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ES2925868T3 - Genes implicados en la producción de noscapina - Google Patents

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ES2925868T3
ES2925868T3 ES17162348T ES17162348T ES2925868T3 ES 2925868 T3 ES2925868 T3 ES 2925868T3 ES 17162348 T ES17162348 T ES 17162348T ES 17162348 T ES17162348 T ES 17162348T ES 2925868 T3 ES2925868 T3 ES 2925868T3
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Spain
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nucleic acid
polypeptide
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acid molecule
sequence
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ES17162348T
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English (en)
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Thilo Winzer
Ian Alexander Graham
Tracey Carol Walker
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Sun Pharmaceutical Industries Australia Pty Ltd
Original Assignee
Sun Pharmaceutical Industries Australia Pty Ltd
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Abstract

La descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada de un cultivo de Papaver somniferum que produce el alcaloide opiáceo noscapina que comprende 10 genes implicados en la biosíntesis de alcaloides opiáceos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Genes implicados en la producción de noscapina
Esta descripción se refiere al aislamiento y la secuenciación de una molécula de ácido nucleico que incluye un conglomerado de genes que comprende 10 genes de un cultivar de Papaver somniferum [adormidera] productor de noscapina; células transgénicas transformadas con dicha molécula de ácido nucleico, variantes de secuencias de los genes; el uso de dichos genes/proteínas en la producción de alcaloides opiáceos; y el uso de los genes como un marcador de plantas de P. somniferum que sintetizan alcaloides opiáceos, en particular noscapina.
Antecedentes de la descripción
La noscapina pertenece a la subclase de ftalideisoquinolina de los alcaloides de isoquinolina estructuralmente diversos, mientras que la codeína, la morfina, la tebaína y la oripavina pertenecen a la subclase de morfinanos. Si bien la biosíntesis de los morfinanos se ha dilucidado a nivel molecular, nuestro conocimiento de la biosíntesis de noscapina no ha avanzado significativamente desde la demostración mediante el uso del marcaje con isótopos en la década de 1960, que se deriva de la escoulerina. Comprender la genética bioquímica que sustenta la biosíntesis de noscapina debería permitir una mejor producción de noscapina y moléculas relacionadas tanto en la amapola como en otros sistemas de expresión.
P. somniferum es la planta de la que se extrae el opio. La adormidera es la única amapola de la familia Papaveraceae explotada comercialmente y es la principal fuente de opiáceos naturales. El opio se extrae del látex cosechado de las vainas de semillas verdes. Otra fuente de alcaloides opiáceos es la paja de amapola, que es la planta madura seca. P. somniferum es una fuente de alcaloides opiáceos clínicamente útiles tales como la morfina, la codeína, la tebaína, la noscapina [también conocida como narcotina] y la papaverina. La aplicación clínica de estos alcaloides opiáceos y sus derivados es amplia, que tienen uso como analgésicos, supresores de la tos y antiespasmódicos. Aunque no se usa como un agente farmacológico por derecho propio, la tebaína es un opiáceo particularmente útil que puede convertirse en una variedad de compuestos tales como hidrocodona, oxicodona, oximorfona, nalbufina, naltrexona, buprenorfina y etorfina. Estos intermediarios también tienen amplias aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, la oxicodona, la oximorfona y la etorfina se usan ampliamente como analgésicos para el dolor moderado a intenso y, a menudo, se combinan con otros analgésicos tales como el ibuprofeno. La buprenorfina se usa en el tratamiento de la adicción a la heroína y el dolor crónico. La naltrexona se usa en el tratamiento de la adicción al alcohol y a los opiáceos.
Esta descripción se refiere al análisis transcriptómico de cultivares de P. somniferum productores de noscapina en comparación con cultivares de P. somniferum no productores de noscapina. El análisis ha revelado la expresión exclusiva de un conglomerado de genes principalmente del citocromo P450 y de la metiltransferasa en una variedad de amapola que produce noscapina. Estos genes están sorprendentemente ausentes de los genomas de dos variedades no productoras de noscapina. El análisis de una población de mapeo F2 indicó que los genes están estrechamente vinculados en la variedad de noscapina y la secuenciación de cromosomas artificiales bacterianos confirmó que existen como un nuevo conglomerado de genes para la biosíntesis de alcaloides opiáceos.
Declaraciones de la invención
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia de nucleótidos representada por la secuencia en la SEQ ID NO: 8;
ii) una secuencia de nucleótidos en donde dicha secuencia es redundante como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i);
iii) una molécula de ácido nucleico que es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 que codifica un polipéptido que tiene actividad carboxiltransferasa;
iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 18 o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos de longitud completa establecida en la SEQ ID NO: 18 en donde dicho polipéptido tiene actividad carboxilesterasa.
En un aspecto o modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste de una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 8 en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con actividad carboxilesterasa.
En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico incluye además una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 o 10.
En una modalidad preferida de la invención dicha molécula de ácido nucleico incluye 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico incluye cada una de las secuencias de nucleótidos representadas en las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
i) un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 18; o
ii) un polipéptido modificado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos modificada en donde dicho polipéptido se modifica mediante la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido de la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 18 y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de longitud completa en la SEQ ID NO: 18 y tiene actividad carboxilesterasa.
Un polipéptido modificado como se describe en la presente descripción puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones, truncamientos que pueden estar presentes en cualquier combinación. Entre las variantes preferidas están aquellas que varían de un polipéptido de referencia por sustituciones conservativas de aminoácidos. Dichas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado por otro aminoácido de características similares. La siguiente lista no limitante de aminoácidos se consideran reemplazos conservativos (similares): a) alanina, serina y treonina; b) ácido glutámico y ácido aspártico; c) asparagina y glutamina; d) arginina y lisina; e) isoleucina, leucina, metionina y valina y f) fenilalanina, tirosina y triptófano. Las más altamente preferidas son las variantes que retienen o mejoran la misma función y actividad biológica que el polipéptido de referencia del que varía.
En una modalidad, los polipéptidos modificados tienen al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de identidad y al menos 99 % de identidad con la mayoría o la secuencia de aminoácidos de longitud completa ilustrada en la presente descripción.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico en el vector está bajo el control de, y operablemente unido a, un promotor adecuado u otros elementos reguladores para la transcripción en una célula huésped, tal como una célula microbiana, (por ejemplo, de bacteria, levadura) o vegetal. El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que funciona en múltiples huéspedes. En el caso de ADN genómico, este puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de ADNc este puede estar bajo el control de un promotor adecuado u otros elementos reguladores para la expresión en la célula huésped.
Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos aguas arriba del sitio de iniciación transcripcional y que contiene todas las regiones reguladoras requeridas para la transcripción. Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos, específicos de tejido, inducibles, de desarrollo u otros para la expresión en células vegetales comprendidas en plantas en dependencia de del diseño. Dichos promotores incluyen promotores virales, fúngicos, bacterianos, animales y derivados de plantas capaces de funcionar en células vegetales.
Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor CaMV 35S (Odell y otros (1985) Nature 313, 9810­ 812); actina de arroz (McElroy y otros (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christian y otros (1989) Plant Mol. Biol. 18 (675-689); pEMU (Last y otros (1991) Theor Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten y otros (1984) EMBO J.
3. 2723-2730); promotor de ALS (Solicitud de EE. Uu . Serie No. 08/409,297), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen aquellos en las patentes de Estados Unidos núms. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680, 5,268,463; y 5,608,142.
Pueden usarse promotores regulados por producto químico para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. En dependencia del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por producto químico, donde la aplicación del producto químico induce la expresión del gen, o un promotor reprimible por producto químico, donde la aplicación del producto químico reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles por producto químico se conocen en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, el promotor In2-2 de maíz, que se activa por los protectores herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor GST de maíz, que se activa por compuestos electrófilos hidrófobos que se usan como herbicidas preemergentes, y el promotor PR-1a de tabaco, que se activa por el ácido salicílico. Otros promotores regulados por producto químico de interés incluyen promotores sensibles a esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides Schena y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425 y McNellis y otros (1998) Plant J. 14(2): 247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (véase, por ejemplo, Gatz y otros (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237, y las patentes de Estados Unidos núms. 5,814,618 y 5,789,156.
