ES2928217T3 - Método para la detección de un producto de PCR - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una molécula de ácido nucleico en una muestra biológica incluye amplificar una molécula de ácido nucleico para generar un amplicón que tenga una sola cola 5' y acoplar la cola 5' a una de una pluralidad de sondas de captura en una superficie de un sensor . El amplicón se convierte en una molécula monocatenaria y un grupo de catalizadores específicos de la diana se une a la molécula monocatenaria. El grupo de catalizadores se somete a metalización para detectar el ácido nucleico objetivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la detección de un producto de PCR

La materia objeto desvelada en el presente documento se refiere a un proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, más particularmente, a un método para la detección anidada de un producto de PCR.

La PCR es una técnica que permite replicar y amplificar cantidades traza de fragmentos de ADN en cantidades suficientes para el análisis. Como tal, la ^pC^r puede usarse en una diversidad de aplicaciones, tales como secuenciación de ADN y detección de fragmentos de ADN en muestras, tal como para la detección de patógenos en muestras.

En el funcionamiento, la PCR implica el uso de una serie de cambios o ciclos de temperatura repetidos que provocan que el ADN se derrita o se desnaturalice, produciendo dos moléculas de ADN monocatenario que después actúan como moldes. Los cebadores, fragmentos cortos de ADN, que contienen secuencias complementarias a una región diana de ADN junto con una ADN polimerasa, se usan para repetir selectivamente la amplificación de una región o secuencia de ADN en particular. Normalmente, se incluyen dos cebadores en una mezcla de reacción. Los cebadores son secuencias monocatenarias, pero son más cortas que la longitud de la región diana del ADN. Los cebadores se unen a una parte complementaria de la cadena de ADN y la ADN polimerasa se une al híbrido cebador-ADN y comienza la formación de ADN de una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de plantilla de ADN. El proceso se repite hasta que se hayan creado múltiples copias de las cadenas de ADN.

Sin embargo, en algunos casos, los cebadores pueden estar sujetos a heterodimerización, en la cual las secuencias del cebador se unen entre sí, en lugar de al ADN, dando como resultado cadenas cortas de dímeros o productos de amplificación de artefactos, conocidos como dímeros de cebadores. Estos productos de artefactos pueden formarse en las primeras etapas de la PCR y posteriormente amplificarse.

En el documento US 2015/0176065 se enseña un método para suprimir los productos de amplificación de artefactos en la fase de PCR mediante el uso de una sonda de fijación de ARN.

En el documento WO 2007/084077 se enseña un método que prescinde por completo de la PCR. Aquí, las moléculas de ADN diana originales están unidas a un sustrato en una sonda, haciendo innecesaria la amplificación. Se describen diferentes métodos modificados de PCR en los documentos US 2005/0196760 A1 y US 2008/0108055 Al.

Los fundamentos de los biosensores electroquímicos basados en ADN se analizan en Rias G A et al: "Electrochemical Biosensors for sequence-specific DNA detection". Analytical Letters, Taylor & Francis INC, EE.UU., vol. 38, n.° 15, 1 de enero de 2005 (01/01/2005).

Un sensor electrónico para la detección de moléculas de ácido nucleico diana específicas puede incluir sondas de captura inmovilizadas en una superficie sensora entre un conjunto de electrodos emparejados. Un ejemplo de un sistema y un método para detectar moléculas de ácido nucleico diana se describe en la Patente de e E.UU. N.° 7.645.574. Después de la PCR, los productos amplificados o los amplicones derivados de secuencias de patógenos específicos son capturados por las sondas a través de una cola monocatenaria en 5', que se incorporó en las moléculas durante el proceso de amplificación mediante el uso de cebadores elaborados con un bloque de replicación interno. Los cúmulos de nano-oro, funcionalizados con un segundo oligonucleótido de captura que tiene una secuencia complementaria a una cola 5' universal etiquetada en el otro extremo del producto amplificado, se usan para la hibridación localizada solo en sitios sensores que tienen productos de amplificación capturados. Posteriormente, usando un tratamiento corto con un reactivo desarrollador de oro, los cúmulos de nano-oro sirven como sitios de nucleación catalítica para la metalización, que cae en cascada en el desarrollo de una película totalmente conductora. La presencia de la película de oro acorta el espacio entre los electrodos y se mide por una caída en la resistencia, permitiendo que la presencia de los productos de amplificación capturados pueda medirse después. Sin embargo, los productos de artefactos de solo cebador o posibles amplicones derivados de moléculas de ácido nucleico espurias, teniendo ambos cebadores las colas 5' requeridas, pueden reaccionar con tales sensores de la misma manera que lo haría una diana de ADN y pueden dar como resultado resultados falsos positivos.

