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ES2930651T3 - Métodos y composiciones para la detección citométrica de células tumorales circulantes en una muestra - Google Patents

Métodos y composiciones para la detección citométrica de células tumorales circulantes en una muestra Download PDF

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ES2930651T3
ES2930651T3 ES12830820T ES12830820T ES2930651T3 ES 2930651 T3 ES2930651 T3 ES 2930651T3 ES 12830820 T ES12830820 T ES 12830820T ES 12830820 T ES12830820 T ES 12830820T ES 2930651 T3 ES2930651 T3 ES 2930651T3
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tumor cell
antibodies
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Hrair Kirakossian
Edward Goldberg
Diether Recktenwald
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Becton Dickinson and Co
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Becton Dickinson and Co
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Abstract

La presente divulgación proporciona métodos citométricos para la detección de células diana raras en una muestra. En ciertos aspectos, los métodos y las composiciones pueden facilitar la detección de células diana raras, como las células tumorales circulantes (CTC), en una muestra biológica como la sangre. Los aspectos de los métodos incluyen poner en contacto la muestra con el primer y segundo miembros de unión que se unen específicamente a un marcador de la célula diana rara, y analizar citométricamente la muestra para detectar la presencia de células que comprenden el primer y el segundo miembros de unión unidos para detectar la célula diana rara en la muestra. También se proporcionan sistemas, composiciones y kits para practicar los métodos en cuestión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para la detección citométrica de células tumorales circulantes en una muestra Introducción
La citometría de flujo es una herramienta bien aceptada en la investigación que permite al usuario analizar y clasificar rápidamente los componentes en un fluido de muestra. Los citómetros de flujo usan un fluido portador (por ejemplo, un fluido envolvente) para hacer pasar los componentes de la muestra, sustancialmente uno a la vez, a través de una zona de iluminación. Cada componente de la muestra se ilumina con una fuente de luz, como un láser, y la luz dispersada por cada componente de la muestra se detecta y analiza. Los componentes de la muestra se pueden separar en base a sus características ópticas y de otro tipo a medida que salen de la zona de iluminación. Las células tumorales circulantes (CTC) son células que se desprenden de los tumores que entran en el torrente sanguíneo de un sujeto. Una vez en la sangre, estas células pueden circular por el cuerpo del sujeto, donde pueden invadir otros tejidos y desarrollar nuevos tumores. Por lo tanto, las CTC se implican en la metástasis, que es la principal causa de muerte en sujetos con cáncer. Los esfuerzos para contar las cTc se obstaculizan por el hecho de que las CTC son extremadamente difíciles de detectar: son excepcionalmente raras y pueden ser difíciles de distinguir de las células sanas. Los enfoques existentes para detectar CTC tienen limitaciones en cuanto a sensibilidad y/o especificidad, lo que trae consigo que muchas células sanas se caractericen erróneamente como cancerígenas y muchas células cancerígenas se pasen por alto en el análisis.
MASASHI TAKAO Y OTROS: "Enumeration, characterization, and collection of intact circulating tumor cells by cross contamination-free flow cytometrie", CYTOMETRY, ALAN LISS, NEW YORK, US, vol. 79A, núm. 2, 1 de febrero de 2011 (01-02-2011), páginas 107-117 divulga un método para detectar CC en la circulación sanguínea.
Resumen
La presente invención se refiere a un método para detectar una célula tumoral circulante en una muestra de sangre, como se define en las reivindicaciones. La presente invención también se refiere a una muestra de sangre, un sistema citométrico y a un kit, como se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La invención se puede entender mejor a partir de las siguientes descripciones detalladas cuando se leen junto con las figuras acompañantes. En las figuras se incluyen los siguientes gráficos:
Figura 1 es una descripción gráfica de un método de acuerdo con la presente divulgación. En este ejemplo particular, las células diana raras (que se etiquetan como "Células tumorales") se marcan con citoqueratina (CK)-Roja y CK-Verde, mientras que las células no raras (aquí, glóbulos blancos o WBC) no se marcan. Las células fluyen hacia abajo en un citómetro de flujo, como muestran las flechas que indican el flujo. La luz de excitación ("Ex-luz") se aplica para provocar la fluorescencia de la CK-Roja y/o CK-Verde. La combinación de luz de fluorescencia de dos colores, donde cada marcador es un fluorocromo, se usa como umbral en el ensayo de citometría de flujo. Un gráfico de densidad que resulta de la fluorescencia de la CK-Roja (eje y) frente a la fluorescencia de la CK-Verde (eje x), muestra el número de células tumorales detectadas por el instrumento. Figura 2, los Paneles A-B muestran los espectros de emisión para los marcadores isotiocianato de fluoresceína (FITC; Panel A) y Alexa Fluor 647 (Panel B). La línea de excitación del láser para cada uno se indica mediante una flecha.