Cuando se desea una expresión mejorada en tejidos particulares, pueden utilizarse promotores específicos de tejido. Los promotores específicos del tejido incluyen los descritos por Yamamoto y otros (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata y otros (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen y otros (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337­ 343; Russell y otros (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart y otros (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp y otros (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascni y otros (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto y otros (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco y otros (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Mutsuoka y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90 (20): 9586-9590; y Guevara-Garcia y otros (1993) Plant J. 4(3): 495-50.
"Operablemente unido" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente posicionado y orientado para que la transcripción se inicie desde el promotor. El ADN operablemente unido a un promotor está "bajo regulación de iniciación transcripcional " del promotor. En un aspecto preferido, el promotor es un promotor específico de tejido, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo.
Particularmente de interés en el presente contexto son los constructos de ácido nucleico que operan como vectores vegetales. Los procedimientos y vectores específicos usados anteriormente con gran éxito en las plantas se describen en Guerineau y Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pág. 121-148. Los vectores adecuados pueden incluir vectores derivados de virus de plantas (véase, por ejemplo, EP194809). Si se desea, pueden incluirse en el constructo marcadores genéticos seleccionables, tales como los que confieren fenotipos seleccionables, tales como resistencia a herbicidas (por ejemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurón, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato).
En una modalidad preferida de la invención, dicho vector es un cromosoma artificial bacteriano [BACS].
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula transgénica transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico o vector de acuerdo con la invención.
En una modalidad preferida de la invención dicha célula es una célula vegetal.
En una modalidad preferida de la invención dicha célula vegetal es del género Papaver.
En una modalidad preferida de la invención dicha célula vegetal es una célula de Papaver somniferum.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una planta que comprende una célula vegetal de acuerdo con la invención.
En una modalidad preferida de la invención dicha planta es del género Papaver; preferentemente Papaver somniferum.
En una modalidad preferida alternativa de la invención, dicha célula es una célula microbiana; preferentemente una célula bacteriana o fúngica [por ejemplo, levadura, Saccharomyces cerevisae].
En una modalidad preferida de la invención, dicha célula está adaptada de manera que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos de acuerdo con la invención se sobreexpresa en comparación con una célula no transgénica de la misma especie.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un casete de transcripción en donde dicho casete incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8, y está adaptado para la expresión mediante la provisión de al menos un promotor operablemente unido a dicha secuencia de nucleótidos de manera que tanto las moléculas con sentido como las antisentido se transcriben desde dicho casete.
En una modalidad preferida de la invención, dicho casete está adaptado de manera que tanto las moléculas de ácido ribonucleico con sentido como las antisentido se transcriben a partir de dicho casete, en donde dichas moléculas de ácido nucleico sentido y antisentido están adaptadas para hibridarse en al menos una parte o la totalidad de su longitud para formar un ARN inhibidor o ARN de horquilla corta.
En una modalidad preferida de la invención, dicho casete se proporciona con al menos dos promotores adaptados para transcribir tanto las hebras con sentido como las antisentido de dicha molécula de ácido ribonucleico.
En una modalidad preferida alternativa de la invención, dicho casete comprende una molécula de ácido nucleico en donde dicha molécula comprende una primera parte unida a una segunda parte en donde dicha primera y segunda partes son complementarias en al menos parte de su secuencia y además en donde la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico produce una molécula de ácido ribonucleico que forma una región bicatenaria mediante el apareamiento de bases complementarias de dicha primera y segunda partes lo que forma de esta manera un ARN de horquilla corta.
Una técnica para eliminar específicamente la función génica es a través de la introducción de ARN bicatenario, también denominado ARN inhibidor pequeño/de interferencia (ARNip) o ARN de horquilla corta [ARNhc], en una célula que da como resultado la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluida en la molécula de ARNip/ARNhc. La molécula de ARNip comprende dos hebras complementarias de ARN (una hebra sentido y una hebra antisentido) hibridadas entre sí para formar una molécula de ARN bicatenario. La molécula de ARNip se deriva típicamente de exones del gen que se van a eliminar. Se ha dilucidado el mecanismo de interferencia del ARN. Muchos organismos responden a la presencia de ARN bicatenario mediante la activación de una cascada que conduce a la formación de ARNip. La presencia de ARN bicatenario activa un complejo proteico que comprende ARNasa III que procesa el ARN bicatenario en fragmentos más pequeños (ARNip, aproximadamente 21-29 nucleótidos de longitud) que pasan a formar parte de un complejo ribonucleoproteico. El ARNip actúa como una guía para que el complejo de ARNasa escinda el ARNm complementario a la hebra antisentido del ARNip, lo que resulta en la destrucción del ARNm.
En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico es parte de un vector adaptado para la expresión en una célula vegetal.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula vegetal transfectada con una molécula de ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención, en donde dicha célula tiene una expresión reducida de un polipéptido de acuerdo con la invención.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un proceso para la modificación de papaveroxina y desmetilpapaveroxina que comprende:
i) proporcionar una célula vegetal de Papaver transgénica de acuerdo con la invención;
ii) cultivar dicha célula vegetal de Papaver para producir una planta de Papaver transgénica; y opcionalmente i) cosechar dicha planta de Papaver transgénica, o parte de la misma.
En un método preferido de la invención, dicho material vegetal cosechado se seca y se extrae el alcaloide opiáceo. De acuerdo con un aspecto alternativo de la invención, se proporciona un proceso para la modificación de papaveroxina o desmetilpapaveroxina que comprende:
i) proporcionar una célula microbiana transgénica de acuerdo con la invención que expresa una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en cultivo con al menos papaveroxina o desmetilpapaveroxina; ii) cultivar la célula microbiana en condiciones que modifican la papaveroxina o la desmetilpapaveroxina; y opcionalmente
iii) aislar narcotinohemiacetal o narceotolinohemiacetal de la célula microbiana o cultivo celular.
En un método preferido de la invención, dicha célula microbiana es una célula bacteriana o una célula fúngica/levadura.
Si se usan células microbianas como organismos en el proceso de acuerdo con la invención, se hacen crecer o se cultivan de la manera con la que el trabajador experto en la técnica está familiarizado, en dependencia del organismo huésped. Por regla general, los microorganismos se cultivan en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, normalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, normalmente en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno tales como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, elementos traza tales como sales de hierro, manganeso y magnesio y, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas comprendidas entre 0 °C y 100 °C, preferentemente entre 10 °C y 60 °C, mientras se gasifica en oxígeno.
El pH del medio líquido puede mantenerse constante, es decir, regularse durante el período de cultivo, o no. Los cultivos pueden cultivarse por lotes, semilotes o continuamente. Los nutrientes pueden proporcionarse al comienzo de la fermentación o pueden alimentarse de forma semicontinua o continuamente. Los alcaloides opiáceos metilados producidos pueden aislarse de los organismos como se describió anteriormente mediante procedimientos conocidos por el trabajador experto en la técnica, por ejemplo mediante extracción, destilación, cristalización, si es apropiado precipitación con sal y/o cromatografía. Para ello, ventajosamente, los organismos pueden ser disgregados previamente. En este proceso, el valor del pH se mantiene ventajosamente entre pH 4 y 12, preferentemente entre pH 6 y 9, de manera especial preferentemente entre pH 7 y 8.
El medio de cultivo a usar debe cumplir adecuadamente con los requisitos de las cepas en cuestión. En el libro de texto "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociendad americana para bacteriología (Washington DC, EE. UU., 1981) pueden encontrarse descripciones de medios de cultivo para varios microorganismos.
Como se describió anteriormente, estos medios que pueden emplearse de acuerdo con la invención comprenden normalmente una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o elementos traza. Las fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di- o polisacáridos. Los ejemplos de fuentes de carbono son glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azúcares también pueden añadirse a los medios a través de compuestos complejos tales como la melaza u otros subproductos del refinado del azúcar. También puede ser ventajosa la adición de mezclas de una variedad de fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y/o grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido linoleico, alcoholes y/o o polialcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol y/o etanol, y/o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético y/o ácido láctico.
Las fuentes de nitrógeno son normalmente compuestos de nitrógeno orgánicos o inorgánicos o materiales que comprenden estos compuestos. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden amoniaco en forma líquida o gaseosa o sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes complejas de nitrógeno tales como licor de maíz, harina de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente o como una mezcla.
