ES2932398T3 - Potenciador de la respuesta de las células T antitumorales - Google Patents

Abstract

Se divulga un nuevo agente terapéutico para el cáncer, que presenta un excelente efecto antitumoral al potenciar el sistema inmunitario de un paciente con cáncer. Los inventores han conseguido la presente invención al descubrir que se obtiene un excelente efecto potenciador de la respuesta de células T antitumorales administrando un inhibidor de IL-6 y/o gemcitabina o una de sus sales a un organismo vivo portador de cáncer. Los inventores también han descubierto que se obtiene un excelente efecto antitumoral mediante el efecto potenciador de la respuesta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Potenciador de la respuesta de las células T antitumorales

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones para potenciar la respuesta de células T antitumorales. Más específicamente, la presente invención se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la potenciación de una respuesta de células T antitumorales, que comprenden un inhibidor de interleucina 6 (IL-6), que es un anticuerpo anti-receptor de la interleucina 6, y gemcitabina o una sal de la misma.

Antecedentes de la técnica

La IL-6 es una citocina también denominada factor 2 estimulante de células B (BSF2) o interferón p2. La IL-6 se descubrió como un factor de diferenciación implicado en la activación de los linfocitos de células B (Documentos No Patente 1), y más tarde se reveló que era una citocina multifuncional que influye en la función de diversas células (Documentos No Patente 2). Se ha informado que induce la maduración de las células de linfocitos T (Documento No Patente 3).

La IL-6 transmite su actividad biológica a través de dos tipos de proteínas en la célula. El primero es el receptor de IL-6, que es una proteína de unión a ligando a la que se une IL-6, con un peso molecular de aproximadamente 80 kDa (Documentos No Patente 4 y 5). El receptor de IL-6 está presente en una forma unida a la membrana que penetra la membrana celular. Se expresa en la membrana celular y también como un receptor soluble de IL-6, que consiste principalmente en la región extracelular de la forma unida a la membrana.

El Documento de Patente 1 describe diversas formas de anticuerpos anti-IL-6R (receptor de IL-6), por ejemplo, anticuerpos anti-IL-6R humanizados y anticuerpos anti-IL-6R quiméricos. El Documento de Patente 2 describe agentes terapéuticos para la artritis reumatoide crónica e inhibidores del crecimiento de células sinoviales, que contienen como ingrediente activo un antagonista de IL-6 tal como un anticuerpo anti-IL-6R. El Documento de Patente 3 describe el tratamiento de enfermedades causadas por la producción de IL-6, tales como plasmocitosis, hiperinmunoglobulinemia, anemia, nefritis, caquexia, reumatismo, enfermedad de Castleman y nefritis proliferativa mesangial. El Documento de Patente 4 describe agentes preventivos y/o terapéuticos, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo, para enfermedades mediadas por células T sensibilizadas, por ejemplo, esclerosis múltiple, uveítis, tiroiditis crónica, hipersensibilidad retardada, dermatitis de contacto y dermatitis atópica.

El Documento de Patente 5 describe agentes terapéuticos para el lupus eritematoso sistémico, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo. El Documento de Patente 6 describe agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo. El Documento de Patente 7 describe agentes terapéuticos para la pancreatitis, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo. El Documento de Patente 8 describe agentes terapéuticos para la psoriasis, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo. Adicionalmente, el Documento de Patente 9 describe agentes terapéuticos para la artritis crónica juvenil, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo. El Documento de Patente 10 describe agentes para suprimir la invasión neural de una célula, que contienen un anticuerpo anti-IL-6R como ingrediente activo, y enseña que pueden inhibir la neuroinvasión del cáncer de páncreas humano.

La gemcitabina (clorhidrato) (Gemzar (marca registrada)) es un análogo de citosina que inhibe la síntesis de ADN al inhibir la ribonucleótido reductasa y competir con dCTP para incorporarse al ADN, y actualmente se usa como agente terapéutico contra algunos tipos de cáncer tal como cáncer de páncreas. La gemcitabina también se usa como agente concomitante en radioterapia; sin embargo, no se ha logrado una mejora significativa en la supervivencia a largo plazo de los pacientes con cáncer de páncreas. Adicionalmente, ha habido algunos intentos de usar otras terapias combinadas eficaces; sin embargo, ningún informe hasta el momento indica una mejora en la tasa de supervivencia. Los documentos de la técnica anterior relacionados con la presente invención incluyen:

Documento No Patente 1: Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76

Documento No Patente 2: Akira, S. et al., Adv. en Inmunología (1993) 54, 1-78

Documento No Patente 3: Lotz, M. et al., J. Exp. Medicina. (1988) 167, 1253-1258

Documento No Patente 4: Taga, T. et al., J. Exp. Medicina. (1987) 166, 967-981

Documento No Patente 5: Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 825-828

Documento de Patente 1: WO92/19759

Documento de Patente 2: WO96/11020

Documento de Patente 3: WO96/12503

Documento de Patente 4: WO98/42377

Documento de Patente 5: WO98/42377

Documento de Patente 6: WO99/47170

Documento de Patente 7: WO00/10607

Documento de Patente 8: WO02/3492

Documento de Patente 9: WO02/080969

Documento de Patente 10: WO2009/148148

Sumario de la invención

[Problemas que se van a resolver por la invención]

Un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer que produzcan un excelente efecto antitumoral mediante la potenciación de la función inmunitaria de los pacientes con cáncer.

[Medios para resolver los problemas]

Los presentes inventores realizaron estudios dedicados para lograr el objetivo descrito anteriormente. Como resultado, los presentes inventores revelaron que la administración de un inhibidor de IL-6 y/o gemcitabina o una sal de la misma mejora la inmunosupresión causada por la proliferación aberrante de células mieloides inmaduras (ImC) y da como resultado una respuesta potenciada de células T en organismos portadores de tumores. De este modo, los presentes inventores completaron la presente invención. Además, la presente invención demuestra que el uso combinado de un inhibidor de IL-6, que es un anticuerpo anti-receptor de la interleucina 6 (IL-6) en el contexto de la presente invención, y gemcitabina o una sal de la misma potencia sinérgicamente la capacidad de respuesta de las células T y produce un excelente efecto antitumoral.

Específicamente, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la potenciación de una respuesta de células T antitumorales en un organismo portador de tumores como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra el resultado de evaluar el efecto antitumoral de la administración de GEM (Gemzar: clorhidrato de gemcitabina) a ratones BALB/c inoculados con una línea celular de cáncer escamoso inducido por metilcolantreno CMC-1.

La figura 2 es un gráfico que muestra el resultado del análisis de citometría de flujo para el número absoluto de células de cada población en el bazo después de la administración de GEM (Gemzar: clorhidrato de gemcitabina) a ratones portadores de tumores inoculados con CMC-1.

La figura 3 es un gráfico que muestra el resultado de evaluar la capacidad de crecimiento de las células CD8+ después de la estimulación con un anticuerpo anti-CD3 donde las células CD8+ se obtuvieron del bazo después de la administración de ciclofosfamida, 5-FU o GEM a ratones portadores de tumores inoculados con CMC-1.

La figura 4 es un gráfico que muestra el resultado de medir el diámetro del tumor después de la administración de GEM a ratones portadores de tumores inoculados con CMC-1.

La figura 5 es un gráfico que muestra el resultado de la evaluación de citometría de flujo para el porcentaje de células T citotóxicas CD8+ específicas de OVA en ratones C57BL6 inoculados con LLC-OVA después de la administración de GEM, donde LLCOVA se preparó introduciendo el gen de la ovoalbúmina (OVA) en la línea celular de cáncer de pulmón LLC de ratón.

La figura 6 es un gráfico que muestra el resultado de medir el nivel de IL-6 en suero en ratones BALB/c inoculados con la línea celular de fibrosarcoma CMC-G4 inducido por metilcolantreno.