Figura 3 es un diagrama de flujo de un procedimiento de ensayo de la presente divulgación. Una muestra de 7,5 ml se centrifuga en un tubo BD Vacutainer CPT para separar la porción de WBC, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, la fracción de WBC se fija, permeabiliza, tiñe y analiza a través de un FACS, tal como un citómetro de flujo FACSCanto™ de BD Biosciences.
Figura 4, los Paneles A-D son gráficos de densidad que muestran el incremento y análisis de varias concentraciones de células tumorales HT-29 de la sangre en presencia de WBC. Panel A: muestras de sangre de 0,5 ml que contenían 10 000 células HT-29/ml que se sometieron a lisis de glóbulos rojos, fijación y centrifugación. La fracción de WBC se eliminó y permeabilizó. Se añadió CK-FITC y CK-Alexa647 por 60 m. La muestra se analizó mediante el uso de un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™. Panel B: Las células HT-29 se encontraban a una concentración inicial de 1000 células HT-29/ml. Panel C: las células HT-29 se encontraban a una concentración inicial de 100 células HT-29/ml. Panel D: las células HT-29 se encontraban a una concentración inicial de 0 células HT-29/ml.
Figura 5, los Paneles A-C son gráficos de densidad que muestran el incremento y análisis de células tumorales HT-29 de la sangre en presencia de WBC. Las muestras de sangre se lisaron con solución de lisis BD FACS 1X para lisar los glóbulos rojos de la muestra. Las muestras se permeabilizaron con solución de permeabilización 2 BD FACS 1X, se lavaron y luego se tiñeron intracelularmente con conjugados de CK Ab-FITC y CK Ab-A647 en 0,55 ml de volumen de Rx, y se contaron 0,36 ml de esta mezcla, sin más lavados, a una velocidad de flujo medio (36 pl/min) en un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Panel A: Recuentos positivos, mediante el uso de 7,5 ml de sangre y una concentración de 10000 células HT-29/ml. El gráfico muestra 1 minuto de conteo. Panel B: Recuentos negativos, mediante el uso de 7,5 ml de sangre y una concentración de 0 células HT-29/ml. El gráfico muestra 10 minutos de conteo. Panel C: Solo tampón, 15 minutos de conteo. Acumulativamente, los Paneles A-C muestran que se observó una célula tumoral HT-29 en el fondo de 34363636 WBC y no se registró ningún punto falso positivo para "Solo tampón" durante los 15 minutos de análisis.
Figura 6, los Paneles A-C muestran la eficiencia de discriminación de los métodos de la presente divulgación. Las muestras que contenían WBC y células tumorales HT-29 se prepararon como se describe en la presente descripción y se marcaron con CK-APC y CK-FITC. Paneles A y B: gráficos típicos de densidad de un color que muestran s Sc frente a APC (Panel A) y FITC (Panel B). Las células tumorales HT-29 se representan con puntos más oscuros en los gráficos y no se pudieron detectar fácilmente en eventos no específicos. Panel C: la medición tanto de APC como de FITC en las muestras proporciona un gráfico de puntos descendentes en una diagonal estrecha, y las células tumorales se identifican fácilmente.
Figura 7, los Paneles A-C muestran las muestras negativas de las muestras de la Figura 6. No se encontraron células tumorales HT-29 en estas muestras. Paneles A y B: gráficos de densidad de un color que muestran SSC frente a APC (Panel A) y FITC (Panel B) que revelaron muchos falsos positivos. Panel C: no se observaron eventos falsos positivos.
Figura 8, los Paneles A-C muestran imágenes de células tumorales HT-29 en las muestras, mediante el uso de varias concentraciones iniciales. Las muestras que contenían WBC y células HT-29 se tiñeron con CK-FITC y CK-PE. Las células HT-29 se encontraban en concentraciones de 5000 células/ml (Panel A), 500 células/ml (Panel B) o 0,0 células/ml (Panel C). Se observaron eventos en el canal PE incluso a concentraciones de células HT-29 de 0,0 células/ml (Panel C).
Figura 9, los Paneles A-B muestran el protocolo de ensayo y las imágenes de células tumorales de la sangre HT-29 en presencia de WBC. Panel A: procedimiento de ensayo para obtener imágenes de células. Las muestras se prepararon como se describió anteriormente en la Figura 5, y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio ZEISS mediante el uso de una lámpara de arco de mercurio. Panel B: De izquierda a derecha: imágenes de una célula que contiene CK-FITC (canal FITC), una célula que contiene CK-Alexa647 (canal APC) y una superposición de imágenes, respectivamente. Todas las figuras representan 100 imágenes.
Figura 10 muestra gráficos que comparan técnicas de preparación de muestras. Los gráficos que se etiquetan como "Lisis" implican el procesamiento de células tumorales HT-29 en la sangre mediante el uso de lisis y centrifugación. Los gráficos que se etiquetan como "CPT" implican el procesamiento mediante el uso de tubos BD Vacutainer CPT.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona un método para la detección de una célula tumoral circulante en una muestra de sangre. También se proporcionan sistemas, y un kit para practicar los métodos en cuestión.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado, se incluye dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir de forma independiente en los intervalos más pequeños y también se incluyen dentro de la invención, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo declarado. Cuando el intervalo que se declara incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de estos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado como comúnmente se entiende por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción también se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.
