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ES2917573T3 - Método de producción de moléculas fotosensibles - Google Patents

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ES2917573T3
ES2917573T3 ES19156541T ES19156541T ES2917573T3 ES 2917573 T3 ES2917573 T3 ES 2917573T3 ES 19156541 T ES19156541 T ES 19156541T ES 19156541 T ES19156541 T ES 19156541T ES 2917573 T3 ES2917573 T3 ES 2917573T3
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ES
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virus
capsid proteins
molecules
photosensitive
tumor
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ES19156541T
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English (en)
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Los Pinos Elisabet De
John Schiller
Rhonda C Kines
John Macdougall
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Aura Biosciences Inc
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
Aura Biosciences Inc
US Department of Health and Human Services
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Abstract

La presente divulgación se dirige a métodos y composiciones para el diagnóstico y/o tratamiento de tumores, como tumores oculares, utilizando partículas similares a virus conjugadas con moléculas fotosensibles. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de producción de moléculas fotosensibles
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere al campo de diagnósticos y terapéuticos de tumores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Aunque están disponibles muchos tratamientos para el cáncer, muchas formas de cáncer siguen siendo incurables, intratables, o se han hecho resistentes a las terapias habituales, y los tratamientos eficaces para muchos cánceres tienen efectos secundarios no deseables. Los cánceres oculares, como el melanoma ocular y el retinoblastoma, son particularmente difíciles de tratar. Un paciente con diagnóstico de melanoma ocular, dependiendo del tamaño del tumor, tiene pocas opciones de tratamiento, que incluyen: (1) procedimientos quirúrgicos, tales como resección, enucleación o exenteración, todos los cuales son muy invasivos e implican principalmente la extirpación del ojo y parte del nervio óptico (después de la cirugía, normalmente se le adapta un ojo artificial al paciente); y (2) braquiterapia de placa, un tipo de radioterapia, en donde una pieza delgada de metal (por ejemplo, oro) con semillas radioactivas que cubren un lado, se siembran en la pared externa del ojo, con las semillas apuntando al tumor. La pieza delgada de metal se retira al final del tratamiento, que normalmente dura varios días. Las complicaciones graves relacionadas con la terapia radiactiva incluyen: formación de cataratas, que es la más común, seguida por hemorragia vítrea. Otras complicaciones incluyen ojo seco, queratitis, neovascularización del iris inducida por radiación, glaucoma neovascular, retinopatía inducida por radiación, neuropatía óptica inducida por radiación, depósitos episclerales, necrosis escleral y/o alteraciones del músculo extraocular. Se ha informado que ocurre retinopatía por radiación en el 10-63 % de los pacientes tratados con braquiterapia de placa, y el tiempo medio desde el tratamiento hasta el desarrollo de la maculopatía es de aproximadamente 25,6 meses.
El documento de patente WO2008140961 desveló una partícula similar a virus (VLP) que se dirige a tumor conjugada químicamente con colorantes fluorescentes, tales como GFP, luciferasa o Alexa Fluor 488, así como 'pseudovirus del VPH que expresan oligo T para citotoxicidad e inmunidad combinadas' y además propusieron 'VLP del papiloma acoplado con un radionucleótido' para usos terapéuticos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención desvela métodos de producción de partículas similares a virus que se dirigen a tumor como se define por las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación proporciona, al menos en parte, métodos y composiciones para la detección y/o el direccionamiento selectivo a células tumorales, por ejemplo, para el diagnóstico y/o el tratamiento de cáncer (por ejemplo, cáncer ocular). En algunos casos, los métodos y las composiciones proporcionados en el presente documento se pueden usar para destruir selectivamente las células tumorales cancerosas sin dañar las células sanas. Por ejemplo, las nanopartículas similares a virus que comprenden (por ejemplo, se conjugan con) moléculas fotosensibles pueden ser selectivamente suministradas a células tumorales y fotoactivadas por exposición a luz. Cuando se fotoactivan, una molécula fotosensible absorbe fotones, y esa energía absorbida produce cambios moleculares que causan la toxicidad (por ejemplo, toxicidad celular). Una ''nanopartícula similar a virus fotosensible" (también denominada en el presente documento una "partícula similar a virus fotosensible") se refiere a una nanopartícula similar a virus conjugada con una molécula fotosensible. Sorprendentemente, la conjugación de moléculas fotosensibles con nanopartículas similares a virus no interfiere con el tropismo tejido/tumor de las nanopartículas (por ejemplo, la especificidad de las nanopartículas similares a virus para un tejido tumoral o célula tumoral hospedadora particular).
En general, las nanopartículas similares a virus (también denominadas partículas similares a virus (VLP)) de la presente divulgación se ensamblan a partir de proteínas de la cápside L1, o una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2, y las moléculas fotosensibles, en algunas realizaciones, se conjugan con una proteína de la cápside que forma la nanopartícula similar a virus. Por lo tanto, diversos aspectos de la divulgación proporcionan nanopartículas similares a virus que se dirigen a tumor que comprenden moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside.
Algunos aspectos de la divulgación también proporcionan partículas similares a virus que se dirigen a tumor que comprenden aproximadamente 50 a aproximadamente 500, aproximadamente 50 a aproximadamente 600, aproximadamente 50 a aproximadamente 700, aproximadamente 50 a aproximadamente 800, aproximadamente 50 a aproximadamente 900, o aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles por partícula. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus que se dirigen a tumor comprenden aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900 o aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles por partícula. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus que se dirigen a tumor comprenden 500 moléculas fotosensibles o 1000 moléculas fotosensibles por partícula.
En la invención, las proteínas de la cápside son proteínas de la cápside del virus del papiloma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano, tales como proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano y no reaccionan de forma cruzada con el virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH 18 o anticuerpos preexistentes específicos para el VPH.
En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas L1 o L1/L2 del papiloma (por ejemplo, de especies humana, bovina, u otras especies). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las VLP de L1 o L1/L2 no reaccionan de forma cruzada con anticuerpos neutralizantes contra el virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH 18, o anticuerpos preexistentes específicos para otros VPH. Sin embargo, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano de VPH16.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con péptidos expuestos en la superficie de proteínas de la cápside.
En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside L1 o una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus consisten en proteínas de la cápside L1.
En algunas realizaciones, una partícula similar a virus comprende la proteína de la cápside del VPB L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y L2 del VPB. En algunas realizaciones, una partícula similar a virus comprende proteínas de la cápside L1 del VPH, o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPH y L2 del VPH. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside L1 del VPH es una proteína L1 del VPH16/31 de variante que tiene inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, en algunas realizaciones, una partícula similar a virus comprende o consiste en variante proteínas de la cápside L1 del VPH 16/31 o una combinación de variante proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) y proteínas de la cápside L2 del VPH.
En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside de una partícula similar a virus tienen inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas. Un ejemplo no limitante de dicha proteína de la cápside es las proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Las partículas similares a virus que contienen proteínas de la cápside modificadas se pueden denominar en el presente documento partículas similares a virus que contienen inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas en comparación con las partículas similares a virus naturales.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con un aminoácido de las proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con un grupo amina (por ejemplo, amina alifática primaria) de un aminoácido de las proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con grupos amina de restos de lisina (por ejemplo, amina de cadena lateral de lisina) de las proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con grupos amina de arginina y/o restos de histidina de las proteínas de la cápside. La presente divulgación proporciona métodos de conjugación de moléculas fotosensibles a la lisina y otros aminoácidos que contienen grupos amina.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles no comprometen (por ejemplo, previenen, interfieren con ni inhiben) la unión de la partícula similar a virus con la superficie de células tumorales. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles no comprometen (por ejemplo, previenen, interfieren con ni inhiben) la unión de la partícula similar a virus con proteoglicanos de sulfato de heparano u otros polisacáridos en la superficie de células tumorales.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus comprenden aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En la invención, las partículas similares a virus comprenden aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden aproximadamente 100 a aproximadamente 500 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las partículas similares a virus comprenden aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. La partícula similar a virus puede comprender más de 1000 moléculas fotosensibles en los ejemplos no citados en las reivindicaciones.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus comprenden aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles que se conjugan con restos de lisina u otros restos de aminoácidos de proteínas de la cápside L1, proteínas de la cápside L2, o una combinación de proteínas de la cápside L1 y proteínas de la cápside L2.
En la invención, las moléculas fotosensibles se activan por luz de infrarrojos, infrarrojos cercano o ultravioleta. Se considera que una molécula fotosensible se "activa" cuando la molécula absorbe fotones, y esa energía absorbida produce cambios moleculares que causan la toxicidad, como se describe en cualquier parte en el presente documento.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles comprenden un colorante de infrarrojos cercano, un colorante fluorescente y en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, un colorante de infrarrojos, una molécula de porfirina, una molécula de clorofila, o una combinación de cualesquiera dos o más de las anteriores. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles son moléculas de porfirina. Los ejemplos de moléculas de porfirina para su uso según la presente divulgación incluyen, sin limitación, HpD (derivado de hematoporfirina), basado en HpD, BPD (derivado de benzoporfirina), ALA (ácido 5-aminolevulínico) y texafirinas. En algunas realizaciones, la molécula de porfirina es verteporfina (Visudyne®).
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles son moléculas de clorofila.
Los ejemplos de moléculas de clorofila para su uso según la presente divulgación incluyen, sin limitación, clorinas, purpurinas y bacterioclorinas.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles son colorantes. Los ejemplos de colorantes para su uso según la presente divulgación incluyen, sin limitación, ftalocianina y naftalocianina.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es tanto una molécula fluorescente como molécula de infrarrojos cercano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es el colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX, LI-COR®). Un colorante IR700 es un colorante fluorescente que tiene longitudes de onda de absorción y emisión en el espectro de infrarrojos cercano (NIR), normalmente entre 680 nm y 800 nm. Otros colorantes fluorescentes que tienen una longitudes de onda de absorción y emisión en el espectro de NIR se proporcionan en el presente documento.
En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se seleccionan de colorantes de ftalocianina (por ejemplo, el colorante IR700 tal como IRDye® 700DX), y en los ejemplos no citados en las reivindicaciones, moléculas de porfirina (por ejemplo, verteporfina, tal como Visudyne®) y una combinación de colorantes de ftalocianina y moléculas de porfirina.
La divulgación proporciona métodos que comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una cualquiera de las partículas similares a virus, o partículas similares a virus fotosensibles, proporcionadas en el presente documento. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles de una partícula similar a virus a una longitud de onda de luz que permita la visualización de las moléculas sensibles a la luz. Por lo tanto, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles de la presente divulgación se usan como agentes de obtención de imágenes y/o agentes de diagnóstico. En algunas realizaciones, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda de luz que hace que la molécula sea citotóxica.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda de luz que genera una transferencia de energía dentro de la célula tumoral que crea un daño directo e irreversible que conduce a necrosis. Por lo tanto, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles de la presente divulgación se usan como agentes terapéuticos y/o profilácticos.
La divulgación proporciona métodos que comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus que se dirige a tumor que comprende moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, los métodos comprenden activar moléculas fotosensibles de las partículas similares a virus a una longitud de onda que convierte las moléculas en visibles. Es decir, las moléculas fotosensibles vuelven a emitir luz tras la excitación con luz. En algunas realizaciones, los métodos comprenden activar moléculas fotosensibles a una longitud de onda que convierte las moléculas en citotóxicas, por lo que se destruyen las células del tumor. Es decir, las moléculas fotosensibles experimentan un cambio molecular tras la excitación con luz que hace que las moléculas fotosensibles se vuelvan tóxicas para las células.
La divulgación proporciona métodos que comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus que se dirige a tumor que comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 1000, aproximadamente 50 a 500, o aproximadamente 500 a 1000 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, los métodos comprenden administrar, a un sujeto que tiene un tumor, una partícula similar a virus que se dirige a tumor que comprende aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más moléculas fotosensibles. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda que convierte las moléculas en visibles. En algunas realizaciones, los métodos comprenden activar las moléculas fotosensibles a una longitud de onda que convierte las moléculas en citotóxicas, por lo que se destruyen las células del tumor.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles son activadas con láser. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el láser es un láser de infrarrojos, infrarrojos cercanos o de ultravioleta. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el láser de infrarrojos es 5 julios (1) a 100 J (o J/cm2) (por ejemplo, 5 J, 6 J, 7 J, 8 J, 9 J, 10 J, 11 J, 12 J, 13 J, 14 J, 15 J, 16 J, 17 J, 18 J, 19 J, 20 J, 21 J, 22 J, 23 J, 24 J, 25 J, 26 J, 27 J, 28 J, 29 J, 30 J, 31 J, 32 J, 33 J, 34 J, 35 J, 36 J, 37 J, 38 J, 39 J, 40 J, 41 J, 42 J, 43 J, 44 J, 45 J, 46 J, 47 J, 48 J, 49 J, 50 J, 51 J, 52 J, 53 J, 54 J, 55 J, 56 J, 57 J, 58 J, 59 J, 60 J, 61 J, 62 J, 63 J, 64 J, 65 J, 66 J, 67 J, 68 J, 69 J, 70 J, 71 J, 72 J, 73 J, 74 J, 75 J, 76 J, 77 J, 78 J, 79 J, 80 J, 81 J, 82 J, 83 J, 84 J, 85 J, 86 J, 87 J, 88 J, 89 J, 90 J, 91 J, 92 J, 93 J, 94 J, 95 J, 96 J, 97 J, 98 J, 99 J o 100 J (o J/cm2)). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el láser se aplica durante aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se activan aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas después de administrar las partículas similares a virus a un sujeto. Por ejemplo, las moléculas fotosensibles se pueden activar 30 minutos después de administrar las partículas similares a virus a un sujeto. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se activan 1 hora, 2 horas (h), 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h, 8 h, 9 h, 10 h, 11 h, 12 h, 13 h, 14 h, 15 h, 16 h, 17 h, 18 h, 19 h, 20 h, 21 h, 22 h, 23 o 24 h después de administrar la partícula similar a virus a un sujeto. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se activan 1 día, 2 días o 3 días después de administrar la partícula similar a virus a un sujeto.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es un tumor ocular o un tumor que ha metastatizado al ojo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tumor ocular se localiza en el cuerpo vítreo, el espacio coroideo, el iris, el cuerpo ciliar, la esclerótica, la fóvea, la retina, la papila óptica o el nervio óptico.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor se localiza en un pulmón, la pleura, el hígado, el páncreas, el estómago, el esófago, el colon, la mama, el ovario, la próstata, el cerebro, las meninges, el testículo, el tubo gastrointestinal, los riñones o la vejiga.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es accesible sin intervención quirúrgica.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor se localiza en la cabeza, el cuello, el cuello uterino, la laringe o la piel.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es una enfermedad huérfana o rara. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es canceroso. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es metastásico. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es precanceroso o displásico.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus se administran por inyección. Por ejemplo, las partículas similares a virus se pueden administrar por inyección intraocular, en el cuerpo vítreo, o por vía intravenosa. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus se administran con una aguja hueca o recubierta, mini-aguja o micro-aguja. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus se administran por vía tópica. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus se administran por implantación.
En la invención, las proteínas de la cápside son proteínas de la cápside del virus del papiloma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano, tales como proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino (VPB). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano y no reaccionan de forma cruzada con el virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH 18 o anticuerpos preexistentes específicos para el VPH. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las partículas similares a virus comprenden proteínas de la cápside del virus del papiloma humano tipo 16. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las VLP no se unen a anticuerpos específicos para VLP del virus del papiloma humano (VPH) 16, VPH 18, o anticuerpos preexistentes inducidos específicamente por infección por el VPH.
