ES2648967T3

ES2648967T3 - Genes involucrados en la producción de noscapina

Info

Publication number: ES2648967T3
Application number: ES13721003.5T
Authority: ES
Inventors: Thilo Winzer; Ian Alexander Graham; Tracey Carol WALKER
Original assignee: Sun Pharmaceutical Industries Australia Pty Ltd
Current assignee: Sun Pharmaceutical Industries Australia Pty Ltd
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: NZ723978A; AU2013234139B2; DK3202908T3; AU2013234139A1; NZ627373A; EP2804949B1; CA2863742A1; EP3202908B1; DK2804949T3; US20150004659A1; CA2863742C; ES2925868T3; NZ729980A; AU2021203237A1; EP3202908A1; AU2018205190A1; US20160281121A1; GB201204407D0; US9447444B2; AU2021203237B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un grupo de genes que codifica dos o más polipéptidos implicados en la biosíntesis de alcaloides opiáceos o intermedios, en donde uno de dichos dos genes comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en; i) una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 9; ii) una secuencia de nucleótidos donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i); iii) una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia en la SEQ ID NO: 9 y que codifica un polipéptido que tiene actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta; y iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 19 o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 46% a través de la secuencia de aminoácidos de longitud completa expuesta en la SEQ ID NO: 19 donde dicho polipéptido tiene actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes involucrados en la producción de noscapina

INTRODUCCIÓN 5

Esta descripción se refiere al aislamiento y secuencia de una molécula de ácido nucleico que incluye un grupo de genes que comprende 10 genes de una noscapina que produce el cultivar Papaver somniferum [adormidera]; células transgénicas transformadas con dicha molécula de ácido nucleico, variantes de secuencia de los genes; el uso de dichos genes/proteínas en la producción de alcaloides opiáceos; y el uso de genes como marcador de plantas de P. 10 somniferum que sintetizan alcaloides opiáceos, noscapina en particular.

Antecedentes de la divulgación

La noscapina pertenece a la subclase ftalidaisoquinolina de los alcaloides de isoquinolina estructuralmente diversos, 15 mientras que la codeína, morfina, tebaína y oripavina pertenecen a la subclase morfinano. Si bien la biosíntesis de los morfinanos se ha dilucidado a nivel molecular, nuestro conocimiento de la biosíntesis de la noscapina no ha avanzado significativamente desde la demostración que usó el etiquetado de isótopos en la década de 1960, que se deriva de la escoulerina. Comprender la genética bioquímica que sustenta la biosíntesis de la noscapina debería permitir una producción mejorada de noscapina y moléculas relacionadas tanto en la adormidera como en otros 20 sistemas de expresión.

P. somniferum es la planta de la que se extrae el opio. La amapola de opio es la única amapola comercialmente explotada de la familia Papaveraceae y es la principal fuente de opiáceos naturales. El opio se extrae del látex cosechado de las vainas de semillas verdes. Otra fuente de alcaloides opiáceos es la paja de adormidera que es la 25 planta madura seca. P. somniferum es una fuente de alcaloides opiáceos clínicamente útiles como morfina, codeína, tebaína, noscapina [también conocida como narcotina] y papaverina. La aplicación clínica de estos alcaloides opiáceos y sus derivados es amplia y tiene uso como analgésicos, antitusígenos y antiespasmódicos. Aunque no se usa como un agente farmacológico en sí mismo, la tebaína es un opiáceo particularmente útil que se puede convertir en una gama de compuestos tales como hidrocodona, oxicodona, oximorfona, naltrefina, naltrexona, buprenorfina y 30 etorfina. Estos productos intermedios también tienen amplias aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, oxicodona, oximorfona y etorfina se utilizan ampliamente como analgésicos para el dolor moderado a intenso y, a menudo, se combinan con otros analgésicos como el ibuprofeno. La buprenorfina se usa en el tratamiento de la adicción a la heroína y el dolor crónico. Naltrexona se usa en el tratamiento del alcohol y la adicción a los opiáceos.

35

La presente descripción se refiere al análisis transcriptómico de P. somniferum que producen variedades de noscapina en comparación con cultivares de P. somniferum que no producen noscapina. El análisis ha revelado la manifestación exclusiva de un grupo de genes principalmente de citocromo P450 y metiltransferasa en una variedad de amapola que produce noscapina. Estos genes están sorprendentemente ausentes de los genomas de dos variedades que no producen noscapina. El análisis de un mapeo de la población F2 indicó que los genes están 40 estrechamente relacionados en la variedad de la noscapina y la secuenciación cromosómica artificial bacteriana confirmó que existen como un nuevo conjunto de genes para la biosíntesis de alcaloides opiáceos.

Declaraciones de la invención

45

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un grupo de genes que codifica dos o más polipéptidos implicados en la biosíntesis de alcaloides opiáceos o intermedios, en donde uno de dichos dos genes comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en;

50

i) una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 9;

ii) una secuencia de nucleótidos donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i);

iii) una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia en la SEQ ID NO: 9 y que codifica un polipéptido que tiene actividad deshidrogenasa/reductasa de 55 cadena corta; y

iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 19 o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 46% a través de la secuencia de aminoácidos de longitud completa expuesta en la SEQ ID NO: 19 donde dicho polipéptido tiene actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta. 60

La hibridación de una molécula de ácido nucleico se produce cuando dos moléculas de ácido nucleico complementarias experimentan una cantidad de enlaces de hidrógeno entre sí. La rigurosidad de la hibridación puede variar de acuerdo con las condiciones ambientales que rodean a los ácidos nucleicos, la naturaleza del método de hibridación y la composición y longitud de las moléculas de ácido nucleico utilizadas. Los cálculos con 5 respecto a las condiciones de hibridación requeridas para alcanzar grados particulares de rigor se discuten en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); and Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993). La Tm es la temperatura a la que el 50% de una cadena dada de una molécula de ácido nucleico se hibrida con su cadena complementaria. Lo siguiente es un 10 conjunto ejemplar de condiciones de hibridación y no es restrictivo:

Rigor Muy Alto (permite secuencias para compartir al menos 90% de identidad para hibridar)

Hibridación:: 5x SSC a 65 ° C durante 16 horas

Lavar dos veces:: 2x SSC a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos cada uno

Lavar dos veces:: 0.5x SSC a 65 ° C durante 20 minutos cada uno

Rigor Alto (permite secuencias para compartir al menos 80% de identidad para hibridar) 15

Hibridación:: 5x-6x SSC a 65 ° C-70 ° C durante 16-20 horas

Lavar dos veces:: 2x SSC a temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada uno

Lavar dos veces:: 1x SSC a 55 ° C-70 ° C durante 30 minutos cada uno

Rigor Bajo (permite secuencias para compartir al menos 50% de identidad para hibridar)

Hibridación:: 6x SSC a temperatura ambiente a 55 ° C durante 16-20 horas

Lavar al menos dos veces:: 2x-3x SSC a temperatura ambiente a 55 ° C durante 20-30 minutos cada uno

20

En un aspecto o realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como la SEQ ID NO: 9 donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta.

En una realización preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico incluye además una o más secuencias de 25 nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:

i) una secuencia de nucleótidos representada por la secuencia en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10;

ii) una secuencia de nucleótidos donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i); 30

iii) una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10 donde dicha molécula de ácido nucleico codifica polipéptidos implicados en la biosíntesis de alcaloides opiáceos de P. somniferum o intermedios en la biosíntesis de alcaloides opiáceos;

iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se 35 representa en SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 20;

v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos donde dicha secuencia de aminoácidos se modifica por supresión o sustitución de al menos un residuo de aminoácido como se representa en iv) anterior y que ha retenido o mejorado la actividad biosintética del alcaloide.

40

En una realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico incluye la SEQ ID NO: 9 y además incluye una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10.

En una realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico incluye secuencias de nucleótidos 3, 45 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

En una realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico incluye cada una de las secuencias de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

50

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

i) un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 19; o

ii) un polipéptido modificado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos modificada donde 5 dicho polipéptido se modifica mediante eliminación o sustitución de al menos un resto de aminoácido de la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 19 y que ha retenido o mejorado la actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta

En una realización preferida de la invención, dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de 10 aminoácidos que es al menos un 46% idéntica a la secuencia de aminoácidos de longitud completa en la SEQ ID NO: 19 y que codifica un polipéptido con actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta.

Un polipéptido modificado como se describe aquí puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones, truncamientos que pueden estar presentes en cualquier combinación. Entre 15 las variantes preferidas están aquellas que varían de un polipéptido de referencia por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado por otro aminoácido de características similares. La siguiente lista no excluyente de aminoácidos se considera reemplazos conservadores (similares): a) alanina, serina y treonina; b) ácido glutámico y ácido aspártico; c) asparagina y glutamina d) arginina y lisina; e) isoleucina, leucina, metionina y valina y f) fenilalanina, tirosina y triptófano. Las más preferidas son las 20 variantes que retienen o potencian la misma función y actividad biológica que el polipéptido de referencia del que varía.

En una realización, los polipéptidos variantes tienen al menos 46% a 50% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 55% de identidad, aún más preferiblemente al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95% de 25 identidad, y al menos 99% de identidad con la mayoría o la secuencia de aminoácidos de longitud completa ilustrado aquí.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. 30

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico en el vector está bajo el control de, y operativamente unida a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción en una célula huésped tal como una célula microbiana (por ejemplo, bacteriana, de levadura) o vegetal . El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que funciona en múltiples hosts. En el caso del ADN genómico, este puede contener su propio promotor u otros 35 elementos reguladores y, en el caso del ADNc, puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la expresión en la célula huesped.

Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos ascendente del sitio de iniciación de la transcripción y que contiene todas las regiones reguladoras requeridas para la transcripción. Los promotores adecuados incluyen 40 promotores constitutivos, específicos de tejido, inducibles, de desarrollo u otros promotores para la expresión en células vegetales comprendidas en plantas que dependen del diseño. Tales promotores incluyen promotores virales, fúngicos, bacterianos, animales y derivados de plantas capaces de funcionar en células vegetales.

Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor CaMV 35S (Odell y col. (1985) Nature 313, 9810 - 45 812); actina de arroz (McElroy y col. (1990) Células vegetales 2: 163-171); ubiquitina(Christian y col. (1989) Plant Mol. Biol. 18:675-689; pEMU Last y col. (1991) Theor Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten y col. (1984) EMBO J. 3. 2723-2730); ALS promoter (U.S. Application Seriel No. 08/409,297), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen los de las patentes de EE. UU. Números de Patentes 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680, 5,268,463; y 5,608,142, cada uno de los cuales se incorpora por referencia. 50

Los promotores regulados químicamente se pueden usar para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por productos químicos, donde la aplicación de la expresión génica inducida por productos químicos, o un promotor reprimible químico, donde la aplicación del químico reprime la expresión génica. Los 55 promotores inducibles por productos químicos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 de maíz, que se activa mediante herbicidas benzenesulfonamida, el promotor GST de maíz, que se activa mediante compuestos electrofílicos hidrófobos que se usan como pre-herbicidas de emergencia, y el promotor de tabaco PR-1a, que se activa con ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés incluyen promotores que responden a esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena y 60 col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425 y McNellis y col. (1998) Plant J. 14(2): 247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y represores de tetraciclina (ver, por ejemplo,Gatz y col. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237, y Números de Patentes de EE.UU 5,814,618 y 5,789,156, incorporado aquí como referencia.