La figura 7 es un gráfico que muestra el resultado de determinar el nivel de IFN-y mediante ELISA después de la estimulación de células de bazo con anticuerpo anti-CD3 o concanavalina A (ConA) luego de la administración de un anticuerpo anti-IL-6R a ratones portadores de tumores inoculados con CMC-G4.

Las figuras 1 a 8 son para referencia.

La figura 8 es un gráfico que muestra el resultado de medir el diámetro del tumor después de la administración de un anticuerpo anti-IL-6R a ratones portadores de tumores inoculados con CMC-G4.

La figura 9 es un gráfico que muestra el resultado de medir el diámetro del tumor después de la administración de GEM y anticuerpo anti-IL-6R en combinación a ratones portadores de tumores inoculados con CMC-G4.

Modo de llevar a cabo la invención

En este documento, "inhibidor de IL-6" se refiere a una sustancia que bloquea la señalización de IL-6 e inhibe la actividad biológica de IL-6. Específicamente, los inhibidores de IL-6 incluyen, por ejemplo, sustancias que se unen a IL-6, sustancias que se unen a un receptor de IL-6 y sustancias que se unen a gp130. Los inhibidores de IL-6 también incluyen sustancias que inhiben la fosforilación de STAT3, que es importante para la señalización intracelular de IL-6, tal como AG490. Los inhibidores de IL-6 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-gp130, variantes de IL-6, variantes de receptor de IL-6 soluble, péptidos parciales de IL-6, péptidos parciales de un receptor de IL-6 y compuestos de bajo peso molecular que tienen una actividad equivalente a los mismos.

En el contexto de la presente invención, los inhibidores de IL-6 son anticuerpos anti-receptor de IL-6.

El origen de los anticuerpos usados en la presente invención no está particularmente limitado; sin embargo, los anticuerpos se derivan preferiblemente de mamíferos y más preferiblemente de seres humanos.

Se puede preparar un anticuerpo de la presente invención como un anticuerpo policlonal o monoclonal usando métodos conocidos. En particular, en la presente invención se usan preferiblemente anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos incluyen los producidos por hibridomas y los producidos por huéspedes transformados con un vector de expresión que lleva un gen de anticuerpo usando técnicas de ingeniería genética. Por lo general, estos anticuerpos bloquean la transmisión de la actividad biológica de IL-6 en las células uniéndose a IL-6, un receptor de IL-6, gp130 o similares.

Básicamente, los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando técnicas conocidas como sigue. Específicamente, la inmunización se lleva a cabo mediante un método de inmunización convencional usando como antígeno sensibilizante un receptor de IL-6, IL-6, gp130 o similar. Los leucocitos resultantes se fusionan con células parentales conocidas mediante un método de fusión celular convencional. Luego, las células productoras de anticuerpos monoclonales se analizan usando un método de cribado convencional.

Específicamente, los anticuerpos monoclonales se pueden producir de la siguiente manera. Por ejemplo, cuando se preparan anticuerpos anti-receptor de IL-6, se puede obtener un receptor de IL-6 humano o un receptor de IL-6 de ratón para su uso como antígeno sensibilizante para obtener anticuerpos usando los genes del receptor de IL-6 y/o secuencias de aminoácidos divulgadas en la Publicación de la solicitud de la Patente Europea No. E^p 325474 y la Publicación de la solicitud KoKai de la Patente Japonesa No. (JPA) Hei 3-155795, respectivamente.

Hay dos tipos de proteínas receptoras de IL-6: una expresada en la membrana celular y la otra separada de la membrana celular (receptores de IL-6 solubles) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). El receptor de IL-6 soluble consta esencialmente de la región extracelular del receptor de IL-6 unido a la membrana celular y se diferencia del receptor de IL-6 unido a la membrana en que carece de la región transmembrana o de las regiones tanto transmembrana como intracelular. Se puede emplear cualquier receptor de IL-6 como una proteína del receptor de IL-6, siempre que se pueda usar como antígeno sensibilizante para producir un anticuerpo anti-receptor de IL-6 usado en la presente invención.

Después de transformar una célula huésped apropiada con un sistema de vector de expresión conocido insertado con una secuencia del gen del receptor de IL-6, la proteína del receptor de IL-6 deseada se purifica desde el interior de la célula huésped o del sobrenadante del cultivo usando un método conocido. Esta proteína del receptor de IL-6 purificada puede usarse como antígeno sensibilizante. Alternativamente, una célula que expresa el receptor de IL-6 o una proteína de fusión de la proteína del receptor de IL-6 y otra proteína puede usarse como antígeno sensibilizante.

Igualmente, cuando se usa IL-6 como antígeno sensibilizante para la preparación de anticuerpos, se puede obtener IL-6 humana usando el gen y/o las secuencias de aminoácidos de IL-6 divulgadas en los documentos Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, o Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688. Alternativamente, para un antígeno sensibilizante para la preparación de anticuerpos anti-gp130, se pueden usar las secuencias génicas y/o de aminoácidos de gp130 divulgadas en la Publicación de la solicitud de la Patente Europea No. EP 411946.

Los mamíferos que se van a inmunizar con un antígeno sensibilizante no están particularmente limitados, pero se seleccionan preferiblemente teniendo en cuenta la compatibilidad con la célula original usada para la fusión celular. En general, se usan roedores tales como ratones, ratas y hámsteres.

Los animales se inmunizan con antígenos sensibilizantes según métodos conocidos. Por ejemplo, como método general, los animales se inmunizan mediante inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante. Específicamente, el antígeno sensibilizante preferiblemente se diluye o suspende en una cantidad apropiada de solución salina regulada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica o similar, se mezcla con una cantidad apropiada de un adyuvante general (por ejemplo, adyuvante completo de Freund), se emulsiona y luego se administra a un mamífero varias veces, cada cuatro a 21 días. Además, se puede usar un portador apropiado para la inmunización con un antígeno sensibilizante.

Después de tal inmunización, se confirma un aumento del nivel de un anticuerpo deseado en el suero y luego se obtienen leucocitos del mamífero para la fusión celular. Los leucocitos preferidos para la fusión celular incluyen, en particular, células de bazo.

Las células de mieloma de mamífero usadas como células madre, es decir, como células asociadas para fusionarse con los leucocitos anteriores, incluyen diversas cepas celulares conocidas, por ejemplo, P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G et al., Nature (1979) 277, 131-133), y similares.

Básicamente, la fusión celular de los leucocitos y las células de mieloma mencionadas anteriormente se puede realizar usando métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein et al. (Kohler, G and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), y similares.

Más específicamente, la fusión celular mencionada anteriormente se logra en un medio de cultivo nutritivo general en presencia de un agente potenciador de la fusión celular. Por ejemplo, el polietilenglicol (PEG), el virus Sendai (HVJ) y similares se usan como agentes potenciadores de la fusión. Además, para potenciar la eficiencia de la fusión, se pueden agregar agentes auxiliares tales como el sulfóxido de dimetilo dependiendo de la necesidad.

La proporción de leucocitos a células de mieloma usada es preferiblemente, por ejemplo, de 1 a 10 leucocitos por cada célula de mieloma. El medio de cultivo usado para la fusión celular mencionada anteriormente es, por ejemplo, el medio de cultivo RPMI 1640 o MEM, que son apropiados para la proliferación de las células de mieloma mencionadas anteriormente. También se puede usar un medio de cultivo general usado para cultivar este tipo de células. Adicionalmente, los suplementos de suero tal como el suero de ternera fetal (FCS) se pueden usar en combinación.

Para la fusión celular, las células de fusión (hibridomas) de interés se forman mezclando cantidades predeterminadas de una célula inmune mencionada anteriormente y una célula de mieloma en un medio de cultivo mencionado anteriormente, y luego agregando y mezclando una solución de PEG a una concentración de 30 % a 60 % (p/v) (por ejemplo, una solución de PEG con un peso molecular medio de aproximadamente 1,000 a 6,000) precalentada a aproximadamente 37 °C. Luego, los agentes de fusión celular y aquellos que no son apropiados para el crecimiento de hibridomas se pueden eliminar agregando repetidamente un medio de cultivo apropiado y luego eliminando el sobrenadante por centrifugación.