Los compuestos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en los medios comprenden las sales de cloruro, fósforo y sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro.
Los compuestos inorgánicos que contienen azufre tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitas, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, o también compuestos orgánicos de azufre tales como mercaptanos y tioles pueden usarse como fuentes de azufre para la producción de productos químicos finos que contienen azufre, en particular de metionina.
Como fuentes de fósforo pueden usarse ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio.
Pueden añadirse agentes quelantes al medio para mantener los iones metálicos en solución. Los agentes quelantes particularmente adecuados comprenden dihidroxifenoles tales como catecol o protocatecuato y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico.
Los medios de fermentación usados de acuerdo con la invención para el cultivo de microorganismos contienen normalmente también otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales se derivan frecuentemente de componentes de medios complejos tales como extracto de levadura, melaza, licor de macerado de maíz y similares. Además, es posible añadir precursores adecuados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos del medio depende en gran medida del experimento particular y se decide individualmente para cada caso específico. La información sobre la optimización de los medios puede encontrarse en el libro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Editores P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pág. 53-73, ISBN 0199635773). Los medios de crecimiento también pueden obtenerse de proveedores comerciales, por ejemplo, Standard 1 (Merck) o BHI (infusión de cerebro y corazón, DIFCO) y similares.
Todos los componentes de los medios se esterilizan, ya sea por calor (20 min a 1,5 bar y 121 °C) o por esterilización por filtración. Los componentes pueden esterilizarse juntos o, si es necesario, por separado. Todos los componentes de los medios pueden estar presentes al comienzo del cultivo o añadirse continuamente o por lotes, según se desee. La temperatura de cultivo está normalmente entre 15 °C y 45 °C, preferentemente de 25 °C a 40 °C, y puede mantenerse constante o puede modificarse durante el experimento. El pH del medio debe estar en el intervalo de 5 a 8,5, preferentemente alrededor de 7,0. El pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo al añadir compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco y amoniaco acuoso o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La formación de espuma puede controlarse al emplear antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos es posible añadir al medio sustancias adecuadas que tengan un efecto selectivo, por ejemplo, antibióticos. Las condiciones aeróbicas se mantienen al introducir en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire ambiente. La temperatura del cultivo es normalmente de 20 °C a 45 °C y preferentemente de 25 °C a 40 °C. El cultivo continúa hasta que la formación del producto deseado es máxima. Este objetivo normalmente se logra dentro de 10 a 160 horas.
El caldo de fermentación entonces puede procesarse adicionalmente. La biomasa puede, de acuerdo con lo que se requiera, eliminarse total o parcialmente del caldo de fermentación por métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos o dejarse completamente en dicho caldo. Es ventajoso procesar la biomasa después de su separación.
Sin embargo, el caldo de fermentación también puede espesarse o concentrarse sin separar las células, mediante el uso de métodos conocidos tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de película delgada, evaporador de película descendente, por ósmosis inversa o por nanofiltración. Finalmente, este caldo de fermentación concentrado puede procesarse para obtener los alcaloides opiáceos presentes en el mismo.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un gen codificado por una molécula de ácido nucleico como se representa por la secuencia de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 8, o una molécula de ácido nucleico que es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 y codifica un polipéptido con actividad carboxilesterasa como un medio para identificar un locus en donde dicho locus está asociado con una expresión o actividad alterada de dicha actividad carboxilesterasa.
La mutagénesis como medio para inducir cambios fenotípicos en organismos se conoce bien en la técnica e incluye, pero no se limita a, el uso de agentes mutagénicos tales como mutágenos químicos [por ejemplo, análogos de bases, agentes desaminantes, agentes intercalantes de ADN, agentes alquilantes, transposones, bromo, azida sódica] y mutágenos físicos [por ejemplo, radiación ionizante, exposición a psoraleno combinada con radiación UV]. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una planta de P. somniferum que tiene expresión alterada de un polipéptido carboxilesterasa obtenible mediante un proceso que comprende las etapas de: i) mutagénesis de la semilla de tipo salvaje de una planta de P. somniferum que expresa dicho polipéptido; ii) cultivo de la semilla en i) para producir la primera y subsiguientes generaciones de plantas;
iii) obtener la semilla de la planta de la primera generación y de las generaciones subsiguientes de plantas; iv) determinar si la semilla de dicha primera y subsiguientes generaciones de plantas tiene una secuencia de nucleótidos alterada y/o una expresión alterada de dicho polipéptido carboxilesterasa;
v) obtener la semilla o las plantas con una secuencia de nucleótidos alterada que codifica un polipéptido carboxilesterasa alterado en donde la actividad enzimática en la modificación de papaveroxina o desmetilpapaveroxina está alterada en comparación con P. somniferum de tipo salvaje.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para el análisis de una planta i) obtener una muestra de una planta mutada y analizar la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se representa en 8; b) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 codifica un polipéptido con actividad carboxilesterasa;
ii) comparar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la planta de tipo salvaje original y opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico se analiza mediante un método que comprende las etapas de:
iii) extraer ácido nucleico de dichas plantas mutadas;
iv) amplificación de una parte de dicha molécula de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa;
v) formar una preparación que comprenda el ácido nucleico amplificado y el ácido nucleico extraído de la semilla de tipo salvaje para formar un ácido nucleico heterodúplex;
vi) incubar dicha preparación con una nucleasa monocatenaria que corta en una región de ácido nucleico heterodúplex para identificar el error de apareamiento en dicho heterodúplex; y
vii) determinar el sitio del error de apareamiento en dicho heterodúplex de ácido nucleico; y
viii) obtener una planta con una mutación en el ácido nucleico que codifica dicho polipéptido carboxilesterasa. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector viral que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
El silenciamiento de genes inducido por virus [VIGS] se conoce en la técnica y explota un mecanismo de defensa antiviral mediado por ARN. Las plantas que están infectadas con un virus no modificado inducen un mecanismo que se dirige específicamente al genoma viral. Sin embargo, los vectores virales que se modifican genéticamente para incluir moléculas de ácido nucleico derivadas de genes de la planta huésped también inducen la inhibición específica de la expresión del vector viral y, adicionalmente, se dirigen al ARNm del huésped. Esto permite el silenciamiento génico específico de genes sin modificación genética del genoma de la planta y es esencialmente una modificación no transgénica.
A través de la descripción y reivindicaciones de esta descripción, las palabras "comprenden" y "contienen" y las variaciones de las palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende", significan "que incluyen pero no se limitan a", y no se pretende excluir (y no se excluyen) otros restos, aditivos, componentes, números enteros o etapas. "Consistir esencialmente" significa tener los enteros esenciales pero que incluyen los enteros que no afectan materialmente la función de los enteros esenciales.
A través de la descripción y reivindicaciones de esta descripción, el singular abarca el plural a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se entiende que la descripción contempla la pluralidad, así como también los singulares, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera.
Los rasgos, enteros, características, compuestos, restos de productos químicos o grupos descritos junto con un aspecto particular, modalidad o ejemplo de la invención se entiende que son aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descrito en la presente descripción a menos que sea incompatible con éste.