Cuando se desea una expresión mejorada en tejidos particulares, pueden utilizarse promotores específicos de tejido. 5 Los promotores específicos de tejido incluyen los descritos por Yamamoto y col. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata y col. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen y col. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343; Russell y col. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart y col. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp y col. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascni y col. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto y col. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; 10 Orozco y col. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Mutsuoka y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590; y Guevara-Garcia y col (1993) Plant J. 4(3): 495-50.

"Unido operativamente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente posicionada y orientada para que se inicie la transcripción a partir del promotor. El ADN operativamente unido a un 15 promotor está "bajo la regulación de iniciación transcripcional" del promotor.En un aspecto preferido, el promotor es un promotor específico de tejido, un promotor inducible o un promotor regulado en el desarrollo.

Particularmente interesante en el presente contexto son constructos de ácidos nucleicos que funcionan como vectores de plantas. Los procedimientos y vectores específicos usados previamente con gran éxito en las plantas los 20 describe Guerineau y Mullineaux (1993) (Transformación de plantas y vectores de expresión. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, páginas 121-148. Los vectores adecuados pueden incluir vectores derivados de plantas víricas (véase por ejemplo EP194809). Si se desea, pueden incluirse marcadores genéticos seleccionables en la construcción, tales como aquellos que confieren fenotipos seleccionables tales como resistencia a herbicidas (por ejemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurón, metotrexato, 25 gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato).

En una realización preferida de la invención, dicho vector es un cromosoma artificial bacteriano [BACS].

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula transgénica transformada o 30 transfectada con una molécula o vector de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

En una realización preferida de la invención, dicha célula es una célula vegetal.

En una realización preferida de la invención, dicha célula vegetal es del género Papaver. 35

En una realización preferida de la invención, dicha célula vegetal es una célula Papaver somniferum.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una planta que comprende una célula vegetal de acuerdo con la invención. 40

En una realización preferida de la invención, dicha planta es del género Papaver; preferiblemente Papaver somniferum.

En una realización alternativa preferida de la invención, dicha célula es una célula microbiana; preferiblemente una 45 célula bacteriana o fúngica [por ejemplo levadura, Saccharomyces cerevisae].

En una realización preferida de la invención, dicha célula está adaptada de manera que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos de acuerdo con la invención se sobreexpresa cuando se compara con una célula no transgénica de la misma especie. 50

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un casete de transcripción donde dicho casete incluye una secuencia de nucleótidos diseñada con referencia a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo: SEQ ID NO. 9, y está adaptada para la expresión mediante la provisión de al menos un promotor ligado operativamente a dicha secuencia de nucleótidos de manera 55 que las moléculas sentido y antisentido se transcriban a partir de dicho casete.

En una realización preferida de la invención, dicho casete está adaptado de modo que las moléculas de ácido ribonucleico sentido y antisentido se transcriban a partir de dicho casete, donde dichas moléculas de ácido nucleico sentido y antisentido están adaptadas para recocer al menos una parte o la totalidad de su longitud para formar un 60 ARN inhibidor o ARN de horquilla corta.

En una realización preferida de la invención, dicho casete está provisto de al menos dos promotores adaptados para transcribir cadenas sentido y antisentido de dicha molécula de ácido ribonucleico.

5

En una realización preferida alternativa de la invención, dicho casete comprende una molécula de ácido nucleico donde dicha molécula comprende una primera parte unida a una segunda parte donde dichas primera y segunda partes son complementarias de al menos parte de su secuencia y en donde una transcripción adicional de dicho ácido nucleico la molécula produce una molécula de ácido ribonucleico que forma una región bicatenaria por apareamiento de bases complementarias de dichas primera y segunda partes, formando así un ARN de horquilla 10 corta.

Una técnica para eliminar específicamente la función del gen es mediante la introducción de ARN bicatenario, también denominado ARN inhibidor / interferente (siARN) pequeño o ARN de horquilla corta [ARNhc], en una célula que da como resultado la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluida en la molécula de siARN/ 15 ARNhc. La molécula de siARN comprende dos cadenas complementarias de ARN (una cadena sentido y una cadena antisentido) unidas entre sí para formar una molécula de ARN de doble cadena. La molécula de siARN normalmente se deriva de los exones del gen que se debe extirpar.El mecanismo de la interferencia de ARN está siendo dilucidado.Muchos organismos responden a la presencia de ARN bicatenario activando una cascada que conduce a la formación de siARN. La presencia de ARN bicatenario activa un complejo de proteína que comprende 20 RNasa III que procesa el ARN bicatenario en fragmentos más pequeños (siARNs, aproximadamente de 21-29 nucleótidos de longitud) que se convierten en parte de un complejo de ribonucleoproteína.El siARN actúa como una guía para el complejo RNasa para escindir ARNm complementario a la cadena antisentido del siARN dando como resultado la destrucción del ARNm.

25

En una realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico es parte de un vector adaptado para la expresión en una célula vegetal.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula vegetal transfectada con una molécula o vector de ácido nucleico según la invención donde dicha célula tiene expresión reducida de un 30 polipéptido de acuerdo con la invención.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un proceso para la modificación de uno o más alcaloides opiáceos que comprende: 35

i) proporcionar una célula vegetal transgénica de acuerdo con la invención;

ii) cultivar dicha célula vegetal para producir una planta transgénica; y opcionalmente

i) cosechar dicha planta transgénica, o parte de la misma.

En un método preferido de la invención, dicho material vegetal cosechado se seca y se extrae el alcaloide opiáceo. 40

De acuerdo con un aspecto alternativo de la invención, se proporciona un proceso para la modificación de uno o más alcaloides opiáceos o metabolitos intermedios de alcaloides opiáceos que comprende:

i) proporcionar una célula microbiana transgénica de acuerdo con la invención que expresa una o más moléculas de 45 ácido nucleico según la invención en cultivo con al menos un alcaloide opiáceo o un metabolito intermedio de alcaloide opiáceo;

ii) cultivar la célula microbiana en condiciones que modifican uno o más alcaloides opiáceos o alcaloides opiáceos intermedios; y opcionalmente iii) aislar dicho alcaloide opiáceo o intermedio alcaloide opiáceo de la célula microbiana o cultivo celular. 50

En un método preferido de la invención, dicha célula microbiana es una célula bacteriana o célula fúngica / de levadura.

Si se usan células microbianas como organismos en el proceso de acuerdo con la invención, se cultivan o se 55 cultivan de la manera en que el experto en la materia está familiarizado, dependiendo del organismo anfitrión. Como regla general, los microorganismos se cultivan en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, generalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, generalmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánico como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, manganeso y magnesio y, en su caso, vitaminas, a temperaturas de entre 0 ° C y 100 ° C, preferiblemente entre 10 ° 60 C y 60 ° C, mientras gasean en oxígeno.

El pH del medio líquido puede mantenerse constante, es decir, regularse durante el período de cultivo, o no. Los cultivos se pueden cultivar de forma discontinua, semidiscontinua o continua.Los nutrientes pueden proporcionarse al comienzo de la fermentación o alimentarse en forma semicontinua o continua. Los alcaloides opiáceos metilados 5 producidos se pueden aislar de los organismos como se describió anteriormente mediante procesos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante extracción, destilación, cristalización, si es apropiado, precipitación con sal, y / o cromatografía. Con este fin, los organismos pueden ser interrumpidos ventajosamente de antemano. En este proceso, el valor del pH se mantiene ventajosamente entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 6 y 9, especialmente preferiblemente entre pH 7 y 8. 10

El medio de cultivo que se utilizará debe cumplir adecuadamente los requisitos de las cepas en cuestión.Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos se pueden encontrar en el libro de texto "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). 15

Como se describió anteriormente, estos medios que se pueden emplear de acuerdo con la invención normalmente comprenden una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y / u oligoelementos.

Las fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di- o polisacáridos. Ejemplos de fuentes de 20 carbono son glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azúcares también se pueden agregar a los medios a través de compuestos complejos como la melaza u otros subproductos de la refinación de azúcar. La adición de mezclas de una variedad de fuentes de carbono también puede ser ventajosa. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y / o grasa de coco, ácidos grasos como, por ejemplo, ácido 25 palmítico, ácido esteárico y / o ácido linoleico, alcoholes y / o polialcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol y / o etanol, y / o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético y / o ácido láctico.

Las fuentes de nitrógeno son habitualmente compuestos de nitrógeno orgánicos o inorgánicos o materiales que comprenden estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden amoníaco en forma líquida o 30 gaseosa o sales de amonio como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes complejas de nitrógeno como licor de maíz, harina de soja, soja proteína, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como una mezcla.

35

Los compuestos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en los medios comprenden las sales de cloruro, fósforo y sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro.

Los compuestos que contienen azufre inorgánico tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, o compuestos de azufre orgánicos tales como mercaptanos y tioles pueden usarse como 40 fuentes de azufre para la producción de azufre que contiene productos químicos finos, en particular de metionina.

Se pueden usar ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio como fuentes de fósforo.

45

Se pueden añadir agentes quelantes al medio para mantener los iones metálicos en solución. Los agentes quelantes particularmente adecuados comprenden dihidroxifenoles tales como catecol o protocatechuate y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico.

Los medios de fermentación usados según la invención para cultivar microorganismos generalmente también 50 comprenden otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales se derivan a menudo de componentes de medios complejos tales como extracto de levadura, melazas, licor de salsa de maíz y similares. Además, es posible agregar precursores adecuados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos de los medios depende en gran medida del experimento particular y se 55 decide individualmente para cada caso específico. La información sobre la optimización de los medios se puede encontrar en el libro de texto"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) páginas 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Los medios de crecimiento también pueden obtenerse de proveedores comerciales, por ejemplo, Standard 1 (Merck) o BHI (infusión de cerebro y corazón, DIFCO) y similares. 60

Todos los componentes del medio se esterilizan, ya sea por calor (20 min a 1,5 bar y 121 ° C) o por esterilización por filtración. Los componentes se pueden esterilizar juntos o, si es necesario, por separado. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al comienzo del cultivo o pueden agregarse de forma continua o por lotes, según se desee. 5

La temperatura de cultivo está normalmente entre 15°C y 45°C, preferiblemente entre 25°C y 40°C, y puede mantenerse constante o puede alterarse durante el experimento. El pH del medio debe estar en el rango de 5 a 8.5, preferiblemente alrededor de 7.0. El pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo mediante la adición de compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco y amoníaco acuoso o compuestos 10 ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La formación de espuma puede controlarse empleando antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácido graso. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, es posible añadir al medio sustancias adecuadas que tengan un efecto selectivo, por ejemplo, antibióticos. Las condiciones aeróbicas se mantienen introduciendo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire ambiente en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 20°C a 15 45°C y preferiblemente de 25°C a 40°C. El cultivo continúa hasta que la formación del producto deseado es máxima. Este objetivo normalmente se logra dentro de 10 a 160 horas.

