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ES3010296T3 - Intestinal microbiota and gvhd - Google Patents

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ES3010296T3
ES3010296T3 ES15862844T ES15862844T ES3010296T3 ES 3010296 T3 ES3010296 T3 ES 3010296T3 ES 15862844 T ES15862844 T ES 15862844T ES 15862844 T ES15862844 T ES 15862844T ES 3010296 T3 ES3010296 T3 ES 3010296T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gvhd
blautia
bacteria
clostridiales
abundance
Prior art date
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Active
Application number
ES15862844T
Other languages
English (en)
Inventor
Den Brink Marcel Van
Robert Jenq
Eric G Pamer
Ying Taur
Yusuke Shono
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Memorial Sloan Kettering Cancer Center filed Critical Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Abstract

La presente divulgación describe composiciones y métodos para aumentar la abundancia de bacterias comensales pertenecientes al orden Clostridiales, incluyendo las especies Blautia, Ruminococcus, Clostridium, Eubacterium, Holdemania y Dorea, asociadas con una reducción de la EICH letal y una mejor supervivencia general tras un trasplante de médula ósea o de células madre hematopoyéticas. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para reducir la probabilidad, la incidencia o la gravedad de la EICH mediante (1) la prevención de la pérdida de especies beneficiosas endógenas mediante la selección de antibióticos; (2) la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una o más Clostridiales asociadas con una EICH reducida a personas que pueden carecer o haber perdido dichas cepas de su microbiota intestinal. Además, el apoyo a los Clostridiales endógenos o restablecidos relacionados con la EICH reducida como opción de tratamiento para reducir la EICH también puede proporcionarse mediante suplementos nutricionales, por ejemplo, azúcares fermentados por algunas especies de Clostridiales con actividad reductora de la EICH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Microbiota intestinal y GVHD
Declaración relativa a la investigación o el desarrollo patrocinados por el gobierno federal
Esta invención se ha realizado con el apoyo del Gobierno de EE.UU. bajo los números de subvención R01 HL069929, R01-AI080455, R01-AI100288, R01-AI101406, P01-CA023766 y P01-CA023766 de los Institutos Nacionales de Salud y el contrato HHSN272200900059C del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de EE.UU. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
Campo Técnico de la Invención
La presente invención se refiere en general a la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Más concretamente, la presente invención se refiere a una composición terapéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto tras un trasplante de médula ósea (BMT) o un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT).
Antecedentes de la invención
A pesar de las continuas mejoras en los resultados de los pacientes sometidos a trasplante alogénico de médula ósea (BMT alo), la GVHD sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en esta población'. Las estrategias modernas de inmunosupresión sólo son parcialmente eficaces para evitar la GVHD y, al mismo tiempo, aumentan el riesgo de infecciones y recurrencia de la enfermedad. Así pues, las estrategias que reducen la GVHD, pero dejan intacta la función inmunitaria pueden mejorar potencialmente los resultados. Una de estas estrategias consiste en poner en la diana a la compleja comunidad de microbios que residen en nuestro tracto intestinal, denominados colectivamente microbiota intestinal.
Hace tiempo que se sospecha que existe una relación entre el microbiota y la GVHD, pero aún no se conoce bien. Los ratones trasplantados en condiciones2 libres de gérmenes o que reciben antibióticos3 descontaminantes del intestino desarrollan una GVHD menos grave. Los estudios clínicos sugirieron inicialmente un beneficio de la descontaminación45 bacteriana casi total, pero posteriormente no mostraron ningún beneficio6-8 claro y este enfoque se abandonó a principios de la década de 19909 Se sigue practicando la descontaminación intestinal parcial, pero se sabe poco sobre los antibióticos óptimos. Un estudio halló que la adición de metronidazol a la ciprofloxacina produjo una reducción significativa de la GVHD aguda, lo que sugiere que las bacterias anaerobias pueden contribuir a la patogénesis10 de la GVHD.
Sin embargo, estudios más recientes indican que este enfoque puede no ser el ideal. La administración de metronidazol durante el BMT alo se asoció a la expansión de Enterococcus resistentes a la vancomicina en el tracto intestinal, que en algunos pacientes precedió a la bacteriemia11 enterococcal. Otros estudios han descubierto que los anaerobios obligados del intestino, en particular las especies clostridiales, son importantes mediadores de la homeostasis intestinal y evitan la inflamación mediante la regulación de las células12 T reguladoras intestinales.
Recientemente se ha informado de que el aumento de la diversidad bacteriana en el momento del injerto se asoció a una mejora de la supervivencia global tras el BMT alo y a una reducción de la mortalidad13 relacionada con el trasplante. La población estudiada, sin embargo, era heterogénea y, en particular, incluía un 45 % de pacientes que recibieron un aloinjerto empobrecido en células T. Los receptores de este tipo de trasplante tienen un riesgo mucho menor de desarrollar GVHD. Probablemente debido al número inadecuado de pacientes y a la heterogeneidad, no fue posible determinar las subcategorías de mortalidad sin recaída asociadas a la baja diversidad, que incluyen la GVHD, la infección y el fallo orgánico. El documento US2014/341921 A1 describe el tratamiento y la prevención del rechazo en el trasplante de órganos, tal como la GVHD tras un trasplante de médula ósea, utilizando bacterias comensales humanas. Jenq et al., 2012, J. Exp. Med, 209:903-911 divulga que la inflamación intestinal secundaria a la GVHD se asocia a cambios en la composición del microbiota intestinal.
Así pues, existe la necesidad de un tratamiento que aproveche la relación entre el microbiota intestinal y la GVHD.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención proporciona una composición terapéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto tras un trasplante de médula ósea (BMT) o un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), en el que la composición terapéutica comprende una o más poblaciones purificadas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum, Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelli,y combinaciones o mezclas de las mismas. En otro aspecto, la invención proporciona una composición terapéutica para su uso en evitar, reducir la probabilidad de, y/o tratar una enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto sometido a trasplante de médula ósea o de células madre hematopoyéticas, en el que la composición terapéutica comprende una o más poblaciones purificadas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans,Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum, Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelli,y combinaciones o mezclas de las mismas. En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar en un sujeto el riesgo de desarrollar GVHD tras un trasplante de médula ósea (BMT) o un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), comprendiendo el método determinar la abundancia de una especie bacteriana del ordenClostridialesen una muestra de material fecal del sujeto, en el que el sujeto tiene un mayor riesgo de GVHD si la abundancia de dichasClostridialesen dicha muestra de material fecal es menor que la abundancia de dichasClostridialesen una muestra de material fecal de un sujeto que no tiene riesgo de desarrollar GVHD, y en la que dicha especie deClostridialesse selecciona de entre el grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum, Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelliy combinaciones o mezclas de los mismos. La presente divulgación se basa en la observación de que la enfermedad injerto contra huésped se correlaciona con cambios importantes en el microbiota intestinal que se producen durante el trasplante de médula ósea y/o de células madre hematopoyéticas, lo que sugiere que las bacterias comensales pueden ser predictoras y moduladoras del riesgo y la gravedad de la GVHD.
Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para evitar la pérdida o restaurar el microbiota gastrointestinal bacteriana de mamífero en un sujeto durante el trasplante de médula ósea o de células madre hematopoyéticas con el fin de evitar, reducir la gravedad o tratar la GVHD. La divulgación abarca varios enfoques o una combinación de los mismos para evitar la pérdida de bacterias relevantes en primera instancia, para restaurar las bacterias en un sujeto que ha sufrido una pérdida sostenida de bacterias protectoras y apoyar las poblaciones endógenas o las bacterias repobladas. Los enfoques incluyen:
(1) selección de antibióticos que tienen menor actividad contra las bacterias anaerobias obligadas como forma de preservar y evitar la pérdida de bacterias protectoras endógenas;
(2) proporcionar prebióticos que favorezcan el crecimiento de la población endógena o de las bacterias beneficiosas repobladas; y
(3) cuando ya se han perdido bacterias beneficiosas, proporcionar un probiótico, es decir, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición terapéutica que comprenda una o más bacterias beneficiosas para repoblar el tracto gastrointestinal.
La divulgación se refiere a un método para restaurar las bacterias gastrointestinales que se han perdido, por ejemplo, como resultado de la exposición a antibióticos con alta actividad contra anaerobios, que comprende administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad eficaz de al menos una bacteria del ordenClostridiales,o combinaciones de las mismas. Las bacterias pueden administrarse por vía oral. Alternativamente, las bacterias pueden administrarse por vía rectal, por ejemplo, mediante un enema.
La presente divulgación se refiere a composiciones para la reducción de la enfermedad injerto contra huésped (GVHD) y la mortalidad relacionada con la GVHD. Se basa en la observación de que existe un cambio en el microbiota del intestino que se correlaciona con la mortalidad relacionada con la GVHD. En particular, la presencia de determinadas especies bacterianas, incluidos algunos organismos que fermentan la xilosa, la rafinosa, la celobiosa o la meliztosa, es especialmente eficaz para reducir la mortalidad relacionada con la GVHD.
La divulgación se refiere a un método para reducir el riesgo de desarrollar enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) y/o tratar GVHD en un sujeto sometido a trasplante de médula ósea o trasplante de células madre hematopoyéticas, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición terapéutica que comprende una o más bacterias del ordenClostridiales,en el que la composición
(i) estimula el crecimiento o la actividad de uno o más taxones bacterianos infrarrepresentados en el microbiota del sujeto antes o después del trasplante; o
(ii) inhibe el crecimiento o la actividad de uno o más taxones bacterianos sobrerrepresentados en el microbiota del sujeto.
En el presente documento se divulga un método para reducir la probabilidad, incidencia o gravedad de la GVHD en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una composición que comprende al menos una especie del ordenClostridiales.El organismo puede comprender un 16SrADN con la secuencia de nucleótidos de GenBank X94966, una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12 y 15 o una secuencia con aproximadamente 98 % a 100 % de identidad con cualquiera de dichas secuencias; por ejemplo, aproximadamente 99-100 %; por ejemplo, aproximadamente 99.5-100 %. La composición terapéutica puede comprender bacterias seleccionadas de los génerosBlautia, Ruminococcus, Eubacterium, Holdemania y Clostridium.Las bacterias pueden seleccionarse del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelliy combinaciones o mezclas de las mismas.
La especieBlautiapuede serBlautia producta.
En el presente documento se divulga una composición terapéutica que comprende una especie deClostridiales. El organismo puede comprender un 16SrADN con la secuencia de nucleótidos de GenBank X94966, una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12 y 15 o una secuencia con una identidad de aproximadamente el 98 % y el 100 % con cualquiera de dichas secuencias; por ejemplo, de aproximadamente el 99 % y el 100 %; por ejemplo, de aproximadamente el 99.5 % y el 100 %. La composición terapéutica puede comprender bacterias seleccionadas de los génerosBlautia, Ruminococcus, Eubacterium, HoldemaniayClostridium.Las bacterias pueden seleccionarse del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelliy combinaciones o mezclas de las mismas.
En el presente documento se divulga un método para reducir la probabilidad de GVHD o evitarla, en el que se administra al sujeto una composición que comprende al menos una especie deClostridialesdesde aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 2 semanas antes del BMT alo, desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 2 semanas antes del BMT alo, y desde aproximadamente 7-10 días antes del BMT alo.
Un método para reducir el riesgo, la incidencia o la gravedad de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto sometido a un trasplante de médula ósea (BMT) o a un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de vancomicina oral o ampicilina cuando el sujeto ha sido tratado por fiebre neutropénica con un antibiótico intravenoso seleccionado del grupo que consiste en metronidazol, piperacilina-tazobactam (pip-tazo), imipenem.
Un método para reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto tras un trasplante de médula ósea (BMT) o un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), el método comprende: determinar la abundancia deAkkermansia muciniphilaen una muestra de materia fecal del sujeto; y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico seleccionado de ampicilina y vancomicina oral al sujeto cuando la abundancia deAkkermansia muciniphilaes superior al 1 % al 10 %, en el que la administración del antibiótico reduce la abundancia deAkkermansia muciniphilay el riesgo de GVHD se reduce o elimina. La abundancia deAkkermansia muciniphilaen dicha muestra por encima del 2 % puede indicar riesgo de desarrollar GVHD. La abundancia deAkkermansia muciniphilase determina antes del trasplante, después del tratamiento antibiótico para la fiebre neutropénica relacionada con el trasplante o en ambos casos.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1muestra que los cambios en la flora intestinal se asocian a diferencias en la mortalidad relacionada con la GVHD.A)La composición bacteriana de las muestras de heces de 64 pacientes de una cohorte de flora inicial se analizó mediante secuenciación del gen 16S y la diversidad bacteriana se cuantificó mediante el índice de Shannon. Se estratificó a los pacientes según el valor medio del índice de Shannon (2.6) y se analizó la incidencia acumulada de mortalidad relacionada con la GVHD. La mitad inferior indica los pacientes con un índice de Shannon inferior a la mediana, mientras que la mitad superior indica los pacientes con un índice de Shannon superior a la mediana.B)Las asociaciones de los géneros bacterianos con los resultados de mortalidad relacionados con la GVHD se cuantificaron mediante el análisis LEfSe.C)Los pacientes de la primera cohorte de flora y de una cohorte de flora posterior se estratificaron según la mediana de abundancia deBlautia(0.05 % en ambas) y se analizaron para determinar la incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD.
La Figura 2muestra la asociación entre la abundancia deBlautiay los resultados tras un BMT alo. Los pacientes de las dos cohortes de flora se combinaron y estratificaron según la abundancia deBlautiapor debajo o por encima del 0.05 %, y se evaluaron para los resultados indicados; se apreciaron resultados similares en cada cohorte individual.
La Figura 3muestra la asociación de la abundancia deBlautiacon la GVHD aguda clínica.A)Los pacientes se estratificaron por abundancia deBlautiainferior o superior al 0.05 %, y se evaluaron en función del desarrollo de los grados de gravedad indicados de GVHD aguda, así como de GVHD aguda que requiriera tratamiento sistémico con corticosteroides.B)Se evaluó a los pacientes para detectar el desarrollo de GVHD aguda en los órganos diana típicos.
La Figura 4indetifica de posibles determinantes de la abundancia deBlautiaen pacientes alo BMT.A)Se evaluaron y trazaron las abundancias deBlautiaen todas las muestras de heces disponibles de ambas cohortes de flora. Se construyó una tendencia de abundancia mediante filtrado de medias móviles (línea azul continua; intervalos de confianza del 95 % en gris).B)Los pacientes se subdividieron según la exposición a antibióticos con cobertura anaerobia antes de la recogida de muestras, y duración de la terapia TPN, y se evaluó la abundancia deBlautia.C)Un subconjunto de pacientes que no estuvieron expuestos a antibióticos con cobertura anaeróbica antes de la recogida de muestras se subdividieron además según la duración del tratamiento con TPN y se evaluó la abundancia deBlautiaen una muestra de heces antes del día 12 en comparación con el día 12.