Una modalidad de la invención se describirá ahora a manera de ejemplo solamente y con referencia a las siguientes figuras:
Figura 1: Identificación de genes presentes exclusivamente en el genoma de una variedad de amapola productora de noscapina, HN1 (alta noscapina 1). (A) Abundancia relativa de los principales alcaloides extraídos de las cápsulas de tres variedades comerciales de amapola, HM1 (alta morfina 1), HT1 (alta tebaína 1) y HN1. M = morfina, C = codeína, T = tebaína, O = oripavina y N = noscapina. (B) Las bibliotecas de EST del tallo y la cápsula se generaron mediante pirosecuenciación y secuencias contiguas únicas ensambladas como se describió en materiales y métodos. Diez genes (PSMT1, PSMT2, PSMT3, CYP82X1, CYP82X2, CYP82Y1, CYP719A21, PSAT1, PSSDR1 y PSCXE1) como se define en el texto, estaban representados solo en bibliotecas de EST de la variedad HN1. La abundancia de EST de otros cinco genes de P. somniferum funcionalmente caracterizados (BBE, TNMT, SalR, SalAT y T6DM) muestran que se expresan en las tres variedades y en niveles consistentemente más altos en el tallo en comparación con la cápsula, al igual que los genes específicos de HN1, como se muestra en el código de color (figura 1). La PCR en el ADN genómico de las tres variedades reveló que los diez genes específicos de HN1 están ausentes de los genomas de las variedades HM1 y HT1 (figura 5);
Figura 2: El análisis de segregación del contenido de noscapina en una población de mapeo F2 demuestra el requerimiento para el conglomerado de genes de noscapina. (A) La representación de diagrama de caja de los niveles de noscapina como porcentaje de peso en seco (PS) en líneas parentales cultivadas en invernadero HN1 y HM1 y la generación F1. (B) La generación F2 cultivada en el campo se segregó en tres clases de cero, baja y alta noscapina. La F2 GC- y F2 GC+ indican la ausencia y la presencia respectivamente del conglomerado de genes de noscapina. Los números entre paréntesis indican el número de individuos en cada clase;
Figura 3: El conglomerado de genes HN1. La estructura y la posición de los diez genes específicos de HN1 expresados en tallos y tejidos de la cápsula se muestran por encima de la línea negra central que representa 401 Kb de secuencia genómica. Los exones están representados por cuadros grises rellenos y los intrones por líneas negras finas. Las flechas indican la orientación 5' a 3' de cada gen. Los marcos de lectura abiertos adicionales representados más abajo de la línea negra central están definidos por la clave. Ninguno de estos ORF está representado en las bibliotecas de EST de tallo y cápsula;
Figura 4: Caracterización funcional mediante el uso del silenciamiento de genes inducido por virus de 6 genes del conglomerado de genes HN1. Los resultados tanto del látex de la hoja como de las cápsulas son consistentes con cada uno de estos genes que codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de noscapina (A-F). Todos los compuestos que se acumulan, aparte de la escoulerina, se han identificado supuestamente sobre la base de espectros de masas, como se detalla en la figura 6. El valor de masa a carga (m/z) (M) seguido del tiempo de retención (T) en segundos se muestra para cada compuesto en el eje horizontal. (G) Vía propuesta para la biosíntesis de noscapina en base a los datos de VIGS. Las flechas sólidas representan las etapas soportadas por los datos de VIGS, las flechas punteadas representan las etapas adicionales propuestas. Para los intermediarios de secoberbina, R1 = H u OH, R2 = H u OH y R3 = CH2OH o ChO o COOH (figura 6). La estructura de noscapina está numerada de acuerdo con la convención de IUPAC;
Figura 5: Los diez genes expresados exclusivamente en la variedad HN1 se encuentran en el genoma de HN1 pero están ausentes en el de las variedades HT1 y HM1. (A) Amplificación de fragmentos de los diez genes expresados exclusivamente en HN1 mediante el uso de dos pares de cebadores diferentes. (B) Amplificación de fragmentos de genes de las vías de la rama de protoberberina y morfinano que se expresan en las tres variedades. Los cebadores usados se detallan en la Tabla 3; HyperLadder I (Bioline Reagents, Londres, Reino Unido) se usó como estándar de tamaño molecular;
Figura 6. Evidencia de identidades supuestas de intermediarios de experimentos de VIGS. Todos los paneles muestran los espectros de masas del ion precursor pseudomolecular en el vértice del pico cromatográfico en negro y los espectros de fragmentación MS2 correspondientes en rojo, escalados a abundancia relativa. Los espectros de MS2 se generaron al dirigirse al ion precursor con un ancho de aislamiento de 3 m/z y mediante el uso de una energía de disociación de aislamiento por colisión establecida en 35 %. Todos los espectros de masas se obtuvieron con un ajuste de resolución de 7500. El texto impreso arriba de los iones de diagnóstico seleccionados indica la masa monoisotópica exacta del ion, la fórmula calculada dentro de los límites C=1:100, O=0:200, N=0:3 y H=1:200, y el número/número total de fórmulas devueltas dentro de una ventana de error de 5 ppm. Los fragmentos se reconciliaron con los fragmentos teóricos generados al enviar estructuras precursoras candidatas al programa informático Mass Frontier (versión 5.01.2; HighChem, Bratislava, Eslovaquia). Las estructuras precursoras candidatas se derivaron de las búsquedas en PubChem y la revisión exhaustiva de alcaloides de Papaver spp. (Sariyar (2002) Pure Appl. Chem. 74, 557-574). (A) Tetrahidrocolumbamina; este compuesto se caracterizó de un pico que eluía a los 174 s a partir de CYP719A21 silenciado con VIGS. Ocho de cada diez fragmentos de MS2 se calcularon como factibles por Mass Frontier; solo se muestran los dos fragmentos diagnósticos más abundantes. (B) Secoberbina intermediario 1 (C21H25NO6); este compuesto se caracterizó de un pico que eluía a los 147 s a partir de CYP82X2 silenciado con V iGS. Si R1=Oh , R2=H y R3=CH2OH, entonces este compuesto es narcotolinol, que es consistente con ambos fragmentos anotados. Otra fórmula candidata adecuada sería narcotindiol desmetoxilado (R1=H, R2=OH, R3=CH2OH); sin embargo, esta estructura no formaría el fragmento observado en 206,0816. (C) Secoberbina intermediario 2 (C21H23NO6); este compuesto se caracterizó de un pico que eluía a los 103 s a partir de CYP82X2 silenciado con VIGS. Si r 1=OH, R2=H y R3=CHO, entonces este compuesto sería un derivado desmetilado del macrantaldehído. (D) Papaveroxina; este compuesto se caracterizó de un pico que eluía a los 214 s a partir de PSCXE1 silenciado con VIGS. El fragmento 398,1600 observado es consistente con la desacetilación. (E) narcotinohemiacetal; este compuesto se caracterizó de un pico que eluía a los 121 s de PSSDR1 silenciado con VIGS. (F) Narcotolina (4'-desmetilnoscapina); este compuesto se caracterizó de un pico que eluía a los 208 s a partir de PSMT2 silenciado con VIGS. Otras posibilidades isobáricas fueron 6- o 7-desmetilnoscapina. Sin embargo, el fragmento 206,0816 observado es consistente con una posición 4' hidroxilada. Las estructuras alternativas podrían descartarse al comparar los espectros de fragmentación candidatos con los de la 7-desmetilnoscapina sintética, que eluyó en un tiempo de retención diferente y carecía del fragmento característico 206,0816;
La Tabla 1 ilustra el % de identidad de CYP82Y1, PSCXE1, PSDFR1 y PSAT1 (SEQ ID 17-20) con sus respectivos homólogos más cercanos caracterizados funcionalmente. Los números de acceso proporcionados provienen de las bases de datos GenBank, Swiss-Prot o PDB;
Tabla 2. Genotipado de familias F3 derivadas de dos clases fenotípicas F2: baja noscapina y alta noscapina. Las proporciones de segregación observadas frente a las esperadas respaldan firmemente la hipótesis de que los individuos en la clase F2 de baja noscapina son heterocigotos para el conglomerado de genes HN1 y los individuos de la clase de alta noscapina son homocigotos;
Tabla 3. Secuencias de cebadores e información asociada.
Tabla 1
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Tabla 2
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
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 Materiales y métodos
Material vegetal Tres variedades de amapola de GSK Australia que acumulan predominantemente ya sea noscapina (alta noscapina, HN1), morfina (alta morfina, HM1) o tebaína (alta tebaína HT1), se cultivaron en Maxi (Fleet) Rootrainers™ (Haxnicks, Mere, Reino Unido) bajo vidrio en días de 16 horas en las instalaciones de horticultura de la Universidad de York. El sustrato de crecimiento consistía de 4 partes de John Innes No. 2, 1 parte de Perlita y 2 partes de Vermiculita. La población de mapeo F2 HM1*HN1 se cultivó en el sitio de prueba de campo de GlaxoSmithKline Australia, Latrobe, Tasmania, desde septiembre de 2009 hasta febrero de 2010.
