ES2915413T3 - Ensayo para la detección del virus de la hepatitis B (VHB) - Google Patents
Ensayo para la detección del virus de la hepatitis B (VHB)Info
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Abstract
Un método para detectar el virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra sospechosa de contener VHB, cuyo método comprende: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un ser humano con un conjunto de secuencias de oligonucleótidos y reactivos para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos, en donde el conjunto de secuencias de oligonucleótidos comprende (i) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende SEQ ID NO: 1; (ii) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (iii) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; y (iv) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 4, en donde cada una de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas comprende una marca detectable, (b) amplificar una primera secuencia diana de ácido nucleico del VHB presente en la muestra, (c) hibridar la primera y segunda sondas de oligonucleótidos con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana, y (d) detectar la hibridación de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana evaluando una señal de cada una de las marcas detectables, con lo que (i) la presencia de las señales indica la hibridación de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y la segunda sondas con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana y la presencia de VHB en la muestra, y (ii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VHB en la muestra, y en donde las etapas (a)-(d) se realizan en aproximadamente dos horas a partir de la muestra.
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayo para la detección del virus de la hepatitis B (VHB)
Incorporación como referencia del material presentado electrónicamente
Se incorpora como referencia en su totalidad en el presente documento una lista de secuencias de nudeótidos/aminoácidos legible por ordenador enviada al mismo tiempo e identificada de la siguiente manera: Un archivo ASCII (texto) de 1460 bytes denominado "2017_09_27_13122USL1-SEQ-LIST.txt", creado el 27 de septiembre de 2017.
Antecedentes de la invención
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN que contiene un genoma parcialmente de doble hebra de aproximadamente 3,2 kb (Liang et al., Hepatology, 49(5): S13-21 (2009), Lok et al., Hepatology, 34(6):1225-41 (2001), y Hepatitis and Liver y Cancer: A National Strategy for Prevention and Control of Hepatitis B and C. Colvin HM, Mitchell AE, Editors. 2010: Washington (DC)). El VHB es uno de los agentes infecciosos más extendidos en el mundo y el más común de varios virus en todo el mundo que puede causar infección crónica de por vida, cirrosis (cicatrización) del hígado, cáncer de hígado, insuficiencia hepática y muerte (Liang et al., Hepatology, 49(5): S13-21 (2009)). A partir de 2016, aproximadamente 240 millones de personas en todo el mundo tienen hepatitis B crónica y aproximadamente 686000 personas mueren cada año debido a complicaciones de la hepatitis B, tales como cirrosis y cáncer de hígado (Organización Mundial de la Salud: Centro de Prensa; Hoja Informativa sobre la Hepatitis B. www.who.int/mediaventre/factsheets/fs204/en/). Una ruta común de infección es la transmisión de madre a hijo al nacer o durante la primera infancia (Gentile et al., Int J Womens Health, 6:605-11 (2014), Srivastava et al., J Pediatric Gastroenterology Nutr, 59(3):393-7 (2014), y Yeung et al., Liver Int, 30(1):5-18 (2010)). Otros factores de riesgo para la infección por VHB incluyen el uso de drogas por vía intravenosa, hemofilia, actividad sexual de alto riesgo, hemodiálisis, lesiones por pinchazos de agujas en el personal de atención médica y perforaciones y tatuajes en el cuerpo. Schweitzer et al., Lancet, 386(10003):1546-1555 (2015)).
El VHB tiene una diversidad genética significativa dentro de nueve genotipos de VHB conocidos (A-I) y regiones altamente conservadas. La hepatitis se diagnostica en gran medida a través de la serología (p. ej., antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno central de la hepatitis y anticuerpo de superficie de la hepatitis B). Las pruebas de ácido nucleico (NAT) para el ADN del VHB se utilizan como ayuda en el manejo de pacientes con infección crónica por el VHB que reciben terapia antiviral, para medir los niveles de ADN del VHB al inicio y durante el tratamiento para ayudar a evaluar la respuesta al tratamiento (Terrault et al., Hepatology, 63(1):261-282 (2015)). Sin embargo, muchas pruebas de ácido nucleico existentes utilizan una sola sonda para detectar y cuantificar el ADN del VHB. Tales métodos de detección de sonda única pueden dar como resultado una subcuantificación o falta de detección de algunas variantes raras del VHB y variantes emergentes debido a mutaciones dentro de la región de la sonda. Las pruebas de ácido nucleico también se realizan normalmente con reactivos de PCR proporcionados en formato líquido que requieren almacenamiento congelado y pruebas por lotes, y el tiempo de preparación de la muestra y la PCR en tiempo real pueden exceder varias horas para algunas pruebas. Las Na T también son propensas a errores de manejo, tales como la contaminación, y los niveles de ADN pueden caer por debajo del límite de detección cuando se resuelve el pico inicial del virus, especialmente cuando se analizan muestras agrupadas.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos y sistemas de detección del VHB que (i) detecten el VHB de manera confiable a pesar de la diversidad genética significativa del VHB, (ii) se proporcionen en un formato que elimine o reduzca los requisitos de almacenamiento y el desperdicio de reactivos de PCR, y (iii) puedan ser realizados rápidamente. La presente descripción proporciona tales métodos y sistemas.
Breve compendio de la invención
La presente divulgación proporciona un conjunto de secuencias de oligonucleótidos para amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico del virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra, que comprende: (a) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (c) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; y (d) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 4, en donde cada una de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas comprende una marca detectable. También se proporciona un método para detectar el VHB humano en una muestra utilizando el conjunto de oligonucleótidos mencionado anteriormente.
También se divulga, pero no forma parte de la invención, un kit para detectar el virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra que comprende: (a) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende la SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (c) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; (d) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 4; (e) reactivos para amplificar y detectar secuencias de
ácido nucleico; y (f) instrucciones de uso, en donde cada una de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas comprende una marca detectable.
También se divulga, pero no forma parte de la invención, una composición que comprende secuencias de oligonucleótidos para amplificar y detectar un virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra, que comprende: (a) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (c) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; y (d) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 4, en donde cada una de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas comprende una marca detectable.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un gráfico que muestra que el ensayo ALINITYm HBV es lineal desde 7 UI/ml hasta 2.000. 000.000 UI/ml con un valor R de 0,998 en plasma (para el genotipo A).
La FIG. 2 es un gráfico que muestra que el ensayo ALINITYm™ HBV es lineal desde 7 UI/ml hasta 2.000. 000.000 UI/ml con un valor R de 0,999 en suero (para el genotipo A).
La FIG. 3 es un gráfico que muestra que el ensayo ALINITYm™ HBV es lineal desde 10 UI/ml hasta 1.000. 000.000 UI/ml en plasma para los genotipos de VHB B, C, D, E, F, G, H e I.
La FIG. 4 es un gráfico que muestra que el ensayo ALINITYm™ HBV es lineal desde 10 UI/ml hasta 1.000. 000.000 UI/ml en suero para los genotipos de VHB B, C, D, E, F, G, H e I.
La FIG. 5 es un gráfico que representa la solidez de la señal del control interno (CI) dentro del rango lineal de la carga viral del VHB.
La FIG. 6 es una serie de gráficos que representan los resultados de la amplificación y detección de una secuencia diana de HBsAg mediante el sistema REALTIME™ m2000 HBV de Abbott (F iG. 6A) y el conjunto de oligonucleótidos descritos en el presente documento (sistema ALINITYm™ HBV) (FIG. 6B). El eje x corresponde al número de ciclo de RT-PCR y el eje y corresponde a la intensidad de la señal FAM. En la FIG.