La Figura 5evalúa otros factores potencialmente asociados con la mortalidad relacionada con la GVHD no son fuertemente predictivos en esta población de pacientes. Los pacientes de las cohortes combinadas se estratificaron según la abundancia media de los géneros bacterianos indicados(Lactobacillus0.2 %,Bacteroides 0.02%,Veillnoella0.03 %,Enterococcus1.3 %) y se evaluó la incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD.
La Figura 6evalúaBlautiay bacterias relacionadas por niveles de clasificación taxonómica y asociación con la mortalidad relacionada con la GVHD. Los pacientes de las cohortes de flora combinada se estratificaron según la abundancia media de los taxones bacterianos indicados(Firmicutes95 %,Clostridia3.5 %,Clostridiales2.9 %,Lachnospiraceae0.2 %,Blautia0.05 %) y se evaluó la incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD. A nivel de especie, la abundancia mediana fue del 0 % para los tres taxones, lo que dio lugar a un número desigual de pacientes tras la estratificación.Ruminococcus obeumse considera miembro del géneroBlautiapor similitud del gen 16sARNr, pero no se ha renombrado oficialmente según el Código Bacteriológico porque no ha sido posible depositar esta especie en una segunda colección de cultivos en un segundo país.
La Figura 7evalúa la asociación de la abundancia deBlautiay la mortalidad relacionada con la GVHD en subconjuntos de intensidad de acondicionamiento y fuente de injerto.A)Los pacientes fueron subdivididos por intensidad de acondicionamiento, estratificados por abundancia deBlautiapor debajo o por encima del 0.05 %, y evaluados por incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD.B)Los pacientes fueron subdivididos por fuente de injerto, estratificados por abundancia deBlautiainferior o superior al 0.05 %, y evaluados por incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD.
La Figura 8evalúa la asociación de la abundancia deBlautiay la mortalidad relacionada con la GVHD en los subconjuntos de terapia con antibióticos y TPN.A)Los pacientes se agruparon por exposición a antibióticos con actividad anaeróbica, estratificados por abundancia deBlautiainferior o superior al 0.05 %, y se evaluó la incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD.B)Los pacientes fueron subdivididos según la duración del tratamiento con TPN, estratificados según la abundancia deBlautiapor debajo o por encima del 0.05 %, y evaluados según la incidencia de mortalidad relacionada con la GVHD.
La Figura 9muestra que el apoyo nutricional específico deBlautiaproduce un aumento de la abundancia en el contexto de la GVHD y una reducción de la gravedad de la GVHD. El agua de bebida de los ratones C57BL/6 se trató con xilosa (10 g/l), un azúcar comúnmente fermentado porBlautia,a partir de una semana antes del BMT Izquierda: Se evaluó la abundancia intestinal deBlautiael día 14 tras el BMT, resultados de un único experimento. Derecha: Se realizó un seguimiento de los ratones para detectar el desarrollo de GVHD clínica (resultados combinados de 2 experimentos).
La Figura 10muestra que el apoyo nutricional específico con rafinosa reduce la gravedad de la GVHD. El agua de bebida de los ratones C57BL/6 se trató con rafinosa (10 g/l), un azúcar comúnmente fermentado porBlautia,comenzando una semana antes del BMT Se realizó un seguimiento de los ratones para detectar el desarrollo de GVHD clínica (resultados combinados de 3 experimentos).
La Figura 11muestra que el crecimiento deBlautia in vitrose ve suprimido por los factores liberados porLactobacillus johnsoniien condiciones de inanición.A)LaBlautiaMurino se cultivó en caldo de glucosa de levadura de peptona solo, o conL. johnsoniimurino en condiciones de medios limitados o medios amplios, y se cuantificaron las colonias viables. B) Se dejó queL. johnsoniicreciera en medios hasta la fase de meseta y, a continuación, se filtró estérilmente para generar medios lactoacondicionados. Se evaluaron los efectos de los medios lactoacondicionados sobre la viabilidad deL. johnsoniiyBlautiamurina cuando se mezclaron con medios frescos en una relación 1:1. También se evaluaron los efectos de la adición de los 3 agentes reductores indicados.
La Figura 12muestra que la abundancia intestinal deBlautiapredice la GVHD en humanos.A)Se evaluó la incidencia de GVHD intestinal en una cohorte de 105 pacientes, estratificados según la abundancia deBlautia.
B)Se evaluó la mortalidad relacionada con la GVHD de la misma cohorte estratificada según la abundancia deBlautia.
La Figura 13muestra que la administración deBlautiaa ratones mitiga la gravedad de la GVHD. Los ratones fueron tratados por vía oral con un ciclo de 2 días de vancomicina, un ciclo de 2 días de ampicilina, inoculados 5 y 7 días después conBlautiaoEnterococcusde origen murino, y 2 semanas después irradiados y trasplantados con médula ósea y células T B10.BR.A)Supervivencia global, resultados combinados de 2 experimentos. B)Evaluación citométrica de flujo de las poblaciones de células T, resultados de un único experimento, ratones recolectados el día 14 del BMT n=4/grupo.C)Los ratones se trataron con antibióticos y bacterias como enApero sin BMT, y se evaluó el contenido de ácidos grasos de cadena corta en las heces mediante HPLC dos semanas después de la introducción bacteriana.
La Figura 14muestra que la reducción de la ingesta nutricional parece impulsar la pérdida deBlautiaen los receptores de alo BMTA)Noventa y cuatro pacientes de BMT alo fueron evaluados semanalmente para detectar cambios en el microbiota intestinal durante la hospitalización por trasplante. La abundancia deBlautiase representa mediante una línea negra continua con bandas de confianza del 95 % en gris construidas mediante filtrado de medias móviles.B)Se analizó la abundancia deBlautiaen muestras de heces recogidas de pacientes de BMT alo que no recibían o recibían nutrición parenteral total (TPN), un marcador indirecto de una ingesta oral deficiente.C)Se recogieron análisis nutricionales y de microbiota diarios en 5 pacientes de BMT alogénico durante la hospitalización por trasplante, y se analizó la abundancia deBlautiaen muestras de heces estratificadas por consumo de kCal.D)Se analizó la abundancia en heces deClostridiales(orden al que perteneceBlautia)en ratones antes y después de una semana de reducción del 25 % en el consumo de alimentos.
La Figura 15(1 del artículo de Shono) muestra que el uso clínico de antibióticos anaerobioactivos para la fiebre neutropénica se asocia a un aumento de la mortalidad relacionada con la GVHD.(A)Se identificó una cohorte retrospectiva de 283 pacientes adultos que recibieron alo-HSCT sin depleción de células T en nuestro centro entre 1994 y 2013 y recibieron antibióticos por fiebre neutropénica. Se estratificó a los pacientes según su exposición a antibióticos con actividad significativa contra los anaerobios. Los resultados indicados se representaron mediante gráficos de Kaplan-Meier y las curvas se compararon mediante la prueba de logrank. (BaG) Seis casos clínicos representativos con representación temporal de la composición del microbiota fecal y la administración de tratamientos antibióticos durante el transcurso del alo-HSCT Se muestra la dinámica de la composición de la flora que se produce en el marco del tratamiento para el aztreonam (ByC), el imipenem(D), el pip/tazo (EyF), el metronidazol(B)y los antibióticos perturbadores mínimos de la flora(G).(H)Cambio en la abundancia de Clostridiales en muestras fecales apareadas de pacientes sometidos a alo-HSCT recogidas antes y después del tratamiento con los antibióticos indicados.
La Figura 16El tratamiento con imipenem, en comparación con el tratamiento con aztreonam, suprime los comensales anaerobios y eleva la gravedad de la GVHD en ratones.(A)Análisis de la composición de la flora mediante secuenciación del ARNr 16S antes y después del tratamiento con los antibióticos indicados en ratones C57BL/6 sanos. Los ratones se trataron con inyecciones subcutáneas (SC) de cada antibiótico dos veces al día durante dos días (500 mg/kg para pip/tazo y 100 mg/kg para los demás) y se recogieron muestras de heces al día siguiente. Los valores representan la media ± SEM (n = 3-4). *, P < 0.05; **, P <0.01; ****, P < 0.0001. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. (BaJ) Receptores 129S1 irradiados letalmente se trasplantaron con C57BL/6 células de médula ósea deplecionadas de células T (TCD-BM) emparejadas con MHC y 1 * 106 células T C57BL/6. Los ratones de control sólo recibieron TCD-BM. Los receptores fueron tratados con imipenem o aztreonam (100 mg/kg, SC, 3 veces por semana desde el día 10 hasta el día 24 después del alo-HSCT).(B)Comparación de la supervivencia global, con datos combinados de tres experimentos independientes (n = 15-43). ****, P < 0.0001.(C)Los ratones con GVHD tratados con antibióticos se sacrificaron el día 21 y un patólogo ciego cuantificó las puntuaciones histológicas de la GVHD en los órganos diana. Los datos proceden de tres experimentos independientes (n = 5-20). *, P < 0.05.(D)Las muestras de heces obtenidas de ratones tratados con imipenem o aztreonam de forma similar a los de B se recogieron el día 21 y se analizaron mediante secuenciación del gen 16S ARNr, seguida de un análisis de coordenadas principales de distancias UniFrac ponderadas y normalizadas. (EyF) La abundancia taxonómica diferencial entre los receptores tratados con aztreonam y los tratados con imipenem se analizó mediante(E)análisis discriminante lineal junto con mediciones del tamaño del efecto (LEfSe) y(F)mediante LEfSe proyectado como cladograma. Los datos son representativos de más de cinco experimentos independientes en D a F. (GyH) Se muestran comparaciones de la abundancia bacteriana en los niveles filogenéticos de(G)orden, y(H)género. Los datos proceden de 6 experimentos independientes (n = 32-36). ***, P < 0.001.(I)Se recogieron muestras de heces de ratones con GVHD tratados con antibióticos el día 21, y se evaluaron mediante análisis metagenómico de secuencias de escopeta, comparación de la abundancia de especies bacterianas determinada por taxonomía. Los números del 1 al 6 en el eje x representan a los sujetos individuales.(J)Análisis de componentes principales de la cuantificación de lecturas de secuencias de ortólogos de genes KEGG comparando muestras de ratones tratados con aztreonam e imipenem.
La Figura 17muestra los resultados del tratamiento con Imipenem tras el alo-HSCT en los cambios inflamatorios y de barrera en el colon. (AaG) Receptores 129S1 irradiados letalmente se trasplantaron con células TCD-Bm C57BL/6 con 1 *106 células T C57BL/6. Los receptores se trataron con imipenem o aztreonam como se describe en la Figura 2. (A) Los leucocitos infiltrantes de la lámina propia colónica de los receptores se analizaron el día 21 mediante citometría de flujo. Los datos proceden de dos experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM (n = 10-14). *p < 0.05; **, P < 0.01.(B)Se muestran los niveles de IL-23 sérico, homogeneizado de intestino delgado entero y homogeneizado de colon entero. Los datos proceden de dos experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM (n = 10-12). *, P < 0.05.(C)Los leucocitos infiltrantes de la lámina propia del colon en el día 21 se enriquecieron para CD11b y CD11c simultáneamente utilizando una mezcla de perlas magnéticas y los transcritos de IL-23 se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM (n = 3). *, P < 0.05.(D)Se utilizó la tinción inmunofluorescente para cuantificar las células pSTAT3, CD3 y DAPI positivas en el tejido colónico recogido el día 21.(E)Análisis de secuenciación de ARN del colon distal el día 16 después del alo-HSCT. Los 50 genes más regulados se muestran en el panel del mapa de calor.(F)Se utilizó la tinción inmunofluorescente para cuantificar las células CD11b, B220 y DAPI positivas en el tejido colónico recogido el día Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM (n = 7-8). **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****; P < 0.0001 en D y F.(G)La cuantificación de las secuencias genéticas por homología se realizó en muestras de heces recogidas el día 21. Amuc_0953, una sulfatasa, y Amuc_2164 una glicosil hidrolasa, son dos genes mucolíticos secretados predichos que se encuentran en el genoma deAkkermansia muciniphilaATCC BAA-835, aislada de heces humanas. **, P < 0.01. (HaJ) Los tejidos de colon de los receptores se fijaron con metanol libre de agua y fijador de Carnoy el día 21, se tiñeron con PAS y se visualizaron mediante microscopía óptica. Los triángulos amarillos en H indican la ubicación de la capa mucosa interna. El número de células caliciformes se muestra en J. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM (n = 10). **, P < 0.01.(K)Inmunotinción para Muc2 (verde) de las secciones de colon con la sonda FISH del gen 16S ARNr bacteriano general EUB338 (rojo) teñida con Hoechst (azul). Los datos son representativos de dos experimentos independientes (n = 10). Puntas de flecha; amarillo, capa mucosa interna; rojo, bacterias que penetran más allá de la capa mucosa y el epitelio colónico.
La Figura 18los receptores tratados con imipenem presentan GVHD histológica en el día 21. A los receptores 129S1 irradiados letalmente se les trasplantaron células TCD-BM C57BL/6 con 1 * 106 células T C57BL/6. Los receptores fueron tratados con imipenem o aztreonam (100 mg/kg, SC, 3 veces por semana desde el día 10 hasta el día 24). Los tejidos del colon se recogieron el día 21. Se muestran muestras teñidas con hematoxilina y eosina (aumento, *200). (Izquierda) receptores tratados con aztreonam; (Derecha) receptores tratados con imipenem. Ambos muestran evidencia de GVHD. El grupo tratado con imipenem presenta más infiltración de células inflamatorias, incluidos neutrófilos y linfocitos, apoptosis robusta y destrucción de criptas. Se muestran imágenes histológicas representativas de tres experimentos independientes.
Descripción Detallada de la Invención
En la práctica de la presente invención, se utilizan muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología y bacteriología, técnicas que están dentro de la habilidad de la técnica.
Con respecto a la terminología, los términos utilizados en el presente documento deben interpretarse de acuerdo con su significado estándar conocido por los expertos en la técnica correspondiente. En el presente documento se ofrece la definición de algunos términos para mayor comodidad.
"Paciente" o "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a mamíferos e incluye a los seres humanos y animales veterinarios.
Los términos "microbiota intestinal", "flora intestinal" y "microbiota gastrointestinal" se utilizan indistintamente para referirse a las bacterias del tracto digestivo.
El término "probiótico" se refiere a una bacteria sustancialmente pura (es decir, un único aislado), o a una mezcla de bacterias deseadas, y también puede incluir cualquier componente adicional que pueda administrarse a un mamífero para restaurar el microbiota. Tales composiciones también se denominan en el presente documento "inoculante bacteriano"
El término "prebiótico" se refiere a un agente que aumenta el número y/o la actividad de una o más bacterias deseadas. Ejemplos no limitantes de prebióticos útiles en los métodos de la presente divulgación incluyen sacáridos, tales como xilosa, rafinosa, celobiosa y meliztosa.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende la cantidad de un inoculante bacteriano o de un compuesto (por ejemplo, un antibiótico o agente antibacteriano de espectro reducido) que, administrada a un sujeto para tratar un trastorno o afección, es suficiente para efectuar dicho tratamiento.