Algunos aspectos de la divulgación proporcionan métodos de detección, en un sujeto, de tumores (por ejemplo, tumores oculares y nevos malignos), comprendiendo los métodos administrar al sujeto (por ejemplo, al ojo del sujeto) una cualquiera de la partícula similar a virus proporcionada en el presente documento, tal como una partícula similar a virus que comprende una molécula fotosensible (por ejemplo, colorante fluorescente o colorante de infrarrojos), y detectar la localización del tumor. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, los métodos comprenden detectar la localización del tumor por iluminación del sujeto (por ejemplo, ojo del sujeto) con un láser (por ejemplo, láser de ultravioleta o de infrarrojos). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, los métodos comprenden identificar el sujeto que se sospecha que tiene un tumor antes de administrar la partícula similar a virus. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, los métodos comprenden diagnosticar y/o tratar el tumor administrando partículas similares a virus fotosensibles a un tumor del sujeto o a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un tumor.
La divulgación proporciona métodos de inhibición selectiva de la proliferación o destrucción de células cancerosas sin inhibir la proliferación o viabilidad de células no cancerosas (por ejemplo, normales, sanas), comprendiendo los métodos administrar a un tumor de un sujeto (por ejemplo, a un tumor ocular del sujeto) una cualquiera de las partículas similares a virus que se dirigen a tumor proporcionadas en el presente documento, tales como partículas similares a virus que comprenden moléculas fotosensibles (por ejemplo, colorante de infrarrojos), e irradiar las células cancerosas del tumor sometiendo el tumor a un láser de infrarrojos (por ejemplo, a una longitud de onda de aproximadamente 660 nm a 740 nm y en dosis de al menos 8 julios), eficazmente.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una nanopartícula similar a virus (también denominada una partícula similar a virus) que comprende moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas L1 del virus del papiloma (por ejemplo, proteínas L1 del virus del papiloma bovino). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las nanopartículas similares a virus tienen 20 a 60 nanómetros (por ejemplo, 10, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 nanómetros) de diámetro. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, una nanopartícula similar a virus contiene 300 a 500 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, L1 del VPB), por ejemplo 360 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, basadas en simetría icosaédrica). Se debe apreciar que en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las nanopartículas similares a virus contienen cada una aproximadamente 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, L1 del VPB). Sin embargo, en algunas realizaciones, una nanopartícula similar a virus contiene menos de 300 proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, L1 del VPB).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una nanopartícula similar a virus del virus del papiloma bovino conjugada covalentemente con 100 a 1000 moléculas fotosensibles (por ejemplo, 100, 200, 300, 400,500, 600, 700, 800, 900 o 1000 moléculas). En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside de la nanopartícula similar a virus del virus del papiloma bovino (VPB) comprenden o consisten en proteínas de la cápside L1 del VPB o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y L2 del VPB. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan con las nanopartículas similares a virus (o con proteínas de la cápside de las nanopartículas similares a virus) mediante un enlace covalente formado haciendo reaccionar un grupo éster en las moléculas fotosensibles con un grupo amina en las proteínas de la cápside, formándose así un enlace amida. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las proteínas de la cápside de nanopartículas similares a virus de la presente divulgación se conjugan con moléculas fotosensibles mediante enlaces amida.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la presente divulgación proporciona una nanopartícula similar a virus que comprende 300 a 500 proteínas de la cápside L1 del VPB y/o un diámetro de 2060 nm, al menos algunos algunas de las cuales (por ejemplo, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %) se conjugan covalentemente (por ejemplo, mediante un enlace amida) con 1 a 5 (por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5) moléculas fotosensibles (por ejemplo, colorante IR700, tal como IRDye® 700DX). La presente divulgación también proporciona métodos de producción de nanopartículas similares a virus y métodos de administración de nanopartículas similares a virus a un sujeto como un agente de diagnóstico, terapéutico o profiláctico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra un mecanismo de inducción de la muerte celular usando una partícula similar a virus (VLP) conjugada con una molécula fotosensible.
La FIG. 2 muestra una comparación de direccionamiento bivalente, por ejemplo, por un anticuerpo, y direccionamiento multivalente, por ejemplo, por una VLP.
La FIG. 3 muestra un gráfico que demuestra que la especificidad de la unión de VLP a células está mediada por interacciones de proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG) y se inhibe por heparina. Muestra además destrucción específica de células tumorales solo cuando las VLP fotosensibles están unidas a la célula y las células se sometieron a irradiación de infrarrojos.
La FIG. 4 muestra un gráfico que demuestra que la muerte celular depende de la dosis de radiación de infrarrojos y la cantidad de VLP y molécula fotosensible (por ejemplo, colorante) suministrada.
La FIG. 5 muestra un gráfico que demuestra la muerte in vitro de células de cáncer de ovario (SKOV-3) tras la irradiación con VLP (designadas PsV en la figura) conjugadas con IR700.
La FIG 6A muestra un análisis de tiempo de vuelo con ionización por electropulverización (ESI-TOF) de VLP de control. La FIG. 6B muestra un análisis de ESI-TOF de VLP (designadas PsV en la figura) conjugadas con 1000 moléculas de IR700.
Las FIG. 7A-7C muestran gráficos de la muerte celular de una estirpe celular de melanoma ocular (92.1) del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano negativo (HER2-), que compara la eficacia de agentes bivalentes (por ejemplo, anticuerpos) y agentes multivalentes (por ejemplo, VLP fotosensibles, también denominados conjugados de VLP, designados PsV en la figura).
Las FIG. 8A-8C muestran gráficos de la muerte celular de una estirpe celular de cáncer de ovario (SKOV-3) del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano positivo (HER2+) que compara la eficacia de agentes bivalentes (por ejemplo, anticuerpos) y agentes multivalentes (por ejemplo, VLP fotosensibles, también denominados conjugados de VLP, designados PsV en la figura).
La FIG. 9 muestra un gráfico que demuestra que los anticuerpos neutralizantes anti-VPH16 inducidos por la vacuna no bloquean la unión de VLP de VPBHR700 a la estirpe celular de melanoma ocular, 92.1.
La FIG. 10A muestra una estructura química de IRDye® 700DX-éster de NHS. La FIG. 10B muestra una estructura química de Visudyne® con un grupo carboxilo reactivo en círculo.
La FIG. 11 muestra un esquema de reacción que implica la unión mediada por (clorhidrato de 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDC) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) de Visudyne® y VLP. En este esquema, @ representa Visudyne® y @ representa VLP. Obsérvese que existen 2 vías hacia el producto final deseado. La presencia de sulfo-NHS tiende a estabilizar la reacción y potencia la producción del producto deseado.
La FIG. 12 muestra histogramas de muestras representativas de la unión dependiente de HSPG de nanopartículas similares a virus que contienen proteínas de la cápside del VPH16, proteínas de la cápside del VPH16/31 de variante y proteínas de la cápside del VPB1 (proteínas L1, o L1 y L2) que se unen a diversos tipos de células del cáncer.
Las FIG. 13A y 13B muestran imágenes de tejido tumoral cortado en campo brillante (FIG. 13A) y fluorescencia (FIG. 13B) de ratones de control negativos inyectados con PBS a las 12 horas, ratones inyectados con nanopartículas similares a virus fotosensibles a las 12 horas (N.° 3 y N.° 4) y ratones inyectados con nanopartículas similares a virus fotosensibles a las 24 horas (N.° 1 y N.° 2) tras la inyección.
La FIG. 14 muestra una representación cuantitativa de fluorescencia total relacionada con nanopartículas similares a virus asociadas a tumor en muestras de tumor TC-1 ex vivo cortadas 12 y 24 horas después de la inyección intravenosa de VLP (mismos tumores que la Fig. 13).
La FIG. 15 muestra un esquema del diseño experimental para el Ejemplo 14.
Las FIG. 16A y 16B muestran gráficos de porcentaje de la muerte celular después de la administración in vivo de nanopartículas similares a virus fotosensibles (designadas NP en la figura) y ajuste de la luz en células subcutáneas 92.1 de melanoma ocular (MO) (viabilidad celular medida 24 horas después del tratamiento con luz).
Las FIG. 17A-17C muestran histogramas sin procesar para datos presentados en las FIG. 16A y 16B.
La FIG. 18 (panel superior) muestra muestras de tejido obtenidas de animales inoculados por vía subcutánea con 2 x 105 células tumorales TC-1 en 100 |ul de PBS y administradas: (1) sin tratamiento, (2) 100 qg de nanopartículas similares a virus (designadas NP en la figura) ensambladas de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante, marcadas con IRDye® 700DX sin luz, (3) PBS con 50 J/cm2 de luz, (4) 200 qg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz, (5) 100 |ug de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz y (6) 50 |ug de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz. La FIG. 18 (panel inferior) muestra el porcentaje de células muertas para cada una de las seis condiciones de prueba.
La FIG. 19A muestra un esquema del experimento descrito en el Ejemplo 15. La FIG. 19B muestra un gráfico de porcentaje de supervivencia en animales inyectados con nanopartículas similares a virus (designadas nanopartículas en la figura) frente al control (con luz). La FIG. 19C muestra el volumen del tumor (panel superior), "linfocitos T CD8+ del tetrámero+ E7" y "células CD8+ secretoras de INF-gamma" en ratones individuales.
La FIG. 20 muestra un gráfico de resultados de un ensayo de potencia, que compara los efectos de nanopartículas similares a virus fotosensibles del VPB y nanopartículas similares a virus fotosensibles del VPH sobre la viabilidad celular.
La FIG. 21 muestra un gráfico de resultados de un ensayo de unión, que compara la unión de nanopartículas similares a virus fotosensibles del VPB y nanopartículas similares a virus fotosensibles del VPH a células.
La FIG. 22 muestra un gráfico de la curva de crecimiento tumoral de células de cáncer de cabeza y cuello tras el tratamiento con nanopartículas similares a virus fotosensibles (designadas PsV en la figura).
Las FIG. 23A y 23B representan ejemplos de un proceso de producción de nanopartículas similares a virus fotosensibles de la presente divulgación (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 20).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La terapia fotodinámica (TFD) es una forma de fototerapia que usa moléculas fotosensibles no tóxicas que, cuando se exponen selectivamente a la luz, se vuelven tóxicas, y se dirigen a y/o destruyen células malignas y otras células enfermas. Un reto que plantea la TFD en el tratamiento del cáncer es la administración de altas concentraciones de moléculas fotosensibles exclusivamente a células tumorales. Para conseguir la administración dirigida, se pueden usar anticuerpos, aunque están limitados por su capacidad de administración, que está en el intervalo de 2-8 moléculas fotosensibles por anticuerpo. Además, hay tumores importantes que carecen de una molécula de receptor tumoral identificado y, por lo tanto, no pueden ser la diana de un anticuerpo. Como consecuencia, múltiples tumores siguen siendo intratables (por ejemplo, melanoma ocular). Además, muchas de las moléculas (por ejemplo, EGFR) que son la diana de los conjugados de anticuerpo/colorante también se encuentran sobre la superficie de células no tumorales, lo que conduce a efectos inespecíficos no deseados.
La presente divulgación se basa, en parte, en el inesperado descubrimiento de que las partículas similares a virus (VLP) (por ejemplo, VLP del papiloma) (también denominadas en el presente documento nanopartículas similares a virus) pueden ser químicamente modificadas para llevar muchas moléculas fotosensibles (por ejemplo, IR700) sin perder su capacidad de direccionamiento de tumores o estabilidad estructural. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las VLP pueden ser químicamente modificadas para llevar más de 50 moléculas, más de 100 moléculas, o más de 1000 moléculas (o aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles). Las partículas similares a virus ensambladas de proteínas de la cápside L1, o L1 y L2, se pueden unir selectivamente a e infectar células cancerosas sin afectar a las células no cancerosas, minimizando así la citotoxicidad de los tratamientos (véase la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° US20100135902A1). Además, en algunos casos, la administración de elevadas cantidades de moléculas fotosensibles por partícula permite la destrucción selectiva de células tumorales con la radiación luminosa con cantidades extremadamente pequeñas de fármaco (por ejemplo, concentraciones picomolares).
Una unión a célula clave característica de una VLP es la presencia de un elevado número de sitios de unión a heparina sobre las proteínas de la cápside (por ejemplo, L1). Sorprendentemente, la conjugación de moléculas fotosensibles con los aminoácidos de la superficie (por ejemplo, conjugación por un enlace amida con los aminoácidos de la superficie, tales como restos de lisina, restos de arginina y restos de histidina de la superficie), no compromete la unión de la VLP a proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) sobre la superficie de células tumorales. Aunque la presente divulgación describe la conjugación de moléculas fotosensibles con péptidos expuestos en la superficie de proteínas de la cápside, se debe entender que las moléculas fotosensibles pueden ser conjugadas con cualquier péptido de proteínas de la cápside. Es decir, las moléculas fotosensibles pueden ser conjugadas con proteínas L1 solo o con una combinación de proteínas L1 y L2. La proteína y el resto de aminoácido con el que se conjuga una molécula fotosensible puede depender de la composición de la partícula similar a virus.
Los descubrimientos anteriores tienen importantes implicaciones en el desarrollo de tratamientos para el cáncer dirigidos y novedosos. Por ejemplo, las VLP fotosensibles (también denominadas conjugados de VLP) de la presente divulgación proporcionan una ventaja con respecto a otras moléculas de direccionamiento, tales como anticuerpos, que tienen una capacidad de suministro muy limitada. Además, las VLP fotosensibles de la presente divulgación son útiles para el direccionamiento de una amplia variedad de tumores que de otro modo no pueden ser elegidos como diana por anticuerpos u otras moléculas de direccionamiento (por ejemplo, tumores oculares) debido a que no se han identificado determinantes específicos de la superficie del tumor adecuados. Además, las VLP fotosensibles son útiles para tratar metástasis distantes. Además, las VLP fotosensibles son útiles para el diagnóstico y el tratamiento de lesiones malignas o precancerosas tempranas (por ejemplo, nevos oculares que se transforman, premalignos o malignos).
Una "partícula similar a virus" (VLP), como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura similar a cápside organizada (por ejemplo, de forma casi esférica o cilíndrica) que comprende matrices ordenadas autoensamblantes de capsómeros L1 o L1 y L2 y que no incluyen un genoma vírico. Las partículas similares a virus son morfológica y antigénicamente similares a viriones auténticos, pero carecen de material genético vírico (por ejemplo, ácido nucleico vírico), que hace que las partículas sean no infecciosas. Se puede usar una VLP para suministrar a una célula receptora un agente (por ejemplo, agente profiláctico, agente terapéutico o agente de diagnóstico) o una molécula de ADN o ARN circular cerrada o lineal. Se debe entender que los términos "partícula similar a virus" o "VLP" y "pseudovirus", o "PsV", se pueden usar indistintamente en el presente documento y también se pueden usar indistintamente con el término "nanopartícula similar a virus".
Una "partícula similar a virus que se dirige a tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a una VLP que se dirige a células tumorales (por ejemplo, cancerosas) sin dirigirse a células no tumorales (por ejemplo, no cancerosas, de otro modo normales, sanas) (por ejemplo, en tejido intacto).
Las VLP según la presente divulgación pueden tener una inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas con respecto a las VLP del virus del papiloma natural. Las VLP se pueden ensamblar, por ejemplo, de capsómeros que tienen una proteína de la cápside de variante con inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas. Una proteína de la cápside de variante con "inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas" es una que se modifica naturalmente o sintéticamente (por ejemplo, se muta, sustituye, deleciona, pegila o inserta) en un aminoácido para reducir o prevenir el reconocimiento de la proteína de la cápside por anticuerpos específicos de serotipo vírico (por ejemplo, endógenos) preexistentes. Una proteína de la cápside de variante puede ser una variante de L1 del virus del papiloma humano (VPH), una variante de L1 del virus del papiloma no humano, o una variante de L1 del virus del papiloma basada en una combinación de aminoácidos de diferentes serotipos de VPH. Por ejemplo, una variante de L1 con inmunogenicidad y/o antigenicidad modificadas puede ser una proteína recombinante basada en el serotipo 16 del VPH y el serotipo 31 del VPH (denominada en el presente documento una "proteína L1 del VPH 16/31 de variante" -SEQ ID NO: 1), que se describe en la publicación internacional N.° WO/2010/120266.