6B, la "sonda primaria" corresponde a SEQ ID NO: 3, y la "sonda secundaria" corresponde a SEQ ID NO: 4. La FIG. 7 es una serie de gráficos que representan los resultados de la amplificación y detección del genotipo C del VHB (bloque de genes 0T00) en comparación con una secuencia del VHB de tipo salvaje (WT) utilizando sistema REALTIME™ m2000 HBV de Abbott con una sonda mutC (FIG. 7A) y el conjunto de oligonucleótidos descritos en el presente documento (sistema ALINITYm™ HBV) (FIG. 7B). El eje x corresponde al número de ciclo de RT-PCR y el eje y corresponde a la intensidad de la señal FAM. La "sonda secundaria" corresponde a SEQ ID NO: 4
La FIG. 8 es un gráfico que representa las curvas de amplificación por PCR en el rango de linealidad de paneles diana que contienen de 1 LOG a 9 LOG lU/mL de VHB de genotipo G en plasma a través de la extracción de muestras y utilizando reactivos de amplificación de VHB, como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados de dos rondas se combinaron en un gráfico.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona un conjunto de oligonucleótidos para amplificar y detectar el virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra. El término "oligonucleótido", como se emplea en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico corta que comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 nucleótidos (p. ej. aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 nucleótidos, o un rango definido por cualquiera de los valores anteriores). Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" como se emplean en el presente documento se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula y, por lo tanto, incluyen ADN de hebra doble y sencilla, y ARN de hebra doble y sencilla. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN elaborados a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, por ejemplo, polinucleótidos metilados y/o protegidos. Los ácidos nucleicos típicamente están conectados a través de enlaces fosfato para formar secuencias de ácido nucleico o polinucleótidos, aunque en la técnica se conocen muchas otras conexiones (p. ej., fosforotioatos, boranofosfatos y similares).
Los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra, o pueden contener porciones de secuencias tanto de doble hebra como de hebra sencilla. El oligonucleótido puede ser ADN, tanto ADN genómico como complementario (ADNc), ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribo y ribonucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los oligonucleótidos se pueden obtener por métodos de síntesis química o por métodos recombinantes. Una secuencia de oligonucleótidos particular puede abarcar variantes de la misma modificadas de forma conservativa (p. ej., sustituciones de codones), alelos, ortólogos, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada.
Oligonucleótidos del cebadores y sondas
Los oligonucleótidos se utilizan en una variedad de aplicaciones en biotecnología, tales como, por ejemplo, la síntesis de genes artificiales, como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la secuenciación del ADN y como sondas moleculares. En una realización, los oligonucleótidos descritos en el presente documento se pueden utilizar como cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos o como sondas para la hibridación y detección de ácidos nucleicos. Los términos "cebador", "secuencia cebadora" y "oligonucleótido cebador", como se emplean en el presente documento, se refieren a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de un producto de extensión del cebador que es una hebra complementaria de ácido nucleico (todos los tipos de ADN o ARN), cuando se colocan en condiciones de amplificación adecuadas (p. ej., tampón, sal, temperatura y pH) en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización de ácidos nucleicos (p. ej., una polimerasa dependiente de ADN o dependiente de ARN). Un cebador puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. Si es de doble hebra, el cebador se puede tratar primero (p. ej., desnaturalizar) para permitir la separación de sus hebras antes de ser utilizado para preparar productos de extensión. Tal etapa de desnaturalización se realiza típicamente utilizando calor, pero alternativamente se puede llevar a cabo utilizando álcali, seguido de neutralización. Los cebadores de la presente divulgación pueden ser de cualquier tamaño adecuado, y deseablemente comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en aproximadamente 15 a 50 nucleótidos, aproximadamente 20 a 40 nucleótidos, o aproximadamente 22 a 30 nucleótidos. Los cebadores de la presente divulgación pueden contener nucleótidos adicionales además de los descritos en el presente documento. Por ejemplo, dependiendo del tipo de procedimiento de amplificación empleado, los cebadores pueden incluir, por ejemplo, un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción 5' con respecto a la secuencia de unión diana (véanse, p. ej., las Patentes de estados Unidos Núm. 5.270.184 y 5.455.166), o un promotor de ARN polimerasa conectado a la secuencia de unión diana del cebador. Un "cebador directo" es un cebador que hibrida (o se reasocia) con una secuencia de ácido nucleico diana (p. ej., hebra molde) para la amplificación. Un "cebador inverso" es un cebador que hibrida (o se reasocia) con la hebra complementaria de la secuencia diana durante la amplificación. Un cebador directo hibrida con una secuencia diana 5' con respecto a un cebador inverso.
Los términos "sonda", "secuencia sonda" y "oligonucleótido sonda" se refieren a un oligonucleótido que se puede hibridar selectivamente con al menos una porción de una secuencia diana en condiciones de amplificación apropiadas (p. ej., una porción una secuencia diana que se ha amplificado). En general, una secuencia sonda se identifica como "complementaria" (es decir, complementaria a la hebra codificante o efectora (+)) o "complementaria inversa" (es decir, complementaria a la hebra antisentido (-)). Las sondas de la presente divulgación pueden ser de cualquier tamaño adecuado y deseablemente comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en aproximadamente 10-50 nucleótidos, aproximadamente 12-35 nucleótidos o aproximadamente 14-25 nucleótidos.
Como se emplean en el presente documento, los términos "conjunto", "conjunto de cebadores", "conjunto de sondas" y "conjunto de cebadores y sondas" se refieren a dos o más cebadores oligonucleotídicos que, juntos, son capaces de cebar la amplificación de una secuencia diana o de un ácido nucleico diana de interés (p. ej., una secuencia diana dentro del VHB) y/o al menos una sonda que puede detectar la secuencia diana o el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones que no forman parte de la invención, el término "conjunto de cebadores" se refiere a un par de cebadores que incluye un cebador directo (o cebador 5' (aguas arriba)) que hibrida con el extremo 5' de la secuencia diana o ácido nucleico diana que se van a amplificar y un cebador inverso (o cebador 3' (aguas abajo)) que hibrida con el complemento de la secuencia diana o ácido nucleico diana que se van a amplificar. Tales conjuntos de cebadores o pares de cebadores son particularmente útiles en las reacciones de amplificación por PCR.
El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento se puede utilizar para amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico del VHB diana en una muestra. Los términos "secuencia diana" y "ácido nucleico diana" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia de ácido nucleico específica, cuya presencia o ausencia se detectará mediante el método divulgado. En el contexto de la presente divulgación, una secuencia diana incluye preferiblemente una secuencia de ácido nucleico con la que hibridarán uno o más cebadores y a partir de la cual se iniciará la amplificación. La secuencia diana también puede incluir una región de hibridación de la sonda con la que una sonda puede formar un híbrido estable en condiciones de amplificación apropiadas. Una secuencia diana puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. Las secuencias cebadora y sonda descritas en el presente documento se pueden dirigir a cualquier secuencia de ácido nucleico adecuada, o combinación de secuencias, presente en el genoma del VHB. El genoma del VHB es un virus de ADN con envoltura que pertenece a la familia Hepadnaviridae. Contiene un pequeño genoma de ADN circular relajado (ADNrc) parcialmente de doble hebra (DH) que se replica mediante la transcripción inversa de un ARN intermedio, el ARN pregenómico (ARNpg). El genoma del VHB tiene entre 3182 y 3248 pares de bases (pb) según el genotipo. El genoma del VHB codifica cuatro marcos de lectura abiertos (ORF) solapantes que se traducen a proteína central viral, proteínas de superficie, polimerasa/transcriptasa inversa (RT) y proteína x de hepatitis B (HBx). Se han identificado al menos nueve genotipos (A-1) y más de 24 subtipos de v Hb en todo el mundo.
