CN110914459A - 用于检测乙型肝炎病毒(hbv)的测定 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及用于扩增和检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的方法、试剂盒和组合物，其包含正向寡核苷酸引物、反向寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的多种组合。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月27日提交的美国临时专利申请号62/564,008的权益，所述临时专利申请通过引用并入本文。
电子提交材料的通过引用并入
通过引用整体并入本文的是与本申请同时提交并且标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：一个1,460字节ASCII(文本)，文件名“2017_09_27_13122USL1-SEQ-LIST.txt”，创建于2017年9月27日。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，含有大约3.2kb的部分双链基因组(Liang等人,Hepatology,49(5):S13-21(2009)；Lok等人,Hepatology,34(6):1225-41(2001)；以及Hepatitis and Liver Cancer:A National Strategy for Prevention and Control ofHepatitis B and C.Colvin HM,Mitchell AE编辑.2010:Washington(DC))。HBV是世界上最广泛的感染剂之一并且是世界范围内可造成终身慢性感染、肝硬化(瘢痕)、肝癌、肝衰竭和死亡的最常见的几种病毒之一(Liang等人,Hepatology,49(5):S13-21(2009))。截至2016年，全球约2.4亿人患有慢性乙型肝炎并且每年大约686,000人因乙型肝炎并发症(诸如肝硬化和肝癌)而死亡(World Health Organization:Media Centre；Hepatitis B FactSheet.www.who.int/mediaventre/factsheets/fs204/en/)。常见的感染途径是出生时或童年早期期间的母婴传播(Gentile等人,Int J Womens Health,6:605-11(2014)；Srivastava等人,J Pediatric Gastroenterology Nutr,59(3):393-7(2014)；以及Yeung等人,Liver Int,30(1):5-18(2010))。HBV感染的其它风险因素包括静脉药物使用、血友病、高危性行为、血液透析、医护人员针刺受伤以及身体穿刺和纹身(Schweitzer等人,Lancet,386(10003):1546-1555(2015))。
HBV在九种已知的HBV基因型(A-I)和高度保守区域内具有大量遗传多样性。肝炎主要经由血清学(例如，乙型肝炎表面抗原、肝炎核心抗原和乙型肝炎表面抗体)诊断。针对HBV DNA的核酸测试(NAT)用于协助管理经历抗病毒疗法的患有慢性HBV感染的患者以测量在基线时和在治疗期间的HBV DNA水平，从而协助评估对治疗的应答(Terrault等人,Hepatology,63(1):261-282(2015))。然而，许多现有核酸测试利用单探针检测和定量HBVDNA。这类单探针检测方法可能导致对一些罕见的HBV变体和由于探针区域内的突变而出现的变体的定量不足或检测缺乏。核酸测试通常也使用呈液体形式提供的PCR试剂进行，所述PCR试剂需要冷冻存储和分批测试，并且样品制备和实时PCR的周转时间可能超过数个小时。NAT还易于出现处理错误(诸如污染)，并且当病毒的初始峰消除，尤其当测试合并样品时，DNA水平可能降到检测限以下。
因此，仍然需要如下HBV检测方法和系统：(i)即使存在大量HBV遗传多样性仍可靠地检测HBV；(ii)以消除或减少存储需求和PCR试剂浪费的形式提供，以及(iii)可以迅速进行。本公开提供这类方法和系统。
发明内容
本公开提供一种用于扩增和检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)核酸序列的寡核苷酸序列组，所述寡核苷酸序列组包含：(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；和(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列，其中所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列中的每一者包含可检测标记。还提供一种用于使用前述寡核苷酸组检测样品中的人HBV的方法。