Se observa que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como "únicamente", "solo", y similares en relación con la exposición de elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa".
Métodos
Como se describió anteriormente, la presente divulgación proporciona métodos citométricos para la detección de células tumorales circulantes en una muestra de sangre. El término "métodos citométricos" se usa en la presente descripción para describir métodos citométricos de flujo y/o métodos citométricos de imagen. En consecuencia, "ensayo de citometría" se puede referir a un ensayo de citometría de flujo y/o un ensayo de citometría de imagen, y "citómetro" se puede referir a un citómetro de flujo y/o un citómetro de imagen.
En algunas modalidades, los métodos de la invención para detectar una célula diana rara en una muestra son cualitativos, donde la detección de la célula tumoral circulante es cualitativa, por ejemplo, se determina que la célula diana está presente o no en la muestra de sangre. En algunas modalidades, los métodos de la invención para detectar una célula tumoral circulante en una muestra son cuantitativos, donde la detección de la célula diana rara es cuantitativa. Los métodos pueden incluir la determinación de una medida cuantitativa del número de células diana raras en una muestra de sangre. En algunas modalidades, cuantificar el número de células diana raras en una muestra de sangre incluye determinar si el número de células diana raras presentes está por encima o por debajo de un umbral predeterminado.
Varias etapas y aspectos de los métodos se describirán ahora con mayor detalle más abajo.
Células diana raras
Como se usa en la presente descripción, el término "células diana raras" se usa para referirse a cualquier tipo de célula presente en una muestra, donde el número de células de ese tipo es inferior al 50,0 % del número total de células de la muestra, por ejemplo, menos que el 40 %, menos que el 30 %, menos que el 20 %, menos que el 10 %, menos que el 1 %, menos que el 0,1 %, menos que el 0,01 % o menos que el 0,001 %. En ciertos aspectos, en la muestra celular las células no raras superan en número a las células diana raras por un factor de 104 o más, tales como 105 o más, que incluye 106 o más, 107 o más, 108 o más, o 109 o más. Los tipos de células diana raras de interés incluyen, pero no se limitan, células procariotas (por ejemplo, células bacterianas o células de arqueas) y células eucariotas (por ejemplo, células de mamíferos, tales como células nerviosas, células musculares, células epiteliales (por ejemplo, células tumorales circulantes), células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas), linfocitos raros (por ejemplo, linfocitos T reguladores), células de adipocitos y similares).
El término "células no raras" se puede usar para referirse a aquellas células de una muestra que no son células diana raras. Las células no raras pueden ser de cualquier tipo, que incluyen, pero no se limitan, células procariotas (por ejemplo, células bacterianas o células de arqueas) y células eucariotas (por ejemplo, células de mamíferos, tales como células nerviosas, glóbulos blancos, células musculares, células epiteliales, células de adipocitos y similares). En ciertos aspectos de los métodos en cuestión, las células no raras no se marcan y/o tiñen específicamente antes del análisis citométrico. Por ejemplo, en ciertos aspectos, las células no raras no se tiñen con CD45. En ciertos aspectos, las células no raras se pueden marcar sustancialmente menos que las células raras (por ejemplo, debido a la unión no específica). En ciertos aspectos de este tipo, las células raras se pueden distinguir de las células no raras que se marcan sustancialmente menos mediante análisis citométrico.
Muestras
El término "muestra de sangre", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier muestra de sangre que contenga una o más células individuales en una suspensión a cualquier concentración deseada. Por ejemplo, la muestra de sangre puede contener 1011 o menos, 1010 o menos, 109 o menos, 108 o menos, 107 o menos, 106 o menos, 105 o menos, 104 o menos, 103 o menos, 500 o menos, 100 o menos, 10 o menos, o una célula por mililitro. La muestra de sangre puede contener un número conocido de células o un número desconocido de células. Las células adecuadas incluyen células eucariotas (por ejemplo, células de mamífero) y/o células procariotas (por ejemplo, células bacterianas o células de arqueas).
En la práctica de los métodos de la invención, la muestra de sangre se puede obtener a partir de una fuente in vitro (por ejemplo, una suspensión de células desarrolladas en un cultivo de laboratorio) o a partir de una fuente in vivo (por ejemplo, un sujeto mamífero, un sujeto humano, etc.). En algunas modalidades, la muestra de sangre se obtiene a partir de una fuente in vitro.
En algunas modalidades, la muestra de sangre se obtiene a partir de una fuente in vivo. Las fuentes in vivo incluyen organismos multicelulares vivos y pueden producir muestras celulares de diagnóstico o no diagnóstico.