Sumario

Un método para detectar una molécula de ácido nucleico en una muestra biológica incluye amplificar una molécula de ácido nucleico para generar un amplicón que tenga una sola cola 5' e hibridar la cola 5' con una de una pluralidad de sondas de captura en la superficie de un sensor. El amplicón se convierte en una molécula monocatenaria y un cúmulo de catalizadores específicos de la diana se une a la molécula monocatenaria. El cúmulo de catalizadores se somete a metalización para detectar un ácido nucleico diana.

En una realización, se desvela un método para detectar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra con un sensor. El sensor incluye un primer electrodo y un segundo electrodo acoplados a una superficie sensora en una disposición separada y una pluralidad de sondas de captura acopladas a la superficie sensora entre el primer electrodo y el segundo electrodo. El método incluye realizar la amplificación de moléculas de ácido nucleico a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un primer cebador que tiene una cola en 5' y un segundo cebador que no tiene cola en 5' para formar una pluralidad de amplicones bicatenarios que tienen una primera cadena con una cola en 5' y una segunda cadena sin cola y que hibridan la pluralidad de amplicones con la pluralidad de sondas de captura. El método incluye además convertir la pluralidad de amplicones en una pluralidad de moléculas monocatenarias y unir un cúmulo de catalizadores a una sección interior de cada una de la pluralidad de moléculas monocatenarias. Además, el método incluye poner en contacto la pluralidad de moléculas monocatenarias que tienen un cúmulo de catalizadores unido a ellas con un metal o aleación metálica para depositar el metal o la aleación metálica sobre el cúmulo de catalizadores y determinar si se puede transportar una corriente eléctrica entre los electrodos. La corriente eléctrica entre los electrodos indica la presencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra.

En otra realización, se desvela un método para preparar un detector de moléculas de ácido nucleico. El detector de moléculas de ácido nucleico incluye un primer electrodo y un segundo electrodo acoplados a una superficie sensora en una disposición separada y una pluralidad de sondas de captura acopladas a la superficie sensora entre el primer electrodo y el segundo electrodo. El método incluye recibir una muestra biológica, amplificar una molécula de ácido nucleico dentro de la muestra biológica para generar un amplicón que tiene una sola cola en 5' y unir la cola en 5' del amplicón a una de la pluralidad de sondas de captura. El método incluye además emplear una exonucleasa para digerir una cadena del amplicón para convertir el amplicón en una molécula monocatenaria y sintetizar un cúmulo de catalizadores específicos de diana. El método incluye además poner en contacto el cúmulo de catalizadores con la molécula monocatenaria del amplicón para unir el cúmulo de catalizadores específico de diana a una región interior de la molécula monocatenaria.

Una ventaja que puede obtenerse en la práctica de algunas realizaciones desveladas es la reducción o la eliminación de falsos positivos debida a la formación de artefactos de dímero de cebador u otros productos de amplificación no deseados.

Las realizaciones anteriores son solo ilustrativas. Otras realizaciones están dentro del alcance de la materia objeto desvelada.