En algunas realizaciones, una VLP es una VLP del virus del papiloma. La VLP puede ser una VLP del virus del papiloma humano (por ejemplo, derivada de un virus que puede infectar a humanos), mientras que en otras realizaciones, la VLP es una VLP del virus del papiloma no humano. Los ejemplos de VLP no humanos incluyen los derivados de, sin limitación, partículas del virus del papiloma bovino, virus del papiloma murino, virus del papiloma del conejo cola de algodón y del virus del papiloma de macaco o macaco de la India. En algunas realizaciones, las VLP son nanopartículas del virus del papiloma bovino similares a virus (por ejemplo, nanopartículas similares a virus de tipo 1) (por ejemplo, ensambladas de proteínas de la cápside L1 del VPB o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y L2 del VPB).
Una "proteína de la cápside", como se usa en el presente documento, se refiere a un monómero de proteína, varios de los cuales forman un oligómero de capsómero. Un "capsómero", como se usa en el presente documento, se refiere a la unidad estructural oligomérica básica de una cápside vírica, que es una cubierta externa de proteína que protege el material genético de un virus, tal como, por ejemplo, el virus del papiloma humano (VPH). Las proteínas de la cápside de la presente divulgación incluyen las proteínas mayores de la cápside L1 del virus del papiloma y las proteínas menores de la cápside L2 del virus del papiloma. En algunas realizaciones, las VLP de la presente divulgación solo contienen proteínas de la cápside L1, mientras que en otras realizaciones, las VLP contienen una mezcla (o combinación) de proteínas de la cápside L1 y L2.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula similar a virus es mayor que el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en la partícula similar a virus. Por ejemplo, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula similar a virus es del 80 % al 100 % (del número total de proteínas de la cápside en la partícula similar a virus). En algunas realizaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula similar a virus es del 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en una partícula similar a virus es del 1 % al 25 % (del número total de proteínas de la cápside en la partícula similar a virus). Por ejemplo, algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en una partícula similar a virus es del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 %.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, una partícula similar a virus contiene 12 a 72 proteínas L2. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, una partícula similar a virus contiene 360 proteínas L1 y 12 a 72 proteínas L2. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las proteínas de la cápside se ensamblan en nanopartículas similares a virus que tienen un diámetro de 20 a 60 nm. Por ejemplo, las proteínas de la cápside se pueden ensamblar en nanopartículas similares a virus que tienen un diámetro de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 nm.
Una "proteína de la cápside externa", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de la cápside que se expone en la superficie de una VLP. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside externa (por ejemplo, proteínas L1) se conjugan con una (por ejemplo, al menos una) molécula fotosensible.
Una "molécula fotosensible", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula no tóxica que, cuando se expone selectivamente a la luz, se "activa" (también denominado "fotoactivada"). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, una molécula fotosensible activada vuelve a emitir luz tras la excitación de la luz (por ejemplo, un fluoróforo). En algunas realizaciones, una molécula fotosensible activada puede llegar a ser tóxica, o puede producir moléculas tóxicas, tras la excitación con luz. Por ejemplo, una clase de moléculas fotosensibles, denominadas fotosensibilizadores, se puede promover a un estado excitado tras la absorción de luz y experimentar un cruce intersistema con oxígeno para producir oxígeno singlete. Este oxígeno singlete ataca rápidamente cualquier compuesto orgánico que encuentra, por lo que es altamente citotóxico.
Según diversos aspectos de la presente divulgación, se conjugan moléculas fotosensibles con proteínas de la cápside (por ejemplo, proteínas de la cápside L1 y/o L2) de las VLP. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con proteínas de la cápside de las VLP. En algunas realizaciones, las moléculas fotosensibles se conjugan covalentemente con restos de lisina de proteínas de la cápside de las VLP. Las VLP que se conjugan con moléculas fotosensibles se pueden denominar en el presente documento "conjugados de VLP" o "VLP fotosensibles". En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles comprenden un grupo éster de NHS (N-hidroxisuccinimida) que reacciona con un grupo amina de la proteína de la cápside (por ejemplo, grupo amina de lisina u otro aminoácido) para formar un enlace amida covalente.
La relación entre molécula fotosensible (MF) y VLP puede variar. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la relación entre VLP:MF es aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000, aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:500, y en algunas realizaciones aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:500, o aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1000. Es decir, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, una VLP puede comprender aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas fotosensibles. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la relación entre VLP:MF es 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, y en algunas realizaciones, la relación de VLP:MF es 1:50, 1:75, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750,1:800. 1:850, 1:900, 1:950 o 1:1000. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las VLP pueden comprender 10, 15, 20 moléculas fotosensibles, y en algunas realizaciones, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 moléculas fotosensibles. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las VLP pueden comprender más de 1000 moléculas fotosensibles o menos de 10 moléculas fotosensibles.
Más de una molécula fotosensible puede conjugada con una única proteína de la cápside. Por ejemplo, una única proteína de la cápside (por ejemplo, proteína de la cápside L1 o L2) pueden estar conjugada con 1 a 5 (por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5) moléculas fotosensibles. Por lo tanto, más de un aminoácido de una proteína de la cápside puede estar conjugado con una molécula fotosensible. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, una única proteína de la cápside puede estar conjugada con 1 a 2, 1 a 3, o 2 a 3 moléculas fotosensibles. Por lo tanto, una molécula fotosensible puede estar conjugada con 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos diferentes (por ejemplo, lisina, arginina y/o histidina, u otro aminoácido) de una única proteína de la cápside.
Los ejemplos de moléculas fotosensibles para su uso según la presente divulgación incluyen, sin limitación, colorantes fluorescentes, colorantes de infrarrojos, colorantes de infrarrojos cercano, moléculas de porfirina y moléculas de clorofila.
Los ejemplos de colorantes fluorescentes para su uso según la presente divulgación incluyen, sin limitación, naranja de acridina, amarillo de acridina, Alexa Fluor, 7-aminoactinomicina D, ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, colorantes ATTO, tinción de auramina-rodamina, benzantrona, bimano, 9,10-bis(feniletinil)antraceno, 5,12-bis(feniletinil)naftaceno, bisbencimida, pintura de luz negra, calceína, carboxifluoresceína, éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína, éster succinimidílico de carboxifluoresceína, 1-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-difenilantraceno, coumarina, DAPI, extintor oscuro, DiOC6, DyLight Fluor, Fluo-3, Fluo-4, FluoProbes, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, cirugía guiada por fluorescencia, tinción de fluoro-jade, fura-2, éster fura-2-acetoximetílico, GelGreen, GelRed, proteína verde fluorescente, colorantes de heptametina, amarillo indio, indo-1, amarillo de Lucifer, luciferina, MCherry, merocianina, azul Nilo, rojo Nilo, blanqueante óptico, perileno, floxina, ficobilina, ficoeritrina, ficoeritrobilina, yoduro de propidio, piranina, rodamina, rodamina 123, rodamina 6G, RiboGreen, RoGFP, rubreno, (E)-estilbeno, (Z)-estilbeno, sulforodamina 101, sulforodamina B, SYBR Green I, synapto-pHluorin, tetrafenilbutadieno, tris(disulfonato de batofenantrolina)rutenio(ll) tetrasódico, Texas Red, amarillo titán, TSQ, umbeliferona, proteína amarilla fluorescente y YOYO-1.
Los ejemplos de colorantes fotosensibilizadores para su uso según la presente descripción incluyen, sin limitación, HpD, porfímero sódico (Photofrin®, Photogem®, Photosan Hemporfin®), m-THPC, temoporfina (Foscan®), verteporfina (Visudyne®), HPPH (Photochlor®), bacteriofeofórbido de paladio (Tookad®), 5-ALA, ácido 5-aminolevulínico (Levulan®), éster metílico de 5-ALA (Metvix®), éster bencílico de 5-ALA (Benzvix®), éster hexílico de 5-ALA (Hexvix®), texafirina de lutecio(lll) o motexafina-lutecio (Lutex®, Lutrin®, Angrin®, Optrin®), SnET2, etiletiopurpurina de estaño(IV) (Purlytin®, Photrex®), NPe6, mono-L-aspartil cloro e6, talaporfin sódico (Talporfin®, Laserphyrin®), BOPP, protoporfirina borada (BOPP®), ftalocianina de cinc (CGP55847®), ftalocianina de silicio (Pc4®), mezcla de derivados de ftalocianina de aluminio sulfonados (Photosens®), ATMPn, acetoxi-tetraquis (beta- metoxietil-)porficeno), TH9402 y éster metílico de dibromorodamina.
Los ejemplos de colorantes fotosensibilizadores para su uso según la presente divulgación incluyen los que se pueden usar en el diagnóstico por fluorescencia (por ejemplo, colorantes fluorescentes de infrarrojos cercano (NIR)), tales como La Jolla Blue® y IRDye® 700DX.
La presente divulgación también proporciona métodos de administración, a un sujeto que tiene un tumor, de una partícula similar a virus que se dirige a tumor que comprende moléculas fotosensibles conjugadas con proteínas de la cápside, o la administración, a un sujeto que tiene un tumor, de una partícula similar a virus que se dirige a tumor que comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 (por ejemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000) moléculas fotosensibles. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano. El modo de administración puede ser por inyección, infusión, implantación, administración tópica, o por cualquier otro medio normalmente usado para suministrar partículas similares a virus. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, se usan agujas huecas, agujas recubiertas, mini-agujas o micro-agujas, dependiendo del área de inyección. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el modo de administración es por inyección en el espacio intraocular o en el cuerpo vítreo de un ojo (por ejemplo, para elegir como diana tumores oculares o tumores que han metastatizado al ojo).
Los ejemplos de reactivos que se pueden usar para suministrar partículas similares a virus de la presente divulgación incluyen, sin limitación, solución salina, MgCl2, trehalosa, hialuronato de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80 o cualquier combinación de dos o más de los reactivos anteriores.
Las moléculas fotosensibles de la divulgación se pueden activar a una longitud de onda adecuada. En algunas realizaciones, la activación de las moléculas fotosensibles hace que se vuelvan citotóxicas o capaces de producir una molécula citotóxica. Las longitudes de onda adecuadas incluyen, sin limitación, longitudes de onda de ultravioleta, longitudes de onda de visible, longitudes de onda de infrarrojos y longitudes de onda de infrarrojos cercano. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se activan y se vuelven citotóxicas a una longitud de onda de 600 nm a 800 nm, o 660 nm a 740 nm. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se activan y se vuelven citotóxicas a una longitud de onda de aproximadamente 600 nm, 610 nm, 620 nm, 630 nm, 640 nm, 650 nm, 660 nm, 670 nm, 680 nm, 690 nm, 700 nm, 710 nm, 720 nm, 730 nm, 740 nm, 750 nm, 760 nm, 770 nm, 780 nm, 790 nm o 800 nm. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las moléculas fotosensibles se activan a una longitud de onda inferior a 600 nm o superior a 800 nm. Las longitudes de onda adecuadas para la activación de moléculas fotosensibles dependerán de la molécula particular usada. Las moléculas fotosensibles de la divulgación, dependiendo del tipo de molécula, se pueden activar por luz infrarroja, infrarroja cercana o ultravioleta. Por ejemplo, se puede usar un láser de infrarrojos, infrarrojos cercano o ultravioleta, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, para activar las moléculas fotosensibles de conjugados de VLP. La energía suministrada por el láser puede variar desde aproximadamente 5 J hasta aproximadamente 100 J, aproximadamente 5 julios (1) hasta aproximadamente 50 J, o aproximadamente 8 J hasta aproximadamente 36 J. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la energía suministrada por el láser es 8 J, 9 J, 10 J, 11 J, 12 J, 13 J, 14 J, 15 J, 16J, 17 J, 18 J, 19 J, 20 J, 21 J, 22 J, 23 J, 24 J, 25 J, 26 J, 27 J, 28 J, 29 J, 30 J, 31 J, 32 J, 33 J, 34 J, 35 J, 36 J, 37 J, 38 J, 39 J, 40 J, 41 J, 42 J, 43 J, 44 J, 45 J, 46 J, 47 J, 48 J, 49 J, 50 J, 51 J, 52 J, 53 J, 54 J, 55 J, 56 J, 57 J, 58 J, 59 J, 60 J, 61 J, 62 J, 63 J, 64 J, 65 J, 66 J, 67 J, 68 J, 69 J, 70 J, 71 J, 72 J, 73 J, 74 J o 75 J. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la energía suministrada por el láser es 10 J, 20 J, 30 J, 40 J, 50 J, 60 J, 70 J, 80 J, 90 J o 100 J.
Se puede aplicar una luz o láser a las moléculas fotosensibles (o VLP fotosensibles) desde aproximadamente 5 segundos hasta aproximadamente 5 minutos. Por ejemplo, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la luz o el láser se aplica a moléculas fotosensibles durante 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 50 o 55 segundos para activar las moléculas. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el láser se aplica a las moléculas fotosensibles durante 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 o 5 minutos, o más. Se debe entender que la duración de tiempo que se aplica una luz o láser a una molécula fotosensible puede variar dependiendo, por ejemplo, de la energía (por ejemplo, vataje) de la última. Por ejemplo, los láseres con un menor vataje se pueden aplicar a una molécula fotosensible durante un periodo de tiempo más largo para activar la molécula.
Se puede aplicar una luz o láser a las moléculas fotosensibles (o conjugados de VLP) aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas después de administrar los conjugados de VLP. Por ejemplo, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la luz o láser se aplica a las moléculas fotosensibles 30, 35, 40, 45, 50 o 55 minutos después de administrar los conjugados de VLP. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la luz o láser se aplica a las moléculas fotosensibles 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 horas después de administrar los conjugados de VLP. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, la luz o láser se aplica a las moléculas fotosensibles 36 o 48 horas después de administrar los conjugados de VLP.
La luz o láser se puede aplicar directamente al sitio del tumor. Por ejemplo, los conjugados de VLP que se dirigen a los tumores oculares se pueden activar iluminando el ojo.
Cualquier tipo de tumor puede ser elegido como diana según la presente divulgación. Los ejemplos de tumores incluyen, sin limitación, los localizados en el ojo, el pulmón, la pleura, el hígado, el páncreas, el estómago, el esófago, el colon, la mama, el ovario, la próstata, el cerebro, las meninges, el testículo, los riñones, la vejiga, la cabeza, el cuello, el cuello del útero, la laringe y/o la piel.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es un tumor ocular. El tumor ocular se puede localizar en el cuerpo vítreo, el espacio coroideo, el iris, el cuerpo ciliar, la esclerótica, la fóvea, la retina, la papila óptica o el nervio óptico.
El tumor, en algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, es canceroso o maligno. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el tumor es metastásico. Otros tumores también pueden ser elegidos como diana. Por ejemplo, la presente solicitud proporciona métodos y composiciones para elegir como diana células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer de ovario, células de cáncer de melanoma, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de cabeza y/o cuello y células de cáncer de vejiga.
Composiciones
Las partículas similares a virus (nanopartículas similares a virus) de la presente divulgación son nanopartículas similares a virus conjugadas con moléculas fotosensibles. Las nanopartículas similares a virus contienen uno o dos tipos de proteínas de la cápside de virus del papiloma.
