 pocillos que contenían portaobjetos de vidrio 48 h antes del experimento. Después, las células se privaron de nutrientes en un medio DMEM sin FBS durante 1 h a 37°C. Después, se añadió Tf-RED (25 pg/mL) durante 30 min. Las células se lavaron 3 veces con PBS y a continuación se incubaron durante 10 min en medio DMEM sin FBS. Finalmente, las células se lavaron en PBS y se fijaron en PFA frío al 4%. La microscopía confocal se realizó como se describió anteriormente37 utilizando anti-Rab11A de conejo (Zymed 71-5300), anti-LAMP2 de ratón (ab25631), anti-IgG de ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor® 488 (Thermofisher A-11001), anti-IgG de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor® 594 I (Thermofisher A-11012) y ProLong® Diamond Antifade Mountant con<d>A<p>I (Thermofisher P36962).

Ensayo de palmitoilación

La palmitoilación de TfR1 en fibroblastos de piel cultivados se modificó a partir de15. Brevemente, las células se lisaron en hielo en un tampón de lisis celular sin DTT y el TfR1 endógeno se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-TfR1 de ratón (Zymed) con cuentas magnéticas de proteína G (Biorad). Después de lavar con PBS, las cuentas se incubaron durante la noche con N-etilmaleimida (NEM) 50 mM a 4°C, se lavaron 3 veces con PBS y después se incubaron con hidroxilamina (HA) 1 M a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de tres lavados, las cuentas se incubaron con HPDP-Biotina (Thermo) 50 mM en oscuridad durante 2 horas. El nivel de TfR1 marcado con biotina se determinó mediante inmunotransferencia en condiciones no reductoras utilizando un anticuerpo anti-biotina de cabra (Thermo) mientras que la inmunotransferencia con anticuerpo anti-TfR1 de conejo (Abcam) se utilizó como control de carga.

Resultados:

Las mutacionesREPS1provocan NBIA y sobrecarga de hierro en los fibroblastos.

La secuenciación del exoma en dos hermanos nacidos de padres no relacionados (pacientes 2-3) reveló heterocigosidad compuesta para dos variaciones deREPS1con cambio de sentido (c.232G>C y c.338C>A; p.Val78Leu y p.Ala113Glu respectivamente) ubicadas en un dominio altamente conservado de la proteína y que se pronostica que son perjudiciales. La variación c.338C>A es un SNP (rs201191394) con una frecuencia de alelo menor baja (0,0001) en los estadounidenses de origen europeo. Las variaciones se cosegregaron con la enfermedad en la familia y estuvieron ausentes en 110 pacientes con NBIA y 200 cromosomas de control. No alteraron el nivel de transcrito específico (no se muestra) pero redujeron significativamente la cantidad de proteína REPS1 en los fibroblastos del paciente.

Las proteínas RalBP1 y dominio EPS asociado a RalBP1 que contiene 1 (REPS1) son dos proteínas distintas que participan en la endocitosis y el transporte de vesículas. REPS1, un adaptador endocítico localizado en fosas recubiertas de clatrina, interactúa con la intersectina 1 (ITSN1) del andamiaje endocítico, uno de los actores clave de la endocitosis mediada por clatrina7. REPS1 está incluida en el complejo endocítico Numb y podría mediar el reclutamiento de RalBP1 a este complejo8. REPS1 se expresa de forma ubicua9, conservado entre especies y contiene dos dominios de homología de Epsina 15 (EH1 y EH2) que se sabe que desempeñan un papel en la interacción proteína-proteína10. Ambas variantes se encuentran en el dominio EH1, una región conservada que interactúa con RalBP1. REPS1 también interactúa con Rab11-FIP2, ubicada en las membranas de los endosomas tempranos11. La unión de REPS1 a Rab11-FIP2 induce la fusión de vesículas no recubiertas con el endosoma temprano, formando el compartimento de reciclaje del endosoma12. Los autores de la presente invención plantean la hipótesis de que las mutaciones deREPS1podrían inducir una sobrecarga de hierro a través de una alteración del tráfico de endosomas y el reciclaje de TfR1. El hierro en fibroblastos cultivados del paciente 2 se cuantificó utilizando un ensayo colorimétrico basado en ferrozina. Los fibroblastos del paciente mostraron un contenido de hierro ligeramente mayor cuando se cultivaron durante 3 días en DMEM sin suero bovino fetal (FBS) (es decir, desprovisto de hierro unido a Tf). A continuación, las células se incubaron con citrato de amonio férrico (FAC), una fuente soluble de hierro que se utiliza para aumentar el contenido de hierro celular y que se sabe que aumenta la captación de NTBI en fibroblastos13 por una vía poco conocida que podría ocurrir a través de la ruta endocítica4. Esto dio como resultado un aumento de tres veces el contenido de hierro en fibroblastos conREPS1en comparación con los controles, lo que sugiere que las mutaciones deREPS1provocaron una desregulación de la homeostasis del hierro en el paciente 2, posiblemente a través de endocitosis anormal.