Breve descripción de los dibujos

Para que se entienda la forma en que se entienden las características de la invención definidas por las reivindicaciones adjuntas, puede obtenerse una descripción detallada de la invención con referencia a determinada realización, algunas de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Ha de observarse, sin embargo, que los dibujos ilustran solo determinadas realizaciones de esta invención y, por lo tanto, no deben considerarse limitantes de su alcance, ya que el alcance de la materia objeto desvelada abarca igualmente otras realizaciones. Los dibujos no están necesariamente a escala, poniéndose énfasis generalmente en ilustrar las características de determinadas realizaciones de la invención. En los dibujos, se usan números similares para indicar partes similares a lo largo de las diversas vistas.

La FIGURA 1 es una ilustración de una realización de una superficie sensora de molécula de ácido nucleico; La FIGURA 2 es un diagrama de flujo que ilustra un método para detectar moléculas de ácido nucleico;

La FIGURA 3 es una ilustración de una realización de un amplicón que tiene una única cola en 5';

La FIGURA 4 es una ilustración de la superficie sensora de la FIGURA 1 que tiene el amplicón de la FIGURA 3 acoplado a la misma;

La FIGURA 5 es una ilustración de la superficie sensora de la FIGURA 4 con el amplicón convertido en una molécula monocatenaria;

La FIGURA 6 es una ilustración de la superficie sensora de la FIGURA 5 con un cúmulo de catalizadores acoplado a la molécula monocatenaria;

La FIGURA 7A es una ilustración de una realización de un método para formar un cúmulo de catalizadores; La FIGURA 7A es una ilustración de una realización de otro método para formar un cúmulo de catalizadores; La FIGURA 8A es una ilustración de una realización de un método para formar un cúmulo de catalizadores multiplexados;

La FIGURA 8B es una ilustración de una realización de un método para mezclar cúmulos de catalizadores multiplexados;

La FIGURA 8C es una ilustración de una realización de un método de anidamiento en múltiples sitios de cúmulos de catalizadores multiplexados en moléculas de amplicón monocatenario;

La FIGURA 9 es una ilustración de una parte de un gen ribosómico usado para la prueba;

La FIGURA 10 es una fotografía de superficies de microchip resultantes de probar los efectos del tiempo en la digestión con exonucleasa de cadenas de amplicón;

La FIGURA 11 es una fotografía de superficies de microchip resultantes de probar los efectos de la variación de la concentración de exonucleasa;

La FIGURA 12 es una fotografía de superficies de microchips que comparan los resultados de dos reactivos de cúmulos de catalizadores diferentes;

La FIGURA 13A es una fotografía de un análisis en gel de réplicas de RT-PCR para el ARN vírico del dengue en una reacción multiplexada usando cebadores pan-flavivirus mezclados con cebadores Cal/Bun; y

La FIGURA 13B es una fotografía de un análisis en gel de réplicas de RT-PCR para ARN de LaCrosse en reacción multiplexada usando cebadores de pan-flavivirus mezclados con cebadores de virus Cal/Bun.

Descripción detallada

La FIGURA 1 ilustra una realización de un microchip 10 sensor detector. En esta realización, el microchip 10 incluye un primer electrodo 12 y un segundo electrodo 14 colocados de tal manera que el primer 12 y el segundo 14 electrodos no estén en contacto entre sí, con una pluralidad de sondas de captura 16 en forma de una superficie de óxido funcionalizada que permite la fijación y la inmovilización de moléculas de sonda de captura 16 en la superficie sensora 18 entre el primer electrodo 12 y el segundo electrodo 14. Las sondas de captura 16 están diseñadas para capturar productos amplificados por PCR a través de la interacción con las colas en 5' incorporadas durante el proceso de amplificación.