El caldo de fermentación puede procesarse posteriormente. La biomasa puede, según los requisitos, eliminarse total o parcialmente del caldo de fermentación por métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, 20 filtración, decantación o una combinación de estos métodos o dejarse completamente en dicho caldo. Es ventajoso procesar la biomasa después de su separación.

Sin embargo, el caldo de fermentación también puede espesarse o concentrarse sin separar las células, usando métodos conocidos tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotativo, un evaporador de película 25 delgada, un evaporador de película descendente, mediante ósmosis inversa o por nanofiltración. Finalmente, este caldo de fermentación concentrado se puede procesar para obtener los alcaloides opiáceos presentes en el mismo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un gen codificado por una molécula de ácido nucleico representada por la secuencia de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 9, o una molécula de ácido 30 nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia de nucleótidos en la SEQ ID NO: 9 y codifica un polipéptido con actividad biosintética de alcaloides opiáceos como un medio para identificar un locus donde dicho locus está asociado con la expresión o actividad alterada de dicha actividad biosintética del alcaloide opiáceo. 35

La mutagénesis como un medio para inducir cambios fenotípicos en organismos es bien conocida en la técnica e incluye, pero no se limita a, el uso de agentes mutagénicos tales como mutágenos químicos [por ejemplo. análogos de bases, agentes desaminantes, agentes de intercalación de ADN, agentes alquilantes, transposones, bromo, azida sódica] y mutágenos físicos [ por ejemplo radiación ionizante, exposición al psoraleno combinada con irradiación UV]. 40

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una planta de P. somniferum que tiene una expresión alterada de un polipéptido de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta de acuerdo con la invención que comprende las etapas de:

45

i) mutagénesis de semillas de tipo silvestre de una planta de P. somniferum que expresa dicho polipéptido de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta;

ii) cultivo de la semilla en i) para producir las primeras y posteriores generaciones de plantas;

iii) obtener semilla de la planta de la primera generación y las siguientes generaciones de plantas; y

iv) determinar si la semilla de dicha primera y siguientes generaciones de plantas tiene una secuencia de nucleótidos 50 alterada y / o una expresión alterada de dicho polipéptido de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para el análisis de una planta que comprende los pasos:

55

i) obtener una muestra y analizar la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se representa en 9;

b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida con la molécula de ácido nucleico en a) bajo condiciones de 60 hibridación rigurosas y que codifica un polipéptido con actividad biosintética sintasa de opiáceo; y opcionalmente

c) c) comparar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la planta original de tipo salvaje y donde la molécula de ácido nucleico se analiza mediante un método que comprende los pasos 5

ii) extraer ácido nucleico de dichas plantas mutadas;

iii) amplificación de una parte de dicha molécula de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa;

iv) formar una preparación que comprende el ácido nucleico amplificado y el ácido nucleico extraído de la semilla de tipo silvestre para formar ácido nucleico heterodúplex; 10

v) incubar dicha preparación con una nucleasa monocatenaria que corta en una región de ácido nucleico heterodúplex para identificar la falta de coincidencia en dicho heterodúplex; y

vi) determinar el sitio del desapareamiento en dicho heterodúplex de ácido nucleico.

En un método preferido de la invención, dicha planta de P. somniferum tiene actividad biosintética mejorada de 15 alcaloides opiáceos.

En un método alternativo preferido de la invención, dicha planta de P. somniferum ha reducido o anulado la actividad biosintética del alcaloide opiáceo.

20

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una planta de P. somniferum donde dicha planta comprende un vector viral que incluye todo o parte de un gen que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

En una realización preferida de la invención, dicho gen o parte está codificado por una molécula de ácido nucleico 25 que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se representa en 9;

ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico en (i) y que codifica una actividad biosintética de alcaloide 30 opiáceo polipeptídico.

En una realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 28.

35

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector viral que comprende la totalidad o parte de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un vector viral de acuerdo con la invención en el silenciamiento génico inducido viral en una planta de P. somniferum. 40

El silenciamiento génico inducido por virus [VIGS] es conocido en la técnica y explota un mecanismo de defensa antiviral mediado por ARN. Las plantas que están infectadas con un virus no modificado inducen un mecanismo que se dirige específicamente al genoma viral. Sin embargo, los vectores virales que se modifican genéticamente para incluir moléculas de ácido nucleico derivadas de genes de plantas hospedadoras también inducen la inhibición 45 específica de la expresión del vector viral y adicionalmente el ARNm del huésped objetivo. Esto permite silenciar genes genéticamente específicos sin modificación genética del genoma de la planta y es esencialmente una modificación no transgénica.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, las palabras "comprender" y 50 "contener" y variaciones de las palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende", significan "que incluyen pero no se limitan a", y no están destinadas (y no) excluye otros restos, aditivos, componentes, enteros o pasos. "Consistente esencialmente" significa tener los enteros esenciales, pero incluyendo enteros que no afectan materialmente a la función de los enteros esenciales.

55

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, el singular abarca el plural a menos que el contexto requiera lo contrario.

En particular, cuando se usa el artículo indefinido, debe entenderse que la especificación contempla tanto la pluralidad como la singularidad, a menos que el contexto requiera lo contrario. 60

Las características, enteros, particularidades, compuestos, restos químicos o grupos descritos junto con un aspecto particular, realización o ejemplo de la invención deben entenderse aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en la presente, a menos que sea incompatible con los mismos.

5

Una realización de la invención se describirá ahora solo a modo de ejemplo y con referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: Identificación de genes exclusivamente presentes en el genoma de una noscapina que produce variedad de amapola, HN1 (alta Noscapina 1). (A) Abundancia relativa de los principales alcaloides extraídos de las cápsulas de tres variedades comerciales de amapola, HM1 (Morfina alta 1), HT1 (alta tebaína 1) y HN1. M = morfina, C = codeína, T = tebaína, O = oripavina y N = noscapina. (B) Se generaron bibliotecas EST procedentes de tallo y 10 cápsula mediante pirosecuenciación y secuencias contiguas únicas ensambladas como se describe en el material y los métodos. Diez genes (PSMT1, PSMT2, PSMT3, CYP82X1, CYP82X2, CYP82Y1, CYP719A21, PSAT1, PSSDR1 y PSCXE1) tal como se definen en el texto, se representaron solo en bibliotecas EST de la variedad HN1. La abundancia de EST de otros cinco genes de P. somniferum funcionalmente caracterizados (BBE, TNMT, SaIR, SalAT y T6DM) muestra que se expresan en las tres variedades y en niveles consistentemente más altos en el tallo 15 en comparación con la cápsula, como también es el caso los genes específicos HN1 como se muestra en el código de color (Fig 1). La PCR en el ADN genómico de las tres variedades reveló que los diez genes específicos de HN1 están ausentes de los genomas de las variedades HM1 y HT1 (Fig. 5);

Figura 2: El análisis de segregación del contenido de noscapina en un mapeo de la población F2 demuestra el requerimiento para el grupo de genes de noscapina. (A) Representación del diagrama de caja de los niveles de 20 noscapina como porcentaje de peso seco (DW) en líneas parentales cultivadas en invernadero HN1 y HM1 y la generación F1. (B) El campo de cultivo de generación F2 se segregó en tres clases de noscapina cero, baja y alta. F2 GC- y F2 GC + indican la ausencia y presencia respectivamente del grupo de genes de noscapina.Los números entre paréntesis indican el número de individuos en cada clase;

Figura 3: El conjunto de genes HN1. La estructura y posición de los diez genes específicos de HN1 expresados en 25 los tallos y los tejidos de las cápsulas se muestran por encima de la línea negra central que representa 401 Kb de secuencia genómica. Los exones están representados por cuadros grises llenos e intrones por finas líneas negras. Las flechas indican la orientación de 5' a 3' de cada gen. Marcos de lectura abiertos adicionales representados debajo de la línea negra central son los definidos por la clave. Ninguno de estos ORF está representado en las bibliotecas EST de tallo y cápsula; 30

Figura 4: Caracterización funcional usando silenciamiento génico inducido por virus de 6 genes del grupo de genes HN1. Los resultados del látex de hoja y las cápsulas son consistentes con cada uno de estos genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de noscapina (A-F). Todos los compuestos que se acumulan, aparte de la escoulerina, han sido supuestamente identificados sobre la base de los espectros de masas como se detalla en la Fig. 6 El valor (M) de la masa a la carga (m / z) seguido del tiempo de retención (T) en segundos se muestra para 35 cada compuesto en el eje horizontal. (G) Ruta propuesta para la biosíntesis de la noscapina basada en datos VIGS. Las flechas sólidas muestran los pasos respaldados por los datos VIGS, las flechas punteadas representan pasos adicionales propuestos. Para los intermedios de secoberbina, R1 = H u OH, R2 = H u OH y R3 = CH2OH o CHO o COOH (Fig. 6). La estructura de la noscapina está numerada de acuerdo con la convención IUPAC;

Figura 5: Los diez genes expresados exclusivamente en la variedad HN1 se encuentran en el genoma de HN1, pero 40 están ausentes de las variedades HT1 y HM1. (A) Amplificación de fragmentos de los diez genes expresados exclusivamente en HN1 usando dos pares de cebadores diferentes. (B) Amplificación de fragmentos de genes de las vías de la rama de protoberberina y morfinano que se expresan en las tres variedades. Los cebadores usados se detallan en la Tabla 3; HyperLadder I (Bioline Reagents, London, UK) se usó como patrón de tamaño molecular;