"Blautia","especies relacionadas con la Blautia" o "especies similares a la Blautia" son bacterias Gram positivas, no móviles, anaerobias obligadas que se encuentran en las heces de humanos y otros mamíferos (Liu et al., 2008). Las especies deBlautiaincluyen, por ejemplo,Blautia producta(ATCCR 27340-DSM 2950, Colección de Cultivos de Tipo Americano, Manassas, VA). Las especiessimilares a Blautiaincluyen aquellas con una secuencia de 16SADNr con una identidad de secuencia del 98 % al 100 % (por ejemplo, 99.5-100 % de identidad) con el 16SADNr deBlautia producta(GenBank X94966). A continuación, en la Tabla 1, se muestran varias especies relacionadas con Blautia por su nombre (nombre NCBI), incluida la secuencia de ADNr 16S de cada una de ellas.
Aunque no es un miembro del ordenClostridiales, Holdemania filiformises una bacteria asociada con menos GVHD y por lo tanto se pretende que sea abarcada por la divulgación como una terapéutica potencial.
Los antibióticos varían considerablemente en la fuerza de su actividad contra anaerobios comensales y se designan en el presente documento como de alta o baja actividad contra anaerobios. Entre los antibióticos con gran actividad contra los anaerobios figuran el metronidazol, la piperacilina-tazobactam (pip-taxo o P/T) y el imipenem. Los antibióticos con baja actividad frente a anaerobios incluyen aztreonam, ceftazidima/cefepima, vancomicina iv, levofloxacina, ciprofloxacina, cefazolina, atovacuona y tmp-smx.
Las características taxonómicas pertinentes de las cepas de organismos pertinentes pueden confirmarse con los resultados obtenidos del análisis de la secuencia del ADNr 16S y el sistema de identificación bacteriana Índice de Perfil Analítico (API®), además de otros métodos convencionales utilizados en la técnica para la identificación bacteriana.
Para los pacientes con neoplasias hematológicas como leucemias, linternas y otros cánceres relacionados, el trasplante alogénico de médula ósea (BMT alo) o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) es una terapia de importancia crítica que puede producir curas cuando la quimioterapia sola no puede. Más de 25,000 pacientes se someten cada año a<b>M<t>alo en todo el mundo. Uno de los principales riesgos del trasplante de médula ósea y células madre hematopoyéticas sigue siendo la enfermedad de injerto contra huésped (GVH<d>), que se produce cuando el sistema inmunitario del donante reconoce los órganos del receptor del trasplante como extraños y provoca una inflamación potencialmente mortal. El desarrollo de estrategias que reduzcan la GVHD, pero dejen intacta la función inmunitaria global debería suponer un gran beneficio para los pacientes.
En el pasado, se creía que el uso de antibióticos de amplio espectro en receptores de alo-HSCT protegía frente a la GVHD. Se administraron combinaciones de amplio espectro con el objetivo de conseguir una descontaminación intestinal completa, lo que se asoció a una reducción de la GVHD en modelos (36) de ratón y en algunos (37, 38), aunque no en todos los estudios (39-41) clínicos. Del mismo modo, la adición de metronidazol a la ciprofloxacina redujo la GVHD en un pequeño estudio (42) aleatorizado, lo que apoya la hipótesis de que las bacterias intestinales contribuyen a la fisiopatología de la GVHD.
Sin embargo, una serie de estudios recientes han descrito una asociación diferente, en la que los receptores de alo-HSCT que sufren una lesión más grave del microbiota tienen más probabilidades de desarrollar GVHD (12, 14, 16, 43) grave. La lesión del microbiota se ha observado de varias formas, como la expansión de especies (12) comensales de Enterococcus, la pérdida de diversidad (14) general, la reducción de comensales del género Blautia, miembro del orden Clostridiales (16), y más recientemente los bajos niveles de indol, un subproducto del metabolismo del triptófano producido por bacterias intestinales que puede cuantificarse en la orina en forma de sulfato (43) de 3 indoxilo. En consonancia con estos informes, en el presente estudio demostramos que el uso de antibióticos con un espectro de actividad más amplio, tal como imipenem, conduce a una mayor lesión del microbiota (especialmente pérdida de Clostridiales) y a una mayor gravedad de la GVHD.
Aún no se ha desvelado una explicación completa de las aparentes incoherencias entre los primeros estudios y los más recientes, pero una posible contribución podría ser el aumento de bacterias resistentes a los antibióticos, incluidos los enterococos resistentes, que pueden dificultar el éxito de la descontaminación intestinal. Se han observado aumentos en la frecuencia de colonización por organismos resistentes en receptores de alo-HSCT con el paso del tiempo (44). Un estudio reciente reveló que la descontaminación intestinal no tuvo éxito en casi la mitad de los pacientes en los que se intentó. Curiosamente, los pacientes descontaminados con éxito tuvieron una incidencia mucho menor de GVHD aguda en comparación con los pacientes descontaminados sin éxito (38).
En este estudio, demostramos que los diferentes antibióticos utilizados para tratar la fiebre neutropénica tienen diferentes efectos sobre la composición del microbiota intestinal, tanto en pacientes como en modelos de ratón. También identificamos varios cambios importantes producidos por el tratamiento con imipenem en ratones con GVHD, incluida la gravedad de la GVHD en el colon, los cambios inflamatorios y la ruptura de la barrera mucosa colónica protectora.
Un enfoque prometedor para reducir el riesgo, la incidencia y la gravedad de la GVHD es centrarse en la compleja comunidad de microbios que residen en el tracto intestinal humano, denominados colectivamente microbiota intestinal. Aunque desde hace muchos años se sospecha que existe una relación entre el microbiota y la GVHD, sigue sin comprenderse del todo. La descontaminación intestinal con antibióticos se practica en algunos centros, pero no en todos, y no existe consenso sobre la elección ideal de la cobertura antibiótica.
En el presente documento se divulgan resultados que demuestran que la abundancia de bacterias pertenecientes a los taxonesClostridiales,incluido el géneroBlautia,un comensal que se encuentra comúnmente en el tracto intestinal de los seres humanos predice la protección frente a la GVHD potencialmente mortal en todos los pacientes trasplantados. Además, en modelos murinos, la introducción de una especie de Blautia de origen murino reduce la gravedad de la GVHD. Sin querer ceñirme a la teoría, parece que lo hace induciendo a las células T reguladoras con la generación de subproductos metabólicos de ácidos grasos de cadena corta (SCFA).
Estudios adicionales que caracterizan la historia natural de la abundancia deClostridialesyBlautiaen todos los receptores de BMT/HSCT demostraron que la gran mayoría de los pacientes comienzan con cantidades abundantes de poblaciones endógenas de estos organismos, pero muchos las pierden de forma drástica durante el trasplante. Curiosamente, la pérdida deBlautiase correlaciona fuertemente con reducciones en la ingesta nutricional oral tanto en humanos como en ratones.
Las estrategias de intervención nutricional para apoyar la abundancia de Clostridiales/Blautia después de todos los BMT/HSCT pueden proporcionar un método para mitigar la GVHD. Se ha demostrado en modelos murinos que estos enfoques nutricionales pueden evitar con éxito la pérdida de Clos-tridialeslBlautia, así como reducir la gravedad de la GVHD. Estos resultados identificaron el microbiota como una potente diana terapéutica que puede utilizarse para reducir significativamente la GVHD.
No se conoce bien la relación entre la composición del microbiota intestinal y la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) tras un BMT alo o un HSCT Tradicionalmente se ha pensado que las bacterias intestinales contribuyen a la GVHD, pero estudios recientes en animales en entornos no relacionados con trasplantes han identificado poblaciones de comensales intestinales obligatoriamente anaerobios con propiedades antiinflamatorias.
En un estudio, se evaluó la composición bacteriana fecal de 64 pacientes a partir del día 12 después del BMT El aumento de la diversidad bacteriana se asoció con una reducción de la mortalidad relacionada con la GVHD. Además, albergar mayores cantidades de bacterias pertenecientes al géneroBlautiase asoció con una menor letalidad de la GVHD en esta cohorte y se confirmó en otra cohorte independiente de 51 pacientes. La abundancia deBlautiatambién se asoció con una mejor supervivencia global. Al evaluar la abundancia deBlautiacon respecto a los factores clínicos, se descubrió que la pérdida deBlautiaestaba asociada a dos factores clínicos: 1) tratamiento con antibióticos que inhiben las bacterias anaerobias y 2) recibir nutrición parenteral total (TPN) durante períodos más largos. Una mayor abundancia de bacterias comensales pertenecientes al géneroBlautiase asocia con una reducción de la GVHD letal y una mejora de la supervivencia global.
En otro estudio, se examinó retrospectivamente a 283 pacientes en busca de fiebre neutropénica tras un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (alo-HSCT). Se observó que la administración de antibióticos con mayor actividad contra los anaerobios, como piperacilina-tazobactam (pip/tazo) o imipenem-cilastatina (imipenem), se asociaba a una mayor mortalidad relacionada con la GVHD, en comparación con la administración de antibióticos, tales como aztreonam o cefepima, con menor actividad contra los anaerobios. El análisis de la composición del microbiota fecal demostró que la administración de pip/tazo e imipenem se asociaba con una pérdida más grave de miembros del orden bacteriano Clostridiales. Experimentos en modelos de ratón demostraron cambios similares en la flora con estos antibióticos. Además, el modelado del tratamiento antibiótico en ratones con GVHD recapituló una mortalidad agravada con imipenem en comparación con aztreonam.
La presente divulgación describe métodos para reducir la probabilidad, incidencia o gravedad de GVHD, para prevenirla o tratarla de otro modo evitando la pérdida o restableciendo ciertas poblaciones deClostridialesen el intestino.
La divulgación abarca un método para reducir el riesgo, la incidencia o la gravedad de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto sometido a un trasplante de médula ósea (BMT) o a un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) tomando medidas para evitar la pérdida de actividad beneficiosa, por ejemplo, evitando el uso, cuando sea posible, de antibióticos que sean perjudiciales con respecto a los anaerobios. El método puede consistir en la selección/administración al sujeto que lo necesita de un antibiótico con actividad reducida para bacterias anaerobias seleccionado del grupo que consiste en vancomicina intravenosa, ceftriaxona, ceftazidima, cefepima, aztreonam, trimetoprim-sulfametoxazol, ciprofloxacino, levofloxacino y atovaquona.
El restablecimiento de la microbiota puede lograrse administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición probiótica que comprenda una cantidad eficaz de al menos una cepa bacteriana, o una combinación de varias cepas, del taxónClostridiales, en la que la composición (i) estimule el crecimiento y/o la actividad de las bacterias que son protectoras contra la GVHD y/o (ii) inhiba el crecimiento y/o la actividad de las bacterias que están sobrerrepresentadas en la GVHD. El apoyo a las bacterias protectoras puede proporcionarse en forma de suplemento nutricional o prebiótico, en algunos casos, sacáridos fermentados por las bacterias beneficiosas. La divulgación también contempla la inhibición de bacterias sobrerrepresentadas, por ejemplo,Akkermansia,mediante la administración de un antibiótico que eliminará esos organismos y evitará el "desplazamiento" de las especiesClostridialesbeneficiosas.
El método para reducir la probabilidad o gravedad de la GVHD puede comprender la administración a un sujeto que la necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprenda una o más especies bacterianas del taxónClostridiales,por ejemplo, una especie/aislado deBlautiaque haya demostrado reducir la GVHD.
Las cepas bacterianas administradas según los métodos de la presente divulgación pueden comprender bacterias vivas. Uno o varios inoculantes bacterianos diferentes pueden administrarse simultánea o secuencialmente (incluyendo la administración en momentos diferentes). Estas bacterias pueden aislarse del microbiota y cultivarse mediante técnicas conocidas.
La administración de una composición bacteriana puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica que pueda introducir los organismos en el lugar deseado. Las bacterias pueden administrarse por vía oral. Alternativamente, las bacterias pueden administrarse por vía rectal, por ejemplo, mediante un enema.
La dosificación del inoculante bacteriano o compuesto de la divulgación será evidente para el experto en la materia. Se contempla que una variedad de dosis será eficaz para lograr la colonización del tracto gastrointestinal con el inoculante bacteriano deseado, por ejemplo,106,107,108,109 y 1010 CFU, por ejemplo, pueden administrarse en una sola dosis. Dosis más bajas también pueden ser eficaces, por ejemplo, 104 y 105 CFU. Se prevén inoculaciones posteriores, cuando sean necesarias.
Entre los organismos cuya administración se contempla para restablecer el microbiota gastrointestinal incluyen los que se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Identificación de especies beneficiosas
Entre las especies que pueden utilizarse en el método descrito en el presente documento se incluyenBlautia producta(ATCCR 27340-DSM 2950, Colección de Cultivos de Tipo Americano, Manassas, VA) o las indicadas con un asterisco en la Tabla 1 a continuación. Cada año se identifican nuevos aislados deBlautia; en algunos casos, aislados de otros géneros se recategorizan comoBlautia.Así, por ejemplo, las especies similares aBlautiao relacionadas conBlautiapueden incluirRuminococcus obeum, Ruminococcusfaecis; Ruminococcus lactaris, etc. (véase la Tabla 1 a continuación)
Para evaluar la asociación con la mortalidad relacionada con la GVHD (o cualquier otro resultado), se utilizó un programa que calcula la asociación de la abundancia de cada bacteria transformada logarítmicamente con el tiempo transcurrido hasta el evento del resultado de interés, utilizando una prueba de riesgos proporcionales de Cox. Esto tiene la ventaja de tener en cuenta el tiempo que transcurre antes del suceso para cada paciente. La otra gran ventaja es que el resultado de la prueba de riesgos proporcionales de Cox puede ajustarse fácilmente para tener en cuenta los efectos de otros posibles factores clínicos que podrían confundir. En este caso, realizamos el análisis univariante, así como un análisis multivariante ajustando por tipo de trasplante (sangre de cordón umbilical frente a sangre periférica frente a médula ósea) e intensidad del acondicionamiento.
Los datos se analizaron a nivel de unidad taxonómica operativa (OTU). La información de la secuencia de nucleótidos de cada ARNr 16S específico se comparó mediante BLAST con la base de datos 16S del NCBI para obtener los nombres.
En general,Blautiay las especiesrelacionadas con Blautia(incluidas las especies de los géneros,Ruminococcus, Lactococcus, Anaerostipes, Holdemania,y) son bacterias Gram positivas, no móviles que son anaerobios obligados que se encuentran en las heces de los seres humanos y otros mamíferos (Liu et al., 2008). Las bacterias que se ha demostrado que tienen una asociación con la GVHD, ya sea beneficiosa o perjudicial, se muestran en la Tabla 1, indicándose con un asterisco (*) aquellas asociadas con un menor riesgo o incidencia de GVHD.