En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside se modifican. Las proteínas de la cápside normalmente se autoensamblan en protocápsides "vacías" de aproximadamente 55 nm de diámetro (por ejemplo, partículas similares a esféricas que contienen un núcleo hueco). Después de la maduración de las protocápsides para formar nanopartículas similares a virus (partículas similares a virus), entonces las nanopartículas similares a virus se conjugan químicamente con una molécula fotosensible (por ejemplo, el colorante IR700, tal como IRDye® 700DX, un colorante de infrarrojos fabricado por LI-COR®). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las nanopartículas similares a virus fotosensibles se proporcionan en una disolución estéril (por ejemplo, 1 o 2 ml) en viales de un solo uso (por ejemplo, viales de vidrio de borosilicato). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las nanopartículas similares a virus fotosensibles se proporcionan en una disolución estéril de agua que incluye opcionalmente NaCl, KCl, Na2HPO4,2H2O, KH2PO4, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el NaCl puede estar presente en la disolución a una concentración de 400 a 600 mMol (por ejemplo, 500 mmoles). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el KCI puede estar presente en la disolución a una concentración de 2 a 6 mMol (por ejemplo, 2,7 mmoles). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el Na2HPO4.2H2O puede estar presente en la disolución a una concentración de 5 a 15 mMol (por ejemplo, 10 mmoles). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, el KH2PO4 puede estar presente en la disolución a una concentración de 1 a 3 mMol (por ejemplo, 2 mmoles). En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, las nanopartículas similares a virus fotosensibles se diluyen y administran por vía intraocular usando una jeringa y aguja estériles comúnmente usadas en procedimientos oftálmicos. La presente divulgación también proporciona otras vías de administración y administración a otros tumores y/o metástasis, como se describe en cualquier parte en el presente documento.
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, cada nanopartícula similar a virus comprende 12-72 capsómeros, conteniendo cada capsómero 5 moléculas de proteína de la cápside L1 (por ejemplo, 55-56 kD cada una) y 1 molécula de proteína de la cápside L2 (por ejemplo, 52 kD cada una).
En algunos ejemplos no citados en las reivindicaciones, cada nanopartícula similar a virus comprende 12-72 capsómeros, conteniendo cada uno solo proteínas de la cápside L1 (por ejemplo, 5 moléculas de proteína L1 por capsómero). En algunas realizaciones, cada nanopartícula similar a virus se conjuga químicamente (por ejemplo, por un enlace amida) con 10 a 1000 moléculas (por ejemplo, 500 moléculas) de molécula fotosensible (colorante IR700, tal como IRDye® 700DX) con al menos un aminoácido (por ejemplo, el aminoácido lisina) de la proteína.
Métodos de producción de partículas similares a virus
Para producir nanopartículas similares a virus fotosensibles de la presente divulgación, se pueden cultivar células de mamífero, tales como células 293T (por ejemplo, células HEK293F) (por ejemplo, en cultivo en suspensión) y transfectar transitoriamente con un ácido nucleico (por ejemplo, ADN de plásmido bicistrónico) que codifica proteínas de la cápside L1 (o L1 y L2) del VPB o VPH. Esto induce la formación de protocápsides (por ejemplo, como se describe en Buck et. al. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre de 2007). Tras la recuperación y la homogeneización de la masa celular, las protocápsides se pueden someter a la depuración del ADN hospedador con tratamiento con benzonasa y un posterior proceso de maduración in vitro para formar nanopartículas similares a virus estables. Tras la purificación, las nanopartículas similares a virus pueden ser químicamente conjugadas con moléculas fotosensibles (por ejemplo, IR700-éster de NHS) para producir las nanopartículas similares a virus fotosensibles. La FIG. 23 muestra una representación esquemática de un ejemplo de un proceso de producción proporcionado en el presente documento.
En la invención en el presente documento se proporcionan métodos de producción de partículas similares a virus, que comprenden:
(a) transfectar transitoriamente células con un ácido nucleico que codifica una o más proteínas de la cápside del virus del papiloma, formando así protocápsides, (b) recoger las protocápsides y someter las protocápsides a un proceso de maduración in vitro, formándose así nanopartículas similares a virus estables, y (c) conjugar químicamente las moléculas fotosensibles a la proteína de la cápside del virus del papiloma de las nanopartículas similares a virus, en donde cada partícula similar a virus se conjuga con 50 a 1000 moléculas fotosensibles y en donde la citotoxicidad de las moléculas fotosensibles se activa por exposición a luz infrarroja, infrarroja cercana o ultravioleta. En algunas realizaciones, las nanopartículas similares a virus se conjugan con 500 moléculas fotosensibles. En algunas realizaciones, las nanopartículas similares a virus se conjugan con moléculas fotosensibles mediante un enlace amida (por ejemplo, haciendo reaccionar un grupo éster de una molécula fotosensible con un grupo amina de un aminoácido de la proteína de la cápside de una nanopartícula similar a virus).
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Conjugación de IRDye® 700DX
El procedimiento de conjugación química de VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH 16/31 y proteínas L2 del VPH de variante) con una molécula fotosensible (por ejemplo, IRDye® 700DX) es del siguiente modo. Normalmente, las disoluciones de VLP se mantuvieron a una concentración de 1 mg/ml en PBS, pH=7,2 y NaCl 0,3 a 0,5 M. Las moléculas de IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) se suministraron del fabricante como ésteres de NHS (N-hidroxisuccinimida) secos (los ésteres de NHS reaccionan con los grupos amina en las proteínas para formar enlaces amida covalentes) (FIG. 10A). Los grupos amina disponibles en las proteínas son el extremo amino de la proteína o el grupo £-amino en el aminoácido (por ejemplo, lisina). El IR700-éster de NHS sólido seco se disolvió en DMSO a una concentración de 5 mg/ml y se guardó congelado. Normalmente, se lograron diferentes relaciones entre VLP:colorante mezclando diferentes cantidades de IR700-NHS hasta una cantidad fija de VLP, normalmente 1 ml de 1 mg/ml de disolución en PBS. Las relaciones típicas y las cantidades de IR700-NHS se enumeran en la siguiente tabla:
Tabla 1
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Para preparar una relación 200:1, se mezcló 1 ml de VLP a 1 mg/ml en PBS con 3,2 pl de la disolución de IR700-éster de NHS. Estas reacciones se realizaron durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, las VLP se purificaron por cromatografía en columna de afinidad por heparina para separar el IR700-NHS no unido del conjugado de VLP-IR700 recién formado (también denominado una VLP fotosensible).
Ejemplo 2 - Conjugación de Visudyné®
La conjugación de Visudyne® con las VLP siguió un protocolo ligeramente diferente con respecto al de IR700-NHS. Las moléculas de Visudyne® requirieron funcionalización con NHS, antes de la conjugación con las VLP. Esta funcionalización se logró mediante el uso de EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil)carbodiimida). Se usó EDC para funcionalizar las moléculas que tenían una molécula de ácido carboxílico libre, tal como Visudyne® (véase la FIG. 10B; con un círculo), y en presencia de sulfo-NHS transfieren eficazmente el resto de NHS a este agente. Este esquema de reacción se expone brevemente en la FIG. 11. Brevemente, se hizo reaccionar aproximadamente 2 mM de EDC y un exceso molar 2x de sulfo-NHS con cantidades variables de Visudyne®. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, las reacciones se detuvieron con la adición de 2-mercaptoetanol hasta una concentración final de 20 mM. Esta mezcla de reacción se añadió a 1 mg de VLP a una concentración de 1 mg/ml en PBS, pH=7,2 NaCl 0,3-0,5 M y se incubó durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Finalmente, los componentes sin reaccionar se separaron de los conjugados de VLP por cromatografía en columna de afinidad por heparina.
Ejemplo 3 - La especificidad de unión de VLP está mediada por HSPG y se inhibió por heparina.
Se trataron células SK-OV-3 en suspensión en las siguientes condiciones: sin VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas l2 del VPH de variante), las VLP se conjugaron o con Alexa Fluor® 488 (FIG. 3, "AF488*PsV") o IR700 (FIG. 3, "IR700*PsV"), o los mismos conjugados de VLP se incubaron en presencia de HSPG. Tras la incubación, estos cultivos se sometieron a 4 julios de luz infrarroja cercana de 690 mm. Un conjunto paralelo de células no irradiadas con luz actuó de control. Tras la irradiación, los cultivos se evaluaron para el grado de la muerte celular. La FIG. 3 muestra que la única condición en la que hubo destrucción celular sustancial fue la exposición de las células a IR700*PsV y 4 julios de luz. No se observó muerte celular similar con exposición a AF488*PsV, lo que revela que la muerte celular es específica de los conjugados del colorante IR700. Además, la muerte celular se suprime casi completamente en presencia de HSPG, lo que revela que la unión de VLP a la célula es crítica para la muerte celular mediada por IR700.
Ejemplo 4 - La muerte celular depende de la radiación infrarroja y la cantidad de VLP y IR700.
Se trataron células SK-OV-3 en suspensión con concentraciones diferentes de VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante) que se habían conjugado con cantidades diferentes del colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Se usó VLP sin conjugación con el colorante IR700 como control. Tras la incubación, estos cultivos se sometieron a 0 o 16 julios de luz infrarroja cercana de 690 mm. Después del tratamiento con luz, se evaluó el grado de la muerte celular. La FIG.
4 muestra que la muerte celular es dependiente de tanto la presencia del colorante IR700 como del tratamiento con luz. Esto está soportado por la observación de que la muerte celular depende de tanto la concentración de VLP como la relación de conjugación con el colorante IR700.
Ejemplo 5 - Muerte celular in vitro de células SKOV-3 tras la irradiación tras el tratamiento con VLP conjugadas con IR700.
Se sembraron células de cáncer de ovario SKOV-3 sobre una placa de 24 pocillos y se trataron con dos concentraciones diferentes de partículas VLP fotosensibles (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH 16/31 y proteínas L2 del VPH de variante conjugadas con el colorante IR700), 2,5 pg (rojo) y 0,25 pg (azul), durante 1 h a 37 °C. Tras la unión, las células se lavaron, seguido por tratamiento con 4 J de luz. Se determinó la muerte celular tras la estimación enzimática de la liberación de LDH (determinada midiendo la absorbancia a 490 nm). Se probaron tres relaciones molares diferentes de conjugación de VLP:IR700: 1:500, 1:1000 y 1:2000, respectivamente. La FIG. 5 muestra que la máxima eficacia de la muerte celular se observó en una relación 1:1000 de VLP:IR700 ("PsV:IR700") para ambas concentraciones probadas. Se usó la lisis celular mediada por detergente como control positivo.
Ejemplo 6 - Evaluación estructural de complejos de IR700-PsV
La FIG. 6 muestra un análisis de ESI-TOF de VLP de control (PsV) (A) y VLP conjugadas con IR700 (PsV) (B). En FIG. 6B, la reacción se estableció para lograr la conjugación de cada molécula de VLP (PsV) con 1000 moléculas de IR700. La señal alcanza un máximo en los barridos de ESI-TOF que corresponden a la proteína L1 del VLP. Se observó un desplazamiento de 5517 uma en muestras conjugadas con respecto a muestras de control, muestras conjugadas que corresponden a un promedio de 3 moléculas de IR700 conjugadas (1840 uma) por proteína L1 o aproximadamente 1000 moléculas de IR700 por VLP (normalmente, existen 360 L1 por VLP).
Ejemplo 7 - La unión del agente determina el grado de muerte celular en una estirpe celular de melanoma ocular
Se expuso la estirpe celular de melanoma ocular (92.1; HER2-) en suspensión a diluciones variables de o el anticuerpo Herceptin® conjugado con el colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) o VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante) conjugadas con el colorante IR700. Entonces se evaluaron cultivos paralelos para la unión del agente (FIG. 7C) o la muerte celular en ausencia (FIG. 7B) o presencia (FIG. 7A) de 16 julios de luz infrarroja cercana de 690 nm. La FIG.
7C muestra la unión de VLP dependiente de la concentración a las células de melanoma ocular 92.1, mientras que la unión del anticuerpo Herceptin® está esencialmente ausente. La FIG. 7B muestra que, en ausencia de luz, no existe muerte celular. La FIG. 7A muestra la muerte celular dependiente de la concentración solo en las células tratadas con VLP fotosensibles.
Ejemplo 8 - La unión del agente determina el grado de muerte celular en una estirpe celular de cáncer de ovario.
Se expusieron células SK-OV-3 (HER2-) en suspensión a diluciones variables de o anticuerpos Herceptin® o partículas VLP (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante) conjugadas con el colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Entonces se evaluaron cultivos paralelos para Herceptin® o la unión de VLP (FIG. 8C) o la muerte celular en ausencia (FIG. 8B) o presencia (FIG. 8A) de 16 julios de luz infrarroja cercana de 690 nm. La FIG. 8C muestra que la unión de VLP se satura en células SK-OV-3. La unión de Herceptin® también es dependiente de la concentración, pero a un menor grado con respecto a las VLP. La FIG. 8B muestra que, en ausencia de luz, no hay muerte celular. La FIG. 8A muestra la muerte celular dependiente de la concentración en ambas condiciones, pero similar a la unión, la respuesta se satura con VLP mientras que parece haber un aumento dependiente de la concentración en la muerte celular con Herceptin®. Estos datos implican que las VLP conjugadas con IR700 (PsV-IR700) son más potentes que el Herceptin® conjugado con IR700 (Herceptin-IR700).
Ejemplo 9 - Los anticuerpos neutralizantes anti-VPH16 inducidos por vacuna no bloquean la unión de VPB*IR700 VLP con la linea de melanoma ocular, 92.1.
Se probaron muestras de suero que contenían diferentes anticuerpos para la capacidad para inhibir partículas VLP fotosensibles (por ejemplo, VLP de VPH16 o VLP de VPB) que se unen a la estirpe celular de melanoma ocular 92.1. La FIG. 9 muestra que condiciones "sin suero" o "sin tratar con suero" no contienen actividad que neutralice la unión de VLP. Además, se observó que la actividad de bloqueo era específica del serotipo del virus. Es decir, solo las partículas similares al virus del papiloma humano conjugadas con el colorante IR700 (VPH16-IR700) se neutralizaron con anticuerpos del VPH16 que contenían suero. Las partículas similares al virus del papiloma bovino conjugadas con IR700 (VPB-IR700) no se neutralizaron por anticuerpos específicos del VPH16 que contenían suero.
Ejemplo 10 - Evaluación de la inmunogenicidad
En un estudio similar al descrito en el Ejemplo 9, se determinaron títulos neutralizantes por dilución sucesiva de sueros que contenían anticuerpos contra o VPH16 o VPB. Los resultados descritos en la Tabla 2 muestran que los anticuerpos contra VPH16 neutralizan solo VPH16. Además, los anticuerpos contra VPB neutralizan solo VPB. Por lo tanto, no existe ni reactividad cruzada de anticuerpos contra VPH16 contra VPB ni anticuerpos contra VPB contra VPH16.
Tabla 2
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Ejemplo 11 - Estudio de unión
El objetivo de este ejemplo era evaluar la unión de nanopartículas similares a virus que contenían proteínas de la cápside del virus del papiloma humano 16 (VPH16), proteínas de la cápside L1 del VPH16/31 de variante y proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino (VPB) a diversos tipos de células de cáncer. Además, se probaron las nanopartículas similares a virus que contenían proteínas de la cápside L1 y L2, o solo proteínas de la cápside L1, para determinar si hubo una dependencia de L2 para la nanopartícula similar a virus que se une a células de cáncer. Los resultados de este estudio muestran que la unión de nanopartículas similares a virus del VPB y nanopartículas similares a virus del VPH son comparables.