Se sabe que la sobrecarga de hierro lábil induce estrés oxidativo por reacción de Fenton. La prueba Oxyblot de fibroblastos cultivados del paciente 2 detectó un ligero aumento de la oxidación de proteínas en condiciones de bajo contenido de hierro (-FAC), pero un aumento importante en condiciones de alto contenido de hierro (+FAC). La adición de FAC al medio de cultivo aumentó la protección contra la lesión por radicales libres en los controles, pero no en los fibroblastos del paciente 2, lo que sugiere que el nivel máximo de protección ya se había alcanzado en condiciones basales.

La transducción del ADNc deREPS1wt devolvió el contenido de hierro de los fibroblastos del paciente 2 a los valores de control, lo que confirma que las variaciones deREPS1fueron de hecho responsables de la sobrecarga de hierro. Por lo tanto, las mutaciones deREPS1causan NBIA a través de un mecanismo hasta ahora no notificado que altera el reciclaje de los endosomas.

CRAT, implicado en la biosíntesis de CoA, es un nuevo gen de enfermedad en NBIA

La genotipificación de SNP y la secuenciación del exoma en el paciente 1, nacido de padres primos hermanos, identificaron una variación homocigótica c.962G>A en el gen de la carnitina acetiltransferasa(CRAT)alterando un resto de aminoácido altamente conservado (p.Arg321His) y se pronosticó que sería perjudicial. La secuenciación de Sanger confirmó que la variación se cosegregaba con la enfermedad en la familia y estaba ausente en 110 pacientes con NBIA y 200 cromosomas de control. CRAT pertenece al grupo de carnitina aciltransferasas que catalizan la transferencia reversible de grupos acilo entre la carnitina y la coenzima A (CoA) y regulan la razón acilCoA/CoA. CRAT también desempeña un papel crucial en el transporte de ácidos grasos para la p-oxidación6. Los análisis de transferencia Western no detectaron la proteína CRAT en los fibroblastos del paciente y el análisis de su estructura cristalina reveló que Arg321, el primer resto de una hélice a, está implicado en enlaces de H con varios aminoácidos circundantes que probablemente fueron interrumpidos por el cambio Arg321His y se espera que desestabilice la proteína.

La p-oxidación de U-13C<16>palmitato en fibroblastos cultivados del paciente 1 detectó menores niveles de C<2>en comparación con el control, lo que sugiere una reducción de la p-oxidación. Sistemáticamente, la incorporación de U-13C<16>palmitato a citrato y otros intermediarios del ciclo de Krebs se redujo notablemente en el paciente 1 en comparación con los fibroblastos de control (no se muestra). Sistemáticamente, la extinción del ARNip de la expresión génica deCRATseguida de p-oxidación de palmitoil-CoA marcado en células HeLa dio como resultado una marcada disminución de derivados de acilcarnitina C<4>y C<2>en comparación con los controles, un patrón similar al observado en fibroblastos cultivados del paciente 1. La evidencia concluyente de la naturaleza causante de la enfermedad de la variación deCRATfue finalmente proporcionada por la transducción lentiviral del ADNc deCRAThumano de tipo salvaje (wt) en fibroblastos del paciente 1 seguido del cambio del perfil de p-oxidación de palmitoil-CoA hacia valores de control.

No se encontró ninguna otra variante causante de enfermedad y se excluyó una variación de acil-CoA tioesterasa 8(ACOT8)c.836G>A homocigótica (p.Trp279*) puesto que la extinción del ARNip deACOT8no logró alterar la poxidación de palmitoil-CoA aunque la expresión en exceso de ADNc deACOT8wt no logró restaurar la p-oxidación normal del palmitoil-CoA.