Cruzamiento y autocruzamiento Se llevaron a cabo los cruzamientos entre individuos HN1 y HM1 para generar semillas híbridas F1. En la etapa de gancho del desarrollo de la inflorescencia, se eliminaron los estambres inmaduros de los botones florales de HN1 seleccionados. Los estigmas de HN1 se fertilizaron con polen de flores de HM1 en desarrollo sincrónico poco después del inicio de la antesis. Para evitar que el polen contaminante llegara a los estigmas receptivos, las flores emasculadas se cubrieron con una bolsa de muselina durante cuatro días después de la polinización. Tanto las generaciones F1 como la F2 se autopolinizaron para producir semillas F2 y F3, respectivamente. La autopolinización se aseguró al cubrir las flores poco antes del inicio de la antesis con una bolsa de muselina.
Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc Se recolectaron tallos superiores (definidos como la sección de 2 cm inmediatamente debajo de la cápsula) y cápsulas enteras en dos etapas de desarrollo representadas por 1-3 días y 4-6 días, después de la caída de los pétalos. Se usaron cinco plantas por etapa de desarrollo y cultivar. El material se molió hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido mediante el uso de un mortero y una maja. El ARN se aisló del polvo mediante el uso de un método de extracción basado en CTAB (Chang y otros (1993) Plant Mol. Biol. Rep.
11, 113-116) con pequeñas modificaciones: (i) se realizaron tres extracciones secuenciales con cloroformo:isoamilalcohol (24:1) y (ii) el ARN se precipitó durante la noche con cloruro de litio a 4 °C. Después de la cuantificación espectrofotométrica, se agruparon cantidades iguales de ARN de cinco plantas por cultivar, etapa de desarrollo y órgano. Las muestras agrupadas se sometieron a una etapa de purificación final mediante el uso de un RNeasy Plus MicroKit (Qiagen, Crawley, Reino Unido). El ARN se eluyó típicamente en 30-100 pl de agua. El ADNc se preparó con el estuche de construcción de bibliotecas de ADNc SMART (Clontech, Saint-Germainen-Laye, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante pero mediante el uso de la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) para la síntesis de la primera hebra. El cebador CDSIII/3'PCR se modificó para: 5' ATT CTA GAT CCR ACA TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TVN 3' donde R = A o G, V = A, C o G; N = A/T o C/G. Después de la digestión con Mmel (New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido), el ADNc finalmente se purificó mediante el uso de un estuche de purificación QIAquick PCR (Qiagen, Crawley, Reino Unido).
Pirosecuenciación de ADNc: La pirosecuenciación se realizó en la plataforma de secuenciación Roche 454 GS-FLX (Branford, CT) mediante el uso de ADNc preparado a partir de las siguientes cuatro muestras de cada una de las tres variedades:
i. tallo superior, 1-3 días después de la caída de los pétalos
ii. tallo superior, 4 -6 días después de la caída de los pétalos
iii. cápsula, 1-3 días después de la caída de los pétalos
iv. cápsula, 4 -6 días después de la caída de los pétalos
Análisis de secuencias sin procesar, ensamblaje de secuencias contiguas y anotación Los conjuntos de datos de secuencias sin procesar se derivaron de la secuenciación etiquetada en paralelo en la plataforma de secuenciación 454 (Meyer y otros (2008) Nature Prot. 3, 267-78). Las secuencias de cebadores y etiquetas se eliminaron primero de todas las lecturas de secuencias individuales. El ensamblaje de secuencias contiguas solo se realizó en secuencias de más de 40 nucleótidos y que contenían menos del 3 % de residuos desconocidos (N). Esas secuencias de etiqueta de secuencia expresada (EST) de alta calidad se ensamblaron en secuencias contiguas únicas con el programa de ensamblaje de secuencias CAP3 (Huang y Madan (1999) Genome Res. 9, 868-877), y los cóntigos resultantes se anotaron localmente mediante el uso del programa BLAST2 (Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402) contra la base de datos de péptidos no redundantes descargada del NCBI.
Perfilado de expresión: Se contó el número de EST asociadas con una secuencia de consenso específica que representa cada uno de los genes candidatos detallados en la figura 1 para cada biblioteca de EST. Los números de EST se normalizaron sobre la base del número total de EST obtenidas por biblioteca. Para cada variedad, se combinaron los recuentos de EST para las dos etapas de desarrollo tanto de tallos como de cápsulas. Las diferencias en los niveles de expresión del gen candidato entre órganos y variedades se visualizaron como un mapa de calor mediante el uso de Microsoft Excel.
Preparación de ADN genómico a partir de plantas cultivadas en invernadero
Con el fin de amplificar y obtener secuencias genómicas de los genes candidatos, se recogieron 30-50 mg de material foliar de plántulas cultivadas en invernadero de 4-6 semanas de edad de cada una de las tres variedades. El ADN genómico se extrajo mediante el uso del estuche BioSprint 96 Plant en la estación de trabajo BioSprint 96 (Qiagen, Crawley, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN extraído se cuantificó mediante el uso de Hoescht 33258 y se normalizó a 10 ng/ul.
Amplificación y secuenciación de genes candidatos a partir de ADN genómico
Los cebadores para la amplificación y la secuenciación de Sanger de los genes candidatos a partir del ADN genómico se basaron en las respectivas secuencias contiguas ensambladas a partir de las EST o en las secuencias de BAC. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 3. Las amplificaciones por PCR se realizaron en grupos de ADN genómico que comprendían ADN de cuatro individuos. La amplificación se llevó a cabo típicamente en 10 ng de ADN genómico en 1 x tampón de fusión de alta fidelidad suplementado con cebadores directos e inversos 200 nM, dNTP 0,2 mM, 0,02 unidades/pl de ADN polimerasa de fusión de inicio caliente (Finnzymes, Vantaa, Finlandia). Se usaron condiciones de pCr estándar en todo momento con temperaturas y tiempos de hibridación dependientes de los cebadores y el equipo de PCR.
Extracción de ADN de la población de mapeo F2 cultivada en el campo
Se recolectó 40-50 mg de tejido foliar de plantas F2 en la etapa de crecimiento de 'roseta pequeña' (~10 hojas presentes en cada planta) en tubos de muestra de 1,2 ml. Se añadió una perla de carburo de tungsteno de 3 mm a cada tubo y las muestras se mantuvieron a -80 °C durante un mínimo de dos horas antes de liofilizarlas durante 18 horas. Después de la liofilización, las muestras se pulverizaron mediante molienda de perlas (Modelo TissueLyser, Qiagen, Hilden, Alemania) a 30 Hz durante dos ciclos de 60 s separados por inversión de placas. La extracción de ADN se realizó con el estuche Nucleospin Plant II (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) mediante el uso del conjunto de tampón suministrado PL2/3 al seguir el protocolo del fabricante para la extracción centrífuga. El ADN se cuantificó por espectroscopía UV.
Genotipado de la población de mapeo F2 HN1 * HM1 para la presencia o ausencia de los genes candidatos específicos de HN1
Las plantas de la población de mapeo F2 se genotiparon para la presencia o ausencia de ocho genes candidatos. Los pares de cebadores de genes (Tabla 3) se diseñaron con etiquetas fluorescentes (5'-VIC®-etiquetado) para uso en el aparato capilar ABI 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo típicamente en 10 ng de ADN genómico en tampón 1x GoTaq suplementado con MgCh 1 mM, cebador directo e inverso 500 nM, dNTP 0,125 mM, GoTaq 0,1 U (Promega, Southampton, Reino Unido). Las condiciones de amplificación fueron: 1 min 94 °C, 30-36 ciclos de 30 s de desnaturalización a 94 °C, 30 s de hibridación a 62 °C y 20-50 s de extensión a 72 °C, seguido de una extensión final durante 5 min a 72 °C. El número de ciclos y los tiempos de extensión dependieron del gen candidato (Tabla 3). Los productos de amplificación se diluyeron 1:20 en H2O y se fraccionaron en un secuenciador capilar ABI 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos se puntuaron mediante el uso del programa informático GeneMarker™ (Softgenetics, State College, PA).