En ciertas modalidades, la fuente de la muestra de sangre es un "mamífero", donde este término se usa ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase de mamíferos, que incluyen los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas), y primates (por ejemplo, humanos, chimpancés y monos). En algunos casos, los sujetos son humanos. Los métodos se pueden aplicar a muestras que se obtienen a partir de sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, neonatos, infantes, jóvenes, adolescentes, adultos), donde en ciertas modalidades el sujeto humano es un joven, adolescente o adulto. Mientras la presente invención se puede aplicar a muestras de un sujeto humano, se debe entender que los métodos también se pueden llevar a cabo en muestras de otros sujetos animales (eso es, en "sujetos no humanos") tales como, pero no se limitan, aves, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.
Las muestras de sangre que se usan en los presentes métodos se pueden obtener mediante cualquier método conveniente. En ciertos aspectos, la muestra de sangre se obtiene a través de venopunción. La sangre se puede obtener de un sujeto y manipularse antes del análisis citométrico. Los métodos de obtención y manipulación de muestras para el análisis citométrico se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, en ciertos aspectos, las muestras se pueden manipular mediante el uso de un ensayo como se presenta en la Figura 3. En este ejemplo, se obtiene una muestra de sangre por venopunción de un sujeto siguiendo los protocolos estándar de venopunción. La muestra celular se recolecta en un tubo BD Vacutainer® CPT, y se manipula de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tubo se centrifuga aproximadamente a temperatura ambiente (de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 25 °C) durante 20 minutos o más, a una fuerza centrífuga relativa de aproximadamente 1500 a aproximadamente 1800. Después de la centrifugación, la capa de células mononucleares y la capa de plaquetas se recolectan y resuspenden. Esta fracción se puede fijar y/o permeabilizar mediante el uso de cualquier protocolo conveniente, tal como mediante el uso de los reactivos disponibles comercialmente tales como la solución de permeabilización 2 BD FACS.
Elementos de unión
El término "elemento de unión", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier agente (por ejemplo, una proteína, una molécula pequeña y similares) que se une específicamente a un marcador de la célula tumoral diana. Los términos "unión específica", "se une específicamente" y similares, se refieren a la unión preferencial a una molécula en relación con otras moléculas o fragmentos en una solución o mezcla de reacción. En algunas modalidades, la afinidad entre el elemento de unión y el marcador de la célula tumoral a la que se une específicamente cuando se unen específicamente entre sí en un complejo de unión se caracteriza por una Kd (constante de disociación) de 10-6 M o menos, tales como 10-7 M o menos, que incluyen 10-8 M o menos, por ejemplo, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, que incluye 10-15 M o menos. "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, donde una mayor afinidad de unión se correlaciona con una Kd más baja.
En ciertos aspectos de la invención, una muestra de sangre se puede poner en contacto con más de dos elementos de unión que se unen específicamente a un marcador de la célula diana rara, por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, que incluyen aproximadamente de 10 a 15, o aproximadamente de 15 o más.
Los elementos de unión se unen específicamente a un marcador de citoqueratina de la célula tumoral.
En algunas modalidades, un elemento de unión incluye un marcador o un elemento de unión marcado. Como se usa en la presente descripción, los términos "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una molécula con capacidad de detección, que incluye, pero no se limita, isótopos radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, cromóforos, colorantes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina o haptenos), colorantes intercalantes y similares. El término "fluorescente" se refiere a una sustancia o una porción de esta que es capaz de exhibir fluorescencia en un intervalo detectable.
Los marcadores de interés incluyen marcadores detectables tanto directa como indirectamente. Los marcadores adecuados para usar en los métodos que se describen en la presente descripción incluyen cualquier molécula que sea directa o indirectamente detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, químicos u otros. Los marcadores de interés incluyen, pero no se limitan, fluoresceína y sus derivados; rodamina y sus derivados; cianina y sus derivados; cumarina y sus derivados; Cascade Blue y sus derivados; amarillo Lucifer y sus derivados; BODIPY y sus derivados; y similares. Los marcadores de interés también incluyen fluoróforos, tales como indocarbocianina (C3), indodicarbocianina (C5); Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; Texas Red; Pacific Blue; Oregon Green 488; Alexa fluor-355; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor-555; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 660; Alexa Fluor 680; Alexa Fluor 700; JOE; Lisamina; Verde Rodamina; BODIPY; isotiocianato de fluoresceína (FITC); carboxifluoresceína (FAM); ficoeritrina; rodamina; diclororrodamina (dRodamina); carboxitetrametilrodamina (TAMRA); carboxi-X-rodamina (ROX); LIZ; VIC; NED; PET; SYBR; PicoGreen; RiboGreen y similares.
