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ES2897712T3 - Procedimientos para seleccionar inhibidores selectivos de fosfatasa y no selectivos de fosfatasa - Google Patents

Procedimientos para seleccionar inhibidores selectivos de fosfatasa y no selectivos de fosfatasa Download PDF

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ES2897712T3
ES2897712T3 ES16717193T ES16717193T ES2897712T3 ES 2897712 T3 ES2897712 T3 ES 2897712T3 ES 16717193 T ES16717193 T ES 16717193T ES 16717193 T ES16717193 T ES 16717193T ES 2897712 T3 ES2897712 T3 ES 2897712T3
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protein
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Anne Bertolotti
Indrajit Das
Agnieszka Krzyzosiak
Adrien Rousseau
Kim Schneider
Anna Gudny Sigurdardottir
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United Kingdom Research and Innovation
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Abstract

Un compuesto inhibidor selectivo de PPP1R15B que es (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal del mismo, para uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para seleccionar inhibidores selectivos de fosfatasa y no selectivos de fosfatasa
La presente invención se refiere a un inhibidor selectivo de PPP1R15B. También se describe un procedimiento para descubrir inhibidores selectivos de fosfatasas.
Antecedentes de la invención
La fosforilación reversible de proteínas controla prácticamente todos los aspectos de la función celular y del organismo, lo que permite que las células se adapten a cambios repentinos a través de la acción antagonista de quinasas y fosfatasas. En consecuencia, la fosforilación dirigida ofrece una amplia gama de oportunidades terapéuticas y las quinasas han surgido como las dianas farmacológicas más prevalentes en la investigación farmacéutica actual con más de 3000 fármacos experimentales y aprobados. Sin embargo, aunque las fosfatasas dirigidas deberían ser en principio tan atractivas como las quinasas, se ha pasado por alto el potencial terapéutico de las fosfatasas.
La mayor parte de la fosforilación de las proteínas se produce en la serina y la treonina, y la desfosforilación selectiva de la serina y la treonina se lleva a cabo mediante cientos de holoenzimas diméricas o triméricas diferentes ensambladas a partir de una de solo unas pocas subunidades catalíticas combinadas con una entre cientos de subunidades reguladoras distintas (Heroes y col., FEBS Journal, 280, 584-595, 2012).
En general, se ha considerado que las fosfatasas no son farmacoconvertibles por varias razones. Por ejemplo, muchas fosfatasas son oligoméricas. Por tanto, la inhibición del componente catalítico de la holoenzima como PP1c da como resultado la inhibición de muchas (por ejemplo, cientos) de holofosfatasas que comparten las mismas subunidades catalíticas y pueden ser tóxicas. Dado que la selectividad es una propiedad importante para el desarrollo de fármacos, la promiscuidad de las fosfatasas catalíticas ha hecho que adquieran la reputación de no ser farmacoconvertibles.
En segundo lugar, las subunidades reguladoras de las fosfatasas están intrínsecamente desordenadas (Bollen y col., 2010; Choy y col., 2012a) y, por lo tanto, son difíciles de expresar e inestables. Entre las aproximadamente 200 olofosfatasas de PP1 (proteína fosfatasa 1) de mamíferos, solo ocho se han cristalizado. Por lo tanto, existe una falta de información estructural sobre las holofosfatasas, lo que significa que el diseño de un fármaco basado en la estructura no es fácilmente aplicable a esta clase de enzima. Hasta la fecha, las holofosfatasas para las que se dispone de información estructural solo contienen un péptido pequeño (menos de aproximadamente 100 aminoácidos) de las subunidades reguladoras (Ragusa 2010hd; Choy y col., 2014) y estas estructuras más pequeñas hacen que sea difícil guiar el descubrimiento de fármacos. .
Además, los ensayos enzimáticos basados en la hidrólisis de sustratos de sustratos artificiales conducirán principalmente al descubrimiento de inhibidores catalíticos que generalmente no son selectivos.
En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar una estrategia y un ensayo genéricos para inhibir selectivamente las fosfatasas y permitir la identificación de inhibidores específicos y, por lo tanto, fármacos con una aplicación terapéutica.
Nguyen y col., ACS Chem. Neurosci., 5, 1075-1082, 2014 describen un estudio de relación estructura-actividad alrededor de guanabenz basado en cambios de las posiciones del cloro en el resto del benceno y a continuación en las modificaciones del grupo guanidina.Krzyzosiak y col., Cell, 174, 1216-1228, 2018 describe un procedimiento de descubrimiento basado en diana que identificó Raphin1, un inhibidor selectivo de PPP1R15B.Stenlund y col., Anal. Biochem. 353, 217-225, 2006 describe un procedimiento para analizar la unión de moléculas pequeñas a PP1 y PP2B con el fin de probar la especificidad del inhibidor hacia diferentes fosfatasas. Li y col., J. Med. Chem., 53, 2409-2417, 2010 describe la síntesis y las actividades biológicas de 2-amino-1-arilidenamino imidazoles como agentes anticancerígenos. El documento WO2005031000 describe compuestos que interactúan selectivamente con el subtipo de receptor de neuropéptido FF que media la nocicepción aguda y el dolor neuropático crónico.
Resumen de la invención
La invención proporciona compuestos inhibidores.
Si bien se han descrito previamente inhibidores de PPP1R15A, no se han informado inhibidores selectivos de una serina/treonina diferente. Por tanto, se desconocía si otra fosfatasa podría inhibirse selectivamente. Los solicitantes investigaron si es posible inhibir selectivamente PPP1R15B y si tal inhibición selectiva podría ser beneficiosa. A diferencia de los ratones con genes inactivados de PPP1R15A que parecen normales, los ratones con genes inactivados de PPP1R15B no sobreviven el primer día de vida posnatal (Harding y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 1832-1837, 2009). Por lo tanto, aunque se predijo que la inhibición de PPP1R15A era segura, se predijo que la inhibición de PPP1R15B sería perjudicial. Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente que PPP1R15B se puede inhibir selectivamente y que tal inhibición conduce a un beneficio terapéutico.
La inhibición de PPP1R15B en lugar de PPP1R15A puede ser ventajosa ya que se prevé que la cantidad de indicaciones terapéuticas que pueden tratarse con inhibidores de PPP1R15A se restrinja a enfermedades en las que PPP1R15A se expresa y en las que PPP1R15A está en el modo de acción de la enfermedad. En contraste, PPP1R15B se expresa de manera constitutiva y, por lo tanto, es una diana de la enfermedad de aplicación más amplia. Como se describe en esta solicitud, la inhibición de PPP1R15B puede usarse en el tratamiento de la enfermedad de Huntington. Un inhibidor selectivo de PPP1R15B útil en la presente invención puede ser una proteína o polipéptido, polinucleótido, anticuerpo, péptido o compuesto de molécula pequeña. Alternativamente, PPP1R15B puede inactivarse mediante edición de genes.
Según un primer aspecto, se proporciona un compuesto inhibidor selectivo de PPP1R15B que es (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida (al que también se hace referencia como «TST3»):
Figure imgf000003_0001
o una sal del mismo, para uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.
Según un segundo aspecto, se proporciona una composición que comprende un inhibidor selectivo de PPP1R15B, (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.
Según un tercer aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor selectivo de PPP1R15B, (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.
En una realización, el tratamiento es para un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas o un trastorno de proteostasis.
En una realización adicional, la enfermedad es la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, una tauopatía, una enfermedad por tráfico de proteínas o un trastorno de la mielina.
En otra realización, el trastorno es un trastorno de poliglutamina.
Recientemente, se ha demostrado la viabilidad de inhibir selectivamente una serina/treonina fosfatasa. Se ha descubierto que guanabenz (Tsaytler y col., Science, 332, 91-94, 2011; Tsaytler y Bertolotti, FEBS Journal, 280, 766­ 770, 2012) y sus derivados, algunos de los cuales se describen en el documento WO2014108520 (Medical Research Council), inhiben selectivamente PPP1R15A/GADD34 («R15A»), una subunidad reguladora inducida por estrés de la serina/treonina proteína fosfatasa 1, y se propuso como tratamiento para enfermedades asociadas con el estrés por mal plegamiento de proteínas. Asimismo, se ha demostrado que un derivado de guanabenz, Sephin1 (Das y col., 2015) inhibe selectivamente PPP1R15A/GADD34. Por lo tanto, se ha propuesto Sephin1 como tratamiento para enfermedades asociadas con el estrés por mal plegamiento de proteínas. Se han descrito otros derivados en los documentosWO2016001389A1,WO2016001390A1yWO2014138298A1, por ejemplo, y se propone que posean una actividad similar. Sin embargo, se necesitan ensayos mejorados de selectividad para confirmar si estas moléculas son selectivas para la inhibición de R15A.
Se han identificado por casualidad otros inhibidores de fosfatasas. Por ejemplo, la ciclosporina A y FK506 se unen a las proteínas inmunofilinas, ciclofilina y FKBP12, respectivamente, y el complejo resultante se une a la calcineurina, una fosfatasa heterodimérica compuesta por una subunidad catalítica PPP3 y una de las dos subunidades reguladoras PPP3R1 o PPP3R2. La ciclosporina A es un inhibidor de la fosfatasa, pero lo hace por una ruta indirecta: la ciclosporina no se dirige a la subunidad reguladora de la holofosfatasa calcineurina .
Se ha informado de una fosfatasa WIP1 alostérica (Gilmartin y col., 2014). Este inhibidor se descubrió en un ensayo enzimático. Hasta la fecha, no hay ensayos disponibles para identificar inhibidores selectivos y alostéricos de fosfatasa.
En resumen, si bien los inhibidores de fosfatasa se han descrito anteriormente, es importante señalar que se han descubierto por casualidad. No existe un procedimiento disponible para identificar genéricamente un inhibidor selectivo de fosfatasa.
Una forma de identificar inhibidores selectivos y alostéricos de fosfatasas consiste en apuntar a sus subunidades reguladoras. Los inhibidores de R15A se han identificado por casualidad y han proporcionado la prueba del concepto de que las serina-treonina fosfatasas pueden inhibirse selectivamente al dirigirse a subunidades reguladoras (Das y col., 2015; Tsaytler y col., 2011). En principio, se podría aprovechar el mismo paradigma para inhibir selectivamente una de las muchas otras holofosfatasas PP1. Sin embargo, el descubrimiento racional de inhibidores selectivos de subunidades reguladoras intrínsecamente desordenadas de fosfatasas representa un desafío no resuelto.
La presente descripción proporciona un procedimiento de ensayo para determinar la unión selectiva de holoenzimas como fosfatasas (es decir holofosfatasas). Las holofosfatasas adecuadas incluyen miembros de la superfamilia de fosfatasas de fosfoproteína (PPP) que comprenden proteínas fosfatasas Ser/Thr 1-7 (PP1-7), como se reseña, por ejemplo, en (Heroes y col., FEb S Journal, 280, 584-595, 2012). PPP1R15A (también conocida como GADD34 y denominada en esta solicitud "R15A") y PPP1R15B (también conocida como CReP y denominada en esta solicitud como "R15B") son holofosfatasas de la familia PP1.
En esta solicitud, se describe un procedimiento para cribar un compuesto de prueba para determinar si el compuesto se une a una holofosfatasa de forma selectiva o no selectiva, que comprende:
i) proporcionar una primera holofosfatasa en la que dicha holofosfatasa es capturada/inmovilizada;
ii) probar un compuesto de prueba para determinar su capacidad para unirse a la primera holofosfatasa;
i) proporcionar una segunda holofosfatasa en la que dicha segunda holofosfatasa es capturada/inmovilizada;
iv) probar el mismo compuesto de prueba para determinar su capacidad para unirse a la segunda holofosfatasa;
v) comparar la unión del compuesto de prueba a dicha primera holofosfatasa con la unión a dicha segunda fosfatasa
en el que un compuesto de prueba que se une a una holofosfatasa selectivamente se unirá a dicha primera holofosfatasa pero no a dicha segunda holofosfatasa; o se unirá a dicha segunda holofosfatasa pero no a dicha primera; o en el que un compuesto que se une a una holofosfatasa de forma no selectiva se unirá tanto a dicha primera holofosfatasa como a dicha segunda holofosfatasa
De manera adecuada, la capacidad de un compuesto de prueba para unirse a una primera holofosfatasa y la capacidad del mismo compuesto de prueba para unirse a una segunda holofosfatasa se prueban secuencialmente, por ejemplo, usando chips, esferas o mezclas de reacción separados como se describe con más detalle en esta solicitud para determinar una la afinidad de unión del compuesto de prueba a cada una de las holofosfatasas por separado para comparación.
La holofosfatasa, es decir, dicha primera y/o dicha segunda holofosfatasa, puede ser una enzima oligomérica compuesta por una subunidad catalítica y una o más subunidades reguladoras. Hay más de 400 fosfatasas que regulan prácticamente todos los aspectos de la función celular, reseñados, por ejemplo, en Heroes y col. (2012). Hay más de 200 subunidades reguladoras que comparten algunas subunidades catalíticas. Las subunidades reguladoras de las fosfatasas están intrínsecamente desordenadas, es decir, no estructuradas de forma nativa (Bollen y col., 2010; Choy y col., 2012a) y tienden a estructurarse solo al unirse a su subunidad catalítica. No se han proporcionado previamente procedimientos para identificar inhibidores de tales moléculas no estructuradas de forma nativa, ya que desarrollar tales procedimientos es generalmente problemático. Cuando se usan solas (marcadas o no marcadas), las subunidades reguladoras no estructuradas en forma nativa de las fosfatasas son generalmente inestables o precipitadas. Por lo tanto, el uso de las subunidades reguladoras por sí solas no ha permitido identificar compuestos de actividades biológicas relevantes.
El procedimiento permite que los complejos que contienen las subunidades reguladoras, que son proteínas no estructuradas de forma nativa, cuando se unen a sus compañeros de interacción, se generen y se utilicen para el cribado, lo que permite identificar nuevos fármacos dirigidos a esta clase de proteína.
De forma adecuada, la holofosfatasa se aísla y se purifica mediante cualquier procedimiento disponible. La holofosfatasa puede, por ejemplo, expresarse como subunidades en un sistema de expresión adecuado tal como un sistema de expresión de células bacterianas, de insectos o de mamíferos. Las subunidades se pueden purificar mediante cualquier procedimiento adecuado como, por ejemplo, cromatografía.
Como las subunidades reguladoras de una holofosfatasa están intrínsecamente desordenadas, como se describió anteriormente, pueden ser necesarios procedimientos específicos para la expresión y purificación. Por consiguiente, la subunidad reguladora puede marcarse para facilitar la expresión y purificación. De forma adecuada, la subunidad reguladora puede marcarse con dos marcas. Las marcas adecuadas serán familiares para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcas de afinidad tales como marca de proteína de unión a maltosa, marca his, etc. Cuando se purifica R15A (y/o R15B), como se describe en esta solicitud, se puede usar una marca MBP en combinación con una marca his. Ventajosamente, una marca MBP (proteína de unión a maltosa) aumenta la solubilidad de las proteínas recombinantes expresadas en E. coli. La marca his también es una marca de afinidad. Por lo tanto, una proteína marcada con subunidad His catalítica de MBP puede purificarse en un procedimiento de dos etapas, dando como resultado una proteína pura y relativamente estable, como se describe en esta solicitud para MBP-R15A-His. La subunidad catalítica también se puede expresar de manera que comprenda una marca tal como una marca de afinidad.
Por lo tanto, la holofosfatasa puede reconstituirse ensamblando las subunidades. Alternativamente, las diferentes subunidades pueden coexpresarse en un sistema de expresión adecuado (por ejemplo, célula bacteriana, de insectos o de mamíferos) y la holoenzima puede purificarse mediante cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, cromatografía).
La holofosfatasa puede ser una proteína endógena purificada a partir de un extracto celular mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo mediante cromatografía.
La subunidad reguladora puede proporcionarse como una versión truncada de la subunidad de longitud completa. De forma adecuada, una versión truncada conservará la capacidad de unirse a la subunidad catalítica y conservará la función catalítica necesaria. Por ejemplo, y como se describe en esta solicitud, una versión truncada adecuada de R15A y/o R15B es una que conserva la capacidad de unirse a la subunidad catalítica PP1c y conserva su actividad catalítica de unirse y desfosforilar elF2a. Cuando la subunidad reguladora es R15A, puede proporcionarse como un fragmento truncado que comprende los aminoácidos 325-636. Cuando la subunidad reguladora es R15B, puede proporcionarse como un fragmento truncado que comprende los aminoácidos 340-698. Las secuencias de aminoácidos de R15A y R15B se proporcionan aquí en la figura 16. Ventajosamente, el uso de fragmentos más cortos puede superar los problemas de bajos rendimientos de proteínas y la baja estabilidad observada usando las proteínas de longitud completa. Sin embargo, los fragmentos descritos en esta solicitud, como se ejemplifica para R15A y R15B, son más grandes que los de las fosfatasas PP1c reconstituidas previamente que solo contenían fragmentos de subunidades reguladoras menores de 100 aminoácidos (Chen y col., 2015; Choy y col., 2015) . La subunidad catalítica puede ser una forma truncada de la proteína nativa. De forma adecuada, tal forma truncada conservaría su capacidad para unirse a la subunidad reguladora así como su actividad catalítica.
