CN101375164B - 用于区分至少两个细胞群体的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的主题是用于区分和计数至少2个任选地存在于样品中的、具有特定特征的生物成分(éléments biologiques)群体的方法。本发明允许通过只使用2种检测工具来明确地检测至少3个生物成分群体，这意味着至少2个生物成分群体可通过同一种检测工具来检测。如果使用3种不同的探针，每种探针识别并结合待检测的生物成分群体之一，使所述探针中的每种探针自身可通过不同的标记物进行检测，所述标记物中的两种标记物呈现出两种具有至少一个共同部分的发射光谱(重叠发射光谱)，而第三种标记物呈现出与另外两种标记物基本上没有共同部分的发射光谱(非重叠光谱)；则可实现本发明。

Description

用于区分至少两个细胞群体的方法及其应用

本发明涉及通过使用流式细胞术的原理来检测、区分和计数存在于液体中的生物成分(éléments biologiques)的方法，所述方法可适用于在血液学中常规使用的装置。 

目前市场上销售的自动血液学分析仪(血液学自动装置)提供了越来越多的能够分析和分类被分析的成分的可能性。 

已广泛用于流式细胞术的荧光测量法主要用于通过免疫表型分型(immunophénotypage)对成分进行分类。在常规使用的血液学自动装置中，其尤其专门用于检测体外活体染料，所述体外活体染料用作用于定量核酸或其他细胞组分的分子探针。 

免疫探针在常规血液学中的应用仍未普遍化，尽管在不同的制造者中，通过少数胚胎试验已看到其的应用前景。 

例如，BAYER公司(Bayer Diagnostics，Tarrytown，New York，USA)(通过BAYER-TECHNICON H*1)首次提出在淋巴细胞分型中使用抗体的混合物来确定不同类型的淋巴细胞。在该情况下，不是通过荧光而是通过测量由对生物素(其本身偶联至抗体)具有高亲和力的抗生物素蛋白-过氧化物酶化合物所产生的光吸收来进行抗原表达的测量。所述抗体对于表面分子(CD4、CD8、CD2、CD19)的靶抗原来说是特异性的，所述表面分子特异于所表征的细胞类型。 

ABBOTT公司(Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois，USA)的ABBOTT CD4000提出了使用2种荧光波长进行分析，以便尤其用于实施免疫表型分型。Abbott Laboratorie s公司的专利WO98/02727描述了这种类型的装置，从而使得能够使用抗体对全血样品进行标记。ABBOTT在该专利中详细描述了用于对全血样品实现抗体-抗原反应的装置。 

简单、快速、有效且特异的表型分型方法必须能够在血液学自动 装置类型的非常简单的自动装置中使用，从而使得能够使用有限数目的检测器进行工作。即使技术学基本上相同，但血液学中常规使用的自动装置具有与流式细胞仪不同的特征，特别是在测量参数的数目方面不同，所述测量参数的数目被减少至必需的最低限度，特别是在常规测量中。此外，由于成本是个非常重要的限制因素，所以装置和它们所允许进行的分析的简化仅能够提高整体节约。 

流式细胞术是使得能够同时测量相应于生物成分例如细胞或细胞器的不同物理特征的多个参数的技术。在液体流中带动生物成分，并当它们通过光源前面的测量室时该装置记录它们中每一个的行为。 

该技术实际上是3个系统的组合： 

1)流体系统：允许悬浮液中的生物成分在测量室中在光源前面一个接一个地通过的层流； 

2)光学系统：激光束或其他光源以及使得能够选择合适的激发和发射波长的不同滤光片； 

3)电子系统：PMT(光电倍增管)或光电二极管，其捕获所发射出的光，从而允许将其转换至电信号，随后转换至数字信号。 

总之，光源使得能够产生光，所述光将通过透镜和照亮经过测量室的生物成分。在与生物成分接触时，部分光散射。该光通过多个透镜和其他光阑，并聚焦在光电二极管型传感器上，从而产生FSC(前向散射)的测量结果。该测量结果，在所选择的角度范围内，给出了关于生物成分的大小的指示。 

该光的另一部分发生正交偏转，并通过另一组透镜，和一组半反射镜，以在传感器的范围内进行测量，从而产生SSC(侧向散射)信号。该正交光的测量结果给出了关于生物成分的密度和其粒度(结构)的指示。 