Análisis de pajas de amapola de plantas F2 cultivadas en el campo
Las cápsulas de amapola se recolectaron a mano de la población de mapeo una vez que las cápsulas se secaron hasta aproximadamente un 10 % de humedad en la planta. Después de separar manualmente la semilla de la cápsula, las muestras de paja de la cápsula (paja de amapola) se molieron en un molino de bolas (modelo MM04, Retsch, Haan, Alemania) hasta obtener un polvo fino. A continuación, se pesaron las muestras de paja de amapola molida con una precisión de 2 ± 0,003 g y se extrajeron en 50 ml de una solución de ácido acético al 10 %. La suspensión de extracción se agitó en un agitador orbital a 200 rpm durante un mínimo de 10 min, luego se filtró para proporcionar un filtrado claro. El filtrado final se pasó a través de un filtro de 0,22 pm antes del análisis. La pérdida por secado (LOD) de la paja se determinó al secar en un horno a 105 °C durante 3 horas.
Todas las soluciones se analizaron mediante el uso un sistema Waters Acquity UPLC (Waters Ltd., Elstree, Reino Unido). equipado con una columna Waters Acquity BEH C18, 2,1 mm * 100 mm con relleno de 1,7 micras. La fase móvil usó un perfil de gradiente con el eluyente A que consiste en bicarbonato de amonio 10 mM de pH 10,2 y el eluyente B metanol. Las condiciones de gradiente de fase móvil usadas se enumeran en la Tabla más abajo con un gradiente lineal. El régimen de flujo fue de 0,5 ml por minuto y la columna se mantuvo a 60 °C. El volumen de inyección fue de 2 pl y los picos eluidos se ionizaron en modo APCI positivo y se detectaron con una precisión de masa de 5 ppm mediante el uso de un Thermo LTQ-Orbitrap. Las corridas se controlaron por el programa informático Thermo Xcalibur (Thermo Fisher Scientific Inc., Hemel Hempstead, Reino Unido).
- Programa de flujo de gradiente:
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Los espectros de masas se recogieron en el intervalo de 150-900 m/z a una configuración de resolución de 7500. Todo el análisis de datos se llevó a cabo en el lenguaje de programación R en un entorno Linux de 64 bits (R 2.11). La selección de picos se realizó mediante el uso del paquete Bioconductor, XCMS (Smith y otros (2006) Anal. Chem.
78, 779-787), que emplea el algoritmo centWave (Tautenhahn y otros (2008) BMC Bioinformatics 9, 504). Se redujo la redundancia en las listas de picos mediante el uso del paquete CAMERA (Kuhl y otros (2012) Anal. Chem. 84, 283-289). Los alcaloides se identificaron al comparar los valores exactos de masa y tiempo de retención con los de los estándares y se cuantificaron por sus áreas de iones pseudomoleculares mediante el uso de guiones R personalizados.
Construcción de la biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos (BAC)
La biblioteca de BAC HN1 se construyó a partir de ADN genómico de alto peso molecular (HMW) procesado en Amplicon Express, Inc. (Pullman, WA) a partir de plántulas de cuatro semanas de edad mediante el uso del método descrito (Tao y otros (2002) Theor. Appl. Genet. 105, 1058-1066). El ADN de HMW se digirió parcialmente con la enzima de restricción Hindlll y se seleccionó el tamaño antes de ligar los fragmentos en el vector pCC1BAC (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) y la transformación de células de E. coli DH10B, que luego se sembraron en agar Luria-Bertani (LB) con cloranfenicol, X-gal e IPTG a concentraciones apropiadas. Los clones se seleccionaron robóticamente con Genetix QPIX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en 240 placas de 384 pocillos que contenían medio de congelación LB. Las placas se incubaron durante 16 horas, se replicaron y luego se congelaron a -80 °C. La copia replicada se usó como placa fuente para filtros de nailon que se fabricaron y usaron para el cribado mediante el uso del estuche de síntesis de sonda PCR DIG (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Para estimar los tamaños de inserción, se digirieron alícuotas de ADN de 10 minipreparaciones de BAC con 5U de enzima Notl durante 3 horas a 37 °C. Los productos de la digestión se separaron mediante electroforesis en gel de campo pulsado (sistema CHEF-DRIII, Bio-Rad, Hercules, CA) en un gel de agarosa al 1 % en TBE. Los tamaños de inserción se compararon con los del marcador Lambda Ladder MidRange I PFG (New England Biolabs, Ipswich, MA). La electroforesis se llevó a cabo durante 18 horas a 14 °C con un tiempo de cambio inicial de 5 s, un tiempo de cambio final de 15 s, en un gradiente de voltaje de 6 V/cm. Se encontró que el tamaño de clon de BAC promedio para la biblioteca era de 150 Kb.
Construcción y cribado de filtros
El diseño y cribado del filtro se llevó a cabo en Amplicon Express, Inc. (Pullman, WA). Se prepararon placas de bioensayo que contenían medio de placa de agar LB y 12,5 pg/ml de cloranfenicol. Se aplicó una membrana de nailon cargada positivamente Amersham Hybond-N+ (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) a la superficie del medio y se usó GeneMachines G3 (Genomics Solutions, Bath, Reino Unido) para cuadricular robóticamente 18 432 clones por duplicado en filtros. Los filtros se incubaron a 37 °C durante 12 a 14 horas. Los filtros se procesaron mediante el uso del método de lisis de filtro de nailon (Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, ed. 3, vol.1, capítulo 1) con ligeras modificaciones. Después del procesamiento, el ADN se unió a los filtros de membrana de hibridación de acuerdo con el manual Hybond N+ al hornear a 80 °C durante 2 horas. Para cribar la biblioteca, una sonda marcada con digoxigenina (DIG) de 643 pb que representa la posición 2161-2803 en la secuencia genómica de CYP82X2 (SEQ ID NO 6) se generó a partir de 1,5 ng de ADNg por la reacción de PCR mediante el uso de los cebadores que se muestran en la Tabla 3 y el estuche de síntesis PCR DIG (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se amplificó, diluyó y aplicó una sonda no marcada a cada filtro en las siguientes diluciones de 2 ng, 1 ng, 0,1 ng y 0,0 ng como un control positivo. Los controles se hornearon a 80 °C durante 30 min. Después de un lavado de prehibridación de 30 min en solución DIG EasyHyb a 45 °C, se añadió aproximadamente 0,5 pl de producto de PCR marcado con DIG desnaturalizado por ml de solución de hibridación con filtros de nailon y se incubó con agitación suave durante la noche a 45 °C. Los filtros de nailon se lavaron dos veces en tampón de 2x citrato de sodio estándar (SSC), dodecilsulfato de sodio al 0,1 % (SDS) a temperatura ambiente durante 5 min cada uno, y dos veces con tampón de 0,5x SSC y SDS al 0,1 % a 65 °C durante 15 minutos cada uno. La sonda hibridada se detectó mediante el uso de una solución madre de NBT/BCIP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) y se encontró que se hibridaba con seis clones de BAC.
Secuenciación de BAC y ensamblaje de secuencias automatizado: Los seis clones de BAC positivos de la biblioteca de BAC se secuenciaron en Amplicon Express, Inc. (Pullman, WA) mediante secuenciación de genoma focalizado (FGS) con una profundidad promedio de cobertura de 100x. La FGS es un método de secuenciación de nueva generación (NGS) desarrollado en Amplicon Express que permite un ensamblaje de muy alta calidad de datos de secuencias de clones de BAC mediante el uso de la plataforma Illumina HiSeq (Illumina, Inc, San Diego, CA). El proceso patentado FGS crea bibliotecas etiquetadas de NGS de clones de BAC y genera una secuencia de consenso de los clones de BAC con todas las lecturas reunidas con una superposición de 80 pb y 98 % de identidad. Las secuencias contiguas con huecos se ordenaron y orientaron manualmente en base a las secuencias de parejas de cuatro bibliotecas de tamaño de inserción de 5000, 2000, 500 y 170 pb. Los clones de BAC solapados, PS_BAC193L09, PS_BAC179L19, PS_BAC150A23 y PS_BAC164F07, que juntos codificaban los 10 genes del conglomerado de HN1, se seleccionaron para un posterior ensamblaje de la secuencia. Siempre que fue posible, los huecos y las regiones ambiguas en ambos clones de BAC se cubrieron con un paseo de cebadores con la secuenciación tradicional de Sanger para validar el ensamblaje. La combinación de las cuatro secuencias de BAC solapadas dio un ensamble de secuencias consenso continuo único de 401 Kb. Las secuencias de los 10 genes del conglomerado de HN1 se determinaron independientemente mediante secuenciación de Sanger y el 100 % de concordancia de las secuencias de genes determinadas por Sanger con el ensamblaje de FGS proporcionó garantía de calidad para todo el ensamblaje.