La FIGURA 2 ilustra una realización de un método 20 para la detección de moléculas de ácido nucleico diana. En el bloque 22, las moléculas de ácido nucleico diana recogidas de una muestra biológica se amplifican mediante PCR. La muestra biológica puede ser cualquier tipo de material adecuado, tales como sangre, moco y piel, entre otros. Debe entenderse que puede emplearse cualquier tipo adecuado de metodología de PCR. En esta realización, se usan dos cebadores durante el proceso de PCR. El primer cebador se sintetiza como un oligonucleótido con cola en 5' con un bloque de replicación interno y el segundo cebador es un oligonucleótido sin cola. En un ejemplo, el segundo cebador tiene un grupo fosfato en 5'. Se realizan ciclos múltiples hasta que se forma una pluralidad de amplicones bicatenarios 30 (replicaciones de las moléculas de ácido nucleico diana) que tienen una primera cadena 31 con una cola 32 en 5' y una segunda cadena 33 extendida desde el cebador sin cola, como se ilustra en la FIGURA 3. En un ejemplo, como se ilustra en la FIGURA 3, la segunda cadena 33 tiene un grupo 5'-fosfato 34. En otro ejemplo, no ilustrado, la segunda cadena 33 no tiene un grupo 5'-fosfato. Volviendo a la FIGURA 2, en el bloque 24, los amplicones 30 se hibridan con las sondas de captura 16 en la superficie del microchip detector 10, como se ilustra en la FIGURA 1. En particular, las colas en 5' de los amplicones 30 se unen a las sondas de captura 16, como se ilustra en la FIGURA 4.

En el bloque 26, los amplicones 30 hibridados se convierten en moléculas monocatenarias 36, como se ilustra en la FIGURA 5. En un ejemplo, en lugar de emplear calor, que desnaturalizaría los amplicones 30 de las sondas de captura 16, se usa una helicasa direccional de 5' a 3' para convertir los amplicones 30 en moléculas monocatenarias 36. En otro ejemplo, se emplea una exonucleasa para convertir los amplicones 30 en moléculas monocatenarias 36. En este ejemplo, la exonucleasa tiene una direccionalidad de 5' a 3' y digiere preferentemente la cadena 33 extendida desde el cebador sin cola. Debido a que la cadena 31 con cola está unida a la sonda de captura 16, la exonucleasa no puede acceder al extremo 5' de la cadena 31 y, por lo tanto, no puede digerir la cadena 31, previniendo la degradación de la cadena 31 con cola. En un ejemplo, dependiendo de la capacidad de procesamiento de la nucleasa o del impedimento estérico a una distancia particular de la superficie sensora 18, la cadena 33 puede experimentar una digestión incompleta, dando como resultado una parte 38 restante de la cadena 33 digerida. En un ejemplo, la cadena 33 extendida desde el cebador sin cola se sintetiza con un fosfato 5' y la exonucleasa es una exonucleasa lambda.

La digestión de la cadena 33 expone la región de secuencia interna de la cadena 31 con cola. En el bloque 28 del método 20 (FIGURA 2), un reactivo catalizador, tal como un reactivo catalizador de oro, se hibrida directamente con la cadena 31 con cola, como se ilustra en la FIGURA 6. En una realización, el reactivo catalizador está en forma de cúmulos de catalizadores. En una realización, un único cúmulo de catalizadores 60 se une a la cadena 31 con cola. En otra realización, y dependiendo de la longitud de la cadena 31 con cola, una pluralidad de cúmulos de catalizadores 60 se unen a cada cadena 31 con cola.

Dado que un oligonucleótido genérico no es adecuado para unirse a secuencias internas dentro de los amplicones, los cúmulos de catalizadores son específicos de diana, es decir, los cúmulos de catalizadores se unen a secuencias diana específicas en la cadena 31. Debido a que los artefactos de dímero de cebador no incluyen estas secuencias diana, los cúmulos de catalizadores 60 no se unen a artefactos de dímero de cebador, evitando de esta manera posibles mediciones falsas positivas. Como se ilustra en la FIGURA 7A, en un ejemplo, un oligonucleótido 40 modificado con tiol puede hacerse reaccionar con un cúmulo de catalizadores 42 para formar un cúmulo de catalizadores 44 funcionalizado con al menos 20 oligonucleótidos. En otro ejemplo, ilustrado en la FIGURA 7B, un oligonucleótido universal 46 que posee una secuencia 45 de unión de cúmulo universal y una secuencia 47 de unión específica de amplicón puede hibridarse con un cúmulo 48 genérico base para formar un cúmulo de catalizadores 50. Como resultado, cada nuevo oligonucleótido se concatena en el extremo 3' con una secuencia específica de adaptador complementaria al oligonucleótido genérico del cúmulo. Mientras que el cúmulo de catalizadores 50 resultante en la FIGURA 7B se representa con cuatro oligonucleótidos 52 adaptadores hibridados, debe entenderse que la cantidad real de adaptadores dependerá del tamaño del cúmulo, lo que limita el número de oligonucleótidos de captura en el grupo base y la estequiometría de los oligonucleótidos adaptadores añadidos al cúmulo.