最后，可通过与待分析的波长和光信号一样多的光电倍增管或光电二极管来进行光强度的测量。 

在细胞计数器中生物成分的通过事先需要这样的步骤，在所述步骤期间使生物成分可检测从而被对所述生物成分的结构或功能特异的 探针所标记，预先使所述探针本身可被检测。 

当探针的标记物是荧光分子时，后者可吸收在对于其而言特异的波长范围内的光子(激发光谱)。在如此激发后，荧光分子将返回其基态，并释放具有更低能量的光子。因此，荧光分子具有对于其而言特有的激发波长光谱，在所述激发波长光谱中，取决于同样特征性的发射光谱，它将吸收能量从而以荧光的形式(发射的荧光)再发射之。发射的荧光波长总是比激发波长更大(更低的频率)。 

散射信号(FSC，SSC)和荧光信号通过适合的检测器将会被转换成电信号，随后通过计算机系统进行分析。 

因此，在流式细胞仪中，荧光波长带通常与所使用的每种探针或探针混合物相关。因而将每种探针与荧光色素(荧光标记物)偶联，所述荧光色素的信号在单个荧光通道中进行测量，无论所述荧光色素被嫁接至一种还是多种类型的探针。 

除了选自轴向散射(前向散射(Forward Scatter)或FSC)、正交散射(diffusion orthogonale)(侧向散射(Side Scatter)或SSC)、通过阻抗测量术而得的体积(volume par impédancemétrie)等的通常物理参数外，还可通过常规使用具有有限数目的荧光测量通道的免疫表型分型参数来实现成本降低。 

合计荧光反应的可能性将使得能够在同一测量通道中表达几种不同的标记物，因而增加系统的分析能力并从而提高其性价比，无需就此通过添加测量通道而增加装置的复杂性。 

当多种探针与相同荧光色素缀合时的困难是分别由不同探针识别的生物学特征的表达将直接影响发射的荧光的总量。 

因此，例如，如果生物学特征强烈呈现(例如细胞表面上的抗原)，那么经标记且结合的探针的量将与所述生物学特征的量成正比。结果，由所述探针发射的荧光的量(其本身与已结合所述经标记的探针的生物学特征的量成正比)将提高。 

平行地，如果同一样品的另一种生物学特征表现微弱，那么由缀合至相同荧光色素的相应探针所发射的荧光的量将会太低，从而可能 不被注意，因为其被第一探针的荧光所掩盖。 

当然，当使用其他类型的标记物时会遇到相同的困难。 

本发明的一个目的正好是允许通过只使用2种检测工具(moyen)来清楚而明确地检测至少3种探针。因而，这意味着要通过同一种检测工具来检测至少2种探针。如果使用3种不同的探针，每种探针识别并结合待检测的生物成分之一或所述生物成分的特征之一，使所述探针中的每种探针自身可通过不同的标记物进行检测，所述标记物中的两种标记物呈现出两种具有至少一个共同部分的发射光谱(重叠发射光谱)，而第三种标记物呈现出与另外两种标记物基本上没有共同部分的发射光谱(非重叠光谱)；则可实现该目的。通过第一检测工具测量具有重叠发射光谱的2(或n)个标记物，通过第二检测工具测量具有非重叠发射光谱的标记物。 

因此，本发明包括： 

(1)-通过与在同一个检测波段中测量的n种标记物偶联的n种探针的发射产率来平衡抗原表达或细胞特征的差异； 

(2)-建立一方面来源于第二检测工具的信号与另一方面来源于第一检测工具的信号之间的比率，以将其用作构成矩阵的轴； 

(3)-以二维方式组合一方面来源于第(2)项的比率和另一方面来源于第一检测工具的信号，以便改进图解表示法(représentationgraphique)，并从而改善目的生物成分的表征和定量。 

根据本发明，“生物成分”是指例如真核或原核细胞、细胞群、细胞碎片。 

“生物学特征”是指对于所研究的生物成分而言特异的组分，例如，细胞的生物学组分例如细胞器、蛋白质、脂质、糖类或者核酸(RNA或DNA)。 

根据本发明，“探针”是指使得能够特异性地鉴定存在于所研究的生物成分之中或之上的生物学或化学特征的任何工具。可根据本发明使用的所述工具，特别是在细胞生物学、分子生物学、免疫学和流式细胞术领域中，是完全已知的。可提及但不限于，抗体，核酸(DNA 或RNA)，化合物，特别是嵌入化合物，对于离子环境(H+、Ca“等)具有反应性的化合物，凝集素，配体或其他细胞活力染料。 

“探针的标记物”是指根据其性质而通过目测或使用合适的装置直接可检测的或在激发后可检测的任何化合物。此类化合物在当偶联至探针时可使后者可被检测。可提及荧光分子，无论此类分子是例如化合物还是生物分子例如蛋白质。所有此类产品可商购获得，并且由大多数实验室化学产品的销售商例如Sigma、Aldrich、Fluka、Riedelde Haen公司等所提供。 

