ES2924429T3

ES2924429T3 - Biomaterial de lignina como portador de principios activos agrícolas

Info

Publication number: ES2924429T3
Application number: ES17707188T
Authority: ES
Inventors: Frederik Wurm; Katharina Landfester; Doungporn Yiamsawas; Eckhard Thines; Jochen Fischer
Original assignee: Inst fur Biotechnologie und Wirkstoff Forschung Ggmbh; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Inst fur Biotechnologie und Wirkstoff Forschung Ggmbh; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2022-10-06
Anticipated expiration: 2037-02-06
Also published as: US11311010B2; AU2017214451B9; CN109068654A; AU2017214451B2; WO2017134308A1; AU2017214451A1; PT3410855T; CN109068654B; US20200390092A1; EP3410855B1; US20190037837A1; EP3410855A1

Abstract

La presente invención también proporciona nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrofóbico. La presente invención proporciona un proceso para la producción de nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrofóbico, el proceso comprende los siguientes pasos: (i) disolver lignina modificada y un agente activo hidrofóbico en un solvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua; (ii) combinar la solución con agua y un tensioactivo para formar una preemulsión; (iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y (iv) reticular la lignina modificada para formar nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrofóbico, en el que la lignina modificada es lignina que se modifica químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales adecuados para la polimerización y/o reticulación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomaterial de lignina como portador de principios activos agrícolas

Campo técnico

La presente invención se refiere a nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrófobo, un proceso para producir las mismas y el uso de las nanopartículas para el tratamiento de infecciones de las plantas.

Antecedentes de la técnica

Los plaguicidas se usan abundantemente en el tratamiento de plantas infectadas por plagas. Sin embargo, muchos plaguicidas son tóxicos o dañan la salud humana o son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, la aplicación de plaguicidas está en general controlada para una determinada dosis. La forma más sencilla de aplicar plaguicidas es pulverizar una solución o emulsión/dispersión del plaguicida sobre las plantas. Lamentablemente, una gran parte de los plaguicidas que se aplican en la agricultura es arrastrada por la lluvia, lo cual reduce su eficacia y genera contaminación ambiental.

Una forma de mejorar la eficacia de los plaguicidas y de reducir el impacto medioambiental es proporcionar formulaciones de liberación controlada de plaguicidas en forma de microcápsulas, micropartículas y gránulos. Las formulaciones de liberación controlada pueden limitar la tasa de transferencia de un plaguicida al entorno circundante y pueden reducir el efecto de arrastre, de modo que se puede reducir la cantidad total de plaguicidas.

El documento US 2003/0013612 A1 divulga un método de producción de micropartículas matriciales a base de lignina para la liberación controlada de un activo agrícola que incluye formar una emulsión de una solución orgánica en una solución acuosa, en donde la solución orgánica contiene un derivado de lignina y un activo agrícola en un disolvente orgánico volátil y la solución acuosa contiene un emulsionante; y retirar el disolvente orgánico, produciendo de ese modo micropartículas que tienen una matriz que comprende el derivado de lignina dentro del cual se distribuye el activo agrícola. El resultado de este método son pequeñas micropartículas matriciales a base de lignina esféricas que liberan un activo agrícola a una velocidad controlada. La desventaja de las micropartículas matriciales a base de lignina es que el ingrediente activo, tal como un plaguicida, se libera durante mucho tiempo, independientemente de si la planta está infestada de una plaga o no. Adicionalmente, las micropartículas no pueden ser transportadas a través del sistema vascular completo de las plantas debido al tamaño de las partículas.

El documento CN101461358 hace referencia a la preparación de nanocápsulas agroquímicas solubles en aceite en donde el agente agroquímico se encapsula en un compuesto reticulado de alto peso molecular, por ejemplo, sulfonato de lignina de sodio. La reticulación tiene lugar con glutaraldehído y fomaldehído. El documento CN105010362 divulga la preparación de una suspensión acuosa de micro(nano)cápsulas de sulfonato de lignina de amina que contienen avermectina y en donde el sulfonato de lignina de amina está reticulado.

Otra forma de reducir la cantidad necesaria de plaguicidas es un método denominado inyección en el tronco (también conocido como inyección en el árbol, inyección en el tallo o inyección en el xilema) en el que los plaguicidas se inyectan en el tejido vascular del xilema, p. ej., de un árbol. Este método usa el sistema vascular de una planta para distribuir los compuestos activos en la madera, el dosel y las raíces de la planta. La inyección en el tronco para la protección de los árboles se considera una alternativa más segura desde el punto de vista medioambiental para la aplicación de plaguicidas, puesto que el compuesto se administra dentro del árbol, lo cual permite una exposición selectiva a las plagas de las plantas. Por tanto, la inyección en el tronco puede reducir de manera significativa la exposición no diana del agua, suelo, aire y fauna silvestre a los plaguicidas.

El complejo de la enfermedad de Esca es una enfermedad de la vid causada por varios hongos. Los hongos asociados con la enfermedad se encuentran en la mayoría de los casos solo en el tronco de la planta. Los hongos Phaeomoniella chlamydospora, Phaeotieremoniuni aleophilum, Fomitiporia mediterránea, y Eutypa lata están habitualmente asociados con la enfermedad. Sin embargo, otros hongos, tales especies de la familia Botryosphaeriaceae, también pueden estar relacionados con la enfermedad. Convencionalmente, solo se podían llevar a cabo medidas preventivas para la protección de las plantas contra los hongos asociados con Esca. Estos métodos incluyen la protección de las heridas tras la poda de las vides, la identificación de las vides infectadas y su retirada del viñedo, así como la desinfección permanente de la herramienta de corte usada. Se ha demostrado que el uso de plaguicidas convencionales, que están en uso, por ejemplo, para el control del oídio, puede solo reducir ligeramente las tasas de infección en el viñedo. Sin embargo, el aumento del uso de plaguicidas convencionales no tiene un efecto suficiente para justificar las pulverizaciones adicionales.

Dula et al. estudiaron el tratamiento de vides infectadas por Esca con la inyección en el tronco de fungicidas (Phytopathol. Mediterr. 2007, 46, 91-95). Se perforó un orificio de 6 mm de diámetro a una profundidad de al menos 25 mm y se inyectaron 40 ml de solución fungicida a una presión de 30 a 40 bar y una dosis de 120 a 180 ml/l. Al inyectar el fungicida directamente en la planta, el fungicida se distribuye estadísticamente por toda la planta, lo que da lugar a una distribución uniforme del mismo a una baja concentración. Por lo tanto, hay que inyectar una gran cantidad de fungicida con el fin de conseguir una concentración suficiente del mismo en el lugar de la planta infectada por hongos.

Tortora et al. sintetizaron microcápsulas rellenas de aceite de lignina kraft creando primero una emulsión de aceite en agua, seguido de una reticulación de alta intensidad asistida por ultrasonidos de lignina en la interfaz agua/aceite (Biomacromolecules 2014, 15, 1634-1643). Las microcápsulas pueden usarse para el almacenamiento y la administración de moléculas hidrófobas, cuya liberación es provocada por dodecilsulfato de sodio. Las microcápsulas de lignina pueden usarse para la aplicación tópica como reservorio de ingredientes defensores de la piel, tales como antioxidantes y aceites esenciales.

Yiamsawas et al. describen nanoenvases biodegradables que pueden prepararse mediante poliadición interfacial en miniemulsiones inversas y pueden cargarse con sustancias hidrófilas que pueden liberarse mediante un desencadenante enzimático (RSC Adv., 2014, 4 11661). Los nanoenvases de lignina-poliurea/poliuretano se generan a partir de fracciones de lignina solubles en agua en la interfaz de nanogotas de agua estables en una miniemulsión inversa. Sin embargo, el método no es adecuado para sustancias hidrófobas.

El objetivo de la invención es eliminar las deficiencias antes mencionadas. En particular, un objeto de la presente invención es proporcionar formulaciones de plaguicidas con mayor eficacia en el tratamiento de las infecciones de las plantas, en particular infecciones fúngicas, y métodos de utilización de las mismas. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar nanopartículas de lignina que muestren solo una liberación muy baja del agente activo en ausencia de un desencadenante enzimático de la enfermedad fúngica/bacteriana y, por tanto, presenten una larga estabilidad en almacenamiento. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método mediante el cual se puedan tratar eficazmente las plantas de vid infectadas por Esca.

Sumario de la invención

Los presentes inventores desarrollaron un proceso para la producción de nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrófobo. Los presentes inventores descubrieron que las nanopartículas de lignina resultantes mostraban una fuga muy baja del agente activo hidrófobo en ausencia de enzimas que degraden la lignina. Después de la reticulación, las nanopartículas de lignina, que están cargadas con el agente activo hidrófobo, presentan una morfología densa. Solo es detectable una baja fuga del agente activo del 10 % o menos (con respecto a la cantidad total del agente activo usado en la preparación de las nanopartículas de lignina) tras una preparación y un almacenamiento durante 4 semanas. Las nanopartículas no liberan el agente activo hidrófobo sin la presencia (es decir, en ausencia) de la enzima lacasa que es producida por hongos o bacterias, p. ej., por Esca. Adicionalmente, los presentes inventores descubrieron que una formulación que comprende las nanopartículas de lignina puede usarse para el tratamiento de plantas contra una infección fúngica o bacteriana o la prevención de dicha infección. En particular, una formulación que comprende las nanopartículas de lignina de la presente invención puede inyectarse en el tallo de una planta. Dado que las nanopartículas no liberan el agente activo sin un desencadenante, el agente activo queda atrapado en las nanopartículas y no se diluye en el tejido de la planta. Solamente en presencia de la enfermedad fúngica o bacteriana en el tronco y en el lugar de la infección, las nanopartículas se degradan enzimáticamente y liberan el principio activo. Por tanto, la presente invención proporciona en un primer aspecto un proceso para la producción de nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrófobo contra las infecciones de las plantas, comprendiendo el proceso las siguientes etapas:

(i) disolver la lignina modificada y un agente activo hidrófobo en un disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua:

(ii) combinar la solución con agua y un tensioactivo para formar una preemulsión;

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

(iv) reticular la lignina modificada para formar nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo,

en donde la lignina modificada es una lignina que está modificada químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales adecuados para una polimerización y/o una reticulación seleccionados del grupo que consiste en dobles enlaces terminales, grupos epoxi, grupos alquinilo, grupos aldehído, grupos ceto y grupos silano, y en donde el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona nanopartículas de lignina que comprenden lignina reticulada y un agente activo hidrófobo, pudiendo ser obtenidas las nanopartículas de lignina mediante el proceso del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula de lignina que comprende una lignina reticulada y un agente activo hidrófobo de acuerdo con la reivindicación 1.

Adicionalmente, la presente invención proporciona en un cuarto aspecto una dispersión acuosa que contiene las nanopartículas de lignina de acuerdo con el segundo aspecto o el tercer aspecto.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de las nanopartículas de lignina de acuerdo con el segundo o tercer aspecto o la dispersión acuosa de acuerdo con el cuarto aspecto para el tratamiento de plantas contra una infección fúngica o bacteriana.

La presente invención también proporciona en un sexto aspecto un método de tratamiento de una planta contra una infección fúngica o bactericida por inyección de la dispersión acuosa del cuarto aspecto en el tallo de la planta.

Descripción de las figuras

Figura 1: Tres precursores comunes de monolignol que intervienen en la formación de la lignina, es decir, alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico.

Figura 2: Modelo de estructura de la lignina propuesto por Adler.

Figura 3: Representación esquemática de una síntesis a modo de ejemplo de lignina metacrilada.

Figura 4: Representación esquemática de una formación a modo de ejemplo de partículas en el proceso de miniemulsión.

Figura 5: Espectro FTIR que muestra la presencia de enlaces éster en la lignina metacrilada.

Figure 6: Espectro de 1H-RMN que muestra la presencia de grupos vinilo de metacrilato unidos a lignina en lignina metacrilada.

Figura 7: Diagrama que muestra los resultados obtenidos del análisis térmico para observar la estabilidad térmica de lignina y lignina metacrilada.