本公开还提供一种用于检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列；(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；和(f)使用说明书，其中所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列中的每一种包含可检测标记。
本公开进一步提供一种包含用于扩增和检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的寡核苷酸序列的组合物，所述组合物包含：(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；和(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列，其中所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列中的每一种包含可检测标记。
附图说明
图1是示出在血浆中ALINITYm TMHBV测定从7IU/mL至2,000,000,000IU/mL为线性、其中R值为0.998(对于基因型A)的图。
图2是示出在血清中ALINITYm TMHBV测定从7IU/mL至2,000,000,000IU/mL为线性、其中R值为0.999(对于基因型A)的图。
图3是示出对于HBV基因型B、C、D、E、F、G、H和I，在血浆中ALINITYm TMHBV测定从10IU/mL至1,000,000,000IU/mL为线性的图。
图4是示出对于HBV基因型B、C、D、E、F、G、H和I，在血清中ALINITYm TMHBV测定从10IU/mL至1,000,000,000IU/mL为线性的图。
图5是描绘在HBV病毒载量的线性范围内内部对照(IC)信号稳健性的图。
图6是描绘由Abbott REALTIMETMm2000 HBV系统(图6A)和本文所述的寡核苷酸组(ALINITYm TMHBV系统)(图6B)对HBsAg靶序列扩增和检测的结果的一系列图。x轴对应于RT-PCR循环数，并且y轴对应于FAM信号强度。在图6B中，“初级探针”对应于SEQ ID NO:3，并且“次级探针”对应于SEQ ID NO:4。
图7是描绘与野生型(WT)HBV序列相比，使用具有mutC探针的AbbottREALTIMETMm2000 HBV系统(图7A)和本文所述的寡核苷酸组(ALINITYm TMHBV系统)(图7B)对HBV基因型C(基因块0T00)扩增和检测的结果的一系列图。x轴对应于RT-PCR循环数，并且y轴对应于FAM信号强度。“次级探针”对应于SEQ ID NO:4。
图8是描绘如实施例2中所述，通过样品提取和使用HBV扩增试剂，在血浆中在1LOG至9LOG IU/mL含HBV的基因型G靶板的线性范围内的PCR扩增曲线的图。两次分开运行的结果组合成一个图。
具体实施方式
本公开提供一种用于扩增和检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的寡核苷酸序列组。如本文所用的术语“寡核苷酸”是指包含约2至约100个核苷酸(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100个核苷酸，或由上述值中的任一个定义的范围)的短核酸序列。如本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的聚合体形式的核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA))。这些术语是指分子的主要结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。所述术语包括由核苷酸类似物和经修饰多核苷酸(诸如像甲基化和/或封端的多核苷酸)制成的RNA或DNA的类似物作为等效物。核酸通常经由磷酸酯键连接以形成核酸序列或多核苷酸，尽管在本领域中许多其它键(例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)是已知的。
寡核苷酸可以是单链的或双链的，或者可含有双链或单链序列两者的部分。所述寡核苷酸可以是DNA、基因组和互补DNA(cDNA)两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。寡核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法来获得。特定寡核苷酸序列可涵盖其保守修饰的变体(例如，密码子取代)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指明的序列。
引物和探针寡核苷酸