Contenido de hierro en fibroblastos de pacientes con NBIA

Cuando se cultivaron en condiciones de bajo contenido de hierro (sin FAC y sin FBS), los fibroblastos cultivados mostraron un contenido de hierro ligeramente elevado en caso de mutaciones bialélicas enCRAT, C19ORF12yFA2H,pero no enPANK2yPL42G6.Después de una incubación de 3 días con FAC, todos los fibroblastos NBIA mostraron un aumento importante del hierro celular (cambio de 10 a 30 veces) mientras que los fibroblastos de control mostraron un cambio de 8 veces (P < 0,001). Esto indica que ninguno de los fibroblastos de los pacientes reguló adecuadamente la captación de hierro en NBIA, posiblemente a través de una endocitosis anormal.

Homeostasis del hierro en fibroblastos cultivados de pacientes con NBIA

Los ARNm del receptor de transferrina(TFRC)se cuantificaron mediante PCR digital de gotas en fibroblastos de control y NBIA cultivados en un medio DMEM sin Tf (sin FBS, /- FAC). Las razones de ARNm deTFRCen condiciones de bajo contenido de hierro (-FAC) frente a alto contenido de hierro (+FAC) fueron relativamente similares en los controles y en los pacientes con NBIA(PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12, REPS1yCRAT),lo que sugiere una regulación por disminución normal de transcritos deTFRCen condiciones de alto contenido de hierro.

De manera similar, los análisis de transferencia Western de fibroblastos cultivados en condiciones de bajo contenido de hierro (-FAC) detectaron niveles relativamente similares de IRP1 e IRP2 en pacientes con NBIA y controles, pero un aumento constante de las ferritinas H y L (FTH y FTL respectivamente) en los fibroblastos de los pacientes, lo que refleja una sobrecarga de hierro. En condiciones de alto contenido de hierro (+FAC), los niveles bajos de IRP1, IRP2 y TfR1 limitaron la captación de hierro en las células de control, mientras que las ferritinas H y L aumentaron. Sin embargo, lo más interesante es que los niveles de TfR1 no disminuyeron en los fibroblastos cultivados de pacientes con NBIA en comparación con los controles, mientras que los niveles de IRP1, IRP2 y ferritina cambiaron según los controles. Lo mismo se observó con FBXL5, una proteína sensora de hierro que refleja el tamaño de la reserva de hierro lábil. La regulación por disminución de TfR1 normalmente resulta de la disminución combinada de transcritos deTFRCy la degradación de la proteína TfR1 por los lisosomas. Dado que la regulación pretraduccional de TfR1 no se vio afectada en NBIA, los resultados de los autores de la presente invención sugieren la existencia de una regulación postraduccional no canónica de TfR1 y su alteración en fibroblastos NBIA. Dado que los autores de la presente invención observaron constantemente mayores cantidades de LC3B-II en fibroblastos NBIA cultivados en condiciones de alto contenido de hierro, sus resultados son compatibles con un direccionamiento deficiente de TfR1/autofagosoma a los lisosomas con posterior disminución de la degradación de TfR1 por autofagia en NBIA.

Reciclaje y tráfico de Tf y TfR1 en fibroblastos NBIA

Los autores de la presente invención examinaron el reciclaje de Tf mediante microscopía confocal utilizando Tf-RED en fibroblastos NBIA. El seguimiento de la intensidad de inmunofluorescencia perinuclear después de un pulso de Tf-RED de 30 minutos seguido de persecución en fibroblastos de control mostró una rápida disminución de la tinción de Tf atribuida al reciclaje de Tf. Por el contrario, el reciclaje de Tf se retrasó significativamente en fibroblastos NBIA a medida que la señal de Tf se agregaba en la proximidad de los núcleos y no lograba disminuir después del pulso de Tf-RED con un retraso significativo de 10 minutos y más. Estos resultados concuerdan con el papel de REPS1 en la endocitosis mediada por receptores y el reciclaje de endosomas y sugieren que otras mutaciones de NBIA también afectan al reciclaje de endosomas.

En las células de control, Tf y TfR1 se localizaron conjuntamente y se distribuyeron uniformemente en el citosol. Se localizaron conjuntamente de forma parcial con RAB11A, un marcador del compartimento de reciclaje, o fueron degradados por el lisosoma, ya que Tf también se localizaba conjuntamente con LAMP2, un marcador lisosomal.