Figura 8: Imágenes de TEM que muestran nanopartículas individuales de lignina de acuerdo con la presente invención con una forma esférica bien definida.

Figura 9: Diagrama que muestra los resultados de la liberación del agente activo hidrófobo obtenido mediante la prueba de liberación usando 2-propilpirina como sustancia modelo.

Figura 10: Diagrama que muestra los resultados de una prueba in vitro, usando nanopartículas de lignina cargadas con fungicida en un ensayo en placa de 96 pocillos (azul: Pal= Phaeoacremonium aleophilum, rojo: Pch= Phaeomoniella chlamydospora)

Figura 11: Ejemplo de un ensayo de campo de inyección de nanopartículas en una planta de vid

Figura 12: Tabla de las nanopartículas de lignina seleccionadas para la prueba de campo in vivo (con diferentes condiciones de preparación (tensioactivo, concentración del principio activo, tamaño de partícula). Figura 13: Nanocápsulas de lignina huecas con núcleo de aceite de oliva y cubierta de lignina

Figura 14: Nanopartículas de lignina porosas sin adición de aceite o hexadecano

Figura 15: Liberación de piracloestrobina como agente activo hidrófobo a partir de nanopartículas de lignina reticulada en presencia del iniciador de radicales AIBN o sin él tras 4 semanas de almacenamiento en una dispersión acuosa a 25 °C

Descripción detallada

La presente invención proporciona en un primer aspecto un proceso para la producción de nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrófobo contra las infecciones de las plantas, comprendiendo el proceso las siguientes etapas:

(i) disolver la lignina modificada y un agente activo hidrófobo en un disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua;

(ii) combinar la solución con agua y un tensioactivo para formar una preemulsión:

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

en donde la lignina modificada es una lignina que está modificada químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales adecuados para una polimerización y/o una reticulación, seleccionados del grupo que consiste en dobles enlaces terminales, grupos epoxi, grupos alquinilo, grupos aldehído, grupos ceto y grupos silano, y en donde el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l.

Por tanto, en una primera etapa (etapa (i)), la lignina modificada y el agente activo hidrófobo se disuelven en un disolvente orgánico que tiene una baja solubilidad en agua.

Un disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua de acuerdo con la presente invención es un disolvente orgánico que tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l, preferentemente de no más de 30 g/l, y lo más preferentemente de no más de 10 g/l.

El disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua incluye disolventes de hidrocarburo tales como ciclohexano, hexano, pentano, heptano, benceno y tolueno, hidrocarburos halogenados, tales como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono y 1,2-dicloroetano, alcoholes tales como 1-butanol, 2-butanol, 2-metilpropan-1-ol, 1-pentanol, 2-pentanol, y 3-metil-1-butanol y compuestos orgánicos que tienen un grupo nitro tal como nitrobenzidina y nitrofenoles. El disolvente orgánico también puede ser una mezcla de diferentes disolventes orgánicos, siempre que la mezcla tenga una baja solubilidad en agua, como se ha definido anteriormente. Lo más preferentemente, el disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua es cloroformo.

El agente activo hidrófobo de acuerdo con la presente invención es un compuesto que tiene una baja solubilidad en agua. Preferentemente, el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l, más preferentemente de no más de 33 g/l, aún más preferentemente de no más de 10 g/l, aún más preferentemente de no más de 3 g/l y lo más preferentemente de no más de 1 g/l.

Además de una baja solubilidad en agua, el agente activo hidrófobo tiene preferentemente una alta solubilidad en el disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua. Preferentemente, el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en el disolvente orgánico de al menos 10 g/l, más preferentemente de al menos 30 g/l, aún más preferentemente de al menos 100 g/l y lo más preferentemente de al menos 330 g/l.

Preferentemente, la solubilidad del agente activo hidrófobo en el disolvente orgánico es al menos 10 veces mayor que la solubilidad del agente activo hidrófobo en agua, más preferentemente, la solubilidad del agente activo hidrófobo en el disolvente orgánico es al menos 30 veces mayor que la solubilidad del agente activo hidrófobo en agua. Por tanto, el agente activo hidrófobo de acuerdo con la presente invención tiene preferentemente una solubilidad en el disolvente orgánico de al menos 10 g/l y una solubilidad en agua de no más de 1 g/l, más preferentemente una solubilidad en el disolvente orgánico de al menos 30 g/l y una solubilidad en agua de no más de 3 g/l, aún más preferentemente una solubilidad en el disolvente orgánico de al menos 100 g/l y una solubilidad en agua de no más de 10 g/l, y lo más preferentemente una solubilidad en el disolvente orgánico de al menos 330 g/l y una solubilidad en agua de no más de 33 g/l.

El agente activo hidrófobo es preferentemente un plaguicida, tal como un fungicida o un bactericida, lo más preferentemente un fungicida. De acuerdo con la presente invención, un fungicida es un compuesto químico biocida que es capaz de destruir, impedir, neutralizar o ejercer un efecto de control sobre hongos o esporas de hongos, y, en particular, es capaz de eliminar o inhibir hongos o esporas de hongos; y un bactericida es un compuesto químico biocida que es capaz de destruir, impedir, neutralizar o ejercer un efecto de control sobre bacterias, y, en particular, es capaz de eliminar o inhibir bacterias. Los ejemplos del fungicida que pueden usarse en la presente invención incluyen estrobilurinas tales como piracloestrobina, fungicidas de triazol tales como propiconazol y difenoconazol, y fungicidas de benzimidazol tales como tiabendazol.

En la primera etapa, la lignina modificada se emplea preferentemente en una cantidad de 0,1 a 30 g, más preferentemente de 0,5 a 15 g, aún más preferentemente de 1 a 10 g, y lo más preferentemente de 2 a 6 g por 100 g del disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua. El agente activo hidrófobo se emplea preferentemente en la primera etapa en una cantidad de 10 mg a 5000 mg, más preferentemente de 30 mg a 2000 mg, aún más preferentemente de 50 mg a 1000 mg, y lo más preferentemente de 100 a 500 mg por 100 g del disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua. Con respecto a 100 partes en peso (pep) de lignina modificada empleada en la primera etapa, el agente activo hidrófobo se emplea preferentemente en una cantidad de 0,1 a 30 pep, más preferentemente de 0,5 a 15 pep y lo más preferentemente de 1 a 10 pep.

En la segunda etapa del proceso de la presente invención (etapa (ii)), la solución obtenida en la primera etapa mediante la disolución de lignina modificada y un agente activo hidrófobo en un disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua se combina con agua y un tensioactivo para formar una preemulsión. La emulsión es del tipo aceite en agua (tipo ac./ag.). Con el fin de formar una emulsión de tipo ac./ag., la cantidad de agua es preferentemente superior a la cantidad de disolvente orgánico empleado en la primera etapa.

La cantidad de agua usada en la segunda etapa es preferentemente de 150 a 2000 pep, más preferentemente de 200 a 1000 pep, lo más preferentemente de 300 a 600 pep con respecto a 100 pep de disolvente orgánico empleado en la primera etapa.

El tensioactivo empleado en la segunda etapa de la presente invención puede ser un tensioactivo aniónico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico o una mezcla de los mismos. Puede usarse cualquier tensioactivo convencional que pueda contribuir a la formación de una emulsión de ac./ag. Los ejemplos del tensioactivo aniónico incluyen dodecilsulfato de sodio (SDS) y lutensol.

Resultan preferentes los tensioactivos no iónicos y aniónicos y combinaciones de los mismos. Los tensioactivos no iónicos adecuados son tensioactivos no iónicos arilalifáticos y alifáticos, p. ej., mono-, di- y trialquilfenilos etoxilados que tienen de 3 a 50 unidades de óxido de etileno (OE) y grupos alquilo C⁴-C¹², alcoholes de cadena larga etoxilados que tienen de 3 a 50 unidades de OE y grupos alquilo C⁸-C³⁰y copolímeros en bloque de óxido de polietileno/polipropileno. Preferentemente, se usan alcoholes de cadena larga etoxilados que tienen de 10 a 50 unidades de OE y grupos alquilo C¹⁰-C²².

Los ejemplos adecuados de tensioactivos no iónicos están disponibles en el mercado como Emulsogen LCN 287, Ethylan A4, Emulan NP50, Emulan TO 3070, Berol 277, Rhodasurf 3065, Triton X-405 y Genapol PF 80 y Lutensol® AT50 (C16/C18-(PEO)5^q).

El contenido total de tensioactivos no iónicos es preferentemente inferior al 10 % en peso (porcentaje en peso), basado en la cantidad total de monómeros de lignina modificada. El límite inferior de la cantidad de tensioactivos no iónicos puede ser de 0,5, o 1, o 1,5, o 2, o 2,5, o 3 % en peso, basado en la cantidad total de monómeros. El límite superior de la cantidad de tensioactivos no iónicos puede ser de 8, o 7,5, o 7, o 6,5, o 6, o 5,5 o 5 % en peso, basado en la cantidad total de monómeros.

Los tensioactivos aniónicos adecuados que pueden usarse para la preparación de la emulsión de acuerdo con la presente invención pueden seleccionarse de sales de ácidos grasos C⁵-C³⁰, sales de ácido de colofonia, sales alcalinas y de amonio de sulfatos de alquilo C⁸-C¹⁶, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfatos de alcanol C⁸-C²²etoxilados que tienen de 2 a 50 grupos de OE, sulfatos de alquilfenol C⁴-C¹²etoxilados que tienen de 2 a 50 unidades de OE, sulfonatos de alquilo C¹⁰-C¹⁸, sulfonatos de alquilarilo C⁸-C¹⁸, ésteres dialquílicos de sulfosuccinato, fosfatos de alquil éter y fosfatos de alquil aril éter.

Otros tensioactivos adecuados pueden encontrarse en Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol. 14/1, Makromolekulare Stoffe. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1961, páginas 192 a 208.

Los ejemplos adecuados de tensioactivos aniónicos están disponibles en el mercado como Texapon T42, Texapon NSO, Dextrol OC 50, Disponil SLS 101 special, Disponil LDBS 25, Empimin PCA 130, Marlon A 350, Dowfax 2A1, Emulsogen EPA 073, Polystep B27, Disponil FES 32, Aerosol OT-75 E, Empimin MA80, Rhodafac RS 610.

El contenido total de tensioactivos aniónicos es preferentemente inferior al 10 % en peso, basado en la cantidad total de monómeros de lignina modificada. El límite inferior de la cantidad de tensioactivos aniónicos puede ser de 0,5, o 1, o 1,5, o 2, o 2,5, o 3% en peso, basado en la cantidad total de monómeros. El límite superior de la cantidad de tensioactivos aniónicos puede ser de 8, o 7,5, o 7, o 6,5, o 6, o 5,5 o 5 % en peso, basado en la cantidad total de monómeros.

Los tensioactivos catiónicos adecuados que pueden usarse para la presente invención pueden seleccionarse de las sales de amonio alifáticas.

Los ejemplos adecuados de tensioactivos catiónicos son bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de hexadecil trimetil amonio, cloruro de cetil trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de dioctadecildimetilamonio y los disponibles en el mercado como Redicote E-5, Redicote E-11, Redicote E-53, Redicote E-606, Redicote 5127, Adogen 477HG, Indulin W-1, Indulin W-5, Indulin SBT.

Otros emulsionantes adecuados pueden encontrarse en Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol. 14/1, Makromolekulare Stoffe, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1961, páginas 192 a 208.

El tensioactivo se emplea preferentemente en la cantidad de 0,1 a 10 pep, preferentemente de 0,3 a 3 pep, aún más preferentemente de 0,5 a 2 pep con respecto a 100 partes en peso del disolvente orgánico empleado en la primera etapa.

Después de combinar la solución obtenida en la primera etapa con agua y un tensioactivo en la etapa (ii), se forma una preemulsión. Esto puede lograrse agitando los líquidos combinados, por ejemplo, mediante agitación o sacudida.