应当指出，在使用本发明的方法来区分生物成分群体的相同实验中，既然可根据依照本发明所定义的标准(至少2个重叠的发射光谱和一个非重叠光谱)来实施其检测，那么可能使用不同性质的探针(例如缀合的抗体和经标记的核酸或细胞活力)。 

根据本发明，“检测工具”是指用于检测或甚至定量探针的标记物的任何工具。所述检测工具当然对于用于使探针可被检测的方法而言是特征性的。所述检测工具在所有情况下由能够检测特定探针的标记物的全体物理组分组成。例如，如果其是发射荧光的标记物，那么检测工具是组合件(ensemble)，其包括用于观察样品的光学透镜、空间滤波器(光阑、“针孔”等)、分光镜滤波器(二色性的、干涉性的)，它们特别地经如此布置以便只允许对于待测量的标记物和光电子传感器本身(光电二极管、光电倍增管等)而言特异的光谱部分(称为“检测波段”)到达传感器。然后，通过电子学方法将该传感器与电子采集链( d’acquisition électronique)相连接，所述电子采集链将进行模拟和/或数字信号的加工和最终通过计算机进行数据处理。 

如果使用荧光标记物来标记探针或者如果探针本身具有荧光，则其还可以是例如荧光检测器，或者如果探针是在激发光的有色光谱的特定部分中具有吸收的标记物，则其还可以是分光光度计。 

根据本发明，“发射光谱”是指在标记物或探针本身的特征带中作为波长的函数的荧光强度的分布。通常，这样的光谱具有相应于发 射最大值的强度峰。可在两个波长之间的范围内进行检测，该范围通常围绕相应于最大发射荧光峰(最大检测峰)的给定的中间波长。 

“检测波段”是指选自所考虑的标记物的发射光谱的波长范围(例如，如果其是发射荧光的标记物，那么检测波段是优选围绕最大荧光发射峰的所选择的波段)。通过整合在检测工具中的光谱过滤，通过至少一个任选地装配在一个或多个分色镜后面的干涉或带通滤波器来确定该检测波段。 

“重叠发射光谱”是指在同一个检测工具中，对于两种不同的标记物，它们的发射光谱具有共同的区带。例如，如果存在2种发射荧光的标记，那么当它们呈现出在对于它们的两个发射光谱而言共同的两个波长之间的共同发射范围时，它们的发射光谱称为重叠发射光谱。通常，这样的光谱具有不同的最大发射峰。 

“基本上不重叠的发射光谱”是指，对于其中2种标记物呈现出重叠发射光谱的3种不同的标记物，第3种标记物呈现出与另外2种标记物的光谱中的任一光谱没有显著重叠区带的发射光谱。 

因此，通过阅读上述内容要理解，如果使用识别3种不同生物学特征的3种探针(其用各自具有不同发射光谱的3种标记物标记，但其中2种是重叠的而1种是非重叠的)，在有着重叠光谱的标记物具有共同的检测波段的情况下，该方法只使用2种检测工具。 

相对于现有技术中已知的方法，这构成了本发明的主题方法的主要的独创性，所述现有技术中已知的方法，为了检测3种生物学特征，使用3种探针，所述探针呈现出通过3种不同的检测工具进行分析的3个独立的发射光谱。 

对于重叠标记物，在其检测方面来合理选择标记物将导致选择出2种标记物，这2种标记物可在相同的检测波段中一个比另一个更有效地起作用。 

根据本发明的变化形式，可选择在检测波段中的发射产率以与所考虑的生物学特征的表达成反比。为了不掩盖弱的阳性表达，还根据该表达来决定检测波段的选择(这是本发明的第一平衡相)。 

因此，例如，对于弱表达的抗原，选择在所选检测波段中呈现出高发射产率的标记物，而对于强表达的抗原，选择在相同的检测波段中呈现出较低发射产率的标记物。这使得能够控制所测量的标记物的量，以便平衡与所考虑的抗原或探针的表达水平成反比的发射。 

本发明的方法使得能够简单、快速和有效地区分和计数生物成分。其另外还使得能够使用简单的装置，这具有减少制造成本以及使用和维护成本的结果。此外，有助于自动化分析。 

因此，本发明的目标是用于区分至少2个任选地存在于样品中的、具有特定特征的生物成分群体的方法，其包括 

-使用3种不同的探针同时标记所述生物成分群体，所述探针是可通过3种不同的标记物进行检测的或被使得可通过3种不同的标记物进行检测，其中所述标记物中的两种标记物(重叠标记物或MC(marqueur couvrant))各呈现出发射光谱，所述发射光谱相互重叠，而第三种标记物(非重叠标记物或MnC(marqueur non couvrant))呈现出基本上不与另外两种标记物的光谱重叠的发射光谱(非重叠发射光谱)； 