Curiosamente, las señales de Tf y TfR1 fueron más intensas y se presentaron principalmente en una región perinuclear en fibroblastos NBIA en comparación con los controles. La señal de RAB11A también aumentó y al enfocar esta región se detectó un punto grande y brillante que sugiere un bloqueo en el reciclaje de endosomas perinucleares. Por lo tanto, los autores de la presente invención cuestionaron si la acumulación de TfR1 en fibroblastos NBIA estaba relacionada con su degradación defectuosa por los lisosomas. De hecho, las estructuras positivas de Tf/LAMP2 disminuyeron en fibroblastos NBIA en paralelo con el aumento de LC3B-II detectado mediante transferencia Western en fibroblastos NBIA cultivados en condiciones de alto contenido de hierro. Por otra parte, todos los fibroblastos NBIA mostraron lisosomas agrandados con forma de rosquilla, una observación compatible con una degradación deficiente de TfR1 por los lisosomas.

Aumento concomitante de los niveles de TfR1 y ferritina observado con alto y bajo contenido de hierro. La condición es paradójica, ya que el hierro almacenado debería regular por disminución los niveles de TfR1 y la importación de metales. Si bien los autores de la presente invención detectaron un reciclaje anormal de TfR1 y su degradación lisosómica alterada, estos se cuestionaron si el aumento del nivel de estado estacionario de TfR1 también estaba relacionado con una captación anormalmente alta de TfR1. Para abordar este problema, se utilizó citometría de imágenes en flujo de próxima generación para cuantificar TfR1. Este análisis mostró mayores cantidades de TfR1 en la superficie celular de los fibroblastos NBIA en comparación con los controles y la cuantificación utilizando el soporte lógico IDEA reveló un aumento significativo de la señal de TfR1 en los fibroblastos de los pacientes. Estos resultados sugieren que, a pesar de la sobrecarga de hierro, los fibroblastos de pacientes con NBIA no logran regular por disminución la captación de metales por TfR1.

Palmitoilación de TfR1 en fibroblastos NBIA

TfR1 se modifica postraduccionalmente mediante la unión covalente de S-acilo, siendo el palmitato el ácido graso predominante, a través de enlaces tioéster a Cys62 y Cys6714. Recordando quei)se ha demostrado que el aumento de la palmitoilación disminuye la cantidad de TfR1 en la superficie celular y su endocitosis15 yii)el acetil-CoA es el único donante de grupos acetilo para las acetiltransferasas, los autores de la presente invención plantearon la hipótesis de que la deficiencia de CoA relacionada con las mutacionesPANK2yCRATpodría reducir la palmitoilación de TfR1. Los autores de la presente invención investigaron la palmitoilación de TfR1 en fibroblastos con deficiencia de PANK2 y CRAT utilizando el método de química de intercambio de acilo graso y observaron una disminución significativa en comparación con los controles, lo que sugiere que la biosíntesis de CoA defectuosa podría alterar directamente la palmitoilación de TfR1. Curiosamente, también se observó un defecto importante de palmitoilación en otros fibroblastos NBIA(PLA2G6, FA2H, C19ORF12yREPS1),siendo el defecto particularmente grave en fibroblastosC19ORF12yPLA2G6.Se sabe que el artesunato inhibe el crecimiento del cáncer de hígado y ovario al alterar la homeostasis celular del hierro mediante una inducción de la palmitoilación de TfR1 y una reducción de sus niveles en la superficie celular15. Por lo tanto, los fibroblastos de control y NBIA se trataron con artesunato 25 |uM durante 48 h, lo que de hecho mejoró la palmitoilación de TfR1. Curiosamente, los niveles de estado estacionario de ferritina (FTH) disminuyeron con el tratamiento con artesunato en los fibroblastos de control y NBIA, lo que refleja una disminución del contenido de hierro, como se ha demostrado anteriormente.