En la tercera etapa del proceso de la presente invención (etapa (iii)), se forma una emulsión a partir de la preemulsión. De este modo, el tamaño de gota de la fase oleosa se reduce y se consigue una distribución de tamaño estrecha. Los métodos para formar la emulsión incluyen ultrasonicación y homogeneización a alta presión (HPH, por sus siglas en inglés). Las gotas de la fase oleosa de la emulsión obtenida en la etapa (iii) tienen preferentemente un diámetro promedio en número de 50 nm a 1 pm, más preferentemente de 50 nm a 500 nm, aún más preferentemente de 100 a 300 nm, según lo determinado por dispersión dinámica de la luz (DLS, por sus siglas en inglés). Preferentemente, la ultrasonicación se lleva a cabo bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente. Específicamente, la ultrasonicación puede llevarse a cabo durante 3 minutos (punta de 1,27 cm (1/2 pulgada), 70 % de amplitud, 20 s de ultrasonidos seguido de 10 s de pausas).

Preferentemente, la emulsión es una miniemulsión, que es una emulsión estable con una distribución de tamaño homogénea en la que la maduración de Ostwald de las gotas se suprime mediante el uso de un agente de presión osmótica. El agente de presión osmótica es un compuesto hidrófobo con una solubilidad muy baja en agua, es decir, un ultrahidrófobo. Preferentemente, el agente de presión osmótica tiene una solubilidad en agua inferior a 0,1 g/l, más preferentemente inferior a 10 mg/l, lo más preferentemente, inferior a 1 mg/l, y se selecciona preferentemente del grupo que consiste en hidrocarburos alifáticos C^12-20, alcoholes alifáticos C^12-20, alquilacrilatos C^12-20, alquil mercaptanos C^12-20, colorantes orgánicos, alcanos fluorados, aceites de silicona, aceites naturales y sintéticos, oligómeros con un peso molecular de 1.000 a 500.000, y polímeros con un peso molecular de 1.000 a 500.000. Más preferentemente, el agente de presión osmótica es al menos un hidrocarburo alifático C^12-20, lo más preferentemente hexadecano.

Las nanopartículas de lignina obtenidas por el método del primer aspecto de la presente invención tienen generalmente una forma esférica que se produce por la reticulación de la lignina modificada que se disuelve en la fase orgánica que está presente en las gotas de la emulsión formada en la etapa (iii) del proceso del primer aspecto de la presente invención. Las nanopartículas de lignina pueden ser huecas, es decir, en forma de esfera hueca, porosa, o en forma de partícula sólida.

En el presente documento, una "esfera hueca" se refiere a una partícula en la que la lignina reticulada está presente en una cubierta esférica que forma la superficie de la partícula. Las partículas huecas se obtienen preferentemente cuando en la etapa (i) del proceso para la producción de nanopartículas de lignina de acuerdo con la presente invención se emplea una gran cantidad del agente de presión osmótica, es decir, si la relación en peso de lignina modificada respecto a agente de presión osmótica (lignina modificada: agente de presión osmótica) está en el intervalo de 5:1 a 1:1, más preferentemente de 4:1 a 2:1, aún más preferentemente de 3,5:1 a 2,5:1, lo más preferentemente aproximadamente 3:1. En la preparación de las nanopartículas de lignina huecas, se añade preferentemente un aceite no volátil que permanece tras la evaporación del disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua en la etapa (v). Los ejemplos de aceite no volátil incluyen aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva, palma, coco, maíz, semilla de maíz, cacahuete, sésamo, soja, girasol, almendra, colza).

Una "partícula sólida" se refiere a una partícula en la que la lignina reticulada y el agente activo hidrófobo están distribuidos homogéneamente por toda la partícula, es decir, una "partícula completa". En otras palabras, la "partícula sólida" no es hueca. Las partículas de la presente invención tienen preferentemente la forma de una partícula sólida. Las partículas sólidas muestran a menudo la menor fuga del agente activo hidrófobo. En particular, las nanopartículas de lignina de la presente invención muestran preferentemente una fuga del agente activo en dispersión acuosa en ausencia de lacasa en condiciones ambientales de no más del 30 % en peso, más preferentemente de no más de 20 % en peso, lo más preferentemente de no más de 10 % en peso. Preferentemente, cuando una dispersión acuosa que contiene las nanopartículas de lignina (tal como en la dispersión acuosa, que puede obtenerse por el proceso de la presente invención después de evaporar el disolvente orgánico) se almacena a 25 °C durante 30 días en ausencia de lacasa, el agente activo hidrófobo se libera de las nanopartículas de lignina en no más del 20 % en peso, más preferentemente en no más del 10% en peso, lo más preferentemente en no más del 5% en peso, basado en la cantidad total del agente activo hidrófobo utilizado en la preparación de las nanopartículas de lignina.

Las nanopartículas de lignina en forma de "partículas sólidas" se obtienen preferentemente cuando en la etapa (i) del proceso para la producción de nanopartículas de lignina de acuerdo con la presente invención se emplea una pequeña cantidad del agente de presión osmótica, es decir, si la relación en peso de lignina modificada respecto a agente de presión osmótica (lignina modificada: agente de presión osmótica) está en el intervalo de 20:1 a 80:1, más preferentemente de 25:1 a 60:1, incluso más preferentemente de 30:1 a 50:1, lo más preferentemente aproximadamente 40:1.

Se pueden conseguir partículas porosas si no se añade ningún agente de presión osmótica (agente ultrahidrófobo) en la etapa (i) del proceso para la producción de nanopartículas de lignina de acuerdo con la presente invención. En la preparación de las nanopartículas de lignina porosas, se emplea preferentemente un tensioactivo no iónico en la etapa (ii), más preferentemente lutensol.

En la cuarta etapa del proceso de la presente invención (etapa (iv)), la lignina modificada se reticula para formar nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo. La lignina, su modificación y la etapa de reticulación se explican a continuación.

Por lo general, la lignina está constituida por unidades de fenilpropano. Tres precursores comunes de monolignol que intervienen en la formación de la lignina se muestran en la Figura 1, es decir, alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico. Se desconoce la estructura exacta de la lignina, sin embargo, se han publicado algunas propuestas de estructura de la lignina. En la Figura 2 se muestra un modelo de estructura completa propuesta por Adler (Calvo-Flores FG, Dobado JA. "Lignin as Renewable Raw Material", ChemSusChem. 2010, 3, 1227).

La lignina usada con el fin de preparar la lignina modificada de acuerdo con la presente invención no está particularmente limitada. Sin embargo, la lignina debe tener preferentemente una solubilidad al menos 10 veces mayor, más preferentemente 30 veces mayor en la fase orgánica que en la fase acuosa.

Se puede emplear cualquier fracción de lignina convencional disponible en el mercado, incluyendo lignina kraft, que puede obtenerse en Aldrich Chemical Co.

De acuerdo con la presente invención, la lignina modificada se refiere a la lignina que está modificada químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales por molécula de lignina modificada que son adecuados para una polimerización y/o una reticulación. Dichos grupos funcionales son conocidos por un experto en la materia. Los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consiste en dobles enlaces terminales, preferentemente grupos (met)acrilato, grupos epoxi, grupos alquinilo, grupos aldehído, grupos ceto y grupos silano. En el presente documento, la expresión "grupos (met)acrilato" significa grupos acrilato, grupos metacrilato o una combinación de los mismos. Preferentemente, al menos el 50 % de los grupos hidroxilo presentes en la lignina antes de la modificación están modificados.

En lo sucesivo, se describen métodos de modificación de la lignina y métodos de reticulación de la lignina modificada.

En estos métodos, se emplean reacciones químicas bien conocidas por el experto en la materia. Detalles adicionales de estos procedimientos convencionales se describen en libros de texto de química tales como March's Advanced Organic Chemistry, 7a edición, 2013.

La lignina modificada con grupos (met)acrilato, es decir, lignina (met)acrilada, puede, por ejemplo, obtenerse mediante uno de los siguientes métodos:

(a) hacer reaccionar los grupos OH de la lignina con anhídrido (met)acrílico;

(b) hacer reaccionar los grupos OH de la lignina con cloruro de (met)acriloilo; o

(c) hacer reaccionar los grupos OH de la lignina con epiclorhidrina y hacer reaccionar el producto de la reacción con ácido (met)acrílico.

En la Figura 3 se muestra la síntesis de lignina metacrilada por reacción con anhídrido (met)acrílico. Se forma un enlace éster cuando los grupos hidroxilo de la lignina atacan al carbono carbonilo del anhídrido metacrílico. La reacción de los grupos OH de la lignina con el anhídrido (met)acrílico puede, por ejemplo, llevarse a cabo en las siguientes condiciones: La lignina se disuelve en un disolvente orgánico que no tiene grupos hidroxilo (p. ej., N,N-dimetilformamida, N-metilformamida, triamida hexametil fosfórica, nitrometano, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, acetona, acetamida, formamida) hasta una concentración de aproximadamente 1-20 % en peso a 0-25 °C. A continuación, se añade una cantidad equimolar de una amina-base terciaria (p. ej., trietilamina, piridina, diisopropiletilamina, lutidina, triisopropilamina, trimetilamina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-en (DBU), 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (TBD)) y se añade gota a gota anhídrido (met)acrílico. Se deja que la reacción continúe a 0-50 °C durante un periodo de 10 h para que se complete. Tratar finalmente eliminando el disolvente orgánico, volver a disolver en un disolvente orgánico para precipitar la sal de amonio (p. ej., dietiléter, diclorometano, cloroformo), la filtración y el secado permiten obtener el producto.

La reacción de los grupos OH de la lignina con cloruro de (me)acriloilo se efectúa de forma análoga a la reacción con el anhídrido de metacriloilo, sustituyendo el anhídrido en cantidades equimolares por cloruro de metacriloilo.

La reacción de los grupos OH de la lignina con epiclorhidrina puede, por ejemplo, llevarse a cabo disolviendo la lignina en un disolvente orgánico (p. ej., N,N-dimetilformamida, N-metilformamida, triamida hexametil fosfórica, nitrometano, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, acetona, acetamida, formamida) y activando la lignina disuelta mediante la adición de carbonato de sodio, potasio o cesio o el hidruro respectivo, seguido de la adición de la cantidad deseada de epiclorhidrina y dejando que la mezcla de reacción reaccione a 50 °C durante 24 h.

La lignina modificada con dobles enlaces terminales que no sean grupos (met)acrilato puede, por ejemplo, obtenerse disolviendo la lignina en un disolvente orgánico, activando la lignina disuelta mediante la adición de carbonato de sodio, potasio o cesio, o el hidruro respectivo, añadiendo la cantidad deseada de una olefina halogenada y dejando que la mezcla de reacción reaccione a 50 °C durante 24 h.

La reticulación en la etapa (iv) de la lignina que tiene dobles enlaces terminales, preferentemente lignina (met)acrilada, puede lograrse preferentemente:

(1) añadiendo un compuesto de amina que tiene al menos 2 grupos amino y/o un compuesto de tiol que tiene al menos dos grupos tiol a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando una adición de Michael;

(2) realizando una polimerización por radicales; o

(3) añadiendo un dieno a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando una metátesis de olefinas.

La adición de Michael puede, por ejemplo, llevarse a cabo a temperaturas elevadas (40-60 °C) durante un periodo de 8 h con una agitación suave. Preferentemente, el pH se ajusta en el intervalo de 5 a 8 antes de añadir el compuesto de amina.

Los ejemplos de compuestos de amina adecuados que tienen al menos dos grupos amino para su uso en la adición de Michael incluyen diaminas alifáticas, preferentemente a-w-diaminas alifáticas C^1-8tales como etilendiamina, 1,3-diamino propano, 1,4-diaminobutano, 1,5-diamino pentano, y 1,6-diamino hexano, difeniletilendiamina, 2,2'(etilendioxi)bis(etilamina), diaminociclohexano, o-fenilendiamina, m-fenilendiamina, p-fenilendiamina, 4,4'-diaminobifenilo, 1,8-diaminonaftaleno, espermidina, espermina; termoespermina, piperazina, cicleno, ciclam, bis(hexametilen)triamina, lisina, dietilentriamina, trietilentetraamina, propano-1,2,3-triamina, ciclohexano-1,3,5-triamina, benceno-1,3,5-triamina, tris(2-aminoetil)amina.