Los marcadores fluorescentes se pueden detectar mediante el uso de un fotodetector (por ejemplo, en un citómetro de flujo) para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos generalmente se detectan por proporcionar a la enzima un sustrato y detectar el producto de la reacción que se produjo mediante la acción de la enzima sobre el sustrato, los marcadores colorimétricos se pueden detectar simplemente al visualizar el marcador que se colorea, y los marcadores antigénicos se pueden detectar al proporcionar un anticuerpo (o un fragmento de unión del mismo) que se une específicamente al marcador antigénico. Un anticuerpo que se une específicamente a un marcador antigénico se puede detectar directa o indirectamente. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar a un fragmento marcador (por ejemplo, un fluoróforo) que proporciona la señal (por ejemplo, fluorescencia); el anticuerpo se puede conjugar con una enzima (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.) que produce un producto detectable (por ejemplo, un producto fluorescente) cuando se le proporciona un sustrato apropiado (por ejemplo, tiramida fluorescente, FastRed, etc.); etc.
Los elementos de unión de los métodos se pueden marcar con diferentes marcadores. En ciertos aspectos, los marcadores se seleccionan de modo que los marcadores se puedan distinguir entre sí, tal como donde los espectros de emisión de un primer marcador y un segundo marcador no se superponen sustancialmente. Por ejemplo, en la Figura 2, los Paneles A-B muestran los espectros de emisión de dos marcadores que no se superponen sustancialmente, isotiocianato de fluoresceína (FITC; Panel A) y Alexa Fluor 647 (Panel B). El FITC se puede excitar mediante el uso de una luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 488 nm, y su espectro de emisión se puede detectar mediante el uso de un filtro (por ejemplo, un filtro 530/30) que no se superpone sustancialmente con el espectro de emisión de Alexa Fluor 647. El uso de dos marcadores diferentes que tienen espectros de emisión detectables que no se superponen, permite que los resultados del ensayo de citometría de flujo se representen como un gráfico de densidad de fluorescencia del primer marcador en el eje y frente a la fluorescencia del segundo marcador en el eje x (Véase, por ejemplo, la Figura 1).
En ciertos aspectos, los elementos de unión pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de estos. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos o inmunoglobulinas de cualquier isotipo, fragmentos de anticuerpos que conservan la unión específica al antígeno, que incluyen, pero no se limitan, fragmentos Fab, Fv, scFv y Fd, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios y proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno de un anticuerpo y una proteína que no es anticuerpo. Los anticuerpos se pueden conjugar además con otros fragmentos, tales como elementos de pares de unión específica, por ejemplo, biotina (elemento del par de unión específica biotina-avidina), y similares. El término también abarca Fab', Fv, F(ab')2 y otros fragmentos de anticuerpos que retienen la unión específica al antígeno, y anticuerpos monoclonales.
Las muestras de sangre se pueden poner en contacto con al menos dos elementos de unión específicos para el marcador de citoqueratina de la célula tumoral. Cuando los elementos de unión son anticuerpos, el marcador de la célula diana rara puede comprender por lo tanto uno o más antígenos que se unen a los anticuerpos. Un "antígeno" es un término que se entiende bien en la técnica e incluye cualquier sustancia que se pueda unir específicamente a un sitio de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo o a un receptor de linfocitos T. Por "epítopo" se entiende un sitio en un antígeno al que responden linfocitos B y/o linfocitos T específicos. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. En ciertos aspectos, los anticuerpos (por ejemplo, el primer elemento de unión, el segundo elemento de unión, el tercer elemento de unión, etc.) se unen al mismo epítopo. En otros aspectos, los anticuerpos se unen a diferentes epítopos.
Cuando el marcador es una citoqueratina, los elementos de unión de interés incluyen, pero no se limitan, los anticuerpos comercialmente disponibles que se producen por el clon CAM5.2 reaccionan principalmente con la citoqueratina 7 y la citoqueratina 8 humana (BD Biosciences); los anticuerpos que se producen por el clon KA4 reaccionan principalmente con las citoqueratinas humanas 14, 15, 16 y 19 (BD Biosciences); los anticuerpos que se producen por el clon RCK102 reaccionan principalmente con las citoqueratinas 5 y 8 de humano, ratón, rata, hámster, cerdo, perro y/o conejo, como se describe en Lodish, y otros MCB, 2000, 795-847; los anticuerpos que se producen por el clon RCK105 reaccionan principalmente con la citoqueratina 7 de humano, ratón, rata, hámster, cerdo y/o perro, como se describe en Lodish, y otros (anteriormente); los anticuerpos que se producen por el clon AE1/AE3 (Millipore); los anticuerpos que se producen por el clon C-11, como se describe en Mikaelian, y otros (2004) Toxicol Pathol, 32: 181-191; los anticuerpos que se producen por el clon Lds103, como se describe en Southgate, y otros 1987 Lab. Invest., 56:211-223; y los anticuerpos que se producen por el clon CK2, como se describe en Watcher, y otros (1990) J. Hepatol., 11:232-239.