Los hibridomas anteriores se seleccionan cultivando células en un medio de cultivo de selección general, por ejemplo, medio de cultivo HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en medio de cultivo HAT se continúa durante un período suficiente, generalmente de varios días a varias semanas, para destruir células distintas de los hibridomas de interés (células no fusionadas). Luego, se realiza un método estándar de dilución limitada para cribar y clonar hibridomas que producen un anticuerpo de interés.

Además de los métodos para inmunizar animales no humanos con antígenos para obtener los hibridomas mencionados anteriormente, se pueden obtener anticuerpos humanos deseados con la actividad de unión a un antígeno deseado o célula que expresa antígeno sensibilizando un linfocito humano con una proteína de antígeno deseada o célula que expresa un antígeno in vitro, y fusionar el linfocito B sensibilizado con una célula de mieloma humano (por ejemplo, ^u 266) (véase, la Publicación de la Solicitud Kokoku de la Patente Japonesa No. (JP-B) Hei 1­ 59878 (Solicitud de la Patente Japonesa examinada y aprobada publicada para oposición)). Además, se puede obtener un anticuerpo humano deseado mediante la administración de un antígeno o una célula que expresa antígeno a un animal transgénico que tiene un repertorio de genes de anticuerpos humanos, y luego siguiendo el método mencionado anteriormente (véase, la Publicación de la Solicitud de las Patentes Internacionales Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, y WO 96/33735).

Los hibridomas preparados de este modo que producen anticuerpos monoclonales pueden subcultivarse en un medio de cultivo convencional y almacenarse en nitrógeno líquido durante un período prolongado.

Cuando se obtienen anticuerpos monoclonales de los hibridomas mencionados anteriormente, se pueden emplear los siguientes métodos: (1) métodos en los que los hibridomas se cultivan según métodos convencionales y los anticuerpos se obtienen como sobrenadante de cultivo; (2) métodos en los que los hibridomas proliferan administrándolos a un mamífero compatible y los anticuerpos se obtienen como ascitis; y así sucesivamente. Se prefiere el primer método para obtener anticuerpos con alta pureza, y el último se prefiere para la producción de anticuerpos a gran escala.

Por ejemplo, los hibridomas productores de anticuerpos anti-receptor de IL-6 pueden prepararse mediante el método divulgada en JP-A (Kokai) Hei 3-139293. Tales hibridomas se pueden preparar inyectando un hibridoma productor de anticuerpos PM-1 en la cavidad abdominal de un ratón BALB/c, obteniendo ascitis y luego purificando un anticuerpo PM-1 de la ascitis; o cultivando el hibridoma en un medio apropiado (por ejemplo, medio RPMI 1640 que contiene suero bovino fetal al 10 % y BM-Condimed H1 al 5 % (Boehringer Mannheim); medio SFM de hibridoma (G ⁱBCOBRL); medio PFHM-II (GIBCO-BRL), etc.) y luego obtener el anticuerpo PM-1 del sobrenadante del cultivo.

Los anticuerpos recombinantes se pueden usar como anticuerpos monoclonales de la presente invención, en los que los anticuerpos se producen usando técnicas de recombinación genética clonando un gen de anticuerpo de un hibridoma, insertando el gen en un vector apropiado y luego introduciendo el vector en un huésped (véase, por ejemplo, Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom por Macmillan Publishers Ltd, 1990).

Más específicamente, los ARNm que codifican regiones (V) variables de anticuerpos se aíslan de células que producen anticuerpos de interés, tales como hibridomas. Los ARNm se pueden aislar preparando ARN totales de acuerdo con métodos conocidos, tales como el método de ultracentrifugación con guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) y el método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), y preparar ARNm usando un kit de purificación de ARNm (Pharmacia) y similares. Como alternativa, los ARNm se pueden preparar directamente con un kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia).

Los ADNc de las regiones V del anticuerpo se sintetizan a partir de los ARNm obtenidos usando transcriptasa inversa. Los ADNc se pueden sintetizar usando un kit de síntesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa AMV y así sucesivamente. Además, para sintetizar y amplificar los ADNc, se pueden emplear el método 5'-RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919­ 2932) usando el kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) y PCR. Un fragmento de ADN de interés se purifica a partir de los productos PCR obtenidos y luego se liga con un vector de ADN. Luego, se prepara un vector recombinante usando el ADN anterior y se introduce en Escherichia coli o similar, y luego se seleccionan sus colonias para preparar un vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN de interés se confirma, por ejemplo, mediante el método didesoxi.

Cuando se obtiene un ADN que codifica la región V de un anticuerpo de interés, el ADN se liga con un ADN que codifica una región constante del anticuerpo deseada (región C) y se inserta en un vector de expresión. Alternativamente, un ADN que codifica una región V de anticuerpo puede insertarse en un vector de expresión que comprende un ADN de una región C de anticuerpo.

Para producir un anticuerpo para su uso en la presente invención, como se describe a continuación, se inserta un gen de anticuerpo en un vector de expresión de modo que se exprese bajo el control de una región reguladora de la expresión, por ejemplo, un potenciador y un promotor. Luego, el anticuerpo puede expresarse transformando una célula huésped con este vector de expresión.

En la presente invención, para reducir la heteroantigenicidad contra seres humanos y similares, se pueden usar anticuerpos recombinantes genéticos modificados artificialmente, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o similares. Estos anticuerpos modificados se pueden preparar usando métodos conocidos.

Se puede obtener un anticuerpo quimérico ligando un ADN que codifica una región V del anticuerpo, obtenido como se indicó anteriormente, con un ADN que codifica una región C del anticuerpo humano, luego insertando el ADN en un vector de expresión e introduciéndolo en un huésped para la producción (véase, la Publicación de la solicitud de la Patente Europea No. EP 125023; la Publicación de la Solicitud de la Patente Internacional No. WO 92/19759). Este método conocido se puede usar para obtener anticuerpos quiméricos útiles para la presente invención.

Los anticuerpos humanizados también se denominan anticuerpos humanos reformados y son anticuerpos en los que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero que no es humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) se transfieren a las CDR de anticuerpos humanos. También se conocen métodos generales para esta recombinación de genes (véase, la Publicación de la solicitud de la Patente Europea No. EP 125023, la Publicación de la Solicitud de la Patente Internacional No. WO 92/19759).

Más específicamente, las secuencias de ADN diseñadas de manera que las CDR de un anticuerpo de ratón se ligan con las regiones marco (FR) de un anticuerpo humano se sintetizan mediante PCR a partir de varios oligonucleótidos producidos para contener porciones superpuestas en sus extremos. El ADN obtenido se liga con un ADN que codifica la región C de un anticuerpo humano y luego se inserta en un vector de expresión. El vector de expresión se introduce en un huésped para producir el anticuerpo humanizado (véase, la Publicación de la solicitud de la Patente Europea No. EP 239400, la Publicación de la Solicitud de la Patente Internacional No. WO 92/19759).

Las FR de anticuerpos humanos que se van a ligar a través de las CDR se seleccionan de modo que las CDR formen sitios de unión a antígeno apropiados. El o los aminoácidos dentro de las FR de las regiones variables del anticuerpo pueden sustituirse según sea necesario para que las CDR del anticuerpo humano reformado formen un sitio de unión al antígeno adecuado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Las regiones C de la cadena pesada del anticuerpo humano se usan generalmente para los anticuerpos quiméricos y humanizados, e incluyen Cy etc. Por ejemplo, se pueden usar Cy1, Cy2, Cy3 o Cy4. Las regiones C de la cadena ligera del anticuerpo humano incluyen, por ejemplo, C^k y CX. Adicionalmente, para mejorar la estabilidad de los anticuerpos o su producción, se pueden modificar las regiones C del anticuerpo humano.