La polimerización por radicales puede, por ejemplo, llevarse a cabo en presencia de un iniciador tal como azobisisobutironitrilo (AIBN), peróxido de dibenzoilo (DBPO), 2,2'azobis(2-metilbutironitrilo) (V-59). En este caso, la ultrasonicación en la etapa (iii) se lleva a cabo preferentemente bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente y el inicio de la polimerización debido al calentamiento. Después de la formación de la emulsión, la polimerización por reticulación se lleva a cabo preferentemente a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 5 horas con una agitación suave.

La metátesis de olefinas puede, por ejemplo, llevarse a cabo añadiendo el catalizador (catalizador de Grubbs de 2a generación o de Grubbs Hoveyda de 2a generación) después de la formación de la emulsión, y llevando a cabo la polimerización por reticulación preferentemente a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 5 horas con agitación suave.

Cuando se emplea polimerización por radicales o metátesis de olefinas, la ultrasonicación en la etapa (iii) se lleva a cabo preferentemente bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente y el inicio de la polimerización debido al calentamiento.

Los ejemplos de compuestos de dieno adecuados para su uso en la metátesis de olefinas incluyen alfa-omega diolefinas, tales como pentadieno, hexadieno, heptadieno, octadieno, nonadieno y divinilbenceno.

La lignina modificada con grupos epoxi puede, por ejemplo, obtenerse haciendo reaccionar los grupos OH de la lignina con epiclorhidrina, como se ha descrito anteriormente.

La reticulación en la etapa (iv) de la lignina modificada con grupos epoxi puede conseguirse preferentemente añadiendo un compuesto de amina que tiene al menos dos grupos amino a la emulsión obtenida en la etapa (iii). Las condiciones de esta reacción son análogas a la reacción de adición de Michael de la lignina metacrilada con diaminas mencionadas anteriormente.

Los ejemplos de compuestos de amina adecuados que tienen al menos dos grupos amino para su uso en la reacción con lignina modificada con epoxi incluyen los compuestos de amina mencionados anteriormente con respecto a la adición de Michael.

La lignina modificada con grupos alquinilo, es decir, lignina alquinada, puede, por ejemplo, obtenerse haciendo reaccionar los grupos OH de la lignina con alquinos halogenados. Esto puede, por ejemplo, conseguirse disolviendo la lignina en un disolvente orgánico y activando la lignina mediante la adición de carbonato de sodio, potasio o cesio, o el hidruro respectivo. A continuación se añade la cantidad deseada de un alquino halogenado y se deja reaccionar la mezcla de reacción a 50 °C durante 24 h.

Los ejemplos de alquinos halogenados adecuados incluyen alquinos u>-halógeno sustituidos que tienen un triple enlace terminal de la fórmula hal-(CH²)n-CECH, en donde n es 1 a 12 y hal es CI, Br o I, tal como bromuro de propargilo, cloruro de propargilo, 4-cloro-1-butino, 5-bromo-1-pentino, etc.

La reticulación en la etapa (iv) de la lignina alquinada puede lograrse preferentemente añadiendo un compuesto que tiene al menos dos grupos azida a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando la azida-alquino-cicloadición.

Los ejemplos de catalizadores que pueden usarse en la azida-alquino-cicloadición incluyen catalizadores de cobre y rutenio, tales como ascorbato de cobre, CuSO⁴, Cp*RuCl(cod), Cp*RuCl(PPh³)².

Los ejemplos del compuesto adecuado que tiene al menos dos grupos azida incluyen 1,3-diazidopropano, 1,4-diazidobutano, 1,5-diazidopentano, 1,6-diazidohexano, 1,7-diazidoheptano, 1,8-diazidooctano, etc.

Como alternativa, la reticulación en la etapa (iv) de la lignina alquinada puede lograrse mediante la realización de la metátesis de alquinos. Esta reacción es análoga a la reacción de metátesis de olefinas, salvo que se use un catalizador adecuado de metátesis de diinos y alquinos, tal como los descritos en Fürstner, A.; Davies, P. W. (2005). "Alkyne metathesis". Chemical Communications (18): 2307-2320 (doi:10.1039/b419143a).

La lignina modificada con grupos aldehido o ceto puede, por ejemplo, obtenerse mediante la reacción de Vilsmeier usando una amida sustituida y oxicloruro de fósforo, seguido de hidrólisis. La reacción de Vilsmeier puede llevarse a cabo de acuerdo con la Revisión de Rajput et al. en IJPCBS 2012, 3(1), 25-43 (ISSN 2249-9504).

La reticulación en la etapa (iv) de la lignina modificada con grupos aldehido o ceto puede, por ejemplo, conseguirse añadiendo una amina difuncional o un alcóxido difuncional a la emulsión obtenida en la etapa (iii). Los ejemplos de la amina difuncional incluyen los compuestos de amina mencionados anteriormente con respecto a la adición de Michael. Los ejemplos del alcóxido difuncional incluyen sales de sodio, potasio, rubidio o cesio de etilenglicol, propilenglicol, dietilenglicol, oligoetilenglicol, glicerol, hexosas, pentosas, sorbitol u oligoglicerol.

La lignina modificada con grupos silano puede, por ejemplo, obtenerse haciendo reaccionar los grupos OH de la lignina con clorosilanos. Esto puede, por ejemplo, conseguirse disolviendo la lignina en un disolvente orgánico, añadiendo la cantidad deseada de clorosilano y dejando que la mezcla de reacción reaccione a 50 °C durante 24 h.

Los ejemplos de clorosilanos adecuados incluyen dimetilclorosilano, clorodifenilsilano, clorodiisopropilsilano, clorodietilsilano, y cloro(metil)fenilsilano.

La reticulación en la etapa (iv) de la lignina modificada con grupos silano puede, por ejemplo, conseguirse añadiendo un dieno y un catalizador de Pt y realizando la hidrosililación. Esta reacción puede llevarse a cabo en condiciones análogas a la reacción de metátesis de olefinas mencionada anteriormente, excepto por el uso de un catalizador de Pt tal como el catalizador de Speier, el catalizador de Karstedt, o Pt/C.

Además de las etapas descritas anteriormente (i) a (iv), el proceso de la presente invención puede comprender una quinta etapa (etapa (v)) en la que el disolvente orgánico se evapora de la emulsión obtenida en la cuarta etapa. Durante el proceso de evaporación, las partículas de lignina se forman puesto que el agua es un disolvente deficiente de la lignina reticulada. Por tanto, se obtiene una dispersión acuosa de nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo.

Si se lleva a cabo la etapa (v) del proceso, el disolvente orgánico debe tener un punto de ebullición inferior al del agua o el disolvente orgánico debe formar un azeótropo con agua. Dado que el disolvente orgánico presenta baja solubilidad en agua, normalmente se forma un azeótropo, ya que el punto de ebullición del disolvente orgánico es superior al del agua. La evaporación del disolvente orgánico puede lograrse, por ejemplo, agitando la mezcla de reacción en el recipiente de reacción que está abierto a la atmósfera, calentando o aplicando un vacío.

Además de las etapas descritas anteriormente (i) a (v), el proceso de la presente invención puede comprender una sexta etapa (etapa (vi)) en la que, después de la etapa de evaporación (v), las nanopartículas de lignina se separan de la fase acuosa. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración o diálisis.

Además de las etapas descritas anteriormente (i) a (vi), el proceso de la presente invención puede comprender una séptima etapa (etapa (vii)) en la que se retiran el agua y el disolvente orgánico restantes para conseguir un polvo de nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo. Esto puede, por ejemplo, conseguirse mediante la aplicación de vacío, particularmente mediante liofilización.

El polvo de nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo obtenido en la etapa (vii) puede dispersarse en agua con el fin de obtener una dispersión acuosa de dichas nanopartículas de lignina.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula de lignina que comprende una lignina reticulada y un agente activo hidrófobo como se define en la reivindicación 1.

Las nanopartículas de lignina de acuerdo con el segundo y tercer aspecto de la presente invención tienen preferentemente un diámetro promedio en número de 50 nm a 1 pm, más preferentemente de 50 nm a 500 nm, aún más preferentemente de 100 a 300 nm, según lo determinado por dispersión dinámica de la luz (DLS).

Las nanopartículas de lignina de acuerdo con el segundo y tercer aspecto de la presente invención tienen generalmente una forma esférica que se produce por la reticulación de la lignina modificada que se disuelve en la fase orgánica que está presente en las gotas de la emulsión formada en la etapa (iii) del proceso del primer aspecto de la presente invención. Las partículas pueden ser huecas, es decir, en forma de esfera hueca, porosa, o en forma de partícula sólida.

Adicionalmente, la presente invención proporciona en un cuarto aspecto una dispersión acuosa que contiene las nanopartículas de lignina de acuerdo con el segundo aspecto o el tercer aspecto. La dispersión acuosa del cuarto aspecto se puede obtener mediante el proceso del primer aspecto que incluye las etapas (i) a (v) o que incluye las etapas (i) a (vii).

Las plantas que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención incluyen generalmente plantas vasculares, en particular spermatophytes (es decir, plantas de semilla), más específicamente plantas leñosas. Los ejemplos de plantas incluyen plantas de los géneros Vitis, Prunus, Pistacia, Olea, Platanus, Malus, Púnica, Ulmus, y Nerium, preferentemente Vitis, Prunus, Pistacia, y Olea, más preferentemente Vitis. Las especies vegetales específicas incluyen vides (Vitis vinifera), almendro (Prunus dulcis), melocotonero (Prunus pérsica), pistachero (Pistacia vera), y olivo (Olea europaea), más preferentemente vides (Vitis vinifera).

Los ejemplos de infección fúngica o bacteriana de las plantas incluyen infecciones causadas por una especie que es capaz de degradar la lignina. La lignina puede ser degradada por enzimas producidas por hongos o bacterias, incluyendo lacasa, lignina peroxidasa, mangan peroxidasa y alquil-aril-eterasa. Las especies de hongos que producen dichas enzimas incluyen especies de los géneros Phaeomoniella, Phaeoacremonium, o Formitiporia, o la familia Botryosphaeriaceae. Existe un amplio intervalo de Basidiomycetes, que producen lacasas, lignina peroxidasas, mangan peroxidasas y otras enzimas que degradan la lignina, por ejemplo, hongos de los géneros: Phanerochaete, Phlebia, Ceriporiopsis, Trametes, Agaricus Pleurotus y otros (Lundell, T. K., Makela, M. R., y Hilden, K. (2010). Ligninmodifying enzymes in filamentous basidiomycetes-ecological, functional and phylogenetic review. Journal of basic microbiology, 50(1), 5-20.). Phanerochaete que es un género de hongos de la familia Phanerochaetaceae de la división de Basidiomycota. Varias de las especies de este género son patógenos de las plantas. Infectan, por ejemplo, las plataneras y los manzanos, así como las higueras, granados, olmos, vides, algodonero, alfalfa y adelfa. La mayoría de las especies son capaces de producir lignina peroxidasa, mangan peroxidasa, alquil-aril-eterasa, como hacen muchas Basidiomycota. Los miembros de este género también podrían ser una diana para nuestro tratamiento.

Las infecciones que pueden tratarse con la dispersión acuosa de acuerdo con la presente invención incluyen Esca, que es un tipo de enfermedad del tronco de la vid, y que se considera que es causada por especies que incluyen Phaeomoniella chlamydospora (Pch), Phaeoacremonium aleophilum (Pal), y Formitiporia mediterranea (Fmed).

Las infecciones fúngicas del almendro (Prunus dulcis) incluyen infecciones por Botryosphaeriaceae, Collophora, Eutypa lata, Phaeoacremonium, y Phomopsis amygdali. Las infecciones fúngicas del melocotonero (Prunus persica) incluyen infecciones por Botryosphaeria. Las infecciones fúngicas del pistachero (Pistacia vera) incluyen infecciones por Phaeoacremonium y Botiyosphaeria.

La presente invención también proporciona en un sexto aspecto un método de tratamiento de una planta contra una infección fúngica o bacteriana por inyección de la dispersión acuosa del cuarto aspecto en el tallo de la planta.