Análisis citométrico
Los métodos de la presente divulgación pueden implicar el análisis de la muestra mediante citometría de flujo. Los procedimientos de los ensayos de citometría de flujo se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Ormerod (ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997); Jaroszeski y otros (eds), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology No. 91, Humana Press (1997); Practical Flow Cytometry, 3rd ed., Wiley-Liss (1995); Virgo, y otros (2012) Ann Clin Biochem. Jan;49(pt 1):17-28; Linden y otros, Semin Throm Hemost. 2004 Oct;30(5): 502-11; Alison, y otros J Pathol, 2010 Dec; 222(4):335-344; y Herbig, y otros (2007) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 24(3):203-255. En ciertos aspectos, el ensayo de citometría de flujo de la muestra implica el uso de un citómetro de flujo capaz de excitaciones y detecciones simultáneas de múltiples fluoróforos, tales como un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™, que se usa sustancialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de la presente divulgación pueden implicar citometría de imágenes, tal como se describe en Holden y otros (2005) Nature Methods 2:773 y Valet, y otros 2004 Cytometry 59:167-171.
En ciertos aspectos de los métodos, el ensayo de citometría comprende dispersión de luz frontal (FSC) y/o dispersión de luz lateral (SSC). En otros aspectos, el ensayo de citometría comprende la detección tanto del marcador del primer elemento de unión como el marcador del segundo de unión (Figura 4, Paneles A-D y Figura 5, Paneles A-C), donde en lugar de luz dispersa, la combinación de los marcadores (por ejemplo, la combinación de luz de fluorescencia de dos colores, donde cada marcador es un fluorocromo) se usa como umbral en el ensayo. En tales aspectos, la identificación de una célula diana rara en la muestra puede requerir la detección tanto del primer marcador como del segundo marcador. En ciertos aspectos, la identificación de una célula diana rara en la muestra puede requerir la detección de más de dos marcadores (por ejemplo, un tercer elemento de unión, un cuarto elemento de unión, etc.).
En ciertos aspectos, las células no raras se pueden separar de una muestra antes del análisis citométrico. Cualquier medio conveniente se puede emplear para eliminar células no raras de una muestra. Los métodos de separación de interés incluyen, pero no se limitan, técnicas de separación magnética, tales como las que se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 5,945,281, 6,858,440; 6,645,777; 6,630,355; y 6,254,830; solicitud de patente de Estados Unidos núm. PCT/US2012/032423; y Hoeppener, y otros (2012) Recent Results Cancer Res. 195:43-58. Los métodos de separación de interés incluyen además aquellos que comprenden concentradores o separadores acústicos, tales como los que se describen en patente de Estados Unidos núm. 6,929,750.
El análisis citométrico puede comprender una clasificación. Las células que se identifican en la muestra como células diana raras se pueden clasificar y analizar posteriormente mediante cualquier técnica de análisis conveniente. Las técnicas de análisis posteriores de interés incluyen, pero no se limitan, secuenciación; un ensayo por CellSearch, como se describe en Food and Drug Administration (2004) Final rule. Fed Regist 69: 26036-26038; un ensayo por CTC Chip, como se describe en Nagrath, y otros (2007) Nature 450: 1235-1239; un ensayo por MagSweeper, como se describe en Talasaz, y otros (2009). Proc Natl Acad Sci USA 106: 3970-3975; y un ensayo por sustratos nanoestructurados, como se describe en Wang S y otros (2011) Angew Chem Int Ed Engl 50: 3084­ 3088. Cuando se desee, el protocolo de clasificación puede incluir la distinción de las células raras viables y muertas, donde cualquier protocolo de tinción conveniente para identificar tales células se pueda incorporar a los métodos.
Sistemas
También se proporcionan sistemas citométricos para practicar los métodos en cuestión. Los sistemas citométricos pueden incluir un subsistema fluídico de muestra citométrica, como se describe más abajo. Además, los sistemas citométricos incluyen un citómetro acoplado por fluido al subsistema fluídico de muestra citométrica. Los sistemas de la presente divulgación pueden incluir varios componentes adicionales, tales como dispositivos de salida de datos, por ejemplo, monitores, impresoras y/o altavoces, dispositivos de entrada de datos, por ejemplo, puertos de interfaz, un ratón, un teclado, etc., componentes de manejo de fluidos, fuentes de energía, etc.
En ciertos aspectos, un sistema citométrico incluye un subsistema fluídico de muestra citométrica que se configura para poner en contacto una muestra de sangre que comprende una célula diana rara con un primer y segundo elementos de unión que se unen específicamente a un marcador de la célula diana rara. El subsistema se puede configurar además de manera tal que no se marquen y/o tiñan específicamente las células no raras de la muestra (por ejemplo, no se tiñan con CD45). Los sistemas pueden incluir un citómetro acoplado por fluido al subsistema fluídico de muestra citométrica.