Los anticuerpos quiméricos consisten en la región variable de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y la región constante de un anticuerpo derivado de un ser humano; los anticuerpos humanizados consisten en las CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y las regiones marco y las regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano. Tienen una antigenicidad reducida en el cuerpo humano y, de este modo, son útiles como anticuerpos para su uso como productos farmacéuticos.

Los ejemplos específicos preferidos de anticuerpos humanizados para su uso en la presente invención incluyen el anticuerpo PM-1 humanizado (véase, la Publicación de la Solicitud de la Patente Internacional No. WO 92/19759).

Adicionalmente, además de los métodos mencionados anteriormente para obtener anticuerpos humanos, también se conocen técnicas para obtener anticuerpos humanos mediante selección, usando una biblioteca de anticuerpos humanos. Por ejemplo, las regiones variables de los anticuerpos humanos pueden expresarse en superficies de fagos como anticuerpos de cadena sencilla (scFv) usando el método de presentación en fagos, y luego pueden seleccionarse fagos que se unen a antígenos. Al analizar los genes de los fagos seleccionados, se pueden determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables del anticuerpo humano que se unen al antígeno. Una vez que se revela la secuencia de ADN de un scFv que se une al antígeno, se puede construir un vector de expresión adecuado que comprenda la secuencia para obtener un anticuerpo humano. Estos métodos ya son conocidos, y las publicaciones de WO 92/01047, WO 92/20791, WO93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, y WO 95/15388 pueden usarse como referencia.

Los genes de anticuerpos construidos anteriormente se pueden expresar según métodos convencionales. Cuando se usa una célula de mamífero, el gen del anticuerpo se puede expresar usando un ADN en el que el gen del anticuerpo que se va a expresar está ligado funcionalmente a un promotor útil de uso común y una señal poli A corriente abajo del gen del anticuerpo, o un vector que comprende el ADN. Los ejemplos de un promotor/potenciador incluyen el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano.

Adicionalmente, otros promotores/potenciadores que se pueden usar para expresar los anticuerpos para su uso en la presente invención incluyen promotores/potenciadores virales de retrovirus, poliomavirus, adenovirus, virus de simio 40 (SV40) y similares; y también incluyen promotores/potenciadores derivados de células de mamíferos tal como el factor de elongación humano 1a (HEF1a ).

Por ejemplo, cuando se usa el promotor/potenciador de SV40, la expresión se puede realizar fácilmente siguiendo el método de Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114). Alternativamente, en el caso del promotor/potenciador HEF1a , se puede usar fácilmente el método de Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)

Los sistemas de producción que usan células procarióticas incluyen aquellos que usan células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen E. coli y Bacillus subtilis.

Cuando se usa E. coli, un gen de anticuerpo puede expresarse ligando funcionalmente un promotor convencional, una secuencia señal para la secreción de anticuerpo y el gen de anticuerpo que se va a expresar. Los ejemplos del promotor incluyen un promotor lacZ, un promotor araB y similares. Cuando se usa un promotor lacZ, los genes pueden expresarse según el método de Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); y el promotor araB puede usarse según el método de Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).

Cuando el anticuerpo se produce en el periplasma de E. coli, la secuencia señal pel B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) puede usarse como secuencia señal para secreción de anticuerpos. Los anticuerpos producidos en el periplasma se aíslan y luego se usan después de replegar apropiadamente la estructura del anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento WO 96/30394).

Como origen de replicación, se pueden usar los derivados de SV40, poliomavirus, adenovirus, papilomavirus bovino (BPV) y similares. Además, para potenciar el número de copias del gen en un sistema de células huésped, el vector de expresión puede comprender el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina-guanina fosforribosiltransferasa (Ecogpt) de E. coli, la dihidrofolato reductasa (dhfr), o como un marcador de selección.

Se puede usar cualquier sistema de producción para preparar los anticuerpos para su uso en la presente invención. Los sistemas de producción para la preparación de anticuerpos incluyen sistemas de producción in vitro e in vivo. Los sistemas de producción in vitro incluyen aquellos que usan células eucariotas o células procariotas.

Cuando se usan células eucarióticas como huéspedes, los sistemas de producción incluyen aquellos que usan células animales, células vegetales o células fúngicas. Tales células animales incluyen (1) células de mamífero, por ejemplo, CHO, COS, mieloma, riñón de cría de hámster (BHK), HeLa, Vero y similares; (2) células de anfibios, por ejemplo, ovocito de Xenopus; y (3) células de insecto, por ejemplo, sf9, sf21, Tn5 y similares. Las células vegetales conocidas incluyen células derivadas de Nicotiana tabacum, que pueden cultivarse como un callo. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras tal como Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae), hongos de moho tal como Aspergillus (por ejemplo, A. niger) y similares.

Los anticuerpos se pueden obtener usando la transformación para introducir un gen de anticuerpo de interés en estas células y luego cultivando las células transformadas in vitro. Los cultivos se realizan según los métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden usar DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM como medio de cultivo, y se pueden usar en combinación suplementos de suero tal como FCS. Además, las células introducidas con genes de anticuerpos pueden transferirse a la cavidad abdominal o similar de un animal para producir los anticuerpos in vivo.

Por otro lado, los sistemas de producción in vivo incluyen aquellos que usan animales o plantas. Los sistemas de producción que usan animales incluyen aquellos que usan mamíferos o insectos.

Los mamíferos que pueden usarse incluyen cabras, cerdos, ovejas, ratones, bovinos y similares (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Además, los insectos que se pueden usar incluyen gusanos de seda. Cuando se usan plantas, se puede usar tabaco, por ejemplo.

Se introduce un gen de anticuerpo en estos animales o plantas, se produce el anticuerpo en el cuerpo de los animales o plantas y luego se recupera este anticuerpo. Por ejemplo, un gen de anticuerpo se puede preparar como un gen de fusión insertándolo en medio de un gen que codifica una proteína tal como la p caseína de cabra, que se produce únicamente en la leche. Los fragmentos de ADN que comprenden el gen de fusión, que incluye el gen del anticuerpo, se inyectan en embriones de cabra y los embriones se introducen en cabras hembra. El anticuerpo deseado se obtiene de la leche producida por los animales transgénicos nacidos de las cabras que recibieron los embriones, o producida de la progenie de estos animales. Las cabras transgénicas pueden recibir hormonas para aumentar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado que producen (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Cuando se usan gusanos de seda, los gusanos de seda se infectan con un baculovirus insertado con un gen de anticuerpo deseado, y el anticuerpo deseado se obtiene de los fluidos corporales de estos gusanos de seda (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Además, cuando se usa tabaco, el gen del anticuerpo deseado se inserta en un vector de expresión vegetal (por ejemplo, pMON530) y el vector se introduce en bacterias tal como Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria se usa para infectar el tabaco (por ejemplo, Nicotiana tabacum) de manera que se pueden obtener los anticuerpos deseados de las hojas de este tabaco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Cuando se producen anticuerpos usando sistemas de producción in vitro o in vivo, como se describió anteriormente, los ADN que codifican una cadena pesada (cadena H) y una cadena ligera (cadena L) del anticuerpo pueden insertarse en vectores de expresión separados y luego se cotransforman con los vectores. Alternativamente, los ADN pueden insertarse en un único vector de expresión para transformar un huésped (véase, la Publicación de la Solicitud de la Patente Internacional No. WO 94/11523).

Los anticuerpos usados en la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o productos modificados de los mismos, siempre que puedan usarse adecuadamente en la presente invención. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, Fv y Fv de cadena sencilla (scFv), en los que los Fv de las cadenas H y L se unen a través de un enlazante adecuado.