Tabla 1
(continuación)
Blautiay especiessimilares a Blautia,en particular aquellas cepas con una secuencia de ARNr16S que coincide estrechamente con la secuencia de ARNr16S (GenBank X94966) deBlautia productao cualquiera de los SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12 y 15 (por ejemplo, con una identidad de secuencia del 98 % al 100 % o del 99.5-100 %) son adecuados para su uso en los métodos divulgados.
También se ha demostrado que la abundancia de bacterias del taxónClostridiales,que incluyeBlautia,predice una menor mortalidad relacionada con la GVHD en algunos pacientes. Curiosamente, varias de las 17 cepas clostridiales analizadas (para su caracterización, véase Narushima et al. Caracterización de las 17 cepas de Clostridia de origen humano inductoras de células T reguladoras. Gut Microbes 5:3, 333-3392014) son parientes muy cercanos y, por lo tanto, pueden ser útiles para practicar el método divulgado en el presente documento.
Los métodos para determinar si una especie o aislado deBlautiao similar a Blautia es adecuado para su uso en la presente divulgación pueden incluir la determinación del porcentaje de identidad del ARN16Sr de una especie/aislado con la secuencia de 16SARNr deBlautia producta(GenBank x 94966) o cualquiera de los SEQ ID n Os : 1-16; los métodos para hacerlo son bien conocidos en la técnica.
Las especies deBlautiapara su uso en la presente divulgación incluyen aquellas especies deBlautiaysimilares a Blautiaque fermentan ciertos azúcares, por ejemplo, xilosa, rafinosa, celobiosa y meliztosa. El suministro de suplementos nutricionales que comprenden estos azúcares puede ser adecuado para su administración a un sujeto como estrategia prebiótica para reducir la GVHD.
Administración de Especiesrelacionadas con BlautialBIautia
Uno o más inoculantes bacterianos diferentes pueden administrarse simultánea o secuencialmente (incluyendo la administración en momentos diferentes). Las cepas bacterianas administradas según los métodos de la presente divulgación pueden comprender bacterias vivas, bacterias congeladas, esporas bacterianas o una combinación de las mismas. Dichas bacterias pueden aislarse de una fuente de microbiota apropiada u obtenerse de un repositorio celular (tal como la Colección de Cultivos de Tipo Americano/ATCC) y cultivarse mediante técnicas conocidas.
La administración de especies deBlautiaa un sujeto para reducir la probabilidad, incidencia, gravedad o evitar o tratar de otro modo la GVHD puede llevarse a cabo utilizando cualquier sistema de administración oral adecuado para administrar microorganismos vivos a un individuo que los necesite, por ejemplo, como se describe en la solicitud publicada en EE.UU. n.° 20140112985. Dicho sistema de administración puede comprender un agente probiótico que comprende al menos una especie de microorganismosBlautiavivos que se ha demostrado que se correlacionan con una reducción de la GVHD; opcionalmente, al menos un agente adicional, por ejemplo, agentes de motilidad intestinal; y un vehículo de administración, en el que el vehículo de administración oral libera el agente probiótico en el intestino delgado distal del individuo. Un aislado deBlautiapuede administrarse en combinación con un azúcar que se sabe que fermenta.
La administración oral puede lograrse a través de un vehículo seleccionado del grupo que consiste en píldoras, comprimidos, cápsulas, geles blandos y gránulos probióticos recubiertos, que liberarán el agente probiótico en el intestino delgado distal. La divulgación prevé además la administración oral en el que el agente probiótico está presente, y se encuentra en una forma de dosificación seleccionada de liberación inmediata, liberación retardada, liberación prolongada que se libera en el intestino delgado distal, y liberación dirigida que está destinada a liberarse en el intestino delgado distal.
EJEMPLOS
Selección de pacientes y método de recogida de muestras
En un estudio, los sujetos analizados retrospectivamente para determinar el impacto de los antibióticos en los resultados clínicos fueron 283 pacientes adultos sometidos a alo-HSCT completo en el Centro Oncológico Memorial Sloan Kettering (MSKCC) entre 1994 y 2013. En este estudio se incluyó a los pacientes que recibieron injertos convencionales (sin depleción de células T); se excluyó a los pacientes que recibieron injertos con depleción de células T ex vivo o alemtuzumab peritransplante. Se recogieron y almacenaron muestras de heces semanalmente durante el transcurso de la hospitalización para el trasplante. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del MSKCC. Todos los pacientes del estudio dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida y el análisis de bioespecímenes.
La GVHD se diagnosticó clínicamente, se confirmó patológicamente mediante biopsia siempre que fue posible y se clasificó según los criterios de consenso históricos descritos anteriormente (véase Rowlings PA, Przepiorka D, Klein JP, et al. Índice de gravedad IBMTR para clasificar la enfermedad de injerto contra huésped aguda: comparación retrospectiva con la calidad de Glucksberg. Br J Haematol 1997). Estos criterios se aplicaron a la GVHD con características puramente agudas que se produjo después del día 100. Los casos de GVHD se clasificaron además por tratamiento con o sin esteroides sistémicos (prednisona o metilprednisolona, 0.5 mg/kg diarios o más). La causa de la muerte se determinó mediante un algoritmo estándar en el que los resultados se priorizaron en el siguiente orden: 1) recurrencia primaria de la enfermedad, 2) fallo del injerto, 3) GVHD, 4) infección y 5) fallo orgánico; así, en los pacientes sin recurrencia de la enfermedad ni fallo del injerto, se consideró que los que estaban en tratamiento por GVHD en el momento de la muerte habían sucumbido a la mortalidad relacionada con la GVHD, incluidos los que fallecieron por infecciones. El riesgo de enfermedad se determinó según la Clasificación de Enfermedades ASBMT RFI 2014. La intensidad del acondicionamiento se asignó con base en definiciones de trabajo previamente establecidas.
Almacenamiento de muestras y extracción de ADN
Las muestras de heces de los pacientes se conservaron a 4 °C durante <24 h antes de congelarlas a -80 °C. Las muestras ileales y de intestino grueso de ratones se congelaron a -80 °C. El ADN se extrajo utilizando uno de los dos métodos, que dan resultados similares.
Para cada muestra de heces, se extrajo ADN utilizando una técnica de extracción con fenol-cloroformo (véase Ubeda, C., Y Taur, R.R. Jenq, M.J. Equinda, T Son, M. Sam-stein, A. Viale, N.D. Socci, M.R.M. van den Brink, M. Kamboj y E.G. Pamer. 2010. La dominación intestinal por Enterococcus resistentes a la vancomicina precede a la invasión del torrente sanguíneo en humanos. J. Clin. nvest.) o utilizando el kit de aislamiento de ADN Power Soil (Laboratorios MO BIO).
Análisis 16S de la muestra
Se extrajo y purificó el ADN de cada muestra de heces. Las muestras se analizaron utilizando la plataforma 454 GS FLX Titanium para secuenciar la región V1-V3 del gen 16S ARNr bacteriano o, alternativamente, se analizaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq para secuenciar la región V4-V5 del gen 16S ARNr. Los datos de secuencias se compilaron y procesaron con mothur versión 1.34 y QIIME versión 1.8.0, y se examinaron y filtraron para comprobar su calidad. Las unidades taxonómicas operativas (OTUs) se clasificaron a nivel de especie utilizando una forma modificada de la base de datos de referencia Greengenes. El análisis de componentes principales se realizó sobre una matriz de distancia Unifrac ponderada y normalizada de la abundancia OUT en el software R. Los datos de este estudio se han almacenado en el Archivo de Lectura de Secuencias del NCBI (url: ncbi.nlm.nih.bov/sra).
Se realizaron comparaciones de abundancia filogenética con el fin de identificar biomarcadores de mortalidad relacionada con la GVHD mediante análisis discriminante lineal (LDA) de tamaño del efecto (LEfSe)27, utilizando un corte logarítmico LDA de 2.0.
Anticuerpos y citometría de flujo
Todos los anticuerpos se obtuvieron de BD Biosciences-Pharmingen. Para el análisis celular de los marcadores de superficie, las células se tiñeron durante 20 minutos a 4 °C en PBS con 0.5 % de BSA (PBS/BSA) tras el bloqueo Fc, se lavaron y se resuspendieron en DAPI en PBS/BSA. A la tinción de la superficie celular le siguió la tinción intracelular con el kit eBioscience siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células muertas se excluyeron con el kit VIVAS/MUERTAS Tinción fijable de células muertas (Invitrogen). Todas las citometrías de flujo se realizaron en un LSR II (BD Biosciences) y se analizaron con FlowJo (Software TreeStar).
Categorías de antibióticos
Los antibióticos utilizados durante la hospitalización por trasplante se dividieron en los que incluían una actividad significativa contra las bacterias anaerobias (pip/tazo, clavulanato de ticarcilina, imipenem, meropenem, metronidazol, vancomicina oral y clindamicina), y aquellos con actividad reducida (vancomicina intravenosa, ceftriaxona, ceftazidima, cefepima, aztreonam, trimetoprim-sulfametoxazol, ciprofloxacino, levofloxacino, atovaquona (19).
Prácticas de trasplante
Según nuestra práctica institucional, los pacientes recibieron profilaxis con ciprofloxacina, y los sometidos a un acondicionamiento más intenso que los regímenes no mieloablativos también recibieron profilaxis con vancomicina intravenosa desde el día -2 hasta el día 7 (59). La profilaxis antibiótica contra Pneumocystis jiroveci (trimetoprim sulfametoxazol, pentamadina aerosolizada o atovaquona) se administró a discreción del médico responsable del trasplante.
Análisis de muestras
Para cada muestra de heces, el ADN se purificó utilizando una técnica de extracción de fenol-cloroformo con disrupción mecánica (agitador de perlas) basada en un protocolo (60) descrito previamente. Las muestras se analizaron utilizando la plataforma 454 GS FLX Titanium para secuenciar la región V1-V3 del gen 16S ARNr bacteriano o, alternativamente, se analizaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq para secuenciar la región V4-V5 del gen 16S ARNr. Los datos de secuencias se compilaron y procesaron con la versión 1.34 (61) de mothur, y se examinaron y filtraron para comprobar su calidad (62). Las unidades taxonómicas operativas (OTUs) se clasificaron a nivel (63) de especie utilizando una forma modificada de la base de datos (64) de referencia Greengenes. Se realizó un análisis de componentes principales sobre una matriz de distancias Unifrac (65) ponderada y normalizada de la abundancia de OTU en el software R. Los datos de este estudio se han almacenado en el Archivo de Lectura de Secuencias del NCBI (véase la url: www.ncbi.nlm.nih.gov/sra).
Secuenciación y análisis del ARN
Los ratones se sacrificaron el día 16 después de recibir un total de tres veces el tratamiento con antibióticos. Se extrajo el colon distal y se hizo una muestra (n = 4; tanto para el grupo tratado con aztreonam como con imipenem), seguida del aislamiento del ARN mediante TrizolLS. El a Rn se preparó con RiboMinus (LifeTechnologies). La biblioteca se secuenció utilizando el sistema Ion Proton (LifeTechnologies). Se analizó el cambio en la expresión del ARN alineado. Se evaluó la expresión génica diferencial en ratones tratados con imipenem frente a ratones tratados con aztreonam.
Secuenciación y análisis metagenómico de escopeta
Las lecturas en bruto de extremo pareado procedentes de la secuenciación de escopeta se recortaron con Trimmomatic 0.32 (69) utilizando un desajuste máximo de 2, una puntuación mínima de base terminal de 30 y las secuencias adaptadoras Illumina TruSeq. Las lecturas recortadas restantes se asignaron taxonómicamente utilizando Kraken (70). En resumen, las lecturas recortadas y filtradas se clasificaron taxonómicamente por el parecido de los k-mer con los perfiles de k-mer bacterianos, víricos y fúngicos generados a partir de las colecciones de genomas y Cromosomas del NCBI (consultado el 12 de noviembre de 2014). Las lecturas no clasificadas se interrogaron con BLAST (base de datos nt, 24 de marzo de 2015) y se descartaron las lecturas no microbianas. El análisis funcional se llevó a cabo en lecturas de calidad filtrada utilizando HUMAnN v0.99 (71), que determina la abundancia de genes y vías en una comunidad metagenómica dada. Para identificar aquellas categorías funcionales que estaban representadas de forma diferencial entre las muestras de sujetos tratados con aztreonam e imipenem, empleamos LEfSe (21), una herramienta validada que identifica biomarcadores diferencialmente abundantes tales como genes, rutas u organismos entre comunidades microbianas.
Los receptores se sacrificaron el día 21 y se recogieron cuidadosamente segmentos de colon de 10 mm de longitud junto con el contenido fecal, que se sumergieron en un fijador de metanol-Carnoy sin agua (60 % de metanol seco, 30 % de cloroformo y 10 % de ácido acético) (72) durante toda la noche. A continuación, los tejidos se lavaron en metanol, se embebieron en parafina y se colocaron secciones de 5 pm en portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se desparafinaron, se tiñeron con el método estándar Ácido de Schiff Periódico y se evaluaron al microscopio (73) óptico.
Inmunotinción e hibridación fluorescente in situ (FISH) de los tejidos del colon
Los colones de los receptores fijados con formol se tiñeron con el anticuerpo anti-CD3 de ratón A0452 (DAKO), el anticuerpo pSTAT39135 (Señalización celular), el anticuerpo CD11b ab133357 (Abcam), el anticuerpo B220550286 (BD Pharmingen), frente al control del isotipo. La tinción secundaria de inmunofluorescencia se realizó con AF488 para pSTAT3 y B220, y AF594 para CD3 y CD11b. Los trozos de colon con material fecal se fijaron en Carnoy y se realizó FISH bacteriana (EUB338) (35) e inmunotinción con antisérico MUC2C3 y ADN mediante Hoechst 34580 (Life technologies) como se ha descrito (74, 75) previamente.
Ratones y trasplante de médula ósea y evaluación de la enfermedad injerto contra huésped.
Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6, C57BL/6/Ly5.1 y 129S1/SvlmJ del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine, EE.UU.). Los ratones utilizados para los experimentos tenían entre 6 y 9 semanas de edad. Se trató a los ratones con un cóctel de antibióticos descontaminantes intestinales (ampicilina y vancomicina) para imitar la lesión del microbiota que se produce en los pacientes de BMT alo. A continuación, se expuso a los ratones a una dosis mieloablativa de irradiación corporal total (TBI, 11 Gy de una fuente de 137Cs como dosis dividida con un intervalo de 3 horas entre las dosis) y luego se trasplantaron mediante inyección intravenosa con médula ósea y células T esplénicas purificadas de ratones B10.BR totalmente incompatibles con el MHC (H2k en H2b). Los ratones donantes fueron eutanasiados por asfixia con dióxido de carbono y se extrajeron asépticamente el bazo, el fémur y la tibia. La BM del donante se obtuvo mediante lavado de tibia y fémur con medio de cultivo tisular frío. La médula ósea del donante fue deplecionada de células T (TCD) mediante incubación con 2.5 pg de anti-Thy-1.2 por 106 células BM durante 30 minutos a 4 °C, seguida de incubación con 10 pl de complemento de conejo de baja toxicidad por 106 células BM durante 40 minutos a 37 °C, de modo que la GVHD pudiera inducirse de forma reproducible mediante inyección simultánea de médula ósea deplecionada de células T y células T esplénicas del donante en ratones experimentales. Las células T esplénicas se purificaron con microesferas MACS anti-CD5 (Miltenyi). Las células BM (5 *106 por receptor) y las células T esplénicas (1 x 106 por receptor) se trasplantaron mediante inyección en la vena caudal.
Aislamiento de cepas deBlautia apartir de heces de ratón o humanas
Se recogen muestras enteras de heces y se homogeneizan en 1-3 volúmenes de peptona al 0.05%utilizando una batidora estéril de acero inoxidable con 1-3 volúmenes de peptona. Aproximadamente 1 gramo de la muestra se diluye en serie (10 veces) en blancos de dilución previamente reducidos y esterilizados anaeróbicamente (PRAS) (Anaerobe Systems). Se pesa una alícuota separada de ~1 gramo, se seca al vacío durante la noche y se vuelve a pesar para calcular los recuentos en peso seco. Para seleccionar las bacterias clostridiales, incluidas las especies deBlautia,se colocan 100 pl de la serie de diluciones de la muestra de heces homogeneizada en agar sangre infusión cerebrocorazón (SBA, Becton Dickinson) suplementado con 4 pg/ml de trimetoprima (Sigma Chemical) y 1 pg/ml de sulfametoxazol (Sigma), agar sangre Brucella (BAP, Anaeobe Systems), Agar sangre CDC ANA, (BBL Microbiology Systems), y agar yema de huevo (EYA, Anaerobe Systems) (Finegold SM, Molitoris D, Song Y, Liu C, Vaisanen ML, Bolte E, McTeague M, Sandler R, Wexler H, Marlowe<e>M, Collins MD, Lawson PA, Summanen P, Baysallar M, Tomzynski TJ, Read E, Johnson E, Rolfe R, Nasir P, Shah H, Haake DA, Manning P, Kaul A, 2002. Estudios de la microflora gastrointestinal en el autismo de inicio tardío. Clin Infect Dis 1:35). Para seleccionar los formadores de esporas, las diluciones pueden calentarse a 70-80 °C durante 10-20 minutos y sembrarse de la misma manera que las muestras de heces homogeneizadas no calentadas. Tras 5 días de crecimiento a 37 °C en una cámara anaeróbica, se seleccionan colonias individuales. El procedimiento de purificación de colonias se repite volviendo a extraer las colonias individuales seleccionadas, cultivándolas como se ha descrito anteriormente y seleccionando de nuevo las colonias individuales. Las colonias individuales se congelan en glicerol al 15 %-25 % en criotubos de 1 ml y se almacenan a -80 °C.
Administración de Blautia/consortia para mitigar la GVHD experimental
Los ratones C57BL/6 adquiridos a El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine) se trataron con vancomicina oral y ampicilina. Tras la descontaminación, los ratones se alojaron en condiciones de autoclave (jaula, cama, agua y comida) para eliminar casi todos los Clostridia endógenos presentes en la flora de los ratones. A continuación, los ratones fueron tratados por sonda con una suspensión líquida deEnterococcus faecaliscultivado como control, o con un aislado deBlautia.A continuación, se expuso a los ratones a una dosis mieloablativa de irradiación corporal total (TBI, 11 Gy) y luego se les trasplantó mediante inyección intravenosa médula ósea y células T purificadas de ratones B10.BR totalmente incompatibles con el MHC (H2k en H2b). Los efectos sobre la patología intestinal y la supervivencia global se evaluaron como se ha descrito. Los ratones colonizados porBlautia,en comparación con los que albergaban Enterococcus, estaban protegidos frente a la GVHD, con una mayor supervivencia(Figura 9).
Puntuación clínica e histológica de la GVHD
Se realizó un seguimiento diario de la supervivencia de los ratones y un seguimiento semanal de las puntuaciones clínicas de la GVHD (véase Cooke, K.R., L. Kobzik, TR. Martin, J. Brewer, J. Delmonte Jr., J.M. Crawford y J.L. Ferrara.
1996. Un modelo experimental del síndrome de neumonía idiopática tras el trasplante de médula ósea: I. Papel de los antígenos H menores y de la endotoxina. Blood. 88:3230-3239). Las muestras de intestino delgado, intestino grueso e hígado se evaluaron histológicamente en busca de evidencias de GVHD y se puntuaron según lo descrito previamente (véase Hill, G.R., J.M. Crawford, K.R. Cooke, Y.S. Brinson, L. Pan y J.L. Ferrara. 1997. Irradiación corporal total y enfermedad injerto contra huésped aguda: papel del daño gastrointestinal y las citocinas inflamatorias. Blood.90:3204-3213).
Medición del número y la funcionalidad de las células paneth
Las luces del intestino delgado de ratones adultos se enjuagan con agua helada y se segmentan. Las criptas se eluyen poniendo primero los segmentos del revés y agitándolos después en PBS que contiene 30 mM de EDT<a>y carece de Ca2+ y Mg2+. Las vellosidades y criptas eluidas se granulan a 700xg, se resuspenden en PBS y se transfieren a tubos de microcentrífuga siliconados utilizando pipetas capilares. Las criptas se resuspenden en tampón iPIPES (10 mM PIPES (pH 7.4) y 137 mM NaCl) en preparación para la exposición a estímulos secretores.
Las criptas se incuban en 30 pl de iPIPES conteniendo 1000 CFU bacterianas (Clostridiales) por cripta durante 30 min a 37 °C. Los componentes celulares se granulan mediante centrifugación breve y los sobrenadantes se transfieren a tubos de microcentrífuga estériles y se almacenan a -20 °C. Este método puede ampliarse utilizando hasta ~3000 criptas en 2 ml de iPIPES (más o menos bacterias Clostridiales). Las criptas se granulan y se analizan 10 pl de los sobrenadantes para determinar la actividad bactericida contra las bacterias Clostridiales y Enterococcus en cultivo líquido o en placas de agar. Las proteínas se extraen del resto del sobrenadante y de las criptas utilizando ácido acético al 30 %. La proteína total extraída de cada fracción se resolvió mediante AU-PAGE y se sometió a análisis western blot utilizando anticriptidina-1 como se indica a continuación. Las proteínas de AU-P<a>G<e>se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. A continuación, se bloquea la membrana con leche desnatada al 5 %, se incuba secuencialmente con criptdina-1 de ratón anti-conejo (1:500), IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:20.000) y sustrato quimioluminoso (SuperSignal, Pierce, Rockland, IL), y se visualiza (Ayabe T, Satchell DP, Wilson CL, Parks WC, Selsted ME, Ouellette a J, 2000. Secreción de a-defensinas microbicidas por las células de Paneth intestinales en respuesta a las bacterias. Nature Immunology 1:113-118).
Método para medir los niveles de microbios en órganos distales (hígado, timo, pulmones, riñones)La PCR cuantitativa (qPCR) de los genes 16S ARNr bacterianos se realizó en muestras de tejido utilizando el kit DyNAmo SYBR Green qPCR (Finnzymes) y 0.2 pM del cebador bacteriano universal 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCa G-3' SEQ ID NO: 1) y el cebador bacteriano de amplio intervalo 338R (5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' SEQ ID NO: 2). Las curvas estándar se prepararon mediante dilución en serie del vector romo PCR (Invitrogen) que contenía 1 copia del gen 16s ARNr.
Método para medir el efecto de los microbios sobre metabolitos bacterianos tales como los niveles de SCFA.
Muchas bacterias producen ácidos grasos de cadena corta (SCFA) como subproducto de la fermentación de los hidratos de carbono. Se ha descubierto que los SCFA son importantes moduladores del sistema inmunitario. Son producidos abundantemente porBlautiay bacterias afines de la clase Clostridia. Para evaluar cómoBlautiay las bacterias relacionadas median en la supresión de la GVHD, se recogieron gránulos fecales para cuantificar los niveles de SCFA, en particular acetato, propionato o butirato. Los SCFAs, creatinas e hidroxi-SCFAs se cuantificaron alcalinizando las muestras de heces, obteniendo huellas dactilares de la composición metabólica de la muestra mediante NMR 1D 1H en un espectrómetro Bruker Avance-600 MHz, y analizando con métodos estadísticos multivariantes supervisados mediante el software Chenomx NMR Suite.
Administración de SCFA para mitigar la GVHD.
Se realizaron experimentos preliminares para probar el impacto de la administración de SCFA en la GVHD murina. No se observó un beneficio significativo del propionato administrado a través del agua de bebida (datos no mostrados), ni del butirato administrado a través del agua de bebida o por enema (datos no mostrados), mientras que sí se observó un beneficio notable con la administración de acetato a través del agua de bebida. Se administrará acetato de sodio (150mM) a través del agua de bebida de los ratones a partir de 2 semanas antes del BMT A continuación, los ratones serán irradiados y trasplantados con una suplementación continua de acetato de sodio. Los resultados que se evaluarán en los ratones incluyen las puntuaciones clínicas de la GVHD, la supervivencia y la patología tisular de los días 14 y 28. Las curvas de Kaplan-Meier mostrarán la supervivencia global de los dos grupos. Además, el área bajo la curva (AUC) resumirá la puntuación total semanal de GVHD desde el momento de la infusión hasta la semana 13 para cada ratón. Se practicará la eutanasia a los ratones para evaluar la evidencia patológica de GVHD, así como para cuantificar y caracterizar las Tregs del intestino grueso y las células T efectoras alorreactivas mediante citometría de flujo en los días 14 y 28.
Método para medir el efecto de los metabolitos microbianos (SCFA) en la regeneración de las criptas intestinales
Se utilizó un sistema de cultivo de criptas epiteliales intestinales descrito previamente (Toshiro Sato, Robert G. Vries, Hugo J. Snippert, Marc van de Wetering, Nick Barker, Daniel E. Stange, Johan H. van Es, Arie Abo, Pekka Kujala, Peter J. Peters & Hans Clevers, 2009). Las células madre Lgr5 individuales construyen estructuras cripto-vellosidades in vitro sin un nicho mesenquimal, Nature, 459:262-265). se suspendieron 400 criptas por pocillo en Matrigel licuado reducido en factor de crecimiento (Corning) (25 % medio DMEM / F12 avanzado (Gibco); Matrigel reducido al 75 % de factor de crecimiento) a 4 °C. A continuación, se sembraron en placas Nunc de 24 pocillos con superficie delta precalentada en gotas de 50 pl para el intestino delgado y de 30ul para el intestino grueso, cada una de las cuales contenía aproximadamente entre 100 y 500 criptas. Una vez polimerizadas las gotas de Matrigel, se añadieron 500ul de medio de cultivo de criptas completo a los cultivos de criptas de intestino delgado (ENR-medio: DMEM/F12 avanzado (Sigma), 2mM L-glutamina (Sigma), 10mM HEPES (Sigma), 100U/ml penicilina/100pg/ml estreptomicina (Sigma), 1mM N-acetil cisteína (Sigma), 1 * suplemento B27 (Invitrogen,), 1 * suplemento N2 (Invitrogen), 50ng/ml de mEGF (Peprotech), 100ng/ml de mNoggin (Peprotech) y 10 % de medio condicionado de R-espondina-1 humana de células HEK 293T transfectadas con hR-espondina-1. En algunos experimentos en los que se evaluó el brote de hR-espondina-1 se redujo al 1.25-5 %. Las criptas del intestino grueso se cultivaron en medio WENR que contenía un 50 % de medio condicionado de Wnt3a, además de las proteínas mencionadas y un 1 % de Albúmina sérica Bovina (Sigma). Para los cultivos de intestino grueso se añadieron 10uM de SB202190 (Sigma, Cat.nr.S7067) y de inhibidor de ALK5 (A83-01, Tocris) al WENR. Todas las placas se incubaron a 37 °C/5 % de CO2 y los medios se sustituyeron cada 2-3 días. Los pocillos de control se dejaron sin tratar y, en su caso, los pocillos de tratamiento recibieron diferentes concentraciones de metabolitos bacterianos junto con cambios de medio. Las criptas se reagruparon en el día 7 disgregándolas mecánicamente con una seropipeta, lavando el Matrigel mediante centrifugación de las criptas en un exceso de medio, y volviéndolas a reagrupar tras la reconstitución del granulado en Matrigel licuado.
Selección de oligosacáridos para aumentarBlautia
UtilizandoBlautiaaislada de origen C57BL/6, así como unLactobacillus johnsoniide origen C57BL/6, se evaluó la capacidad de estas bacterias para fermentar una variedad de azúcares utilizando el pH y la densidad óptica para evaluar el crecimiento bacteriano en medios carentes de glucosa. Se evaluóLactobacillus johnsoniiporque esta bacteria se expande en el contexto de la restricción calórica a expensas de Clostridia y, por tanto, es presumiblemente un competidor directo por los nutrientes en el intestino murino. A partir de este análisis se identificaron dos azúcares fermentados porBlautiay no porLactobacillus:la ramnosa y la xilosa.
Administración de oligosacáridos para aumentar Blautia y mitigar la GVHD experimental
Se inoculó por vía oral a ratones C57BL/6 un aislado murino de Blautia conocido por fermentar la xilosa. A algunos ratones se les administró xilosa en el agua de bebida (10g/l) 7 días antes del BMT con células BM y T B10.BR. Estos ratones que recibieron xilosa mostraron una expansión deBlautia,medida por secuenciación profunda 16S, en la flora intestinal a pesar de la presencia de GVHD el día 14 después del BMT(Figura 9).Curiosamente, la administración a largo plazo de xilosa también mejoró la supervivencia de los ratones con GVHD.
Otro estudio muestra el crecimiento de cepas de una mezcla clostridial, en medio BHI sin glucosa al que se añaden diversos azúcares. La glucosa dio los mejores resultados y fue capaz de favorecer el crecimiento de 10 de las 17 cepas totales. La glucosa, sin embargo, tendría un beneficio limitado, ya que probablemente no da una ventaja selectiva a las bacterias beneficiosas. La rafinosa fue capaz de sustentar 5 cepas, mientras que la celobiosa pareció sustentar 4 cepas no sustentadas por la rafinosa. Una mezcla de rafinosa y celobiosa puede administrarse a un sujeto para proporcionar soporte al menos a una parte de las bacterias beneficiosas.