El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente o consistir en cualquier número de oligonucleótidos cebadores y sondas para amplificar y detectar cualquier número
adecuado de secuencias de ácido nucleico del VHB. En una realización que no forma parte de la invención, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en dos o más cebadores que amplifican una secuencia de ácido nucleico del VHB que comprende al menos una porción del gen del antígeno de superficie del VHB para producir un único amplicón de VHB y al menos dos sondas que hibridan con dos regiones diferentes del único amplicón del VHB. Una "porción" de una secuencia de ácido nucleico comprende al menos diez nucleótidos (p. ej., de aproximadamente 10 a aproximadamente 5.000 nucleótidos). Preferiblemente, una "porción" de una secuencia de ácido nucleico comprende 10 o más (p. ej., 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más, 50 o más, o 100 o más) nucleótidos, pero menos de 5.000 (p. ej., 4.900 o menos, 4.000 o menos, 3.000 o menos, 2.000 o menos, 1.000 o menos, 800 o menos, 500 o menos, 300 o menos, o 100 o menos) nucleótidos. Como se emplea en el presente documento, el término "amplicón" se refiere a un producto de una reacción de amplificación natural o artificial. En una realización que no forma parte de la invención, por ejemplo, la primera secuencia de ácido nucleico de VHB diana comprende una secuencia de ácido nucleico altamente conservada que comprende al menos una porción del gen del antígeno de superficie del VHB.
En una realización, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en (a) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (c) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; y (d) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende s Eq ID NO: 4 (también denominada ALINITYm™ HBV).
El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento comprende un diseño de "sonda doble", en contraste con otras pruebas de ácido nucleico de VHB disponibles en el mercado que utilizan una única sonda para detectar y cuantificar el ADN del VHB (p. ej., REALTIME™ HBV de Abbott) (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL; COBAS® HBV para COBAS® 4800 System (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA); COBAS® HBV para COBAS® 6800/8800 System (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA; y ensayo VERIs/MDx® HBV (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA)). El tiempo de respuesta para la preparación de la muestra y la PCR en tiempo real para estos sistemas de detección de "sonda única" puede superar las 6 horas en algunos casos. Por el contrario, los métodos de amplificación y detección descritos en el presente documento permiten un análisis de muestra a resultado en aproximadamente dos horas a partir de un espécimen de sangre. Además, como se discutió anteriormente, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento mejora la confiabilidad de detección de múltiples genotipos de VHB, ya que el conjunto amplifica y detecta una región altamente conservada del genoma de VHB.
Se pueden modificar uno cualquiera o una combinación de los oligonucleótidos descritos en el presente documento de cualquier manera adecuada para estabilizar o mejorar la afinidad de unión (también denominada "temperatura de fusión" o "Tm") de un oligonucleótido cebador o sonda para su diana. A este respecto, una secuencia de oligonucleótidos como se describe en el presente documento puede comprender una o más bases de oligonucleótidos modificadas. Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos puede comprender una o más bases modificadas con propino, en donde el oligonucleótido comprende un alquino con la fórmula química CH3CECH. Las una o más bases modificadas con propino pueden incluir, por ejemplo, 5-(1-propinil)-2'-desoxi-Uridina (pdU) y/o 5-(1-propinil)-2'-desoxiCitidina (pdC).
Cualquiera de las secuencias de oligonucleótidos de la invención descritas en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en un complemento de cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento. Los términos "complemento" o "secuencia complementaria", como se emplean en el presente documento, se refieren a una secuencia de ácido nucleico que forma un dúplex estable con un oligonucleótido descrito en el presente documento mediante las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick, y típicamente comparte una identidad mayor de aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94% aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% con el oligonucleótido de la invención. La identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede determinar utilizando cualquier algoritmo matemático adecuado o soporte lógico informático conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, CLUSTAL-W, T-Coffee y ALIGN (para el alineamiento de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos), programas BLAST (p. ej., BLAST 2.1 BL2SEQ y versiones posteriores del mismo) y programas FASTA (p. ej., FASTA3*, FASTM y SSEARCH) (para búsquedas de alineamiento de secuencias y similitud de secuencias). Los algoritmos de alineamiento de secuencias también son descritos, por ejemplo, porAltschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990); Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Prohalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido (2009); Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005); Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997); y Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge Reino Unido (1997)).
Los oligonucleótidos descritos en el presente documento se pueden preparar utilizando cualquier método adecuado, una variedad de los cuales se conoce en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, 2. Sup. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nueva York, N.Y.; M. A. Innis (Ed.), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: Nueva York, N.Y. (1990); P. Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes - Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Parts I and II), Elsevier Science (1993); M. A. Innis (Ed.), Pc R Strategies, Academic Press: Nueva York, N.Y. (1995); y F. M. Ausubel (Ed.), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons: Secaucus, N.J. (2002); Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109-151 (1979); y Belousov et al., Nucleic Acids Res., 25: 3440-3444 (1997)). Los pares de cebadores también se pueden diseñar utilizando una variedad de herramientas, tales como la herramienta Primer-BLAST proporcionada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). La síntesis de oligonucleótidos se puede realizar en sintetizadores de oligonucleótidos tales como los disponibles comercialmente de Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) o Milligen (Bedford, MA). Alternativamente, los oligonucleótidos se pueden fabricar a la medida y obtener a partir de una variedad de fuentes comerciales bien conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), Eurofins Scientific (Louisville, KY), BioSearch Technologies, Inc. (Novato, CA), y similares. Los oligonucleótidos se pueden purificar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, electroforesis nativa en gel de acrilamida, HPLC de intercambio aniónico (véase, p. ej., Pearson et al., J. Chrom., 255: 137-149 (1983)), y HPLC de fase inversa (véase, p. ej., McFarland et al., Nucleic Acids Res., 7: 1067-1080 (1979)).
La secuencia de los cebadores y las sondas se puede verificar utilizando cualquier método de secuenciación adecuado conocido en la técnica, que incluye, sin limitarse a, degradación química (véase, por ejemplo, Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499-560 (1980)), espectrometría de masas de desorción-ionización por láser asistida por matriz con detector de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (véase, p. ej., Pieles et al., Nucleic Acids Res., 21: 3191-3196 (1993)), espectrometría de masas después de una combinación de digestiones con fosfatasa alcalina y exonucleasa (Wu et al. Anal. Biochem., 290: 347-352 (2001)), y similares.
Los oligonucleótidos cebador y sonda descritos en el presente documento comprenden deseablemente una temperatura de fusión (Tm) en el rango de 45°C a 80°C. De acuerdo con la presente divulgación, los oligonucleótidos hibridan específicamente con una secuencia de ácido nucleico del VHB diana sin exhibir una hibridación significativa con ácidos nucleicos que no son del VHB. Además, los oligonucleótidos se seleccionan de modo que hibriden con regiones conservadas en el genoma del VHB, minimizando así los emparejamientos erróneos con la secuencia diana. Esta selección asegura que los oligonucleótidos sean capaces de hibridar con los ácidos nucleicos del VHB de todos los genotipos y subtipos. Además, los oligonucleótidos se seleccionan de modo que muestren la menor probabilidad de formación de dímeros y contengan mínimas repeticiones de secuencia. Tales propiedades se pueden determinar mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el programa de modelado informático OLIGO® Primer Analysis Software (distribuido por National Biosciences, Inc., Plymouth, Minnesota).