La inyección se lleva a cabo preferentemente con el sistema de microinyección Tree Tech®. Como alternativa, pueden usarse otros sistemas de inyección, tales como Smart-Shot™ Refillable Tree Injector de treelogic, o Chemjet Tree Injector.

El método de tratamiento de una planta contra una infección fúngica o bacteriana por inyección de la dispersión acuosa del cuarto aspecto en el tallo de la planta puede, por ejemplo, llevarse a cabo tal como sigue:

(i) la cápsula del sistema de microinyección Tree Tech® se rellena con una dispersión acuosa de las nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrófobo de acuerdo con la presente invención,

(ii) se perfora un orificio de una profundidad de 5 a 9 mm en el tallo de la planta, p. ej., en el tronco de la vid, usando una broca esterilizada;

(iii) el sistema de microinyección Tree Tech® se coloca en el orificio y se activa para iniciar la inyección de la dispersión acuosa;

(iv) después de 24 a 48 horas, se retira el sistema de inyección y se tapa el orificio con cera de sellado para heridas.

Con el método descrito en el presente documento, se pueden tratar plantas (tales como la vid) ya infestadas con hongos (tales como Esca). El método incluye una inyección en una planta viva (vid). Con este fin, se perfora un pequeño orificio en el tallo de la planta que, sin embargo, no causa ningún daño duradero. Las nanopartículas de lignina que contienen el agente activo se transportan por medio de la circulación del xilema y del floema, por medio del cual, el ingrediente activo encapsulado se distribuye en los capilares de la planta. El agente activo se inmoviliza en las nanopartículas de lignina y se activa y libera a través de la escisión enzimática de las nanopartículas de lignina reticulada en aquellas partes de la planta que están infectadas por hongos. Por tanto, el agente activo puede ejercer su acción directamente en el sitio infectado de la planta.

La presente invención proporciona un tratamiento curativo de plantas de vid ya infectadas. De este modo, se puede evitar la pérdida total de la planta de vid. Adicionalmente, la aplicación del agente activo directamente en el tejido de la planta y la posterior activación dirigida del agente activo permite el uso de una cantidad muy pequeña de fungicida. Por otra parte, no es necesario aplicar el agente activo en la superficie de la planta. Por tanto, la contaminación del medio ambiente con plaguicidas puede reducirse. Los microorganismos terrestres no se ven, por tanto, afectados por la aplicación del agente activo. La aplicación del agente activo puede repetirse fácilmente en una planta con un diámetro de tronco de más de 2 cm. Esto da como resultado una alternativa rentable a la sustitución de la planta. El principio activo hidrófobo no puede aplicarse per se. Cuando las nanopartículas de lignina hidrófila de acuerdo con la presente invención se inyectan en una planta infectada, el fungicida solo se liberará en los sitios de la planta en los que la capa de lignina es descompuesta por los hongos patógenos. Por lo tanto, el fungicida se enriquece en la proximidad de los hongos, con lo que se consigue una concentración suficientemente alta del fungicida para atacar eficazmente a los hongos. Los últimos ensayos de campo también mostraron que no se puede aislar ninguna sustancia biológica activa (fungicida) de las uvas.

La presente invención se resume en las siguientes realizaciones preferidas:

En una primera realización, la presente invención proporciona un proceso para la producción de nanopartículas de lignina que comprenden un agente activo hidrófobo contra las infecciones de las plantas,

comprendiendo el proceso las siguientes etapas:

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

en donde la lignina modificada es una lignina que está modificada químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales adecuados para una polimerización y/o una reticulación seleccionados del grupo que consiste en dobles enlaces terminales, grupos epoxi, grupos alquinilo, grupos aldehido, grupos ceto y grupos silano, y en donde el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l.

En una segunda realización, la presente invención proporciona el proceso de la primera realización , que incluye, después de la etapa de reticulación (iv), una etapa (v):

(v) evaporar el disolvente orgánico.

En una tercera realización, la presente invención proporciona el proceso de la segunda realización , que incluye, después de la etapa (v), una etapa (vi):

(vi) separar las nanopartículas de lignina de la fase acuosa.

En una cuarta realización, la presente invención proporciona el proceso de la tercera realización, que incluye, después de la etapa de separación (vi), una etapa (vii):

(vii) retirar el agua y el disolvente orgánico restantes para conseguir un polvo de nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo.

En una quinta realización, la presente invención proporciona el proceso de la cuarta realización, que incluye una etapa (viii) :

(viii) dispersar las nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo obtenido en la etapa (vii) en agua usando un agente tensioactivo para obtener una dispersión acuosa de dichas nanopartículas de lignina.

En una sexta realización, la presente invención proporciona el proceso de cualquiera de una de las realizaciones primera a quinta, en donde los grupos funcionales se seleccionan de dobles enlaces terminales, grupos epoxi y grupos silano.

En una séptima realización, la presente invención proporciona el proceso de la sexta realización, en donde los grupos funcionales son dobles enlaces terminales.

En una octava realización, la presente invención proporciona el proceso de la séptima realización, en donde los grupos funcionales son grupos (met)acrilato.

En una novena realización, la presente invención proporciona el proceso de cualquiera de una de las realizaciones sexta a octava, en donde al menos el 50 % de los grupos hidroxilo presentes en la lignina antes de la modificación están modificados.

En una décima realización, la presente invención proporciona el proceso de cualquiera de una de las realizaciones primera a novena, en donde la lignina modificada se emplea en una cantidad de 0,1 a 30 g, preferentemente de 0,5 a 15 g, más preferentemente de 1 a 10 g, y lo más preferentemente de 2 a 6 g por 100 g del disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua.

En una undécima realización, la presente invención proporciona el proceso de cualquiera de una de las realizaciones primera a décima, en donde el disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua empleado en la etapa (i) es un disolvente orgánico que tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l, preferentemente de no más de 30 g/l, y lo más preferentemente de no más de 10 g/l.

En una duodécima realización, la presente invención proporciona el proceso de la undécima realización, en donde el disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua se selecciona de disolventes de hidrocarburo, hidrocarburos halogenados, alcoholes y compuestos orgánicos que tienen un grupo nitro.

En una décima tercera realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a duodécima, en donde el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l, preferentemente de no más de 33 g/l, más preferentemente de no más de 10 g/l, aún más preferentemente de no más de 3 g/l y lo más preferentemente de no más de 1 g/l.

En una décima cuarta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a décima tercera, en donde el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en el disolvente orgánico empleado en la etapa (i) de al menos 10 g/l, preferentemente de al menos 30 g/l, más preferentemente de al menos 100 g/l y lo más preferentemente de al menos 330 g/l.

En una décima quinta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a décima cuarta, en donde la solubilidad del agente activo hidrófobo en el disolvente orgánico es al menos 10 veces mayor que la solubilidad del agente activo hidrófobo en agua, preferentemente, la solubilidad del agente activo hidrófobo en el disolvente orgánico es al menos 30 veces mayor que la solubilidad del agente activo hidrófobo en agua.

En una décima sexta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a décima quinta, en donde el agente activo hidrófobo es un plaguicida, preferentemente un fungicida o un bactericida, lo más preferentemente un fungicida.

En una décima séptima realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a décima sexta, en donde el agente activo hidrófobo se emplea en la etapa (i) en una cantidad de 10 mg a 5000 mg, preferentemente de 30 mg a 2000 mg, más preferentemente de 50 mg a 1000 mg, y lo más preferentemente de 100 a 500 mg por 100 g del disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua.

En una décima octava realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a décima séptima, en donde el agente activo hidrófobo se emplea en una cantidad de 0,1 a 30 pep, preferentemente de 0,5 a 15 pep, y lo más preferentemente de 1 a 10 pep con respecto a 100 partes en peso de lignina modificada empleada en la etapa (i).

En una décima novena realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a décima octava, en donde el disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua empleado en la etapa (i) comprende un agente de presión osmótica.

En una vigésima realización, la presente invención proporciona el proceso de la décima novena realización, en donde el agente de presión osmótica tiene una solubilidad en agua inferior a 0,1 g/l, más preferentemente inferior a 10 mg/l, lo más preferentemente, inferior a 1 mg/l.

En una vigésima primera realización, la presente invención proporciona el proceso de la realización décima novena o vigésima, en donde el agente de presión osmótica se selecciona del grupo que consiste en hidrocarburos alifáticos C¹²-²⁰, alcoholes alifáticos C¹²-²⁰, alquilacrilatos C¹²-²⁰, alquil mercaptanos C¹²-²⁰, colorantes orgánicos, alcanos fluorados, aceites de silicona, aceites naturales y sintéticos, oligómeros con un peso molecular de 1.000 a 500.000, y polímeros con un peso molecular de 1.000 a 500.000, es preferentemente al menos un hidrocarburo alifático C¹²-²⁰, y es lo más preferentemente hexadecano.

En una vigésima segunda realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones décima novena a vigésima primera, en donde en la etapa (iii) se forma una miniemulsión.

En una vigésima tercera realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones décima novena a vigésima segunda, en donde la relación en peso de lignina modificada respecto al agente de presión osmótica está en el intervalo de 5:1 a 1:1, preferentemente de 4:1 a 2:1, más preferentemente de 3,5:1 a 2,5:1, lo más preferentemente aproximadamente de 3:1 para obtener nanopartículas de lignina huecas.

En una vigésima cuarta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones décima novena a vigésima segunda, en donde la relación en peso de lignina modificada respecto al agente de presión osmótica está en el intervalo de 20:1 a 80:1, preferentemente de 25:1 a 60:1, más preferentemente de 30:1 a 50:1, lo más preferentemente aproximadamente de 40:1 para obtener nanopartículas de lignina sólidas.

En una vigésima quinta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones décima novena a vigésima cuarta, en donde el tensioactivo empleado en la etapa (ii) se selecciona de un tensioactivo aniónico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico o una combinación de los mismos.

En una vigésima sexta realización, la presente invención proporciona el proceso de la vigésima quinta realización, en donde el tensioactivo se selecciona de un tensioactivo aniónico o un tensioactivo no iónico o una combinación de los mismos.

En una vigésima séptima realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a vigésima sexta, en donde la emulsión se forma en la etapa (iii) por ultrasonicación y/u homogeneización a alta presión.

En una vigésima octava realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a vigésima séptima, en donde la lignina modificada es una lignina que tiene dobles enlaces terminales, preferentemente lignina (met)acrilada, y la reticulación en la etapa (iv) se realiza:

(1) añadiendo un compuesto de amina que tiene al menos dos grupos amino y/o un compuesto de tiol que tiene al menos dos grupos tiol a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando una adición de Michael;

(2) realizando una polimerización por radicales; o

En una vigésima novena realización, la presente invención proporciona el proceso de la vigésima octava realización, en donde la lignina (met)acrilada se obtiene por uno de los siguientes métodos:

(a) hacer reaccionar los grupos OH de la lignina con anhídrido (met)acrílico;

En una trigésima realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a vigésima séptima, en donde la lignina modificada es una lignina modificada con grupos epoxi y la reticulación en la etapa (iv) se realiza:

añadiendo un compuesto de amina que tiene al menos dos grupos amino a la emulsión obtenida en la etapa (iii).

En una trigésima primera realización, la presente invención proporciona el proceso de la trigésima realización, en donde la lignina modificada con grupos epoxi se obtiene haciendo reaccionar grupos OH de la lignina con epiclorhidrina.

En una trigésima segunda realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a vigésima séptima, en donde la lignina modificada es una lignina alquinada y la reticulación en la etapa (iv) se realiza:

(1) añadiendo un compuesto que tiene al menos dos grupos azida a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando la azida-alquino-cicloadición; o

(2) realizando una metátesis de alquinos.

En una trigésima tercera realización, la presente invención proporciona el proceso de la trigésima segunda realización, en donde la lignina alquinada se obtiene haciendo reaccionar grupos OH de la lignina con alquinos halogenados.

En una trigésima cuarta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a vigésima séptima, en donde la lignina modificada es una lignina modificada con grupos aldehído o ceto y la reticulación en la etapa (iv) se realiza:

En una trigésima quinta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a vigésima séptima, en donde la lignina modificada es una lignina modificada con grupos silano y la reticulación en la etapa (iv) se realiza:

realizando una hidrosililación.