Como se ilustra en la FIGURA 8A, los cúmulos 48 genéricos base pueden prepararse con mezclas de oligonucleótidos de sonda A, B, C, D para formar un cúmulo de catalizadores 54 con capacidades de multiplexado. Dependiendo del tamaño del cúmulo, que determina el área superficial disponible para la funcionalización, es posible cargar múltiples sondas diferentes en un solo cúmulo. Para soportar reacciones de metalización eficientes, la relación para el número de cada tipo de sonda por cúmulo puede requerir optimización. Como se ilustra en la FIGURA 8B, pueden crearse mezclas adaptadas de cúmulos multiplexados 54. Las mezclas de cúmulos multiplexados 54 pueden multiplexarse para un gran número de amplicones direccionados y poblar cada amplicón direccionado con múltiples cúmulos, como se ilustra en la FIGURA 8C.

Volviendo a la FIGURA 2, en el bloque 30, la metalización de los cúmulos de catalizadores 60, que sirven como sitios de nucleación catalítica, puede realizarse para formar una película conductora y puede medirse la resistencia entre los electrodos 12, 14 (FIGURA 1) para detectar moléculas de ácido nucleico diana en el bloque 32. En un ejemplo, los cúmulos de catalizadores 60 son cúmulos de oro y se aplica un reactivo revelador de oro a los cúmulos de catalizadores 60 para que caigan en cascada en el desarrollo de la película conductora, que en este ejemplo es una película de oro. En este ejemplo, la presencia de la película de oro corta eléctricamente el espacio entre los electrodos 12, 14 y se mide por una caída en la resistencia. En este ejemplo, un sensor negativo tiene una resistencia de más de un millón de ohmios y un sensor positivo tiene una resistencia de aproximadamente mil ohmios.

Ejemplo:

Se usó una prueba existente desarrollada para Plasmodium faliciparum para probar el método 20 descrito anteriormente. La FIGURA 9 es una captura de pantalla tomada del programa INVITROGEN™ que muestra una parte del gen ribosómico 18S para el que se diseñan los cebadores (que se muestran en negrita). Normalmente, los dos cebadores, el cebador directo 60 y el cebador inverso 62, usados en la PCR para este método, cada uno tiene un sensor y un catalizador que se une a la cola en 5'. Sin embargo, usando el método 20 descrito anteriormente, se identificó un nuevo cebador inverso 64 situado posteriormente al cebador inverso 62 original. La síntesis del nuevo cebador inverso 64 omitió la cola 5' para la unión del catalizador e incluyó un grupo 5'-fósforo para facilitar la degradación de la exonucleasa.

Debido a que la cola 5' del cebador inverso original 62 se hibrida con un reactivo catalizador universal, la modificación del cúmulo de catalizadores para su uso con el método 20 se logró mediante la hibridación previa del oligonucleótido cebador inverso original en un cúmulo universal para formar cúmulos de oro de catalizador específicos de diana. La preparación de estos cúmulos de oro de catalizadores específicos de diana incluyó una incubación calentada con un exceso molar de 1000 veces del cebador 62, enfriamiento a temperatura ambiente y eliminación del exceso de oligonucleótido no unido mediante lavado, repetido dos veces, mediante centrifugación de alta velocidad y resuspensión con el tampón de reactivo final. De forma similar, se preparó un segundo reactivo catalizador 66 con especificidad hacia un elemento de secuencia diferente ubicado anteriormente a la secuencia de unión del primer cúmulo. La capacidad de este segundo grupo para efectuar la metalización y la detección sirvió solo como un intento preliminar para evaluar la capacidad de procesamiento de la exonucleasa en la digestión de los amplicones unidos al sensor. Con este amplicón derivado particular, la nucleasa debe haberse digerido en al menos 95 nucleótidos de degradar completamente la cadena de ADN extraña, dejando un tracto monocatenario de unos ochenta nucleótidos disponibles para la unión del cúmulo.