寡核苷酸在生物技术中用于多种应用，诸如像人工基因合成、作为聚合酶链反应(PCR)引物、用于DNA测序中和作为分子探针。在一个实施方式中，本文所述的寡核苷酸可以用作核酸扩增的引物或核酸杂交和检测的探针。如本文所用，术语“引物”、“引物序列”和“引物寡核苷酸”是指当在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如，DNA依赖性或RNA依赖性聚合酶)存在下置于合适的扩增条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)下时，能够充当作为核酸(所有类型的DNA或RNA)的互补链的引物延伸产物的合成起始点的寡核苷酸。引物可以是单链或双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物之前，首先处理引物(例如使变性)以分离其链。这种变性步骤通常使用加热进行，但是可以替代地使用碱然后中和来进行。本公开的引物可以具有任何合适的大小，并且希望地包含约15至50个核苷酸、约20至40个核苷酸、或约22至30个核苷酸、基本由其组成或由其组成。除了本文所述的那些之外，本公开的引物还可以含有额外的核苷酸。例如，根据所采用的扩增过程类型，引物可以包括例如靶结合序列的限制性核酸内切酶识别位点5’(参见例如，美国专利5,270,184和5,455,166)，或与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子。“正向引物”是与靶核酸序列(例如，模板链)杂交(或退火)以进行扩增的引物。“反向引物”是在扩增过程期间与靶序列的互补链杂交(或退火)的引物。正向引物相对于反向引物与靶序列5'杂交。
术语“探针”、“探针序列”和“探针寡核苷酸”是指可以在适当的扩增条件下选择性地与靶序列的至少一部分(例如，已经被扩增的靶序列的一部分)杂交的寡核苷酸。一般而言，探针序列被鉴定为“互补的”(即与编码或有义链(+)互补)或“反向互补的”(即与反义链(-)互补)。本公开的探针可以具有任何合适的大小，并且希望地包含约10-50个核苷酸、约12-35个核苷酸、或约14-25个核苷酸、基本由其组成或由其组成。
如本文所用，术语“组”、“引物组”、“探针组”和“引物和探针组”是指两种或更多种一起能够引发感兴趣的靶序列或靶核酸(例如，HBV内的靶序列)的扩增的寡核苷酸引物和/或至少一种可以检测靶序列或靶核酸的探针。在某些实施方式中，术语“引物组”是指一对引物，其包括与待扩增的靶序列或靶核酸的5'末端杂交的正向引物(或5'(上游)引物)和与待扩增的靶序列或靶核酸的补体杂交的反向引物(或3'(下游)引物)。这类引物组或引物对在PCR扩增反应中特别有用。
本文所述的寡核苷酸组可以用于扩增和检测样品中的靶标HBV核酸序列。术语“靶序列”和“靶核酸”在本文可互换使用，并且是指特定的核酸序列，其存在或不存在将通过公开的方法检测。在本公开的上下文中，靶序列优选地包括将与一种或多种引物杂交并且扩增从其起始的核酸序列。靶序列还可以包括探针杂交区域，探针可以在适当的扩增条件下与该探针杂交区域形成稳定的杂合体。靶序列可以是单链或双链的。本文所述的引物和探针序列可以靶向HBV基因组中存在的任何合适的核酸序列或序列的组合。HBV基因组是一种属于嗜肝DNA病毒科的包膜DNA病毒。它含有小的、部分双链(DS)的、松弛环状DNA(rcDNA)基因组，该基因组通过RNA中间体-前基因组RNA(pgRNA)的逆转录而复制。根据基因型，HBV基因组在3182与3248个碱基对(bp)之间。HBV基因组编码四个重叠的开放阅读框架(ORF)，这些开放阅读框架被翻译成病毒核心蛋白、表面蛋白、聚合酶/逆转录酶(RT)和乙型肝炎蛋白x(HBx)。全球已鉴定HBV的至少九种基因型(A-I)和超过24种亚型。
本文所述的寡核苷酸组可以包含任何数目的引物和探针寡核苷酸、基本上由其组成或由其组成，以便扩增和检测任何合适数目的HBV核酸序列。在一个实施方式中，本文所述的寡核苷酸组包含两种或更多种扩增包含HBV表面抗原基因的至少一部分的HBV核酸序列以产生单一HBV扩增子的引物和与所述单一HBV扩增子的两个不同区域杂交的至少两种探针，基本上由其组成或由其组成。核酸序列的“部分”包含至少十个核苷酸(例如，约10至约5000个核苷酸)。优选地，核酸序列的“部分”包含10个或更多个(例如15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个、50个或更多个、或100个或更多个)核苷酸，但少于5,000个(例如4900个或更少个、4000个或更少个、3000个或更少个、2000个或更少个、1000个或更少个、800个或更少个、500个或更少个、300个或更少个、或100个或更少个)核苷酸。如本文所用，术语“扩增子”是指天然或人工扩增反应的产物。在一个实施方式中，例如，第一靶标HBV核酸序列包含高度保守的核酸序列，该高度保守的核酸序列包含HBV表面抗原基因的至少一部分。