En una trigésima sexta realización, la presente invención proporciona el proceso de la trigésima quinta realización, en donde la lignina se modifica haciendo reaccionar los grupos OH de la lignina con clorosilanos.

En una trigésima séptima realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a trigésima sexta, que comprende las siguientes etapas:

(i) disolver la lignina (met)acrilada y un fungicida en un disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua; (ii) combinar la solución con agua y un tensioactivo para formar una preemulsión;

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

(iv) reticular la lignina (met)acrilada añadiendo un compuesto de amina que tiene al menos dos grupos amino y/o un compuesto de tiol que tiene al menos dos grupos tiol a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando una adición de Michael para formar nanopartículas de lignina que comprenden el fungicida; y

(v) evaporar el disolvente orgánico.

En una trigésima octava realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a trigésima sexta, que comprende las siguientes etapas:

(i) disolver la lignina (met)acrilada y un fungicida en cloroformo;

(ii) combinar la solución con agua y dodecilsulfato de sodio para formar una preemulsión;

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

(v) evaporar el disolvente orgánico.

En una trigésima novena realización, la presente invención proporciona el proceso de la realización trigésima séptima o trigésima octava, en donde en la etapa (i) se añade hexadecano y se forma una miniemulsión en la etapa (iii). En una cuadragésima realización, la presente invención proporciona el proceso de la realización trigésima séptima o trigésima octava, en donde en la etapa (i) se añade un aceite vegetal y se forma una miniemulsión en la etapa (iii). En una cuadragésima primera realización, la presente invención proporciona nanopartículas de lignina que comprenden una lignina reticulada y un agente activo hidrófobo, pudiendo ser obtenidas las nanopartículas de lignina mediante el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a cuadragésima.

En una cuadragésima segunda realización, la presente invención proporciona nanopartículas de lignina que comprenden lignina reticulada y un agente activo hidrófobo de acuerdo con la reivindicación 1.

En una cuadragésima tercera realización, la presente invención proporciona las nanopartículas de lignina de la cuadragésima segunda realización, en donde el agente activo hidrófobo es un plaguicida, preferentemente un fungicida o un bactericida, lo más preferentemente un fungicida

En una cuadragésima cuarta realización, la presente invención proporciona el proceso de una cualquiera de las realizaciones primera a cuadragésima o las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las realizaciones cuadragésima primera a cuadragésima tercera, en donde las nanopartículas de lignina no son huecas.

En una cuadragésima quinta realización, la presente invención proporciona las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las realizaciones cuadragésima primera a cuadragésima cuarta que tienen un diámetro promedio en número de 50 nm a 1 pm, preferentemente de 5o nm a 500 nm.

En una cuadragésima sexta realización, la presente invención proporciona las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las realizaciones cuadragésima primera a cuadragésima sexta que muestran una fuga del agente activo en solución acuosa en condiciones ambientales de no más del 30 % en peso.

En una cuadragésima séptima realización, la presente invención proporciona las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las realizaciones cuadragésima primera a cuadragésima sexta, en donde cuando una dispersión acuosa que contiene las nanopartículas de lignina se almacena a 25 °C durante 30 días en ausencia de lacasa, el agente activo hidrófobo se libera de las nanopartículas de lignina en no más del 20 % en peso, preferentemente del 10 % en peso, más preferentemente del 5 % en peso, basado en la cantidad total del agente activo hidrófobo usado en la preparación de las nanopartículas de lignina.

En una cuadragésima octava realización, la presente invención proporciona una dispersión acuosa que contiene las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las realizaciones cuadragésima primera a cuadragésima séptima. En una cuadragésima novena realización, la presente invención proporciona la dispersión acuosa de la cuadragésima octava realización, que puede obtenerse por el proceso de la realización segunda o quinta.

En una quincuagésima realización, la presente invención proporciona un uso de las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las realizaciones cuadragésima primera a cuadragésima séptima o la dispersión acuosa de la realización cuadragésima octava o cuadragésima novena para el tratamiento de las plantas contra una infección fúngica o bacteriana, en donde el agente activo hidrófobo es un fungicida o un bactericida, respectivamente.

En una quincuagésima primera realización, la presente invención proporciona el uso de la quincuagésima realización, en donde la infección es causada por una especie que es capaz de degradar la lignina.

En una quincuagésima segunda realización, la presente invención proporciona el uso de la quincuagésima realización, en donde la infección es causada por una lacasa (o lignina peroxidasa, mangan peroxidasa, alquil-aril-eterasa) que produce especies, tales como Phaeomoniella, Phaeoacremonium, Formitiporia, o Phanerochaete.

En una quincuagésima tercera realización, la presente invención proporciona el uso de una cualquiera de las realizaciones quincuagésima a quincuagésima segunda, en donde la planta es la vid y la infección es Esca.

En una quincuagésima cuarta realización, la presente invención proporciona el uso de una cualquiera de las realizaciones quincuagésima a quincuagésima segunda, en donde la planta se selecciona de almendro, melocotonero o pistachero.

En una quincuagésima quinta realización, la presente invención proporciona un método de tratamiento de una planta contra una infección fúngica o bacteriana por inyección de la dispersión acuosa de la realización cuadragésima octava o cuadragésima novena en el tallo de la planta, en donde el agente activo hidrófobo es un fungicida o un bactericida, respectivamente.

Ejemplos

Materiales

La lignina se adquirió en Aldrich Chemical Co. (lignina kraft, álcali). Antes del experimento, la lignina se extrajo con propanol y se secó en una estufa de vacío durante la noche. Los datos publicados sobre la lignina kraft muestran que la cantidad de grupos hidroxilo (alifáticos y fenólicos) era de 1,24 por 1 unidad de fenilpropano (PPU o unidad C9, suponiendo que el peso molecular de la madera dura es de 183 g mol-1). Anhídrido metacrílico, trietilamina, alcohol isopropílico, cloruro de litio y dimetilformamida (DMF) también se obtuvieron en Aldrich Chemical Co. El cloruro de litio se secó a 70 °C en una estufa de vacío antes de su uso. El tensioactivo no iónico Lutensol se obtuvo en BASF. El tensioactivo aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS) y el hexadecano se adquirieron en Fluka y se usaron tal como se recibieron.

Caracterizaciones de la lignina

Con el fin de investigar la estructura de la lignina y la lignina metacrilada, se obtuvieron espectros de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés) mediante Nicolet iS 10 con accesorio de ATR vertical. Las muestras se secaron a temperatura ambiente en un horno de vacío. Los espectros se registraron entre 600 y 4000 cm-1 con una resolución de 4 cm-1 y un promedio de 32 barridos. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN) fue realizada por Bruker AVANCE a 500 MHz. Se disolvieron aproximadamente 5 mg de muestras en 750 pl de DMSO-d6. El cálculo del grado de sustitución se realizó usando hexametilciclotrisiloxano como patrón interno en las mismas condiciones. Se usó la cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés) para determinar el peso molecular promedio en peso.

Las mediciones de la cromatografía de permeación en gel (GPC) se llevaron a cabo en DMF, con muestras de la concentración de 1 g l-1. La inyección de la muestra se realizó con un muestreador automático 717 plus (Waters) a 30 °C de DMF. El flujo fue de 1 ml min-1. Se emplearon tres columnas SDV (PSS) de dimensiones 300 x 80 mm, 10 pm de tamaño de partícula y tamaños de poro de 106, 104 y 500 A. La detección se logró con el detector DRI Shodex RI-101 (ERC), detector Uv-Vis S-3702 (Soma), y F^lD 1260 (Agilent Technologies 1260 Infinity, excitación de fluorescencia: 520 nm; emisión: 540 nm). La calibración se llevó a cabo usando patrones de poliestireno proporcionados por Polymer Standards Service.

La temperatura de transición vítrea (Tg) de las ligninas se evaluó usando un calorímetro diferencial de barrido Mettler Toledo DSC 823 que funcionaba con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min bajo un caudal de nitrógeno de 10 ml/min. Los valores Tg se calcularon como el punto medio del cambio en la capacidad calorífica. La estabilidad térmica de la lignina se estudió en términos de análisis termogravimétrico (TGA, por sus siglas en inglés) de 30 a 900 °C a 10 °C/min bajo atmósfera de nitrógeno. Antes de ser analizadas por DSC y TGA, las muestras se secaron a temperatura ambiente bajo vacío durante una noche para eliminar la presencia de agua.

Caracterizaciones de las partículas de lignina

El diámetro hidrodinámico de las partículas se midió por DLS con NICOMP 380 a un ángulo fijo de 90° y un diodo láser funcionando a 635 nm, tras diluir la muestra con agua hasta aproximadamente un 0,01 % en peso. La morfología de las partículas se observó mediante TEM con un Zeiss EM912 a una tensión de aceleración de 120 kV. Las muestras se prepararon vertiendo una gota de dispersión diluida (0,1 % en peso) sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono (300 mallas cuadradas) y se secaron a temperatura ambiente.

Eficiencia de encapsulación del principio activo antifúngico

Con el fin de determinar la eficiencia de encapsulación del fungicida cargado de partículas de lignina, se investigaron dos métodos posibles. En el método indirecto, se centrifugó una muestra a 10.000 rpm durante 30 min. Se tomó el sobrenadante, se liofilizó y se disolvió en THF. En el método directo, se usó el sedimento después de la centrifugación. El sedimento se liofilizó y se disolvió en THF para romper las nanopartículas. Las soluciones de ambas rutas se pasaron por un filtro de 0,2 pm y se analizaron por el método de cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) con la columna Agilent Elicpse Plus RP18; la fase móvil fue THF:agua (80:20), el volumen de inyección fue de 10 pl y la temperatura de la columna se mantuvo a 20 °C. El análisis se realizó a un caudal de 0,2 ml/min con un detector UV a 280 nm. La eficacia de encapsulación de la piracloestrobina en las nanopartículas se determinó como la relación de masas de la cantidad atrapada en las nanopartículas respecto a la cantidad teórica de piracloestrobina usada en la preparación.

Ejemplo de preparación 1: Síntesis de lignina metacrilada

Se disolvieron 2 g de lignina (10 mmol) en 60 ml de LiCl/dimetilformamida (DMF) a 90 °C bajo argón. Después de la disolución completa, se añadió 1 ml de trietilamina (10 mmol) a la solución de lignina y se agitó durante 15 min a 50 °C. A continuación, se inyectaron progresivamente 3 ml de anhídrido metacrílico (20 mmol) en el matraz de reacción.

La reacción se mantuvo a 50 °C durante la noche. La mezcla de reacción se precipitó en alcohol isopropílico y se aisló por centrifugación a 3000 rpm. El producto se disolvió repetidamente en cloroformo y se precipitó en alcohol isopropílico tres veces. A continuación, el producto se secó a temperatura ambiente en una estufa de vacío. El rendimiento fue de aproximadamente el 80%. La espectroscopia de ¹H-RMN demostró el éxito de la unión de la fracción de metacrilato a la lignina: -CH³.2,05-1,7 ppm; CH=CH², 6,2-5,4 ppm.

La síntesis de la lignina metacrilada se muestra en la Figura 3. Se obtuvo un rendimiento de alrededor del 50 % de la reacción. Se forma un enlace éster cuando los grupos hidroxilo de la lignina atacan al carbono carbonilo del anhídrido metacrílico. Los enlaces éster se confirmaron por la presencia de un éster FT-IR en 1710cm'1 (-C=O) en la Figura 5. Asimismo, la banda ancha del grupo hidroxilo (-OH) en 3000-3800 cirr¹se redujo significativamente, un indicio de que se han convertido grandes cantidades del grupo hidroxilo de la lignina. Los grupos vinilo del metacrilato unidos a la lignina también se confirmaron mediante el espectro ¹H-RMN de la Figura ⁶. Hay dos picos distintivos de dos átomos de hidrógeno adyacentes al doble enlace del grupo vinilo a 5,88 y 6,22 ppm que no aparecían en el espectro ¹H-RMN de la lignina antes de la esterificación. Asimismo, se sabe que la ¹H-RMN puede usarse para una cuantificación de los grupos funcionales en la lignina mediante una integración de un pico característico. Para obtener el grado de sustitución, se dividió una integración del hidrógeno de la región del doble enlace (5,5-6,5 ppm) por una integración de los picos del hidroxilo fenólico (8-10 ppm). La reacción de esterificación funcionó muy bien. Dado que la relación molar de los grupos hidroxilos de la lignina respecto al anhídrido metacrílico era de 1:2, se obtuvo más de 0,9 grados de sustitución en la reacción de esterificación.