Específicamente, los fragmentos de anticuerpos se producen mediante el tratamiento de anticuerpos con enzimas, por ejemplo, papaína o pepsina, o alternativamente, los genes que codifican estos fragmentos se construyen, se introducen en vectores de expresión y estos se expresan en células huésped adecuadas (véase, para ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Se puede obtener un scFv uniendo la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo. En el scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L están unidas a través de un enlazante, preferiblemente a través de un enlazante peptídico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Las regiones V de las cadenas H y L en un scFv pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Los enlazantes de péptidos para unir las regiones V incluyen, por ejemplo, péptidos de cadena sencilla arbitrarios que consisten en 12 a 19 residuos de aminoácidos.

Se puede obtener un ADN que codifica scFv usando un ADN que codifica una cadena H o una región V y un ADN que codifica una cadena L o una región V de los anticuerpos mencionados anteriormente como plantillas, usando PCR para amplificar una porción de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos deseada en la secuencia de la plantilla y usa cebadores que definen los extremos de la porción, y luego amplifica aún más la porción de ADN amplificada con un ADN que codifica una porción del enlazante peptídico y pares de cebadores que unen ambos extremos del enlazante a la cadena H y cadena L.

Una vez que se ha obtenido un ADN que codifica scFv, se puede obtener un vector de expresión que comprende el ADN y un huésped transformado con el vector según métodos convencionales. Además, scFv puede obtenerse según métodos convencionales usando el huésped.

Como anteriormente, estos fragmentos de anticuerpos se pueden producir a partir del huésped obteniendo y expresando sus genes. En este documento, un "anticuerpo" abarca tales fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos unidos a diversas moléculas, tal como el polietilenglicol (PEG), también se pueden usar como anticuerpos modificados. En este documento, un "anticuerpo" abarca tales anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados se pueden obtener modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Tales métodos ya están establecidos en la técnica.

Los anticuerpos producidos y expresados como anteriormente pueden aislarse del interior o exterior de las células o de los huéspedes y luego purificarse hasta la homogeneidad. Los anticuerpos para su uso en la presente invención se pueden aislar y/o purificar usando cromatografía de afinidad. Las columnas que se van a usar para la cromatografía de afinidad incluyen, por ejemplo, columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los portadores usados para las columnas de proteína A incluyen, por ejemplo, HyperD, POROS, Sepharose FF y similares. Además de los anteriores, pueden usarse otros métodos usados para el aislamiento y/o purificación de proteínas comunes, y no están particularmente limitados.

Por ejemplo, los anticuerpos usados para la presente invención pueden aislarse y/o purificarse seleccionando y combinando apropiadamente cromatografías además de cromatografía de afinidad, filtros, ultrafiltración, salinización, diálisis y similares. Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel y similares. Estas cromatografías se pueden aplicar a la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Alternativamente, se puede usar HPLC de fase inversa.

La concentración de los anticuerpos obtenidos como se indicó anteriormente se puede determinar mediante la medición de la absorbancia, ELISA o similar. Específicamente, la absorbancia se determina diluyendo apropiadamente la solución de anticuerpo con PBS(-), midiendo la absorbancia a 280 nm y calculando la concentración (1.35 OD = 1 mg/ml). Alternativamente, cuando se usa ELISA, la medición se puede realizar de la siguiente manera: Específicamente, se agregan 100 |il de cabra anti-IgG humana (TAG) diluida a 1 |ig/ml con solución reguladora de bicarbonato 0.1 M (pH 9.6) a una placa de 96 pocillos (Nunc) y se incubó durante la noche a 4 °C para inmovilizar el anticuerpo. Después del bloqueo, se agregan como estándar 100 |il de un anticuerpo de la presente invención apropiadamente diluido o una muestra apropiadamente diluida que comprende el anticuerpo y la IgG humana (CAPPEL) y se incuba durante una hora a temperatura ambiente.

Después del lavado, se agregan 100 |il de IgG antihumana marcada con fosfatasa alcalina diluida 5,000x (BIO SOURCE) y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Después de otro lavado, se agrega la solución de sustrato y se incuba, y se mide la absorbancia a 405 nm usando un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo de interés.

Específicamente, los ejemplos de anticuerpos anti-IL-6 incluyen, pero no se limitan particularmente a, los anticuerpos MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1998) 18, 951-956) y SK2 (Sato K et al., The abstracts of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21, 166).

Específicamente, los ejemplos de anticuerpos anti-receptor de IL-6 incluyen, pero no se limitan particularmente a, los anticuerpos MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20, AUK64-7, y AUK146-15 (Solicitud de la Patente Internacional No. WO 92-19759). De éstos, el anticuerpo PM-1 es un ejemplo de anticuerpos monoclonales preferidos contra el receptor de IL-6 humano, mientras que el anticuerpo MR16-1 es un ejemplo de anticuerpos monoclonales preferidos contra el receptor de IL-6 de ratón; sin embargo, los anticuerpos no se limitan a estos. Los ejemplos de anticuerpos anti-receptor de IL-6 humanizados preferidos incluyen un anticuerpo PM-1 humanizado (Tocilizumab; MRA). Otros anticuerpos anti­ receptor de IL-6 humanizados preferidos incluyen, por ejemplo, los anticuerpos descritos en el documento WO2009/041621. En otra realización preferida, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 incluyen aquellos que reconocen el mismo epítopo reconocido por un anticuerpo PM-1 humanizado (Tocilizumab; MRA).

Específicamente, los ejemplos de anticuerpos anti-gp130 incluyen, pero no se limitan particularmente a, los anticuerpos AM64 (JP-A(Kokai) Hei 3-219894), 4B11, 2H4 (Publicación de la Patente de los Estados Unidos No.US 5571513), y B-P8 (JP-A(Kokai) Hei 8-291199).

Las variantes de IL-6 usadas en la presente invención son sustancias con actividad de unión a un receptor de IL-6 y que no transmiten actividad biológica de IL-6. Es decir, las variantes de IL-6 compiten con IL-6 para unirse a los receptores de IL-6, pero no logran transmitir la actividad biológica de IL-6 y, de este modo, bloquean la transducción de señales mediada por IL-6.

Las variantes de IL-6 se producen mediante la introducción de mutación(es) mediante la sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de IL-6. El origen de la IL-6 usada como base de las variantes de IL-6 no está limitado, pero es preferiblemente IL-6 humana, teniendo en cuenta la antigenicidad y demás.

Más específicamente, las sustituciones de aminoácidos se realizan prediciendo la estructura secundaria de la secuencia de aminoácidos de IL-6 usando programas de modelado molecular conocidos (por ejemplo, WHATIF; Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56), y evaluando adicionalmente la influencia de los residuos de aminoácidos sustituidos en la molécula completa. Después de determinar el residuo de aminoácido adecuado que se va a sustituir, los métodos de PCR comúnmente realizados se llevan a cabo usando una secuencia de nucleótidos que codifica un gen de IL-6 humano como plantilla, y se introducen mutaciones para causar sustituciones de aminoácidos y, de este modo, se obtienen genes que codifican variantes de IL-6. Si es necesario, este gen se inserta en un vector de expresión adecuado y la variante de IL-6 se puede obtener aplicando los métodos mencionados anteriormente para la expresión, producción y purificación de anticuerpos recombinantes.

Los ejemplos específicos de las variantes de IL-6 son los divulgadas en Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96/18648, y WO 96/17869.

Los péptidos parciales del receptor de IL-6 son péptidos que comprenden parte o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la región de la secuencia de aminoácidos del receptor de IL-6 que está implicada en la unión entre la IL-6 y el receptor de IL-6. Tales péptidos normalmente comprenden de diez a 80, preferiblemente de 20 a 50, más preferiblemente de 20 a 40 residuos de aminoácidos.