Anotación de la secuencia ensamblada: Las secuencias de los cuatro clones de BAC se anotaron con un programa automatizado de predicción de genes FGENESH (Salamov y Solovyev (2002) Genoma Res. 10, 516-522). La estructura del gen, que incluye el arreglo exón-intrón para los 10 genes en el conglomerado de HN1, se validó por comparación con la secuencia de ADNc para cada gen. La secuencia de ADNc no estaba disponible para ninguno de los ORF restantes detallados en la figura 3, ya que no están representados en ninguna de las bibliotecas de EST. La función predicha de todos los ORF se evaluó mediante análisis BLAST (Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402) y aquellos ORF con aciertos significativos (valor e inferior a 1e'8) se incluyeron en la figura 3. Generación de constructos de plásmidos para el silenciamiento de genes inducido por virus (VIGS)
El sistema de silenciamiento génico basado en el virus del cascabel del tabaco (TRV) (Liu y otros (2002) Plant J. 30, 415-422) se usó para investigar la función del génica de PSMT1, PSMT2, CYP719A21, CYP82X2, PSSDR1 and PSCXE1. Los fragmentos de ADN seleccionados para el silenciamiento se amplificaron mediante PCR y se clonaron en el vector de silenciamiento pTRV2 (número de acceso de GenBank: AF406991). Se unieron a un fragmento de 129 pb de longitud (SEQ ID NO: 30) del gen P. somniferum PHYTOENE DESATURASE (PSPDS) para silenciar simultáneamente los respectivos genes candidatos y PSPDS. Las plantas que muestran el fenotipo de fotoblanqueo resultantes silenciamiento de PSPDS (Hileman y otros (2005) Plant J. 44, 334-341) se identificaron como plantas infectadas con éxito con los respectivos constructos de silenciamiento y se seleccionaron para un análisis posterior. Generación del constructo pTRV2:PDS: Un fragmento de 622 pb de PSPDS se amplificó a partir de ADNc preparado de HN1 mediante el uso de los cebadores que se muestran en la Tabla 3. La digestión con Sau3AI del producto de PCR de 622 pb produjo, entre otros, un fragmento de 129 pb (SEQ ID NO: 30) que se clonó en el sitio BamHI del vector pTRV2. La orientación y la fidelidad se confirmaron mediante secuenciación y el vector pTRV2:PDS resultante se usó en la generación del constructo de VIGS para cada gen candidato. El constructo pTRV2:PDS también sirvió como control en los experimentos de VIGS.
Los fragmentos de ADN seleccionados para silenciar los genes candidatos respectivos se amplificaron a partir de ADN genómico o ADNc de HN1. Los cebadores usados para la amplificación, así como también las posiciones de las secuencias seleccionadas dentro de los respectivos marcos de lectura abiertos, se muestran en la Tabla 3. Los fragmentos de PSMT1, CYP719A21yCYP82X2 se clonaron primero en pTV00 (Ratcliff y otros (2001) Plant J., 237­ 245) mediante el uso de Hindll y Kpnl y luego se subclonaron en pTRV2:PDS mediante el uso de BamHI y Kpnl. Los fragmentos de PSMT2, PSCXE1 and PSSDR1 se clonaron directamente en pTRV2:PDS mediante el uso de BamHI y Kpnl. La orientación y fidelidad de todas los constructos se confirmó por secuenciación.
Transformación de Agrobacterium tumefaciens con constructos de VIGS: Los constructos de VIGS se propagaron en la cepa de E. coli DH5a y se transformaron en Agrobacterium tumefaciens electrocompetente (cepa GV3101) por electroporación.
Infiltración de plantas: Se usaron los cultivos líquidos de A. tumefaciens separados durante la noche que contenían constructos de VIGS individuales (cada uno que consiste en un fragmento de ADN seleccionado del gen diana unido al fragmento de 129 pb de longitud del gen P. somniferum PHYTOENE DESATURASE) para inocular medio LB que contenía MES 10 mM, acetosiringona 20 pM y 50 pg/ml de kanamicina. Los cultivos se mantuvieron a 28 °C durante 24 horas, se recolectaron mediante centrifugación a 3000xg durante 20 min y se resuspendieron en solución de infiltración (MES 10 mM, acetosiringona 200 pM, MgCb 10 mM,) a una DO600 de 2,5. A. tumefaciens que albergaba los constructos de VIGS individuales, que incluían el control, pTRV2:PDS, se mezclaron cada uno 1:1 (v/v) con A. tumefaciens que contenía pTRV1 (número de acceso de GenBank: AF406990) y se incubaron durante dos horas a 22 °C antes de la infiltración. Se infiltraron plántulas de HN1 de dos semanas de edad cultivadas en condiciones estándar de invernadero (22 °C, 16 h de fotoperíodo), con las primeras hojas emergentes, como se describió (Hagel y Facchini (2010) Nat. Chem. Biol. 6, 273-275).
Análisis de látex y cápsulas de plantas silenciadas: Se analizó el látex de las hojas de las plantas infiltradas que mostraban fotoblanqueo como marcador visual de infección y silenciamiento exitosos cuando emergieron los primeros botones florales (plantas de ~7 semanas de edad). Se recogió látex de peciolos cortados, con una única gota dispersada en 500 pl de ácido acético al 10 %. Esto se diluyó 10x en ácido acético al 1 % para dar una solución de alcaloide en ácido acético al 2 % para su posterior análisis. Las cápsulas se recolectaron de las mismas plantas usadas para el análisis de látex y las cápsulas individuales se molieron hasta obtener un polvo fino en un molino de bolas (Modelo MM04, Retsch, Haan, Alemania). A continuación, las muestras de paja de amapola molida se pesaron con precisión de 10 ± 0,1 mg y se extrajeron en 0,5 ml de una solución de ácido acético al 10 % con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se clarificaron mediante centrifugación y una submuestra de 50 j l se diluyó 10x en ácido acético al 1 % para dar una solución de alcaloide en ácido acético al 2 % para su posterior análisis. Todas las soluciones se analizaron como se describió para el análisis de paja de amapola de plantas F2 cultivadas en el campo. Igualmente, todo el análisis de datos se llevó a cabo mediante el uso del lenguaje de programación R. Los picos de alcaloides supuestos se cuantificaron por sus áreas de iones pseudomoleculares mediante el uso de guiones personalizados. Se compilaron listas de picos y se identificaron las diferencias significativas en cuanto a picos entre las muestras mediante el uso de un ANOVA de 1 vía con valores de p ajustados mediante el uso de la corrección de Bonferroni para el número de picos únicos en el conjunto de datos. Para cualquier comparación de picos con valores de p ajustados < 0,05, se usó la prueba HSD de Tukey para identificar picos que fueran significativamente diferentes entre cualquier muestra dada y el control. Los alcaloides se identificaron al comparar los valores exactos de masa y tiempo de retención con los de los estándares. Donde los estándares no estaban disponibles, se usó el paquete Bioconductor rcdk (Smith y otros (2006) Anal. Chem. 78, 779­ 787) para generar fórmulas pseudomoleculares a partir de masas exactas dentro de restricciones elementales C = 1 100, H = 1200, O = 0200, N = 03 y precisión de masa < 5 ppm. El acierto con el error de ppm más bajo dentro de estas restricciones se usó para asignar una fórmula supuesta.
Ejemplo 1
El análisis transcriptómico revela la expresión exclusiva de 10 genes que codifican cinco clases distintas de enzimas en una variedad de amapola que productora de alta noscapina, HN1. Estos genes están ausentes del genoma de dos variedades no productoras de noscapina.