Los resultados obtenidos del análisis térmico para observar la estabilidad térmica se muestran en la Fig. 7. La medición de la degradación térmica (pérdida de peso de la lignina y de la lignina metacrilada en relación con la temperatura de degradación térmica) presentó una temperatura de fusión entre 200-400 °C. Sin embargo, la descomposición de la lignina metacrilada se produce a temperaturas más altas en comparación con la lignina no modificada, lo que se ha constatado en el termograma de la lignina metacrilada. Por lo general, la lignina se descompone térmicamente en un amplio intervalo de temperaturas, como se ha observado, puesto que partes de su estructura tienen diferentes estabilidades térmicas, es decir, su escisión se produce a diferentes temperaturas. Se observó un pequeño aumento de la temperatura de transición vítrea (Tg) tras la esterificación de la lignina con el metacrilato en la medición de calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 82 a 100 °C.

Ejemplo de trabajo 1: Preparación de partículas de lignina reticulada

Se disolvieron 100 mg (1,1 mmol de PPU) de lignina metacrilada en 2,5 g de cloroformo (CHCh). Esta solución se añadió a 10 g de agua que contenía 20 mg de tensioactivo (SDS) a temperatura ambiente y se agitó a 1000 rpm durante 1 h con el fin de formar una preemulsión. A continuación, la emulsión se trató con ultrasonidos durante 3 minutos (punta de sonicación de 1,27 cm (1/2 pulgada), 70 % de amplitud. 20 s de ultrasonidos seguido de 10 s de pausas) usando un sonificador Branson W-450-Digital bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente. Tras el proceso de sonicación, se añadió a la emulsión una solución de moléculas de diamina (2-2'(etilendioxi)bis(etilamina)) en agua (relación molar 1:1 respecto a la lignina metacrilada). La reacción se llevó a cabo durante la noche a 50 °C. El disolvente se evaporó de la miniemulsión por agitación durante la noche a temperatura ambiente. El volumen final de la dispersión se completó con 10 ml añadiendo agua. Las partículas obtenidas se caracterizaron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés). Para estudiar la eficiencia de injerto de la adición de Michael entre la lignina metacrilada y la diamina, las partículas obtenidas se lavaron con agua y cloroformo y luego se secaron durante la noche en un horno de vacío. Para la encapsulación de la piracloestrobina (fungicida), se añadieron 5 mg de piracloestrobina a la fase dispersa antes de su mezcla con la fase acuosa. Los procedimientos para formar partículas de lignina se muestran en la Figura 4.

Ejemplo de prueba 1: Prueba antifúngica (prueba en laboratorio y/o en campo)

Prueba in vitro en placas de 96 pocillos:

Las soluciones de partículas de lignina se pipetearon en varias concentraciones (1, 5 y 10 pg/ml) en los 96 pocillos. Se analizaron varias nanopartículas diferentes (véanse las figuras 10 y 12). Posteriormente, se añadió una suspensión de esporas (en medio mínimo) de hongos asociados con Esca, cada hongo por separado en tres pocillos, a la solución de partículas de lignina. El volumen final fue de 200 pl por pocillo y 500 esporas en esos 200 pl (significa 2.500 esporas/ml). La placa de 96 pocillos se incubó a 26 °C durante 48 h en un agitador con 120 rpm. La densidad óptica se determinó después de 24 y 48 h usando un lector de placas de laboratorio (BioRad) a una longitud de onda de 600 nm.

Los controles fueron partículas de lignina vacías, así como estrobilurina y glufosinato de amonio (1,5 y 10 pg/ml). También se midió la densidad óptica del medio sin esporas.

Los resultados de tres réplicas se combinaron después para calcular el valor promedio de todas las muestras (véase también la desviación típica en la Figura 10).

Ensayo de campo in vivo:

Para los ensayos de campo in vivo, se eligieron dos preparaciones de partículas de lignina (n.° 78 y 80, véase la Tabla 1). Los dos controles fueron la piracloestrobina pura y las nanopartículas de lignina vacías. La inyección se efectuó en plantas que mostraban una fase temprana de infección a mediados de junio. Todos los tratamientos se prepararon en cuatro plantas elegidas al azar en el viñedo. La inyección se realizó como se ha descrito anteriormente. Y las plantas fueron controladas semanalmente desde julio hasta octubre, cuando comenzó la coloración otoñal de las hojas. En 2015 se realizó un segundo tratamiento, comenzando a finales de julio.

Ejemplo de trabajo 2: Preparación de partículas de lignina en un proceso de miniemulsión

La lignina metacrilada se disolvió junto con un ultrahidrófobo (p. ej., hexadecano o un aceite vegetal) en cloroformo para generar la fase dispersa (para partículas huecas lignina:ultrahidrófobo = 75% en peso:25 % en peso, para nanopartículas de lignina sólidas: ultrahidrófobo = 97,5 % en peso:2,5 % en peso, para partículas porosas: sin ultrahidrófobo). Se añadieron 5 mg de piracloestrobina a la fase dispersa, que luego se mezcló con la fase acuosa que contenía el tensioactivo. Se puede usar ya sea un tensioactivo iónico, tal como dodecilsulfato de sodio (tensioactivo aniónico), o no iónico (para partículas porosas, se usa un tensioactivo no iónico), tal como Lutensol AT25 (tensioactivo no iónico). La preemulsión se agitó a temperatura ambiente y posteriormente se sometió a ultrasonidos con el fin de generar una miniemulsión estable. La reacción de adición de Michael se inició por calentamiento después de añadir una solución de la diamina a la miniemulsión previamente formada.

Como agente de reticulación se seleccionan las diaminas que son solubles tanto en fase acuosa como en cloroformo. Se investigaron dos posibles rutas de reticulación de las partículas de lignina añadiendo las moléculas de diamina a la fase dispersa antes o después de la ultrasonicación. Se comprobó que la adición de moléculas de diamina a la fase acuosa después de la formación de la gota, antes de calentar la emulsión, proporcionaba la mayor estabilidad de la emulsión.

La lignina fue reticulada por moléculas de diamina que se dispersaron desde la fase acuosa a la gota de lignina metacrilada y reaccionaron con los dobles enlaces de la lignina metacrilada. Después de 5 h de reacción, la emulsión se mantuvo abierta a temperatura ambiente durante toda la noche con el fin de asegurar la evaporación completa del cloroformo, dejando la dispersión acuosa de los nanoportadores de lignina.

Las condiciones de la miniemulsión y algunos resultados de los datos se resumen en la Tabla 1. Los diámetros de las partículas de lignina promedio en número estaban en el intervalo de 100-600 nm por DLS. También se usó TEM para investigar la morfología de las partículas de lignina cargadas con fungicida, como se muestra en la Figura 8. Las imágenes de TEM mostraron partículas individuales con una forma esférica bien definida con un tamaño de 80-200 nm. El diámetro de las partículas de lignina determinado por TEM fue generalmente menor que el obtenido por DLS. La razón es que el diámetro de la partícula de DLS se relaciona con la partícula rodeada de moléculas de agua, mientras que el de TEM se refiere al estado en seco de las partículas.

Tabla 1

Muestra ^{Relación en masa}

_{fungicida: lignina}Tensioactivo Diámetro (nm) PDI % de % de LC EE

2A - SDS 1 mg/ml 266 0,346 - -2B 1:20 SDS 1 mg/ml 314 0,217 3,9 94,0 2C 1:10 SDS 1 mg/ml 334 0,378 8,6 94,1 2D 1:5 SDS 1 mg/ml 310 0,422 15,1 97,9 2E 1:20 SDS 0,5 mg/ml 511 0,408 4,5 98,7 2F 1:20 SDS 2 mg/ml 220 0,354 2,1 64,0 2G 1:20 Lutensol 1 mg/ml 641 0,289 4,5 99,7 2H 1:20 Lecitina 1 mg/ml 645 0,389 3,5 98,1

Efecto del fungicida en la lignina sobre el contenido de carga de la distribución de tamaño y eficiencia de encapsulación (diámetro determinado por dispersión dinámica de la luz (DLS), PDI = polidispersidad de DLS, eficiencia de encapsulación (EE) y contenido de carga (LC)).

La eficiencia de encapsulación (EE) y el contenido de carga (LC) de la piracloestrobina en las nanopartículas se determinaron de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

peso de la piracloestrobina en las partículas

LC (%o) = peso de las partículas X 100

peso de la piracloestrobina en las partículas

EE(%) = - ------------- . . . . -----:-----j-------------------------X 100

peso inicial de piracloestrobina

Ejemplo de prueba 2: Prueba antifúngica (prueba en laboratorio y/o en campo)

Prueba in vitro en placas de 96 pocilios:

Los datos generados muestran la densidad óptica medida a 600 nm. El resumen de los datos mostrados a continuación se presenta también en la figura 10. Los números 1 a 10 y las letras A a H son el etiquetado de la placa de 96 pocillos, así como la rejilla del sistema de prueba. Los números 66 a 84 se explican como las soluciones de partículas de lignina analizadas, difieren en su composición y en la concentración de fungicida (véase también la Tabla 2). La densidad óptica es proporcional a la actividad del fungicida. Dado que las esporas de los hongos solo germinan sin ninguna actividad fungicida, la densidad óptica aumenta en los pocillos libres de fungicida o con una formulación inactiva de las partículas de lignina. Por lo tanto, los valores más altos de la densidad óptica significan más esporulación y crecimiento de hongos y menos actividad biológica de la formulación de lignina (p. ej., en A1, A2). Una densidad óptica baja es característica de una alta toxicidad y bioactividad fúngica (véase en A5 y A6).

Tabla 2

Vacío SDS Lutensol

66 72 77 78 79 80 81 82 83 84

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A 1,151 1,232 0,281 0,276 0,282 0,253 0,431 0,388 0,595 0,404 Pal B 1,232 1,152 0,313 0,308 0,308 0,257 0,471 0,441 0,780 0,445 Pal C 1,163 1,041 0,237 0,265 0,301 0,203 0,225 0,198 0,418 0,245 Pch D 1,305 0,839 0,275 0,266 0,317 0,214 0,312 0,224 0,441 0,290 Pch E 0,707 0,853 0,192 0,180 0,200 Pch

F 0,670 0,930

0,220 0,212

0,206

Pal

G 0035 0034 Fondo Medio

G 0,035 0,035 Fondo Medio

H 0,037 0,037 0,036

control neg. (DMSO, 5 j l)

control pos. (glufosinato de amonio, 50 jg )

Pal Phaeoacremonium aleophilum

Pch Phaeomoniella chlamydospora

Ensayo de campo in vivo:

Los resultados del ensayo de campo son hasta ahora solo preliminares. Por lo tanto, solo se muestra una visión general del tratamiento (Figura 11).

Ejemplo de trabajo 3: Preparación de partículas de lignina reticulada que incluyen un ingrediente activo UV

Las partículas de lignina reticulada se prepararon de acuerdo con el Ejemplo de trabajo 1, excepto que se añadieron 10 mg de 2-propilpiridina a la fase oleosa antes de añadir el agua.

Ejemplo de prueba 3: Estudio de liberación

En el estudio de liberación, se emplearon las partículas de lignina reticulada del Ejemplo de trabajo 3. Se usó 2-propilpiridina como ingrediente activo UV, ya que es soluble en la fase oleosa y también parcialmente soluble en la fase acuosa. La fuerza motriz de la liberación corresponde al coeficiente de reparto aceite/agua, que es de 86,3 en el caso de la 2-propilpiridina. Se añadieron 3 ml de la emulsión (con un contenido sólido del 1 % en peso) a un tubo de diálisis y se sumergieron en 197 ml de agua destilada. La 2-propilpiridina tiene un elevado coeficiente de extinción molar UV-visible a 260 nm. Por tanto, el perfil de liberación de la 2-propilpiridina puede determinarse midiendo la absorbancia del medio de liberación, a 260 nm, en función del tiempo. Se tomaron 5 ml de medio de liberación (agua destilada) a diferentes intervalos de tiempo para determinar la concentración de 2-propilpiridina liberada mediante espectroscopia UV-visible. Este perfil de liberación se define como la masa de 2-propilpiridina liberada de la suspensión de la cápsula dividida por la masa de 2-propilpiridina inicialmente disuelta en la fase oleosa.