在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸组包含以下各者、基本上由以下各者组成或由以下各者组成：(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；(d)包含SEQID NO:4的第二探针寡核苷酸序列(也称为ALINITYm TMHBV)。
本文所述的寡核苷酸组包含“双探针”设计，与利用单探针检测和定量HBV DNA的其它商购获得的HBV核酸测试(例如Abbott REALTIMETMHBV)(Abbott Molecular公司,DesPlaines,IL；用于
4800系统的
HBV(Roche Molecular Diagnostics,Pleasanton,CA)；用于
6800/8800系统的
HBV(Roche MolecularDiagnostics,Pleasanton,CA；和
HBV测定(Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA))形成对比。在某些情况下，这类“单探针”检测系统的样品制备和实时PCR的周转时间可能超过6小时。相比之下，本文所述的扩增和检测方法允许从血液样本开始在大约两小时内进行样品至结果分析。此外，如上所论述，本文所述的寡核苷酸组增强了多种HBV基因型的检测可靠性，因为该组扩增和检测HBV基因组的高度保守区域。
可以以任何合适的方式修饰本文所述的寡核苷酸的任何一种或组合，以便稳定或增强引物或探针寡核苷酸对其靶标的结合亲和力(也称为“解链温度”或“Tm”)。就此而言，如本文所述的寡核苷酸序列可以包含一个或多个经修饰的寡核苷酸碱基。例如，寡核苷酸序列可以包含一个或多个丙炔修饰的碱基，其中寡核苷酸包含具有化学式CH3C≡CH的炔烃。一个或多个丙炔修饰的碱基可以包括例如5-(1-丙炔基)-2’-脱氧尿苷(pdU)和/或5-(1-丙炔基)-2’-脱氧胞苷(pdC)。
本文所述的本发明寡核苷酸序列中的任一个可以包含本文所述的序列中的任一个的补体、基本上由其组成或由其组成。如本文所用，术语“补体”或“互补序列”是指经由Watson-Crick碱基配对规则与本文所述的寡核苷酸形成稳定双链体的核酸序列，并且通常与本发明寡核苷酸共有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％更大的同一性。核酸序列同一性可以使用本领域已知的任何合适的数学算法或计算机软件来确定，诸如像CLUSTAL-W、T-Coffee和ALIGN(用于核酸和氨基酸序列的比对)、BLAST程序(例如，BLAST 2.1、BL2SEQ及其后续版本)和FASTA程序(例如，FASTA3X、FASTM和SSEARCH)(用于序列比对和序列相似性搜索)。序列比对算法也在例如以下各者中描述：Altschul等人,J.Molecular Biol.,215(3):403-410(1990)；Beigert等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106(10):3770-3775(2009)；Durbin等人编,BiologicalSequence Analysis:Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids,CambridgeUniversity Press,Cambridge,UK(2009)；
Soding,Bioinformatics,21(7):951-960(2005)；Altschul等人,Nucleic AcidsRes.,25(17):3389-3402(1997)；和Gusfield,Algorithms on Strings,Trees andSequences,Cambridge University Press,Cambridge UK(1997))。
本文所述的寡核苷酸可以使用任何合适的方法来制备，多种所述方法在本领域中是已知的(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,1989,2.增刊版,Cold Spring Harbor Laboratory Press:New York,N.Y.；M.A.Innis(编),PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications,Academic Press:New York,N.Y.(1990)；P.Tijssen,Hybridization with Nucleic Acid Probes-Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology(Parts I and II),Elsevier Science(1993)；M.A.Innis(编),PCR Strategies,Academic Press:New York,N.Y.