Dicha prueba de un compuesto de prueba para determinar su capacidad para unirse a dicha primera holofosfatasa, dicha segunda holofosfatasa o dicha subunidad catalítica puede realizarse mediante la determinación de la afinidad de unión usando un enfoque de resonancia de plasmón superficial (RPS).
La holofosfatasa puede estar inmovilizada en una superficie. Las superficies adecuadas son aquellas que permiten realizar un análisis de unión posterior. Por ejemplo, la superficie puede ser un chip tal como un chip sensor de RPS (resonancia de plasmón superficial) que es adecuado para mediciones de RPS. La superficie puede ser una esfera o resina o, por ejemplo, un pocillo de una microplaca. De forma adecuada, la holofosfatasa se reconstituye mediante inmovilización sobre una superficie.
La holofosfatasa puede inmovilizarse utilizando un procedimiento de captura por afinidad o cualquier procedimiento de captura relevante. Los procedimientos de captura por afinidad adecuados incluyen el uso biotina: estreptavidina u otros pares de unión similares, por ejemplo, histidina-níquel, glutatión GST, etc.
La subunidad catalítica de la holoenzima, como, por ejemplo, PP1c, puede inmovilizarse primero en el chip y a continuación unirse a una subunidad reguladora. Esto se muestra esquemáticamente en la figura 33 donde se demuestran las subunidades catalíticas A o B.
La holofosfatasa puede reconstituirse en las esferas utilizando una subunidad marcada por afinidad. Por ejemplo, His-PP1y/o MBP-R15A-His pueden reconstituirse en esferas. Las esferas adecuadas incluyen esferas de amilosa. De forma adecuada, las proteínas/péptidos biotinilados pueden generarse usando biotinilación in vivo en células de insecto. La marca utilizada en la subunidad reguladora y catalítica puede ser diferente.
Los ensayos para la unión del compuesto de prueba a una holofosfatasa (o subunidad catalítica) se pueden realizar en solución.
El procedimiento de cribado para un compuesto de prueba puede comprender además una etapa adicional: vi) proporcionar una subunidad catalítica de dicha primera y segunda holofosfatasa en la que dicha subunidad catalítica es capturada/inmovilizada; y
vii) probar dicha molécula inhibidora de fosfatasa candidata para determinar su capacidad de unirse a la subunidad catalítica.
Una comparación del perfil de unión de los compuestos de prueba con la unión al dominio catalítico de una holoenzima puede ser una etapa importante para determinar la selectividad o la falta de la misma de las moléculas de unión. Los compuestos candidatos de interés pueden ser aquellos que no se unen a la subunidad catalítica y/o la inhiben pero son selectivos para la holofosfatasa que comprende la subunidad catalítica junto con una subunidad reguladora específica.
En el contexto de un procedimiento de ensayo que comprende las etapas adicionales vi) y vii), y con referencia a la figura 33, un compuesto que se une a A y es un candidato a inhibidor (o activador) selectivo de A se unirá preferentemente al chip A pero no al B o C. Un compuesto que se une a B y es un candidato a inhibidor selectivo de B (o activador) se unirá preferentemente al chip B pero no a A o C. Un aglutinante o inhibidor no selectivo puede unir más de un chip.
El procedimiento puede comprender además determinar si un inhibidor selectivo o no selectivo tiene un efecto sobre la subunidad catalítica sola (por ejemplo, en un ensayo enzimático) o en el que un inhibidor que es un inhibidor o activador de una subunidad reguladora, es decir, A o B o ambos, tiene ningún efecto sobre una subunidad catalítica.
El procedimiento de cribado de un compuesto de prueba puede comprender además la realización de un ensayo de confirmación para probar una determinada actividad inhibitoria/activadora en otros ensayos. Por ejemplo, un inhibidor o activador de prueba se puede validar en un ensayo enzimático o un ensayo basado en células para demostrar la interacción de la diana. Los ensayos adecuados para la actividad de holoenzimas particulares dependerán de las vías celulares particulares en las que estén implicadas. El experto en la materia conocerá los ensayos adecuados para cualquier holoenzima particular conociendo las moléculas con las que interactúa la holoenzima como sustratos.
La interacción de la diana se puede validar repitiendo el mismo ensayo en células desactivadas o inactivadas para la fosfatasa diana. Las células desactivadas se pueden generar mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, Crispr/Cas desactivadas) y el silenciamiento génico se puede lograr mediante cualquier procedimiento adecuado, como ARNsi. En ausencia de la diana, un compuesto selectivo no tendrá efectos en las células.
Adecuadamente, la validación adicional de un compuesto de prueba puede ser mediante la validación en ensayos biológicos. Puede usarse cualquier ensayo adecuado que revele la actividad biológica de la diana. Por ejemplo, si la diana está implicada en la señalización, la inducción de la vía de señalización puede monitorizarse mediante cualquier procedimiento (por ejemplo, procedimiento basado en anticuerpos, citometría de flujo, etc.). Un inhibidor o activador de la fosfatasa alterará la vía de señalización. Se puede usar cualquier otro ensayo biológico para controlar la inhibición o activación de la diana. Por ejemplo, el ensayo puede ser un ensayo de crecimiento si la actividad diana afecta el crecimiento celular, pueden ser ensayos de muerte (si la actividad diana es importante para la supervivencia celular), puede ser protección contra químicos (si la vía que está involucrada es una protección contra químicos), etc.
De forma adecuada, un inhibidor selectivo de fosfatasa aumentará o prolongará la fosforilación de su sustrato. Un inhibidor selectivo puede ser uno que tiene afinidad de unión o actividad biológica cuando se presenta en concentraciones por debajo de 10 pM, incluso más preferiblemente por debajo de 5 pM, incluso más preferiblemente por debajo de 1 pM e incluso más preferiblemente por debajo de 0,5 pM.
En la figura 33, se muestra un ejemplo de un procedimiento de ensayo según la invención.
En este ejemplo, el procedimiento consta de las siguientes etapas (figura 33):
1. Aislar y purificar una holofosfatasa (llamada A) en este ejemplo.
Esto puede realizarse mediante cualquier procedimiento disponible, ya sea utilizando la proteína endógena o expresando las subunidades en cualquier sistema adecuado (bacterias, células de insectos o mamíferos, etc.), purificándolas y reconstituyendo una holofosfatasa. En este ejemplo, la subunidad catalítica de la fosfatasa PP1c se biotinila in vivo para la captura de alta afinidad en un CHIP de RPS de estreptavidina.
2. Inmovilización de la holofosfatasa en el chip
En el presente ejemplo, la subunidad catalítica PP1c se inmoviliza primero en el chip y a continuación se une a una subunidad reguladora (A o B en el presente ejemplo).
3. Cribado de moléculas/compuestos de prueba que se unen a la holofosfatasa A (chip A)
4. Repetición de las etapas 1-3 con una fosfatasa diferente llamada B en este ejemplo (chip B)
5. Repetición de las etapas 1-2 usando la subunidad catalítica para generar el chip C
6. Perfilamiento de la selectividad de los compuestos de prueba probando su unión a los chips A, B y C.
Un inhibidor (o activador) selectivo A se unirá preferentemente al chip A pero no al B o C. Un inhibidor (o activador) selectivo B se unirá preferentemente al chip B pero no al A o C. Un inhibidor no selectivo puede unir más de un chip. Los compuestos de prueba identificados por este procedimiento pueden probarse para determinar su actividad solo en subunidades catalíticas. Un aglutinante selectivo o inhibidor o activador de una subunidad reguladora no tiene ningún efecto sobre una subunidad catalítica.
Los compuestos identificados por este procedimiento se validan en otros ensayos, incluidos ensayos enzimáticos o ensayos basados en células para demostrar la interacción de la diana. Un inhibidor selectivo de fosfatasa aumentará o prolongará la fosforilación de su sustrato. Para validar la interacción de la diana, se repite el mismo ensayo en las células que están desactivadas o inactivadas para la fosfatasa diana. En ausencia de la diana, un compuesto selectivo no tendrá efectos en las células.
Los compuestos pueden validarse en ensayos biológicos. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con ensayos adecuados que revelen la actividad de una diana particular.
También se describe en esta solicitud una serie de procedimientos de ensayo para su uso en la identificación, cribado, evaluación o caracterización de polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas capaces de inhibir PPP1R15B ("R15B").
Breve descripción de las Figuras
Se describen ahora ciertas realizaciones de la presente invención, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
FIGURAS
La figura 1 muestra la unión selectiva de un inhibidor de R15B del ejemplo 1 a R15B-PP1 sobre R15A-PP1.
La figura 2 muestra que un inhibidor selectivo de R15B del ejemplo 1 induce una fosforilación transitoria de elF2a en las células en ausencia de estrés e induce la expresión de R15A en células.
La figura 3 muestra que un inhibidor selectivo de R15B del ejemplo 1 protege a las células del estrés.
La figura 4 muestra los efectos de un inhibidor selectivo R15B sobre la fosforilación de elF2a después de estrés. El compuesto del ejemplo 1 prolonga la fosforilación de elF2a después de estrés.
La figura 5 muestra la distribución de tejido de un compuesto del ejemplo 1que exhibe una distribución extensa del tejido.
La figura 6 muestra que el tratamiento de ratones con un compuesto del ejemplo 1 (10 mg/kg) no es tóxico.
La figura 7 muestra que el tratamiento de ratones con un compuesto del ejemplo 1 (10 mg/kg) no causa los efectos secundarios de guanabenz.
La figura 8 muestra la inducción de R15A en un mamífero después del tratamiento con un compuesto del ejemplo 1.
La figura 9 muestra la efectividad de un inhibidor de R15B en el ejemplo 1 para prevenir la enfermedad en un mamífero. El ejemplo usado en la figura 9 es la enfermedad de Huntington que utiliza HD82Gln del modelo de ratón(Schilling y col., Hum. Mol. Genet., 8, 387-407, 1999). WT: ratones de tipo salvaje. Tg: HD82Gln.
La figura 10 muestra los internódulos de mielina en rojo (en forma de varilla) de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) cultivados y los núcleos en azul (en forma de «gota» esférica) del genotipo indicado tratado con el vehículo o compuesto del ejemplo 1. Los entrenudos de mielina en ratones mutantes para PMP22 son más cortos. El tratamiento con un compuesto del ejemplo 1 aumentó la longitud de los internódulos de mielina en los GRD de los mutantes, revelando que mejoró la mielinización.
La figura 11 mostró niveles de glucosa en sangre en ratones obesos db/animales db (n=5 por afección) después del tratamiento con el compuesto del ejemplo 1.
La figura 12 muestra un gel teñido con InstantBlue (azul de Comassie) que muestra las proteínas recombinantes MBP-R15A325-636 -His, MBP-R15B34°"698 -His.
La Figura 13 A. muestra una ilustración esquemática que ilustra el procedimiento RPS usado para determinar las afinidades de unión de guanabenz biotinilado (Bio-GBZ) a R15A y R15B. B. Sensogramas de RPS de R15A y R15B que se unen a bio-GBZ inmovilizados en la superficie del chip del sensor de RPS. Concentración de R15A/B = 0,0244­ 12,5 pM.
La figura 14 muestra que las unidades de respuesta de la figura 13B se representaron gráficamente frente a las concentraciones de proteína para determinar la constante de unión en estado estable (Kd). Unión de R15A (O, azul) y de R15B (▲, magenta). Kd de R15A para bio-GBZ es 11 pM y Kd de R15B para bio-GBZ es 123 pM.
Figura 15 Panel superior: gel teñido con InstantBlue que muestra bio-PP1 recombinante (parcialmente purificado), MBP-R15A325-636 'His y MBP-R15B34"'698 ’His(entrada). BAP-PP1c, purificado en esferas de neutravidina, se unió a R15A y R15B (unido). Bio-PP1c = PP1 biotinilada. Panel inferior: inmunotransferencia que muestra PP1c biotinilada. Figura 16 Alineaciones de R15A y R15B humanas. Aunque funcionalmente relacionados, R15A y R15B son diferentes y comparten solo 23 % identidad.
La figura 17 muestra una ilustración esquemática que representa la reconstitución de las holofosfatasas R15 en un chip de estreptavidina (SA) - RPS.
La figura 18 muestra los sensogramas de RPS de la unión de guanabenz a la holofosfatasa R15A-PP1c inmovilizada en un chip sensor de RPS.
La figura 19 muestra los sensogramas de RPS de la unión de guanabenz a la holofosfatasa R15A-PP1c inmovilizada en un chip sensor de RPS.
La figura 20 muestra los sensogramas de RPS de la unión de guanabenz a la holofosfatasa PP1c inmovilizada en un chip sensor de RPS.
La figura 21 muestra las afinidades en estados estacionarios de GBZ por R15A-PP1c, R15B-PP1c y PP1c inmovilizados en chips de RPS de la presente invención. Enlace de GBZ a R15A/PP1c (o) y R15B/PP1c (A) inmovilizado en la superficie del chip del sensor de estreptavidina. Las unidades de respuesta se representaron frente a la concentración de compuesto para determinar la constante de unión en estado estacionario (Kd). La Kd de GBZ para R15A es 0,1221 pM y no se detectó unión de GBZ a R15B.
La figura 22 muestra las afinidades en estados estacionarios de Sephin1 por R15A-PP1c, R15B-PP1c y PP1c inmovilizados en chips de RPS de la presente invención. La Kd de Sephin1 para R15A es 0,786 pM y para R15B es 23 pM.
La figura 23 muestra las afinidades en estados estacionarios de Salubrinal por R15A-PP1c, R15B-PP1c y PP1c inmovilizadas en chips de RPS de la presente invención..
La figura 24 muestra las afinidades en estados estacionarios de TST3 por R15A-PP1c, R15B-PP1c y PP1c inmovilizadas en chips RPS de la presente invención.
La figura 25 muestra las afinidades en estados estacionarios de diferentes compuestos por R15A-PP1c, R15B-PP1c y PP1c inmovilizados en chips de RPS de la presente invención.
Tabla que muestra GBZ, Sephin1 Sal003 y TST3 y sus respectivas afinidades (Kd) por las holofosfatasas de elF2a o PP1c solo. (-): Sin unión. En cada panel, se muestran resultados representativos de al menos tres experimentos independientes. Los datos son medias ± DE, n=3. Los valores de Kd se calcularon con un modelo de afinidad de estado estacionario mediante el software de análisis Biacore T200 (Biaevaluation Versión 1.0).
Figura 26 A diferencia de la caliculina A, un inhibidor catalítico de PP1, TST3, como GBZ y Sephin1 no inhibe PP1c Figura 27 TST3 induce transitoriamente la fosforilación de elF2a inhibiendo selectivamente R15B. Inmunotransferencias de las proteínas indicadas en lisados de células HeLa tratadas con TST3 a 10 pM
Figura 28 TST3 reduce transitoriamente la síntesis de proteínas porque inhibe selectivamente R15B pero no R15A. Autorradiograma de proteínas recién sintetizadas radiomarcadas con 35S-metionina de lisados de células HeLa tratadas con TST3 a 10 pM durante el tiempo indicado. Panel inferior: tinción InstantBlue.
Figura 29 TST3 inhibe persistentemente la síntesis de proteínas en presencia de GBZ. Autorradiograma de proteínas recién sintetizadas radiomarcadas con 35S-metionina de lisados de células HeLa tratadas con TST3 /- GBZ a 10 pM durante el tiempo indicado. Panel inferior: Tinción InstantBlue
Figura 30 TST3 induce persistentemente la fosforilación de elF2a en presencia de GBZ. Inmunotransferencias de las proteínas indicadas en lisados de células HeLa tratadas con TST3+GBZ a 10 pM.
Figura 31 La actividad de TST3 se suprime en células desactivadas de r15b.
Inmunotransferencias de las proteínas indicadas en lisados de MEF r15amut/mut o r15bmut/mut tratados con TST3 a 10pM durante el tiempo indicado.
Figura 32 TST3 no tiene ningún efecto sobre la síntesis de proteínas en células r15B-/-. Panel superior: autorradiograma de proteínas recién sintetizadas radiomarcadas con 35 S-metionina de lisados de MEF r15amut/mut o r i5 b mut/mut tratados con TST3 a 10 pM durante el tiempo indicado.