Para investigar la degradación de las nanopartículas de lignina por la lacasa, las emulsiones se incubaron con lacasa (30 mg en 3 ml de emulsión) en un tampón acetato (pH 7) a temperatura ambiente durante la noche antes de usar el método de diálisis para controlar la liberación de 2-propilpiridina del tubo de diálisis con el tiempo tras el contacto con la lacasa. Los resultados se muestran en la Figura 9.

Ejemplo de trabajo 4: Preparación de partículas de lignina reticulada que incluyen piracloestrobina

Las partículas de lignina reticulada se prepararon de acuerdo con el Ejemplo de trabajo 1, excepto que se añadieron 10 mg de piracloestrobina a la fase oleosa antes de añadir el agua.

Ejemplo de prueba 4: Estudio de estabilidad a largo plazo

En el estudio de estabilidad a largo plazo, se emplearon las partículas de lignina reticulada del Ejemplo de trabajo 2 (1:10, estabilizadas con SDS). Para investigar la densidad y la degradación enzimática de los nanoportadores de lignina por la lacasa, se encapsuló la piracloestrobina (fungicida) en nanopartículas de lignina (10 % en peso, como se informó en el Ejemplo de trabajo 4). Se almacenaron 2x 1 ml de dispersión (contenido sólido 1 % en peso) a 25 °C durante un periodo de 30 días. Una de las dispersiones se separó por centrifugación a 10.000 rpm durante 60 min y el sobrenadante se analizó por cromatografía líquida de alta presión para determinar la concentración de piracloestrobina. La segunda dispersión se incubó con 1 ml de lacasa en un tampón acetato de pH 7 (10 mg/ml) a temperatura ambiente durante la noche antes de usar la centrifugación a 10.000 rpm durante 60 min. Después se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de piracloestrobina por HpLC. Los resultados se muestran en la Fig. 15. Estos experimentos muestran el potencial de liberación enzimática de las nanopartículas de lignina preparadas de acuerdo con la presente invención y demuestran además la estanqueidad a largo plazo en ausencia de la enzima. El Ejemplo de trabajo 3 y el Ejemplo de prueba 3 muestran además la cinética de la liberación de un ingrediente activo UV (2-propilpiridina).

Ejemplo de trabajo 5: Preparación de partículas de lignina reticulada por adición de Michael

La formación de nanoportadores de lignina se llevó a cabo mediante una polimerización combinada por miniemulsión con la posterior evaporación del disolvente. El procedimiento típico es el siguiente: La lignina metacrilada (75 mg, 4,8 |jmol, 1 mmol de acrilatos) incluyendo el hidrófobo (25 mg) (hexadecano, o aceite de oliva) y la diamina (1 mmol de aminas) se disolvieron y mezclaron en 0,6 ml de cloroformo. Esta solución se añadió a una solución acuosa (10 ml) del tensioactivo (1 % en peso de solución de SDS) a temperatura ambiente y se agitó a 1000 rpm durante 30 minutos para formar una preemulsión. A continuación, la emulsión se trató con ultrasonidos durante 3 min (punta de 1,27 cm (1/2 pulgada), 70 % de amplitud, 20 s de ultrasonidos seguido de 10 s de pausas) bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente y el inicio de la polimerización debido al calentamiento. Después de la formación de la miniemulsión estable, la polimerización por reticulación se llevó a cabo durante 5 horas a 60 °C y con agitación suave. Después de la polimerización, el disolvente se evaporó de la miniemulsión con agitación en un recipiente abierto durante toda la noche a temperatura ambiente (aprox. 21 °C). El volumen final de las dispersiones se ajustó a 10 ml con agua destilada (los contenidos sólidos típicos de las dispersiones eran de aprox. 10 mg/ml).

Ejemplo de trabajo 6: Preparación de partículas de lignina reticulada por polimerización por radicales

La formación de nanoportadores de lignina se llevó a cabo mediante una polimerización combinada por miniemulsión con la posterior evaporación del disolvente. El procedimiento típico es el siguiente: La lignina metacrilada (75 mg, 4,8 jmol, 1 mmol de acrilatos) incluyendo el hidrófobo (25 mg) (hexadecano, o aceite de oliva) y el iniciador (20 mg de AIBN) se disolvieron y mezclaron en 0,6 ml de cloroformo. Esta solución se añadió a una solución acuosa (10 ml) del tensioactivo (1 % en peso de solución de SDS) a temperatura ambiente y se agitó a 1000 rpm durante 30 minutos para formar una preemulsión. A continuación, la emulsión se trató con ultrasonidos durante 3 min (punta de 1,27 cm (1/2 pulgada), 70 % de amplitud, 20 s de ultrasonidos seguido de 10 s de pausas) bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente y el inicio de la polimerización debido al calentamiento. Después de la formación de la miniemulsión estable, la polimerización por reticulación se llevó a cabo durante 5 horas a 60 °C y con agitación suave. Después de la polimerización, el disolvente se evaporó de la miniemulsión con agitación en un recipiente abierto durante toda la noche a temperatura ambiente (aprox. 21 °C). El volumen final de las dispersiones se ajustó a 10 ml con agua destilada (los contenidos sólidos típicos de las dispersiones eran de aprox. 10 mg/ml).

Ejemplo de trabajo 7: Preparación de partículas de lignina reticulada por metátesis de olefinas

El procedimiento típico es el siguiente: La lignina metacrilada (75 mg, 4,8 jmol, 1 mmol de acrilatos) incluyendo el hidrófobo (25 mg) (hexadecano, o aceite de oliva) y la diolefina (1 mmol de olefina) se disolvieron y mezclaron en 0,6 ml de cloroformo. Esta solución se añadió a una solución acuosa (10 ml) del tensioactivo (1 % en peso de solución de SDS) a temperatura ambiente y se agitó a 1000 rpm durante 30 minutos para formar una preemulsión. A continuación, la emulsión se trató con ultrasonidos durante 3 min (punta de 1,27 cm (1/2 pulgada), 70% de amplitud. 20 s de ultrasonidos seguido de 10 s de pausas) bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente y el inicio de la polimerización debido al calentamiento. Después de la formación de la miniemulsión estable, la polimerización por reticulación se inició mediante la adición del catalizador Grubbs-Hoveyda de 2a generación (5 mg) disuelto en tolueno y transferido gota a gota a la miniemulsión. La temperatura se elevó a 40 °C y se dejó que la reacción se desarrollara durante toda la noche. Después de la polimerización, el disolvente se evaporó de la miniemulsión con agitación en un recipiente abierto durante toda la noche a temperatura ambiente (aprox. 21 °C). El volumen final de las dispersiones se ajustó a 10 ml con agua destilada (los contenidos sólidos típicos de las dispersiones eran de aprox. 10 mg/ml).

Ejemplo de trabajo 8: Preparación de partículas de lignina reticulada mediante azida-alquino-cicloadición

El procedimiento típico es el siguiente: la lignina modificada (75 mg, 4,8 pmol, 1 mmol de alquinos) incluyendo el hidrófobo (25 mg) (hexadecano, o aceite de oliva) y la diazida (1 mmol de azidas) se disolvieron y mezclaron en 0,6 ml de cloroformo. Esta solución se añadió a una solución acuosa (10 ml) del tensioactivo (1 % en peso de solución de SDS) a temperatura ambiente y se agitó a 1000 rpm durante 30 minutos para formar una preemulsión. A continuación, la emulsión se trató con ultrasonidos durante 3 min (punta de 1,27 cm (1/2 pulgada), 70% de amplitud, 20 s de ultrasonidos seguido de 10 s de pausas) bajo enfriamiento con hielo con el fin de evitar la evaporación del disolvente y el inicio de la polimerización debido al calentamiento. Después de la formación de la miniemulsión estable, la polimerización por reticulación se inició mediante la adición del catalizador (5 mg) disuelto en tolueno y transferido gota a gota a la miniemulsión. La temperatura se elevó a 50 °C y se dejó que la reacción se desarrollara durante toda la noche. Después de la polimerización, el disolvente se evaporó de la miniemulsión con agitación en un recipiente abierto durante toda la noche a temperatura ambiente (aprox. 21 °C). El volumen final de las dispersiones se ajustó a 10 ml con agua destilada (los contenidos sólidos típicos de las dispersiones eran de aprox. 10 mg/ml).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Nanopartículas de lignina que comprenden lignina reticulada y un agente activo hidrófobo contra las infecciones de las plantas, en donde las nanopartículas de lignina se pueden obtener mediante un proceso que comprende las siguientes etapas:

(i) disolver la lignina modificada y un agente activo hidrófobo en un disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua que no es superior a 100 g/l;

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

(iv) reticular la lignina modificada para formar nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo, en donde la lignina modificada es una lignina que está modificada químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales adecuados para una polimerización y/o una reticulación seleccionados del grupo que consiste en dobles enlaces terminales, grupos epoxi, grupos alquinilo, grupos aldehído, grupos ceto, y grupos silano, en donde el agente activo hidrófobo tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/l.

2. Las nanopartículas de lignina de la reivindicación 1, en donde las nanopartículas de lignina no son huecas.

3. Las nanopartículas de lignina de las reivindicaciones 1 o 2 que tienen un diámetro promedio en número de 50 nm a 1 |jm, según se determina por DLS.

4. Proceso para la producción de las nanopartículas de lignina de la reivindicación 1,

comprendiendo el proceso las siguientes etapas:

(iii) formar una emulsión a partir de la preemulsión; y

(iv) reticular la lignina modificada para formar nanopartículas de lignina que comprenden el agente activo hidrófobo, en donde la lignina modificada es una lignina que está modificada químicamente para comprender al menos dos grupos funcionales adecuados para una polimerización y/o una reticulación.

5. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el proceso de la reivindicación 4, que incluye, después de la etapa de reticulación (iv), una etapa (v):

(v) evaporar el disolvente orgánico.

6. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 o el proceso de las reivindicaciones 4 o 5, en donde los grupos funcionales son grupos metacrilato.

7. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 o 6 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua que no es superior a 100 g/l, y se selecciona de disolventes de hidrocarburo, hidrocarburos halogenados, alcoholes y compuestos orgánicos que tienen un grupo nitro.

8. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 7 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el agente activo hidrófobo es un plaguicida.

9. Las nanopartículas de lignina o el proceso de la reivindicación 8, en donde el agente activo hidrófobo es un fungicida o un bactericida.

10. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 9 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el disolvente orgánico que tiene baja solubilidad en agua empleado en la etapa (i) comprende un agente de presión osmótica.

11. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 10 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde la lignina modificada es una lignina que tiene dobles enlaces terminales, y la reticulación en la etapa (iv) se realiza:

(1) añadiendo un compuesto de amina, que tiene al menos dos grupos amino y/o un compuesto de tiol que tiene al menos dos grupos tiol, a la emulsión obtenida en la etapa (iii) y realizando una adición de Michael;

(2) realizando una polimerización por radicales; o

12. Las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 11 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde la lignina (met)acrilada se obtiene por uno de los siguientes métodos:

(a) hacer reaccionar los grupos OH de la lignina con anhídrido (met)acrílico;

13. Dispersión acuosa que contiene las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 12.

14. Uso de las nanopartículas de lignina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 12 o la dispersión acuosa de la reivindicación 12 para el tratamiento de las plantas contra una infección fúngica o bacteriana, en donde el agente activo hidrófobo es un fungicida o un bactericida, respectivamente.

15. Método de tratamiento de una planta contra una infección fúngica o bacteriana por inyección de la dispersión acuosa de la reivindicación 13 en el tallo de la planta, en donde el agente activo hidrófobo es un fungicida o un bactericida, respectivamente.