Figura 6. Evidencia de identidades putativas de productos intermedios de experimentos VIGS. Todos los paneles 45 muestran los espectros de masas del ion parental pseudomolecular en el ápice del pico cromatográfico en negro y los espectros de fragmentación de MS2 correspondientes en rojo, a escala de abundancia relativa. Los espectros de MS2 se generaron dirigiendo el ión precursor con un ancho de aislamiento de 3 m / z y usando energía de disociación de aislamiento colisionado ajustada al 35%. Todos los espectros de masas se obtuvieron con una resolución de 7500. El texto impreso encima de los iones de diagnóstico seleccionados indica la masa 50 monoisotópica exacta del ion, la fórmula calculada dentro de los límites C =1:100, O = 0:200, N =0:3 y H =1:200, y el número / número total de fórmulas devueltas dentro de una ventana de error de 5 ppm. Los fragmentos se reconciliaron con los fragmentos teóricos generados por la presentación de estructuras padre candidatas al software Mass Frontier (versión 5.01.2; HighChem, Bratislava, Eslovaquia). Las estructuras de los padres candidatos se derivaron de las búsquedas de PubChem y de la revisión exhaustiva de Papaver spp. alcaloides (Sariyar (2002) 55 Pure Appl. Chem. 74, 557-574). (A) Tetrahidrocolumbamina; este compuesto se caracterizó a partir de un pico de elución a 174s de CYP719A21 silenciado con VIGS. Ocho de cada diez fragmentos de MS2 observados se calcularon como factibles por Mass Frontier; solo se muestran los dos fragmentos de diagnóstico más abundantes. (B) intermedio de Secoberbine 1 (C21H25NO6); este compuesto se caracterizó a partir de un pico que eluía a 147s de CYP82X2 silenciado por VIGS. Si R1=OH, R2=H, y R3=CH2OH, entonces este compuesto es narcotolinol que es 60 consistente con ambos fragmentos anotados. Otro ajuste de la fórmula candidata sería el narcotindiol desmetoxilado (R1=H, R2=OH, R3=CH2OH); sin embargo, esta estructura no formaría el fragmento observado en 206.0816.(C) Secoberbina intermedio 2 (C21H23NO6); este compuesto se caracterizó a partir de un pico que eluía a 103s de CYP82X2 silenciado con VIGS. Si R1 = OH, R2 = H, y R3 = CHO, entonces este compuesto sería un derivado desmetilado de macrantaldehído. (D) Papaveroxina; este compuesto se caracterizó a partir de un pico de elución a 5 214s de PSCXE1 silenciado con VIGS. El fragmento 398.1600 observado es consistente con la desacetilación. (E) Narcotinehemiacetal; este compuesto se caracterizó a partir de un pico de elución a 121s de PSSDR1 silenciado con VIGS. (F) Narcotolina (4'-desmetilnoscapina); este compuesto se caracterizó a partir de un pico de elución a 208s de PSMT2 silenciado con VIGS. Otras posibilidades isobáricas fueron 6- o 7-desmetilnoscapina. Sin embargo, el fragmento 206.0816 observado es consistente con una posición 4' hidroxilada. Se podrían descontar estructuras 10 alternativas comparando los espectros de fragmentación candidatos con los de la 7-desmetilnoscapina sintética, que se eluye en un tiempo de retención diferente y carecía del fragmento característico 206.0816;

La Tabla 1 ilustra el % de identidad de CYP82Y1, PSCXE1, PSDFR1 y PSAT1 (SEQ ID 17-20) con sus respectivos homólogos caracterizados funcionalmente más próximos. Los números de acceso proporcionados provienen de las 15 bases de datos GenBank, Swiss-Prot o PDB;

Tabla 2: Genotipificación de familias F3 derivadas de dos clases fenotípicas F2: noscapina baja y noscapina alta . Las relaciones de segregación observadas versus esperadas respaldan fuertemente la hipótesis de que los individuos en la clase baja F2 de la noscapina son heterocigotos para el grupo de genes HN1 y los individuos en la 20 clase alta de la noscapina son homocigóticos;

Tabla 3: Secuencias de cebadores e información asociada.

Tabla 1 25

Proteína: % De identidad Número de acceso Anotación

CYP82Y1: 54 CYP82X1 de Papaver somniferum

48: CYP82X2 de Papaver somniferum

39: ABM46919.1 CYP82E3, nicotina desmetilasa de Nicotiana tomentosiformis

PSCXE1: 45 2O7R_A AeCXE1, Carboxyl esterase de Actinidia eriantha

PSSDR1: 46 AAB41550.1 Vestitone reductasa de Medicago sativa

45: ABQ97018.1 Dihidroflavonol 4-reductasa de Saussurea medusa

PSAT1: 66 Q94FT4.1 Salutaridinol 7-O-acetiltransferasa de Papaver somniferum

Tabla 2

La clase de noscapina y el genotipo resultado de individuo F2: Familia de semillas F3 (obtenida por autopolinización de individuos F2) Número de individuos F3 genotipificados Segregación observada del grupo de genes en la progenie F3 Segregación esperada en F3 si la clase de noscapina baja F2 es heterocigota y la clase de noscapina alta es homocigótica Chi-cuadrado

GC+: GC- GC+ GC- X-cuadrado valor de p

noscapinabaja/GC+: S-111809 28 18 10 21 7 1,714 0,190

noscapinabaja/GC+: S-111835 26 18 8 19,5 6,5 0,462 0,497

noscapinaalta/GC-: S-111714 28 28 28

noscapinaalta/GC-: S-111854 54 54 54

Tabla 3

: Secuencias de cebadores (5'-to 3'-)

Gen: Directa Inversa Nota: Aplicación

PSMT1: GATTCCCGATTTACTCCTGATG AACACAAAATACGATTACTTACTTTTGTCC par cebador1

PSMT1: TGCCTCATGTTATTTCTGTTGCC GCATGAAATGGATGTAGTTATCTTGG par cebador 2

PSMT2: ATTGATGTCGGTGGTGGTCACG ATTCCCGTTCAAGTAAACATGCGG par cebador 1

PSMT2: GCAACTGTTTCATTAACAGGCACATCC CAGTAAATTCACACATTCCGTATCTTCCC par cebador 2

PSMT3: GCTTCAGCATTGGTTAACGAGTGC GAGGGTAAGCCTCAATAACAGACTGG par cebador 1

PSMT3: AGACCGTTTGTACCGAATTCTGC TCGTTCCATTCGTGAAGAATGC par cebador 2

CYP82X1: GAACCATTAAACACTTGAGTCATGC TGCAATTGAATTTAGCTCATCTCC par cebador 1

CYP82X1: TTGATGAACGACAAGGAACCG ATTCATGATTGTGACCTTTGTAATCC par cebador 2

CYP82X2: ATGTGGAAAACGGTAAGCAAGTGG ACGATTCTGTCATCATCATTTTCGC par cebador 1

CYP82X2: CAACCTCAATCTAGCTAGAGTCG CCCAAGATTTTCATATCCTTTACAA par cebador 2

CYP82Y1: CAATAATTGAGTAATTTCAGTTCATTCATGG GCTCCGTAAGTGCTCCTGTG par cebador 1 Cebadores para

CYP82Y1: GAATTGTGGTAAAAAATTAGATGCAG CCCTTCACATCTACCATCCCTT par cebador 2 amplificación de

CYP719A21: CAAAGAGTCAATCTGACTCAAGCTAGC CGAGTGCCCATGCAGTGG par cebador 1 fragmentos de

CYP719A21: TCAAACCCTGCTACTAACACTTACTTGC CACTCCATCAGACACACAAGACC par cebador 2 ADN genómico de HM1,

PSAT1: TTTTATCGACCTTGAGGAACAATTAGG AAATGGCAGTTCCACCGC par cebador 1 HT1 y HN1 como se muestra 5

PSAT1: GACTTCATGATGAAATCAGATGCAC CACTGCTGACTTCCATATCAAAGC par cebador 2 en la Figura

PSCXE1: ATGCTGTTGATGCTTTAAACTGGG AGCTGAATTTGTCGATCAATAAGTGG par cebador 1

PSCXE1: AATAAAAATCCAACAATGGCAGATCC ACTGGCATGATATGCAACATTAGC par cebador 2

PSSDR1: GGAAGATGTGAGCCACCTTAAAGC GATACACTGGGAGGAGGATGGG par cebador 1

PSSDR1: GAGAGTAACCACATCTTTGTTGTCGG CGGCAAAATTCATTCCTTGAGC par cebador 2

BBE: GTTTACTCCCACGTGCATC CATTCCTCGTCTAATTCATCTGC

TNMT: GTTTACTCCCACGTGCATC GCTTCACTACTTCTTCTTGAAAAG

SalR: AAACAATGCTGGGGTTGC CATTATAATTTCCAATGCCGTAGTTC

SalAT: TAAGAGAGGGAGACCACGAG CATTCGTTGTTGTTGCTGGTAAG

T6ODM: CTTATGAAGCTAGGTAATGGTATGGA CATCCTCATTGCTTGTGTCC

PSMT1: CTCTAAAATGCCAAACGCG Cebador de secuenciación Cebadores usados como cebadores de secuenciación para obtener secuencia de ADN genómico de HN1