Descripción detallada de la invención
La fosforilación de la subunidad a de eIF2a es la primera línea de defensa contra una variedad de tensiones y, por lo tanto, es un componente central de dos vías de señalización parcialmente superpuestas: la respuesta de proteína no plegada (UPR) y la respuesta integrada al estrés (ISR). Para revertir la fosforilación de eIF2a, las células de mamífero tienen dos fosfatasas de eIF2a. Las eIF2a fosfatasas son holoenzimas diméricas que comparten una subunidad catalítica PP1c con aproximadamente otras 200 fosfatasas y están unidas a una de dos subunidades reguladoras relacionadas: PPP1R15A (Novoa y col., The Journal of Cell Biology, 153, 1345-1355, 2001), una proteína inducible por estrés o PPP1R15B, que se expresa constitutivamente (Jousse y col., The Journal of Cell Biology, 163, 767-775, 2003).
La inhibición de PPP1R15A («R15A») inhibe selectivamente la eIF2a fosfatasa inducida por estrés compuesta de PPP1R15A y PP1, mientras que evita la fosfatasa PPP1R15B-PP1 estrechamente relacionada y constitutiva. La inhibición de PPP1R15A prolonga la fosforilación de eIF2a en células estresadas y esto da como resultado una prolongación de la atenuación de la traducción en células estresadas. Como consecuencia, la disponibilidad de chaperonas aumenta en las células estresadas porque se pueden obtener las chaperonas que normalmente se dedican a ayudar al plegamiento de proteínas recién sintetizadas cuando se reduce la traducción. Esto favorece el plegamiento de proteínas y rescata a las células de los defectos de proteostasis de proteínas. Por tanto, en principio, los inhibidores de PPP1R15A podrían tratar enfermedades de mamíferos que implican estrés por mal plegamiento de proteínas. La inhibición de la PPP1R15A en mamíferos tiene un atractivo potencial terapéutico porque se prevé que la inhibición de la PPP1R15A es segura, ya que los ratones knock-out de la PPP1R15A/GADD34 son prácticamente indistinguibles de los ratones de tipo salvaje (Marciniak y col., Genes & Development, 18, 3066-3077, 2004). Sin embargo, se prevé que el número de indicaciones terapéuticas que pueden tratarse con inhibidores de PPP1R15A está restringido a enfermedades en las que se expresa PPP1R15A y en las que PPP1R15A se encuentra en el modo de acción de la enfermedad. Por tanto, la inhibición de PPP1R15A puede ser potente y segura, pero estará restringida a enfermedades que involucran a PPP1R15A.
Independientemente de las limitaciones asociadas con la inhibición de PPP1R15A, el enfoque de restaurar la proteostasis al ajustar la traducción para aumentar la disponibilidad de chaperonas es en teoría convincente, sencillo y aplicable para corregir una amplia gama de enfermedades que involucran proteínas mal plegadas. Como se indicó anteriormente, el uso de inhibidores de PPP1R15A estará restringido a enfermedades en las que se expresa PPP1R15A y en las que PPP1R15A se encuentra en el modo de acción de la enfermedad.
Para ampliar la gama de enfermedades para las que se puede usar la inhibición selectiva de PP1, la presente invención busca proporcionar un procedimiento para identificar los inhibidores selectivos y/o no selectivos de PP1.
Como se usa en esta solicitud, el término «inhibidor de PPP1R15A» se refiere a un inhibidor selectivo seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas. El término «PPP1R15A» se usa indistintamente con el término «R15A». De manera adecuada, un «inhibidor de PPP1R15A» es un inhibidor que es selectivo para R15A sobre R15B y/o PPIc. Los ensayos de inhibición selectiva se describen en esta solicitud.
Como se usa en esta solicitud, el término «inhibidor de PPP1R15A y PPP1 R15B» se refiere a un inhibidor selectivo seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas. Adecuadamente, un «inhibidor de PPP1R15A e inhibidor de PPP1R15B» es un inhibidor que se une a y/o inhibe tanto R15A como R15B. Los ensayos para tales inhibidores se describen en esta solicitud.
Como se usa en esta solicitud, el término «inhibidor de PPP1R15B» se refiere a un inhibidor selectivo seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas. El término «PPP1R15B» se usa indistintamente con el término «R15B». De manera adecuada, un «inhibidor de PPP1R15B» es un inhibidor que es selectivo para R15B sobre R15A. and/or PPIc. Los ensayos de inhibición selectiva se describen en esta solicitud.
En una realización, un «un inhibidor selectivo» puede definirse como un compuesto en el que la diferencia en los valores KD entre una holofosfatasa, tal como R15A o R15B, y otra está en la región de 3 veces y, preferiblemente, mayor que 3 veces, o incluso más preferiblemente 10 o 20 veces.
COMPUESTOS DE PRUEBA
Un compuesto de prueba para usar en el ensayo descrito en esta solicitud puede ser una proteína o polipéptido, polinucleótido, anticuerpo, péptido o compuesto de molécula pequeña. En una realización, el ensayo puede abarcar el cribado de una colección de compuestos de prueba, por ejemplo, una colección de proteínas, polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas. Los expertos en la técnica conocerán procedimientos de cribado de alto rendimiento adecuados. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una RPS de alto rendimiento utilizando matrices.
ENSAYO
Los inhibidores descritos en esta solicitud en los ejemplos 1 a 4 se unen selectivamente al complejo PPP1R15B-PP1 pero no se unen, o la unión es significativamente menor, al complejo PPP1R15A-PP1. Preferiblemente, el inhibidor de PPP1R15B exhibe una Kd para el complejo PPP1R15B-PP1 de 1 pM o menos y exhibe unión 5 veces mayor, preferiblemente 10 veces mayor, o incluso más preferiblemente al menos 20 veces mayor para el complejo PPP1R15A-PP1.
Por ejemplo, el compuesto del ejemplo 1 tiene una Kd de 0,035 pM para PPP1R15B-PP1 y 1 pM para PPP1R15A-PP1 y el compuesto del ejemplo 2 tiene una Kd de 5 pM para PPP1R15A-PP1 y una Kd de 0,143 pM para PPP1R15B-PP1. Se había pensado anteriormente que el compuesto del ejemplo 2 era un inhibidor no selectivo (documento WO2014108520). Sin embargo, anteriormente no era posible medir los valores de Kd. Con los ensayos novedosos descritos en esta solicitud, los presentes inventores han establecido los valores de Kd y han revelado que, para el compuesto del ejemplo 2, la diferencia de afinidades es superior a 30 veces. Por tanto, se considera que el ejemplo 2 es un inhibidor selectivo de PPP1R15B-PP1. Se descubrió que el ejemplo 3 tenía una Kd de 0,149 pM para PPP1R15B-PP1 y 3,93 pM para PPP1R15A-PP1 y se descubrió que el compuesto del ejemplo 4 tenía una Kd de 0,457 pM para PPP1R15A-PP1 y una Kd de 0,022 pM para PPP1R15B-PP1.
Se describe en esta solicitud un ensayo para determinar polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas que inhiben selectivamente PPP1R15B sobre PPP1R15A. También se describe un ensayo para determinar polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas que inhiben selectivamente PPP1R15A sobre PPP1R15B. También se describe un ensayo para determinar polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, péptidos o compuestos de moléculas pequeñas que inhiben selectivamente PPP1R15B sobre PPP1R15A.
La unión selectiva puede ser a PPP1R15B solamente o a PPP1R15B en un complejo con PP1. Asimismo, la unión selectiva puede ser a PPP1R15A solamente o a PPP1R15A en un complejo con PP1.
En esta solicitud, se describe un ensayo de unión competitiva en el que el ensayo comprende poner en contacto un compuesto descrito en esta solicitud con PPP1R15B y un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo o fragmento candidato del mismo, péptido o compuesto de molécula pequeña y detectar cualquier cambio en la interacción entre el compuesto y PPP1R15B.
Alternativamente, el ensayo de unión competitiva puede comprender poner en contacto un compuesto descrito en esta solicitud con PPP1R15B en presencia de un sustrato conocido de PPP1R15B y detectar cualquier cambio en la interacción entre PPP1R15B y dicho sustrato conocido.
Opcionalmente, el ensayo se utiliza como cribado o cribado analítico masivo (HTS).
Sin embargo, aunque se puede usar un ensayo de unión para cribar candidatos que se unen selectivamente a PPP1R15B, las propiedades de un candidato no se predicen necesariamente mediante un ensayo de unión. Por tanto, se necesitan otros ensayos para evaluar si el compuesto inhibe la función de PPP1R15B o no.
También se describe un conjunto de ensayos para determinar la inhibición selectiva de PPP1 R15B o PPP1R15A de un candidato seleccionado de un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo, péptido o compuesto de molécula pequeña, en el que el ensayo comprende las etapas de:
i) tratar células de mamífero con el candidato;
ii) monitorizar la fosforilación de elF2a a lo largo del tiempo;
en el que la inducción transitoria de la fosforilación de elF2a indica la inhibición selectiva de PPP1R15B o PPP1R15A.
Opcionalmente, el ensayo se utiliza como un cribado analítico masivo. Por ejemplo, la fosforilación de elF2a puede detectarse mediante un procedimiento adecuado para un HTS como, entre otros, la detección inmunológica de la fosforilación de elF2a (por ejemplo, el ensayo AlphaScreen® SureFire ™ Phospho-elF2a (Ser51)).
Un inhibidor selectivo de PPP1R15B induce una fosforilación transitoria de elF2a porque elF2a es finalmente desfosforilado por PPP1R15A. Por tanto, el cribado de compuestos que solo inducen de forma transitoria la fosforilación de elF2a conducirá a la identificación de inhibidores selectivos de PPP1R15B. Alternativamente, puede usarse cualquier otro procedimiento para controlar la fosforilación de elF2a directa o indirectamente en un HTS. Por ejemplo: la monitorización de las velocidades de traducción reflejará la fosforilación de elF2a; un inhibidor selectivo de PPP1R15B solo reducirá transitoriamente las velocidades de traducción y esta propiedad se puede usar en un HTS para identificar el inhibidor selectivo de PPP1R15B. Dado que la fosforilación de elF2a induce ATF4, PPP1R15A y CHOP, estos genes o proteínas pueden usarse como indicadores en un cribado para identificar inhibidores selectivos de PPP1R15B en las condiciones descritas en esta solicitud en las que la fosforilación de elF2a es solo transitoria.
Se puede generar un compuesto candidato mediante la modificación de SAR convencional de un compuesto de cualquiera de los ejemplos 1 a 4.
El inhibidor de PPP1R15B puede ser capaz de proteger a las células del estrés al menos20%, más preferiblemente al menos 30%, incluso más preferiblemente al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, y más preferiblemente aún, por al menos 90%.
Por ejemplo, el inhibidor del ejemplo 1 protege a las células del estrés del RE citotóxico causado por la tunicamicina. La citoprotección contra el estrés del RE se puede medir mediante un ensayo adecuado. En este caso, se midió la citoprotección en células HeLa en las que se provocó estrés en el RE mediante la adición de medio que contenía tunicamicina, un fármaco que bloquea la N-glicosilación, evitando así el plegamiento de proteínas e induciendo la respuesta de la proteína no plegada. La viabilidad celular puede detectarse en presencia y ausencia del inhibidor de PPP1R15B después de un período de tiempo establecido, al medir la reducción de WST-8 en formazán utilizando un kit de viabilidad celular estándar (tal como Cell Viability Counting Kit-8 de Dojindo). La citoprotección del estrés del RE se midió en términos del porcentaje de aumento de células viables (en relación con el control) después del estrés del RE.
Por extensión, un compuesto del Ejemplo 1 es capaz de proteger las células contra el estrés inducido por tunicamicina, pero también otros tipos de estrés tales como, de modo no taxativo, estrés inducido por tapsigargina, estrés causado por mal plegamiento de proteínas, análogos de aminoácidos (por ejemplo azetidina, canavanina), agentes reductores (DTT) y estrés oxidativo.
La citoprotección del estrés se puede utilizar para identificar más inhibidores de PPP1R15B. Opcionalmente, el ensayo se utiliza como un cribado analítico masivo. Por ejemplo, HTS puede usarse para medir la supervivencia celular bajo estrés con el fin de identificar nuevos inhibidores de PPP1R15B.
En esta solicitud, se describe un ensayo de viabilidad celular comparativo para determinar selectivamente un inhibidor de PPP1R15B que comprende las etapas de i) tratar las células desactivadas de PPP1R15A y PPP1R15B con el inhibidor de PPP1R15B, y a continuación ii) comparar con la viabilidad de las células desactivadas de PPP1R15A y PPP1R15B naturales.
Este ensayo es análogo al ensayo utilizado para demostrar la selectividad de los inhibidores de PPP1R15A. Las células que carecen de actividad PPP1R15A o PPP1R15B son viables, mientras que las células que carecen tanto de la fosfatasa constitutiva (PPP1R15B-PP1) como de la inducida por estrés (PPP1R15A-PP1) elF2a no son viables (Harding y col., Proc. Natl. Acad. Sci . Estados Unidos, 106, 1832-1837, 2009; Tsaytler y col., Science, 332, 91-94, 2011). Se han utilizado células desactivadas de PPP1R15A y PPP1R15B para evaluar la selectividad de un inhibidor de PPP1R15A. Guanabenz reduce la viabilidad de las células que carecen de PPP1R15B porque la falta de actividad de PPP1R15A y PPP1R15B es perjudicial (Tsaytler y col., FEBS Journal, 280, 766-770, 2011). Por tanto, los inventores han razonado que la selectividad de los inhibidores de PPP1R15B podría revelarse en las células comparando la viabilidad de las células desactivadas de PPP1R15A y PPP1R15B naturales después de un tratamiento con inhibidores de PPP1R15B. La inactivación tanto de PPP1 R15A como de PPP1R15B es letal (Harding y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 1832-1837, 2009). Por tanto, las células que carecen de actividad PPP1R15A que se han tratado con un inhibidor de PPP1R15B reducen selectivamente su viabilidad, lo que confirma la presencia de un inhibidor selectivo de PPP1R15B.
Este ensayo de viabilidad celular puede usarse para un HTS para identificar otros inhibidores de PPP1R15B que serán selectivamente tóxicos para las células que carecen de PPP1R15A o en el que se ha inhibido PPP1R15A. Estas células se pueden generar mediante un procedimiento convencional de inactivación de genes (desactivados, Crispr/Cas9, ARNip, por ejemplo). Alternativamente, PPP1R15A puede inhibirse farmacológicamente con guanabenz o cualquier otro inhibidor selectivo de PPP1R15A. Un inhibidor selectivo de PPP1R15B reducirá la viabilidad de las células tratadas con un inhibidor de PPP1R15A en mayor grado que las células tratadas solo con inhibidor de PPP1R15B.
También se pueden usar ensayos de actividad de fosfatasa para cribar inhibidores de PPP1R15B.
En esta solicitud, se describe un procedimiento para identificar inhibidores selectivos de la fosfatasa.
KITS Y APARATOS
En esta solicitud, se describen kits y/o aparatos dispuestos para su uso y/o cuando se usan para un procedimiento de cribado según la invención. Los kits y/o aparatos adecuados pueden incluir chips de RPS u otras superficies sólidas generadas para "mostrar" una primera y/o segunda holofosfatasa a través de la unión de la superficie a un chip o superficie sólida, por ejemplo, una esfera o placa de microtitulación. De forma adecuada, se puede disponer un chip o esfera de tal manera que permita llevar a cabo el procedimiento de cribado como se describe en esta solicitud.
También se describe un kit para su uso en un procedimiento de cribado según la divulgación en esta solicitud. De forma adecuada, dicho kit puede comprender una primera holofosfatasa capturada sobre una primera superficie y una segunda holofosfatasa capturada sobre una segunda superficie. Tal primera y/o segunda superficies pueden ser chips o esferas adecuados para el análisis de una reacción de unión por RPS. El kit o aparato puede usarse para un procedimiento de cribado como se describe en esta solicitud.
APLICACIONES TERAPÉUTICAS
Los inhibidores identificados mediante un ensayo descrito en esta solicitud, incluidos los inhibidores de PPP1R15A y/o PPP1R15B, tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en el tratamiento y prevención de diversas enfermedades y trastornos. La inhibición de la desfosforilación de elF2a disminuye la traducción y, como resultado, aumenta la disponibilidad de chaperones para favorecer el plegamiento.