Marca detectable
Una cualquiera o más de las secuencias de oligonucleótidos de cebadores y sondas descritas en el presente documento pueden comprender una marca detectable, de modo que el cebador y/o la sonda se puedan visualizar después de unirse a otra entidad (p. ej., un producto de amplificación o un amplicón). El término "marca detectable", como se emplea en el presente documento, se refiere a un radical o un compuesto que generan una señal que se puede medir y cuya intensidad está relacionada con (p. ej., es proporcional a) la cantidad de entidad unida al mismo. Se puede utilizar cualquier marca detectable adecuada que se pueda conjugar o conectar a un oligonucleótido para detectar la unión del oligonucleótido a una secuencia diana, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. En una realización que no forma parte de la invención, la marca detectable se puede detectar indirectamente. Las marcas detectables indirectamente son típicamente miembros de unión específicos utilizados junto con un "producto conjugado" que está anclado o acoplado a una marca directamente detectable. Las químicas de acoplamiento para sintetizar tales productos conjugados son bien conocidas en la técnica y están diseñadas de manera que la propiedad de unión específica del miembro de unión específica y la propiedad detectable de la marca permanezcan intactas. Como se emplea en el presente documento, "miembro de unión específica" y "producto conjugado" se refieren a los dos miembros de un par de unión, es decir, dos moléculas diferentes, donde el miembro de unión específica se une específicamente al polinucleótido de la presente divulgación y el "producto conjugado" se une específicamente al miembro de unión específica. La unión entre los dos miembros del par es típicamente de naturaleza química o física. Los ejemplos de tales pares de unión incluyen, pero no se limitan a, antígenos y anticuerpos, avidina/estreptavidina y biotina, haptenos y anticuerpos específicos para haptenos, secuencias de nucleótidos complementarias, cofactores/sustratos enzimáticos y enzimas, y similares.
En otra realización que no forma parte de la invención, la marca detectable se puede detectar directamente. Tales marcas directamente detectables incluyen, por ejemplo, radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidales, micropartículas fluorescentes, colorantes intercalados (p. ej., SYBR Green o bromuro de etidio) y similares. En una realización, la marca detectable puede ser un fluoróforo, tal como un colorante de la familia de la fluoresceína, un colorante de la familia de la polihalofluoresceína, un colorante de la familia de la
hexaclorofluoresceína, un colorante de la familia de la cumarina, un colorante de la familia de la rodamina, un colorante de la familia de la cianina, un colorante de la familia de la oxazina, un colorante de la familia de la tiazina, un colorante de la familia de la escuaraína, un colorante de la familia de los lantánidos quelados, un colorante de la familia de los prigmentos azoicos, un colorante de la familia del trifenilmetano o un colorante de la familia BODIPY®. Los ejemplos de fluoróforos incluyen, sin limitarse a, FAM™, HEX™, JOE™, NED™, PET®, ROX™, TAMRA™, TET™, TEXAS RED®, y VIC®. Un experto en la técnica apreciará que las marcas detectables directamente pueden requerir componentes adicionales, tales como sustratos, reactivos desencadenantes, luz y similares, para permitir la detección de la marca. Los métodos para marcar oligonucleótidos, tales como sondas, son bien conocidos en la técnica y son descritos, p. ej., por Kricka et al., en Ann. Clin. Biochem., 39: 114-129 (2002); van Gijlswijk et al., en Expert Rev. Mol. Diagn., 1: 81-91 (2001); Joos et al., en J. Biotechnol., 35: 135-153 (1994); Smith et al., en Nucl. Acids Res., 13: 2399-2412 (1985); Connoly et al., en Nucl. Acids. Res., 13: 4485-4502 (1985); Broker et al., en Nucl. Acids Res., 5: 363-384 (1978); Bayer et al., en Methods of Biochem. Analysis, 26: 1-45 (1980); Langer et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 6633-6637 (1981); Richardson et al., en Nucl. Acids Res., 11: 6167-6184 (1983) ; Brigati et al., en Virol., 126: 32-50 (1983); Tchen et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3466-3470 (1984) ; Landegent et al., en Exp. Cell Res., 15: 61-72 (1984); A. H. Hopman et al., en Exp. Cell Res., 169: 357-368 (1987); y Temsamani et al., en Mol. Biotechnol., 5: 223-232 (1996).
En otra realización, una cualquiera o más de las secuencias de oligonucleótidos de cebadores y sondas descritas en el presente documento también pueden comprender un radical extintor. Cuando una marca detectable (p. ej., un fluoróforo) y un radical extintor se mantienen muy cerca, por ejemplo, en los extremos de una sonda, el radical extintor evita la detección de una señal (p. ej., fluorescencia) de la marca detectable. Cuando los dos radicales se separan físicamente, por ejemplo, después de la escisión por una ADN polimerasa, la señal se vuelve detectable. El extintor se puede seleccionar entre cualquier extintor adecuado conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, BLACK HOLE QUENCHER® 1 (BHQ-1®), BLACK HOLE QUENCHER® 2 (BHQ-2®), IOWA BLACK® FQ y IOWA BLACK® RQ. Por ejemplo, la sonda oligonucleotídica puede comprender un fluoróforo FAM y un extintor BHQ-1. Deseablemente, tanto la primera como la segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda comprenden una marca detectable. Cada una de las sondas se puede marcar con la misma marca detectable o con diferentes marcas detectables. Cuando ambas sondas comprenden la misma marca detectable (p. ej., FAM), la amplificación de la secuencia diana del VHB se detecta como una única señal durante la PCR en tiempo real. Cuando cada sonda comprende una marca detectable diferente, la amplificación de la secuencia diana del VHB se detecta como dos señales separadas.
La selección de una técnica de marcaje en particular dependerá de varios factores, tales como la facilidad y el costo del método de marcaje, el espaciado espectral entre las diferentes marcas detectables utilizadas, la calidad deseada de marcaje de la muestra, los efectos del radical detectable en la reacción de hibridación (p. ej., sobre la velocidad y/o eficiencia del proceso de hibridación), la naturaleza del método de amplificación utilizado, la naturaleza del sistema de detección, la naturaleza e intensidad de la señal generada por la marca detectable, y similares.
Control interno
El conjunto de oligonucleótidos para detectar el VHB descrito anteriormente puede comprender adicionalmente secuencias de oligonucleótidos de cebadores y sondas para amplificar y detectar una secuencia de control interno (CI). En una realización, las secuencias de control interno se añaden a cada reacción de preparación de la muestra. A continuación, el control interno se procesa a través de todo el procedimiento de preparación y amplificación de la muestra junto con las muestras de prueba, los controles y los calibradores (si están presentes), para demostrar el procesamiento adecuado de la muestra y la validez del ensayo. El control interno puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico adecuada que no sea de VHB, incluyendo, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica GAPDH, beta2-microglobulina, beta-actina, R18 o ARN 16S. En una realización, por ejemplo, el control interno puede comprender una secuencia de ADN derivada u obtenida del gen de la hidroxipiruvato reductasa de la planta de calabaza, Curcurbita pepo. En este sentido, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento puede comprender adicionalmente una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo de control interno que comprende SEQ ID NO: 5, una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso de control interno que comprende SEQ ID NO: 6, y una secuencia de oligonucleótidos de la sonda de control interno que comprende SEQ ID NO: 7. La sonda de control interno deseablemente comprende una marca detectable, tal como cualquiera de las descritas en el presente documento. En una realización, la sonda de control interno puede comprender una marca diferente a la de las sondas utilizadas para detectar el VHB, lo que permite la detección y diferenciación simultáneas del control interno y los productos amplificados del VHB dentro de la misma reacción. La sonda de control interno también puede comprender un radical extintor, tal como los descritos en el presente documento.
Método para amplificar y detectar el virus de la hepatitis B humano
La presente divulgación proporciona un método para detectar el virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra sospechosa de contener VHB. El método comprende: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un ser humano con el conjunto de secuencias de oligonucleótidos descrito en el presente documento y reactivos para la
amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos, (b) amplificar una primera secuencia de ácidos nucleicos del VHB diana presente en la muestra, (c) hibridar la primera y segunda sondas de oligonucleótidos con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana, (d) detectar la hibridación de la primera y la segunda secuencias de oligonucleótidos de la sonda con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana evaluando una señal de cada una de las marcas detectables, con lo que (i) la presencia de las señales indica la hibridación de la primera y la segunda secuencias de oligonucleótidos de la sonda con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana y la presencia de VHB en la muestra, y (ii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VHB en la muestra. Las descripciones de los oligonucleótidos cebador y sonda expuestas en el presente documento con respecto al conjunto de oligonucleótidos antes mencionado también son aplicables a esos mismos aspectos del método de la invención.