-使用任何合适的工具，在于所述非重叠标记的发射光谱中选择出的检测波段中测量非重叠标记物的总量(qMnC(quantitétotale demarqueur  non couvrant))； 

-使用任何合适的工具，在对于所述重叠标记物的发射光谱而言共同的检测波段中测量重叠标记物的总量(qMC(quantitétotaledemarqueur couvrant))； 

-对于所分析的每种生物成分，确定非重叠标记物的总量对重叠标记物的总量的比率(R)[R＝(qMnC)/(qMC)]； 

-使用任何工具绘制图，所述图显示出作为经由重叠标记物标记的生物成分量的函数的所述比率(R)[R＝f(qMC)]；和/或 

-使用任何合适的工具(通常为计算机)，对在所述图中鉴定的生物成分和相应的统计数据进行定量。 

本发明的方法是允许区分和计数与给定的标准正相符或非正相符 的生物成分的方法。该方法的目的不是定量生物成分所结合的探针的数目。该方法使得能够在样品中特别是在生物样品中明确地检测呈现出所寻找的特征的生物成分群体。 

按照本发明方法的最后步骤，具有纵坐标R和横坐标qMC的双参数矩阵的分析使得能够改进图解表示法，从而改善目的生物成分的表征和定量。 

根据本发明，样品可以是天然生物样品，特别是液体天然生物样品。其还可以是非天然细胞悬浮液，例如培养基。作为天然生物液体，可提及但不限于血液、尿、离解的组织(tissu dissocié)、骨髓、脑脊髓液、胸膜液或滑液、由单采血液成分术过程而得到的产物，或者作为合成的细胞悬浮液，可提及细胞或微生物的培养基。 

根据本发明，包含在样品中的生物成分可以是真核细胞或原核细胞，或者两者的混合物，或者所述细胞的碎片，细胞器。根据本发明的方法可使用的探针可以是相同或不同的，其可以是抗体，核酸(DNA或RNA)，或者还有任何分子探针例如特异性地识别核酸的染料，酶底物，或者还有对蛋白质特异的标记物，受体的配体，对于离子环境敏感的分子(对于pH、Ca++等的探针)，或对于所靶向的生物学特征特异的任何其他分子。 

当探针是抗体时，抗体可以是单克隆或多克隆的、天然或重组的、人或动物的抗体。 

如果探针不是天然可检测的，为了可被检测，必须将它们与在所选择的检测波段内可被所述检测工具识别的标记物相缀合。 

根据本发明，用于使探针可被检测的标记物可以是能够嫁接至探针上的可检测的化合物，核酸的嵌入或非嵌入标记物，或者对于蛋白质特异的标记物或对于所靶向的生物学特征特异的任何其他分子。在该方面，可提及荧光染料或者吸收染料(colorant absorbant)，例如：Alexa 

350，Alexa 

488，Alexa 

532，Alexa 633，Alexa 647，Alexa 

660，Alexa 

680，别藻蓝蛋白，氨甲基香豆素乙酸， 

氯荧光素(DCFH)，二氢罗丹明(DHR)，“增强型GFP”(EGFP)，Fluo-3， 

萤光素，5-马来酰亚胺萤光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，PerCP，r-藻红蛋白(PE)，r-藻红蛋白-青色素5串列或 

或 r-藻红蛋白-青色素5.5(PE- 

)，r-藻红蛋白-青色素7(PE- 

)，r-藻红蛋白-德克萨斯红- 

Red 罗丹明110，罗丹明123，S65L，S65T，异硫氰酸四甲基罗丹明，德克萨斯红- 

indo 1，纳米晶体(nano cristaux)(QuantumDots)，Fura 2，Fura 3，quin，DS Red，以及尤其对核酸(无论以DNA还是RNA的形式)特异的标记物，例如嵌入染料或其他细胞活力染料例如溴化乙锭或者还有噻唑橙，噻唑蓝和其衍生物，硫黄素S，硫黄素T，硫黄素 

二乙基-喹啉基噻菁碘化物(diéthyl-quinolythocyanine iodide，DEQTC)，TOTO- TO-PRO- 

或者还有YOYO- 

33258， 

33342， 

34580，二脒基苯基吲哚(DAPI)，碘化丙锭，派洛宁Y，7-氨基放线菌素D(7AAD)，吖啶橙，金胺O，钙荧光素，新亚甲蓝，olamin-O，噁嗪750，Astra蓝， 