Los inventores han demostrado, por ejemplo, que:
• un inhibidor de PPP1R15B (ejemplificado por el compuesto expuesto en el ejemplo 1) tiene una buena distribución tisular;
• la inhibición de PPP1R15B es segura en un mamífero (figura 5, 6, 7);
• la inhibición de PPP1R15B previene una enfermedad en un mamífero (figura 9); y
• la inhibición de PPP1R15B reduce un trastorno metabólico en un mamífero (figura 11).
Las enfermedades relacionadas con PPP1R15B son enfermedades que pueden mejorarse mediante inhibición de PPP1R15B. Estas incluyen trastornos asociados con la acumulación de proteínas mal plegadas o la alteración en la homeostasis proteica (proteostasis), como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, ataxias y otros trastornos de la poliglutamina, así como la degeneración de la retina, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedades priónicas; trastornos asociados con la agregación de la proteína tau asociada a los microtúbulos e incluyen la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica y complejo parkinsonismo-demencia, enfermedad del grano argirofílico, encefalopatía traumática crónica, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación (DNTC), síndrome de Down, demencia familiar británica (FBD), demencia familiar danesa (FDD), demencia frontotemporal y parkinsonismo relacionados con el cromosoma 17 (FTDP-17), degeneración lobar frontotemporal (DLFT), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, parkinsonismo de Guadalupe, distrofia miotónica, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral con proteína priónica, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, retraso mental relacionado con SLC9A6, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia solo ovillos, y tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares; trastornos de la mielina, como esclerosis múltiple, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de desvanecimiento de la sustancia blanca, encefalomielitis diseminada aguda, leucomalacia periventricular, lesión de la sustancia blanca periventricular, Tabes dorsalis, enfermedad de Devic, neuritis óptica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, mielitis transversa, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica anti-MAG, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, lesión difusa de la sustancia blanca, síndrome de Guillain-Barré, mielinólisis central pontina, enfermedades desmielinizantes hereditarias tales como leucodistrofia y enfermedad de Charcot Marie Tooth; enfermedades causadas por el mal plegamiento o defectos de tráfico de cualquier proteína producida en el retículo endoplásmico (RE), como fibrosis quística, bocio hipotiroideo congénito, diabetes neurohipofisaria familiar, trastornos de la biosíntesis de procolágeno, incluida la osteogénesis imperfecta, hipercolesterolemia, deficiencias de alfa-1 antitripsina, trastorno lisosómico, retinitis pigmentosa (RP) y enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedades metabólicas, tales como diabetes, síndrome de Wolcott-Rallison, obesidad, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, enfermedad del hígado graso y aterosclerosis; cáncer; envejecimiento; inflamación; y otros trastornos que incluyen artritis reumatoide, diabetes tipo 1 y vitiligo.
En una realización preferida, el inhibidor de PPP1R15B que es el compuesto del ejemplo 1, es para utilizarse en el tratamiento de trastornos asociados con UPR o ISR patológica y/o defectos en la homeostasis de la proteína.
En una realización, el inhibidor de PPP1R15B tiene la estructura del compuesto del ejemplo 1.
También se describe un inhibidor de PPP1R15B que tiene la estructura del compuesto del ejemplo 2.
También se describe un inhibidor de PPP1R15B que tiene la estructura del compuesto del ejemplo 3.
También se describe un inhibidor de PPP1R15B que tiene la estructura del compuesto del ejemplo 4.
Tal como se utiliza en esta invención, el término «procedimiento» se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluidos, entre otros, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos que se conocen o se desarrollan fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos de los profesionales de la técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto que se administra que aliviará hasta cierto grado uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata.
En esta solicitud, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una enfermedad o trastorno, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno.
La expresión "fabricación de un medicamento" incluye el compuesto descrito anteriormente directamente como medicamento además de su uso en un programa de cribado de agentes activos adicionales o en cualquier etapa de la fabricación de tal medicamento.
Enfermedades con potencial mal plegamiento de proteínas o péptidos y/o agregación en su modo de acción
Las proteínas que causan enfermedades se expresan a lo largo de la vida, pero las enfermedades degenerativas son en su mayoría de aparición tardía. Esto sugiere que las diferentes proteínas que causan enfermedades gradualmente se vuelven perjudiciales con el tiempo. Si bien ahora está bien establecido que las proteínas mal plegadas causan distintas enfermedades degenerativas, sigue sin quedar claro por qué se acumulan. Las células normalmente se esfuerzan por asegurar que las proteínas estén correctamente plegadas y, de hecho, todas las células tienen sistemas de control de calidad de proteínas potentes y sofisticados que manejan de manera muy eficaz las proteínas potencialmente dañinas durante décadas. Sin embargo, los mecanismos de control de la calidad de las proteínas parecen fallar gradualmente con la edad, lo que lleva a la acumulación de proteínas mal plegadas con las consecuencias catastróficas resultantes para las células y los organismos. Estas proteínas o péptidos mal plegados/agregados pueden estar presentes dentro o fuera de la célula y pueden encontrarse en cualquier lugar. En principio, potenciar las defensas celulares naturales contra proteínas mal plegadas debería representar un enfoque genérico para reducir la patología en diversas enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas donde las proteínas mal plegadas/propensas a la agregación están presentes en la patología. La presente invención describe tal enfoque y demuestra tanto su seguridad como su eficacia en un mamífero.
Enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), ataxias y otros trastornos poliglutamínicos, tauopatías, así como degeneración retiniana, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedades priónicas son devastadores y afectan a una cantidad cada vez mayor de personas de la población que envejece. Estas enfermedades son clínicamente diversas pero comparten un mecanismo común. Son causadas por la disfunción progresiva y la muerte de células nerviosas específicas en regiones selectivas del cerebro debido a la acumulación de proteínas específicas de forma aberrante. Las proteínas propensas a la agregación y mal plegadas incluyen, de modo no taxativo: Ap42, a-sinucleína, TAU, TDP-43, TLS/FUS, SOD1, Huntingtina y otras proteínas con expansión de poliglutaminas, priones y producto(s) de traducción de C9ORF72.
El solicitante ha demostrado que el compuesto del ejemplo 1 inhibe selectivamente PPP1R15B-PP1, corrigiendo una enfermedad de mal plegamiento de proteínas en ratones. Por tanto, los inhibidores de PPP1R15B descritos en esta invención tienen aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de una variedad de enfermedades en las que está implicada una proteína mal plegada y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas.
Como ejemplo, el solicitante ha demostrado que el compuesto del ejemplo 1 mejora la enfermedad de Huntington en un mamífero. Por tanto, sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que un inhibidor de PPP1R15B tal como, pero de modo no taxativo, un compuesto de cualquiera de los ejemplos 1 a 4, tiene un efecto protector contra diversas enfermedades causadas por proteínas mal plegadas/agregadas tales como, de modo no taxativo, la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), ataxias y otros trastornos de poliglutamina, así como, degeneración retiniana, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), tauopatías y enfermedades priónicas.
La presente invención proporciona tratamiento de trastornos de poliglutamina. La enfermedad de Huntington pertenece a un grupo más amplio de trastornos, los "trastornos de poliglutamina", que se caracterizan por la expansión de los codones CAG traducidos en glutamina en proteínas no relacionadas. La enfermedad de Huntington es causada por una expansión en el gen que codifica Huntingtin; La atrofia muscular espinal y bulbar, la atrofia dentatorubropálidoluisiana y las ataxias espinocerebelosas son causadas por la expansión de genes que codifican el receptor de andrógenos, la atrofina 1, la ataxina 1, 2, 3, la subunidad del canal de calcio dependiente del voltaje a y la TBP, respectivamente. La expansión de CAG se traduce en poliglutamina y provoca la agregación de la proteína afectada. En consecuencia, la prevención y/o el tratamiento de trastornos de poliglutamina como estos están dentro del alcance de la invención.
Las enfermedades incluyen cualquier enfermedad en la que el mal plegamiento/agregación está relacionado con las proteínas conocidas en la actualidad y descritas anteriormente, pero también será aplicable a nuevas proteínas y quizás a nuevas enfermedades en el futuro.
En una realización preferida, la invención proporciona tratamiento de enfermedades de proteostasis.
En otra realización, un inhibidor de PPP1R15B que es el compuesto del ejemplo 1, se usa para tratar una enfermedad en la que la acumulación de proteínas mal plegadas está involucrada en el modo de acción.
En una realización adicional, la enfermedad o trastorno es enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), ataxias u otro trastorno de poliglutamina, degeneración retiniana, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), tauopatías o una enfermedad priónica.
En una realización particular, un compuesto del ejemplo 1 se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
En otra realización particular, un compuesto del ejemplo 1 se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
En una realización, la enfermedad o trastorno está asociado con la agregación de la proteína tau asociada a microtúbulos.
El solicitante ha demostrado que el compuesto del ejemplo 1 inhibe selectivamente PPP1R15B-PP1, corrigiendo una enfermedad de mal plegamiento de proteínas en ratones. Los inhibidores de PPP1R15B también pueden ser útiles para prevenir o detener la progresión de enfermedades causadas por el mismo mecanismo: acumulación de proteínas mal plegadas.
Algunos ejemplos de tales enfermedades incluyen enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, parkinsonismo y demencia, enfermedad de granos argirófilos, encefalopatía traumática crónica, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (ONDC), síndrome de Down, demencia familiar británica (DFB), demencia familiar danesa (DFD), demencia frontotemporal y parkinsonismo relacionados con el cromosoma 17 (FTDP-17) (causados por mutaciones de MAPT), degeneración lobar frontotemporal (DLFT) (algunos casos causados por mutaciones de C9ORF72), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, parkinsonismo de Guadalupe, distrofia miotónica, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral con proteína priónica, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, retraso mental relacionado con SLC9A6, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia solo ovillos, tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares.
En una realización, el trastorno es un trastorno de mielina.
La mielina es una proteína abundante tanto del sistema nervioso central como del periférico. Es producida por dos tipos de células: oligodendrocitos en el sistema nervioso central y células de Schwann en el sistema nervioso periférico. La mielina forma una vaina alrededor de los axones para asegurar la velocidad de conducción de los impulsos eléctricos a lo largo de un axón y para evitar que la corriente eléctrica se disipe del axón. La función de la mielina es esencial para el sistema nervioso.
Los trastornos de la mielina afectan a más de 2,5 millones de personas en todo el mundo y se definen como una enfermedad asociada con daños en la mielina. Los trastornos de la mielina se manifiestan por diversos síntomas que incluyen, entre otros, deficiencias motoras, deficiencias sensoriales, disfunción cognitiva, alteraciones emocionales y alteraciones de la coordinación.
Existen muchos trastornos desmielinizantes, el más común de los cuales es la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune que afecta el cerebro y la médula espinal y produce desmielinización en el cerebro. Además de la EM, otros trastornos desmielinizantes incluyen, de modo no taxativo, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher y la enfermedad de desvanecimiento de la sustancia blanca, encefalomielitis diseminada aguda, leucomalacia periventricular, lesión de la sustancia blanca periventricular, Tabes dorsalis, enfermedad de Devic, neuritis óptica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, mielitis transversa, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica anti-MAG, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, lesión difusa de la sustancia blanca, síndrome de Guillain-Barré, mielinólisis central pontina, enfermedades desmielinizantes hereditarias tales como leucodistrofia y enfermedad de Charcot Marie Tooth (CMT).
La enfermedad de CMT es un grupo de neuropatías de mielina causadas por mutaciones en varios genes. Las mutaciones en la proteína de mielina periférica PMP22 son las causas más comunes de la enfermedad de CMT. Una mutación en PMP22 (Trembler-J) causa el mal plegamiento de PMP22 y da como resultado una enfermedad en ratones que se asemeja a la CMT en humanos debido a defectos en la mielina en el sistema nervioso periférico. Los solicitantes han demostrado que el compuesto del ejemplo 1 puede mejorar la mielinización en explantes de ratones neuropáticos. Los solicitantes han demostrado que la mejora de la mielinización en explantes de ratones neuropáticos predice la eficacia en un mamífero (Das y col. en prensa). Por tanto, el compuesto del ejemplo 1 será útil en el tratamiento de la enfermedad de CMT en mamíferos y otros trastornos de la mielina en los que se sabe que los mecanismos son similares e implican la vía eIF2a (Lin y Popko, Nat. Neurosci., 12, 379-385, 2009).
En una realización, un inhibidor de R15B se usa en el tratamiento de un trastorno de la mielina.
En otra realización, un inhibidor de PPP1R15B que es un compuesto del ejemplo 1, se usa en el tratamiento de la enfermedad de Charcot Marie Tooth.
En otra realización adicional, un inhibidor de PPP1R15B de la presente invención se utiliza en el tratamiento de trastornos de la mielina del sistema nervioso central, por ejemplo, esclerosis múltiple. Se sabe que los mecanismos de la enfermedad de CMT y de la EM son similares a un agotamiento de las células productoras de mielina (células de Schwann en la enfermedad de CMT y oligodendrocitos en la EM) e involucran la señalización patológica de la vía de eIF2a-RRR1R15A (Lin y Popko, Nat. Neurosci., 12, 379-385, 2009). Dado que los solicitantes han demostrado que el ejemplo 1 es eficaz en una mielinopatía y también han demostrado la biodisponibilidad de un compuesto del ejemplo 1 tanto en el sistema nervioso central como en el periférico (Figura 5), se prevé que los inhibidores de PPP1R15B serán útiles en el tratamiento de la esclerosis múltiple.
En una realización, la enfermedad es una enfermedad que surge como consecuencia de una mutación en una proteína que da como resultado su mal plegamiento y localización errónea o defectos de tráfico.
Los solicitantes han demostrado que el compuesto del ejemplo 1 puede rescatar defectos causados por una proteína mal plegada, PMP22, sintetizada en el retículo endoplásmico (RE). Debido al mecanismo de acción (disminución de la traducción para aumentar el plegamiento), un inhibidor de PPP1R15B según la presente invención, también será útil para el tratamiento de enfermedades debidas al mal plegamiento o defectos de tráfico de cualquier proteína producida en el RE, incluidas las proteínas transmembrana o secretadas.
Los ejemplos de tales enfermedades incluyen: fibrosis quística causada por mutaciones que alteran el plegamiento de la proteína transmembrana (CFTR); bocio hipotiroideo congénito con deficiencia de tiroglobulina debido al mal plegamiento y/o defecto de tráfico de la hormona tiroglobulina; diabetes insípida neurohipofisaria familiar causada por mal plegamiento y ausencia de arginina vasopresina circulante (esto también puede incluir determinadas formas de diabetes insípida nefrogénica heredada genéticamente); trastornos de la biosíntesis de procolágeno en los que la enfermedad está causada por un fallo en el plegado, ensamblaje y sintetización del colágeno, tal como, de modo no taxativo, osteogénesis imperfecta; de manera más general, cualquier enfermedad genética de los tejidos conectivos en la que el mal plegamiento/falta de síntesis o localización errónea de las proteínas está en el modo de acción, como la displasia de la placa de crecimiento asociada con defectos de proteínas de la matriz extracelular; hipercolesterolemia, con defectos moleculares causados por mutaciones en el receptor de LDL que causan falta de síntesis, transporte intracelular alterado o función anormal; deficiencias de alfa-1 antitripsina debido al mal plegamiento de alfa 1 antitripsina; trastorno lisosómico debido al mal plegamiento de proteínas asociadas con la función lisosómica, como la enfermedad de Gaucher y la enfermedad de Niemann-Pick y la enfermedad de Anderson-Fabry; retinitis pigmentosa (RP), que es la forma más común de degeneración retiniana hereditaria causada por el mal plegamiento de las proteínas de rodopsina, su retención del RE y el estrés del RE y la muerte celular resultantes; y enfermedad inflamatoria del intestino que se asocia con estrés del RE.
Por las mismas razones, un inhibidor de PPP1R15B según la invención puede usarse para tratar los siguientes trastornos, asociados con UPR patológica y/o defectos en una proteína transmembrana (Lin y Popko, Nat. Neurosci., 12, 379-385, 2009). Estos trastornos incluyen, de modo no taxativo, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher asociada con mutaciones en el gen de la proteína proteolípida de membrana (PLP) y la enfermedad de desvanecimiento de la sustancia blanca (VWM), así como la esclerosis múltiple, un trastorno común de la mielina.
En una realización, la invención se refiere a inhibidores de PPP1R15B para uso en el tratamiento de enfermedades que surgen de una mutación en una proteína que da como resultado el mal plegamiento de la proteína y defectos de localización o tráfico erróneos.