Los péptidos parciales del receptor de IL-6 se pueden producir según métodos generalmente conocidos, por ejemplo, técnicas de ingeniería genética o métodos de síntesis de péptidos, especificando la región de la secuencia de aminoácidos del receptor de IL-6 que está implicada en la unión entre la IL-6 y el receptor de IL-6, y usando una parte o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la región especificada.

Cuando se prepara un péptido parcial del receptor de IL-6 usando métodos de ingeniería genética, se inserta una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado en un vector de expresión, y luego el péptido se puede obtener aplicando los métodos mencionados anteriormente para expresar, producir y purificar anticuerpos recombinantes.

Cuando se produce un péptido parcial del receptor de IL-6 usando métodos de síntesis de péptidos, se pueden usar métodos de síntesis de péptidos generalmente usados, por ejemplo, métodos de síntesis en fase sólida o métodos de síntesis en fase líquida.

Específicamente, los péptidos se pueden sintetizar según el método descrito en "Continuation of Development of Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis (in Japanese) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)". Como método de síntesis en fase sólida, por ejemplo, se puede emplear el siguiente método: el aminoácido correspondiente al extremo C del péptido que se va a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, luego la hebra peptídica se alarga por repetir alternativamente (1) la reacción de condensación de aminoácidos, cuyos grupos a -amino y grupos funcionales de cadena ramificada están protegidos con grupos protectores adecuados, uno a la vez en una dirección C- a N-terminal; y (2) la reacción de eliminar los grupos protectores de los grupos a -amino de los aminoácidos o péptidos unidos a la resina. La síntesis de péptidos en fase sólida se clasifica ampliamente en el método Boc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupos protectores usados.

Después de sintetizar una proteína de interés como anteriormente, se llevan a cabo reacciones de desprotección, luego la hebra peptídica se escinde de su soporte. Para la reacción de escisión de la hebra peptídica, generalmente se usa fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc, y generalmente se usa TFA para el método Fmoc. En el método Boc, por ejemplo, la resina peptídica protegida mencionada anteriormente se trata con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. Luego, el péptido se recupera eliminando los grupos protectores y escindiendo el péptido de su soporte. Al liofilizar el péptido recuperado, se puede obtener un péptido crudo. En el método Fmoc, por otro lado, la reacción de desprotección y la reacción para escindir la hebra peptídica del soporte se pueden realizar en TFA usando un método similar a los descritos anteriormente, por ejemplo.

Los péptidos en bruto obtenidos se pueden separar y/o purificar aplicando HPLC. La elución se puede realizar en condiciones óptimas usando un sistema disolvente de agua-acetonitrilo, que generalmente se usa para la purificación de proteínas. Las fracciones correspondientes a los picos del perfil cromatográfico obtenido se recogen y liofilizan. De este modo, las fracciones de péptidos purificados se identifican mediante análisis de peso molecular mediante análisis de espectro de masas, análisis de composición de aminoácidos, análisis de secuencia de aminoácidos o similares.

En este documento, "gemcitabina o una sal de la misma" se refiere a 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina o una sal de la misma, que tiene la función de inhibir la síntesis de ácidos nucleicos al inhibir la elongación del ADN cuando se incorpora a las cadenas de ADN. Una sal de gemcitabina particularmente preferida es el clorhidrato de gemcitabina (Gemzar (marca registrada)).

Los inhibidores de IL-6 de la presente invención y la gemcitabina o una sal de la misma pueden usarse para potenciar la respuesta de células T antitumorales en organismos portadores de tumores mediante la eliminación selectiva de células mieloides inmaduras (ImC) que proliferan de forma aberrante y tienen actividad inmunosupresora o suprimiendo la actividad inmunosupresora. El tipo de cáncer en el sujeto - los organismos portadores de tumores - no está particularmente limitado y puede ser cualquier tipo de cáncer, incluido el cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de ovario.

En este documento, "potenciación de la respuesta de células T antitumorales" también significa un aumento en el número de células T CD8+, potenciación de su actividad y un aumento en la producción de interferón y. Adicionalmente, dado que el efecto de "aumento de la respuesta de células T antitumorales" de la presente invención da como resultado un efecto antitumoral, la reducción del volumen del tejido tumoral también se considera parte del efecto de la presente invención.

En este documento, cuando un inhibidor de IL-6 se "administra en combinación con" gemcitabina o una sal de la misma, estos agentes pueden administrarse al mismo tiempo o en sucesión, o uno puede administrarse después de un cierto período de tiempo después de la administración del otro. Cuando se administra un inhibidor anti-IL-6 en combinación con gemcitabina o una sal de la misma, las dosis pueden ajustarse apropiadamente dependiendo del peso, la edad, los síntomas y demás del sujeto.

El método de administración, el intervalo de administración y la dosis descritos anteriormente pueden seleccionarse apropiadamente para lograr un efecto terapéutico que sea equivalente al efecto de la presente invención. Por ejemplo, el método de administración, el intervalo de administración o la dosis que logre un efecto que sea equivalente al ejemplo preferible mencionado anteriormente se puede seleccionar midiendo el nivel en sangre de un agente descrito anteriormente. Los métodos de administración, los intervalos de administración y las dosis que logran un nivel en sangre comparable al que se muestra en los ejemplos descritos anteriormente también se incluyen en la presente invención.

Los sujetos a los que se administra una composición o agente de la presente invención son mamíferos. Los mamíferos preferidos son los seres humanos.

Las composiciones o agentes de la presente invención se pueden administrar en forma de productos farmacéuticos, ya sea sistémica o localmente por vía oral o parenteral. Por ejemplo, pueden seleccionarse inyecciones intravenosas tales como infusiones por goteo, inyecciones intramusculares, inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas, supositorios, enemas o comprimidos entéricos orales. Se pueden seleccionar métodos de administración adecuados dependiendo de la edad y los síntomas del paciente. La dosis eficaz por administración se selecciona del intervalo de 0.01 a 100 mg/kg de peso corporal. Alternativamente, la dosis puede seleccionarse del intervalo de 1 a 1000 mg/paciente, preferiblemente del intervalo de 5 a 50 mg/paciente. Una dosis y un método de administración preferidos son los siguientes: por ejemplo, cuando se usa un anticuerpo anti-receptor de IL-6, la dosis eficaz es una cantidad tal que el anticuerpo libre está presente en la sangre. Específicamente, se administra una dosis de 0.5 a 40 mg/kg de peso corporal/mes (cuatro semanas), preferiblemente de 1 a 20 mg/kg de peso corporal/mes, mediante inyección intravenosa, tal como infusión por goteo, inyección subcutánea o similar, de una a varias veces al mes, por ejemplo, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas o una vez cada cuatro semanas. El programa de administración se puede ajustar, por ejemplo, extendiendo el intervalo de administración de dos veces por semana o una vez por semana a una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas, mientras se monitorea la condición del paciente y los cambios en los valores de las pruebas de sangre.

En este documento, cuando se administra un inhibidor de IL-6 en combinación con gemcitabina o una sal de la misma, la dosis puede ajustarse apropiadamente dependiendo del peso, la edad, los síntomas y demás del sujeto. Cuando el inhibidor de IL-6 es, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6R, su dosis es, por ejemplo, de 0.1 a 100 mg/kg/semana o una dosis que proporcione una concentración en sangre equivalente a la dosis anterior, preferiblemente 1 a 50 mg/kg/semana o una dosis que proporcione una concentración en sangre equivalente, y más preferiblemente 5 a 20 mg/kg/semana o una dosis que proporcione una concentración en sangre equivalente. Alternativamente, cuando el agente inmunosupresor es, por ejemplo, clorhidrato de gemcitabina, su dosis es, por ejemplo, de 10 a 10000 mg/m2/semana o una dosis que proporcione una concentración en sangre equivalente a la dosis anterior, preferiblemente de 100 a 5000 mg/m2/semana o una dosis que proporcione una concentración en sangre equivalente, y más preferiblemente de 500 a 1500 mg/m2/semana o una dosis que proporcione una concentración en sangre equivalente.