Se evaluaron exonucleasas seleccionadas de 5' a 3' con propiedades adecuadas para realizar una digestión según el método 20. Se identificaron dos exonucleasas disponibles en el mercado adecuadas, Lambda y T7. Lambda se usó en este ejemplo. Las FIGURAS 10 y 11 ilustran los resultados de este experimento.

La FIGURA 10 ilustra los resultados de experimentos aproximados de tiempo de tratamientos con exonucleasa lambda en amplicones derivados hibridados con microchips. Todos los microchips en el Panel A y el Panel B se hibridaron durante cinco minutos a 45 grados Celsius con 100 ng del amplicón, se lavaron dos veces sumergiéndolos en un volumen de 10 ml de tampón de hibridación y se secaron en una corriente de gas nitrógeno. En una placa Petri humidificada mantenida en una incubadora a 37 grados Celsius, los microchips se mancharon con 25 |jl de solución de reacción Lambda que contenía una unidad de exonucleasa. Una unidad de exonucleasa se define como la cantidad de enzima requerida para producir 10 nmol de desoxirribonucleótido soluble en ácido a partir de un sustrato bicatenario en un volumen de reacción total de 50 j l en 30 minutos a 37 grados Celsius en tampón de reacción de exonucleasa lambda IX con 1 jg de dúplex [3H]-ADN sometido a ultrasonidos. Después de la incubación durante un tiempo designado, indicado encima de cada microchip, las reacciones se extinguieron transfiriendo los microchips a una placa Petri con 20 ml de tampón de hibridación. Posteriormente, para la metalización, la hibridación del catalizador con grupos modificados con el oligonucleótido cebador se realizó durante cinco minutos a 45 grados Celsius, se realizaron dos lavados haciendo girar los chips en placas Petri que contenían tampón de hibridación y después se realizó el desarrollo de oro durante cuatro minutos a 55 grados Celsius con 25 j l de reactivo revelador colocado en la superficie del chip. La FIGURA 11 ilustra el efecto de la titulación de la exonucleasa lambda sobre el desarrollo de oro de los amplicones diana que se hibridaron en la superficie de los microchips. Los microchips se hibridaron como se describe anteriormente con respecto a la FIGURA 10. Sin embargo, las unidades de exonucleasa Lambda usadas en cada microchip ilustrado en la FIGURA 11 se variaron como se indica arriba de cada microchip.

Un descubrimiento de estos experimentos fue que la exonucleasa Lambda no podía digerir la cadena extendida del cebador de la cola 5', lo que habría provocado una pérdida en la capacidad de capturar el reactivo catalizador. Este descubrimiento está respaldado por el experimento de digestión gruesa de mayor duración ilustrado en la FIGURA 10, lo que demuestra que no hay pérdida de metalización del chip, incluso con el tiempo de incubación Lambda más extenso de 300 minutos.

Se investigó la capacidad de los grupos modificados con adaptador para hibridar con un sitio más interno dentro de la cadena con cola en 5' mediante la preparación del segundo reactivo de cúmulo, descrito anteriormente. Este segundo grupo se formó para unirse a unos treinta nucleótidos próximos al sitio de hibridación del primer grupo. Los resultados de esta investigación ilustrada en la FIGURA 12, que compara el desarrollo de un primer microchip 70 procesado con el primer reactivo de cúmulo y un segundo microchip 72 procesado con el segundo reactivo de cúmulo. La comparación del primer microchip 70 y el segundo microchip 72 muestra que ambos cúmulos funcionaron igualmente bien produciendo manchas de oro comparables en los respectivos microchips tratados. Además, los resultados establecieron que, en la mayoría de los amplicones hibridados, la exonucleasa Lambda digirió un mínimo de noventa bases y no se inhibió mientras se acercaba a la superficie del microchip. Además, el tramo más largo de ADN monocatenario con el que interaccionaba el segundo grupo no parecía afectar a la unión del segundo cúmulo en relación con la unión del primer cúmulo.