Discusión:

Tras estudiar una serie de genes patológicos conocidos y no descritos hasta ahora, los autores de la presente invención informaron aquí sobre el aumento de los niveles y el reciclaje anormal de TfR1 como una característica común en la NBIA. Como muchos otros receptores de membrana, TfR1, con hierro unido a Tf, se internaliza a través de endocitosis mediada por clatrina y el posterior tráfico endosómico permite su reciclaje a la membrana. El hierro almacenado en vesículas sin recubrimiento se libera en el citosol después de la acidulación de las vesículas que ocurre antes de su fusión con el endosoma, mediada por la unión de REPS1 a RalBP1. Los autores de la presente invención plantearon la hipótesis de que las mutaciones deREPS1podrían afectar a la unión REPS1-Rab11FIP2 y, en consecuencia, alterar el recambio de hierro, lo que daría lugar a una sobrecarga de hierro. En consonancia con esta hipótesis, observaron un aumento del contenido de hierro y un aumento paradójico del nivel de estado estacionario de TfR1 en fibroblastos cultivados de un paciente portador mutaciones deREPS1,pero también en pacientes portadores de otras mutaciones de genes de NBIA, a saber:CRAT, PANK2, PLA2G6, FA2HyC19ORF12.Por lo tanto, cualquiera que sea el gen de la enfermedad, todas las NBIA dieron lugar a una mayor carga de hierro con una mayor cantidad de TfR1 y un retraso del reciclaje de Tf/TfR1. Curiosamente, ya se ha informado de un reciclaje anormal de TfR1 en modelos con dificiencia de fosfolipasa A2, ya que los antagonistas de la fosfolipasa A2 inhiben el reciclaje de Tf-TfR1 en los niveles tanto de clasificación temprana como de reciclaje tardío de los endosomas1617. En conjunto, estos resultados apuntan a que el reciclaje defectuoso de los endosomas es un mecanismo común en la NBIA. Basándose en este estudio, los autores de la presente invención sugieren considerar la NBIA como una enfermedad de tráfico desencadenada por un deterioro del reciclaje de TfR1.

El aumento de los niveles de TfR1 en el contexto de una sobrecarga de hierro es paradójico, ya que el hierro almacenado normalmente debería regular por disminución TfR1. Vale la pena señalar que la regulación postranscripcional de TfR1 por IRP/IRE funcionó correctamente en los fibroblastos NBIA ya que los transcritos deTFRCse regulaban normalmente por disminución en condiciones de alto contenido de hierro. Por lo tanto, el nivel anormalmente alto de TfR1 notificado aquí es indicativo de una disfunción postraduccional en fibroblastos NBIA. Los autores de la presente invención atribuyen esta anomalía a la palmitoilación alterada del receptor como una consecuencia común de las diversas mutaciones causantes de enfermedades analizadas. Varios datos sugieren un defecto de palmitoilación en NBIA:i)vale la pena recordar queCRATyPANK2están implicados en la producción de CoA necesaria para la palmitoilación y los autores de la presente invención detectaron un defecto en la p-oxidación del palmitato en fibroblastos que portaban mutaciones deCRAT; ii)el perfil metabólico en fibroblastosPANK2mostraron previamente una reducción de la cantidad de ácido palmítico y una reducción de la biosíntesis de lípidos18;iii)también se sabe que los fibroblastos COASY muestran cantidades reducidas de acetilo y CoA total, lo que se espera que reduzca el ácido palmítico19;iv)de manera similar, los ratones con dificiencia de fosfolipasa A2 mostraron una reducción en la p-oxidación del palmitato20;v)otro gen de NBIA,FA2Hcodifica una hidroxilasa de ácidos grasos que transforma el ácido graso en ácido graso hidroxilado en posición 2, pero hasta ahora no se han realizado estudios metabólicos en pacientes conFA2H; vi)finalmente, se ha demostrado que la síntesis defectuosa de CoA relacionada con las mutaciones dePANK2induce alteraciones en la acetilación de histonas y tubulina21. En conjunto, los datos de datos y estudios previos de los autores de la presente invención respaldan la opinión de que la palmitoilación del TfR1 está alterada en la NBIA.