(1995)；和F.M.Ausubel(编),Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons:Secaucus,N.J.(2002)；Narang等人,Meth.Enzymol.,68:90-98(1979)；Brown等人,Meth.Enzymol.,68:109-151(1979)；和Belousov等人,Nucleic Acids Res.,25:3440-3444(1997))。引物对也可以使用多种工具进行设计，诸如国家生物技术信息中心(NCBI)提供的Primer-BLAST工具。寡核苷酸合成可以在寡核苷酸合成器，诸如可购自Perkin Elmer/Applied Biosystems公司(Foster City,CA)、DuPont(Wilmington,DE)、或Milligen(Bedford,MA)的那些合成器进行。可选地，寡核苷酸可以定制和从本领域熟知的多种商业来源获得，包括例如MidlandCertified Reagent Company(Midland,TX)、Eurofins Scientific(Louisville,KY)、BioSearch Technologies公司(Novato,CA)等。寡核苷酸可以使用本领域已知的任何合适方法来纯化，诸如像天然丙烯酰胺凝胶电泳、阴离子交换HPLC(参见例如，Pearson等人,J.Chrom.,255:137-149(1983))和反相HPLC(参见例如，McFarland等人,Nucleic AcidsRes.,7:1067-1080(1979))。
引物和探针的序列可以使用本领域已知的任何合适的测序方法来验证，所述方法包括但不限于化学降解(参见例如Maxam等人,Methods of Enzymology,65:499-560(1980))、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)、质谱法(参见例如Pieles等人,Nucleic Acids Res.,21:3191-3196(1993))、在碱性磷酸酶和核酸外切酶消化的组合之后的质谱法(Wu等人Anal.Biochem.,290:347-352(2001))等。
本文所述的引物和探针寡核苷酸期望包含在45℃至80℃范围内的解链温度(TM)。根据本公开，寡核苷酸与靶标HBV核酸序列特异性杂交，而不与非HBV核酸显著杂交。另外，选择寡核苷酸使得它们与HBV基因组中的保守区域杂交，因此使与靶序列的错配最小化。此选择确保寡核苷酸能够与来自所有基因型和亚型的HBV核酸杂交。此外，选择寡核苷酸使得它们显示出二聚体形成的最小可能性并且含有最少的序列重复。这类特性可以通过本领域已知的方法来确定，例如使用计算机建模程序
引物分析软件(由NationalBiosciences公司,Plymouth,Minn.配销)。
可检测标记
本文所述的引物和探针寡核苷酸序列中的任何一个或多个可以包含可检测标记，使得在与另一实体(例如，扩增产物或扩增子)结合之后，引物和/或探针可以可视化。如本文所用，术语“可检测标记”是指产生可以测量并且其强度与与其结合的实体的量有关(例如成比例)的信号的部分或化合物。可以使用可以与寡核苷酸缀合或连接以便检测寡核苷酸与靶序列的结合的任何合适的可检测标记，许多可检测标记是本领域已知的。在一个实施方式中，可以间接检测可检测标记。可间接检测的标记通常是与“缀合物”结合使用的特异性结合成员，所述“缀合物”与可直接检测的标记连接或偶联。用于合成这类缀合物的偶联化学物质在本领域中是熟知的，并且被设计成使得特异性结合成员的特异性结合特性和标记的可检测特性保持完整。如本文所用，“特异性结合成员”和“缀合物”是指结合对的两个成员，即两个不同的分子，其中特异性结合成员与本公开的多核苷酸特异性结合，并且“缀合物”与特异性结合成员特异性结合。该对的两个成员之间的结合通常本质上是化学或物理的。这类结合对的实例包括但不限于抗原和抗体、亲和素/链霉亲和素和生物素、半抗原和对半抗原具有特异性的抗体、互补核苷酸序列、酶辅因子/底物和酶等。
在另一个实施方式中，可以直接检测可检测标记。这类可直接检测的标记包括例如放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒、嵌入染料(例如SYBR Green或溴化乙锭)等。在一个实施方式中，可检测标记可以是荧光团，诸如荧光素家族染料、多卤代荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、若丹明家族染料、菁家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸家族染料、螯合镧系家族染料、偶氮家族染料、三苯基甲烷家族染料或