Una muestra, como se define en el presente documento, es "sospechosa" de contener VHB si la muestra se obtiene de un sujeto, preferiblemente un ser humano, sospechoso de estar infectado con VHB. Se sospecha que un sujeto está infectado con VHB si el sujeto tiene un mayor riesgo de VHB. Un bebé nacido de una madre infectada con el VHB tiene un alto riesgo de infección por VHB. Otros factores de alto riesgo para la infección por VHB incluyen, por ejemplo, el uso de drogas intravenosas, hemofilia, actividad sexual de alto riesgo, hemodiálisis, lesiones por pinchazos de agujas en el personal de atención médica y perforaciones y tatuajes corporales.
La muestra puede ser cualquier muestra adecuada obtenida de cualquier sujeto adecuado, típicamente un mamífero (p. ej., un ser humano). La muestra se puede obtener de cualquier fuente biológica, tal como un hisopo o cepillo cervical, vaginal o anal, o un fluido fisiológico que incluye, sin limitarse a, sangre completa, suero, plasma, fluido intersticial, saliva, fluido del cristalino, fluido cefalorraquídeo, sudor, orina, leche, fluido de ascitis, moco, fluido nasal, esputo, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido vaginal, menstruación, fluido amniótico, semen y similares. La muestra se puede obtener del sujeto utilizando mecanismos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica, y la muestra se puede utilizar directamente tal como se obtiene de la fuente biológica o después de un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. Tal pretratamiento puede incluir, por ejemplo, preparación de plasma a partir de sangre, dilución de fluidos viscosos, filtración, precipitación, dilución, destilación, mezcla, concentración, inactivación de componentes que interfieren, adición de reactivos, lisis, etc.
Después de obtener la muestra de un sujeto, la muestra se puede poner en contacto con el conjunto de oligonucleótidos que comprende cebadores directos e inversos y la primera y segunda sondas como se describe en el presente documento para formar una mezcla de reacción. A continuación, la mezcla de reacción se coloca en condiciones de amplificación. Los cebadores se hibridan con una primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana (p. ej., al menos una porción del gen del antígeno de superficie del VHB) si está presente en la muestra, y se amplifica una primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana presente en la muestra.
La amplificación de una secuencia de ácido nucleico del VHB en la muestra se puede realizar utilizando cualquier método de amplificación de secuencia de ácido nucleico adecuado conocido en la técnica, incluidos, sin limitarse a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR en tiempo real, amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación de círculo rodante, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y reacción en cadena de la ligasa (LCR).
Debido a que el VHB comprende un genoma de ADN, la amplificación de la secuencia de ácido nucleico del virus del VHB se realiza deseablemente mediante PCR, y preferiblemente PCR en tiempo real, en la que se sintetizan fragmentos de ADN complementarios (ADNc) a partir de un molde de ADN sustrato. La reacción implica típicamente el uso de un cebador oligonucleotídico sintético, que es complementario a las secuencias de nucleótidos en el ADN sustrato, y el uso de una enzima ADN polimerasa. La reacción consiste en un ciclo, en el que los cebadores oligonucleotídicos, que están presentes en un gran exceso, hibridan con el ADN sustrato para formar estructuras de doble hebra a lo largo de secuencias de nucleótidos complementarias. Los complejos ADN:ADN cebador-sustrato servirán en ese caso como sitios de inicio para una reacción de síntesis de ADNc catalizada por la ADN polimerasa, que da como resultado la síntesis de una hebra de ADNc complementaria a la hebra de ADN. "PCR en tiempo real", como se emplea en el presente documento, se refiere a un método de PCR en el que la acumulación de producto de amplificación se mide a medida que avanza la reacción, en tiempo real, con cuantificación del producto después de cada ciclo, en contraste con la PCR convencional en la que el producto de ADN amplificado se detecta en un análisis de punto final. La PCR en tiempo real también se conoce en la técnica como "PCR cuantitativa (qPCR)". La detección en tiempo real de los productos de la PCR implicar típicamente el uso de colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan en cualquier ADN de doble hebra y sondas de ADN marcadas con fluorescencia específicas de secuencia. Los mecanismos y sistemas de PCR en tiempo real son conocidos en la técnica (véanse, p. ej., Dorak, M. Tevfik, ed. Real-time Pc R. Taylor & Francis (2007); y Fraga et al., "Real-time PCR," Current protocols essential laboratory techniques: 10-3 (2008)) y están comercialmente disponibles a partir de una variedad de fuentes (p. ej., el sistema de PCR m2000rt ReA lTÍME™ (Abbott Molecular, Inc., Des Raines, IL); CFX RealTime PCR Detection Systems (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA); y TAQMAN™ Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)), cualquiera de los cuales se puede emplear en los métodos descritos en el presente documento.
Después de la amplificación de una secuencia de ácido nucleico del virus VHB (p. ej., al menos una porción del gen del antígeno de superficie del VHB) que está presente en la muestra, el método de la invención comprende adicionalmente la hibridación del primer y segundo oligonucleótidos de las sondas con la secuencia de ácido nucleico del VHB diana. En una realización, una mezcla de reacción que comprende un amplicón de VHB se puede poner en contacto con la primera y segunda sondas de oligonucleótidos, como se describe en el presente documento, que hibridan preferiblemente con una secuencia de ácido nucleico diana del amplicón, o su complemento, en condiciones rigurosas de hibridación y lavado, formando así un dúplex híbrido que es estable para la detección. "Hibridación", como se emplea en el presente documento, se refiere a la formación de una estructura dúplex por dos ácidos nucleicos de hebra sencilla debido al emparejamiento de bases complementarias. La hibridación puede ocurrir entre hebras de ácido nucleico completamente complementarias o entre hebras de ácido nucleico "sustancialmente complementarias" que contienen regiones menores de emparejamientos erróneos. "Condiciones de hibridación rigurosas", como se emplea en el presente documento, significa condiciones en las que se prefiere fuertemente la hibridación de hebras de ácido nucleico totalmente complementarias. En condiciones de hibridación rigurosas, una primera secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un cebador) hibridará con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia diana), tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Se pueden seleccionar condiciones rigurosas para que estén entre 5 y 10°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. La tm puede ser la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidos) a la cual 50% de un oligonucleótido complementario a una diana hibrida con la secuencia diana en equilibrio (puesto que las secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones rigurosas pueden ser aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,0 M de iones de sodio, tal como una concentración de aproximadamente 0,01-1,0 M de iones de sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (p. ej., aproximadamente 10-50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (p. ej., más de aproximadamente 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tal como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser de al menos 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación rigurosas ilustrativas incluyen las siguientes: formamida al 50%, 5x SSC y SDS al 1%, incubando a 42°C, o 5x SSC, SDS al 1%, incubando a 65°C, con lavado en 0,2x SSC y SDS al 0,1% a 65°C. Se puede utilizar en el método de la invención cualquier método y condición adecuados para hibridar la primera y segunda sondas de oligonucleótidos con la secuencia de ácido nucleico del VHB diana conocida en la técnica.
Después de la hibridación de la primera y la segunda secuencias de oligonucleótidos de la sonda con la secuencia de ácido nucleico del VHB diana, el método comprende detectar la hibridación de la primera y la segunda secuencias de oligonucleótidos de la sonda con la secuencia de ácido nucleico del VHB diana mediante la evaluación de una señal de cada una de las marcas detectables, con lo que (i) la presencia de las señales indica la hibridación de la primera y la segunda secuencias de oligonucleótidos de la sonda con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana y la presencia de VHB en la muestra, y (ii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VHB en la muestra. La detección de señales de la primera y segunda sondas se puede realizar utilizando una variedad de metodologías bien conocidas, que incluyen, por ejemplo, técnicas homogéneas o heterogéneas.