Usando el método descrito anteriormente para Plasmodium falciparum (P.f.), se realizaron cincuenta ejecuciones con cartuchos de prueba. Las muestras negativas y positivas consistieron respectivamente en 10 pl de agua o 1 pl de hemocultivo de células de P.f. (105) diluidas en un tampón a 10 pl. Después de pipetear y sellar una muestra en el cartucho de prueba, se llevó a cabo un ensayo completamente automatizado, incluyendo preparación de muestras, amplificación por PCR e hibridación de microchip, digestión con nucleasas y reacciones de metalización. Las mediciones eléctricas posteriores al ensayo se realizaron retirando cada placa de microchip del cartucho después de cada ejecución de prueba e inspeccionando visualmente cada microchip antes de colocar el microchip en una estación de sonda para la recopilación de resultados eléctricos. La Tabla 1 presenta los datos brutos de los cincuenta ensayos. Como se indica por "SIN PRUEBA" en la columna "resultados" de la Tabla 1, determinados ensayos fueron excluidos debido a fallos de la máquina o errores del operador, como se indica con más detalle en la columna "Notas" en la Tabla 1. La Tabla 2 indica los porcentajes de verdaderos positivos y negativos correctos obtenidos. Como se ilustra en la Tabla 2, usando amplicones modificados de una sola cola dieron como resultado un 100 % de mediciones negativas correctas y un 88 % de mediciones positivas correctas.

TABLA 1:

continuación

continuación

TABLA 2:

Ejecuciones totales

Positivos

Negativos

Ejecuciones descartadas por fallos del lector

Rendimiento mecánico

Ejecuciones excluidas por error de carga del reactivo del

operador

Ejecución positiva excluida por fuga mecánica

Negativos correctos: Ejecuciones

negativas

Positivos correctos: Ejecuciones

positivas

93,2 %

EJEMPLO 2:

Se evaluaron diversas combinaciones de PCR de transcripción inversa multiplexada (RT-PCR) usando conjuntos de cebadores diseñados para el desarrollo de una prueba de pan-flavivirus/pan-alfavirus/pan-bunyavirus. En este ensayo se usó un total de nueve cebadores, con todos los materiales ensayados derivados de la homogeneización, mediante el batido de perlas impulsado por ultrasonidos, de seis a ocho mosquitos agrupados que tenían o no tenían un virus, VEE-TC83, Dengue o Virus LaCrosse. El material de ácido nucleico se aisló de los homogeneizados usando purificación de partículas magnéticas, desalado por filtración en gel y utilizado en la amplificación por RT-PCR con los conjuntos de cebadores multiplexados apropiados, cebadores pan-flavivirus más bunyavirus o cebadores alfa, para generar amplicones de cola 5' monocatenarios. Los resultados indican que los conjuntos de cebadores para las pruebas pan-alfa y pan-flavivirus se inhiben entre sí durante la amplificación por PCR. Para abordar este problema, el cartucho de prueba proporciona dos cámaras de PCR separadas que permiten que los conjuntos de cebadores que interfieren se ejecuten por separado y se mezclen antes de la hibridación en el chip sensor. La FIGURA 13A ilustra el análisis en gel de réplicas de genes de RT-PCR para el ARN vírico del dengue (carriles 1-4), purificado de mosquitos, en una reacción multiplexada usando cebadores pan-flavivirus mezclados con los cebadores Cal/Bun. El carril 5 es un control negativo sin entrada de ARN. La FIGURA 13B ilustra el análisis en gel de RT-PCR para ARN de LaCrosse (carriles 1-5), purificado de mosquitos, en una reacción multiplexada usando cebadores pan-flavivirus mezclados con los cebadores Cal/Bun. El carril 6 es un control negativo, sin entrada de ARN. Los descubrimientos indican que las combinaciones de cebadores de pan-bunyavirus y panflavivirus son compatibles en las reacciones de PCR.