En otra realización, la enfermedad, que surge de una mutación en una proteína que da como resultado un mal plegamiento de la proteína y localización errónea o defectos tráfico, es seleccionada de entre fibrosis quística, bocio hipotiroideo congénito, diabetes insípida neurohipofisaria familiar, trastornos de la biosíntesis de procolágeno tales como osteogénesis, hipercolesterolemia, deficiencia de alfa-1 antitripsina, trastornos lisosomales como la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Niemann-Pick y la enfermedad de Anderson-Fabry, la retinosis pigmentaria y la enfermedad inflamatoria intestinal.
En una realización, el trastorno es un trastorno metabólico.
Se sabe que las enfermedades metabólicas como la diabetes, la obesidad, la resistencia a la insulina, la hiperlipidemia, la enfermedad del hígado graso y la aterosclerosis están asociadas con el estrés patológico del RE y se cree que los moduladores farmacológicos de la UPR pueden tener un beneficio terapéutico (Cao y Kaufman, 2012, Curr Biol, vol.
22 (16)). Sin embargo, como no se disponía anteriormente de inhibidores de PPP1R15B y se predijo que la inhibición de PPP1R15B sería perjudicial, y además, dado que inhibir las fosfatasas es un desafío, no estaba claro si PPP1R15B podría ser una diana terapéutica en enfermedades metabólicas.
Los inventores han demostrado que el compuesto del ejemplo 1 puede mejorar un trastorno metabólico en un mamífero (figura 11). Por lo tanto, los inhibidores de PPP1R15B serán útiles para tratar trastornos metabólicos tales como, de modo no taxativo, diabetes, obesidad, enfermedad del hígado graso y aterosclerosis.
En una realización, los inhibidores de PPP1R15B descritos en esta invención se utilizan en el tratamiento de trastornos metabólicos.
En una realización preferida de la invención, el trastorno metabólico es seleccionado de diabetes, obesidad, enfermedad del hígado graso y aterosclerosis.
Los inhibidores selectivos de PPP1R15B también son útiles en el tratamiento de otros trastornos que incluyen artritis reumatoide, diabetes, síndrome de Wolcott Rallison, enfermedad inflamatoria intestinal y vitiligo, que involucran a la UPR en su mecanismo de acción (Cao y Kaufman, 2012, Curr Biol, vol. 22 (16)).
Se ha descrito que la reducción de la síntesis de proteínas aumenta la duración de la vida (véase, por ejemplo, Tavernarakis, N. (2008). (Ageing and the regulation of protein synthesis: a balancing act? Trends Cell Biol, 18 (5), 228­ 235. http://doi.org/10.10167j.tcb.2008.02.004.). Aquellos compuestos según la invención que se ha demostrado que reducen la síntesis de proteínas inhibiendo R15B pueden, por lo tanto, usarse en tratamientos para aumentar la esperanza de vida/reducir el envejecimiento.
COMPUESTOS
En esta solicitud, se describen compuestos de los ejemplos 1 a 4 y su uso como inhibidores selectivos de PPP1R15B:
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(continuación)
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Los compuestos descritos en esta solicitud no exhiben ventajosamente actividad hacia el receptor adrenérgico a2A en relación con los compuestos de la técnica anterior tales como guanabenz. Esta pérdida en la actividad adrenérgica alfa-2 hace que los compuestos sean terapéuticamente útiles en el tratamiento de las enfermedades y trastornos descritos en esta solicitud. Por el contrario, los derivados de guanabenz con actividad adrenérgica no pueden usarse terapéuticamente porque esto provoca efectos secundarios como hipotensión, somnolencia, letargo e incluso coma. (Hallet y col. Ann Intern Med 102, 787-788, 1985). La ausencia de actividad adrenérgica alfa-2 significa que los compuestos de la invención pueden administrarse en una dosis adecuada para tratar las enfermedades mencionadas anteriormente, sin ningún efecto significativo sobre la presión arterial.
Sales y ásteres
Los compuestos descritos en esta invención pueden estar presentes como sales o ésteres, en particular sales o ésteres farmacéuticamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen sales de adición de ácido o base de los mismos. Se puede encontrar una revisión de las sales farmacéuticas adecuadas en Berge y col., J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Las sales que no son farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser valiosas como productos intermedios.
Los ésteres se forman utilizando ácidos orgánicos o alcoholes / hidróxidos, dependiendo del grupo funcional que se esté esterificando.
Enantiómeros/Tautómeros
En todos los aspectos de la presente invención analizados previamente, la invención incluye, cuando sea adecuado, todos los enantiómeros, diastereoisómeros y tautómeros de los compuestos de la invención. El experto en la materia reconocerá compuestos que poseen propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales) o características tautoméricas. Los enantiómeros y/o tautómeros correspondientes pueden aislarse/prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los enantiómeros se caracterizan por la configuración absoluta de sus centros quirales y se describen mediante las reglas de secuencia R y S de Cahn, Ingold y Prelog. Tales convenciones son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, véase 'Advanced Organic Chemistry', 3.a edición, ed. March, J., John Wiley y Sons, Nueva York, 1985).
Estereoisómeros e isómeros geométricos
Algunos de los compuestos de la invención pueden existir como estereoisómeros y/o isómeros geométricos, por ejemplo, pueden poseer uno o más centros asimétricos y/o geométricos y, por lo tanto, puede existir en dos o más formas estereoisoméricas y geométricas. La presente invención contempla el uso de todos los estereoisómeros e isómeros geométricos individuales de esos agentes inhibidores y mezclas de los mismos. Los términos usados en las reivindicaciones abarcan estas formas, siempre que dichas formas conserven la actividad funcional adecuada (aunque no necesariamente en el mismo grado).
La presente invención también incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas del agente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una variación isotópica de un agente de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se define como aquella en la que al menos un átomo se reemplaza con un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que normalmente se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de los isótopos que pueden incorporarse en el agente y sales farmacéuticamente aceptables del mismo incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. Determinadas variaciones isotópicas del agente y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, por ejemplo, aquellas en las que se incorpora un isótopo radiactivo tal como 3H o 14C, son útiles en fármacos y/o en estudios de distribución tisular del sustrato. Se prefieren particularmente los isótopos tritiados, es decir, 3H, y el isótopo carbono-14, es decir, 14C por su facilidad de preparación y detección. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, es decir 2H, puede procurar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, mayor semivida in vivo o menores requisitos de dosificación, y por tanto puede preferirse en algunas circunstancias. Por ejemplo, la invención incluye compuestos de los ejemplos 1 a 4 en los que algún átomo de hidrógeno ha sido reemplazado por un átomo de deuterio. Las variaciones isotópicas del agente de la presente invención y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo de esta invención pueden prepararse generalmente mediante procedimientos convencionales usando variaciones isotópicas adecuadas de reactivos convenientes.
Profármacos
La invención incluye además los compuestos de la presente invención en forma de profármaco, es decir, compuestos unidos covalentemente que liberan el fármaco original activo según cualquiera de los compuestos ejemplificados in vivo. Tales profármacos son generalmente compuestos de la invención en los que uno o más grupos apropiados se han modificado de manera que la modificación puede revertirse tras la administración a un sujeto humano o mamífero. La reversión se realiza habitualmente mediante una enzima presente de forma natural en dicho sujeto, aunque es posible administrar un segundo agente junto con dicho profármaco para realizar la reversión in vivo. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen éster (por ejemplo, cualquiera de los descritos anteriormente), en los que la reversión puede llevarse a cabo con una esterasa, etc. Otros de tales sistemas serán bien conocidos por los expertos en la materia.
Solvatos
La presente invención también incluye formas solvatos de los compuestos de la presente invención. Los términos utilizados en las reivindicaciones abarcan estas formas.
Polimorfos
La invención se refiere además a los compuestos de la presente invención en sus diversas formas cristalinas, formas polimórficas y formas hidratadas y/o anhídricas. Está bien establecido dentro de la industria farmacéutica que los compuestos químicos pueden aislarse en cualquiera de tales formas variando ligeramente el procedimiento de purificación y/o aislamiento de los disolventes usados en la preparación sintética de tales compuestos.
ANTICUERPOS
Las referencias a "anticuerpo" incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, humanos, humanizados o quiméricos. El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo que incluye un dominio VH o VL o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla (scFv). En una realización, el anticuerpo es humano.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PPP1R15B, (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de la proteostasis, un trastorno de la mielina o un trastorno metabólico. En una realización, la composición farmacéutica se usa en terapia combinada con cualquier portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "composición farmacéutica" en el contexto de esta invención significa una composición que comprende un agente activo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y adicionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los expertos en la materia conocen excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables y generalmente incluyen una composición, material, portador, diluyente o vehículo aceptables adecuados para administrar un inhibidor de PPP1R15B de la invención a un animal.
En una realización, el animal es un mamífero. En otra realización, el mamífero es un ser humano.
Las formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración por vía oral, tópica (lo que incluye administración cutánea, bucal, ocular y sublingual), rectal o parenteral (lo que incluye subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), nasal, intraocular y pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación. La formulación se puede presentar, cuando sea adecuado, convenientemente en formas de dosificación unitarias y puede prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica.
Sin embargo, las dosificaciones se pueden variar según los requisitos del paciente, la gravedad de la afección que se trate y el compuesto que se utilice. La determinación de la dosis efectiva está dentro del alcance del experto, sin una carga indebida. Las formas de dosificación adecuadas para la administración a mamíferos, incluidos los seres humanos, se encuentran en general en el intervalo de hasta 100 mg/kg peso corporal, o puede ser de 0,1mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg, por ejemplo.
En esta solicitud, también se describe un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente, comprendiendo el procedimiento la asociación del (de los) compuesto(s) activo(s) con el portador, por ejemplo, mediante mezcla.
En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente el principio activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y a continuación, si fuera necesario, moldeando el producto. La descripción se extiende a los procedimientos para preparar una composición farmacéutica que comprende poner un compuesto descrito en esta solicitud en conjunto o asociación con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Todos los procedimientos incluyen la etapa de asociar un compuesto activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y después, si es necesario, darle forma al producto hasta alcanzar la formulación deseada.
También se describe en esta solicitud un uso de un inhibidor de PPP1R15B como se describe en esta solicitud en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno aliviado por la inhibición selectiva de PPP1R15B.
COMBINACIONES
En una realización particularmente preferida, el uno o más inhibidores de PPP1R15B de la invención se administran en combinación con uno o más de otros agentes activos, por ejemplo, fármacos existentes disponibles en el mercado. En tales casos, los inhibidores de la invención se pueden administrar de forma consecutiva, simultánea o secuencial con uno o más de los otros agentes activos.
Los medicamentos en general son más efectivos cuando se usan en combinación. En particular, el tratamiento combinado es deseable para evitar una superposición de las principales toxicidades, mecanismo de acción y mecanismo(s) de resistencia. Además, también es deseable administrar la mayoría de los fármacos en sus dosis máximas toleradas con intervalos de tiempo mínimos entre dichas dosis. Las principales ventajas de combinar fármacos son que pueden favorecer efectos aditivos o posibles sinérgicos a través de interacciones bioquímicas y también pueden disminuir la aparición de resistencia.
Se pueden sugerir combinaciones beneficiosas mediante el estudio de la actividad inhibidora de los inhibidores de prueba con agentes de los que se sabe o se sospecha que son valiosos en el tratamiento de un trastorno en particular. Este procedimiento también se puede utilizar para determinar el orden de administración de los agentes, es decir, antes, simultáneamente o después de la administración. Dicha programación puede ser una característica de todos los agentes activos identificados en este documento.
EJEMPLOS
Ejemplo A
Preparación de los compuestos según la presente invención
Los compuestos según la presente invención se pueden preparar según los siguientes procedimientos:
Procedimiento general A:
A una solución de benzaldehído (1 eq.) en etanol (300 ml) se le añadió secuencialmente clorhidrato de aminoguanidina (1 eq.) y acetato de sodio (1 eq.) a 25 °C La mezcla de reacción resultante se calentó a 80°C durante las siguientes ~6 horas. La finalización de la reacción se controló en TLC usando diclorometano/metanol (8/2) como fase móvil. Tras completarse la reacción, la mezcla de reacción se dejó enfriar a 25 °C y se vertió en una solución saturada de NaHCO3 (700 ml). Los precipitados resultantes se eliminaron por filtración al vacío y se lavaron con agua (100 ml). El material sólido resultante se trituró con éter dietílico (2 x 25 ml) y se secó al vacío para proporcionar el derivado de aminoguanidina sustituido deseado.
Los siguientes compuestos se prepararon según el procedimiento general A:
Ejemplo 1: (E)-2-(2,3-diclorobenciliden)hidrazina-1-carboximidamida
Preparada siguiendo el procedimiento general A a partir de 2,3-diclorobenzaldehído con un rendimiento del 85 % (considerando la sal monoacetato) m/z= 231,23 (M+H). 1H-NMR (DMSO-cfe): ó (ppm) 11,85 (brs, 1H); 8,35 (s, 1H); 8,19-8,21 (dd, 1H); 7,56-7,59 (dd, 1H); 7,32-7,36 (t, 1H); 7,04 (brs, 4H); 1,84 (s, 3H); MS (ESI+): m/z = 231,23 [M+H]+
Ejemplo 2: (E)-2-(2-cloro-4-fluorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida
Preparada siguiendo el procedimiento general A a partir de 2-cloro-4-fluorobenzaldehído con un rendimiento del 67 %.
1H-NMR (DMSO-cfe): ó (ppm) 5,80 (brs, 2H); 5,84 (brs, 2H); 7,19-7,34 (m, 4H); 8,16 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 215,1 [M+H]+
Ejemplo 3: (E)-2-(3,4,5-triclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida
Preparada siguiendo el procedimiento general a partir de 3,4,5-triclorobenzaldehído con un rendimiento del 70,88 %.
1H-NMR (DMSO-cfe): ó (ppm) 7,96 (s, 2H); 7,89 (s, 1H); 6,20 (brs, 2H); 5,69 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z = 265,1 [M+H]+
Ejemplo 4: (E)-2-(2,4,5-triclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida
Preparada siguiendo el procedimiento general A a partir de 2,4,5-triclorobenzaldehído con un rendimiento del 78,76 %.
1H-NMR (DMSO-cfe): ó (ppm) 8,43 (s, 1H); 8,12 (s, 1H); 7,77 (s, 1H); 6,33 (brs, 2H); 5,83 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z =265,17 [M+H]+
Expresión, purificación y análisis de proteínas mediante resonancia de plasmón superficial
Expresión y purificación de proteínas
Se expresaron y purificaron PPP1R15A325'636 y PPP1R15B34°'698 de la siguiente manera: los ADNc que codifican los aminoácidos 325-636 de PPP1R15A y 340-698 de PPP1R15B se marcaron con His y se clonaron en pMAL-c5x. Las secuencias de aminoácidos de R15A y R15B se establecen en la figura 16. Los PPP1R15A/B recombinantes se expresaron en células BL21-Gold y se purificaron mediante cromatografía de afinidad en una columna HisTrap HP (GE Healthcare), seguida de una columna MBPTrap HP (GE Healthcare). El ADNc que codifica PP1y (Pp1c) humana se clonó en un vector de transferencia de baculovirus pDW464 para añadir un péptido aceptor de biotina (BAP). El vector también codifica la holoenzima sintetasa de biotina de E. coli (BirA), de modo que las proteínas marcadas con BAP pueden ser biotiniladas in vivo en células de insectos Spodoptere frugiperda (Sf9) (Duffy y col., Anal. Biochem., 262, 122-128, 1998). Se usó el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Life Technologies) para generar el ADN del bácmido recombinante y se usaron células de insecto Sf9 para amplificar las reservas virales. Los cultivos se extrajeron mediante centrifugación a 1200 g durante 15 minutos, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tritón al 0,2%, glicerol al 5%, 1 tableta de PiC (Roche) por 50 ml y PMSF 0,2 mM) y seguido de sonicación suave. La proteína se purificó primero en una columna HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare) seguido de un HiLoad 16/600 Columna Superdex 200 (GE Healthcare). Las fracciones positivas confirmadas por SDS-PAGE y western blot se combinaron, se concentraron hasta ~1 pM y se almacenaron a -80 °C.
Captura de biotina-PPI en el chip sensor SA
Se usó un sistema Biacore T200 (GE Healthcare) para todos los experimentos y se capturó PP1 biotinilado usando un chip sensor SA (GE Healthcare, catálogo no BR-1005-31). La superficie recubierta de estreptavidina se activó mediante una inyección de 1 min con una solución de NaOH 50 mM y NaCl 1 M. Se diluyó biotina-PP1 en el tampón de migración (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EGTA 0,1 mM, MnCl2 1 mM, Tween 20 al 0,05%) y se inyectó a una concentración de aproximadamente 300 nM directamente a la superficie recubierta de estreptavidina durante 100 segundos o para alcanzar el nivel de inmovilización de biotina-PP1 correspondiente a -7000 RU. Se realizó una inmovilización en blanco para una de las superficies del chip sensor SA para utilizarla como referencia.