Se cribó un gran panel de estirpes celulares, que incluyó: diversas estirpes celulares (por ejemplo, 293TT, HaCaT, PAM-212 y TC-1), estirpes celulares de cuello uterino (por ejemplo, HeLa, SiHa, CaSki y C-33A), estirpes celulares de ovario (por ejemplo, MOSEC, SHIN-3, SK-OV-3, WF-3, ES-2, A2780, OVCAR-3 y OVCAR-4), estirpes celulares de melanoma (por ejemplo, B16F10, Sk Me L-2, SKMEL-5, SKm El -28 y UACC), estirpes celulares de melanoma ocular (por ejemplo, 92,1, MKT-BR, Oc M-1 y UW-1), estirpes celulares de pulmón (por ejemplo, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460 y NCI-H522), estirpes celulares de cabeza y cuello (por ejemplo, CAL-33 (VPH-), FaDu (VPH-), HSC-3 (VPH-), SNU-1076 (VPH-), MMU-SCC-47 (VPH+), UPCI-SSC-90 (VPH+) y UPCI-SCC-154 (VPH+)) y estirpes celulares de vejiga (por ejemplo, 5637, J82, RT112, SCaBER, SVHUC, T24, UMUC-3, UMUC-5).
Antes del experimento, se conjugaron nanopartículas similares a virus con AlexaFluor488 para permitir un análisis fácil y directo de nanopartículas similares a virus que se unen a la superficie celular. Se fijó AlexaFluor488 a la nanopartícula similar a virus usando la química del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), que no interfiere con la unión. Cada una de las nanopartículas similares a virus se probó a una concentración de 10 pg/ml, 1 pg/ml y 0,1 p/ml.
Se tripsinaron las células para retirarlas de la superficie de plástico de placas de cultivo de tejido, se lavaron y se dejó que se recuperaran durante 4 horas a 37 °C en medio de crecimiento en una plataforma basculante. Entonces se lavaron las células, se contaron y se colocaron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a 1 x 105 células/pocillo en solución salina tamponada con fosfato (PBS)/2 % de suero bovino fetal (FBS). Las nanopartículas similares a virus se añadieron a las células en un volumen final de 100 pl de PBS/2 % de FBS. Las nanopartículas similares a virus preincubadas con heparina (1 mg/ml, 1 hora, 4 °C) también se añadieron a pocillos como controles. Las células y nanopartículas similares a virus se incubaron entonces durante 1 hora a 4 °C (en la oscuridad), se lavaron dos veces con PBS/2 % de FBS y se fijaron con 4 % de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron finalmente otra vez y se resuspendieron en 200 pl de PBS/2 % de FBS y se analizaron en un BD FACS CANTO™ II (BD Biosciences, San Jose, Ca ) usando BD fAc SDIVA™ (BD Biosciences, San Jose, CA) y el software FlowJo.
Los resultados usando las estirpes celulares TC-1, HeLa, SK-OV-3, SKMEL-28, 92,1, NCI-H322M, HSC-3, UPCI-SCC-154 y T24 se presentan como histogramas en la FIG. 12. Como es evidente de la FIG. 12, todas las nanopartículas similares a virus, independientemente de su serotipo o constitución (L1 frente a L1/L2) se unen a células de cáncer en el ensayo de unión. Además, la heparina compite por la unión, que demuestra que la nanopartícula similar a virus que se une es específica y dependiente de HSPG.
Ejemplo 12 - Evolución temporal de la biodistribución
El objetivo de este ejemplo era evaluar la localización del tumor y la evolución temporal de la eliminación de las nanopartículas similares a virus tras la inyección intravenosa en animales que tienen un tumor.
Se prepararon nanopartículas similares a virus purificadas marcando las nanopartículas similares a virus (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y L2 del VPH variante) con el colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX) en una relación entre nanopartícula similar a virus:colorante de 1:500. Las nanopartículas similares a virus fotosensibles se purificaron por ultracentrifugación de gradiente de densidad usando OPTIPREP™ Density Gradient Medium.
Se generaron tumores en ratones C57B1/6 albinos por inyección subcutánea de 2 x 105 células de cáncer TC-1 en 100 gl de PBS. Después de aproximadamente dos semanas, los animales se aleatorizaron a grupos de tratamiento. Los animales que tenían tumor recibieron por inyección intravenosa o PBS o 200 gg de nanopartículas similares a virus fotosensibles en un volumen de 100 gl. Doce o veinticuatro horas después de la inyección, los animales se sacrificaron. Tras la eutanasia, se recogió tejido tumoral y se obtuvieron imágenes de fluorescencia del colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX), que indica la presencia de las nanopartículas similares a virus fotosensibles.
La FIG. 13B muestra la fluorescencia del colorante IR700 detectable (por ejemplo, IRDye® 700DX) en el tejido tumoral obtenido de tanto los momentos de tiempo de 12 y 24 horas, mientras que no se detectó la fluorescencia en el control de PBS (momento de tiempo de 12 horas). La fluorescencia total cuantitativa en el tejido tumoral se representa en el gráfico representado en la FIG. 14.
Ejemplo 13 - Evolución temporal de la biodistribución
El objetivo de este ejemplo era evaluar la localización del tumor y la evolución temporal de la eliminación de las nanopartículas similares a virus tras la inyección intravenosa en animales que tienen un tumor.
Se marcaron nanopartículas similares a virus purificadas con AlexaFluor488 en lisado y se purificaron por ultracentrifugación de gradiente de densidad usando OPTIPREP™ Density Gradient Medium.
Se generaron tumores en ratones C57B1/6 albinos por inyección subcutánea de 2 x 105 células de cáncer TC-1 en 100 gl de PBS. Después de aproximadamente 2 semanas, se suministraron 200 gg de nanopartículas similares a virus fotosensibles por inyección intravenosa en un volumen de 100 gl. Los tumores se recogieron en los siguientes momentos de tiempo tras la inyección de las nanopartículas similares a virus fotosensibles: T=1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 y 72 horas. Tras la recogida, se congelaron los fragmentos de tumores para la evaluación microscópica. Para esta evaluación microscópica, se tiñeron aún más las secciones de tejido. Se usaron sueros policlonales de conejo contra VPH16 junto con anticuerpos secundarios con AlexaFluor-488. Se tiñeron conjuntamente los vasos sanguíneos con un anticuerpo anti-CD31 de rata y un anticuerpo secundario con AlexaFluor-594 anti-rata. Los núcleos se resaltaron con DAPI.
Los datos (imágenes in situ no mostradas) demostraron la presencia de las nanopartículas similares a virus fotosensibles en el momento de tiempo de 1 hora. La localización de la señal pareció estar asociada dentro de los vasos sanguíneos. El nivel máximo de tinción pareció ocurrir en el momento de tiempo de 8 horas, y en el momento de tiempo de 8 horas, las nanopartículas similares a virus fotosensibles parecieron estar difundiendo desde el interior de los vasos sanguíneos hacia las células tumorales. Finalmente, en los momentos de tiempo de 24 horas y 48 horas, pareció haber poca señal de nanopartículas similares a virus en el tumor.
Ejemplo 14 - Eficacia in vivo después de la administración sistémica
El estudio presentado en este ejemplo se diseñó para medir la viabilidad tumoral 24 horas después de un único tratamiento. El estudio establece directrices para estudios in vivo de larga duración.
El diseño completo del estudio se ilustra en la FIG. 15. Debido al intervalo de tamaños de los tumores, los animales se aleatorizaron de forma que una distribución homogénea de tumores grandes y pequeños estuviera dentro de cada grupo de n=3 en los grupos tratados con solución salina y n=5 en los grupos tratados con IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX)-nanopartículas similares a virus fotosensibles. Las nanopartículas similares a virus se administraron por vía intravenosa 12 horas antes del tratamiento con luz. Se probaron dosis de cien microgramos (100 gg) y de 200 gg. El tratamiento con luz incluyó 25 J (62,3 s a 400 mW) o 50 J (125 s a 400 mW). Después de 24 horas, los tumores se recogieron y se procesaron usando colagenasa y DNAsa para generar una suspensión de células individuales. Entonces se aplicó la tinción amarilla BD LIVE/DEAd®, y las células se colocaron en un FACS CANTO™ II. Los datos se informan como porcentaje de células muertas como se indica por un desplazamiento en la fluorescencia en el canal de Pacific orange (FIG. 16A).
Una dosis única de 200 gg de IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX)-nanopartículas similares a virus fotosensibles (NP) fue capaz de destruir la mayoría de las células tumorales después del tratamiento con 50 J de luz (FIG. 16B y FIG.
17C). El nivel de destrucción con 200 gg de NP se redujo en casi la mitad cuando los tumores se trataron con 25 J de luz (FIG. 16B y FIG. 17B). 100 gg de Np no fue suficiente para inducir la destrucción con 25 J de luz (FIG. 16B y FIG.
17B); sin embargo, se observó cierta muerte tumoral a dosis de 50 J (FIG. 16B y FIG. 17C). Este estudio proporcionó el IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX)-nanopartículas similares a virus fotosensibles necesario y la información de dosis de luz para los estudios in vivo.
Ejemplo 15 - Estudio de activación del sistema inmunitario
El modelo tumoral TC-1 ofrece la capacidad de examinar la inducción inmunitaria antitumoral tras el tratamiento con nanopartículas similares a virus en animales competentes inmunitarios. La línea tumoral TC-1 se desarrolló a partir de células epiteliales de pulmón C57B1/6 inmortalizadas con oncogenes E6 y E7 del VPH16, así como un gen mutado que expresa c-Ha-Ras (Lin KY, et al., Cancer Research. 56(1 ):21 -6, 1996). Estas células se pueden implantar por vía subcutánea o, para estudiar modelos metastásicos, se pueden inyectar por vía intravenosa para sembrar células en los pulmones. Durante casi veinte años, estas células se han usado para probar la eficacia de vacunas terapéuticas E6 y E7. E7 tiene un epítope distintivo de MHC de clase I en el acervo genético de C57B1/6, que se ha mostrado que es protector si se puede provocar una respuesta de linfocitos T CD8 contra él (H-2Db, aa 49-57 RAHYNIVTF) (Feltkamp MC, et al. European Journal of Immunology. 23(9):2242-9, 1993). Estas respuestas se detectan por tanto la tinción con tetrámeros como la reestimulación de células con el péptido, seguido por tinción de citocinas intracelulares.
Estudio de respuesta a la dosis: Se inocularon los animales por vía subcutánea con 2 x 105 células TC-1 en 100 pl de PBS. Aproximadamente dos semanas después de la inoculación, los animales se aleatorizaron en seis grupos: (1) controles sin tratamiento, (2) 100 pg de nanopartículas similares a virus (que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante marcadas con IRDye® 700DX) sin controles de luz, (3) PBS con controles de 50 J/cm2 de luz, (4) 200 pg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz, (5) 100 pg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz y (6) 50 pg de nanopartículas similares a virus con 50 J/cm2 de luz. Los ratones recibieron PBS o nanopartículas similares a virus por inyección intravenosa de un volumen de 100 pl, y se aplicó luz al tumor 12 horas después de usar un láser de 690 nm. Los tumores se recogieron 24 horas después, se digirieron para generar una suspensión de células individuales y se tiñeron con una tinción de viabilidad para medir el porcentaje de células muertas (FIG. 18, arriba).
Varios animales en el grupo de dosis alta tuvieron síntomas relacionados con el síndrome de lisis del tumor, probablemente debido a la necrosis tumoral masiva y rápida y a la liberación de componentes intracelulares en el sistema del animal. Aunque no murió ninguno del grupo de "100 pg de nanopartículas con 50 J/cm2 de luz", los ratones en el grupo mostraron algunos signos de enfermedad (FIG. 18, arriba). Los grupos de "100 pg de nanopartículas sin luz" y de "PBS con 50 J/cm2 de luz" no mostraron signos de enfermedad, que indica que la respuesta observada fue debida a la combinación de las nanopartículas similares a virus y luz. En general, la necrosis fue evidente en todos los grupos que recibieron las nanopartículas similares a virus y luz. La máxima destrucción ocurrió en todos los grupos, y no se observó respuesta a la dosis (FIG. 18, abajo).
Estudio de supervivencia: Se inocularon los animales por vía subcutánea con 2 x 105 células TC-1 en 100 pl de PBS. Aproximadamente dos a tres semanas después de la inoculación, los animales se aleatorizaron en el grupo de tratamiento (25 pg de nanopartículas similares a virus) y el grupo de placebo (PBS solo). Los ratones recibieron dos rondas de tratamiento, separadas tres días. Un tratamiento se consideró una única inyección intravenosa de 100 pl de o 25 pg de nanopartículas similares a virus o PBS estéril, seguido 12 horas después por tratamiento con luz a 50 J/cm2 usando un láser de 690 nm. Los volúmenes de tumor se midieron cada 3-4 días, y los animales se sacrificaron cuando sus tumores alcanzaron un tamaño >1500 mm3 (FIG. 19A).
El tratamiento con nanopartículas similares a virus fue capaz de retrasar el crecimiento o erradicar los tumores en animales con tumores inferiores a 500 mm3 (FIG. 19B y 19C). No hubo efecto sobre la cinética del crecimiento tumoral en el grupo de placebo. Los dos animales que empezaron con los tumores más pequeños no mostraron evidencia de tumores en los 7 días desde el primer tratamiento, y tres de los animales mostraron signos de reducción tumoral (FIG. 19C).
Estudio de inmunología: Para la lectura inmunológica, se recogió sangre en el día 0 (antes del primer tratamiento), día 10 y día 17. Se lisaron los glóbulos rojos y las células restantes se dividieron en dos, la mitad se tiñó para marcadores de la superficie celular (CD62L, c D127, CD103, CD69, CD4, CD8, CD3, tetrámero H2-DbE7(49-57)). La otra mitad se volvió a estimular durante 4,5 horas con el péptido E749-57 del VPH16, seguido de tinción con anticuerpos contra CD4, CD8 e IFN-gamma, así como un colorante de viabilidad para discriminar las células vivas.
En la sangre de los dos animales con crecimiento tumoral controlado, se pudieron detectar tanto "linfocitos T CD8+ del tetrámero+ E7" como "células CD8+ secretoras de INF-gamma" (después de la re-estimulación con el péptido E7), que indica que se había provocado una posible respuesta antitumoral (FIG. 19C).
Ejemplo 16 - Análisis histológico
Se evaluaron los efectos de nanopartículas similares a virus fotosensibles (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante conjugadas con el colorante IR700) al nivel histológico usando un modelo murino de xenoinjerto. Brevemente, se implantaron 1,5 x 106 células de melanoma maligno uveal 92.1 en el espacio subcutáneo del flanco trasero de ratones nu/nu. Se dejó que los tumores alcazaran aproximadamente 200 mm3, momento en el que los animales se trataron con una inyección intravenosa de 200 pg de nanopartículas similares a virus fotosensibles. Doce horas después de la inyección de nanopartículas similares a virus fotosensibles, el sitio tumoral se irradió con 50 J/cm2 de luz infrarroja cercana de 690 nm. Después de 24 horas adicionales, los animales se sacrificaron, se cortó el tejido tumoral, se fijó en formol, se incorporó en parafina y se procesó para el examen histológico habitual.
Las imágenes de hematoxilina y eosina (H&E) revelaron un gran grado de necrosis, cuando se comparó con controles no tratados (imágenes no mostradas). El tumor tratado con nanopartículas similares a virus fotosensibles y láser tuvo un aspecto pálido cuando se comparó con el tumor de control. Tras el examen con mayor aumento, las células de los tumores tratados con nanopartículas similares a virus fotosensibles mostraron una considerable pérdida de citoplasma en comparación con el tumor tratado con control. Además, el grado de necrosis cubrió todo el tumor, que conduce a la conclusión de que la luz de NIR penetra a través de toda la profundidad del tejido tumoral.