绿，SYTO 

SYTO 

SYTO 

SYTO 

SYTO 

SYTO 

SYTO 

在本发明的特定实施方案中，当细胞特征例如抗原由被使得可通过重叠标记物进行检测的探针识别时，可能选择第一所谓的通有(générique)细胞特征，即所有所考虑的生物成分均存在的且特征性的。该细胞特征的表达在所述生物成分中通常较高，将被嫁接至识别其的探针的标记物可以是在对于两个重叠标记物(MC)而言共同的检测波段中更弱地作出应答的标记。这样的探针使得能够证明，良好的细胞群体受到特别关注。 

由被使得可通过其他重叠标记物进行检测的探针所识别的第二细胞特征可以是只在所研究的生物成分群体中较少表达的细胞特征。将嫁接至所述探针的标记物必须是在对于两个重叠标记物(MC)而言共同的检测波段中更强地作出应答的标记物。 

由第三标记物进行标记的探针相应于所研究的第三细胞特征，所 述第三标记物与其是非重叠的(MnC)并且将在与第一检测波段不同的第二检测波段中被检测到。 

可在允许检测标记物的任何装置中进行本发明的方法。在该方面，可提及的示例是：荧光的检测，无论其是由缀合至分子探针例如抗体的染料发射的还是直接由体外活体荧光染料例如对核酸特异的嵌入或非嵌入染料发射的；或者还有，尤其是在光谱的指定波长范围内的光吸收或散射的检测，无论这些测量是通过波长范围的消失(extinction)或散射来进行的还是通过选自紫外至红外的波段的光谱测定法来进行。该吸收可以是由缀合至分子探针例如抗体的染料产生的吸收或者直接由体外活体染料例如对核酸特异的嵌入或非嵌入染料产生的吸收。 

本发明的目标还在于前述方法用于区分至少2个具有特定特征且任选地存在于样品中的细胞群体的用途。该方法的用途可涉及医学诊断，例如借助于抗-CD45抗体、抗-CD19抗体和抗-CD5抗体在慢性淋巴细胞白血病(LLC，leucémie 

chronique)和急性白血病(LA，leucémieaigue)的领域内进行的；借助于抗-CD45抗体、抗-CD16抗体和抗-CD11b抗体在残留病(maladie résiduelle)(最小残留疾病(Minimum Residual Disease)，MRD)检测和白细胞分化的领域内进行的；借助于抗-CD45抗体、抗-CD34抗体、抗-CD33抗体和7-AAD或DAPI或其他活力标记物在造血祖细胞的领域内进行的；借助于抗-CD45抗体、抗-CD64抗体和抗-CD163抗体在炎症和细胞激活的领域内进行的；借助于抗-CD45抗体、抗-CD8抗体或抗-CD4抗体和抗-CD 3抗体在HIV病毒感染的检测或监控的领域内进行的；在儿童的b型急性淋巴细胞白血病(LALb，Leucémie Lymphoblastique detype b)的领域内进行的；借助于抗-CD45抗体、抗-CD19抗体和抗-CD10抗体在骨髓的观察的领域内进行的；或者还有，借助于抗-CD19抗体、抗-CD10抗体和抗-CD38抗体在B淋巴细胞前体(原始血细胞)分化的领域内进行的。这些描述既不是穷举的也不是限定性的，而仅仅是医学知识的目前状态。 

通过阅读下面的并且只通过举例说明而不限定本发明的方式而给出的附图和实施例，本发明的其他特征将变得显而易见。 

如此，图1是生物成分的表型的示意图解，其中A和B是重叠标记物，和C是非重叠标记物，它们分别相应于使得可被检测的探针(SA、SB和SC)，所述探针识别所考虑的生物成分的特定特征(CPA、CPB和CPC)。 

1A部分显示了作为C的荧光(qMnC)的函数的A+B的荧光(qMC)的流式细胞术标准图解。 

1B部分显示了根据本发明获得的作为A+B的总荧光(qMC)的函数的C的荧光(qMnC)对A+B的总荧光(qMC)的比率[qMnC/qMC]的流式细胞术图解[qMnC/qMC＝f(qMC)]。 

本发明的实施允许在第一地表达(A+B+)、第二地表达(A-B-)和第三地表达(A+B-)或(A-B+)的生物成分之间在相同的荧光轴(横坐标轴)上存在差别。 

图2显示了本发明的方法，所述方法在用偶联至r-藻红蛋白(PE)的抗-CD45抗体、偶联至藻红蛋白-青色素5(PC5)的抗-CD5抗体和偶联至FITC的抗-CD19抗体进行标记后，应用于分析在正常血液样品中(2a)和在来自患急性白血病的患者的血液样品中(2b)的血液白细胞。单独的CD45表达使得能够鉴定出在该病理学状态中存在的胚细胞。 