Detección de metabolitos producidos por cultivos deBlautia.
Se cuantificarán los metabolitos bacterianos, incluidos los SCFAs, las creatinas y los hidroxi-SCFAs, obteniendo huellas dactilares de la composición metabólica de la muestra mediante NMR 1D 1H en un espectrómetro Bruker Avance-600 MHz, y analizando con métodos estadísticos multivariantes supervisados utilizando el software Chenomx NMR Suite.
Ensayoin vitropara demostrar la supresión deBlautiapor microbios disbióticos dominantes debido a la producción de radicales libres
Del estudio de los efectos de la restricción calórica en la composición del microbiota intestinal se observó que los anaerobios obligados (Clostridia, Bacteroidetes) disminuyen en abundancia, mientras que los anaerobios facultativos (Lactobacillales, Proteobacteria) aumentan. La producción de radicales libres porE. colien condiciones de inanición se ha descrito anteriormente (Saby S, et al. Appl Environ Microbiol. 1999; 5600-5603. Se diseñaron experimentos para examinar in vitro si el Lactobacillus johnsonii podía suprimir el crecimiento de nuestro aislado murino deBlautiaen condiciones de inanición, y para investigar además si la producción de radicales libres podía ser un factor contribuyente. En concreto, se cultivóBlautiasola o con L.johnsonii,y se observó queL. johnsoniiefectivamente suprimía el crecimiento deBlautia,pero no lo hacía si se añadían medios adicionales para evitar la inanición(Figura 11). Los efectos de los medios que habían favorecido el crecimiento deL. johnsoniihasta la fase de meseta se investigaron más a fondo tras la filtración estéril. El medio lactoacondicionado no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento deLactobacilluscuando se mezcló con medio fresco en una relación 1:1, pero pudo suprimir el crecimiento deBlautia,lo que indica que, en condiciones de inanición,Lactobacilluslibera sustancias que suprimen el crecimiento deBlautia,pero no de sí mismo. A continuación, se examinó si los agentes reductores podían rescatar aBlautiade la supresión mediada por el medio lactoacondicionado. Se observó que la L-cisteína, el ácido ascórbico y el tioglicolato sódico eran capaces de favorecer el crecimiento deBlautiaen presencia de medios lactoacondicionados. En conjunto, estos resultados sugieren queLactobacilluspuede desarrollar una ventaja competitiva sobreBlautiaen un entorno de nutrientes limitados debido a la producción de radicales libres, que son selectivamente perjudiciales para las bacterias anaerobias obligadas debido a la falta de enzimas protectoras, incluyendo glutatión transferasas, catalasas y superóxido dismutasas.
Combinaciónin vitrodeBlautia+ xilosa y efectos sobre los metabolitos bacterianos
Blautiase cultivó en medio PY líquido solo, o suplementado con glucosa o xilosa (10g/l), durante 48 horas. Se centrifugaron los medios y se evaluaron los niveles de SCFAen el sobrenadante.
Categorías de antibióticos
Los antibióticos utilizados durante la hospitalización por trasplante se dividieron en aquellos que incluían una actividad significativa contra las bacterias anaerobias (piperacilina-tazobactam, ticarcilina-clavulánico, imipenem-cilastatina, meropenem, metronidazol, vancomicina oral y clindamicina), y aquellos con una actividad reducida (vancomicina intravenosa, ceftriaxona, ceftazidima, cefepima, aztreonam, trimetoprima-sulfametoxazol)19.
Prácticas de trasplante
Según la práctica institucional, los pacientes recibieron profilaxis con ciprofloxacina, y los sometidos a un acondicionamiento más intenso que los regímenes no mieloablativos también recibieron profilaxis con vancomicina intravenosa desde el día -2 hasta el día 720. La profilaxis antibiótica contraPneumocystis jiroveci(trimetoprimsulfametoxazol, pentamadina en aerosol o atovaquona) se administró a discreción del médico responsable del trasplante.
Análisis estadístico
La incidencia de la GVHD aguda y la mortalidad relacionada con la GVHD se estimó mediante funciones de incidencia acumulada, tratando la recaída y la muerte no relacionada con la GVHD como eventos competitivos, y se comparó entre factores mediante la prueba de Gray. Las probabilidades de supervivencia global se estimaron mediante la metodología de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de logrank. Las comparaciones de la abundancia bacteriana se realizaron mediante la U de Mann-Whitney para pruebas no apareadas. Para los experimentos con ratones, los datos se presentaron como media ± SEM. Las curvas de supervivencia se analizaron con la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox. Para las demás comparaciones se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. En todos los análisis, la significación estadística se definió como P < 0.05 basada en una prueba de 2 caras. Los análisis estadísticos se realizaron con R versión 3.1.0 (Fundación R para la Computación Estadística, Viena, Austria) y GraphPad Prism versión 6.00 para Machintosh, (Software GraphPad, San Diego, California, EE.UU.).
Composición de la flora intestinal y mortalidad relacionada con la GVHD: impacto de la diversidad e identificación de subconjuntos predictivos de bacterias
Nuestro grupo informó recientemente de que el aumento de la diversidad bacteriana en el momento del injerto se asociaba a una mejora de la supervivencia global tras el BMT alo y a una reducción de la mortalidad relacionada con el trasplante, pero en esa población heterogénea de pacientes no pudimos determinar si la diversidad se asociaba a una reducción de la GVHD13. Para el estudio actual, comenzamos preguntándonos si la diversidad de la flora bacteriana podría predecir la GVHD letal en una población más uniforme de pacientes con alto riesgo de desarrollar GVHD. Utilizamos muestras de heces recogidas en bancos de pacientes sometidos a BMT alo en nuestro centro. Identificamos una cohorte de 64 pacientes que, tras un BMT alo convencional sin depleción de células T, habían proporcionado una muestra de heces tras la infusión del BMT y antes del alta hospitalaria (recogida el día 8-16, mediana del día 12; características clínicas resumidas en la Tabla 2). Analizamos la composición de la flora de estas muestras de heces mediante la secuenciación de las regiones V1-V3 del gen 16S ARNr utilizando la plataforma 454, y realizamos un seguimiento clínico de los pacientes para detectar el desarrollo de mortalidad relacionada con la GVHD.
Tabla 2
Características clínicas de 64 pacientes de BMT alo trasplantados en el MSKCC con muestras de heces recogidas el día 12 tras el BMT incluidos en una cohorte de identificación.
Fechas del trasplante De septiembre de 2009 a octubre de 2012 Edad (años) 25 a 70, mediana 53
Sexo Mujeres 38 %, hombres 62 %
Tumor maligno primario NHL 38 %, AML 38 %, ALL 9.4 %, enfermedad de Hodgkin 6.3 %, CLL 6.3 %, MDS 3.1 % Riesgo de enfermedad Alto 45 %, Intermedio 36 %, bajo 19 %.
Fuente del injerto Sangre periférica 55 %, sangre de cordón umbilical 42
%, médula ósea 3.1 %
Relación donante/HLA Hermanos idénticos (29 %), no emparentados idénticos (22 %), no emparentados no idénticos (48 %) Intensidad del acondicionamiento mieloablativo de intensidad estándar 23 %,
mieloablativo de intensidad reducida 44 %, no mieloablativo 33 %
Día de recogida de muestras de heces 8 a 16, mediana 12
Clasificamos a los pacientes según la mediana del índice de diversidad de Shannon en dos grupos iguales y descubrimos que una mayor diversidad bacteriana se asociaba efectivamente con una menor letalidad de la GVHD(Figura 1A, p=0.005). Para identificar subconjuntos bacterianos asociados con el aumento o la disminución de la mortalidad relacionada con la GVHD, comparamos las abundancias de géneros bacterianos de pacientes que murieron o no de GVHD mediante el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LDA) (LEfSe)27 como enfoque de generación de hipótesis. Se observó que las bacterias pertenecientes al géneroBlautiase asociaron de forma más significativa con una reducción de la mortalidad relacionada con la GVHD(Figura 1B, p=0.01). El géneroBlautiaincluye, en particular, organismos anaerobios comensales intestinales dentro de la clase bacteriana Clostridia2829.
Evaluamos la abundancia deBlautiacomo factor predictivo de la mortalidad relacionada con la GVHD, estratificando a los pacientes según la mediana de abundancia deBlautiade 0.05 %, y descubrimos que una mayor abundancia deBlautiase asociaba con una menor mortalidad relacionada con la GVHD (Figura 1C, p=0.04). Repetimos este análisis en una cohorte posterior de 51 pacientes (características clínicas resumidas en la Tabla 3).
Tabla 3
Características clínicas de 51 pacientes de BMT alo trasplantados en el MSKCC con muestras de heces recogidas el día 12 tras el BMT incluidos en una cohorte de validación.
Fechas del trasplante Agosto de 2011 a agosto de 2013
Edad (años) 26 a 75, mediana 50
Sexo Mujeres 32 %, hombres 69 %
Tumor maligno primario AML 37 %, NHL 35 %, ALL 12 %, CLL 7.8 %, Enfermedad de Hodgkin 3.9 %, MDS 3.9 %, Riesgo de enfermedad Alto 35 %, Intermedio 27 %, bajo 37 %.
Fuente del injerto Médula ósea 3.9 %, sangre periférica 57 %, sangre de cordón umbilical 39 %
Relación donante/HLA Hermanos idénticos (24 %), no emparentados idénticos (29 %), no emparentados no idénticos (47 %) Intensidad del acondicionamiento mieloablativo de intensidad estándar 14 %,
mieloablativo de intensidad reducida 57 %, no mieloablativo 29 %.
Día de recogida de muestras de heces 8 a 16, mediana 12
A pesar de las diferencias en la metodología de secuenciación, incluido el análisis de V4-V5 del gen ARNr 16S y el uso de la plataforma MiSeq, esta cohorte independiente demostró resultados similares, con una mediana de abundancia deBlautiaque volvió a ser del 0.05 % y la confirmación de una asociación entre la abundancia deBlautiay una menor letalidad de la GVHD (Figura 1C, p=0.01). Al evaluar las cohortes combinadas, descubrimos que la abundancia deBlautiapredecía fuertemente la mejora de la supervivencia global tras el BMT alo. Esto se debió en gran medida a la reducción de la mortalidad relacionada con la GVHD y, en menor medida, a la reducción de la mortalidad relacionada con las recaídas (p=0.03), sin diferencias en la mortalidad no relacionada con el tratamiento de la GVHD (Figura 2). Se obtuvieron resultados similares cuando las cohortes se analizaron por separado (datos no mostrados). Al ajustar por los dos factores de riesgo más fácilmente modificables para la GVHD aguda, la procedencia del injerto y la intensidad del acondicionamiento se observó que la abundancia deBlautiamantenía una asociación con la reducción de la mortalidad relacionada con la GVHD (HR 0.13 [0.04-0.46], p=0.001). En cuanto a la mortalidad relacionada con la recidiva, un modelo ajustado que tenía en cuenta el riesgo de enfermedad y la procedencia del injerto demostró una reducción de la asociación con la abundancia deBlautia(p=0.055).
También se evaluó la asociación de la mortalidad relacionada con la GVHD con otras bacterias. Dado que el aumento de Enterococcus puede estar asociado con la GVHD30, evaluamos si Enterococcus o bacterias potencialmente beneficiosas (Lactobacillus y Bacteroides) estaban asociadas con la mortalidad relacionada con la GVHD en nuestra población de pacientes. También evaluamos Veil-lonella, que se predijo mediante el análisis LEfSe de la primera cohorte de flora de pacientes que se asociaba con un aumento de la mortalidad relacionada con la GVHD (p=0.047). Nuestros resultados indican que ninguno de estos taxones bacterianos predecía la mortalidad relacionada con la GVHD en las cohortes combinadas(Figura 5).
También nos preguntamos si los subtipos bacterianos relacionados conBlautiapodrían ser predictivos de una GVHD letal reducida. Las bacterias del géneroBlautiase clasifican de la siguiente manera: familia-Lachnospiraceae, orden -Clostridiales, clase - Clostridia, y filo - Firmicutes28. El análisis de los pacientes según la abundancia de bacterias de Lachnospiraceae, Clostridiales y Clostridia demostró asociaciones con una menor incidencia de GVHD letal, lo que sugiere que los miembros deBlautia,y potencialmente sus parientes, contribuyen con un efecto protector contra la GVHD letal (datos no mostrados). A nivel de especie, tres taxones deBlautiase asociaron con una reducción de la mortalidad relacionada con la GVHD, similar a los resultados a nivel de género.
Habiendo identificado laBlautiacomo un biomarcador prometedor de la mortalidad relacionada con la GVHD, nos preguntamos si también se correlacionaba con una reducción de la GVHD aguda clínica. Nuestros resultados indican que la abundancia deBlautiapodría estar asociada con una menor incidencia de GVHD aguda de grados 2-4 aunque esto no alcanzó significación estadística (p=0.1); no hubo asociación con GVHD aguda de grados 3-4(Figura 3A).Sin embargo, la abundancia deBlautiasí predijo un menor desarrollo de GVHD aguda que requiriera tratamiento con corticosteroides sistémicos (p=0.01), lo que sugiere que la pérdida deBlautiase asocia a una GVHD aguda que no responderá únicamente a los corticosteroides tópicos. En cuanto a los órganos diana clásicos de la GVHD aguda, el aumento de la abundancia deBlautiano se relacionó con la GVHD cutánea ni con la GVHD del intestino superior (Figura 3B). Tendió a asociarse con una reducción de la GVHD intestinal inferior (p=0.1) y se asoció con una reducción de la GVHD hepática (p=0.02), aunque el número de eventos fue pequeño.
Examinamos además las asociaciones entre la abundancia deBlautiay los resultados de la GVHD ajustando los factores de riesgo clínicos. Tras ajustar por los dos factores de riesgo de GVHD aguda más fácilmente modificables, la procedencia del injerto y la intensidad del acondicionamiento se observó que la abundancia deBlautiamantenía una asociación con una reducción de la GVHD que conducía al tratamiento con esteroides sistémicos (HR 0.39 [0.19 0.78], p=0.009) y de la mortalidad (HR 0.13 [0.04-0.46], p=0.001). El número limitado de eventos en nuestra población de pacientes impidió el ajuste por factores adicionales. Corroborando este análisis, encontramos que, en pacientes agrupados por intensidad de acondicionamiento,Blautiaseguía siendo predictivo de protección contra la GVHD letal en pacientes con acondicionamiento no mieloablativo(Figura 7A, p=0.02) y tendía a asociarse con protección en pacientes que recibían acondicionamiento mieloablativo y de intensidad reducida, (p=0.1 y p=0.1). En los pacientes agrupados por fuente de injerto, los que recibieron injertos de células madre de sangre periférica mostraron una fuerte asociación entre la abundancia deBlautiay la reducción de la GVHD letal(Figura 7B, p=0.002), mientras que los que recibieron injertos de células madre de sangre del cordón umbilical tendieron a mostrar esta asociación (p=0.2). En conjunto, estos resultados sugieren que los estudios de cohortes más grandes de pacientes podrían demostrar una asociación entre la abundancia deBlautiay la letalidad reducida de GVHD a través de diferentes intensidades de acondicionamiento y fuentes de injerto.