PSMT1: GACCCTTTGGGACTTCCTCG Cebador de secuenciación

PSMT1: CGTGTTGTTTGGTCCCTCG Cebador de secuenciación

PSMT1: TGCCTCATGTTATTTCTGTTGCC Cebador de secuenciación

PSMT1: GATTCCCGATTTACTCCTGATGG Cebador de secuenciación

PSMT1: AACACAAAATACGATTACTTACTTTTGTCC Cebador de secuenciación

PSMT1: TGCCTCATGTTATTTCTGTTGCC Cebador de secuenciación

PSMT1: GCATGAAATGGATGTAGTTATCTTGG Cebador de secuenciación

PSMT1: AAATCGTTCGCTCTTTACCGC Cebador de secuenciación

PSMT1: CACACCAAACTTGATCATTGTC Cebador de secuenciación

PSMT2: ATTGTTGATATTGAATCAGAAACTTTC Cebador de secuenciación

PSMT2: TCAATACCAGTACTGTTAGTTTCCG Cebador de secuenciación

PSMT2: GCAACTGTTTCATTAACAGGCACATCC Cebador de secuenciación

PSMT2: ATTGATGTCGGTGGTGGTCACG Cebador de secuenciación

PSMT2: GCACACTGTCTTTTTCTTCCACC Cebador de secuenciación

PSMT2: ACCGGAATGAGAATGCATAAAGTAAAGG Cebador de secuenciación

PSMT2: CCAATACCCAATCAATTAAACTC Cebador de secuenciación

PSMT2: CAGTAAATTCACACATTCCGTATCTTCCC Cebador de secuenciación

PSMT3: ATTGTATAGCCAAAGTTGCAGGTAGGG Cebador de secuenciación

PSMT3: AGACCGTTTGTACCGAATTCTGC Cebador de secuenciación

PSMT3: GCAGTGAAAGCCATATCCAAAGC Cebador de secuenciación

PSMT3: AACCGTCCCCAAGATGATTCC Cebador de secuenciación

PSMT3: TCGTTCCATTCGTGAAGAATGC Cebador de secuenciación

PSMT3: GAGGGTAAGCCTCAATAACAGACTGG Cebador de secuenciación

CYP82X1: GAACCATTAAACACTTGAGTCATGC Cebador de secuenciación

CYP82X1: TTGATGAACGACAAGGAACCG Cebador de secuenciación

CYP82X1: TCGACAGCGCTTACGAACG Cebador de secuenciación

CYP82X1: CAATTATCAAAGAATCAATGC Cebador de secuenciación

CYP82X1: TGCAATTGAATTTAGCTCATCT Cebador de secuenciación

CYP82X1: ATTCATGATTGTGACCTTTGTAATCC Cebador de secuenciación

CYP82X1: GACAGAGGGCCCAAGTTAAGG Cebador de secuenciación

CYP82X1: AGCAAACCATTCGTCCATCC Cebador de secuenciación

CYP82X1: TACGACAGGTTGCTAGCTTGG Cebador de secuenciación

CYP82X2: AATAATGGATCAGTCACGGCTTCC Cebador de secuenciación

CYP82X2: AATCCATCAGATTTTCAACCAGAGAGG Cebador de secuenciación

CYP82X2: TGTCAGCCAACCATTCGTCCATCCTAAC Cebador de secuenciación

CYP82X2: GGCTTCCCGGAGATGACCCAGATTTTAT Cebador de secuenciación

CYP82X2: TTGTTATTTTCATGACTATTACCACCAGCTTCCTCTTA Cebador de secuenciación

CYP82X2: AGTGGAGGAGGCACAAAAGTTAGGATGGAC Cebador de secuenciación

CYP82X2: CCATGTCTGATAAATACGGGTCGGTGTTC Cebador de secuenciación

CYP82X2: TTGTTGATAAGGACGACTAAGAATAAGCAGAAGATA Cebador de secuenciación

CYP82X2: ACGATTCTGTCATCATCATTTTCGC Cebador de secuenciación

CYP82X2: AGTCGTGTATCGTTCGCTTAATGC Cebador de secuenciación

CYP82X2: CATGCCTATCTATTTCCTCCCTTGCCCTC Cebador de secuenciación

CYP82X2: TGTCAGCCAACCATTCGTCCATCCTAAC Cebador de secuenciación

CYP82X2: TGTTCGATCACGTTGTCTCTTTTTGCCATAA Cebador de secuenciación

CYP82X2: TAACAATAAAAGTACTGATAATGGTGGTCGAAGGAGAA Cebador de secuenciación

CYP82Y1: TATTGATGTGGACCAGTACC Cebador de secuenciación

CYP82Y1: TGTAACTCTTGGTCACATGG Cebador de secuenciación

CYP82Y1: CGCGTACTTGACATTTAACG Cebador de secuenciación

CYP82Y1: GGATCATCGCCAAAAGAAAC Cebador de secuenciación

CYP719A21: CAAAGAGTCAATCTGACTCAAGCTAGC Cebador de secuenciación

CYP719A21: TGAAATGCCTGAGATCACTAAAATCG Cebador de secuenciación

CYP719A21: TCAAACCCTGCTACTAACACTTACTTGC Cebador de secuenciación

CYP719A21: TGTAAAGACACTTCATTGATGGGC Cebador de secuenciación

CYP719A21: TTCGATTTGTGTAAACATTAATGATATTTGG Cebador de secuenciación

CYP719A21: GAGATGATCAAGTGGTTTAACCATTCC Cebador de secuenciación

CYP719A21: CGAGTGCCCATGCAGTGG Cebador de secuenciación

PSCXE1: AATAAAAATCCAACAATGGCAGATCC Cebador de secuenciación

PSCXE1: ATGCTGTTGATGCTTTAAACTGGG Cebador de secuenciación

PSCXE1: GGTTAATCGAGAGATGTTTTGTGGTAGG Cebador de secuenciación

PSCXE1: CGATGACACAGAGCAAGAACGAC Cebador de secuenciación

PSCXE1: CGCGGGTATATGTGTAGCAATCG Cebador de secuenciación

PSCXE1: CGGCAACGCCAGTTCCC Cebador de secuenciación

PSSDR1: CTAACAGGCAAACAATAACAGGTTGC Cebador de secuenciación

PSSDR1: GGAAGATGTGAGCCACCTTAAAGC Cebador de secuenciación

PSSDR1: AAAGGTACTGACAGAAAGAGCTTGCC Cebador de secuenciación

PSSDR1: AGATACACTGGGAGGAGGATGGG Cebador de secuenciación

PSSDR1: CGGCAAAATTCATTCCTTGAGC Cebador de secuenciación

PSSDR1: AACATATAGCCAAAGGACTCTTCG Cebador de secuenciación

PSAT1: AGGATACACAATGACCCAAC Cebador de secuenciación

PSAT1: TTTTATCGACCTTGAGGAACAATTAGG Cebador de secuenciación

PSAT1: TGTTCACTAGGTGGAAAGAG Cebador de secuenciación

PSAT1: AGTACAATACCGAGAAATCCGACAAG Cebador de secuenciación

PSAT1: GCTCAATTAATGGAACAGTAGTTACCC Cebador de secuenciación



: condiciones específicas de PCR: Pares de cebadores para el genotipado del mapeo de la población F2

PsMT1: VIC®-CGTGTTGTTTGGTCCCTCG GCACACTGTCTTTTTCTTCCACC 30 cilindros, 20s de extensión a 72°

PsMT2: VIC®-GCAACTGTTTCATTAACAGGCACATCC GCCAGCGCTAATACAAGGATGTGG 36 cilindros, 50s de extensión a 72°

PsMT3: VIC®-GCAGTGAAAGCCATATCCAAAGC TCGTTCCATTCGTGAAGAATGC 30 cilindros, 30s de extensión a 72°

CYP82X1: VIC®-GCTACGAAAGATAATGGTG CAGC AGCAAACCATTCGTCCATCC 30 cilindros, 30s de extensión a 72°

CYP82X2: VIC®-ATGTGGAAAACGGTAAGCAAGTGG ACGATTCTGTCATCATCATTTTCGC 30 cilindros, 50s de extensión a 72°

CYP719A21: VIC®-TGAAATGCCTGAGATCACTAAAATCG GGAATGGTTAAACCACTTGATCATCTC 30 cilindros, 30s de extensión a 72°

PSCXE1: VIC®-ATGCCAGTTTAAGAGCAATAGAAATGG GGGAACTGGCGTTGCCG 30 cilindros, 30s de extensión a 72°

PSSDR1: VIC®-GAAGATGTGAGCCACCTTAAAGC GCTCAAGGAATGAATTTTGCCG 30 cilindros, 30s de extensión a 72°

CYP82X2: GTTGACGCAGGAAGCTTTTGC GGAACATAAGATTTAACTCCGCCTC Par de cebadores para la amplificación por PCR de la sonda de cribado de la biblioteca BAC

PSMT1: aaactcgagaagctTGGTCATAATCATCAATCAG aaaggtaccCATGTACTACTACATCATCTCC Pares de cebadores para la amplificación y clonación de fragmentos seleccionados para VIGS

PSMT2: aaactcgagaagcttGTGTAACTAAGCCAGCGC aaaggtaccACTTGAATATATCACCGC

CYP82X1: aaaggatccTTTGAGTAATGGTGAAAAGA aaaggtaccAACATCTACTCTCGAGGATTG

CYP82X2: aaactcgagaagcttTAGGAGGGTATGTCCGGC aaaggtaccTTAACTCCGCCTCGGCTCC

CYP82Y1: aaaggatccTTCAGTTCATTCATGGCG aaaggtaccGTTCATAGTAAATAATAACAGGCG

CYP719A21: aaactcgagaagcttATGATCATGAGTAACTTATGGA aaaggtaccCCAACAGGCCATTCCGTTG

PSCXE1: aaaggatccTGGCAGATCCTTATGAATTCC aaaggtaccTTATGATAGGAAGCAGCTTATTC

PSSDR1: aaaggatccGAAATTGACGAGACAATATGG aaaggtaccCATTCAAAAACGAATATGTGTGC

PSAT1: aaaggatccCCTAAGAGAGATCCTCCAACTG aaaggtaccAATACAAGTATGAAAACAAGAGAATAA

PSPDS: GAGGTGTTCATTGCCATGTCAA GTTTCGCAAGCTCCTGCATAGT

Materiales y métodos

Material vegetal Tres variedades de amapola GSK Australia que acumulan principalmente noscapina (Noscapina Alta , HN1), morfina (Morfina Alta, HM1) o tebaína (Tebaína Alta HT1), se cultivaron en invernadero en Maxi (Flota) Rootrainers™ (Haxnicks, Mere) , Reino Unido) 16 horas al día en las instalaciones de horticultura 5 de la Universidad de York. El sustrato de crecimiento consistió en 4 partes John Innes Nº2, 1 parte Perlita y 2 partes Vermiculita. El mapeo de la población HM1 ×HN1 F2 se cultivó en el sitio de prueba de campo GlaxoSmithKline Australia, Latrobe, Tasmania desde septiembre de 2009 hasta febrero de 2010.

Cruzamiento y autofecundación Se llevaron a cabo cruces entre individuos HN1y HM1 para generar semilla 10 híbrida F1. En la etapa de gancho del desarrollo de la inflorescencia, los estambres inmaduros se eliminaron de los botones florales seleccionados HN1. Los estigmas de HN1 se fecundaron con polen de flores HM1 en desarrollo sincrónico poco después del inicio de la antesis. Para evitar que el polen contaminante llegue a los estigmas receptivos, las flores emasculadas se cubrieron con una bolsa de muselina durante cuatro días después de la polinización. Las generaciones F1 y F2 se autopolinizaron para producir semillas F2 y F3, 15 respectivamente. La autopolinización se aseguró cubriendo las flores poco antes del inicio de la antesis con una bolsa de muselina.

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc Los tallos superiores (definidos como la sección de 2 cm inmediatamente debajo de la cápsula) y las cápsulas enteras se recogieron en dos etapas de desarrollo 20 representadas por 1-3 días y 4-6 días, después de la caída del pétalo. Se usaron cinco plantas por etapa de desarrollo y cultivar. El material se molió hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido utilizando un mortero y una mano de mortero. El ARN se aisló del polvo usando un método de extracción basado en CTAB (Chang y col (1993) Plant Mol. Biol. Rep. 11, 113-116) con pequeñas modificaciones: (i) se realizaron tres extracciones secuenciales con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y (ii) el ARN se precipitó durante la noche con cloruro de 25 litio a 4°C. Después de la cuantificación espectrofotométrica, se juntaron cantidades iguales de ARN de cinco plantas por cultivar, fase de desarrollo y órgano.Las muestras agrupadas se sometieron a una etapa de purificación final usando un RNeasy Plus MicroKit (Qiagen, Crawley, Reino Unido). El ARN se eluyó típicamente en 30-100 μl de agua. El ADNc se preparó con el kit de construcción de la Biblioteca SMART cDNA (Clontech, Saint-Germainen-Laye, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero utilizando la transcriptasa 30 inversa SuperScript II (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) para la síntesis de la primera cadena.El cebador CDSIII /3'PCR se modificó para: 5' ATT CTA GAT CCR ACA TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TVN 3' donde R = A o G, V = A, C o G; N = A/T o C/G. Tras la digestión con Mmel (New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido), el ADNc se purificó finalmente usando un kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen, Crawley, Reino Unido).

35

Pirosecuenciación de ADNc: La pirosecuenciación se realizó en la plataforma de secuenciación Roche 454 GS-FLX (Branford, CT) usando ADNc preparado a partir de las siguientes cuatro muestras de cada una de las tres variedades:

i. tallo superior, 1-3 días después de la caída del pétalo 40

ii. tallo superior, 4-6 días después de la caída del pétalo

iii. cápsula, 1-3 días después de la caída del pétalo

iv. cápsula, 4 -6 días después de la caída del pétalo

Análisis de secuencia bruta, ensamblaje de secuencia contigua y anotación Los conjuntos de datos de 45 secuencia en bruto se derivaron de secuenciación etiquetada paralela en la plataforma de secuenciación 454 (Meyer y col (2008) Nature Prot. 3, 267-78). Las secuencias de cebador y etiqueta se eliminaron primero de todas las lecturas de secuencia individuales. El ensamblaje de secuencia contigua solo se realizó en secuencias de más de 40 nucleótidos y que contienen menos del 3% de residuos desconocidos (N). Esas secuencias de Secuencia de Secuencia Expresada (EST) de alta calidad se ensamblaron en secuencias contiguas únicas con 50 el Programa de Conjunto de Secuencia CAP3 (Huang y Madan (1999) Genome Res. 9, 868-877), y los contigs resultantes se anotaron localmente usando el programa BLAST2 (Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402) contra la base de datos de péptidos no redundante descargada del NCBI.