图3代表了正常血液和来自患慢性淋巴细胞白血病的患者的血液(A2和B2)的样品。图3A1和3A2显示了通过流式细胞术进行分析的结果，图3B1和3B2显示了在应用本发明方法后的相同结果。 

图4显示了本发明的方法，所述方法在用与PE偶联的抗-CD45抗体、偶联至PC5的抗-CD3抗体和偶联至FITC的抗-CD8抗体进行标记后，应用于分析血液T淋巴细胞。图3A显示了通过流式细胞术进行分析的结果，图3B显示了在应用本发明方法后的相同结果。 

实施例1：

肿瘤血液学中最常见的病理学状态是不同类型的急性白血病(LA)和B淋巴细胞血液病，其中慢性淋巴细胞白血病(LLC)呈现出恒定进展的发病率(30/10⁶)。 

急性白血病(LA)的特征可在于，由恶性造血细胞增殖产生的髓侵袭。 

慢性淋巴细胞白血病(LLC)的特征可在于，单克隆淋巴细胞、非典型B谱系的淋巴样细胞的增殖。 

LA的白血病胚细胞的特征在于，与正常血液淋巴细胞和单核细胞相比，CD45的中等表达。 

B型LLC的异常淋巴细胞的特征在于，抗原CD5和CD19在相同细胞上的异常共表达，而正常淋巴细胞表达CD5(T谱系的淋巴细胞)或CD19(B谱系的淋巴细胞)。 

可在下表中概述此类细胞的表型： 

抗原	CD19	CD45	CD5
				正常T淋巴细胞	-	++	++
正常B淋巴细胞	+	++	-
				LA的胚细胞		+/-
LLC的B淋巴细胞	+	++	+

迄今，通过流式细胞术对血液样品中的这些不同群体的分析和鉴定要求使用3种不同的针对3种抗原CD5、CD19和CD45的抗体和SSC正交散射。为进行该分析，将每种抗体偶联至荧光色素，并且使用不同的光电倍增管在不同的波长下测量各表达。 

本发明方法的应用使得能够提出通过细胞计量术的标记和分析系统，所述系统使得能够使用仅两个光电倍增器和SSC正交散射在同一血液样品中和在同一测量过程中检测和定量白血病细胞的可能存在。 

在流式细胞仪上，就给定的荧光色素来优化光信号的光学过滤以在集中于其发射最大值的波长波段中测量其荧光：通常在525nm分析 荧光素(FITC)，在575nm分析r-藻红蛋白(PE)和在675nm分析r-藻红蛋白-青色素5串列(PC5)，带宽大约30nm。 

PE和PC5的发射光谱是重叠的。它们例如共同具有波长675nm，在该波长处PE具有比PC5低得多的荧光产率。本发明方法的一个创新性在于，在与其最大发射波长不同的波长处测量所述荧光色素(PE)之一的荧光，在该情况下在675nm下测量PE。因此，在该波长处，通过对测量系统针对为此而选择的2种荧光色素的不同效能起作用，可能使得补偿所分析的抗原的表达的显著差异。 

该原理应用于在用偶联至PE(λ_最大＝575nm)的抗-CD45抗体、偶联至PC5(λ_最大＝675nm)的抗-CD5抗体和偶联至FITC(λ_最大＝525nm)的抗-CD19抗体标记后分析血液白细胞。 

在集中于675nm(其为PC5的最大发射波长)的第一检测波段中分析这些标记。PE的光谱与PC 5的光谱重叠。因而，在675nm进行的分析将确定由PC5和PE发射的荧光的总量(qMC)。 

在另一方面，在525nm处分析由偶联至FI TC的抗-CD19抗体发射的荧光的量(qMnC)。 

多核和单核细胞被排除在基于它们的光散射性质的开窗分析(analyse par 

)之外。 

方案： 

1)从总外周血样品中取出数微升(5至50)的血液等分试样，并与数微升(3至50)的上述3种经缀合的抗体溶液的等分试样相混合。 

2)在避光的条件下在环境温度或经调节的温度下温育该混合物，进行数分钟(1至30)的时间段。 

3)在温育期后，向该混合物中加入红细胞裂解剂，以获得具有希望的特定浓度(1/40、1/80、1/100等)的血液终溶液。 

4)依赖于裂解试剂和温育温度，让如此获得的经裂解的血液溶液温育数秒(通常15至30秒)。 

5)然后将该溶液注射入流式细胞仪类型的测量组合件中，以在通过光束(对于所指定的染料，最常见的是488nm的激光)的每个细胞 上测量在FSC轴中的散射、SSC正交散射、525nm处的绿色荧光(FL1)和675nm处的红色荧光(FL2)的参数。可在半自动流式细胞术装置或专门设计的血液学自动装置上自动进行步骤3至5，和可在专门设计的自动流式细胞术装置上自动进行步骤1至5。 