El extracto de cápsula de tres variedades de adormidera desarrolladas en Tasmania para la producción de alcaloides designados como alta morfina 1 (HM1), alta tebaína 1 (HT1) y alta noscapina 1 (HN1) sobre la base del alcaloide más abundante en cada caso (figura 1A) ) se sometió a un perfil de metabolitos. Se encontró que la noscapina era exclusiva de HN1 con relación a HM1 y HT1. La pirosecuenciación Roche 454 se realizó en bibliotecas de ADNc derivadas de tejido de tallo y cápsula de las tres variedades. El análisis de la abundancia de la etiqueta de secuencia expresada (EST) condujo al descubrimiento de una serie de genes previamente no caracterizados que se expresan en la variedad HN1 pero están completamente ausentes de las bibliotecas de EST de HM1 y hT1 (figura 1B). Los genes correspondientes se identificaron supuestamente como tres O-metiltransferasas (PSMT1, PSMT2, PSMT3), cuatro citocromos P450 (CYP82X1, CYP82X2, CYP82X3 y CYP719A21), una acetiltransferasa (PSAT1), una carboxilesterasa (PSCXE1) y una deshidrogenasa/reductasa de cadena corta (PSSDR1). Por el contrario, una serie de otros genes caracterizados funcionalmente asociados con la síntesis de alcaloides de bencilisoquinolina, que incluyen enzima puente de berberina (BBE), Tetrahidroprotoberberina cis-N-metiltransferasa (TNMT), salutaridina reductasa (SaIR), salutaridinol 7-O-acetiltransferasa (SalAT) y tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) se expresaron en las tres variedades (figura 1B). El análisis de PCR en el ADN genómico de las tres variedades reveló que los genes expresados exclusivamente en la variedad HN1 están presentes como se esperaba en el genoma de HN1 pero ausentes en los genomas de las variedades HM1 y HT1 (figura 1B y figura 5).
Ejemplo 2
El análisis de una población de mapeo F2 muestra que los genes están estrechamente unidos en HN1 y su presencia está asociada con la producción de noscapina.
Se generó una población de mapeo F2 de 271 individuos mediante el uso de HN1 y HM1 como parentales. El genotipado de la población F2 cultivada en el campo reveló que los genes específicos de HN1 están estrechamente unidos y asociados con la presencia de noscapina, lo que sugiere que ocurren como un conglomerado de genes involucrados en la biosíntesis de noscapina (figura 2B). El análisis de los niveles de noscapina en cápsulas de F2 cultivadas en el campo reveló que los individuos que contienen este supuesto conglomerado de genes se dividen en dos clases. La primera clase, que contiene 150 individuos, tiene niveles relativamente bajos de noscapina y la segunda clase, que contiene 63 individuos, exhibe el rasgo de alta noscapina de la variedad HN1 parental (figura 2B). Los 58 individuos F2 que carecen del conglomerado de genes supuestos contienen niveles indetectables de noscapina (figura 2B). El análisis de la familia F3 confirmó que los individuos F2 que exhibían el rasgo de alta noscapina eran homocigotos para el conglomerado de genes, mientras que los que exhibían el rasgo de baja noscapina eran heterocigotos (Tabla 2). Los niveles de noscapina tanto en la población F1 (figura 2A) como en la clase F2 heterocigota son mucho más bajos que los niveles intermediarios esperados para un rasgo semidominante, lo que sugiere la participación de alguna forma de represión. El cambio de etapa a alta noscapina en la clase F2 homocigota sugiere que este rasgo está unido con el locus del conglomerado de genes en lugar de propagarse cuantitativamente entre otros loci.
Ejemplo 3
La secuenciación de cromosomas artificiales bacterianos confirma que los 10 genes existen como un complejo conglomerado de genes

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo:
i) una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 8;
ii) una secuencia de nucleótidos en donde dicha secuencia es redundante como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i);
iii) una molécula de ácido nucleico que es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 que codifica un polipéptido que tiene actividad carboxilesterasa;
iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 18, o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos sobre la secuencia de aminoácidos de longitud completa establecida en la SEQ ID NO: 18 en donde dicho polipéptido tiene actividad carboxilesterasa.
2. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
i) un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 18;
ii) un polipéptido modificado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos modificada en donde dicho polipéptido se modifica mediante la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido de la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 18 y que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de longitud completa en la SEQ ID NO: 18 y tiene actividad carboxilesterasa;
iii) un polipéptido modificado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de longitud completa en la SEQ ID NO: 18 y que codifica un polipéptido con actividad carboxilesterasa.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico incluye además una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:
i) una secuencia de nucleótidos representada por la secuencia en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 o 10; ii) una secuencia de nucleótidos en donde dicha secuencia es redundante como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i);
iii) una molécula de ácido nucleico que es al menos 80 % idéntica a la secuencia en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 o 10 en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica polipéptidos implicados en la biosíntesis de noscapina de P. somniferum;
iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19 o 20; y
v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde dicha secuencia de aminoácidos se modifica mediante la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido como se representa en iv) anterior y que son al menos 75 % idénticos a los secuencias de aminoácidos representadas en la SEQ ID nO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19 o 20 implicados en la biosíntesis de noscapina.
4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico incluye la SEQ ID NO: 9 e incluye además una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 10.
5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico incluye 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.
6. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 5.
7. Una célula transgénica que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. La célula transgénica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha célula es una célula vegetal.
9. La célula transgénica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha célula es una célula microbiana.
10. Una molécula de ácido nucleico que comprende un casete de transcripción en donde dicho casete incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 y está adaptado para la expresión mediante la provisión de al menos un promotor operablemente unido a dicha secuencia de nucleótidos de manera que tanto las moléculas con sentido como las antisentido se transcriben desde dicho casete.
11. Un proceso para la modificación de papaveroxina y desmetilpapaveroxina que comprende:
i) proporcionar una célula vegetal de Papaver transgénica de acuerdo con 8;
ii) cultivar dicha célula vegetal para producir una planta de Papaver transgénica; y opcionalmente iii) cosechar dicha planta transgénica de Papaver, o parte de la misma.
12. Un proceso para la modificación de papaveroxina o desmetilpapaveroxina que comprende:
i) proporcionar una célula microbiana transgénica de acuerdo con la reivindicación 9 que expresa una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido con actividad carboxilesterasa y papaveroxina o desmetilpapaveroxina;
ii) cultivar la célula microbiana en condiciones que modifican la papaveroxina o la desmetilpapaveroxina; y opcionalmente
iii) aislar narcotinohemiacetal o narcotolinohemiacetal de la célula microbiana o cultivo celular.
13. El uso de un gen codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 8, o una molécula de ácido nucleico que es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 y codifica un polipéptido con actividad carboxilesterasa como un medio para identificar un locus en donde dicho locus está asociado con una expresión o actividad alterada de dicha carboxilesterasa.
14. Una planta de P. somniferum que tiene expresión alterada de un polipéptido carboxilesterasa de acuerdo con la reivindicación 2 obtenible mediante un proceso que comprende las etapas de:
i) mutagénesis de la semilla de tipo salvaje de una planta de P. somniferum que expresa dicho polipéptido; ii) cultivo de la semilla en i) para producir la primera y subsiguientes generaciones de plantas;
iii) obtener la semilla de las plantas de la primera generación y de las subsiguientes generaciones de plantas; iv) determinar si la semilla de dicha primera y subsiguientes generaciones de plantas tiene una secuencia de nucleótidos alterada y/o una expresión alterada de dicho polipéptido carboxilesterasa; y
v) obtener la semilla o las plantas con una secuencia de nucleótidos alterada que codifica un polipéptido carboxilesterasa alterado en donde la actividad enzimática en la modificación de papaveroxina o desmetilpapaveroxina está alterada en comparación con una planta de P. somniferum de tipo salvaje.
15. Un método para el análisis de una planta que comprende:
i) obtener una muestra de una planta de acuerdo con la reivindicación 14 y analizar la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia en la SEQ ID NO: 8; y
b) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 y codifica un polipéptido carboxilesterasa con actividad;
ii) comparar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la planta de tipo salvaje original y opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico se analiza mediante un método que comprende las etapas de:
iii) extraer ácido nucleico de dichas plantas mutadas;
iv) amplificación de una parte de dicha molécula de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa;
v) formar una preparación que comprenda el ácido nucleico amplificado y el ácido nucleico extraído de la semilla de tipo salvaje para formar un ácido nucleico heterodúplex;
vi) incubar dicha preparación con una nucleasa monocatenaria que corta en una región de ácido nucleico heterodúplex para identificar el error de apareamiento en dicho heterodúplex;
vii) determinar el sitio del error de apareamiento en dicho heterodúplex de ácido nucleico; y
viii) obtener una planta con una mutación en el ácido nucleico que codifica dicho polipéptido carboxilesterasa 16. Un vector viral que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
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