La abundancia deblautiaes independiente de los factores de riesgo clínicos conocidos de GVHD aguda
Para determinar si la abundancia deBlautiaproporciona información pronóstica adicional, investigamos las posibles asociaciones entre la abundancia deBlautiay los factores de riesgo conocidos de GVHD31'33 aguda. Encontramos que la intensidad del acondicionamiento, la edad del paciente, el estado funcional, el sexo del donante/paciente, el estado del CMV y el riesgo de enfermedad no estaban asociados con la abundancia deBlautia(Tabla 4). Aunque limitados por el pequeño número, los pacientes de origen asiático o hispano parecían tener menor abundancia deBlautia.Por último, la evaluación de la abundancia deBlautiay el origen del injerto tampoco mostró ninguna asociación. En resumen, nuestro análisis indica que la abundancia deBlautiano parece estar asociada a factores de riesgo conocidos de GVHD aguda.
Tabla 4
(continuación)
Identificación de posibles determinantes clínicos de la abundancia deBlautiadurante la hospitalización por BMT alo
Para comprender mejor la heterogeneidad en la abundancia deBlautiaen nuestra población de pacientes, intentamos identificar los factores determinantes de la abundancia deBlautia.Un análisis de todas las muestras de heces de ambas cohortes de flora mostró que una gran mayoría de los pacientes tenían cantidades relativamente grandes deBlautiaen el momento del ingreso hospitalario para el trasplante, con una abundancia media de >0.1 (10 %)(Figura 4A).En muchos pacientes, sin embargo, los niveles deBlautiadescendieron rápidamente durante el curso de la hospitalización. Como era de esperar, observamos que los pacientes que no habían estado expuestos a antibióticos con cobertura anaerobia tenían más probabilidades de presentar niveles elevados deBlautia(Figura 4B).
Debido a las náuseas y la mucositis tras el acondicionamiento, los pacientes de BMT alo suelen experimentar un periodo prolongado de ingesta oral significativamente reducida y son tratados con TPN suplementaria. Se utilizó la duración de la suplementación con TPN como indicador de la nutrición oral y se examinaron las asociaciones con la abundancia deBlautia.Curiosamente, los pacientes con uso de TPN de menos de 10 días de duración (lo que indica retraso, interrupción o interrupción del tratamiento con TPN, ya que el inicio de la TPN se considera el día 2 y las muestras de heces se recogieron de media el día 12), tenían mayores niveles deBlautia(Figura 4B).La duración de la TPN se asoció con la pérdida deBlautiaincluso en los pacientes que evitaron el tratamiento con antibióticos anaerobioactivos(Figura 4C).En conjunto, estos resultados indican que tanto la terapia antibiótica anaeróbica como una ingesta nutricional oral deficiente parecen mediar en la supresión deBlautiaen el tracto intestinal.
En este estudio comenzamos descubriendo que, en los receptores de BMT alo, el género bacteriano de las muestras de heces más asociado con la reducción de la mortalidad relacionada con la GVHD eraBlautia,en dos cohortes independientes. Los pacientes con másBlautiatambién mostraron una menor incidencia de GVHD aguda que requirió tratamiento con corticosteroides sistémicos y una mejor supervivencia global. Para demostrar estas asociaciones, clasificamos a los pacientes por su abundancia deBlautiay estratificamos por el valor mediano, que resultó ser del 0.05 % en ambas cohortes.
Sorprendentemente, a pesar de la asociación con la mortalidad relacionada con la GVHD, la abundancia deBlautiano distinguió la incidencia de grados 3-4 de GVHD aguda, que se sabe que identifica a los pacientes con menos probabilidades de responder a los esteroides, lo que conduce a una supervivencia34 deficiente. Sin embargo, se sabe que hay una subpoblación de pacientes que presentan inicialmente una GVHD aguda de grado 2 y que, sin embargo, evolucionan mal, que puede identificarse mediante nuevos sistemas34 de clasificación de la GVHD o mediante nuevos biomarcadores35. La investigación adicional en cohortes de pacientes adicionales puede determinar si la abundancia deBlautiapuede añadirse de forma similar a la utilidad pronóstica de la clasificación clínica de la GVHD aguda.
La abundancia de bacterias de la clase Clostridia, que incluyeBlautia,también ha demostrado ser predictiva de una menor mortalidad relacionada con la GVHD en nuestros pacientes. Curiosamente, varios de los 17 aislados clostridiales son parientes muy cercanos de miembros del géneroBlautia,incluida una cepa con una secuencia 16S que coincide más estrechamente con la de la secuencia 16S (GenBank X94966) de la especieBlautiaproducta (ATCCR 27340-DSM 2950, Colección de Cultivos de Tipo Americano, Manassas, VA), que predecía una letalidad reducida de la GVHD en nuestra cohorte de pacientes. También se ha observado una asociación antiinflamatoria beneficiosa de laBlautiaen otros contextos clínicos, como el cáncer36 colorrectal, la pouchitis inflamatoria tras una anastomosis36 ileo-anal y la cirrosis37 hepática.
El tratamiento con antibióticos con mayor actividad frente a anaerobios se asocia a una mayor mortalidad relacionada con la GVHD y a una reducción de Clostridiales en pacientes sometidos a alo-HSCT que desarrollan fiebre neutropénica
En un segundo estudio, empezamos preguntándonos si el tratamiento con antibióticos dirigidos contra las bacterias anaerobias se asocia a diferencias clínicas en la mortalidad relacionada con la GVHD. Los pacientes de alo-HSCT de nuestro centro reciben un régimen profiláctico de antibióticos, incluyendo un ciclo corto de trimetoprim-sulfametoxazol para evitar la neumonía porPneumocystis jiroveci,así como vancomicina intravenosa y ciprofloxacina durante todo el periodo de neutropenia. En particular, hemos observado que este régimen sólo suele producir alteraciones leves en la composición del microbiota (14) intestinal. Más adelante en el transcurso del alo-HSCT, los pacientes que desarrollan fiebre neutropénica son tratados con antibióticos empíricos, cuya selección puede variar debido a antecedentes de alergias a medicamentos o a consideraciones específicas del paciente. Algunos pacientes que desarrollan fiebres persistentes, síntomas abdominales o tienen pruebas microbiológicas de infección por una bacteria resistente pueden recibir antibióticos de segunda línea que suelen ser más activos contra los anaerobios. Por último, a los pacientes de alo-HSCT también se les suele diagnosticar y tratar colitis porClostridium difficiledurante la hospitalización por alo-HSCT, lo que conduce rápidamente a la pérdida de comensales (17, 18) intestinales anaerobios.
Se identificó de forma retrospectiva una cohorte de 538 pacientes adultos trasplantados consecutivamente con alo-HSCT en nuestro centro entre 1994 y 2013 que cumplían nuestros criterios de inclusión de estar en riesgo estándar de GVHD (es decir, sin depleción de células T ex vivo) y recibir tratamiento para la fiebre neutropénica. Se excluyó a los pacientes que recibieron antibióticos de segunda línea o antibióticos para tratar la colitis por Clostridium difficile (metronidazol por vía intravenosa u oral, o vancomicina por vía oral). Los283pacientes restantes se clasificaron según recibieran antibióticos más activos contra los anaerobios (predominantemente piperacilina-tazobactam [pip/tazo] e imipenem-cilastatina [imipenem]), o recibieran tratamiento con antibióticos menos activos contra los anaerobios (predominantemente cefepima y aztreonam) (19); las características clínicas se proporcionan en la Tabla 2. Encontramos que 225 pacientes que recibieron antibióticos con actividad anaeróbica tenían una incidencia significativamente mayor de mortalidad relacionada con la GVHD en el primer año tras el alo-HSCT (Figura 1A, p=0.04). Los análisis univariantes de los factores de riesgo de GVHD previamente identificados no demostraron ninguna asociación significativa con la mortalidad relacionada con la GVHD en este conjunto de datos (Tabla 3), lo que sugiere que el tipo de exposición a antibióticos puede ser un nuevo factor predictivo de la mortalidad relacionada con la GVHD. También se realizó un análisis multivariante que evaluó la asociación del tipo de exposición a antibióticos con la mortalidad relacionada con la GVHD mientras se ajustaban los factores de riesgo de GVHD asociados con la mortalidad relacionada con la GVHD en nuestro grupo de pacientes utilizando un criterio de significación de p<0.1. Se observó que el tipo de exposición a antibióticos seguía siendo significativo tras ajustar por la compatibilidad donante/HLA (p=0.047) (Tabla 3). Estos resultados apoyan la posibilidad de que la selección de antibióticos que preserven los comensales anaerobios pueda reducir el riesgo de GVHD. Una hipótesis alternativa sería que los pacientes con antecedentes de alergia a las penicilinas (y, por tanto, más propensos a recibir cefalosporinas o aztreonam en lugar de penicilinas y carbapenems) podrían estar protegidos frente a la GVHD, aunque esto parece tener menos plausibilidad biológica.
Los pacientes de HSCT tenían una composición bacteriana intestinal. En 2009, nuestro centro comenzó a recoger prospectivamente muestras semanales de heces de pacientes sometidos a alo-HSCT. A partir de este banco de muestras, identificamos muestras de heces emparejadas recogidas de pacientes antes y después del inicio de antibióticos específicos durante el transcurso del alo-HSCT. En la Figura 15, B a G, se muestran casos representativos de pacientes tratados por fiebre neutropénica, así como de pacientes que no requirieron antibióticos terapéuticos (pero sí antibióticos profilácticos). Mediante secuenciación profunda del gen 16S ARNr, evaluamos los efectos de estos antibióticos en la composición microbiana. Nos centramos en los cambios en la abundancia deClostridiales,un orden predominante de bacterias anaerobias grampositivas comensales que incluye muchas especies asociadas con la salud (8, 13, 20) intestinal.
Encontramos que los pacientes a menudo mostraban pérdida deClostridialesy esto coincidía temporalmente con el inicio del tratamiento con imipenem, pip/tazo o metronidazol, mientras que el tratamiento con aztreonam a menudo conducía a la preservación relativa de las abundancias deClostridiales(Figura 15, B a G). Cuantificando el cambio en la abundancia deClostridialesantes y después de comenzar con antibióticos específicos, encontramos que los pacientes tratados con imipenem, pip/tazo y metronidazol tenían todos una abundancia significativamente menor deClostridialesen comparación con los tratados con aztreonam (Figura 15H).
El tratamiento con imipenem (en comparación con aztreonam) se asocia a una mayor alteración del microbiota intestinal y a una exacerbación de la GVHD en ratones
Para explorar más a fondo la causalidad y los mecanismos de los efectos de los antibióticos con actividad anaeróbica sobre la GVHD, recurrimos a experimentos en ratones. En primer lugar, tratamos a ratones C57BL/6 sanos con antibióticos de mayor actividad contra las bacterias anaerobias (pip/tazo, imipenem y metronidazol) o de actividad reducida (aztreonam y cefepime). Los ratones se trataron mediante inyecciones subcutáneas (SC) de cada antibiótico dos veces al día durante dos días (500 mg/kg para pip/tazo y 100 mg/kg para los demás) y se recogieron muestras de heces, seguidas de amplificación del gen 16S ARNr y análisis de secuencias. Descubrimos que el tratamiento sistémico con imipenem o metronidazol reducía significativamente la abundancia de Clostridiales y aumentaba la de Enterococcus, mientras que el tratamiento con aztreonam o cefepime preservaba los Clostridiales (Figura 16A). Curiosamente, el tratamiento con pip/tazo no produjo ADN bacteriano amplificable tras dos días de tratamiento, lo que indica una descontaminación casi completa en ratones (datos no mostrados).
A continuación, investigamos los efectos del tratamiento antibiótico en un modelo de alo-HSCT con antígeno menor clínicamente relevante (C57BL/6 en 129S1). Optamos por no administrar antibióticos profilácticos como la vancomicina IV o la ciprofloxacina, que alteran mínimamente la composición de la microbiota intestinal, y nos centramos en comparar los efectos del aztreonam, que preservó los Clostridiales tanto en pacientes como en ratones, con el imipenem, que redujo los Clostridiales tanto en pacientes como en ratones, cuando se administró en las primeras semanas tras el alo-HSCT, similar al escenario clínico frecuente de fiebre/neutropenia postrasplante. A los receptores de 129S1 irradiados letalmente se les trasplantaron células de médula (TCD-BM) ósea con depleción de células T C57BL/6 y 1 * 106 células T esplénicas C57BL/6. Los receptores de control sólo recibieron TCD-BM. Los receptores fueron tratados con aztreonam o imipenem SC tres veces por semana a partir del día 10 tras el alo-HSCT Sorprendentemente, observamos un aumento significativo de la mortalidad en los receptores tratados con imipenem a las 2 semanas de iniciar el tratamiento (Figura 16B). Los receptores de control sin transferencia de células T (control sin GVHD) mostraron una supervivencia del 100 %, lo que indica que el tratamiento antibiótico en sí no tuvo efectos adversos sobre el injerto de BM o la supervivencia tras la irradiación mieloablativa. Estos resultados fueron reproducibles en tres experimentos consecutivos e independientes. El examen histológico de los órganos diana de la GVHD el día 21 después del alo-HSCT (11 días después de iniciar la terapia antibiótica) reveló que la patología de la GVHD era mayor en los ratones tratados con imipenem. Curiosamente, esto se localizó en el colon (Figura 16C y Figura 18), mientras que otros órganos diana comunes de la GVHD, incluidos la piel, el hígado y el intestino delgado, no mostraron diferencias significativas en el grado de inflamación y daño. La secuenciación del gen 16S ARNr de muestras de heces de ratones con GVHD seguida de un análisis de componentes principales indicó que el tratamiento con aztreonam e imipenem dio lugar a patrones distintos de composición del microbiota (Figura 16D). Los taxones que mejor explicaron las diferencias entre estos grupos, evaluados mediante el análisis lineal discriminante del tamaño del efecto (LEfSe) (21) se representan en la Figura 16, E y F. Los ratones trasplantados tratados con imipenem mostraron una pérdida deClostridiales,corroborando nuestros resultados en pacientes y ratones no trasplantados.