Perfiles de expresión: Se contó el número de EST asociados con una secuencia consenso específica que 55 representa cada uno de los genes candidatos detallados en la Figura 1 para cada biblioteca EST. Los números de EST se normalizaron sobre la base del número total de ESTs obtenidos por biblioteca. Para cada variedad, los recuentos de EST se combinaron para las dos etapas de desarrollo de tallos y cápsulas. Las diferencias en los niveles de expresión de genes candidatos entre órganos y variedades se visualizaron como un mapa de calor con Microsoft Excel. 60

Preparación de ADN genómico a partir de plantas cultivadas en invernadero

Para amplificar y obtener secuencias genómicas de los genes candidatos, se recogieron 30-50 mgs de material de hoja de plántulas maduras cultivadas en invernadero de 4 a 6 semanas de edad de cada una de las tres 5 variedades. El ADN genómico se extrajo utilizando el kit BioSprint 96 Plant en la estación de trabajo BioSprint 96 (Qiagen, Crawley, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN extraído se cuantificó usando Hoescht 33258 y se normalizó a 10 ng/ul.

Amplificación y secuenciación de genes candidatos de ADN genómico 10

Los cebadores para la amplificación y la secuenciación de Sanger de los genes candidatos a partir de ADN genómico se basaron en las respectivas secuencias contiguas reunidas a partir de las EST o en las secuencias de BAC. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 3. Las amplificaciones por PCR se realizaron en conjuntos de ADN genómico que comprenden ADN de cuatro individuos. La amplificación se llevó a cabo 15 típicamente en 10 ng de ADN genómico en 1 × Phusion High Fidelity Buffer complementado con 200 nM directo e inverso cebadores, 0,2 mM dNTPs, 0,02 unidades/μl Phusion Hot Start DNA Polymerase (Finnzymes, Vantaa, Finnland). Se usaron condiciones de PCR estándar durante todo el tiempo con temperatura de hibridación y tiempos dependientes de los cebadores y el equipo de PCR.

20

Extracción de ADN del mapeo de la población F2 cultivada en el campo

Se recogieron 40-50 mg de tejido foliar de plantas F2 en la etapa de crecimiento de 'pequeña roseta' (∼10 hojas presented en cada planta) en tubos de muestra de 1,2 ml. Se añadió un cordón de carburo de tungsteno de 3 mm a cada tubo y las muestras se mantuvieron a -80 ° C durante un mínimo de dos horas antes de la liofilización 25 durante 18 horas. Después de la liofilización, las muestras se pulverizaron mediante molienda de perlas (Model TissueLyser, Qiagen, Hilden, Alemania) a 30 Hz durante dos ciclos de 60 s separados por inversión de placa. La extracción de ADN se realizó con el kit Nucleospin Plant II (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) utilizando el tampón Set PL2 / 3 suministrado siguiendo el protocolo del fabricante para extracción centrífuga. El ADN fue cuantificado por espectroscopía UV. 30

Genotipado del mapeo de la población HN1xHM1 F2 para la presencia o ausencia de los genes candidatos específicos de HN1

Las plantas del mapeo de la población F2 se genotiparon para la presencia o ausencia de ocho genes 35 candidatos. Los pares de cebadores génicos (Tabla 3) se diseñaron con etiquetas fluorescentes (marcadas con 5'-VIC®) para su uso en el aparato capilar ABI 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo típicamente en 10 ng de ADN genómico en 1x tampón GoTaq suplementado con 1 mM MgCl2, cebador directo e inverso 500 nM, 0,125 mM dNTPs, 0,1 U GoTaq (Promega, Southampton, Reino Unido). Las condiciones de amplificación fueron: 1 min 94°C, 30-36 ciclos de desnaturalización de 30 s a 94°C, 40 30s de recocido a 62°C y 20-50 s de extensión a 72°C, seguido de una extensión final de 5 min a 72°C. El número de ciclos y los tiempos de extensión dependían del gen candidato (Tabla 3). Los productos de amplificación se diluyeron 1:20 en H2O y se fraccionaron en un secuenciador capilar ABI 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos se calificaron utilizando el software GeneMarker ™ (Softgenetics, State College, PA). 45

Análisis de paja de amapola de plantas F2 cultivadas en el campo

Se recogieron las cápsulas de amapola a mano de la población de mapeo una vez que las cápsulas se habían secado hasta aproximadamente 10% de humedad en la planta. Después de separar manualmente la semilla de 50 la cápsula, las muestras de paja de la cápsula (Poppy Straw) se molieron en un molino de bolas (Modelo MM04, Retsch, Haan, Alemania) en un polvo fino. Las muestras de paja de adormidera molida se pesaron con precisión a 2 ± 0,003 g y se extrajeron en 50 ml de una solución de ácido acético al 10%. La suspensión de extracción se agitó en un agitador orbital a 200 rpm durante un mínimo de 10 minutos, luego se filtró para proporcionar un filtrado claro. El filtrado final se pasó a través de un filtro de 0,22 μm antes del análisis. La pérdida en el secado 55 (LOD) de la paja se determinó mediante secado en un horno a 105°C durante 3 horas.

Todas las soluciones se analizaron usando un sistema Waters Acquity UPLC (Waters Ltd., Elstree, Reino Unido). equipado con una columna Waters Acquity BEH C18, 2.1 mm × 100 mm con un empaquetamiento de 1.7 micras. La fase móvil usó un perfil de gradiente con eluyente A que consiste en 10 mM de bicarbonato de amonio de pH 60

10.2 y eluyente B metanol. Las condiciones de gradiente de fase móvil utilizadas se muestran en la siguiente tabla con un gradiente lineal. El caudal fue de 0,5 ml por minuto y la columna se mantuvo a 60°C. El volumen de inyección fue de 2 μl y los picos eluidos se ionizaron en modo APCI positivo y se detectaron con una precisión de masa de 5 ppm utilizando un Thermo LTQ-Orbitrap. Las pruebas fueron controladas por el software Thermo Xcalibur (Thermo Fisher Scientific Inc., Hemel Hempstead, Reino Unido). 5

- Programa de flujo de gradiente:

TIEMPO (minutos): % De eluyente A % De eluyente B Flujo (ml / min)

0,0: 98. 2,0 0,50

0,2: 98,0 2,0 0,50

0,5: 60,0 40 0,50

4,0: 20,0 80,0 0,50

4,5: 20,0 80,0 0,50

Se recogieron espectros de masas en el intervalo de 150-900 m/z a una configuración de resolución de 7500. Todos los análisis de datos se llevaron a cabo en el lenguaje de programación R en un entorno Linux de 64 bits 10 (R 2.11). La selección de pico se realizó usando el paquete Bioconductor, XCMS (Smith y col (2006) Anal. Chem. 78, 779-787), empleando el algoritmo centWave (Tautenhahn y col (2008) BMC Bioinformatics 9, 504). La redundancia en las listas de picos se redujo utilizando el paquete CAMERA (Kuhl y col (2012) Anal. Chem. 84, 283-289). Los alcaloides se identificaron comparando la masa exacta y los valores del tiempo de retención con los estándares y se cuantificaron por sus áreas de iones pseudomoleculares usando escrituras R personalizadas. 15

Construcción de la biblioteca del Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC)

La biblioteca HN1 BAC se construyó a partir de ADN genómico de alto peso molecular (HMW) procesado en Amplicon Express, Inc. (Pullman, WA) a partir de plántulas de cuatro semanas usando el método descrito (Tao y 20 col (2002) Theor. Appl. Genet. 105, 1058-1066). El ADN de HMW se digirió parcialmente con la enzima de restricción HindIII y el tamaño seleccionado antes de la ligación de fragmentos en el vector pCC1BAC (Epicenter Biotechnologies, Madison, WI) y la transformación de células de E. coli DH10B, que luego se sembraron en Luria-Bertani (LB) agar con cloranfenicol, X-gal e IPTG en concentraciones apropiadas.Los clones se recogieron de forma robotizada con un Genetix QPIX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en 240 placas de 384 pocillos que 25 contenían medios de congelación LB. Las placas se incubaron durante 16 horas, se replicaron y luego se congelaron a -80ºC. La copia replicada se usó como una placa fuente para filtros de nylon que se fabricaron y usaron para el cribado usando el kit de síntesis de sonda PCR DIG (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Para estimar los tamaños de inserto, se digirieron alícuotas de ADN de 10 BAC minipreps con 5U de enzima Notl durante 3 horas a 37°C. Los productos de digestión se separaron mediante electroforesis en gel de campo 30 pulsado (sistema CHEF-DRIII, Bio-Rad, Hercules, CA) en un gel de agarosa al 1% en TBE.Los tamaños de insertos se compararon con los de Lambda Ladder MidRange I PFG Marker (New England Biolabs, Ipswich, MA). La electroforesis se llevó a cabo durante 18 horas a 14°C con un tiempo de conmutación inicial de 5 s, un tiempo de conmutación final de 15 s, en un gradiente de voltaje de 6 V/cm. El tamaño promedio de clonación de BAC para la biblioteca fue de 150 Kb. 35

Construcción y cribado del filtro

El diseño del filtro y el cribado se llevaron a cabo en Amplicon Express, Inc. (Pullman, WA). Se prepararon platos de bioensayo que contenían medio de placa de agar LB y 12,5 μg/ml de cloranfenicol. Se aplicó una membrana 40 Amersham Hybond-N+ de nailon cargada positivamente (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) a la superficie del medio y se usó GeneMachines G3 (Genomics Solutions, Bath, RU) para tener una red robótica de 18,432 clones por duplicado en filtros. Los filtros se incubaron a 37 ° C durante 12 a 14 horas. Los filtros fueron procesados usando el método de lisis de filtro de nylon(Sambrook y col., Molecular Cloning: Un manual de laboratorio (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, ed.3, vol.1, cap. 1) con ligeras 45 modificaciones. Después del procesamiento, el ADN se ligó a los filtros de membrana de hibridación de acuerdo con el manual Hybond N+ mediante cocción a 80°C durante 2 horas. Para explorar la biblioteca, se generó una sonda marcada con digoxigenina (DIG) de 643 pb representando la posición 2161-2803 en la secuencia genómica de CYP82X2 (SEC ID NO 6) a partir de 1,5 ng de ADNg por reacción de PCR usando los cebadores que se muestran en la Tabla 3 y la PCR Kit de síntesis DIG (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) según las 50 instrucciones del fabricante. Se amplificó una sonda no marcada, se diluyó y se filtró a cada filtro en las siguientes diluciones de 2 ng, 1 ng, 0,1 ng y 0,0 ng como control positivo. Los controles se cocieron a 80°C durante 30 min. Después de un lavado prehibridación de 30 min en solución DIG EasyHyb a 45°C aproximadamente 0,5 μl de producto de desnaturalizado DIG etiquetado PCR se añadió por ml de solución de

hibridación con los filtros de nylon y se incubaron con agitación suave durante la noche a 45°C. Los filtros de nylon se lavaron 2x en un citrato de sodio standar (SSC), 0,1% tampón de dodecilsulfato sódico (SDS) a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno, y dos veces con un 0.5× SSC, tampón de SDS al 0,1% a 65°C durante 15 minutos. La sonda hibridada se detectó usando una solución madre de NBT/BCIP según las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y se encontró que se hibridaba con seis 5 clones de BAC.