Determinación de las constantes de unión en estado estacionario de pequeñas moléculas a complejos de holofosfatasas eIF2a utilizando la superficie de biotina-PP1
Con pequeñas desviaciones, se usó el mismo procedimiento y condiciones en todos los experimentos de unión. Las moléculas pequeñas se almacenaron como soluciones madre de 50 mM en DMSO al 100 %. Antes de determinar las constantes de unión, se prepararon diluciones en serie de 12 u 8 concentraciones de los compuestos en el tampón de funcionamiento en una placa de 96 pocillos. Antes de cada serie de dilución de compuesto, la subunidad reguladora, R15A o R15B, se diluyó a 15 pM en el tampón de migración y se capturó en la superficie de biotina-PPI, para formar el complejo de holofosfatasa en la superficie del chip sensor. A continuación, sin regenerar la superficie, la serie de dilución del compuesto se inyectó en la superficie del chip. Los sensorgramas se analizaron mediante el software de evaluación Biacore T200 y las constantes de unión se determinaron con base en un modelo de estado estable. Se llevan a cabo experimentos cinéticos utilizando diferentes concentraciones del compuesto y se determinan sus respectivos niveles de unión en equilibrio. Estos niveles de respuesta de equilibrio (Req) se representan frente a la concentración y se ajustan mediante un ajuste global, que es capaz de determinar las constantes de afinidad de estado estacionario, es decir, la concentración al 50 % de saturación es KD (Frostell-Karlsson y col., J. Med. Chem., 43, 1986­ 1992, 2000).
Cultivo celular de mamífero
Las células HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con penicilina, estreptomicina, que contiene suero bovino fetal (SBF) al 5 % y al 10 %, respectivamente. Las células MEF se cultivaron en DMEM suplementado con penicilina, estreptomicina, glutamina, p-mercaptoetanol 55 pM, 1X aminoácidos no esenciales (Sigma-Adrich) y SBF al 10 %. Donde se indica, las células se trataron con 2,5 pg/ml tunicamicina, DTT 1 mM (Sigma-Adrich) y o los compuestos indicados a las concentraciones indicadas.
Análisis de proteínas por inmunotransferencias
Para las inmunotransferencias, se sembraron células HeLa (80.000 células/ml) en placas de 12 pocillos 24 horas antes de cada experimento. Inmediatamente después de los tratamientos indicados, las células se lisaron en 75 pl de tampón Laemmli, se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos y se sonicaron. Las proteínas se separaron y analizaron tal como se describe (Tsaytler y col., Science, 332, 91-94, 2011) con los siguientes anticuerpos: fosfo-elf2a [pS52] y PPP1R15A/GADD34 (10449-1-AP; Grupo ProteinTech, 1/1000 dilución).
Evaluación de la viabilidad celular
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 15.000 (HeLa) o 12.000 células/ml (MEFs) 24 horas antes del tratamiento. El estrés del RE se provocó mediante la adición de medios nuevos que contenían tunicamicina 2,5 pg/ml (Sigma-Aldrich). Los compuestos del ejemplo 1 se disolvieron en DMSO y se añadieron como se indica. Se usó DMSO como tratamiento de control. La viabilidad celular se evaluó midiendo la reducción de WST-8 [2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio] en formazán mediante el Cell viability Counting Kit-8 (Dojindo) según la recomendación del proveedor, 48 horas después del tratamiento con tunicamicina.
Estudios en animales
Todo el cuidado y los procedimientos de los animales se realizaron de conformidad con la regulación sobre el uso de animales en la investigación (Ley de Procedimientos Científicos para Animales del Reino Unido de 1986) con aprobación ética local.
Para estudiar el efecto de un compuesto del Ejemplo 1 sobre el peso, se administraron forzadamente los compuestos del ejemplo 1 a ratones C3H/B6 por vía oral una vez al día y se registró el peso de los ratones diariamente durante 2 semanas.
Para evaluar la eficacia de un compuesto del Ejemplo 1 para mejorar el fenotipo de una enfermedad, se administró por vía oral a ratones transgénicos de 28 días de edad o al control de la camada un compuesto del ejemplo 1 (2 mg/kg) o vehículo durante 4 semanas. La evolución de la enfermedad se evaluó pesando a los ratones durante el tratamiento y evaluando su rendimiento motor después de 4 semanas de tratamiento.
Para evaluar si un compuesto del ejemplo 1 tuvo los efectos secundarios de guanabenz, se administraron forzadamente 10 mg/kg de compuesto o guanabenz a los ratones (n>3) por vía oral. Su actividad se controló 30 minutos después de la dosificación. Los ratones tratados con guanabenz no se movieron 30 minutos después de la dosificación, debido a la actividad hipotensora de guanabenz, a diferencia de los ratones tratados con el compuesto del ejemplo 1 que fueron tan activos como los ratones no tratados.
Los ratones HD-N171-82Q de ocho semanas de edad y sus compañeros de camada de tipo salvaje se habituaron primero durante 1 min en un rotor estático y durante 1 min a velocidad constante (4 rpm). Se repitió la habituación. La sesión de prueba consistió en cuatro ensayos con intervalos de 15 minutos entre ellos. Para cada ensayo, se colocaron 5 ratones en un rotor de aceleración (4 a 40 rpm) y se registró la latencia hasta la caída con un límite máximo para cada animal establecido en 300 s.
Para el tratamiento de un trastorno metabólico, se trataron animales Db/db (n=5 por condición) una vez al día con 1 mg/kg del compuesto del ejemplo 1 durante tres semanas. Los niveles de glucosa en sangre se midieron con un medidor de glucosa en sangre (DSI) entre las 9 y las 10 de la mañana. Los datos son promedios ± error estándar del promedio.
RT-PCR cuantitativo
El ARN del cerebro se extrajo en trizol (Life Technologies). La concentración de ARN se midió mediante un espectrofotómetro NANODROP1000 (Thermo Fisher Scientific), y se transcribió inversamente 1 pg a ADNc usando una transcriptasa inversa SuperScript (Life Technologies). La PCR cuantitativa con cebadores GAPDH (f): ACCACAGTCCATGCCATCAC, GAPDH (r): TCCACCACCCTGTTGCTGTA, PPP1R15A (f): CCTCCTGAAACTTGGGGACT; y PPP1R15A (r): GCTGTGATGTGGGATAAGCG se realizó usando SYBR® Select Master Mix (Ref 4472908, biosistemas aplicados) en un Corbett Rotor-Gene versión 6000. La expresión de cada gen se normalizó al gen de referencia GAPDH y se expresó como cambio de veces calculado mediante la ecuación de Paffl.
Cultivos de GRD
Se diseccionaron los ganglios de la raíz dorsal (GRD) del tipo salvaje oPmp22Tr-J (PMP22mutante) (Henry y col., Neuropathol. Exp. Neurol., 42, 688-706, 1983) de 13,5 de desarrollo (E13.5) se cultivaron en cubreobjetos recubiertos de colágeno en medio neurobasal suplementado con 4 g/l glucosa, L-glutamina 2 mM, Suplemento B27 al 2 %y 50 ng/ml factor de crecimiento neuronal (NGF) durante 7 días. Para diferenciar las células de Schwann e inducir la mielinización, los DRG cultivados se mantuvieron en medio C (medio MEM suplementado con 4 g/l glucosa, L-glutamina 2 mM, FCS al 10 %, 50 ng/ml NGF). El medio C se sustituyó cada dos días con ácido ascórbico recién añadido de 50 pg/ml ± 5 nM del compuesto del Ejemplo I y se cultivó durante 14 días para la mielinización por células de Schwann. Los GRD cultivados se fijaron a continuación en paraformaldehído al 4 % y se inmunotiñeron con MBP (proteína básica de mielina de rata, dilución 1/250, ab73498).
La referencia para los ratones es Pubmed ID: 631386.
Ensayo bioquímico
Ensayo 1: un inhibidor selectivo de PPP1R15B se une selectivamente a PPP1R15B-PP1 (figura 1)
Se utilizó la resonancia de plasmón superficial (RPS) para medir la afinidad de unión de los compuestos al complejo de fosfatasa PPP1R15A/B-PP1. El péptido aceptor de biotina (BAP) se fusionó con el extremo N-terminal de PP1y, lo que permite la biotinilación de la proteína marcada con BAP en células de insecto Sf9. Tras la purificación, la proteína BAP-PP1y se capturó en un chip sensor de estreptavidina (SA-chip, GE healthcare) hasta un nivel de respuesta de ~5,000 RU. El uso de biotinilación controlada permite una inmovilización orientada y uniforme en la superficie del chip sensor. A continuación, se utilizó el PP1y para capturar PPP1R15A/B y formar un complejo de holofosfatasa en la superficie del chip de estreptavidina. Este complejo puede usarse a continuación para probar la unión de compuestos. Se utilizó una concentración de proteína PPP1R15A/B de 10 pM para formar el complejo de holofosfatasa durante una inyección de 80 s. Una vez capturada la PPP1R15A/B, se inyectó una serie de concentraciones de un compuesto sobre la superficie del chip, midiendo la unión del compuesto a la holofosfatasa. Una vez completada la serie de concentraciones (8 o 12 concentraciones), la superficie se regenera con NaCl 3 M y SE PUEDE capturar R15A/B de nuevo para formar un nuevo complejo de holofosfatasa para medir la unión de otra serie de concentraciones de compuestos. El análisis del nivel de unión en equilibrio en función de la concentración da afinidades de interacción o afinidad de unión en estado estacionario (Kd).
La figura 1 muestra los valores Kd para el compuesto del ejemplo 1. Una Kd de 0,035 pM para PPP1R15B-PP1 y 1 pM para PPP1R15A-PP1 demuestra que el compuesto del ejemplo 1 se une selectivamente al complejo PP1R15B-PP1 pero que la unión es significativamente menor que para el complejo PPP1R15A-PP1.
Ensayo 2: Un inhibidor selectivo de PPP1R15B induce una fosforilación transitoria de eIF2a en las células, en ausencia de estrés (Figura 2A y B)
Se describió la selectividad de un compuesto del ejemplo 1 utilizando un ensayo de unión in vitro con proteínas recombinantes. Sin embargo, aunque se puede usar un ensayo de unión para cribar compuestos selectivos que se unen a PPP1 R15B, las propiedades de un compuesto no se predicen necesariamente mediante un ensayo de unión. Por tanto, se necesitan otros ensayos para evaluar si el compuesto inhibe la función de PPP1R15B o no.
Se trataron células humanas con un inhibidor de PPP1R15B y se controló la fosforilación de eIF2a a lo largo del tiempo. Los inventores encontraron que, en ausencia de estrés (en condiciones en las que las células no expresan PPP1 R15a ), el tratamiento de las células con un compuesto del ejemplo 1 inducía la fosforilación de eIF2a. Esto se manifestó entre 1 y 7,5 horas después de la adición del compuesto del ejemplo 1. Sin embargo, 10 horas después de la adición del compuesto del ejemplo 1, la fosforilación de eIF2a volvió a niveles basales. Esto sugirió que había una fosfatasa de eIF2a activa en este momento. De hecho, los inventores notaron que PPP1R15A se indujo en los puntos de tiempo tardíos después de la adición del compuesto del Ejemplo 1 (véase el ensayo 3). La inducción transitoria de la fosforilación de eIF2a demuestra que el compuesto es un inhibidor selectivo de PPP1R15B en las células. Además, esto establece que el compuesto del ejemplo 1 ahorra PPP1R15A. Este ensayo puede servir para identificar otros inhibidores selectivos de PPP1R15B.
Ensayo 3: un inhibidor selectivo de PPP1R15B induce la expresión de PPP1R15A en células (figura 2A y B)
Las células y los organismos suelen tener mecanismos para compensar las deficiencias. Por tanto, los inventores consideraron si las células podrían compensar la inhibición de PPP1R15B induciendo PPP1R15A. Se ha informado previamente que los niveles de PPP1R15A están aumentados en el hígado de ratones con PPP1R15B desactivada (Harding y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 1832-1837, 2009). Se desconoce si esta respuesta compensadora es específica del hígado o si puede se puede producir en células u otros tejidos. Además, antes de este estudio, se desconocía si se podía observar la inducción de PPP1R15A tras la inhibición farmacológica de PPP1R15B, ya que no eran inhibidores selectivos de PPP1R15B anteriormente a este estudio.
La figura 2B demuestra que se encontró que las células tratadas con un compuesto del ejemplo 1 inducían PPP1R15A. Esta propiedad, la inducción de PPP1R15A, puede usarse como un procedimiento para cribar inhibidores de PPP1R15B, ya que los compuestos que inducen la expresión de PPP1R15A en células poseerán propiedades de inhibición de PPP1R15B. Por ejemplo, un ensayo que usa un gen PPP1R15A o un promotor fusionado a un gen indicador puede diseñarse y desarrollarse en un cribado HTS para identificar compuestos que inducen PPP1R15A.
Ensayo 4: Un inhibidor selectivo de PPP1R15B protege las células del estrés (figura 3)
La figura 3 demuestra que un inhibidor selectivo de PPP1R15B protege a las células del estrés. Las células se estresaron con tunicamicina (2,5 ug/ml) en presencia de 0,2-5 pM de un compuesto del ejemplo 1. Se midió la viabilidad celular 3 días después del tratamiento.
Por el inhibidor del ejemplo 1 protege a las células del estrés del estrés citotóxico causado por la tunicamicina. La citoprotección contra el estrés del RE se puede medir mediante un ensayo adecuado. En este caso, se midió la citoprotección en células HeLa en las que se provocó estrés en el RE mediante la adición de medio que contenía tunicamicina, un fármaco que bloquea la N-glicosilación, evitando así el plegamiento de proteínas e induciendo la respuesta de la proteína no plegada. La viabilidad celular se detectó a continuación en presencia y ausencia de un compuesto del ejemplo 1 después de un período de tiempo establecido, al medir la reducción de w ST-8 en formazán utilizando un kit de viabilidad celular estándar tal como Cell Viability Counting Kit-8 de Dojindo. La citoprotección del estrés del RE se midió en términos del porcentaje de aumento en células viables (en relación con el control) después del estrés del RE.
Ensayo 5: un inhibidor selectivo de PPP1R15B prolonga la fosforilación de eIF2a durante la recuperación del estrés (figura 4)
Los inventores razonaron que un inhibidor de PPP1R15B debería prolongar la fosforilación de eIF2a después del estrés. Para revelar esta actividad, fue crucial buscar condiciones donde no se expresa PPP1R15A, para evitar efectos de confusión. Los inventores aprovecharon la cinética rápida y la reversibilidad de la inducción de estrés por DTT (Bertolotti y col., Nat. Cell. Biol., 2, 326-332, 2000; Jousse y col., 2003) y monitorizaron la fosforilación de eIF2a en las células después de un tratamiento de 30 minutos con DTT 1 mM y un lavado. Los inventores encontraron que la disminución en la fosforilación de eIF2a que se produce normalmente después del lavado de DTT se retrasa y esto se produjo antes de cualquier inducción sustancial de PPP1R15A. Por lo tanto, la monitorización cuidadosa de la cinética de la desfosforilación de eIF2a en la fase temprana de un paradigma de recuperación del estrés como el que se describe aquí puede usarse para identificar otros inhibidores de PPP1R15B.
El compuesto del ejemplo 1 en ratones (Figura 5) tiene una buena distribución tisular
El análisis de tejidos de ratón (plasma, cerebro, médula espinal, páncreas, hígado) en diferentes momentos después de la alimentación forzada oral de un compuesto del ejemplo 1 reveló que el inhibidor de PPP1R15B tiene una distribución tisular extensa y, por lo tanto, demuestra su aplicación en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos que afectan diferentes órganos.
El tratamiento de ratones con un compuesto del ejemplo 1 no es tóxico para los ratones (figura 6)
Los ratones se trataron con el ejemplo 1 y se monitorizaron de cerca para detectar cualquier signo clínico. Se encontró que los ratones tratados durante 2 semanas con hasta 10 mg/mg una vez al día de un compuesto del ejemplo 1 eran indistinguibles de los ratones tratados con placebo y los ratones aumentaron de peso normalmente (figura 6). Esto demuestra que la inhibición de PPP1R15B no es tóxica. Esto fue sorprendente e inesperado, ya que antes de este estudio se habría especulado que los inhibidores de PPP1R15B serían tan perjudiciales que no tendrían potencial terapéutico.