Los métodos de detección homogéneos implican la detección de productos de la reacción de amplificación a medida que se forman, es decir, en tiempo real. Como resultado, se forman y detectan híbridos de producto de amplificación/sonda mientras la mezcla de reacción está en condiciones de amplificación. Los métodos de detección homogéneos incluyen, sin limitarse a, el uso de marcas FRET que se adhieren a las sondas y que emiten una señal en presencia de la secuencia diana, Balizas Moleculares (Véanse, Tyagi et al., Nature Biotechnol., 14: 303-308 (1996); Tyagi et al., Nature Biotechnol., 16: 49-53 (1998); Kostrikis et al., Science, 279: 1228-1229 (1998); Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 11538-11543 (1998); Marras et al., Genet. Anal., 14: 151-156 (1999); y Patentes de Estados Unidos Núm. 5.846.726, 5.925.517,6.277.581 y 6.235.504), ensayos TAQMAN® (véanse, p. ej., Patentes de Estados Unidos Núm. 5.210.015; 5.804.375; 5.487.792 y 6.214.979 y Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 01/86001), y ensayos de protección de hibridación (HPA) que utilizan sondas marcadas con éster de acridinio (EA) (véanse, p. ej., Weeks et al., Clin. Chem., 29: 1474-1479 (1983); Berry et al., Clin. Chem., 34: 2087-2090 (1988)).
Los sistemas de detección heterogéneos generalmente emplean un agente de captura para separar las secuencias amplificadas de otros materiales en la mezcla de reacción. Los agentes de captura típicamente comprenden un material de soporte sólido (p. ej., pocillos de microtitulación, cuentas, chips y similares) recubierto con una o más secuencias de unión específicas. Una secuencia de unión puede ser complementaria a una secuencia de cola añadida a las sondas de oligonucleótidos de la divulgación. Alternativamente, una secuencia de unión puede ser complementaria a una secuencia de un oligonucleótido de captura, comprendiendo ella misma una secuencia complementaria a una secuencia de cola de una sonda. Después de la separación de los híbridos de producto de amplificación/sonda unidos a los agentes de captura de la mezcla de reacción restante, los híbridos de producto de amplificación/sonda se pueden detectar utilizando cualquier método de detección adecuado conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
Kits y composiciones para amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico del virus de la hepatitis B
También se divulga, pero no forma parte de la invención, un kit para amplificar y detectar el VHB humano en una muestra. El kit comprende un oligonucleótido cebador directo, un oligonucleótido cebador inverso, un primer oligonucleótido sonda que comprende una marca detectable, un segundo oligonucleótido sonda que comprende una marca detectable y reactivos e instrucciones para amplificar y detectar el VHB. Las descripciones de los oligonucleótidos cebadores y oligonucleótidos sonda que se exponen en el presente documento con respecto a los métodos mencionados anteriormente también son aplicables a los mismos aspectos de los kits descritos en el presente documento. Los ejemplos de reactivos adecuados para su inclusión en el kit (además de los cebadores y sondas de oligonucleótidos descritos en el presente documento) incluyen reactivos convencionales empleados en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, una o más enzimas con actividad de polimerasa, cofactores enzimáticos (tales como magnesio o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD)), sales, tampones, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos trifosfato (dNTP/rNTP; por ejemplo, trifosfato de desoxiadenosina, trifosfato de desoxiguanosina, trifosfato de desoxicitidina y trifosfato de desoxitimidina), agentes bloqueantes, agentes de marcaje y similares. Muchos de tales reactivos se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. El kit puede contener bandejas de ensayo de múltiples pocillos. El kit puede contener dos bandejas de ensayo de múltiples pocillos, una puede contener reactivos de amplificación/detección de RT-PCR de dosis unitaria liofilizados y control interno de dosis unitaria y proteinasa K liofilizados en pocillos separados, y la otra puede contener reactivo de activación líquido.
En una realización que no forma parte de la invención, el kit puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en (a) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (c) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; (d) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 4; (e) reactivos para amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico; y (f) instrucciones de uso, en donde cada una de la primera y segunda sondas comprende una marca detectable.
El kit que no forma parte de la invención puede comprender instrucciones para utilizar los reactivos de amplificación y los oligonucleótidos de cebadores y sondas descritos en el presente documento, p. ej., para procesar la muestra de prueba, extraer moléculas de ácido nucleico y/o realizar la prueba; y para interpretar los resultados obtenidos, así como un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental. Opcionalmente, tales instrucciones pueden estar en forma impresa o en CD, DVD u otro formato de medios grabados.
También se divulga, pero no forma parte de la invención, una composición para amplificar y detectar VHB en una muestra. La composición comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un oligonucleótido cebador directo, un oligonucleótido cebador inverso, un primer oligonucleótido sonda que comprende una marca detectable y un segundo oligonucleótido sonda que comprende una marca detectable. Las descripciones de los oligonucleótidos cebadores y oligonucleótidos sonda que se exponen en el presente documento con respecto a los métodos y el kit antes mencionados también son aplicables a los mismos aspectos de la composición descrita en el presente documento. En algunos que no forman parte de la invención, la composición comprende un portador, preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable (p. ej., fisiológicamente aceptable). Se puede utilizar cualquier portador adecuado dentro del contexto de la invención, y tales portadores son bien conocidos en la técnica. La composición puede ser opcionalmente estéril o estéril con la excepción de los oligonucleótidos descritos en el presente documento.
El kit y la composición antes mencionados que no forman parte de la invención pueden comprender adicionalmente oligonucleótidos cebadores y sondas que amplifican y detectan una secuencia de ácido nucleico de control interno, como se describe en el presente documento. A este respecto, el kit y/o la composición pueden comprender una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo de control interno que comprende SEQ ID NO: 5, una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso de control interno que comprende SEQ ID NO: 6, y una secuencia de oligonucleótidos de la sonda de control interno que comprende SEQ ID NO: 7 que comprende una marca detectable.
Los kits y/o la composición que no forman parte de la invención se pueden suministrar en forma sólida (p. ej., liofilizada) o líquida. En una realización, los oligonucleótidos cebadores, los oligonucleótidos sonda y otros reactivos se liofilizan (es decir, se secan mediante congelación). Como se discutió anteriormente, muchos sistemas de detección de VHB de una sola diana conocidos en la técnica proporcionan reactivos de PCR en formato líquido que requiere almacenamiento congelado y pruebas por lotes. Sin embargo, la liofilización de los diversos componentes del kit y la composición que se describen en el presente documento elimina la necesidad de almacenamiento en congelación y permite que los componentes del ensayo se suministren en formato de dosis unitaria, de modo que los usuarios puedan realizar la cantidad exacta de ensayos requeridos, minimizando así el desperdicio de reactivos. Los diversos componentes de los kits y la composición de la presente divulgación pueden estar contenidos opcionalmente dentro de diferentes recipientes (p. ej., vial, ampolla, tubo de ensayo, matraz o frasco) para cada componente individual (p. ej., oligonucleótidos cebadores, oligonucleótidos sonda o tampón). Cada componente será generalmente dividido en alícuotas adecuadamente en su respectivo recipiente o proporcionado en forma concentrada. También se pueden proporcionar otros recipientes adecuados para realizar ciertas etapas del ensayo
de amplificación/detección. Los recipientes individuales se mantienen preferiblemente en confinamiento cerrado para la venta comercial.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero, por supuesto, no deben interpretarse como limitantes de su alcance de ningún modo.
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra un método para amplificar y detectar el VHB humano en una muestra de acuerdo con la presente divulgación.
Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines, IL) ha desarrollado un ensayo de detección de VHB que utiliza PCR en tiempo real para amplificar y detectar secuencias genómicas de ADN de VHB extraídas de especímenes de plasma o suero humanos bajo la marca ALINITYm™ HBV. El ensayo está destinado a ser utilizado (1) para evaluar el pronóstico de la enfermedad mediante la medición del nivel inicial de VHB y para evaluar la respuesta viral al tratamiento antirretroviral mediante la medición de los cambios en los niveles de ADN del VHB en suero o plasma; y (2) como ayuda en el diagnóstico de la infección por VHB y para confirmar la infección por VHB en plasma o suero de individuos que tienen resultados reactivos con inmunoensayos de VHB.