Secuenciación de BAC y ensamblaje de secuencia automatizado: Los seis clones de BAC positivos de la biblioteca de BAC se secuenciaron en Amplicon Express, Inc. (Pullman, WA) mediante Secuenciación de Genoma Enfocado (FGS) con una profundidad promedio de cobertura de 100x. FGS es un método de 10 secuenciación de última generación (NGS) desarrollado en Amplicon Express que permite un ensamblaje de muy alta calidad de datos de secuencia de clonación BAC utilizando la plataforma Illumina HiSeq (Illumina, Inc, San Diego, CA). El proceso de FGS patentado crea bibliotecas marcadas con NGS de clones de BAC y genera una secuencia consenso de los clones de BAC con todas las lecturas ensambladas a 80 pb de superposición y 98% de identidad. Las secuencias contiguas con huecos se ordenaron y orientaron manualmente en base a 15 secuencias de mate pair de cuatro bibliotecas de tamaño de inserción 5000, 2000, 500 y 170 bp. Los clones de BAC superpuestos, PS_BAC193L09, PS_BAC179L19, PS_BAC150A23 y PS_BAC164F07, que juntos codificaron los 10 genes del grupo HN1, se seleccionaron para un ensamblaje de secuencia adicional. Donde fue posible, las lagunas y las regiones ambiguas en ambos clones de BAC se cubrieron con walking de cromosomas con la secuenciación tradicional de Sanger para validar el ensamblaje. La combinación de las cuatro secuencias 20 de BAC superpuestas dio un único consenso contínuo de secuencia de ensamblaje de 401 Kb. Las secuencias de los 10 genes del clúster HN1 se determinaron de forma independiente mediante la secuenciación de Sanger y el acuerdo del 100% de las secuencias génicas determinadas por Sanger con el ensamblaje de FGS proporcionó control de calidad para todo el ensamblaje.

25

Anotación de la secuencia ensamblada: Las secuencias de los cuatro clones de BAC se anotaron con un programa automatizado de predicción de genes FGENESH (Salamov y Solovyev (2002) Genome Res. 10, 516-522). La estructura del gen que incluye la disposición exón-intrón para los 10 genes en el grupo HN1 se validó por comparación con la secuencia de ADNc para cada gen. La secuencia de ADNc no estaba disponible para ninguno de los ORFs restantes detallados en la Fig. 3 ya que no están representados en ninguna de las 30 bibliotecas EST. La función predicha de todos los ORFs se evaluó mediante análisis BLAST (Altschul y col (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402) y aquellos ORFs con éxitos significativos (valor e inferior a 1e-8) se incluyeron en la Fig.3.

Generación de construcciones de plásmidos para silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) 35

El sistema de silenciamiento génico basado en el virus del tabaco cascabeleo (TRV) (Liu y col (2002) Plant J. 30, 415-422) se usó para investigar la función del gen de PSMT1, PSMT2, CYP719A21, CYP82X2, PSSDR1 y PSCXE1. Los fragmentos de ADN seleccionados para el silenciamiento se amplificaron mediante PCR y se clonaron en el vector de silenciamiento pTRV2 (GenBank acceso nº: AF406991). Se unieron a un fragmento de 40 129 pb de longitud (SEQ ID NO: 30) del gen P. somniferumPHYTOENE DESATURASE (PSPDS) para silenciar simultáneamente los respectivos genes candidatos y PSPDS. Se identificaron plantas que exhibían el fenotipo de fotodecoloración resultante del silenciamiento de PSPDS (Hileman y col (2005) Plant J. 44, 334-341) como plantas infectadas con éxito con las respectivas construcciones de silenciamiento y seleccionadas para un análisis posterior. 45

Generación de la construcción pTRV2: PDS: Un fragmento de 622 pb de PSPDS se amplificó a partir de ADNc preparado a partir de HN1 utilizando cebadores que se muestran en la Tabla 3. La digestión con Sau3AI del producto de PCR de 622 pb produjo, entre otros, un fragmento de 129 pb (SEQ ID NO: 30) que se clonó en el sitio BamHI del vector pTRV2. La orientación y la fidelidad se confirmaron por secuenciación y el vector pTRV2: 50 PDS resultante se usó en la generación de la construcción VIGS para cada gen candidato. La construcción pTRV2: PDS también sirvió como control en los experimentos de VIGS.

Los fragmentos de ADN seleccionados para silenciar los genes candidatos respectivos se amplificaron a partir de ADN genómico de HN1 o de ADNc. Los cebadores usados para la amplificación así como las posiciones de las 55 secuencias seleccionadas dentro de los respectivos marcos de lectura abiertos se muestran en la Tabla 3. Los fragmentos PSMT1, CYP719A21 y CYP82X2 se clonaron primero en pTV00 (Ratcliff y col (2001) Plant J., 237-245) usando HindIII y Kpnl y luego se subclonaron en pTRV2: PDS usando BamHI y Kpnl. Los fragmentos PSMT2, PSCXE1 y PSSDR1 se clonaron directamente en pTRV2: PDS usando BamHI y Kpnl. La orientación y la fidelidad de todos los constructos se confirmaron por secuenciación. 60

Transformación de Agrobacterium tumefaciens con construcciones de VIGS: Los constructos de VIGS se propagaron en E. coli cepa DH5α y se transformaron en electrocompetente Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3101) por electroporación.

5

Infiltración de plantas: Se usaron cultivos líquidos «overnight» separados de A. tumefaciens que contenían constructos VIGS individuales (cada uno compuesto por un fragmento de ADN seleccionado del gen objetivo unido al fragmento de 129 pb de longitud del gen P. somniferum PHYTOENE DESATURASE) para inocular medio LB que contenía 10 mM MES, 20 μM de acetosiringona y 50 μg/ml de kanamicina. Los cultivos se mantuvieron a 28°C durante 24 horas, se recogieron por centrifugación a 3000xg durante 20 min y se 10 resuspendieron en solución de infiltración (MES 10 mM, acetosiringona 200 μM, MgCl2 10 mM) hasta una OD600 de 2,5. A. tumefaciensharbouring las construcciones de VIGS individuales, incluyendo el control, pTRV2: PDS, se mezclaron cada uno 1: 1(v / v) con A. tumefaciens que contiene pTRV1 (GenBank acceso nº: AF406990), y se incubaron durante dos horas a 22°C antes de la infiltración. Se infiltraron plántulas maduras de HN1 de dos semanas de edad cultivadas en condiciones de invernadero estándar (22ºC, fotoperíodo de 16 horas), con 15 primeras hojas emergentes, tal como se describe (Hagel y Facchini (2010) Nat. Chem. Biol. 6, 273-275).

Análisis de látex y cápsula de plantas silenciadas: Se analizó el látex foliar de las plantas infiltradas que mostraban blanqueamiento fotográfico como marcador visual de una infección y silenciamiento exitosos cuando aparecieron brotes de las flores (plantas de 7∼ semanas de edad). Se recogió látex de pecíolos cortados, con 20 una sola gota dispersa en 500 μl de ácido acético al 10%. Esto se diluyó 10 veces en ácido acético al 1% para dar una solución de alcaloide en ácido acético al 2% para un análisis posterior. Las cápsulas se recogieron de las mismas plantas usadas para el análisis de látex y las cápsulas individuales se molieron hasta obtener un polvo fino en un molino de bolas (Modelo MM04, Retsch, Haan, Alemania). Las muestras de paja de adormidera molida se pesaron con precisión a 10 ± 0,1 mg y se extrajeron en 0,5 ml de una solución de ácido acético al 10% con 25 agitación suave durante 1h a temperatura ambiente. Las muestras se clarificaron luego mediante centrifugación y una submuestra de 50 μl se diluyó 10 veces en ácido acético al 1% para dar una solución de alcaloide en ácido acético al 2% para un análisis posterior. Todas las soluciones se analizaron como se describe para el análisis de paja de adormidera de plantas F2 cultivadas en el campo. Del mismo modo, todos los análisis de datos se llevaron a cabo utilizando el lenguaje de programación R. Picos putativos alcaloides se cuantificaron por sus 30 áreas de iones pseudomolecular utilizando scripts personalizados. Las listas de picos se compilaron y cualquier diferencia significativa entre las muestras se identificó utilizando 1-way ANOVA con valores de p ajustados usando la corrección de Bonferroni para el número de picos únicos en el conjunto de datos. Para cualquier comparación de picos con valores de p ajustados <0.05, la prueba de HSD de Tukey se utilizó para identificar picos que fueron significativamente diferentes entre cualquier muestra dada y el control. Los alcaloides se 35 identificaron comparando la masa exacta y los valores de tiempo de retención con los de los estándares. Donde los estándares no estaban disponibles, el paquete Bioconductor rcdk (Smith y col (2006) Anal. Chem. 78, 779-787) se usó para generar fórmulas pseudomoleculares a partir de masas exactas dentro de las restricciones elementales C = 1 100, H = 1 200, O = 0 200, N = 0 3 y exactitud de masa <5 ppm. El hit con el menor error de ppm dentro de estas restricciones se usó para asignar una fórmula putativa. 40

Ejemplo 1

El análisis transcriptómico revela la expresión exclusiva de 10 genes que codifican cinco clases distintas de enzimas en una variedad de amapola que produce noscapina alta , HN1. Estos genes están ausentes 45 del genoma de dos variedades que no producen NOSCAPINA.

Extracto de cápsula de tres variedades de adormidera desarrolladas en Tasmania para la producción de alcaloides designadas como morfina alta 1 (HM1), tebaína alta 1 (HT1) y noscapina alta1 (HN1) sobre la base del alcaloide más abundante en cada caso ( Fig. 1A) se sometió a perfiles de metabolitos. Se descubrió que la 50 noscapina es única para HN1 en relación con HM1 y HT1. La pirosecuenciación Roche 454 se realizó en bibliotecas de ADNc derivadas de tejido de tallo y cápsula de las tres variedades. El análisis de la abundancia de la etiqueta de secuencia expresada (EST) condujo al descubrimiento de varios genes previamente no caracterizados que se expresan en la variedad HN1, pero que están completamente ausentes de las bibliotecas EST HM1 y HT1 (figura 1B). Los genes correspondientes se identificaron putativamente como tres O-55 metiltransferasas (PSMT1, PSMT2, PSMT3), cuatro citocromo P450 (CYP82X1, CYP82X2, CYP82X3 y CYP719A21), una acetiltransferasa (PSAT1), una carboxilesterasa (PSCXE1) y una cadena corta deshidrogenasa/reductasa (PSSDR1). En contraste, una cantidad de otros genes caracterizados funcionalmente asociados con la síntesis de alcaloides de la bencilisoquinolina, incluida la Enzima del Puente de Berberina (BBE), Tetrahidroprotoberberina cis-N-metil transferasa (TNMT), Salutaridina Reductasa (SalR), Salutaridinol 7-60

O-AcetilTransferasa (SalAT) y Tebaína 6-O-demethylase (T6ODM) se expresaron en las tres variedades (Fig. 1B). El análisis de PCR en ADN genómico de las tres variedades reveló que los genes expresados exclusivamente en la variedad HN1 están presentes como se esperaba en el genoma de HN1 pero ausentes de los genomas de las variedades HM1 y HT1 (Fig. 1B y Fig. 5).