En otros aspectos, los sistemas pueden incluir un subsistema fluídico de muestra citométrica que se configura para poner en contacto una muestra que comprende una célula diana rara con un primer y segundo elementos de unión que se unen específicamente a un marcador de la célula diana rara; y un citómetro de flujo acoplado por fluido al subsistema fluídico de muestra citométrica de flujo, el citómetro se configura para analizar la muestra para detectar la presencia de células que comprenden un primer y segundo elementos de unión unidos para detectar la célula diana rara en la muestra. En ciertos aspectos, el citómetro se configura para usar la combinación de fluorescencia de un primer marcador unido al primer elemento de unión y un segundo marcador unido al segundo elemento de unión como un umbral de detección.
Kits
También se proporcionan kits para practicar una o más modalidades de los métodos que se describieron anteriormente. Los kits en cuestión pueden incluir varios componentes y reactivos. En algunos casos, los kits incluyen al menos los reactivos que encuentran uso en los métodos (por ejemplo, como se describió anteriormente); y un medio legible por ordenador que tiene un programa de ordenador almacenado en el mismo, en donde el programa de ordenador, cuando se carga en un ordenador, hace funcionar el ordenador para realizar un ensayo de citometría como se describe en la presente descripción; y un sustrato físico que tiene una dirección desde la cual obtener el programa de ordenador.
Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos. Estas instrucciones se pueden presentar en los kits en cuestión en una variedad de formas, una o más de las cuales se pueden presentar en el kit. Una forma en la cual estas instrucciones se pueden presentar es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja u hojas de papel en las cuales se imprime la información, en el empaque del kit, en un prospecto, etc. Aún otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, CD, DVD, Blu-Ray, memoria flash, etc., en el cual se graba la información. Aún otro medio que se puede presentar es una dirección de sitio web la cual se puede usar a través de Internet para acceder a la información en un sitio que se elimina. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Ejemplos
Como se puede apreciar a partir de la divulgación proporcionada anteriormente, la presente divulgación tiene una amplia variedad de aplicaciones. En consecuencia, los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos que se realizan. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que se podrían cambiar o modificar para producir resultados esencialmente similares. Por lo tanto, los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos que se realizan. Se hacen esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números que se usan (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.
Materiales y métodos
Los siguientes son materiales y protocolos generales que se usaron en los Ejemplos más abajo.
Los anticuerpos anticitoqueratina purificados se obtuvieron de BD (Franklin Lakes, New Jersey). Los anticuerpos se separaron en dos poblaciones, y se produjeron dos poblaciones de anticuerpos anticitoqueratina conjugados con fluorocromo mediante la conjugación de los fluorocromos FITC o Alexa Fluor 647 con los anticuerpos de una población, respectivamente. Las células de adenocarcinoma de colon HT-29 se obtuvieron a partir de una colección ATCC (ATCC HTB 38).
Las muestras de sangre se lisaron mediante el uso de solución de lisis BD FACS 1X. Las muestras se permeabilizaron mediante el uso de solución de permeabilización 2 BD FACS 1X. Todos los ensayos de citometría de flujo se realizaron mediante el uso de un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™. Todos los reactivos y materiales se usaron siguiendo los protocolos del fabricante.
Ejemplo 1: detección de células tumorales en muestras de sangre
La sangre venosa de donantes normales se recolectó en tubos BD Vacutainer con heparina sódica. Las células tumorales HT-29 se añadieron a las muestras de sangre en concentraciones de (i) 10000 células HT-29/ml; (ii) 1000 células HT-29/ml; (iii) 100 células HT-29/ml; o (iv) 0 células HT-29/ml. Para cada una de las cuatro muestras, se extrajo 7,5 ml y se centrifugó en un tubo BD Vacutainer CPT para separar la porción de WBC. La técnica de preparación de las muestras de CPT fue comparable a un protocolo que implica lisis y centrifugación (Figura 10). La fracción de WBC posteriormente se fijó, permeabilizó, tiñó con CK-FITc y CK-Alexa647 durante 60 m, y se analizó a través de FACS (Figura 3).
Los gráficos de densidad resultantes (Figura 4, Paneles A-D) del canal APC (eje y) frente al canal FITC (eje x) mostraron una población de células en las muestras donde las células tumorales HT-29 tenían concentraciones iniciales de (i) 10000 células HT-29/ml (Panel A); (ii) 1000 células HT-29/ml (Panel B); y (iii) 100 células HT-29/ml (Panel C). El número de células que se observó en cada gráfico disminuyó en proporción a la concentración inicial de las células tumorales HT-29. No se observaron células en donde la concentración inicial de células tumorales HT-29 era de 0 células/ml (Panel D).
Las células tumorales HT-29 se pudieron detectar incluso cuando el fondo de WBC era alto (Figura 5, Paneles A-C). Las muestras de sangre (7,5 ml) que contenían células HT-29 a una concentración de 10000 células/ml se lisaron con una solución de lisis FACS 1X, se permeabilizaron con solución de permeabilización 2 BD FACS 1X, se lavaron y luego se tiñeron con conjugados CK Ab-FITC y CK Ab-A647 en 0,55 ml de volumen de Rx y se contaron 0,36 ml de esta mezcla, sin más lavados, a una velocidad de flujo medio (36 pl/min) en un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™. Una célula tumoral HT-29 se observó en el fondo de 34363636 WBC (Paneles A-B) y no se registró ningún punto falso positivo para "Solo tampón" durante los 15 minutos de análisis (Panel C).