作为SSC正交散射的函数的675nm处的荧光(FL1)的分析(参见图2A)使得能够区分： 

·荧光非常微弱的群体，其相应于微弱地表达CD45的LA胚细胞的， 

·具有中等荧光的群体，其相应于表达CD45但不表达CD5的淋巴细胞(B淋巴细胞和NK细胞)，和 

·荧光非常强的群体，其相应于还表达CD5的淋巴细胞(T林巴细胞和LLC细胞)。 

在该最后的群体中，525nm处的荧光分析使得能够鉴定也表达CD19的LLC细胞。 

本发明方法的应用使得能够通过对于每种细胞考虑525nm处的荧光对675nm处的荧光的比率(qMnC/qMC)来区分非T淋巴细胞、T淋巴细胞和LLC细胞。该比率按照下列真值表(table de vérité)来表示： 

CD19	CD45	CD5	比率CD19/CD45+CD5  (qMnC/qMC)
				-	++	++	-
+	++	-	++
				+	++	+	+/-

根据本发明获得的分布直方图[(qMnC)/(qMC)＝f(qMC)](参见图2C)使得能够鉴定、分开和定量3种非常显然地分开的群体。 

·正常T淋巴细胞(L.T.)在525nm处不发荧光，但在675nm处荧光显著，因此它们具有非常低的比率。 

·正常B淋巴细胞(L.B.)在525nm处发荧光，在675nm处具 有中等荧光，因此它们具有高的比率。 

·LLC细胞同时表达CD5、CD45和CD19，在525nm和675nm处发荧光，因而它们的比率中等(图2)。 

·既不表达CD5也不表达CD19的NK细胞被排除在基于它们在675nm处的荧光的分析之外(CD45+、CD5-和CD19-)。 

因此，从血液样品开始，在用3种荧光抗体进行标记和裂解红细胞后，可能在单次分析中通过只在两个荧光波长上进行测量来区分和计数T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞。 

本发明方法的应用使得能够区分T淋巴细胞和LLC细胞(图2B)，所述T淋巴细胞和LLC细胞在按照常规分析获得的图中以单个云状物的形式显现(图2A)。对于B淋巴细胞和NK细胞也是如此。 

此外，可检测急性白血病的胚细胞或慢性淋巴细胞白血病的细胞的可能存在，并且可对这些细胞进行计数。 

本发明方法的用途可应用于诊断或监控B慢性淋巴样病理学状态、急性白血病，以及应用于在治疗期间监控残留病。 

实施例2：

本发明的方法还可在用偶联至PE的抗-CD45抗体、偶联至PC5的抗-CD3抗体和偶联至FITC的抗-CD8抗体进行标记后应用于分析血液T淋巴细胞。(图3)。 

1)从总外周血样品中取出数微升(5至50)的血液等分试样，并与数微升(3至50)的上述3种经缀合的抗体溶液的等分试样相混合。 

2)在避光的条件下在环境温度或经调节的温度下温育该混合物，进行数分钟(1至30)的时间段。 

3)在温育期后，向该混合物中加入红细胞裂解剂，以获得具有希望的特定浓度(1/40、1/80、1/100等)的血液终溶液。 

4)依赖于裂解试剂和温育温度，让如此获得的溶液温育数秒(通常15至30秒)。 

5)然后将该溶液注射入流式细胞仪类型的测量组合件中，以在通过光束(对于所指定的染料，最常见的是488nm的激光)的每个细胞上测量在FSC轴中的散射、SSC侧向散射、525nm处的绿色荧光(FL1)和675nm处的红色荧光(FL2)的参数。 

可在半自动流式细胞术装置或专门设计的血液学自动装置上自动进行步骤3至5，和可在专门设计的自动流式细胞术装置上自动进行步骤1至5。 

在675nm处分析使用PE和PC5进行的标记(qMC)。在525nm处分析使用FITC进行的标记(qMnC)。 

多核和单核细胞被排除在通过它们的SSC正交散射性质来进行的分析之外。 

按照常规方法获得的作为SSC正交散射的函数的675nm处荧光的图(图3)使得能够检测出云状物，所述云状物代表了表达CD45但不表达CD3的淋巴细胞(B淋巴细胞和NK细胞)的具有中等荧光的群体以及相应于还表达CD3的淋巴细胞(T淋巴细胞)的荧光非常强的群体。 