El ensayo ALINITYm™ HBV consiste en la preparación de la muestra, el ensamblaje, amplificación/detección por RT-PCR, y el cálculo y la notificación de los resultados. Todas las fases del procedimiento de ensayo ALINITYm™ HBV se ejecuta automáticamente mediante el aparato ALINITYm ™. El ADN del VHB del plasma o suero humanos se extrae au TtMomáticamente a bordo del TM aparato ALINITY ™
m de Abbott que ™ utiliza ALINITYm Sample Prep Kit 2, ALINITYm Lysis Solution y ALINITYm Diluent Solution, que emplean tecnología de micropartículas magnéticas para facilitar la captura, el lavado y la elución de ácidos nucleicos.
Al comienzo del proceso de preparación de muestras ALINITY ™
m , el aparato ™ ALINITYm rehidrata automáticamente un control interno liofilizado a 1X (que contiene ADN de plásmido linealizado) y proteinasa K sobre la placa de ensayo y lo suministra a cada reacción de preparación de muestra. El plásmido linealizado de control interno consiste en ADN de plásmido purificado que contiene una porción de 566 pb del gen de la hidroxipiruvato reductasa de la planta de calabaza, Cucúrbita pepo, que no está relacionado con VHB, clonado en el vector pBlueScript KS-. El plásmido purificado se corta con la enzima de restricción Bgl I que crea 2 fragmentos de peso molecular 1267 pb y 2251 pb. La proteinasa K (pK) es una serina proteasa relacionada con la subtilisina que digiere las proteínas de manera eficiente. La pK se utiliza para ayudar a lisar la partícula viral, para eliminar la polimerasa de VHB que está unida de forma covalente al genoma del ADN del VHB y para inactivar las nucleasas endógenas y otras proteínas que interfieren durante la preparación de la muestra.
A continuación, el control interno y la pK se procesan durante todo el procedimiento de preparación de la muestra y el procedimiento de PCR junto con los especímenes, los calibradores y los controles para demostrar el procesamiento adecuado de la muestra y la validez del ensayo. El reactivo de control interno se prepara mezclando el excipiente, la pK y 2X el volumen de control interno (que consiste en ADN de plásmido diana de control interno no infeccioso en tampón TE). La formulación del control interno se expone en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Formulación de control interno
El reactivo de mezcla maestra de PCR se prepara combinando ADN Polimerasa KAPA2G, UDG, excipiente, cebadores de oligonucleótidos directos e inversos (como se describe en el presente documento), primera y segunda sondas de oligonucleótidos (como se describe en el presente documento), agua de grado de biología molecular, componentes de tampón de PCR, dNTP, y colorante de referencia pasivo Ca1610.
La Polimerasa KAPA2G es una enzima diseñada para una mayor procesividad y velocidad a través de la evolución dirigida, que ofrece tasas de extensión significativamente más rápidas que la ADN polimerasa TAQ de tipo salvaje®. KAPA2G tiene una ADN polimerasa 5'-3' altamente procesiva, pero carece de actividad exonucleasa 3'-5'. La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) cataliza la liberación de uracilo libre a partir de ADN que contiene uracilo y proporciona un medio de control de la contaminación para los amplicones externos que contienen uracilo.
La formulación de la mezcla maestra se expone en la Tabla 2.
Tabla 2. Formulación de reactivos de Mezcla Maestra
El reactivo de mezcla maestra y el reactivo de control interno se preparan cada uno a granel y se cargan como alícuotas de dosis unitarias en placas de reactivos de pocillos múltiples. A continuación, la placa de reactivos de ensayo ensamblada se liofiliza/seca, se sella con papel de aluminio en un entorno seco, se marca y se envasa con desecantes y se sella en bolsas de papel de aluminio.
El reactivo de activación líquido se prepara mezclando agua de grado de biología molecular, cloruro de magnesio y cloruro de tetrametilamonio (TMAC). La formulación del reactivo de activación líquido se muestra en la Tabla 3. El reactivo activador se prepara a granel y se carga como dosis unitaria en una placa de reactivo de pocillos múltiples separada, pero el reactivo activador no se liofiliza.
Tabla 3. Formulación del reactivo de activación lí uido
Las condiciones de ciclo de PCR en tiempo real utilizadas por el ensayo ALINlTYm™ HBV se exponen en la Tabla 4.
Tabla 4. Condiciones de ciclo de PCR en tiem o real
La formulación de PCR y las condiciones de ciclación descritas anteriormente se pueden modificarse adicionalmente para optimizar el ensayo.
Se requiere una curva de calibración de VHB para determinar la concentración de ADN de VHB. Para ello, se procesaron dos niveles de calibradores mediante preparación de muestra y PCR para generar la curva de calibración. A continuación, se calculó la concentración de ADN de VHB en los especímenes y los controles a partir de la curva de calibración almacenada. Se preparó un plásmido de VHB de tipo salvaje (WT) que consistía en ADN de plásmido purificado que contenía el genoma completo de VHB clonado en el vector pSP72. El plásmido purificado se cortó con la enzima de restricción BamHI, generando tres fragmentos de peso molecular 1372 pb, 1852 pb y 3082 pb. La provisión de partida positiva para VHB inactivado consiste en una muestra de plasma de paciente positivo para v Hb de alto título que se diluyó en plasma negativo a una concentración aproximada de 1 * 107 copias/mL y a continuación, se inactivó con calor para reducir la infectividad.
Los controles del ensayo se sometieron a prueba a una frecuencia mínima establecida o superior para garantizar que el rendimiento del aparato y del reactivo siguiera siendo satisfactorio. Durante cada evento de control, se procesaron un control negativo, un control positivo bajo y un control positivo alto mediante procedimientos de preparación de muestras y PCR que son idénticos a los utilizados para los especímenes.
El límite de detección (LOD) se determinó sometiendo a prueba diluciones del Tercer Patrón Internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el virus de la hepatitis B para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (código NIBSC: 10/264; genotipo A) preparado en plasma y suero humanos negativos para VHB. Las pruebas para cada concentración de ADN de VHB se realizaron con 4 lotes de reactivos de amplificación durante varios días. Los resultados, representativos del rendimiento de sensibilidad analítica de Alinity m HBV, se resumen para plasma (Tabla 5) y suero (Tabla 6).
Tabla 5. Límite de detección LOD de Alinit m HBV en lasma
El análisis de próbitas de los datos determinó que la concentración de ADN del VHB en plasma detectada con una probabilidad de 95% era de 6,72 UI/mL (IC de 95%: 5,28 a 9,27 UI/mL).
Tabla 6. Límite de detección LOD de Alinit m HBV en suero
El análisis de próbitas de los datos determinó que la concentración de ADN del VHB en suero detectada con 95% de probabilidad fue de 9,62 UI/mL (IC de 95%: 7,14 a 14,43 UI/mL).
El ensayo ALINITYm ™ HBV fue lineal desde 7 UI/mL hasta 2.000.000.000 UI/mL con un valor R de 0,998 para
plasma (FIG. 1) y un valor R de 0,999 para suero (FIG. 2), como se muestra en la Tabla 7. Específicamente, la linealidad se evaluó sometiendo a prueba 9 niveles de panel que agruparon y abarcaron el rango dinámico previsto del ensayo (10 a 109 UI/mL), incluido un nivel dirigido al límite inferior de cuantificación (LLOQ) esperado a 10 UI/mL y un nivel igual al límite superior de cuantificación (ULOQ) esperado a 109 UI/mL. Además, se prepararon 2 niveles de panel de suero a dos veces el ULOQ esperado y se incluyó en la prueba un nivel por debajo del LLOQ. Se probaron un mínimo de 24 réplicas de cada nivel de panel.