El tratamiento de ratones con un compuesto del ejemplo 1 no provoca los efectos secundarios provocados por guanabenz (figura 7)
En los seres humanos, la actividad agonista adrenérgica de guanabenz tiene efectos secundarios que incluyen somnolencia y coma a dosis altas (A. H. Hall, Ann Intern Med 102; 787-788; 1985). Debido a estos efectos secundarios, el guanabenz ya no se usa en humanos. Se anticipa que los derivados de guanabenz tienen los efectos secundarios del guanabenz, asociados con la actividad adrenérgica alfa-2. Si bien la relación estructura-actividad de guanabenz con el receptor adrenérgico alfa-2 no está disponible, los inventores encontraron sorprendentemente aquí que el ejemplo 1 carece de los efectos secundarios del guanabenz, aunque estructuralmente es muy similar.
Ensayo 6: inducción de PPP1R15A en un mamífero después del tratamiento con un compuesto del ejemplo 1 (figura 8)
La inducción de PPP1R15A se evaluó mediante qPCR en ARNm total extraído de cerebros de ratones tratados con las dosis indicadas del compuesto del ejemplo 1.
De manera similar a lo que se había visto en las células, se encontró que los ratones inducían PPP1R15A después de un tratamiento con un compuesto del Ejemplo 1 y que esta inducción era dependiente de la dosis. Esto explica por qué en ratones se tolera un inhibidor selectivo de PPP1R15B: la inducción de PPP1R15A desfosforila eIF2a, asegurando que la fosforilación de eIF2a que resulta de la inhibición de PPP1R15B por un compuesto del Ejemplo 1 es solo transitoria. Esto es importante porque una fosforilación persistente de elF2a es perjudicial. La inducción de PPP1R15A in vivo por un inhibidor de Pp p 1 R15B es un parámetro farmacodinámico que puede usarse para evaluar la eficacia y potencia de los inhibidores de PPP1R15B en mamíferos en estudios preclínicos o clínicos.
Un compuesto del ejemplo 1 previene una enfermedad en un mamífero (figura 9)
El aumento del plegamiento mediante la inhibición de PPP1R15B tiene el potencial de beneficiar a una amplia gama de patologías humanas. Para probar esto, los inventores observaron la enfermedad de Huntington (EH), una enfermedad de proteostasis causada por la acumulación de una proteína mal plegada, la huntingtina mutante. Hay algunos informes que indican que la huntingtina mutante induce la UPR (Duennwald y Lindquist, Gene & Development, 22, 3308-3319, 2008; Nishitoh y col., Genes & Development, 16, 1345-1355, 2002). Sin embargo, la incapacidad de los inventores de detectar PPP1R15A en modelos de la enfermedad de Huntington sugirió que PPP1R15A no es una diana terapéutica para la EH. Como la EH no tiene cura hasta la fecha, los inventores valoraron si la EH podría prevenirse mediante la inhibición de PPP1R15B. Los inventores encontraron que el tratamiento de ratones con EH con 2 mg/kg de un compuesto del Ejemplo 1 impidió el deterioro del rendimiento motor (Figura 9). Esto demuestra que PPP1R15B es una diana terapéutica válida y que, por lo tanto, la inhibición de PPP1R15B será útil en el tratamiento y prevención de enfermedades.
Como se demuestra aquí, para determinar si una enfermedad se puede prevenir o mejorar mediante la inhibición de PPP1R15B, se pueden tratar modelos de ratón o humanos con dosis tolerables del inhibidor. Para confirmar la inhibición de la diana in vivo, los marcadores de la vía de PPP1R15B pueden monitorizarse y usarse como marcadores farmacodinámicos. Tales marcadores pueden ser PPP1R15A, como se muestra aquí (figura 8) o cualquier otra diana en la vía como los marcadores de UPR o ISR (que incluyen, entre otros, fosforilación de eIF2a, CHOP, ATF4). Como se muestra aquí con un compuesto del ejemplo 1, un inhibidor de PPP1R15B será útil para tratamientos siempre que sea seguro y esto está determinado por la selectividad del compuesto para PPP1R15B.
Mielinización en explantes de ratones neuropáticos (figura 10).
La enfermedad de CMT es un grupo de neuropatías de mielina causadas por mutaciones en varios genes. Las mutaciones en la proteína de mielina periférica PMP22 son las causas más comunes de la enfermedad de CMT. Una mutación en PMP22 (Trembler-J) causa el plegamiento incorrecto de PMP22 y una enfermedad en ratones que se asemeja a la CMT en humanos debido a defectos en la mielina en el sistema nervioso periférico. Los explantes de ratones mutantes PMP22 recapitulan la grave hipomielinización observada en las enfermedades humanas. Los inventores encontraron que el tratamiento del cultivo de ganglios de la raíz dorsal (GRD) de ratones mutantes PMP22 mejoró la mielinización. Se ha descubierto previamente que los cultivos de GRD de ratones mutantes son modelos útiles para predecir la eficacia terapéutica de los compuestos. Por tanto, los datos aquí presentes demuestran que el compuesto del ejemplo 1 será útil para tratar una enfermedad causada por mutación o sobreproducción de PMP22, como la enfermedad de CMT. El compuesto del ejemplo 1 también será útil en el tratamiento de otros trastornos de la mielina.
Evaluación de la eficacia de PPP1R15B en una enfermedad metabólica (figura 11)
Se sabe que las enfermedades metabólicas como la diabetes, la obesidad, la enfermedad del hígado graso y la aterosclerosis están asociadas con el estrés patológico del RE y se cree que los moduladores farmacológicos de la UPR pueden tener un beneficio terapéutico. Como no había inhibidores de PPP1R15B disponibles antes de este estudio, no estaba claro si PPP1R15B podría ser una diana terapéutica en enfermedades metabólicas. Los inventores valoraron esta posibilidad y encontraron que el tratamiento de ratones obesos con un compuesto del ejemplo 1 reducía el nivel patológico alto de glucosa en sangre en estos mamíferos (figura 11). Esto demuestra que el tratamiento con un compuesto del ejemplo 1 puede mejorar un trastorno metabólico.
Habiendo demostrado en un modelo de enfermedad que el tratamiento con un compuesto del ejemplo 1 es beneficioso, es evidente que los compuestos de la invención serán beneficiosos para otros trastornos metabólicos de mamíferos tales como diabetes, obesidad, enfermedad del hígado graso y aterosclerosis.
EJEMPLO B
La fosforilación reversible controla la actividad de la mayoría de las proteínas. Con solo unos pocos inhibidores de las serina/treonina fosfatasas, aún se cree esta gran familia de enzimas no es quimiomodulable. Aquí utilizamos resonancia de plasmón superficial para diseñar un procedimiento que permitió el descubrimiento racional de TST3 (compuesto establecido en el ejemplo 1), un inhibidor selectivo de PPP1R15B, una subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 1. La inhibición selectiva de PPP1R15B provocó una acumulación rápida y transitoria de su sustrato fosforilado, la subunidad a del factor de iniciación de la traducción 2 (elF2a). Esto produjo una atenuación rápida y transitoria de la síntesis de proteínas, una propiedad que aprovechamos terapéuticamente para prevenir de forma segura los defectos moleculares y de comportamiento en un modelo de ratón de la enfermedad de Huntington, una enfermedad paradigmática de mal plegamiento de proteínas. Esto establece que las subunidades reguladoras intrínsecamente desordenadas de serina/treonina fosfatasas son dianas farmacológicas válidas y manejables y proporcionan un procedimiento generalizable para identificar sus inhibidores selectivos.
Para sobrevivir, las células responden a las duras condiciones mediante la fosforilación de la subunidad a del factor de iniciación de la traducción eucariota 2 elF2 a en la Serina 51 para reducir la síntesis de proteínas, ahorrando así recursos para neutralizar los desafíos (1-3). El ajuste fino dinámico de la fosforilación de elF2a es vital y tanto la falta como el exceso de fosforilación de elF2a son perjudiciales (4). Para protegerse contra una fosforilación persistente de elF2a, los mamíferos han desarrollado dos fosfatasas de elF2a selectivas compuestas por una o dos subunidades reguladoras, la PPP1R15A (R15A) inducible o la PPP1R15B (R15B) constitutiva, unida a la subunidad catalítica PP1c (5, 6). Los inhibidores de R15A se han identificado por casualidad y han proporcionado la prueba del concepto de que las serina-treonina fosfatasas pueden inhibirse selectivamente al dirigirse a subunidades reguladoras (7, 8). Si bien el mismo paradigma podría en principio explotarse para inhibir selectivamente cualquier otra holofosfatasa de PP1, el descubrimiento racional de inhibidores selectivos de subunidades reguladoras de fosfatasas intrínsecamente desordenadas representa un desafío no resuelto.
Aquí nos propusimos desarrollar una estrategia generalizable para identificar nuevos inhibidores selectivos de la fosfatasa. Primero, expresamos y purificamos R15A y R15 B (figura 12) y usamos resonancia de plasmón superficial (RPS) para medir las afinidades de unión de inhibidores de R15A conocidos a sus dianas. Intentamos inmovilizar R15 en el chip de RPS, pero este procedimiento produjo resultados inconsistentes, probablemente porque las proteínas no estructuradas de forma nativa precipitan en el chip. Por lo tanto, usamos guanabenz biotinilado (GBZ) (7) que inmovilizamos en el chip y valoramos la unión de las proteínas en el compuesto inmovilizado (Figura 13A y 13B). Encontramos que el conocido inhibidor de R15A GBZ se unía al fragmento de R15A recombinante con una afinidad diez veces mayor que la de R15B (figuras 13 y 14), lo que confirma su selectividad por R15A (7). Sin embargo, la afinidad 11 pM de GBZ por R15A era incompatible con la potencia submicromolar de GBZ en las células (7), lo que indica que el ensayo utilizado aquí no recapituló las condiciones celulares probablemente porque la subunidad reguladora aislada está intrínsecamente desordenada (9).
Por lo tanto, diseñamos otro ensayo para evitar el problema encontrado al trabajar con subunidades reguladoras aisladas.
En las células, las subunidades reguladoras de fosfatasas se pliegan al unirse a PP1c (9), lo que sugiere que se pueden requerir holofosfatasas para diseñar ensayos relevantes Reconstituimos un R15A-PP1c recombinante usando un PP1c biotinilado in vivo y un fragmento grande de R15A (aminoácido 325-636), conocido por unirse a GBZ (7) y Sephin1 (8). El complejo R15A-PP1c se purificó mediante captura por afinidad en resina de neutravidina (figura 15). Asimismo, se purificó la holofosfatasa paráloga R15B-PP1c (figura 15). Cabe destacar que R15A y R15B están relacionadas funcionalmente pero con secuencias muy diferentes (figura 16). Las holofosfatasas R15-PP1c se inmovilizaron a continuación en un chip sensor de estreptavidina RPS en dos etapas (figura. 17). Los experimentos de RPS mostraron que GBZ y Sephin1 se unían fuertemente a R15A-PP1c pero no o débilmente a R15B-PP1c (figura 18-22) y no a PP1c solamente (figura 18-22), lo que confirma su selectividad por R15A. Las afinidades medidas en estado estacionario de GBZ y Sephin1 por R15A-PP1c, 0,122 pM y 0,786 pM) respectivamente fueron compatibles con la potencia submicromolar de los inhibidores en ensayos basados en células (7) e in vivo (8).Por tanto, los experimentos de RPS realizados con holofosfatasas recombinantes proporcionan un procedimiento cuantitativo para medir las afinidades de unión relevantes de inhibidores conocidos a R15A.
A continuación, utilizamos el procedimiento establecido aquí para buscar inhibidores selectivos de la fosfatasa con propiedades novedosas. Sintetizamos derivados de GBZ e identificamos TST3 (inhibidor racional de una holofosfatasa), un compuesto que se une fuerte y selectivamente a R15B (Kd = 0,033 pM) (figura 24).
También medimos las afinidades de unión de Salubrinal (Sal003), un inhibidor conocido de R15A y R15B y descubrimos que se une a R15A, R15B así como a PP1 (figura 23) con afinidades > 20 |jM (figura 25).
A continuación, confirmamos que TST3 no inhibe PP1 en un ensayo enzimático (figura 26) y a continuación lo caracterizamos en células. En condiciones basales, GBZ no afectó las tasas de fosforilación o traducción de elF2a, como se esperaba porque PPP1R15A no se expresa sin estrés (5, 7). En contraste con GBZ, TST3 aumentó rápida y transitoriamente la fosforilación de elF2a (figura 27). Las velocidades de traducción fueron paralelas a la fosforilación de elF2a y la traducción disminuyó rápida y transitoriamente por TST3 (figura 28). Las transcripciones que codifican ATF4 y R15A escapan a la atenuación de la traducción general resultante de la fosforilación de elF2a (10, 11). TST3 indujo la expresión de ATF4 y R15A (figura 27). Especialmente, la expresión de R15A coincidió con la recuperación de la traducción observada después de 10 horas después de la adición de TST3 (figura 27, 28). Esto sugiere que R15A mediaba la desfosforilación de elF2a y la recuperación de la traducción en células tratadas con TST3, lo que implica que TST3 es un inhibidor selectivo de R15B-PP1c.
De ser así, TST3 debería provocar una fosforilación persistente de elF2a y una inhibición persistente de la síntesis de proteínas en ausencia de R15A De hecho, la fosforilación de elF2a inducida por TST3 y la atenuación de la traducción se hicieron persistentes en presencia del inhibidor de R15A GBZ o tras la inactivación genérica de R15A. Es importante destacar que todos los efectos medibles de TST3 sobre la fosforilación y traducción de elF2a se abolieron en células -/- r15b (figuras 31-32). Esto demuestra que TST3 es un inhibidor selectivo de R15B. La inhibición selectiva de R15B provoca una fosforilación transitoria de elF2a y una atenuación transitoria de la síntesis de proteínas.
La combinación de ensayos descritos aquí define las actividades de los inhibidores de R15. Como se mostró anteriormente (7), un inhibidor selectivo de R15A no afecta la traducción o la fosforilación de elF2a en células no estresadas. Por el contrario, mostramos aquí que un inhibidor selectivo de R15B induce transitoriamente la fosforilación de elF2a en ausencia de estrés. Es así porque la R15A es inducida por un inhibidor selectivo de R15B. La combinación de un inhibidor de R15A y R15B define la actividad de un inhibidor de R15A/B: un inhibidor de R15A/B induce una inhibición persistente de la síntesis de proteínas en las células. También induce ATF4, lo que confirma su efecto en la diana.
Aquí, hemos descrito un procedimiento que permitió el descubrimiento de TST3, un inhibidor selectivo de fosfatasa constitutiva elF2a R15B y, por lo tanto, demostró que el descubrimiento racional de fármacos se puede aplicar a subunidades reguladoras intrínsecamente desordenadas de las fosfatasas. La inhibición selectiva de R15B da como resultado una atenuación transitoria de la síntesis de proteínas, una propiedad que se aprovechó terapéuticamente para prevenir de forma segura la EH en ratones. Los inhibidores selectivos de R15B como TST3 pueden ser útiles para el tratamiento de diversas enfermedades causadas por proteínas mal plegadas. Además, el procedimiento proporcionado aquí es, en principio, generalizable a otras fosfatasas, así como a proteínas intrínsecamente desordenadas, creando nuevas y amplias oportunidades para el descubrimiento de fármacos. El procedimiento se resume en un diagrama esquemático de la figura 33.
Materiales y procedimientos
Expresión y purificación de proteínas
MBP-R15A325-636-His y MBP-R15B34°-698-His se expresaron y purificaron como se describe anteriormente (Das y col. (2015) Science 348, 239-242). Se clonó ADNc que codifica PP1y humano en el vector de transferencia de baculovirus pDW464 para añadir un péptido aceptor de biotina en el extremo amínico (BAP). El vector también codifica la holoenzima sintetasa de biotina E. coli (BirA), de manera que las proteínas marcadas con BAP puedan biotinilarse (bio-PP1c) in vivo en células de insecto Spodoptere frugiperda (Sf9) (Duffy y col. (1998) Anal. Biochem. 262, 122-128). Se usó el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Thermo Fischer Scientific) para generar el ADN del bácmido recombinante y se usaron células de insecto Sf9 para amplificar las reservas virales. La proteína se produjo utilizando células de insecto Sf9 en medio Insect-Xpress (Lonza). bio-PP1c se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna HiTrap Q HP (GE Healthcare), seguida de filtración en gel (columna HiLoad 16/600 Superdex 200, GE Healthcare). Las proteínas se analizaron en geles BOLT SDS-PAGE 4-12 % Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific) teñidos con InstantBlue (Expedeon) y la presencia de una PP1 biotinilada se confirmó mediante una transferencia de Western usando un anticuerpo de estreptavidina-HRP de alta sensibilidad de Pierce (Thermo Fisher Scientific). Esto da como resultado una proteína parcialmente pura, la purificación completa se alcanza en etapas posteriores debido a la alta afinidad y especificidad de la biotina a la estreptavidina (en el chip de RPS).