Las posibles ventajas del método descrito anteriormente incluyen la reducción o la eliminación de mediciones falsas positivas debido a la formación de artefactos de dímero de cebador.

En la medida en que las reivindicaciones recitan la expresión "al menos uno de" en referencia a una pluralidad de elementos, esta recitación pretende significar al menos uno o más de los elementos enumerados y no se limita a al menos uno de cada elemento. Por ejemplo, "al menos uno de un elemento A, un elemento B y un elemento C", pretende indicar el elemento A solo, o el elemento B solo, o el elemento C solo o cualquier combinación de los mismos. "Al menos uno del elemento A, el elemento B y el elemento C" no pretende limitarse a al menos uno de un elemento A, al menos uno de un elemento B y al menos uno de un elemento C.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra con un sensor que comprende un primer electrodo y un segundo electrodo acoplados a una superficie sensora en una disposición separada y una pluralidad de sondas de captura acopladas a la superficie sensora entre el primer electrodo y el segundo electrodo, comprendiendo el método:

realizar la amplificación de moléculas de ácido nucleico a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un primer cebador que tiene una cola en 5' y que comprende un bloque de replicación interno configurado para detener una acción de polimerasa antes de la cola en 5' y un segundo cebador que es complementario a un región de la molécula de ácido nucleico diana y que no tiene cola en 5', en donde la PCR forma una pluralidad de amplicones bicatenarios con una cola en 5' monocatenaria, en donde cada amplicón bicatenario comprende

una primera cadena que incluye una secuencia diana interna, en donde la primera cadena comprende además la cola en 5' y una segunda cadena sin cola;

aplicar la pluralidad de amplicones bicatenarios formados por la PCR a la superficie del sensor;

hibridar la pluralidad de amplicones bicatenarios con la pluralidad de secuencias de sonda de captura, en donde las colas en 5' monocatenarias de la pluralidad de amplicones bicatenarios se unen a la pluralidad de secuencias de sonda de captura;

convertir la pluralidad de amplicones bicatenarios en una pluralidad de moléculas monocatenarias usando una exonucleasa 5'-3' con especificidad para el ADN bicatenario para exponer la secuencia diana de la primera cadena, en donde las colas en 5' de la pluralidad de moléculas monocatenarias permanecen unidas a la pluralidad de secuencias de sonda de captura y un extremo 3' opuesto no está unido;

hibridar un cúmulo de catalizadores con la secuencia diana interna de cada una de la pluralidad de moléculas monocatenarias; poner en contacto la pluralidad de moléculas monocatenarias que tienen un cúmulo de catalizadores unido a ellas con un metal o una aleación metálica, en donde el metal o la aleación metálica se une al cúmulo de catalizadores para formar una película de metal conductor entre el primer electrodo y el segundo electrodo; y

determinar si puede transportarse una corriente eléctrica entre los electrodos, indicando la corriente eléctrica entre los electrodos la presencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde convertir la pluralidad de amplicones en moléculas monocatenarias comprende emplear una exonucleasa para digerir la segunda cadena sin cola.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el cúmulo de catalizadores comprende un cúmulo de catalizadores de oro y en donde el metal comprende oro.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además formar un cúmulo de catalizadores específicos de diana configurado para unirse a una región interior de la primera cadena del amplicón.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el cúmulo de catalizadores es un cúmulo genérico que tiene acoplado un oligonucleótido adaptador al mismo.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el cúmulo genérico tiene una pluralidad de oligonucleótidos acoplados al mismo, estando configurado cada oligonucleótido para dirigirse a un amplicón diferente.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la unión del cúmulo de catalizadores comprende la unión de una pluralidad de cúmulos de catalizadores a las secciones interiores de cada una de las moléculas monocatenarias.