5

Ejemplo 2

El análisis de una población de mapeo F2 muestra que los genes están estrechamente relacionados en HN1 y su presencia está asociada con la producción de noscapina.

10

Se generó una población de mapeo F2 de 271 individuos usando HN1 y HM1 como progenitores. La genotipificación de la población F2 cultivada en el campo reveló que los genes específicos de HN1 están estrechamente relacionados y asociados con la presencia de noscapina, lo que sugiere que se producen como un conjunto de genes implicados en la biosíntesis de la noscapina (figura 2B). El análisis de los niveles de noscapina en cápsulas F2 cultivadas en el campo reveló que los individuos que contienen este grupo de genes 15 putativo se dividen en dos clases. La primera clase que contiene 150 individuos tiene niveles relativamente bajos de noscapina y la segunda clase que contiene 63 individuos exhibe el rasgo de noscapina alta de la variedad parental HN1 (figura 2B). Los 58 individuos F2 que carecen del conjunto de genes putativo contienen niveles indetectables de noscapina (figura 2B). El análisis de la familia F3 confirmó que los individuos F2 que exhiben el rasgo de alta noscapina eran homocigóticos para el grupo de genes, mientras que los que exhibían el rasgo bajo 20 de noscapina eran heterocigotos (Tabla 2). Los niveles de noscapina tanto en la población F1 (figura 2A) como en la clase F2 heterocigota son mucho menores que los niveles intermedios esperados para un rasgo semicontinuo, lo que sugiere la participación de alguna forma de represión. El cambio de paso a la noscapina alta en la clase F2 homocigótica sugiere que este rasgo está relacionado con el locus del clúster de genes en lugar de diseminarse cuantitativamente entre otros loci. 25

Ejemplo 3

La secuenciación bacteriana de cromosomas artificiales confirma que los 10 genes existen como un complejo cúmulo de genes 30

Para caracterizar adicionalmente el supuesto conjunto de genes de noscapina, se preparó una biblioteca de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) a partir de ADN genómico aislado de HN1 y se identificaron seis BACs solapantes que contenían genes del grupo. La generación siguiente y la secuenciación de Sanger se utilizaron para generar un ensamblaje de alta calidad de 401 Kb confirmando la disposición de los 10 genes 35 en un grupo que abarca 221 Kb (figura 3). Sólo otro gen homólogo, una carboxilesterasa (PSCXE2), se encontró en la secuencia genómica que flanquea el grupo de genes (Fig 3), pero PSCXE2 no se representó en ninguna de nuestras bibliotecas EST. Intercalados entre los diez genes hay secuencias de retrotransposón y de elemento transponible de ADN (TE) (Fig. 3), que pueden tener alguna función en la reorganización genética para la formación de cúmulos, como se cree para el thalianol y los cúmulos marinos de A. thaliana (Field y col (2011) 40 PNAS 108, 16116-16121).

Ejemplo 4

El silenciamiento génico inducido por el virus da como resultado la acumulación de intermediarios de la 45 vía, permitiendo que la función del gen se relacione con la síntesis de la noscapina y se proponga una nueva vía biostética bifurcada.

Con el fin de caracterizar funcionalmente los genes en el clúster de HN1, el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) se realizó en plántulas de amapola. VIGS en plántulas de amapola persiste a través de etapas de 50 planta maduras(Hileman y col (2005) Plant J. 44, 334-341), y, por lo tanto, tanto el látex de hojas como los extractos de cápsulas se analizaron rutinariamente (figura 4). El silenciamiento de PSMT1 dio como resultado la acumulación de escoulerina en cápsulas y también bajos niveles de reticulina en el látex, lo que indica que este producto génico es responsable del primer paso comprometido en la ruta hacia la síntesis de la noscapina (figura 4A). El producto predicho de PSMT1 es tetrahidrocolumbamina (figura 6), que se acumuló en plántulas y 55 cápsulas que se silenciaron para CYP719A21 (figura 4B). CYP719A21 muestra una alta homología con las oxidasas del citocromo P450 que actúan como enzimas formadoras de puentes de metilendioxilo (Díaz Chávez y col (2011) Arch. Biochem. Biophys. 507, 186193; Ikezawa y col (2009) Plant Cell Rep. 28, 123-133). Por lo tanto, CYP719A21 puede codificar una sintasa canadiense.Fig. 6). El silenciamiento de un segundo gen del citocromo P450, CYP82X2, dio como resultado la acumulación de varios productos intermedios de secoberbina, algunos de 60

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un grupo de genes que codifica dos o más polipéptidos implicados en la biosíntesis de alcaloides opiáceos o intermedios, en donde uno de dichos dos genes comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en; 5

i) una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 9;

ii) una secuencia de nucleótidos donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético de la secuencia de nucleótidos definida en (i);

iii) una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones de hibridación 10 rigurosas con la secuencia en la SEQ ID NO: 9 y que codifica un polipéptido que tiene actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta; y

iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 19 o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 46% a través de la secuencia de aminoácidos de longitud completa 15 expuesta en la SEQ ID NO: 19 donde dicho polipéptido tiene actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta.
2. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

20

i) un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 19; o

ii) un polipéptido modificado que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos modificada donde dicho polipéptido se modifica por adición, deleción o sustitución de al menos un residuo de aminoácido de la secuencia presentada en la EQ ID NO: 19 y que ha retenido o mejorado la actividad de 25 deshidrogenasa/reductasa de cadena corta; o

iii) un polipéptido modificado que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 46% idéntica a la secuencia de aminoácidos de longitud completa en la EQ ID NO: 19 y que codifica un polipéptido con actividad deshidrogenasa/reductasa de cadena corta.

30
3. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde la molécula de ácido nucleico incluye además una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:

i) una secuencia de nucleótidos representada por la secuencia en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10;

ii) una secuencia de nucleótidos donde dicha secuencia está degenerada como resultado del código genético de 35 la secuencia de nucleótidos definida en (i);

iii) una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10 donde dicha molécula de ácido nucleico codifica polipéptidos implicados en la biosíntesis de alcaloides opiáceos de P. somniferum o intermedios en la biosíntesis de alcaloides opiáceos; 40

iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 20.

v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos donde dicha secuencia de aminoácidos se modifica por adición, deleción o sustitución de al menos un residuo de aminoácido como se representa en iv) anterior y que ha retenido o mejorado la actividad biosintética del alcaloide 45 opiáceo .
4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, donde dicha molécula de ácido nucleico incluye la SEC ID NO: 9 y además incluye una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10. 50
5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, donde dicha molécula de ácido nucleico incluye 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

55
6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicha molécula de ácido nucleico incluye cada una de las secuencias de nucleótidos como se representa en la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.
7. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones1, 3-60
6.
8. Una célula transgénica transformada o transfectada con un vector de acuerdo con la reivindicación 7. 5
9. La célula transgénica según la reivindicación 8, donde dicha célula es una célula vegetal o célula microbiana.
10. Una molécula de ácido nucleico que comprende un casete de transcripción donde dicho casete incluye la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 9 y está adaptado para la expresión mediante la provisión de al 10 menos un promotor unido operativamente a dicha secuencia de nucleótidos de modo que las moléculas sentido y antisentido se transcriban a partir de dicho casete.
11. Un proceso para la modificación de uno o más alcaloides opiáceos que comprende:

15

i) proporcionar una célula vegetal transgénica según 9;

ii) cultivar dicha célula vegetal para producir una planta transgénica; y opcionalmente

iii) cosechar dicha planta transgénica, o parte de la misma.
12. Un proceso para la modificación de uno o más alcaloides opiáceos o metabolitos intermedios de 20 alcaloides opiáceos que comprende:

i) proporcionar una célula microbiana transgénica según la reivindicación 9 que expresa una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en cultivo con al menos un alcaloide opiáceo o un metabolito intermedio de alcaloide opiáceo; 25

ii) cultivar la célula microbiana en condiciones que modifican uno o más alcaloides opiáceos o alcaloides opiáceos intermedios; y opcionalmente

iii) aislar dicho alcaloide opiáceo o intermedio alcaloide opiáceo de la célula microbiana o cultivo celular.
13. El uso de un gen codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste en 30 la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 9, o una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia de nucleótidos en la SEQ ID NO: 9 y codifica un polipéptido con actividad de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta como un medio para identificar un locus donde dicho locus está asociado con la expresión o actividad alterada de dicha actividad biosintética del alcaloide opiáceo. 35
14. Una planta de P. somniferum que tiene una expresión alterada de un polipéptido de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta según la reivindicación 2, que comprende los pasos de:

i) mutagénesis de semillas de tipo silvestre de una planta de P. somniferum que expresa dicho polipéptido de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta; 40

ii) cultivo de la semilla en i) para producir las primeras y posteriores generaciones de plantas;

iii) obtener semilla de la planta de la primera generación y las siguientes generaciones de plantas; y

iv) determinar si la semilla de dicha primera y siguientes generaciones de plantas tiene una secuencia de nucleótidos alterada y / o una expresión alterada de dicho polipéptido de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta. 45
15. Un procedimiento para el análisis de una planta, que comprende

i) obtener una muestra de la planta de acuerdo con la reivindicación 14 y analizar la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: 50

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se representa en 9;

b) una molécula de ácido nucleico que se hibrida con la molécula de ácido nucleico en a) bajo condiciones de hibridación rigurosas y que codifica un polipéptido con actividad biosintética de alcaloides; y opcionalmente

c) comparar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia 55 de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la planta original de tipo salvaje y donde la molécula de ácido nucleico se analiza mediante un método que comprende los pasos:

ii) extraer ácido nucleico de dichas plantas mutadas;

iii) amplificación de una parte de dicha molécula de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la 60

polimerasa;

iv) formar una preparación que comprende el ácido nucleico amplificado y el ácido nucleico extraído de la semilla de tipo silvestre para formar ácido nucleico heterodúplex;

v) incubar dicha preparación con una nucleasa monocatenaria que corta en una región de ácido nucleico heterodúplex para identificar la falta de coincidencia en dicho heterodúplex; y 5

vi) determinar el sitio del desapareamiento en dicho heterodúplex de ácido nucleico.
16. Un vector viral que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.