Desde hace tiempo se sabe que TfR1 se modifica postraduccionalmente mediante S-acilación, incluida palmitoilación, ya que el palmitato (C16:0) es el principal lípido incorporado a las proteínas S-aciladas. El contenido de hierro intracelular depende de la palmitoilación de TfR1, ya que las mutaciones de Cys62 y Cys67 que son los principales sitios de palmitoilación de TfR1 dan como resultado una sobrecarga de hierro14 y ya que el tratamiento con dihidroartesunato, que aumenta la palmitoilación, reduce la cantidad de hierro15. Sin embargo, las consecuencias del nivel de palmitoilación de TfR1 sobre su captación son controvertidas. De hecho, se ha afirmado que la disminución de la palmitoilación de TfR1 aumenta su captación14, pero estudios posteriores no detectaron modificaciones de la captación de TfR1 en función de la modificación de la palmitoilación1522. Estas discrepancias podrían estar probablemente relacionadas con el momento en el que se midió la captación de TfR1 en estos diversos estudios. Las modificaciones de los sitios de S-acilación de TfR1 por mutaciones de Cys62 y Cys67 no obstaculizan su reciclaje14, si bien los autores de la presente invención observan un reciclaje anormal de TfR1 en NBIA. Una gran cantidad de proteínas están palmitoiladas, incluidas las proteínas del reciclaje de endosomas. Por lo tanto, el reciclaje anormal de TfR1 en NBIA debería estar relacionado con la disminución de la palmitoilación de otras proteínas endosómicas aún desconocidas que también podrían desempeñar un papel en la fisiopatología de la enfermedad. En consonancia con esto, los autores de la presente invención también han encontrado evidencia preliminar de degradación lisosomal anormal en NBIA, ya que Tf/TfR1 se acumula en lisosomas de fibroblastosCRATyPLA2G6o se redujeron en célulasREPS1, PANK2, FA2HyC19ORF12.Finalmente, se ha demostrado quePLA2G6está implicado en la red deltrans Golgia membrana plasmática23 y regula la morfología y el tráfico intraorganelar en el compartimento intermedio del retículo endoplásmico-Golgi24. TfR1 normalmente se recicla al menos 100 veces o más durante su vida útil y experimenta varios ciclos de acilación/desacilación, ya que la S-acilación es reversible25. Debido a que las S-acil transferasas están asociadas exclusivamente a la membrana y se localizan principalmente en las membranas del RE y del aparato de Golg26, se puede plantear la hipótesis de que el reciclaje anormal causado por las mutaciones deREPS1deberían ralentizar el tráfico de TfR1 y reducir su palmitoilación. Por último, dado que C19ORF12 es una proteína mitocondrial27 que no incluye un dominio S-acil transferasa, se puede plantear la hipótesis de que esta proteína está involucrada en el metabolismo de los ácidos grasos.

La palmitoilación es un mecanismo rápido de regulación postraduccional. De hecho, la semivida de [3H] palmitato incorporado a N-Ras es de 20 min28. Teniendo en cuenta que la regulación por disminución postranscripcional de TfR1 en condiciones de alto contenido de hierro requiere varias horas29 y que la semivida de la proteína TfR1 es de más de 24 h30, la regulación postraduccional de TfR1 mediante palmitoilación podría representar una alternativa para modular rápidamente el contenido de hierro celular, una regulación que podría verse dañada u obstaculizada en la NBIA.

La palmitoilación anormal se ha descrito raramente en enfermedades genéticas y sólo con relación a mutaciones en las enzimas de acilación. La mayoría de ellas son trastornos neurológicos o neuropsiquiátricos, que incluyen enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, trastorno bipolar, retraso mental ligado al cromosoma X, lipofuscinosis ceroidea31, y modelos de la enfermedad de Parkinson22, destacando la importancia de la palmitoilación para la función neuronal normal. Sin embargo, por qué las mutaciones en los genes de NBIA que se expresan de forma ubicua dieron lugar a enfermedades neurológicas sigue sin respuesta. Al menos 23 palmitoil transferasas (PAT) se expresan en el cerebro y muestran varios patrones de expresión y no se han identificado todos sus sustratos. Se podría plantear la hipótesis de que la expresión clínica específica del cerebro de la NBIA puede ser el resultado de PAT específicas de TfR1 hasta ahora desconocidas. La identificación de estas PAT debería ayudar a comprender mejor el mecanismo de la enfermedad.