Ejemplo 17 - Actividad de nanopartículas similares a virus en un modelo de xenoinjerto ortotópico de melanoma maligno uveal
El tumor primario maligno del ojo más común es el melanoma maligno uveal (MMU). Aproximadamente 2.000 pacientes lo presentan anualmente en los EE. UU., con manifestación más frecuente en Europa. Aunque existen varias opciones de tratamiento para el MMU, ningún tratamiento controla de manera fiable el crecimiento tumoral, conserva la visión ni minimiza la aparición de efectos secundarios relacionados con la radiación.
La fototerapia (FT) con nanopartículas similares a virus es una novedosa terapia molecular dirigida contra el cáncer que implica un proceso de dos etapas que requiere la administración de tanto fármaco como activación de luz. La porción de fármaco de la FT con nanopartículas similares a virus es una nanopartícula (NP) similar a virus fotosensible conjugada con IRDye®700 DX, un colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano (NIR) que actúa de sensibilizador de la luz, seguido por la aplicación de luz de NIR no térmica diseñada para tratar adultos con melanoma maligno uveal primario.
En el presente estudio, se evaluó la actividad anticancerosa de la nanopartícula similar a virus fotosensible en un modelo de xenoinjerto ortotópico de melanoma maligno uveal. En este modelo, células de melanoma maligno uveal humano se implantaron en el espacio coroideo de conejos inmunodeprimidos y se dejó que crecieran. Cuando los tumores fueron observables por oftalmoscopia, los animales se asignaron a grupos de tratamiento o de control. En ambos casos, los animales fueron seguidos por oftalmoscopia y ultrasonidos para el crecimiento tumoral progresivo o la respuesta al tratamiento. Tras la finalización del estudio, los ojos que tenían un tumor también se examinaron por anatomía patológica macroscópica e histopatología.
Este estudio se llevó a cabo usando 20 conejos totales implantados con la estirpe celular de melanoma maligno uveal 92.1. En total, 11 de los veinte animales desarrollaron tumores. Dos animales murieron inesperadamente durante el periodo de seguimiento antes del tratamiento; estos animales se usaron como controles sin tratar. Varios animales tuvieron tumores extraoculares que no fueron tratados con láser; estos se usaron como controles internos. Los animales con tumores en la cámara anterior se excluyeron del estudio.
Todos los tumores tratados mostraron una respuesta tumoral importante en comparación con los animales de control, demostrado por evaluación por oftalmoscopia, anatomía patológica macroscópica e histopatología. Los tejidos retinianos adyacentes a los tumores no estuvieron afectados por el tratamiento.
En conclusión, basándose en el grado de respuesta tumoral y la necrosis observada tras la administración de nanopartículas similares a virus fotosensibles y administración de láser, la metodología de tratamiento proporcionada en el presente documento se puede usar para el tratamiento de tumores de melanoma maligno uveal .
Programa del estudio: Dos grupos de tratamiento: 1) tratamiento tumoral completo; 2) sin tratamiento.
Tabla 3
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Métodos y diseño experimental:
Sistema de prueba
Tabla 4
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Modelo
Cultivo de células
Se cultivó la estirpe celular de melanoma maligno uveal humano 92.1 (cortesía del Dr. Jerry Y. Niederkorn, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX) a 37 °C en 5 % de CO2 en medio de cultivo completo (RPMI-1640 con 10 % de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina G, 250 ng/ml de anfotericina B y 100 pg/ml de disolución de estreptomicina).
Animales e inducción de inmunosupresión
Se usaron para este estudio conejos albinos de Nueva Zelanda con un peso inicial medio de aproximadamente 3 kg. Los conejos se inmunodeprimieron con inyecciones diarias subcutáneas de ciclosporina A (CsA; Sandimmune 50 mg/ml; Novartis Pharmaceuticals, Cambridge, MA, EE. UU.). La administración de CsA se mantuvo durante todo el experimento para prevenir la regresión tumoral espontánea. El programa de dosis fue 15 mg/kg por día durante 3 días antes de la inoculación de células y durante 4 semanas a partir de aquí, seguido por 10 mg/kg por día hasta el final del experimento. La dosis se atenuó adicionalmente a criterio del veterinario. La dosis de CsA se ajustó diariamente según cada peso corporal del animal. El peso corporal se midió diariamente, y se registró en la sala donde se alojaron los conejos.
Durante el seguimiento, los animales se monitorizaron diariamente para signos de toxicidad por CsA, tales como hipertrofia gingival, sialorrea, diarrea y pérdida de peso. Si los animales mostraron signos tempranos de toxicidad por CsA (por ejemplo, pérdida de apetito), se consultó inmediatamente al personal veterinario para gestión complementario, tal como estimulante del apetito y potenciador de la motilidad GI.
El ajuste de la dosis de inyección también se consideró según la recomendación del veterinario.
Implante de células
El día 3 después del tratamiento con CsA, los animales se anestesiaron con una inyección intramuscular de ketamina (40 mg/kg) y xilazina (6 mg/kg). Después de la anestesia, se administraron 1-3 gotas de 0,5 % de clorhidrato de proparacaína en los ojos derechos y se inyectó 1,0 x 106 células de melanoma maligno uveal humano 92.1 en un volumen de 100 pl de suspensión en el espacio supracoroideo del ojo derecho de los conejos usando una cánula doblada. Brevemente, se colocó una talla estéril sobre el ojo para evitar cualquier contaminación con pelos o las pestañas de los ojos, y se limpió la conjuntiva con 10 % de disolución de betadine. A continuación, se giró el ojo hacia adelante usando suturas debajo de los músculos oculares, y después de diseccionar la conjuntiva, se realizó una esclerotomía aproximadamente 10 mm desde el limbo. Entonces se insertó la cánula en la esclerotomía (1/3-1/2 de su longitud) y las células (100 pl que contenían 1,0 x 10A6 células) se inyectaron en el espacio supracoroideo. La aguja se retrayó lentamente, y se apretaron las suturas que cerraban la esclerotomía para garantizar un reflujo mínimo en el lugar de inyección. Se administró una gota de disolución oftálmica de antibiótico (pomada de eritromicina) sobre la herida quirúrgica para prevenir la infección.
Alojamiento, comida, agua y condiciones medioambientales, aclimatación
Los animales se alojaron en alojamientos grupales en grupos de 6 y se alimentaron con comida fresca, sabrosa y adecuada nutricionalmente a voluntad. El agua que era limpia, potable y sin contaminar se proporcionó a voluntad. Se establecieron controles medioambientales para mantener temperaturas de 22 ± 4 °C (68 ± 5 °F) con humedad relativa del 50 % ± 20 %. Se mantuvo un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad. Los animales se aclimataron durante al menos 5 días después de la llegada a la instalación antes de la evaluación basal. Los animales se asignaron a grupos de prueba después de las evaluaciones oftalmoscópicas basales.
Artículos de prueba y de control
Tabla 5: Vehículo de producto experimental
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Tabla 6: Producto experimental
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Tabla 7: Láser
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Preparación de las formulaciones de dosis
El producto experimental se diluyó 1:1 en agua estéril para inyección.
Administración de artículo de prueba/control
Administración: Se administró nanopartícula similar a virus fotosensible o solución salina por inyección intraocular en el cuerpo vítreo.
Administración del láser: El tratamiento con láser se aplicó usando un sistema de lámpara de hendidura con un láser Coherent Opal Photoactivator® que suministraba 690 nm de luz con una potencia de 600 mW durante una duración de 83 segundos para una fluencia total de 50 J/cm2. El tamaño del sitio del láser se estableció a un diámetro de 5 mm y, como tal, los tumores que fueron superiores a este tamaño se sometieron a láser con sitios de solapamiento. En los casos donde no se pudo delinear una clara distinción del límite del tumor debido a complicaciones oculares (por ejemplo, vitritis, desprendimiento de retina), se sometió a láser el área sospechosa completa.
Comprobaciones de mortalidad/morbilidad: Todos los animales permanecieron con buena salud a lo largo del estudio, aparte de los dos animales que murieron debido a complicaciones de CsA (véase más adelante).
Observaciones clínicas: Todos los animales se observaron diariamente por personal del animalario; las observaciones se registraron. La mayoría de los animales experimentó algún grado de pérdida de peso y pérdida de apetito, que se atribuyó a CsA.
Oftalmología
Frecuencia: Se realizó semanalmente un examen oftalmológico por oftalmoscopia y ultrasonidos.
Procedimiento: Se sedó al animal y se le dilató el ojo derecho usando gotas oculares de clorhidrato de fenilefrina ocular y tropicamida. A continuación, se realizó un examen oftalmoscópico del ojo usando un oftalmoscopio binocular indirecto. El oftalmólogo registró cualquier complicación ocular. Cuando se identificó un tumor, el tamaño se estimó comparándolo con la papila óptica (diámetro de la papila [DD]; 1 DD = aproximadamente 1,75 mm). Para las lecturas de ultrasonidos, inmediatamente después de la oftalmoscopia, se aplicó una sonda de ultrasonidos al ojo para visualizar la localización del tumor como se determinó por la oftalmoscopia. Las mediciones de ultrasonidos demostraron ser técnicamente difíciles, principalmente debido a que algunos de los tumores estaban localizados demasiado en la periferia como para ser apropiadamente visualizados. Como resultado, no fue siempre posible medir la dimensión más larga del tumor; y en la mayoría de los casos solo la altura fue cuantificable.
Procedimientos terminales y patología anatómica
Muertes no programadas: de los 20 animales usados en este estudio, uno se sacrificó debido a pérdida de peso (>20 % de peso después de la llegada), según las directrices del protocolo. Un animal murió inesperadamente debido a estasis gastrointestinal causada por la toxicidad de CsA.
Eutanasia programada: después de la finalización del estudio, los animales se sacrificaron según las directrices aceptadas de la American Veterinary Medical Association (AVMA). Los animales se desangraron con anestesia usando una combinación de ketamina-xilazina-acepromazina (0,75 mg/kg, 5 mg/kg y 20-35 mg/kg, respectivamente) y buprenorfina (0,2 mg/kg).
Resultados
En general, 11 animales desarrollaron tumores evidentes histopatológicamente. Como se menciona previamente, dos animales murieron inesperadamente y se usaron como control no tratado. 9 animales con diferentes tamaños de los tumores recibieron tratamiento con nanopartículas similares a virus fotosensibles. Un animal no se incluyó en la evaluación debido al grado de tumor en el segmento anterior del ecuador que no se pudo someter a láser.
Para los animales que tenían tumores en la parte posterior del ojo y recibieron el tratamiento completo (nanopartícula similar a virus fotosensible láser), se observó una respuesta tumoral perceptible, que se caracterizó por tres elementos: 1) inducción de una extensa necrosis tumoral; 2) cambio en el patrón de crecimiento, de difuso a un "patrón similar a manga"; y 3) conservación de la retina adyacente.
Tabla 8
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Controles no tratados
Se sacrificó el conejo N.° 14 en la semana 4 debido a una pérdida de peso no aceptable (>20 % del peso corporal inicial). La oftalmoscopia para la presencia de tumor fue inconclusa debido a una enorme hemorragia y desprendimiento de retina. Este animal no recibió tratamiento.
Ultrasonidos: Este conejo no se sometió a un análisis de ultrasonidos debido al momento de la muerte.
Anatomía patológica macroscópica/histopatología: En la anatomía patológica macroscópica, se observó un tumor intraocular que medía 3 mm de altura (H) x 8 mm de la dimensión más larga del tumor (LTD), y en la histopatología un tumor intraocular que medía 2,2 mm de H y 9,5 de la dimensión más larga del tumor. En la anatomía patológica macroscópica, se observó un tumor extraocular que medía 1,4 mm de altura y 9,4 mm de la dimensión más larga del tumor. Aproximadamente el 10 % de tanto los tumores intra- como extraoculares fueron necróticos. No se detectó patrón en manga.
Tratamiento completo
Conejo 9
El conejo N.° 9 tuvo un tumor clínicamente detectable en el fondo de aproximadamente 1 DD de tamaño en la semana 4, que se trató inmediatamente. A la siguiente semana, el tumor se estimó como 0,5 DD. En la semana 6, el tumor se estimó en <0,5 DD y en la semana final no se detectó.
Ultrasonidos: El ultrasonido no percibió ningún tumor en la semana 3, pero en el peso 4 se identificó una masa que medía 1,04 mm de altura. En las semanas posteriores, las mediciones en ultrasonidos retrocedieron hasta que ya no fue visible en la semana 6 ni a partir de entonces.
Anatomía patológica macroscópica/histopatología: La histopatología no reveló ni tumor ni células. Sin embargo, secciones sucesivas de todo el ojo y los resultados inmunohistoquímicos están pendientes de confirmar este resultado.
Conejo 6
Hubo una sospecha clínica de un tumor en la semana 4 (masa elevada debajo de la retina), pero la hemorragia subrretiniana, el líquido y el desprendimiento de resina descartaron la estimación del tamaño clínico durante la duración del experimento.
Ultrasonidos: por ultrasonidos, en la semana 3 se detectó una masa grande de 4,88 mm, que creció hasta 5,29 mm en la semana 4, momento en el que los presentes inventores empezaron el tratamiento. En la semana 5, el tumor midió 4,88 mm, mientras que en las semanas 6 y 7 el tumor midió 4,02 y 4,98 mm, respectivamente.
Anatomía patológica macroscópica/histopatología: En la anatomía patológica macroscópica, se identificaron dos tumores distintos: un tumor intraocular y un tumor conjuntivo, este último se sospecha que es el resultado del reflujo durante la implantación de las células. Debido a la localización del tumor conjuntivo, no se trató, y así los presentes inventores lo consideran como un control interno. El tumor intraocular se desagregó y midió 7 mm de H x 11 mm de LTD. También se identificó una extensión extraocular que medía 6 mm de H x 9 mm de LTD, que tuvo una textura característica. En la histopatología, el tumor intraocular midió 4,9 mm de H x 8,3 mm de LTD y fue >70 % necrótico, formando la mayoría de las células viables restantes el patrón similar a manga anteriormente mencionado. El tumor conjuntivo no tratado presentó mucha menos necrosis (~15 %) y el patrón de manga no fue evidente.
El objetivo de este estudio era explorar la actividad de nanopartículas similares a virus fotosensibles luz NIR en un modelo ortotópico de xenoinjerto de melanoma maligno uveal en el ojo del conejo. Todos los tumores que recibieron nanopartículas similares a virus fotosensibles tratamiento con láser respondieron favorablemente al tratamiento. Esto es particularmente evidente para tumores de pequeños a medios que tuvieron un evidente encogimiento tumoral como respuesta al tratamiento y respuestas histopatológicas completas. En el conejo 9, por ejemplo, que presentó un pequeño tumor en la semana 4, el tumor se erradicó completamente por las dos primeras dosis del tratamiento y ya no fue detectable ni clínica ni histopatológicamente dos semanas después del segundo tratamiento. En tumores más grandes, por ejemplo el conejo 4, la mayor parte del tumor fue necrótico, esto contrasta con el control no tratado (conejo 14), que solo presentó necrosis en aproximadamente el 10 % del volumen del tumor, una clara indicación de la eficacia del tratamiento. Además, varios animales que tuvieron tumores intraoculares que recibieron tratamiento completo tuvieron extensiones extraoculares que no fueron tratadas con láser; estas fracciones mostraron sustancialmente menos necrosis que las fracciones de tumor tratadas, que son más pruebas de que la eficacia del láser activó las nanopartículas similares a virus fotosensibles para el tratamiento de melanoma de la úvea. No se afectaron las áreas retinianas adyacentes a los tumores por el tratamiento.
Basándose en la respuesta tumoral intraocular tras el tratamiento, especialmente en comparación con los controles (fracciones extraoculares no tratadas), los datos proporcionados en el presente documento soportan una actividad anticancerosa selectiva y potente para nanopartículas similares a virus fotosensibles, en presencia de un tumor, para el tratamiento de melanoma ocular.