Las composiciones o agentes de la presente invención pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables, como conservantes y estabilizantes. "Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que se puede administrar en combinación con los agentes anteriores. Tales materiales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, estabilizantes, excipientes, soluciones reguladoras, conservantes, detergentes, agentes quelantes (EDTA y similares) y aglutinantes.

En la presente invención, los detergentes incluyen detergentes no iónicos, y los ejemplos típicos de los mismos incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán tales como monocaprilato de sorbitán, monolaurato de sorbitán y monopalmitato de sorbitán; ésteres de ácidos grasos de glicerina tales como monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina y monoestearato de glicerina; ésteres de ácidos grasos de poliglicerina tales como monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo y monolinoleato de decaglicerilo; ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán tales como monolaurato de polioxietilensorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán, monopalmitato de polioxietilensorbitán, trioleato de polioxietilensorbitán y triestearato de polioxietilensorbitán; ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbit tales como tetra estearato de polioxietilen sorbit y tetraoleato de polioxietilen sorbit; ésteres de ácidos grasos de polioxietilenglicerina tales como monoestearato de polioxietilenglicerilo; ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol tales como diestearato de polietilenglicol; polioxietilen alquil éteres tales como polioxietilen lauril éter; polioxietilen polioxipropilen alquil éteres tales como polioxietilen polioxipropilen glicol, polioxietilen polioxipropilen propil éter y polioxietilen polioxipropilen cetil éter; éteres de polioxietilenalquilfenilo tales como polioxietilennonilfeniléter; aceites de ricino endurecidos con polioxietileno tales como aceite de ricino polioxietilenado y aceite de ricino endurecido con polioxietileno (aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno); derivados de cera de abejas de polioxietileno tales como cera de abejas de polioxietilen sorbit; derivados de polioxietilen lanolina tales como polioxietilen lanolina; y polioxietilenamidas de ácidos grasos y similares con un HLB de seis a 18, tal como amida del ácido polioxietilenesteárico.

Los detergentes también incluyen detergentes aniónicos, y ejemplos típicos de los mismos incluyen, por ejemplo, alquilsulfatos que tienen un grupo alquilo con diez a 18 átomos de carbono, tal como cetilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio y oleilsulfato de sodio; sulfatos de polioxietilen alquil éter en los que el grupo alquilo tiene de diez a 18 átomos de carbono y el número molar promedio de óxido de etileno agregado es de 2 a 4, tal como polioxietilen lauril sulfato de sodio; sales de éster de sulfosuccinato de alquilo que tienen un grupo alquilo de ocho a 18 átomos de carbono, tal como éster de lauril sulfosuccinato de sodio; detergentes naturales, por ejemplo, lecitina; glicerofosfolípidos; esfingofosfolípidos tales como esfingomielina; y ésteres de ácidos grasos de sacarosa en los que los ácidos grasos tienen de 12 a 18 átomos de carbono.

Se pueden combinar uno, dos o más de los detergentes descritos anteriormente y agregarse a las composiciones o agentes de la presente invención. Los detergentes que se usan preferiblemente en las preparaciones de la presente invención incluyen ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán, tales como polisorbatos 20, 40, 60 y 80. Los polisorbatos 20 y 80 son particularmente preferidos. También se prefieren polioxietilen polioxipropilenglicoles, tales como poloxámero (Pluronic F-68® y similares).

La cantidad de detergente agregado varía dependiendo del tipo de detergente usado. Cuando se usa polisorbato 20 u 80, la cantidad está en general en el intervalo de 0.001 a 100 mg/ml, preferiblemente en el intervalo de 0.003 a 50 mg/ml, más preferiblemente en el intervalo de 0.005 a 2 mg/ml.

En la presente invención, las soluciones reguladoras incluyen fosfato, solución reguladora citrato, ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido láctico, fosfato de potasio, ácido glucónico, ácido cáprico, ácido desoxicólico, ácido salicílico, trietanolamina, ácido fumárico, y otros ácidos orgánicos; y solución reguladora de ácido carbónico, solución reguladora Tris, solución reguladora de histidina y solución reguladora de imidazol.

Las preparaciones líquidas pueden formularse disolviendo los agentes en soluciones reguladoras acuosas conocidos en el campo de las preparaciones líquidas. La concentración de solución reguladora está en general en el intervalo de 1 a 500 mM, preferiblemente en el intervalo de 5 a 100 mM, más preferiblemente en el intervalo de 10 a 20 mM.

Las composiciones o agentes de la presente invención también pueden comprender otros polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina e inmunoglobulina; aminoácidos; azúcares y carbohidratos tales como polisacáridos y monosacáridos, alcoholes de azúcar y similares.

En este documento, los aminoácidos incluyen aminoácidos básicos, por ejemplo, arginina, lisina, histidina y ornitina, y sales inorgánicas de estos aminoácidos (preferiblemente sales de clorhidrato y sales de fosfato, a saber, aminoácidos de fosfato). Cuando se usan aminoácidos libres, el pH se ajusta a un valor preferido mediante la adición de sustancias reguladoras fisiológicamente aceptables adecuadas, por ejemplo, ácidos inorgánicos y, en particular, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético y ácido fórmico, y sales del mismo. En este caso, el uso de fosfato es particularmente beneficioso porque da productos liofilizados bastante estables. El fosfato es particularmente ventajoso cuando las preparaciones no contienen sustancialmente ácidos orgánicos, tales como ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico y ácido fumárico, o no contienen los aniones correspondientes (ion malato, ion tartrato, ion citrato, ion succinato, ion fumarato, y similares). Los aminoácidos preferidos son arginina, lisina, histidina y ornitina. También se pueden usar aminoácidos ácidos, por ejemplo, ácido glutámico y ácido aspártico, y sales de los mismos (preferiblemente sales de sodio); aminoácidos neutros, por ejemplo, isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina, cisteína y alanina; y aminoácidos aromáticos, por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano y su derivado, N-acetiltriptófano.

En este documento, los azúcares y carbohidratos tales como polisacáridos y monosacáridos incluyen, por ejemplo, dextrano, glucosa, fructosa, lactosa, xilosa, manosa, maltosa, sacarosa, trehalosa y rafinosa.

En este documento, los alcoholes de azúcar incluyen, por ejemplo, manitol, sorbitol e inositol.

Cuando las composiciones o agentes de la presente invención se preparan como soluciones acuosas para inyección, los agentes pueden mezclarse, por ejemplo, con solución salina fisiológica y/o solución isotónica que contiene glucosa u otros agentes auxiliares (tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). Las soluciones acuosas pueden usarse en combinación con agentes solubilizantes adecuados tales como alcoholes (etanol y similares), polialcoholes (propilenglicol, PEG y similares) o detergentes no iónicos (polisorbato 80 y HCO-50).

Las composiciones o agentes pueden comprender además, si se requiere, diluyentes, solubilizantes, ajustadores de pH, agentes calmantes, agentes reductores que contienen azufre, antioxidantes y similares.

En este documento, los agentes reductores que contienen azufre incluyen, por ejemplo, compuestos que comprenden grupos sulfhidrilo, tales como N-acetilcisteína, N-acetilhomocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiosorbitol, ácido tioglicólico y sales de los mismos, tiosulfato de sodio, glutatión y ácidos tioalcanoicos que tienen de uno a siete átomos de carbono.

Además, los antioxidantes en la presente invención incluyen, por ejemplo, ácido eritórbico, dibutilhidroxitolueno, butilhidroxianisol, a -tocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico y sales de los mismos, palmitato de ácido L-ascórbico, estearato de ácido L-ascórbico, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de sodio, galato de triamilo, galato de propilo y agentes quelantes tal como etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), pirofosfato de sodio y metafosfato de sodio.