Finalmente, los autores de la presente invención demostraron que el artesunato mejoró la palmitoilación de TfR1 en fibroblastos NBIA y disminuyó el nivel de ferritina en estado estacionario, un indicador del contenido de hierro. El artesunato, un derivado de la artemisinina, ampliamente utilizado como fármaco antipalúdico32, también muestra potentes actividades anticancerosas en una variedad de células cancerosas humanas33. Se sabe desde hace mucho tiempo que la artemisinina induce una pérdida de hierro que es tóxica para las células cancerosas y se utiliza para combatirPlasmodium falciparum,el parásito de la malaria, que requiere grandes cantidades de hierro. Varios millones de pacientes han recibido artemisinina para el tratamiento de la malaria con muy pocos efectos secundarios. Sin embargo, no se ha establecido ni su seguridad ni su farmacocinética en los trastornos neurodegenerativos. Los autores de la presente invención sugieren que se consideren la artemisinina y otros fármacos que aumentan la pamitoilación de TfR1 como posibles vías para ensayos terapéuticos en la NBIA, así como en otras enfermedades neurodegenerativas más frecuentes, tales como la enfermedad de Parkinson asociada con la acumulación de hierro en el cerebro.

Ejemplo 2 (figura 1): Contenido anormal de hierro y homeostasis en fibroblastos cultivados de sujetos con NBIA.

La figura 1 muestra una sobrecarga de hierro anormal y una desregulación de TfR1 en fibroblastos de sujetos con mutaciones PLA2G6 (PLA2G6-2, c.109C>T (p.Arg37*) y c.386T>C.

Referencias:

A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta invención.

1. Meyer, E., Kurian, M.A. & Hayflick, S.J. Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation: Genetic Diversity and Pathophysiological Mechanisms. Annu Rev Genomics Hum Genet 16, 257-79 (2015).

2. Jaberi, E. et al. Identification of mutation in GTPBP2 in patients of a family with neurodegeneration accompanied by iron deposition in the brain. Neurobiol Aging 38, 216 e11 -8 (2016).

3. Lane, D.J. et al. Cellular iron uptake, trafficking and metabolism: Key molecules and mechanisms and their roles in disease. Biochim Biophys Acta 1853, 1130-44 (2015).

4. Sohn, Y.S. et al. The role of endocytic pathways in cellular uptake of plasma non-transferrin iron.

Haematologica 97, 670-8 (2012).

5. Gray, N.K. & Hentze, M.W. Iron regulatory protein prevents binding of the 43S translation pre-initiation complex to ferritin and eALAS mRNAs. Em BO J 13, 3882-91 (1994).

6. Jogl, G., Hsiao, Y.S. & Tong, L. Structure and function of carnitine acyltransferases. Ann N Y Acad Sci 1033, 17-29 (2004).

7. Dergai, O. et al. Intersectin 1 forms complexes with SGIP1 and Reps1 in clathrin-coated pits. Biochem Biophys Res Commun 402, 408-13 (2010).

8. Krieger, J.R. et al. Identification and selected reaction monitoring (SRM) quantification of endocytosis factors associated with Numb. Mol Cell Proteomics 12, 499-514 (2013).

9. Xu, J. et al. Cloning, expression and characterization of a novel human REPS 1 gene. Biochim Biophys Acta 1522, 118-21 (2001).

10. Yamaguchi, A., Urano, T., Goi, T. & Feig, L.A. An Eps homology (EH) domain protein that binds to the Ral-GTPase target, RalBP1. J Biol Chem 272, 31230-4 (1997).

11. Cullis, D.N., Philip, B., Baleja, J.D. & Feig, L.A. Rab11-FIP2, an adaptor protein connecting cellular components involved in internalization and recycling of epidermal growth factor receptors. J Biol Chem 277, 49158-66 (2002).

12. Boissel, L., Fillatre, J. & Moreau, J. Identification and characterization of the RLIP/RALBP1 interacting protein Xreps1 in Xenopus laevis early development. PLoS One 7, e33193 (2012).

13. Kaplan, J., Jordan, I. & Sturrock, A. Regulation of the transferrin-independent iron transport system in cultured cells. J Biol Chem 266, 2997-3004 (1991).

14. Alvarez, E., Girones, N. & Davis, R.J. Inhibition of the receptor-mediated endocytosis of diferric transferrin is associated with the covalent modification of the transferrin receptor with palmitic acid. J Biol Chem 265, 16644-55 (1990).

15. Ba, Q. et al. Dihydroartemisinin exerts its anticancer activity through depleting cellular iron via transferrin receptor-1. PLoS One 7, e42703 (2012).

16. de Figueiredo, P. et al. Inhibition of transferrin recycling and endosome tubulation by phospholipase A2 antagonists. J Biol Chem 276, 47361-70 (2001).