Ejemplo 18 - Ensayo de potencia in vitro que compara L1 del VPH con L1 del VPB
Se ensayó la potencia de nanopartículas similares a virus fotosensibles (por ejemplo, nanopartículas similares a virus que contienen una combinación de proteínas L1 del VPH16/31 y proteínas L2 del VPH de variante conjugadas con el colorante IR700) por un ensayo de destrucción de células in vitro. Se recogieron células de melanoma maligno uveal (por ejemplo, la estirpe celular OCM-1 o 92.1) por métodos rutinarios usando una disolución de EDTA y tripsina. Una vez retirados del plástico de cultivo de tejido, las células se suspendieron en medio de crecimiento completo y se dejó que se recuperaran durante aproximadamente 30 minutos a 37 °C. Durante este periodo de recuperación, se hicieron diluciones sucesivas de la nanopartícula similar a virus fotosensible en incrementos de aproximadamente / logaritmo (2000 pM, 600 pM, 200 pM, 60 pM, 20 pM, 6 pM, 2 pM y 0,6 pM) en PBS 2 % de suero bovino fetal. Tras el periodo de recuperación, se contaron las células, se centrifugaron y se suspendieron en PBS 2 % de FBS dando una densidad celular de 3x106/ml. Se añadió un volumen igual de suspensión de células a las disoluciones de nanopartículas similares a virus dando 1,5x106 células por ml en la concentración apropiada (1000 pM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 3 pM, 1 pM y 0,3 pM) de nanopartícula similar a virus. Estas condiciones (por ejemplo, 360 pl) se incubaron sobre hielo durante aproximadamente 1,5 a 2 horas.
Tras esta incubación, los tubos se centrifugaron para recoger las células y las células se lavaron posteriormente dos veces con PBS 2 % de FBS, sin las nanopartículas similares a virus fotosensibles. Después de la centrifugación final, las células se suspendieron en 200 pl de PBS 2 % de FBS. Se retiró 100 pl de cada muestra y se transfirió al pocillo de una placa de / área de 96 pocillos. Cada muestra se irradió entonces con 25 J/cm2 (600 mW, 43 segundos) de luz infrarroja cercana (689 nm) usando un láser oftálmico Coherent Opal Photoactivator. Tras la irradiación, la muestra de células se transfirió entonces a un nuevo tubo. Tanto las muestras irradiadas con luz como las no irradiadas se pusieron a 37 °C durante 1 a 2 horas adicionales.
Tras esta incubación se mezcló una muestra final de 20 pl de células 1:1 con tinción AOPI (naranja de acridina y yoduro de propidio) y la viabilidad de las células se evaluó usando un Nexcelom Cellometer Auto 2000. La FIG. 20 muestra efectos comparables de VPBL1 y VPHL1 sobre la viabilidad celular a la máxima concentración eficaz (CE50) (VPBL1 = 88 pm; VPHL1 = 60,5 pm), que indica que las potencias de las moléculas fotosensibles son comparable entre sí.
La FIG. 21 enseña una muestra de células del ensayo de destrucción descrito en la FIG. 20 analizado para la unión de nanopartículas similares a virus fotosensibles. Las células del ensayo de destrucción se barrieron en un gel Odyssey Clx/escáner de placas. Odyssey Clx está diseñado específicamente para la detección y cuantificación de una serie de colorantes de infrarrojos, que incluyen el colorante IR700 (por ejemplo, IRDye® 700DX). Por lo tanto, en este ensayo, las células que se trataron con diferentes concentraciones de las nanopartículas similares a virus fotosensibles muestran una cantidad dependiente de la concentración de fluorescencia asociada a las células, que indica que las células se unieron a tanto VPB-L1-IR700 como a VPH-L1-IR700.
Ejemplo 19 - Actividad de nanopartículas similares a virus fotosensibles en un modelo de xenoinjerto de cáncer de cabeza y cuello
Se implantaron células de cáncer de cabeza y cuello en el flanco lateral dorsal de ratones nu/nu. Se dejó que los tumores crecieran durante dos semanas. Una vez el tumor alcanzó un tamaño promedio de 150 mm3, los animales se aleatorizaron en 6 grupos de estudio (7 animales por grupo), del siguiente modo: Solución salina; nanopartículas similares a virus fotosensibles (L1/L2 del VPH16/31; dosis de 200 pg); solución salina luz NIR (50 J/cm2); nanopartículas similares a virus fotosensibles (dosis de 200 pg) luz NIR (50 J/cm2); nanopartículas similares a virus fotosensibles (dosis de 100 pg) luz NIR (50 J/cm2); y nanopartículas similares a virus fotosensibles (dosis 50 pg) luz NIR (50 J/cm2). La administración y el tratamiento de luz NIR se realizó cada tres días. Las mediciones de tumor se registraron cada 3-5 días.
Aunque ningún control mostró efecto sustancial para sus tratamientos respectivos, hubo una inhibición significativa del crecimiento tumoral observado en todos los grupos de dosis (FIG. 22). La inhibición observada del crecimiento tumoral fue dependiente de la dosis. Hubo una respuesta de los tumores en el grupo de dosis alta. Dos animales murieron en el grupo de tratamiento de 200 pg asociado a muerte celular masiva y toxicidades posiblemente relacionadas con el síndrome de lisis tumoral.
Ejemplo 20 - Producción de nanopartículas similares a virus fotosensibles
Para producir nanopartículas similares a virus fotosensibles de la presente divulgación, se cultivaron HEK293F en cultivo en suspensión y se transfectaron transitoriamente con un ADN de plásmido bicistrónico que codificaba proteínas de la cápside L1 (o L1 y L2). Esto induce la formación de protocápsides (como se describe en Buck et. al. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre de 2007). Tras la recuperación y la homogeneización de la masa celular, las protocápsides pasaron por tratamiento con benzonasa para eliminar los contaminantes de ADN hospedador y un proceso de maduración posterior in vitro para formar nanopartículas similares a virus estables para la conjugación. Tras la purificación, las nanopartículas similares a virus se conjugaron químicamente con IR700-éster de NHS para producir las nanopartículas similares a virus fotosensibles. La FIG. 23 muestra una representación esquemática de un proceso de producción.
Las nanopartículas similares a virus fotosensibles producidas a partir del proceso descrito en este ejemplo se han caracterizado usando SDS-PAGE, SE-HPLC y DLS y muestran purezas del 90-95 %. Las histonas de las células HEK293 están presentes como parte de la composición de nanopartículas similares a virus y comprenden de 10-15 % de la proteína total de la nanopartícula similar a virus.
Secuencias
Secuencia de nucleótidos de la proteína L1 del VPH16/31 de variante (SEQ ID NO:1)
ATGAGCCTGTGGCTGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGT
GGTG AGC ACCG ACG AGT ACGTGGCC AGG ACC A AC ATCT ACT ACC ACGCCGGC ACC AGC AGGC
TGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTTCCCCATCAAGAAGCCCAACAACAACAAGATCCTGGTG
CCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGATCCACCTGCCCGACCCCAACAAGTT
CGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGG
GCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAAC
AAGCTGGACGACACCGAGAACGCCAGCGCCTACGCCGCCAACGCCGGCGTGGACAACAGGG
AGTGCATCAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCATC
GGCGAGCACTGGGGCAAGGGCAGCCCCTGCACCAACGTGGCCGTGAACCCCGGCGACTGCCC
CCCCCTGGAGCTGATCAACACCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCG
CCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCACCAGC
ATCTGC A AGT ACCCCG ACT AC ATC A AG ATGGTG AGCG AGCCCT ACGGCG AC AGCCTGTTCTTC
TACCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACCTGTTCAACAGGGCCGGCGCCGTGGGCGA
GAACGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAGCACCGCCACCCTGGCCAACAGCA
ACTACTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGACGCCCAGATCTTCAACAAGCCC
TACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGT
GACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCCGCCATCAGCACCAGCG
AG ACC ACCT AC A AG A AC ACC A ACTTC A AGG AGT ACCTG AGGC ACGGCG AGG AGT ACG ACCT
GCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAG
CATGAACAGCACCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGCAGCCCCCCCCCGGCGGCACCC
TGGAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCGCCTGCCAGAAGCACACCCCCCCC
GCCCCCAAGGAGGACCCCCTGAAGAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTT
CAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGG
CCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGCAAGAGGAAGGCCACCCCCACCACCAGCAGCACCAGCACC
ACCGCCAAGAGGAAGAAGAGGAAGCTGTGA
Secuencia de nucleótidos de L1 del VPB1 (SEQ ID NO:2)
ATGGCCCTCTGGCAGCAGGGGCAGAAACTCTACCTGCCACCCACACCCGTGTCAAAAGTCCT
GTGTTCCGAGACATACGTCCAGCGGAAGTCAATCTTCTACCACGCCGAGACCGAAAGGCTCC
TC ACC ATCGGCC ACCCCT ACT ACCCCGTC AGC ATTGGCGCT A AG ACCGTGCCC A A AGTCTCCG
CCAACCAATACCGCGTGTTCAAGATCCAGCTGCCCGACCCAAACCAGTTCGCCCTGCCCGATC
GCACCGTGCATAACCCCTCCAAGGAAAGACTCGTCTGGGCCGTGATCGGCGTCCAAGTCTCA
CGGGGCCAACCCCTGGGCGGCACCGTGACCGGCCATCCAACCTTCAACGCCCTCCTGGACGC
CGAGAACGTCAACCGGAAAGTCACAACACAAACCACCGACGATCGCAAGCAGACCGGGCTG
GACGCCAAACAGCAGCAAATCCTCCTCCTGGGGTGCACACCCGCTGAGGGCGAGTACTGGAC
CACCGCTCGGCCCTGCGTGACCGACAGGCTGGAGAACGGGGCTTGTCCCCCCCTGGAGCTGA
AG A AT A AGC AT ATCG AGG ACGGCG ACATGATGGAGATCGGCTTCGGCGCCGCT AACTTC A AG
GAGATCAACGCCTCCAAGAGCGACCTGCCCCTGGATATCCAGAACGAAATTTGTCTCTATCCC
GATTATCTGAAGATGGCCGAAGATGCCGCCGGCAACTCAATGTTTTTCTTCGCCCGCAAGGAG
C A AGTCT ACGTGCGGC AT ATTTGG AC ACGGGGCGGG AGCG A A A AGG AGGCTCCC AC A ACCG
ACTTCTACCTGAAAAACAACAAGGGCGACGCTACACTGAAGATCCCATCCGTCCACTTCGGC
TCCCCATCCGGGAGCCTCGTCAGCACCGACAACCAGATCTTCAACAGACCATATTGGCTGTTT
AGGGCTCAAGGGATGAATAACGGCATCGCTTGGAACAACCTGCTCTTCCTGACCGTCGGCGA
TAACACCAGGGGCACCAACCTGACAATCTCCGTGGCTAGCGACGGCACACCCCTGACCGAAT
ACGACTCAAGCAAGTTTAACGTGTATCACCGGCACATGGAGGAGTACAAACTGGCTTTCATC
CTGGAACTGTGTAGCGTCGAGATTACCGCCCAGACCGTCAGCCACCTCCAGGGCCTGATGCC
AAGCGTCCTGGAGAACTGGGAGATCGGCGTCCAACCACCAACAAGCAGCATCCTGGAAGATA
CATACAGATACATCGAAAGCCCCGCCACCAAGTGCGCCTCAAACGTGATCCCCGCCAAGGAG
GATCCCTACGCCGGCTTCAAATTCTGGAATATCGACCTGAAGGAGAAACTGAGCCTCGATCT
GGACCAGTTCCCACTCGGCCGGCGGTTCCTGGCCCAACAGGGCGCTGGCTGCAGCACCGTCC
GGAAGAGGCGGATCTCACAAAAGACCAGTTCCAAACCCGCCAAGAAGAAGAAGAAGTAG

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método de producción de partículas similares a virus que se dirigen a tumor, que comprende:
(a) transfectar transitoriamente células con un ácido nucleico que codifica una o más proteínas de la cápside del virus del papiloma, formando así protocápsides,
(b) recoger las protocápsides y someter las protocápsides a un proceso de maduración in vitro, formando así partículas similares a virus, y
(c) conjugar químicamente moléculas fotosensibles con proteínas de la cápside del virus del papiloma de las partículas similares a virus, en donde cada partícula similar a virus se conjuga con aproximadamente 50 a 1000 moléculas fotosensibles, y en donde la citotoxicidad de las moléculas fotosensibles se activa por exposición a luz infrarroja, infrarroja cercana o ultravioleta.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico que codifica proteínas de la cápside del virus del papiloma.
3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa (b) comprende purificar las proteínas de la cápside.
4. El método según la reivindicación 3, en donde la etapa (b) comprende purificar usando una columna de cromatografía de afinidad por heparina.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las moléculas fotosensibles son moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además tratar las cápsides víricas de la etapa (a) con benzonasa u otros agentes para eliminar el ADN de células hospedadoras.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma humano (VPH), en cuyo caso opcionalmente, en donde las proteínas de la cápside del VPH comprenden proteínas de la cápside L1 del VPH, proteínas de la cápside L2 del VPH, o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPH y proteínas de la cápside L2 del VPH.
8. El método según la reivindicación 7, en donde las proteínas de la cápside L1 del VPH comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las proteínas de la cápside del virus del papiloma son proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano.
10. El método según la reivindicación 9, en donde las proteínas de la cápside del virus del papiloma no humano son proteínas de la cápside del virus del papiloma bovino (VPB), en cuyo caso opcionalmente,
en donde las proteínas de la cápside del VPB comprenden proteínas de la cápside L1 del VPB, proteínas de la cápside L2 del VPB, o una combinación de proteínas de la cápside L1 del VPB y proteínas de la cápside L2 del VPB, en cuyo caso opcionalmente además
en donde las proteínas de la cápside L1 del VPB comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
11. El método según la reivindicación 5, en donde las moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano se conjugan covalentemente con las proteínas de la cápside del virus del papiloma, en cuyo caso opcionalmente en donde las moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano se conjugan covalentemente con:
(a) las proteínas de la cápside del virus del papiloma mediante enlaces amida covalentes, o
(b) restos de lisina de las proteínas de la cápside del virus del papiloma.
12. El método según la reivindicación 5, en donde las moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano comprenden:
(a) moléculas fotosensibilizadoras que son promovidas hasta un estado excitado tras la absorción de luz y que se someten a un cruce intersistema con oxígeno para producir oxígeno singlete, o
(b) moléculas de colorante IR700.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (c) comprende: (a) conjugar aproximadamente 50 a aproximadamente 500 moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano con proteínas de la cápside del virus del papiloma de las partículas similares a virus,
(b) conjugar aproximadamente 200 moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano con proteínas de la cápside del virus del papiloma de las partículas similares a virus,
(c) conjugar aproximadamente 300 moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano con proteínas de la cápside del virus del papiloma de las partículas similares a virus, o
(d) conjugar aproximadamente 400 moléculas de colorante de ftalocianina de infrarrojos cercano con proteínas de la cápside del virus del papiloma de las partículas similares a virus.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células son células de mamífero y son células de riñón embrionario humano (HEK), en cuyo caso opcionalmente,
en donde las células HEK son células HEK293.