Se mejoró la discriminación de eventos falsos positivos de las células HT-29 al requerir la detección de al menos un primer y segundo elementos de unión. Por ejemplo, las células tumorales HT-29 no se pudieron detectar fácilmente a partir de eventos no específicos cuando se observó la unión de un solo elemento de unión (Figura 6, Paneles A-B; Figura 7, Paneles A-B). Requerir la detección de un primer y segundo elementos de unión proporcionó un gráfico de puntos descendentes en una diagonal estrecha y una fácil identificación de las células HT-29 (Figura 6, Panel C), mientras que también se eliminaron los eventos falsos positivos (Figura 7, Panel C).
Las imágenes revelaron además que se pueden observar muchos eventos falsos positivos con la medición de solo un elemento de unión. Por ejemplo, en la Figura 8, los paneles A-C muestran imágenes de las células tumorales HT-29 a varias concentraciones iniciales. Las muestras que contenían WBC y células tumorales HT-29 se tiñeron con CK-FITC y CK-PE. Las células HT-29 se encontraban en concentraciones de 5000 células/ml (Panel A), 500 células/ml (Panel B) o 0,0 células/ml (Panel C). Se observaron eventos en el canal PE incluso a concentraciones de células HT-29 de 0,0 células/ml (Panel C).
También se obtuvieron imágenes de células individuales, mediante el uso de un microscopio ZEISS y una lámpara de arco de mercurio (Figura 9, Paneles A-B). Las muestras se prepararon como se describió anteriormente y se tomaron imágenes de las células individuales mediante el uso de un microscopio ZEISS mediante el uso de una lámpara de arco de mercurio. Las imágenes que se tomaron del canal FITC revelaron la presencia de CK-FITC en células individuales, el canal APC reveló la presencia de CK-Alexa647 en las células individuales y mostró la superposición tanto de CK-FITC como de CK-Alexa647 presente en la célula (imagen derecha, Panel B). Se tomaron 100 imágenes de cada muestra.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una célula tumoral circulante en una muestra de sangre, el método comprende:
poner en contacto la muestra con un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al mismo epítopo de un marcador de la célula tumoral circulante, en donde el marcador es citoqueratina, y
analizar por citometría la muestra para detectar la presencia de células que comprenden un primer y segundo anticuerpos unidos, o fragmentos de unión a antígeno de estos, para detectar la célula tumoral circulante en la muestra.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer y segundo anticuerpos marcados, o fragmentos de unión a antígeno de estos, se detectan directa o indirectamente.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células tumorales no circulantes en la muestra no se marcan.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende permeabilizar células nucleadas en la muestra con un agente permeabilizante.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra de sangre se obtiene de un humano.
6. Una muestra de sangre celular que comprende:
una célula tumoral circulante que comprende un marcador que tiene un epítopo; y
un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al mismo epítopo de la célula tumoral circulante.
7. Un sistema citométrico que comprende:
un subsistema fluídico de muestra citométrica que se configura para poner en contacto una muestra que comprende una célula tumoral circulante con un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al mismo epítopo de la célula tumoral circulante, en donde las células no circulantes de la muestra no se marcan; un citómetro acoplado por fluido al subsistema fluídico de muestra citométrica;
una muestra de sangre sospechosa de tener una célula tumoral circulante que comprende un marcador que tiene un epítopo y un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno estos que se unen específicamente al mismo epítopo de la célula tumoral circulante.
8. Un sistema citométrico que comprende:
un subsistema fluídico de muestra citométrica que se configura para poner en contacto una muestra que comprende una célula tumoral circulante con un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al mismo epítopo de la célula tumoral circulante;
un citómetro acoplado por fluido al subsistema fluídico de muestra citométrica, el citómetro se configura para analizar la muestra para detectar la presencia de células que comprenden un primer y segundo anticuerpos unidos, o fragmentos de unión a antígeno de estos, para detectar la célula tumoral circulante en la muestra; una muestra de sangre sospechosa de comprender una célula tumoral circulante que comprende un marcador que tiene un epítopo;
y un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al mismo epítopo de la célula tumoral circulante.
9. Un kit para identificar una célula tumoral circulante en una muestra de sangre, el kit comprende:
un primer y segundo anticuerpos marcados con fluorescencia de forma distinguible, o fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al mismo epítopo de la célula tumoral circulante; e instrucciones para el uso del primer y segundo anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de estos para analizar por citometría la muestra de sangre para detectar la presencia de células que comprenden un primer y segundo anticuerpos unidos, o fragmentos de unión a antígeno de estos, para detectar la célula tumoral circulante en la muestra.
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