17. Doody, A.M., Antosh, A.L. & Brown, W.J. Cytoplasmic phospholipase A2 antagonists inhibit multiple endocytic membrane trafficking pathways. Biochem Biophys Res Commun 388, 695-9 (2009).

18. Leoni, V. et al. Metabolic consequences of mitochondrial coenzyme A deficiency in patients with PANK2 mutations. Mol Genet Metab 105, 463-71 (2012).

19. Dusi, S. et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. Am J Hum Genet 94, 11-22 (2014).

20. Song, H. et al. Mice deficient in group VIB phospholipase A2 (iPLA2gamma) exhibit relative resistance to obesity and metabolic abnormalities induced by a Western diet. Am J Physiol Endocrinol Metab 298, E1097-114 (2010).21

21. Siudeja, K. et al. Impaired Coenzyme A metabolism affects histone and tubulin acetylation in Drosophila and human cell models of pantothenate kinase associated neurodegeneration. EMBO Mol Med 3, 755-66 (2011).

22. Senyilmaz, D. et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature 525, 124-8 (2015).

23. Schmidt, J.A., Kalkofen, D.N., Donovan, K.W. & Brown, W.J. A role for phospholipase A2 activity in membrane tubule formation and T<g>N trafficking. Traffic 11, 1530-6 (2010).

24. Ben-Tekaya, H., Kahn, R.A. & Hauri, H.P. ADP ribosylation factors 1 and 4 and group VIA phospholipase A(2) regulate morphology and intraorganellar traffic in the endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment. Mol Biol Cell 21,4130-40 (2010).

25. Zaliauskiene, L. et al. Down-regulation of cell surface receptors is modulated by polar residues within the transmembrane domain. Mol Biol Cell 11,2643-55 (2000).

26. Chamberlain, L.H. & Shipston, M.J. The physiology of protein S-acylation. Physiol Rev 95, 341-76 (2015).

27. Hartig, M.B. et al. Absence of an orphan mitochondrial protein, c19orf12, causes a distinct clinical subtype of neurodegeneration with brain iron accumulation. Am J Hum Genet 89, 543-50 (2011).

28. Magee, A.I., Gutierrez, L., McKay, I.A., Marshall, C.J. & Hall, A. Dynamic fatty acylation of p21 N-ras. EMBO J 6, 3353-7 (1987).

29. Mullner, E.W. & Kuhn, L.C. A stem-loop in the 3' untranslated region mediates iron-dependent regulation of transferrin receptor mRNA stability in the cytoplasm. Cell 53, 815-25 (1988).

30. Zaliauskiene, L. et al. Inhibition of T cell responses by transferrin-coupled competitor peptides. Immunol Res 26, 77-85 (2002).

31. Chavda, B., Arnott, J.A. & Planey, S.L. Targeting protein palmitoylation: selective inhibitors and implications in disease. Expert Opin Drug Discov 9, 1005-19 (2014).

32. Efferth, T. & Kaina, B. Toxicity of the antimalarial artemisinin and its dervatives. Crit Rev Toxicol 40, 405 21 (2010).

33. Lai, H.C., Singh, N.P. & Sasaki, T. Development of artemisinin compounds for cancer treatment. Invest New Drugs 31,230-46 (2013).

34. Mutterer, J. & Zinck, E. Quick-and-clean article figures with FigureJ. J Microsc 252, 89-91 (2013).

35. Barbeito, A.G., Levade, T., Delisle, M.B., Ghetti, B. & Vidal, R. Abnormal iron metabolism in fibroblasts from a patient with the neurodegenerative disease hereditary ferritinopathy. Mol Neurodegener 5, 50 (2010).

36. Moura, I.C. et al. A neutralizing monoclonal antibody (mAb A24) directed against the transferrin receptor induces apoptosis of tumor T lymphocytes from ATL patients. Blood 103, 1838-45 (2004).

37. Hanein, S. et al. TMEM126A is a mitochondrial located mRNA (MLR) protein of the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta 1830, 3719-33 (2013).

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Un fármaco que aumenta la palmitoilación de TfR1 para su uso en el tratamiento de la neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro (NBIA) en un sujeto que lo necesita, en donde dicho fármaco es artesunato y en donde la NBIA resulta de un gen de enfermedad seleccionado entre PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12, FTL,<c>R<a>T yREPS1.