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ES (2) ES2729841T3 (es)
HU (1) HUE043463T2 (es)
MX (1) MX385842B (es)
PL (1) PL3046583T3 (es)
PT (1) PT3046583T (es)
TR (1) TR201907128T4 (es)
WO (1) WO2015042325A1 (es)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107252489A (zh) 2009-04-13 2017-10-17 法国健康和医学研究院 Hpv颗粒及其用途
US8524239B2 (en) 2010-07-09 2013-09-03 The United States of America as represented by the Secrectary, Department of Health and Human Services Photosensitizing antibody-fluorophore conjugates
US9700639B2 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
MX385842B (es) 2013-09-18 2025-03-18 Aura Biosciences Inc Conjugados de partículas de tipo virus y uso de las mismas.
WO2015187651A1 (en) * 2014-06-02 2015-12-10 Li-Cor, Inc. Therapeutic and diagnostic probes
ES2743458T5 (es) 2014-08-08 2023-06-08 Us Health Eliminación fotocontrolada de dianas in vitro e in vivo
CN114699525A (zh) 2015-08-18 2022-07-05 乐天医药生技股份有限公司 酞菁染料偶联物的制造方法及稳定偶联物
EP3827846B1 (en) 2015-08-18 2024-10-02 Rakuten Medical, Inc. Compositions, combinations and related methods for photoimmunotherapy
AU2016343722A1 (en) * 2015-10-30 2018-05-24 Aleta Biotherapeutics, Inc. Targeted cancer therapy
CN107789743A (zh) * 2016-08-31 2018-03-13 北京至感传感器技术研究院有限公司 无创肿瘤治疗装置
AU2018251788B2 (en) * 2017-04-12 2025-04-10 Aura Biosciences, Inc. Targeted combination therapy
MX2019015769A (es) 2017-06-23 2020-08-03 Verimmune Inc Partículas tipo virus quiméricas y usos de estas como redireccionadores de respuestas inmunitarias específicos para el antígeno.
EP3668518A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Li-Cor, Inc. Sonodynamic therapy
US12203935B2 (en) 2018-02-14 2025-01-21 The University Of Houston System Probe for universal detection of circulating tumor cells
JP7641005B2 (ja) 2018-12-27 2025-03-06 ヴェリミューン インコーポレイテッド コンジュゲート型ウイルス様粒子および抗腫瘍免疫リダイレクタとしてのその使用
WO2020198344A1 (en) 2019-03-26 2020-10-01 Aura Biosciences, Inc. Human papillomavirus nanoparticle formulations
TW202102272A (zh) 2019-03-29 2021-01-16 美商樂天醫藥生技股份有限公司 光免疫療法之方法及相關之生物標記
GB201917487D0 (en) 2019-11-29 2020-01-15 Oxular Ltd Methods for the treatment of retinoblastoma
CN115942958A (zh) 2020-04-10 2023-04-07 乐天医药生技股份有限公司 酞菁染料化合物、缀合物及其使用方法
MX2023004465A (es) 2020-10-19 2023-06-19 Verimmune Inc Composiciones basadas en virus y métodos para redirigir respuestas inmunitarias preexistentes mediante su uso para el tratamiento del cáncer.
EP4284912A4 (en) * 2021-01-27 2024-11-27 Vanderbilt University COMBINATION OF INTRACELLULAR AND EXTRACELLULAR PHOTOSENSITIZERS FOR THE TREATMENT OF BACTERIAL INFECTIONS
WO2023038927A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Aura Biosciences, Inc. Bladder cancer therapies
DE102023004548A1 (de) 2023-11-07 2025-05-08 Biolitec Research Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Behandlung von Tumoren
DE102023004549A1 (de) 2023-11-07 2025-05-08 Biolitec Research Gmbh Vorrichtung und verfahren zur behandlung von dysplasien
CN118986895B (zh) * 2024-07-31 2025-10-24 山东第一医科大学附属眼科医院(山东省眼科医院) 一种可见光催化交联的病毒样氧化钌纳米颗粒用于高效跨膜治疗圆锥角膜

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
JP3038339B2 (ja) * 1988-05-02 2000-05-08 ザイナクシス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド バイオ粒子の表面膜に対してバイオアフェクティング物質を結合する化合物
US5126129A (en) 1988-05-23 1992-06-30 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Cancer therapy using interleukin-2 and flavone compounds
WO1991003162A1 (en) 1989-08-31 1991-03-21 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5290551A (en) 1990-05-08 1994-03-01 Thomas Jefferson University Treatment of melanoma with a vaccine comprising irradiated autologous melanoma tumor cells conjugated to a hapten
DE69123979T2 (de) 1990-10-12 1997-04-30 Max Planck Gesellschaft Abgeänderte ribozyme
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US20030206887A1 (en) 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5478556A (en) 1994-02-28 1995-12-26 Elliott; Robert L. Vaccination of cancer patients using tumor-associated antigens mixed with interleukin-2 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
US5783169A (en) 1995-07-26 1998-07-21 Brookhaven Science Associates Llc Rigid bifunctional chelating agents
ATE373672T1 (de) 1996-01-16 2007-10-15 Sirna Therapeutics Inc Synthese von methoxynukleoside und enzymatische nukleisäure moleküle
IT1283218B1 (it) * 1996-03-08 1998-04-16 Bracco Spa Polichelanti, loro complessi con ioni metallici, loro preparazione e loro usi
CA2257822A1 (en) 1996-07-17 1998-01-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services Infectious papillomavirus pseudoviral particles
US6180389B1 (en) 1997-01-03 2001-01-30 The Research And Development Institute, Inc. Virion-constrained nanoparticles comprising a plant virion coat protein shell and encapsulated guest molecules
AU747602B2 (en) 1997-06-04 2002-05-16 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector
DE69835294T2 (de) 1997-09-05 2007-07-26 Medimmune, Inc. Methode zur in vitro auseinander- und wiederzusammensetzung von papillomavirus virusähnlichen teilchen (vlps)
US7351533B2 (en) 1997-09-05 2008-04-01 Medimmune, Inc. In vitro method for disassmbly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (VLPs). Homogeneous VLP and cavsomere compositions produced by said methods: use thereof as vehicle for improved purification, and delivery of active agents
FR2768749A1 (fr) 1997-09-22 1999-03-26 Inst Nat Sante Rech Med Virus artificiels derives de papillomavirus, et leurs utilisations, notamment en therapie genique
AU5298699A (en) 1998-08-13 2000-03-06 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Dnazymes and methods for treating hpv-related disorders
US6991795B1 (en) 1998-08-14 2006-01-31 Merck & Co., Inc. Protein delivery system using human papillomavirus virus-like particles
US20050112141A1 (en) 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20040146531A1 (en) 1999-09-30 2004-07-29 Active Biotech Ab Virus-like particles devoid of HPV 16 type-specific antibody epitopes as carriers of peptides for introduction into cells
EP2333065B1 (en) 2000-01-28 2017-03-15 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services MHC class II restricted T cell epitopes from the cancer antigen NY ESO-1
CN1114690C (zh) 2001-05-15 2003-07-16 乔良 乳头瘤假病毒及其制备方法
EP1432799A2 (en) 2001-07-17 2004-06-30 Anne Josephine Milner Silencing of gene expression by sirna
US20030129583A1 (en) 2002-01-08 2003-07-10 Martin William John Therapy of stealth virus associated cancers and other conditions using light
WO2003061696A2 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Light Sciences Corporation Systems and methods for photodynamic therapy
AU2003272187A1 (en) 2002-02-01 2004-01-06 Montana State University Novel nanoparticles and use thereof
WO2003068163A2 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of chimeric virus-like particles for expression in insect cells
JP4212921B2 (ja) 2002-03-29 2009-01-21 独立行政法人科学技術振興機構 抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子
JP2003286189A (ja) 2002-03-29 2003-10-07 Japan Science & Technology Corp 中空ナノ粒子を形成するタンパク質に疾患治療用の細胞導入物質を融合させた薬剤
AU2003239531A1 (en) 2002-05-17 2003-12-02 Montana State University Protein cages for the delivery of medical imaging and therapy
ATE489969T1 (de) 2002-06-20 2010-12-15 Cytos Biotechnology Ag Verpackte virusartige partikel in kombination mit cpg zur verwendung als adjuvantien mit allergenen. herstellungsverfahren und verwendung
US20060141042A1 (en) 2002-06-28 2006-06-29 Shunichi Kuroda Hollow nanoparticle having modified cysteine residue and drug with the use thereof
JP2004261002A (ja) 2003-01-08 2004-09-24 Tsutomu Suzuki ｓｉＲＮＡの製造方法
WO2005051431A1 (en) 2003-11-25 2005-06-09 The University Of York Colloidal delivery system for biological therapeutic agents
AU2005220734A1 (en) 2004-02-27 2005-09-22 Dow Global Technologies Inc. High efficiency peptide production in plant cells
US20060216238A1 (en) * 2005-02-28 2006-09-28 Marianne Manchester Compositions and methods for targeting or imaging a tissue in a vertebrate subject
US8067572B2 (en) 2005-05-25 2011-11-29 The University Of York Hybrid interfering RNA
GB2426687A (en) 2005-05-26 2006-12-06 Jason Kershaw Inter-engaging fasteners
JP5077914B2 (ja) 2005-08-05 2012-11-21 シンジーテック株式会社 電子写真装置用ポリウレタン部材
CA2558601A1 (en) 2005-09-14 2007-03-14 Japan Science And Technology Agency Substance carrier using hollow nanoparticle of hepatitis b virus protein and liposome, and method of introducing substance into cell
WO2008048288A2 (en) 2005-11-09 2008-04-24 Montana State University Novel nanoparticles and use thereof
US20110104051A1 (en) 2006-03-27 2011-05-05 The Regents Of The University Of California Chemically Modified Viral Capsids as Targeted Delivery Vectors for Diagnostic and Therapeutic Agents
US7700541B2 (en) * 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
CN100415859C (zh) 2006-07-28 2008-09-03 上海应用技术学院 薰衣草纳米精油的制备方法
WO2008016297A1 (en) 2006-08-01 2008-02-07 Dolphys Technologies B.V. Drug delivery device comprising a pharmaceutically or biologically active component and an infrared absorbing compound
KR100962301B1 (ko) 2006-11-03 2010-06-11 재단법인서울대학교산학협력재단 자궁경부암을 위한 치료용 조성물
US20090035389A1 (en) 2007-02-23 2009-02-05 Specigen Inc. Targeted protein cages
US20130136689A1 (en) * 2007-06-05 2013-05-30 Christian Rohlff Proteins
CA2686990C (en) * 2007-05-08 2018-04-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Papillomavirus pseudoviruses for detection and therapy of tumors
WO2009046738A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc)
WO2009106999A2 (en) 2008-02-28 2009-09-03 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung Des Öffentlichen Rechts Hollow nanoparticles and uses thereof
CA2735006A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
WO2010047839A1 (en) 2008-10-25 2010-04-29 Aura Biosciences Modified plant virus particles and uses therefor
CN107252489A (zh) 2009-04-13 2017-10-17 法国健康和医学研究院 Hpv颗粒及其用途
US20120184495A1 (en) * 2009-06-12 2012-07-19 Amrita Vishwa Vidyapeetham University Kerala Targeted nano-photomedicines for photodynamic therapy of cancer
US8993715B2 (en) 2009-07-06 2015-03-31 Canon Kabushiki Kaisha Labeled protein and method for obtaining the same
WO2011039646A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Papilloma virus -like particles for targeted gene delivery
US20120207840A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Diagnostic Or Therapeutic Agents For The Treatment Of Non-Melanoma Skin Cancer
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2013009717A1 (en) 2011-07-10 2013-01-17 Elisabet De Los Pinos Virion derived protein nanoparticles for delivering diagnostic or therapeutic agents for the treatment of skin-related diseases
JP2014231477A (ja) 2011-09-21 2014-12-11 シャープ株式会社 アルコキシ基を有する遷移金属錯体、及びこれを用いた有機発光素子、色変換発光素子、光変換発光素子、有機レーザーダイオード発光素子、色素レーザー、表示装置、照明装置並びに電子機器
US20130115247A1 (en) * 2011-11-05 2013-05-09 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Radioisotopes For The Diagnosis And Treatment Of Malignant And Systemic Disease And The Monitoring Of Therapy
US20130116408A1 (en) * 2011-11-05 2013-05-09 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Radioisotopes For The Diagnosis And Treatment Of Malignant And Systemic Disease And The Monitoring Of Therapy
KR102013801B1 (ko) * 2011-12-01 2019-08-23 유니버시티 오브 케이프 타운 Ｈｐｖ 키메라 입자
US9700639B2 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
AU2013312838B2 (en) 2012-09-04 2018-11-29 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2014170389A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Tilt Biotherapeutics Oy Enhanced adoptive cell therapy
US20160024469A1 (en) 2013-07-29 2016-01-28 Allan Yang Wu Non-conventional Cellular Based Immunotherapy
MX385842B (es) 2013-09-18 2025-03-18 Aura Biosciences Inc Conjugados de partículas de tipo virus y uso de las mismas.
WO2015075468A1 (en) 2013-11-21 2015-05-28 Ucl Business Plc Cell
ES2792849T3 (es) 2014-02-10 2020-11-12 Univ Emory Expresión de polipéptido químico con receptores de linfocitos variables en células inmunes y usos para tratar el cáncer
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
GB201503776D0 (en) 2015-03-05 2015-04-22 Pci Biotech As Compound and method
EP3827846B1 (en) 2015-08-18 2024-10-02 Rakuten Medical, Inc. Compositions, combinations and related methods for photoimmunotherapy
AU2016343722A1 (en) 2015-10-30 2018-05-24 Aleta Biotherapeutics, Inc. Targeted cancer therapy
US20180311374A1 (en) 2015-10-30 2018-11-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Targeted cancer therapy
AU2018251788B2 (en) 2017-04-12 2025-04-10 Aura Biosciences, Inc. Targeted combination therapy

Also Published As

Publication number Publication date
US11806406B2 (en) 2023-11-07
MX385842B (es) 2025-03-18
JP2016531591A (ja) 2016-10-13
US20160228568A1 (en) 2016-08-11
EP3046583A4 (en) 2017-05-03
AU2022202408B2 (en) 2025-07-10
CN120617536A (zh) 2025-09-12
AU2020201799A1 (en) 2020-03-26
US10117947B2 (en) 2018-11-06
JP2019013249A (ja) 2019-01-31
PT3046583T (pt) 2019-05-30
TR201907128T4 (tr) 2019-06-21
KR20160079779A (ko) 2016-07-06
EP3046583B1 (en) 2019-02-13
DK3046583T3 (da) 2019-05-20
AU2020201799B2 (en) 2022-04-28
WO2015042325A1 (en) 2015-03-26
CA2924684A1 (en) 2015-03-26
CN105979967A (zh) 2016-09-28
US20220088216A1 (en) 2022-03-24
EP3517130B1 (en) 2022-03-30
US10588984B2 (en) 2020-03-17
MX2016003660A (es) 2016-12-20
AU2014323424A1 (en) 2016-04-21
HUE043463T2 (hu) 2019-08-28
JP2020005662A (ja) 2020-01-16
US11110181B2 (en) 2021-09-07
EP4059521A1 (en) 2022-09-21
AU2014323424B2 (en) 2019-12-19
KR102257009B1 (ko) 2021-05-27
US20190083647A1 (en) 2019-03-21
ES2729841T3 (es) 2019-11-06
AU2022202408A1 (en) 2022-05-05
EP3517130A1 (en) 2019-07-31
US20220387619A2 (en) 2022-12-08
CA2924684C (en) 2021-02-09
US20240216527A1 (en) 2024-07-04
JP6685365B2 (ja) 2020-04-22
JP6444417B2 (ja) 2018-12-26
EP3046583A1 (en) 2016-07-27
US20200188529A1 (en) 2020-06-18
US12029794B2 (en) 2024-07-09
BR112016005917A2 (pt) 2017-09-26
US20210393797A1 (en) 2021-12-23
PL3046583T3 (pl) 2019-10-31

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