本发明方法的应用使得能够完全区分不同的群体(图3B)。 

特别地，这使得能够在相应于还表达CD3的淋巴细胞的荧光非常强的群体中鉴定出CD8+淋巴细胞。 

CD4+T淋巴细胞在525nm处不发荧光，但在675nm处荧光显著，并且只呈现出非常低的525/675比率。 

CD8+T淋巴细胞在525nm和675nm处发荧光，因此其具有更高的比率。 

基于它们在675nm处的中等荧光，鉴定出不表达CD 3的NK细胞和B细胞(非-T)。 

Claims (11)

1.用于区分和计数至少2个任选地存在于液体样品中的、具有特定生物学特征的生物成分群体的方法，其包括

-使用3种不同的探针同时标记所述生物成分群体，所述探针是可通过3种不同的标记物进行检测的或被使得可通过3种不同的标记物进行检测，其中所述标记物中的两种标记物各呈现出发射光谱，所述发射光谱相互重叠，而第三种标记物呈现出不与另外两种标记物的光谱重叠的发射光谱，其中所述呈现出相互重叠的发射光谱的两种标记物被称为重叠标记物或MC，所述第三种标记物被称为非重叠标记物或MnC，并且所述不与另外两种标记物的光谱重叠的发射光谱被称为非重叠发射光谱；

-使用任何合适的工具，在于所述非重叠标记物的发射光谱中选择出的检测波段中测量非重叠标记物的总量qMnC；

-使用任何合适的工具，在对于所述重叠标记物的发射光谱而言共同的检测波段中测量重叠标记物的总量qMC；

-确定非重叠标记物的总量对重叠标记物的总量的比率R，R＝(qMnC)/(qMC)；

-使用任何工具绘制图，所述图显示出作为经由重叠标记物标记的生物成分总量的函数的所述比率R，R＝f(qMC)；和/或

-使用任何工具，对所述图中存在的生物成分群体进行定量，

其中所述生物成分是真核细胞或原核细胞，或者两者的混合物，或者所述细胞的碎片，或者细胞器，并且所述方法用于非诊断目的。

2.权利要求1的方法，其特征在于，所述液体样品是血液、尿、离解的组织、骨髓、脑脊髓液、胸膜液、滑液或由单采血液成分术过程而得到的产物。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于，任选地存在于液体样品中的生物成分是真核细胞或原核细胞，或者两者的混合物，或者所述细胞的碎片。

4.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述探针是抗体，或核酸，或对核酸特异的染料，或酶底物，或者对蛋白质特异的标记物，受体的配体或对离子环境敏感的标记物，或所靶向的生物成分的任何其他特征性分子。

5.权利要求4的方法，其特征在于，所述核酸为DNA或RNA。

6.权利要求4的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆或多克隆的、天然或重组的、人或动物的抗体。

7.权利要求1的方法，其特征在于，用于使得探针可检测的标记物是核酸的嵌入或非嵌入标记物，或者是对蛋白质特异的标记物或所靶向的生物成分的任何其他特征性分子。

8.权利要求1的方法，其特征在于，所述标记物是荧光或非荧光标记物。

9.权利要求7或8的方法，其特征在于，所述标记物选自Alexa

350，Alexa488，Alexa532，Alexa

633，Alexa647，Alexa660，Alexa

680，别藻蓝蛋白，氨甲基香豆素乙酸，

二氯荧光素(DCFH)，二氢罗丹明(DHR)，“增强型GFP”(EGFP)，Fluo-3，，萤光素，5-马来酰亚胺萤光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，PerCP，r-藻红蛋白，r-藻红蛋白-青色素5串列或

或

，r-藻红蛋白-青色素5.5，r-藻红蛋白-青色素7，r-藻红蛋白-德克萨斯红

，，罗丹明110，罗丹明123，S65L，S65T，异硫氰酸四甲基罗丹明，德克萨斯红

indo1，纳米晶体，Fura2，Fura3，quin，DS Red，嵌入化合物。

10.权利要求7或8的方法，其特征在于，所述标记物选自溴化乙锭，噻唑橙，噻唑蓝，硫黄素S，硫黄素T，硫黄素

二乙基-喹啉基噻菁碘化物(DEQTC)，

33258，

33342，34580，DAPI，碘化丙锭，派洛宁Y，7-氨基放线菌素D(7AAD)，吖啶橙，金胺O，钙荧光素，新亚甲蓝，olamin-O，

嗪750，Astra蓝，

绿，

11.前述权利要求中任一项的方法用于区分至少2个具有特定特征且任选地存在于液体样品中的生物成分群体的用途，其中所述生物成分是真核细胞或原核细胞，或者两者的混合物，或者所述细胞的碎片，或者细胞器，并且所述用途用于非诊断目的。

Images