El ensayo ALINITYm™ HBV fue lineal desde 10 UI/mL hasta 1.000.000.000 UI/mL para los genotipos B, C, D, E, F, G, H e I en plasma (FIG. 3) y en suero (FIG. 4).
Tabla 7. Linealidad del Ensa o ALINITYm™ HBV ara muestras de suero
Durante el desarrollo de los ciclos de liofilización, los reactivos de amplificación liofilizados se sometieron a prueba en múltiples posiciones del liofilizador. La precisión y detección de muestras en LOD y 10X LOD se muestran en la Tabla 8. Ct (umbral de ciclo es una medida relativa de la concentración de la diana en la reacción de PCR.
Tabla 8. Precisión Detección de Muestras
La robustez de la señal del control interno (CI) dentro del rango lineal de la carga viral del VHB se examinó utilizando los mismos niveles diana que se sometieron a prueba en el estudio de linealidad descrito anteriormente. El Ct delta CI entre los dos calibradores fue de aproximadamente 0,3 Ct. El Ct delta CI entre las muestras de VHB de 3,3 a 6 log UI/mL (que está cerca de las concentraciones diana de los dos calibradores) fue de aproximadamente 0,4 Ct. El Ct delta CI fue similar entre calibradores y muestras (FIG. 5), como se muestra en la Tabla 9.
Tabla 9. Robustez de la señal de CI dentro del ran o lineal de la car a viral de VHB.
Los resultados de este ejemplo demuestran un método para amplificar y detectar el VHB en una muestra utilizando el conjunto de oligonucleótidos descritos en el presente documento.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la amplificación y detección de una secuencia de ácido nucleico de VHB utilizando el sistema ALINITYm HBV™ descrito en el presente documento en comparación con el sistema de detección REALTIME™ m2000 HBV de Abbott.
TM TM
Como el sistema ALINITYm HBV descrito en el presente documento, el sistema REALTIME m2000 HBV de Abbott
se dirige al gen del antígeno de superficie del VHB (HbsAg) y utiliza dos sondas. Los cebadores y sondas de oligonucleótidos utilizados en el sistema de detección REALTIME™ m2000 HBV se describen en detalle en la Patente de Estados Unidos. Núm. 7.015.317. Los sistemas ALINITYm HBV y REALTIME m2000 HBV comparten los mismos oligonucleótidos del cebador directo e inverso, pero la primera y la segunda secuencias de oligonucleótidos de la sonda del sistema ALINITYm™ HBV son diferentes de las utilizadas en el sistema m2000. Se comparó el uso de Fragmentos de Genes GBLOCKS® (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) (también denominados en el presente documento "bloques de genes") que contienen mutaciones en diferentes ubicaciones en los cebadores/sondas, amplificación y detección de la secuencia diana de HBsAg mediante el sistema ALINITYm™ HBV con el sistema m2000, como se ilustra en la FIG. 6. Los fragmentos de genes GBLOCK® son bloques genómicos de secuencia verificada que tienen una alta fidelidad de secuencia que se pueden utilizar para la construcción o modificación rápida de genes u otras aplicaciones que requieren ADN de doble hebra. En particular, se generaron secuencias diana sintéticas de doble hebra que tenían aproximadamente 400 pares de bases para representar las diferentes mutaciones. Los GBLOCK® tienen mutaciones en uno o varios oligos, donde (x, x, x, x) se refiere al sitio del cebador directo, primer sitio de la sonda m2000, segundo sitio de sonda de ALINITYm™ HBV, y sitio de cebador inverso, respectivamente, y el número asociado con cada uno de estos sitios indica el número de mutaciones introducidas en ese sitio en particular (como se muestra en la Tabla 10 a continuación).
El ADN sintético que representa algunas de las secuencias más desafiantes identificadas en colecciones de secuencias públicas y propiedad de Abbott se interrogó tanto con el diseño m2000 como con el diseño ALINITYm™ HBV. Para el bloque de genes 29 y 36, la T indica el cambio de C a T en la posición 12 del sitio principal de la sonda. Para el bloque de genes 29, además del cambio de posición C a T, se introdujeron dos mutaciones más en el sitio principal de la sonda. El cambio de C a T se realizó para minimizar la subcuantificación del genotipo C. El bloque de genes 29 no se detectó con las sondas de m2000 HBV (una sonda de VHB WT y una sonda mutC), pero se detectó con la primera y segunda sondas de oligonucleótidos de ALINITYm™ HBV. La sonda mutC se utilizó en REALTIME™m2000 para superar la subcuantificación en el genotipo C.
Tabla 10. Delta-CTviola-normalizado Inducida or mutaciones en el enoma del VHB
Para demostrar que el reemplazo de la segunda sonda en ALINITYm™ HBV por la sonda mutC no provoca una subcuantificación del genotipo C (un bloque de genes 0T00 en el que solo la C en la posición 12 se cambia por T en el sitio principal de la sonda), se probó el rendimiento del ensayo comparando el bloque de genes WT con este ADN sintético mutado. La sonda mutC utilizada en el sistema REALTIME™ m2000 HBV exhibió un Ct posterior (aproximadamente 0,8 a 1) y una intensidad más baja que la segunda sonda en ALINITYm™ HBV tanto para el bloque de genes 0T00 como para WT. La segunda sonda en ALINITYm™ HBV exhibió un Ct similar pero un poco más temprano que mutC, lo que indica que ALINITYm™ HBV detecta el genotipo C1 (véanse la FIG. 7 y la Tabla 11), y la segunda sonda en ALINITYm™ HBV exhibió un Ct FAM más temprano que sonda mutC.
Tabla 11. Cuantificación del enoti o C
La linealidad se realizó a partir de paneles diana que contenían de 1 LOG hasta >8 LOG UI/mL de VHB a través de la extracción de muestras y utilizando el ensayo ALINITYm™ HBV en dos rondas (véase la FIG. 8). Se prepararon
Claims (7)
1. Un método para detectar el virus de la hepatitis B (VHB) humano en una muestra sospechosa de contener VHB, cuyo método comprende:
(a) poner en contacto una muestra obtenida de un ser humano con un conjunto de secuencias de oligonucleótidos y reactivos para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos, en donde el conjunto de secuencias de oligonucleótidos comprende
(i) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo que comprende SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso que comprende SEQ ID NO: 2; (iii) una primera secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 3; y (iv) una segunda secuencia de oligonucleótidos de la sonda que comprende SEQ ID NO: 4, en donde cada una de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas comprende una marca detectable,
(b) amplificar una primera secuencia diana de ácido nucleico del VHB presente en la muestra,
(c) hibridar la primera y segunda sondas de oligonucleótidos con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana, y
(d) detectar la hibridación de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y segunda sondas con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana evaluando una señal de cada una de las marcas detectables, con lo que
(i) la presencia de las señales indica la hibridación de las secuencias de oligonucleótidos de la primera y la segunda sondas con la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana y la presencia de VHB en la muestra, y
(ii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VHB en la muestra,
y en donde las etapas (a)-(d) se realizan en aproximadamente dos horas a partir de la muestra.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de ácido nucleico del VHB diana comprende al menos una porción del gen del antígeno de superficie del VHB.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la muestra comprende suero o plasma.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el conjunto de oligonucleótidos comprende adicionalmente:
(e) una secuencia de oligonucleótidos del cebador directo de control interno que comprende SEQ ID NO: 5, (f) una secuencia de oligonucleótidos del cebador inverso de control interno que comprende SEQ ID NO: 6, y (g) una secuencia de oligonucleótidos de la sonda de control interno que comprende SEQ ID NO: 7 y una marca detectable.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la marca detectable es un fluoróforo.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde cada uno de los oligonucleótidos de la sonda comprende adicionalmente un radical extintor.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde los cebadores, las sondas y los reactivos están liofilizados.
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