Incremento enAkkermansia m uniciphila
Curiosamente, en seis experimentos con estos animales se observó sistemáticamente una expansión deAkkermansia muciniphila(Figura 16, G y H). Evaluamos los efectos del tratamiento con imipenem sobre la infiltración de células T y la fosforilación de STAT3 en el colon de ratones con GVHD y hallamos un mayor número de células T infiltradas en el colon, tanto por citometría de flujo como por histología, con niveles significativamente mayores de STAT3 fosforilada apreciados en las células T in situ por microscopía de fluorescencia, lo que respalda la noción de que los niveles elevados de IL-23 participaron en el reclutamiento y la activación de las células T del donante, lo que probablemente contribuyó a agravar la GVHD específicamente en el colon. En ratones con GVHD, el tratamiento con imipenem provocó una expansión deAkkermansia muciniphila,una bacteria comensal común que se encuentra en el tracto intestinal de humanos, ratones y otros animales. En particular, esta bacteria es inusual por su capacidad para utilizar la mucina como fuente de carbono y nitrógeno (33). Se ha observado la ruptura de la capa de mucus colónico tras la monocolonización de ratones libres de gérmenes conAkkermansia muciniphila,lo que sugiere queAkkermansia muciniphilapuede degradar la mucina tanto in vivo como in vitro (51). Sin embargo, los efectos deAkkermansia muciniphilasobre la homeostasis intestinal son menos claros y probablemente dependan del entorno. En un modelo murino de obesidad, el tratamiento conAkkermansia muciniphilamejoró los trastornos metabólicos y redujo los niveles sistémicos de endotoxinas, lo que sugiere que en este contexto laAkkermansia muciniphilamejoró la función (52) de barrera intestinal. Sin embargo, un modelo murino gnotobiótico de infección por Salmonella typhimurium demostró que la presencia deAkkermansia muciniphilaprovocaba una inflamación intestinal agravada que se atribuyó a la alteración (53) de la mucosa colónica. Nuestro examen del colon en los animales tratados con imipenem demostró un borramiento casi completo de la capa mucosa. También detectamos la presencia de bacterias en la lámina propia del colon más allá de la capa de moco alterada, lo que concuerda con el hecho de que la capa de moco proporciona una primera línea de defensa crítica contra la invasión de la mucosa (54) intestinal. No está claro por quéAkkermansiase expande en el colon de ratones trasplantados tratados con imipenem; hasta donde sabemos, no se ha observado que los aislados deAkkermansiasean resistentes al imipenem o a otros antibióticos relacionados. Hasta donde sabemos, tampoco se han descrito interacciones competitivas entreAkkermansiayClostridiales,aunque en algunos estudios se han observado expansiones similares deAkkermansiatras el tratamiento de ratones con otros antibióticos que inhibenClostridiales,como la clindamicina (55). Estos resultados sugieren que la selección de antibióticos con un espectro de actividad más limitado (especialmente contra anaerobios) puede evitar la lesión del microbiota y reducir la GVHD.
LosClostridialesse han identificado como los principales productores de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) (10, 22), que son productos de fermentación bacteriana que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la salud (23, 24) del colon. Sorprendentemente, a pesar de las grandes diferencias en la abundancia deClostridiales,no observamos cambios significativos en los niveles de SCFA en el colon comparando muestras de receptores tratados con aztreonam o imipenem (datos no mostrados).
Con el fin de adquirir una mayor resolución de la composición bacteriana entre las muestras de los sujetos tratados con aztreonam e imipenem, realizamos la secuenciación metagenómica de escopeta con heces recogidas el día 21 después del alo-HSCT. Nuestros hallazgos revelaron que, en concordancia con los resultados de la secuenciación 16S, el tratamiento con imipenem, pero no con aztreonam produjo un aumento de la abundancia deAkkermansia muciniphilia(Figura 16I). Sin embargo, dado que se determinó que el mayor porcentaje de lecturas del análisis no estaban clasificadas, es posible que existan otras diferencias significativas en la composición de especies bacterianas entre los dos tipos de tratamiento antibiótico. El análisis metagenómico de secuenciación de escopeta también reveló diferencias en el contenido génico entre las muestras de microbiota de ratones tratados con aztreonam e imipenem, representadas por el análisis de componentes principales de ortólogos génicos (Figura 16J). El análisis LEfSe de las vías génicas indicó que los genes del microbiota en ratones tratados con imipenem estaban enriquecidos para procesos que incluían la síntesis de lipopolisacáridos, y relativamente agotados en varios procesos que incluían el metabolismo de la D-alanina (datos no mostrados). Curiosamente, el lipopolisacárido es bien conocido por inducir una cascada proinflamatoria en muchos procedimientos de enfermedad, incluida la GVHD (25), mientras que las reducciones en el contenido de D-alanina del ácido lipotecoico pueden potenciar las propiedades antiinflamatorias de losLactobacilos(26, 27).
Como se ha mencionado anteriormente, detectamos un aumento deAkkermansia muciniphilaen la flora de ratones tratados con imipenem mediante secuenciación profunda del ARNr 16S (Figura 16H). Esta bacteria tiene la capacidad de degradar el moco como fuente (33, 34) de hidratos de carbono. Utilizando nuestros resultados de secuenciación metagenómica, nos preguntamos si los genes que se predice que codifican para enzimas mucolíticas secretoras estaban presentes de forma diferencial en los ratones tratados con cada antibiótico. La identificación y caracterización de las enzimas mucolíticas bacterianas es todavía un campo joven, pero un estudio reciente examinó la secuencia genómica completa deAkkermansia muciniphilaATCC BAA-835, aislada de heces (34) humanas. Los autores identificaron dos fuertes candidatos para la degradación del moco: Amuc_0953, una sulfatasa, y Amuc_2164, una glicosil hidrolasa, que contenían sitios de escisión de péptidos señal secretores y dominios de unión a mucinas. Cuantificamos la presencia de secuencias con homología a estos dos genes y descubrimos que ambos estaban notablemente enriquecidos en muestras de ratones tratados con imipenem (Figura 17G). A continuación, tratamos de caracterizar la capa mucosa del colon en ratones trasplantados tratados con antibióticos. Utilizando la tinción de ácido periódico-Schiff, observamos una marcada reducción del grosor de la capa de moco en los receptores tratados con imipenem el día 21 en comparación con los receptores tratados con aztreonam (Figura 17, H e I). No se observaron diferencias en el número de células caliciformes productoras de moco entre los receptores tratados con aztreonam e imipenem, lo que sugiere que la producción de moco no se vio afectada (Figura 17J). Además, utilizando una sonda bacteriana general de ARNr 16S (EUB338) (35) junto con la tinción de Muc2, visualizamos directamente la capa mucosa interna en el colon de los receptores tratados con antibióticos y confirmamos un drástico adelgazamiento de la capa mucosa de los ratones tratados con imipenem. Llamativamente, también observamos histológicamente la diseminación de bacterias más allá de la barrera epitelial colónica en ratones tratados con imipenem (Figura 17K), mientras que esto no se observó en ratones tratados con aztreonam. En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con imipenem puede exacerbar la GVHD a través de una combinación de factores que incluyen el compromiso de la función de barrera con el adelgazamiento de la capa mucosa protectora y la reducción del número de células B colónicas, el aumento de la infiltración con granulocitos, los niveles elevados de IL-23 y el aumento del número y la activación de las células T CD4+ efectoras del donante.
Una pregunta que surge es cómo la abundancia deBlautiay otras bacterias relacionadas tan pronto como el día 12 después del b Mt alo podría tener un impacto biológico en la GVHD aguda y la mortalidad relacionada con la GVHD, que puede ocurrir meses, y en el caso de la mortalidad, años, después del b Mt alo. Sin embargo, existen precedentes; las concentraciones séricas de ciclosporina en la primera semana tras el BMT alo predijeron la aparición de GVHD aguda, aunque la aparición de GVHD aguda se produjo en gran medida después del día 3038. Del mismo modo, los niveles séricos del biomarcador ST2 predijeron la GVHD refractaria a esteroides y los niveles a partir del día 14 se asociaron con la mortalidad a los 6 meses sin recaída35. En conjunto, estos estudios sugieren que las condiciones iniciales posteriores al BMT pueden afectar al inicio de la GVHD y dictar la gravedad final del curso de la GVHD, aunque esto puede tardar meses en manifestarse por completo, quizá debido a la contención parcial de la inflamación por la administración continua de inmunosupresores en las formas de profilaxis y terapia de la GVHD.
Curiosamente, mientras que nuestros resultados sugieren queBlautiase asocia con una reducción de la GVHD, el aumento de la abundancia deBlautiano se asoció con un aumento de la mortalidad relacionada con la recaída. Esto sugiere que laBlautiapuede estar relacionada principalmente con efectos antiinflamatorios localizados, una posibilidad respaldada por nuestro hallazgo de falta de asociación con la GVHD cutánea. En conjunto, estos datos sugieren que centrarse en el microbiota puede permitir reducir la GVHD sin comprometer simultáneamente los efectos del injerto contra el tumor. De hecho, encontramos una asociación de la abundancia deBlautiacon la reducción de la mortalidad relacionada con la recaída, aunque esta asociación se perdió tras ajustar por riesgo de enfermedad y origen del injerto. Examinar más a fondo el impacto del microbiota en la recaída requeriría más estudios.
Al caracterizar la abundancia deBlautiaen nuestros pacientes a lo largo de su hospitalización por trasplante, descubrimos que la mayoría de los pacientes tenían inicialmente cantidades relativamente grandes deBlautia,pero que en muchos pacientes las especies deBlautiase perdían después drásticamente. Se identificaron dos factores de riesgo potenciales asociados con la pérdida deBlautia,entre ellos recibir antibióticos con cobertura anaeróbica y requerir una mayor duración del tratamiento de TPN. El hallazgo de una reducción deBlautiacon la administración de antibióticos no es sorprendente, pero la asociación con la TPN prolongada fue inesperada. Aunque se sabe que la intensidad del acondicionamiento y la duración de la necesidad de TPN están asociadas39, no encontramos ninguna asociación significativa entre la intensidad del acondicionamiento y la abundancia deBlautia(datos no mostrados). Esto sugiere que una nutrición oral deficiente puede contribuir más a la pérdida de Blautia que un acondicionamiento más intenso. Esta explicación se ve corroborada por los hallazgos en modelos de ratón según los cuales el acondicionamiento mieloablativo se asocia únicamente con alteraciones leves en la composición de la flora, en comparación con alteraciones mayores caracterizadas por la pérdida de Clostridiales que se aprecian tanto en ratones como en humanos con la aparición de la GVHD, un potente inductor de la anorexia40. Un patrón de pérdida de miembros de Clostridiales, incluyendo especies deRoseburia, Faecalibacterium, RuminococcusyBlautia,puede observarse de forma similar en voluntarios sometidos a dietas41 altas en proteínas y bajas en carbohidratos o a dietas derivadas enteramente de productos42 animales.
A partir de la descripción detallada anterior de las realizaciones específicas de la presente invención, debería ser evidente que se ha descrito una metodología única para la utilización de bacterias Clostridiales para reducir el riesgo y/o tratar la GVHD después de un trasplante de médula ósea o de células madre hematopoyéticas. Aunque en el presente documento se han divulgado en detalle realizaciones particulares, esto se ha hecho a modo de ejemplo con fines ilustrativos y no pretende ser limitativo con respecto al alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos métodos.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición terapéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto tras un trasplante de médula ósea (BMT) o un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), en la que la composición terapéutica comprende una o más poblaciones purificadas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum, Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelli,y combinaciones o mezclas de los mismos.
2. La composición terapéutica para uso de la reivindicación 1, en el que dichas bacterias comprenden un ADNr 16S con la secuencia de nucleótidos de uno de los SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12 y 15 o una secuencia de nucleótidos con una identidad de entre el 98 % y el 100 % con dicha secuencia.
3. La composición terapéutica para uso de la reivindicación 1 o 2,
en la que las bacterias de dicha composición son bacterias vivas, bacterias congeladas, esporas germinables o una combinación de las mismas; y/o
en el que las bacterias fermentan un oligosacárido seleccionado entre xilosa, rafinosa, celobiosa o meliztosa.
4. La composición terapéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en la que las bacterias están presentes en una dosis de 104 a 1010 CFUs; o
en el que las bacterias están presentes en una dosis de 105 a 109 CFUs; o
en el que las bacterias están presentes en una dosis de 106 a 108 CFUs.
5. La composición terapéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 formulada para administración oral; o formulada para administración colónica/rectal.
6. Una composición terapéutica para su uso en la prevención, la reducción de la probabilidad y/o el tratamiento de una enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en un sujeto sometido a un trasplante de médula ósea o de células madre hematopoyéticas, en la que la composición terapéutica comprende una o más poblaciones purificadas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta), Eubacterium contortum, Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelli, y combinaciones o mezclas de los mismos.
7. La composición terapéutica para uso de la reivindicación 6, en la que la composición
(i) estimula el crecimiento o la actividad de uno o más taxones bacterianos infrarrepresentados en el microbiota del sujeto antes o después del trasplante; o
(ii) inhibe el crecimiento o la actividad de uno o más taxones bacterianos sobrerrepresentados en el microbiota del sujeto.
8. La composición terapéutica para uso de la reivindicación 6 o 7,
en el que el trasplante de médula ósea es un trasplante alogénico de médula ósea (alo-BMT); y/o en el que el trasplante de células madre hematopoyéticas es un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (alo-HSCT).
9. La composición terapéutica para uso de la reivindicación 8,
en la que la composición debe administrarse al sujeto entre 1 día y 2 semanas tras el cese de un tratamiento con antibióticos de alta actividad contra anaerobios; o bien
en la que dicha composición se administra al sujeto entre 7 y 10 días antes del alo-BMT o del alo-HSCT; o bien en la que dicha composición se administra al sujeto entre 1 día y 1 semana antes del alo-BMT o del alo-HSCT
10. Un método para detectar en un sujeto el riesgo de desarrollar GVHD tras un trasplante de médula ósea (BMT) o un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), comprendiendo el método la determinación de la abundancia de una especie bacteriana del ordenClostridialesen una muestra de material fecal del sujeto, en el que el sujeto tiene un mayor riesgo de GVHD si la abundancia de dichasClostridialesen dicha muestra de material fecal es menor que la abundancia de dichasClostridialesen una muestra de material fecal de un sujeto que no tiene riesgo de desarrollar GVHD, y en la que dicha especie deClostridialesse selecciona del grupo que consiste enRuminococcus obeum, Clostridium hathewayi, Eubacterium desmolans, Dorea longicatena, Ruminococcus lactaris (Blautia producta),Eubacterium contortum, Ruminococcus faecis, Holdemania filiformis, Clostridium sordelliy combinaciones o mezclas de los mismos.
11. El método de la reivindicación 10,
en la que la abundancia de la especieClostridialeses inferior al 0.5 % al 0.01 %; o
en la que la abundancia de la especieClostridialeses inferior al 0.25 % al 0.02 %; o
en la que la abundancia de la especieClostridialeses inferior al 0.05 %; o
en el que dichasClostridialescomprenden un ADNr 16S con la secuencia de nucleótidos de uno de los SEQ ID NOS: 1-16 o una secuencia de nucleótidos con una identidad de entre el 98 % y el 100 % con dicha secuencia.
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