Si se requiere, las composiciones o agentes pueden encapsularse en microcápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina, ácido poli[metilmetacrílico] o similares) o prepararse como sistemas de administración de fármacos coloidales (liposoma, microesferas de albúmina, microemulsión, nanopartículas, nanocápsulas, y similares) (véase "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980, y similares). Adicionalmente, también se conocen métodos para preparar composiciones o agentes como composiciones o agentes de liberación sostenida, y son aplicables a la presente invención (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919; Solicitud de la Patente Europea No. (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; y EP 133,988).

Los portadores farmacéuticamente aceptables usados se seleccionan apropiadamente de los descritos anteriormente o se combinan dependiendo del tipo de forma de dosificación, pero no se limitan a estos.

En este documento, el "sujeto" que se va a administrar con una composición o agente de la presente invención es un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

Las "partes del cuerpo de un organismo" no están particularmente limitadas; sin embargo, preferiblemente incluyen áreas afectadas por una enfermedad.

En este documento, "administrar" incluye administraciones orales y parenterales. La administración oral incluye la administración en forma de una preparación oral. Las preparaciones orales se pueden seleccionar de formas de dosificación tales como gránulos, polvos, comprimidos, cápsulas, soluciones, emulsiones o suspensiones.

La administración parenteral incluye la administración en forma de inyecciones. Las inyecciones incluyen inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares e inyecciones intraperitoneales. Alternativamente, los agentes de la presente invención se pueden administrar localmente en las áreas objetivo del tratamiento. Por ejemplo, los agentes también pueden administrarse mediante inyección local durante una cirugía o usando catéteres.

Cuando se practican los métodos de la presente invención junto con otros agentes (por ejemplo, otros agentes terapéuticos para células cancerosas o vacunas contra el cáncer), los agentes de la presente invención se pueden administrar como parte de una composición farmacéutica. En una realización, un agente de la presente invención y otro agente pueden administrarse sustancialmente al mismo tiempo.

Ejemplos

La presente invención se explicará en detalle con referencia a los ejemplos, pero no debe interpretarse como limitada a los mismos. Los expertos en la técnica pueden realizar fácilmente una variedad de alteraciones y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.

[Ejemplo de referencia 1] Efecto antitumoral del clorhidrato de gemcitabina (GEM) (1)

Se inoculó por vía intradérmica la línea celular de cáncer escamoso inducido por metilcolantreno CMC-1 (2 x 106 células) a ratones BALB/c, y desde el día 5 después de la inoculación, se administró por vía intraperitoneal GEM (Gemzar: clorhidrato de gemcitabina) a 120 mg/kg cada semana. El crecimiento tumoral se midió cada dos días para evaluar el efecto antitumoral de GEM. El resultado se muestra en la figura 1.

Se administró GEM a los ratones portadores de tumores 30 días después de la inoculación de CMC-1, y después de 48 horas se analizó el número absoluto de poblaciones celulares respectivas en el bazo mediante citometría de flujo. El resultado se muestra en la figura 2. Se administró por vía intraperitoneal ciclofosfamida (CY) (60 mg/kg), fluoro-5-uracilo (5-FU) (120 mg/kg) o GEM a ratones portadores de tumores 30 días después Inoculación de CMC-1. Después de 48 horas, las células CD8+ se aislaron del bazo y la capacidad de crecimiento después de 60 horas de estimulación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado (2 |ig/ml) se evaluó mediante la prueba de incorporación de 3H. El resultado se muestra en la figura 3.

Los resultados demuestran que GEM elimina las células inmunosupresoras y tiene un excelente efecto potenciador del crecimiento de las células T CD8+ en organismos portadores de tumores. Dicho efecto no se observó con CY o 5-FU. También se demostró que GEM tiene un efecto supresor del crecimiento tumoral.

[Ejemplo de referencia 2] Efecto antitumoral del clorhidrato de gemcitabina (GEM) (2)

Se inoculó CMC-1 (2 x 106) por vía intradérmica a ratones BALB/c. Desde el día 5 después de la inoculación, se administró GEM (120 mg/kg) por vía intraperitoneal cada semana y el anticuerpo anti-CD8 (250 |ig) se administró por vía intravenosa cada tres días. El diámetro del tumor se midió cada dos días. El resultado se muestra en la figura 4.

LLC-OVA (2 x 106) preparado introduciendo el gen de ovoalbúmina (OVA) en la línea celular de cáncer de pulmón de ratón LLC se inoculó por vía intradérmica a ratones C57BL6, y después de cinco días se administró por vía intraperitoneal GEM (120 mg/kg). Después de nueve días, los ganglios linfáticos regionales se recolectaron y evaluaron mediante citometría de flujo para determinar la proporción de células T citotóxicas CD8+ específicas de OVA. El resultado se muestra en la figura 5.

Los resultados demuestran que GEM produce el efecto antitumoral mediante la potenciación de la actividad de las células T CD8+.

[Ejemplo de referencia 3] Efecto antitumoral del anticuerpo anti-IL-6R (MR16-1) (1)

La línea celular de fibrosarcoma inducido por metilcolantreno CMC-G4 (2 x 106) se inoculó por vía intradérmica en ratones BALB/c y después de una y dos semanas se determinaron las concentraciones de IL-6 en suero mediante ELISA. El resultado se muestra en la figura 6. Después de la inoculación intradérmica de CMC-G4, el anticuerpo anti-IL-6R (MR16-1; Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928) (250 |ig) se administró por vía intravenosa cada tres días. Después de 28 días, las células de bazo se recogieron y se incubaron en presencia de un anticuerpo anti-CD3 (2 |ig/ml) o concanavalina A (ConA: 2.5 |ig/ml). Después de 36 horas de incubación, se determinaron por ELISA las concentraciones de IFN-y en los sobrenadantes del cultivo. El resultado se muestra en la figura 7. Además, se midió el diámetro del tumor cada dos días para evaluar el efecto supresor del crecimiento del tumor. El resultado se muestra en la figura 8.

Los resultados muestran que el anticuerpo anti-receptor de interleucina 6 tiene el efecto de potenciar la producción de IFN-y en organismos portadores de tumores. Este hallazgo demuestra que, al igual que con GEM, el anticuerpo anti­ receptor de IL-6 tiene un efecto excelente de potenciar la activación de células inmunocompetentes. También se demostró que el anticuerpo tiene un efecto supresor del crecimiento tumoral.

[Ejemplo 4] Efecto de la terapia combinada usando anticuerpo anti-IL-6R (MR16-1) y GEM

Se inoculó por vía intradérmica CMC-G4 (2 x 106 células) a ratones BALB/c, y desde el día 6 después de la inoculación se administró por vía intraperitoneal GEM (120 mg/kg) cada semana y el anticuerpo anti-receptor de IL-6 MR16-1 (200 |ig) se administró por vía intravenosa cada tres días. El diámetro del tumor se midió cada dos días. El resultado se muestra en la figura 9.

El resultado demuestra que el uso combinado de gemcitabina (GEM) y anticuerpo anti-receptor de IL-6 (MR16-1) produce un efecto antitumoral más excelente que cuando cada uno se administra solo.

Aplicabilidad Industrial

La presente invención demostró que la administración de un inhibidor de IL-6 y/o gemcitabina o una sal de la misma produce un excelente efecto potenciador de la respuesta de células T antitumorales en organismos portadores de tumores. Adicionalmente, se demostró que el efecto potenciador de la respuesta de las células T produce un excelente efecto antitumoral.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la potenciación de una respuesta de células T antitumorales en un organismo portador de tumores, que comprende un anticuerpo anti-receptor de interleucina 6 (IL-6) y comprende además gemcitabina o una sal de la misma, en la que dicho organismo portador de tumores es un mamífero, y en la que el tratamiento del cáncer da como resultado una reducción del volumen del tejido tumoral.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo anti-receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1 a 2, en la que la gemcitabina o una sal de la misma es clorhidrato de gemcitabina.

4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el mamífero es un ser humano.