Unión de R15 a bio-PP1c
Se incubó bio-PP1c parcialmente purificado (100 j l) en esferas de agarosa neutravidina (Thermo Fisher Scientific) durante 2 horas a 4 °C con agitación en tampón IP (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Eg Ta 0,1 mM, 0,05 % Tween 20, 0,1% NP40). A continuación, las esferas se lavaron tres veces con el tampón IP y se incubaron en presencia o ausencia de R15 10 j M (A o B) durante la noche a 4 °C con agitación en tampón IP. A continuación, las esferas se lavaron tres veces con tampón IP y las proteínas unidas se eluyeron hirviendo en 60 j l de tampón Laemmli. Las proteínas unidas se analizaron a continuación en geles BOLT SDS-PAGE 4-12 % Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific) teñidos con InstantBIue (Expedeon) y la presencia de una PP1c biotinilada se confirmó mediante una transferencia de Western usando un anticuerpo de estreptavidina-HRP de alta sensibilidad de Pierce (Thermo Fisher Scientific).
Resonancia de plasmón superficial (RPS)
Captura de bio-GBZ o bio-PP1c en el chip sensor de SA
Se utilizó un sistema Biacore T200 (GE Healthcare) para todos los experimentos y GBZ biotinilado (bio-GBZ) (Tsaytler:2011) o bio-PP1 se capturó en un chip sensor de SA (GE Healthcare). La superficie recubierta de estreptavidina se activó mediante una inyección de 1 minuto con una solución de NaOH 50 mM y NaCl 1 M tres veces a un flujo de 10 pl/min. bio-GBZ o bio-PP1c se diluyeron en el tampón de migración (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EGTA 0,1 mM, Tween 20 al 0,05 %, DMSO al 0,1 %) y se inyectaron a una concentración de aproximadamente 300 nM a un flujo de 10 pl/min directamente a la superficie recubierta de estreptavidina para alcanzar el nivel de inmovilización de bio-GBZ o bio-PP1c correspondiente a ~200 y 6000 RU, respectivamente. Se realizó una inmovilización en blanco para una de las superficies del chip sensor Sa para utilizarla como referencia.
Determinación de las constantes de unión en estado estacionario de pequeñas moléculas a complejos de holofosfatasas R15 utilizando la superficie de bio-PP1c
Con pequeñas desviaciones, se usó el mismo procedimiento y condiciones en todos los experimentos de unión. Las moléculas pequeñas se almacenaron como soluciones madre de 50 mM en DMSO al 100 %. Antes de determinar las constantes de unión, se prepararon diluciones en serie de 12 u 8 concentraciones de los compuestos en el tampón de migración en una placa de 96 pocillos. Antes de cada serie de dilución de compuestos, la subunidad reguladora, MBP-R15A325'636-His o MBP-R15B34°'698-His, se diluyó a 10 pM en el tampón de funcionamiento y se capturó en la superficie de bio-PP1c a un caudal de 30 pl/min durante 1 minuto para formar el complejo de holofosfatasa en la superficie del chip sensor. A esto le siguió un período de estabilización de 1 minuto, para eliminar cualquier unión inespecífica. Luego, sin regenerar la superficie, la serie de dilución del compuesto se inyectó en la superficie del chip a un flujo de 30 pl/min durante 1 minuto, seguido de 2 minutos de tiempo de disociación. Después de cada serie de diluciones, la superficie se regeneró usando NaCl 3 M durante 90 segundos. Después de la regeneración, las respuestas de RPS generalmente volvieron a los niveles básicos y la superficie de bio-PP1c estaba lista para la siguiente serie de diluciones de compuestos. Para poder corregir pequeñas variaciones en la concentración de DMSO entre muestras, se inyectaron ocho muestras de solvente que van desde DMSO al 0,06 a DMSO al 8 % cada quincuagésimo ciclo. La temperatura de la celda de flujo fue de 10 °C.
Análisis de los datos
Se analizaron los sensogramas utilizando el software de evaluación Biacore T200 y las constantes de unión se determinaron con base en un modelo en estado estacionario. Se llevan a cabo experimentos cinéticos utilizando diferentes concentraciones del compuesto y se determinan sus respectivos niveles de unión en equilibrio. Estos niveles de respuesta de equilibrio (Req) se graficaron contra la concentración y se adaptaron utilizando un ajuste global, que puede determinar constantes de afinidad en estado estacionario, es decir la concentración a una saturación del 50% es Kd (Frostell-Karlsson (2000) como anteriormente).
Ensayo de actividad catalítica PP1c
Se incubó PP1c purificada (30 nM) en Tris pH 750 mM, EGTA 1,5 mM, MnCb 3 mM, Brij-350,01%, p-mercaptoetanol 0,15% con concentraciones indicadas de caliculina A GBZ, Sal003, Sephin1 y TST3 durante 30 a 4°C. A continuación, se midió la actividad residual de PP1c utilizando el kit de ensayo de fosfatasa EnzChek (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del proveedor.
Cultivo celular de mamífero
Las células HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con penicilina, estreptomicina, glutamina y suero bovino fetal (SBF) al 10%.Las células Ppp1r15a -/- y Ppp1r15b -/- MEF se mantuvieron en DMEM suplementada con penicilina, estreptomicina, glutamina, p-mercaptoetanol 55 pM, 1X aminoácidos no esenciales (Sigma) y SBF al 10%.
Análisis de proteínas en inmunotransferencias
Las células (90.000 células/ml) se sembraron en una placa de 24 pocillos y se trataron según lo indicado. Al final del tratamiento, las células se lisaron en tampón Laemmli 150 pl. Los lisados se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos, se sonicaron y se resolvieron en geles Bolt Bis-Tris Plus al 4-12 % (Thermo Fisher Scientific). Las proteínas se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema iBlot 2 (Thermo Fisher Scientific) y se analizaron utilizando los siguientes anticuerpos: e-lF2a-P (44-728G, Thermo Fisher Scientific, 1:1000), e-lF2a (ab5369, Abcam, 1:1000), tubulina (T5168, Sigma-Aldrich, 1:4000), BiP (610978, BD Biosciences Pharmingen, 1:1000), ATF4 (sc-200, Santa Cruz Biotechnology, 1:500), Ppp1r15a (10449-1-AP, Proteintech, 1:1000) y Ppp1r15b (14634-1-AP, Proteintech, 1:1000). Las proteínas se visualizaron usando ECL Prime (GE Healthcare).
Evaluación de tasas de traducción
Las células (90.000 células/ml) se sembraron en placas de 12 pocillos, se trataron según lo indicado, se marcaron con 35S-methionine 100 pCi/ml (Hartmann Analytic) durante 10 minutos a 37°C, se lavaron con PBS helado y se lisaron en tampón de Laemmli 120 pl. Los lisados se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos, se sonicaron y se resolvieron en geles Bolt Bis-Tris Plus al 4-12 % (Thermo Fisher Scientific). A continuación, los geles se tiñeron con InstantBlue (Expedeon) y se analizaron mediante imágenes de fósforo.
Animales
Todo el cuidado de los animales y los procedimientos se realizaron de conformidad con la norma sobre el uso de animales en la investigación (Ley de Procedimientos Científicos para Animales del Reino Unido de 1986 y la Directiva de la UE 2010/63/ EU) con aprobación ética local.
Se obtuvieron ratones macho C57BL/6J de The Jackson Laboratory o Charles River. Se obtuvieron ratones transgénicos HD-N171-82Q (HD) de The Jackson Laboratory y se mantuvieron en un entorno mixto. (C3H/B6). Todos los ratones se alojaron en grupos (2-3 por jaula), en jaulas ventiladas individualmente con acceso ad libitum a comida y agua y se mantuvieron en 12 horas en un cilo de luz/oscuridad (7 a.m. a 7 p.m.).
Tratamientos farmacológicos:
La sal de acetato de TST3 o GBZ se disolvió en agua y se sonicó durante 10 minutos. La solución se dividió en alícuotas y se mantuvo a -20 ° C hasta su uso. Una vez descongelado, un tubo se mantuvo a 4 ° C y se usó dentro de las 24 horas.
Se administró TST3 o GBZ por alimentación forzada oral a razón de 2 mg/kg (a menos que se especifique lo contrario). Los ratones recibieron una dosis única o fueron tratados de forma crónica, una vez al día.
Para producir un grupo experimental, se cruzaron machos transgénicos HD-N171-82Q con hembras de tipo salvaje C3H/B6 F1. Se aleatorizaron machos transgénicos de 4 semanas de edad y sus controles machos de camada de tipo salvaje en diferentes grupos y se trataron con TST3 durante 4 semanas.
Estudios farmacocinéticos:
Los estudios de farmacocinética fueron realizados por XenoGesis. Se administró TST3 por vía oral a machos C57BL/6J. Las muestras de plasma se prepararon mediante precipitación de proteínas con estándares internos que contenían metanol. Los tejidos se pesaron y prepararon mediante homogeneización. (1:3 en solución salina tamponada con fosfato) y la proteína se precipitó con un patrón interno que contenía metanol. Después de la adición de metanol, las muestras de plasma y tejido se colocaron a -20 ° C durante > 1 hora (o durante la noche) para permitir que las proteínas precipitaran. Las muestras se centriguraron a continuación a 2500 x g (3400 rpm) durante 20 minutos a 4°C. Los sobrenadantes fueron analizados por LC-MS/MS.
Rotarod
El tratamiento con TST3 de machos transgénicos HD-N171-82Q y sus controles machos de camada de tipo salvaje comenzó a las 4 semanas de edad y se continuó durante 4 semanas antes de la prueba. Durante la fase de habituación, los ratones se colocaron sobre una varilla estática durante 1 minuto y a continuación se entrenaron durante 1 minuto a una velocidad fija de 4 rpm. Se repitió la fase de habituación. La prueba de la varilla giratoria se realizó en tres ensayos. En cada ensayo, se permitió que los ratones corrieran sobre una barra de aceleración de 4 a 40 rpm durante hasta 300 segundos y se contó la latencia para caer. Se presenta el promedio de tres ensayos.
Monitorización del rendimiento motor tras la administración aguda de TST3
Con el fin de evaluar los efectos secundarios similares a GBZ (debido a la actividad adrenérgica) del tratamiento, se controló el rendimiento motor de los ratones después de una sola administración de TST3. Con este fin, los ratones se trataron con TST3 y se dejaron en una jaula durante 60 minutos. El comportamiento de los ratones se controló cada 15 minutos. Los ratones tratados de forma similar con GBZ se utilizaron como control.
Análisis estadístico
Las comparaciones se llevaron a cabo mediante la prueba t de Student o el análisis de varianza bidireccional (ANOVA). Las diferencias significativas se indican en las cifras correspondientes.
Síntesis de compuestos
Procedimiento sintético:
A una suspensión de 2,3-diclorobenzaldehído (22,00 g, 0,12570 mol) y bicarbonato de aminoguanidina (17,1 g, 0,12570 mol) en metanol (220 ml) se añadió ácido acético (22 ml) a 25°C. La mezcla resultante se calentó a 70°C durante los siguientes -30 minutos. Al calentar, la suspensión se volvió transparente. La finalización de la reacción se monitorizó en TLC usando diclorometano/metanol (8/2) como fase móvil. Tras completarse la reacción, la mezcla de reacción se dejó enfriar a 25 °C y se concentró al vacío. El residuo resultante se suspendió en éter dietílico (100 ml) y el producto resultante se recogió por filtración. Este procedimiento se repitió 3 veces. Al final del procedimiento anterior, podríamos obtener la (E) -2- (2,3-diclorobenciliden) hidrazina-1-carboximidamida deseada ("TST3). LC-MS: m/z= 231,23 (M+H). El producto resultante también se analizó mediante 1H-NMR, 13C-NMR, titulación potenciométrica, HPLC y análisis de CHN.
REFERENCIAS
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto inhibidor selectivo de PPP1R15B que es (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal del mismo, para uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.
2. Una composición que comprende un inhibidor selectivo de PPP1R15B, (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.
3. Una composicion farmacéutica que comprende un inhibidor selectivo de PPP1R15B, (E)-2-(2,3-diclorobenziliden)hidrazina-1-carboximidamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas, un trastorno de proteostasis, un trastorno de mielina o un trastorno metabólico.
4. El compuesto, composición o composición farmacéutica para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas o trastorno de proteostasis.
5. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en la reivindicación 4, en el que el trastorno es un trastorno de poliglutamina.
6. El compuesto o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en la reivindicación 5, en el que el trastorno es seleccionado de: enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y una ataxia.
7. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en la reivindicación 6, en el que el trastorno de poliglutamina es enfermedad de Huntington.
8. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en la reivindicación 6, en el que el trastorno de poliglutamina es enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer.
9. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en la reivindicación 4, en el que el trastorno se selecciona de: degeneración retiniana, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica, una tauopatía y una enfermedad priónica.
10. El compuesto, composición o composición farmacéutica para uso según se reivindica en la reivindicación 4 en el tratamiento de trastornos asociados con la acumulación de proteína tau asociada con microtúbulos.
11. El compuesto, composición o composición farmacéutica para uso según se reivindica en la reivindicación 10, en el que el trastrono se selecciona de: enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, parkinsonismo y demencia, enfermedad de granos argirófilos, encefalopatía traumática crónica, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (ONDC), síndrome de Down, demencia familiar británica (DFB), demencia familiar danesa (DFD), demencia frontotemporal y parkinsonismo relacionados con el cromosoma 17 (FTDP-17) (causados por mutaciones de MAPT), degeneración lobar frontotemporal (DLFT) (algunos casos causados por mutaciones de C9ORF72), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, parkinsonismo de Guadalupe, distrofia miotónica, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral con proteína priónica, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, retraso mental relacionado con SLC9A6, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia solo ovillos, tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares
12. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el trastorno es un trastorno de mielina y se selecciona de: esclerosis múltiple, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de desvanecimiento de la sustancia blanca, encefalomielitis diseminada aguda, leucomalacia periventricular, lesión de la sustancia blanca periventricular, Tabes dorsalis, enfermedad de Devic, neuritis óptica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, mielitis transversa, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica anti-MAG, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, lesión difusa de la sustancia blanca, síndrome de Guillain-Barré, mielinólisis central pontina, enfermedades desmielinizantes hereditarias tales como leucodistrofia y enfermedad de Charcot Marie Tooth (CMT).
13. El compuesto, composición o composición farmacéutica para uso según se reivindica en la reivindicación 4 en el tratamiento de enfermedades causadas por defectos de mal plegamiento o tráfico de cualquier proteína elaborada en el retículo endoplásmico (RE).
14. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su suo según se reivindica en la reivindicación 13, en el que la enfermedad se selecciona de: fibrosis quística causada por mutaciones que alteran el plegamiento de la proteína transmembrana (CFTR); bocio hipotiroideo congénito con deficiencia de tiroglobulina debido al mal plegamiento y/o defecto de tráfico de la hormona tiroglobulina; diabetes insípida neurohipofisaria familiar causada por mal plegamiento y ausencia de arginina vasopresina circulante (esto también puede incluir determinadas formas de diabetes insípida nefrogénica heredada genéticamente); trastornos de la biosíntesis de procolágeno en los que la enfermedad está causada por un fallo en el plegado, ensamblaje y sintetización del colágeno, tal como, de modo no taxativo, osteogénesis imperfecta; de manera más general, cualquier enfermedad genética de los tejidos conectivos en la que el mal plegamiento/falta de síntesis o localización errónea de las proteínas está en el modo de acción, como la displasia de la placa de crecimiento asociada con defectos de proteínas de la matriz extracelular; hipercolesterolemia, con defectos moleculares causados por mutaciones en el receptor de LDL que causan falta de síntesis, transporte intracelular alterado o función anormal; deficiencias de alfa-1 antitripsina debido al mal plegamiento de alfa 1 antitripsina; trastorno lisosómico debido al mal plegamiento de proteínas asociadas con la función lisosómica, como la enfermedad de Gaucher y la enfermedad de Niemann-Pick y la enfermedad de Anderson-Fabry; retinitis pigmentosa (RP), que es la forma más común de degeneración retiniana hereditaria causada por el mal plegamiento de las proteínas de rodopsina, su retención del RE y el estrés del RE y la muerte celular resultantes; y enfermedad inflamatoria del intestino que se asocia con estrés del RE.
15. El compuesto, composición o composición farmacéutica para su uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el trastorno es un trastorno metabólico y se selecciona de: diabetes, síndrome de Wolcott-Rallison, obesidad, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, enfermedad del hígado graso y aterosclerosis.
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