家族染料。荧光团的实例包括但不限于FAMTM、HEXTM、JOETM、NEDTM、
ROXTM、TAMRATM、TETTM、TEXAS
本领域技术人员将了解，可直接检测的标记可能需要额外的组分，诸如底物、触发试剂、光等，以能够检测标记。用于标记寡核苷酸的方法(诸如探针)是本领域中熟知的并且在例如以下各者中描述：Kricka等人,Ann.Clin.Biochem.,39:114-129(2002)；van Gijlswijk等人,Expert Rev.Mol.Diagn.,1:81-91(2001)；Joos等人,J.Biotechnol.,35:135-153(1994)；Smith等人,Nucl.AcidsRes.,13:2399-2412(1985)；Connoly等人,Nucl.Acids.Res.,13:4485-4502(1985)；Broker等人,Nucl.Acids Res.,5:363-384(1978)；Bayer等人,Methods of Biochem.Analysis,26:1-45(1980)；Langer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:6633-6637(1981)；Richardson等人,Nucl.Acids Res.,11:6167-6184(1983)；Brigati等人,Virol.,126:32-50(1983)；Tchen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3466-3470(1984)；Landegent等人,Exp.CellRes.,15:61-72(1984)；A.H.Hopman等人,Exp.Cell Res.,169:357-368(1987)；和Temsamani等人,Mol.Biotechnol.,5:223-232(1996)。
在另一个实施方式中，本文所述的引物和探针寡核苷酸序列中的任何一个或多个也可以包含淬灭剂部分。当保持可检测标记(例如荧光团)和猝灭剂部分紧密靠近时，诸如在探针的末端处，猝灭剂部分防止检测来自可检测标记的信号(例如，荧光)。当两个部分物理上分离时，诸如在被DNA聚合酶切割之后，该信号变得可检测。淬灭剂可以选自本领域已知的任何合适淬灭剂，诸如像BLACK HOLE
1(BHQ-
)、BLACK HOLE
2(BHQ-
)、IOWA
FQ和IOWA
RQ。例如，寡核苷酸探针可以包含FAM荧光团和BHQ-1淬灭剂。
第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列两者都期望包含可检测标记。每一种探针都可以用相同的可检测标记或不同的可检测标记标记。当两种探针包含相同的可检测标记(例如FAM)时，在实时PCR期间将HBV靶序列的扩增检测为单一信号。当每种探针包含不同的可检测标记时，将HBV靶序列的扩增检测为两种单独的信号。
特定标记技术的选择取决于多个因素，诸如标记方法的简便性和成本、所使用的不同可检测标记之间的光谱间隔、所希望样品标记的质量、可检测部分对杂交反应(例如，对杂交过程的速率和/或效率)的影响、所使用扩增方法的性质、检测系统的性质、由可检测标记产生的信号的性质和强度等。
内部对照
上文所述的用于检测HBV的寡核苷酸组可以进一步包含用于扩增和检测内部对照(IC)序列的引物和探针寡核苷酸序列。在一个实施方式中，将内部对照序列添加到每个样品制备反应中。然后通过整个样品制备和扩增程序连同测试样品、对照和校准物(如果有)对内部对照进行处理，以证明适当样品处理和测定有效性。内部对照可以是任何合适的非HBV核酸序列，包括例如编码GAPDH、β2-微球蛋白、β-肌动蛋白、R18或16S RNA的核酸序列。在一个实施方式中，例如内部对照可以包含来源于或获自南瓜植物西葫芦(Cucurbitapepo)的羟基丙酮酸还原酶基因的DNA序列。就此而言，本文所述的寡核苷酸组可以进一步包含：包含SEQ ID NO:5的内部对照正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO:6的内部对照反向引物寡核苷酸序列、和包含SEQ ID NO:7的内部对照探针寡核苷酸序列。内部对照探针期望包含可检测标记，诸如本文所述的那些中的任一者。在一个实施方式中，内部对照探针可以包含与用于检测HBV的探针不同的标记，该标记允许在同一反应中同时检测和区分内部对照和HBV扩增产物。内部对照探针还可以包含淬灭剂部分，诸如本文所述的那些。
用于扩增和检测人乙型肝炎病毒的方法
本公开提供一种用于检测疑似含有HBV的样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的方法。该方法包括：(a)使获自人的样品与本文所述的寡核苷酸序列组和用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，(b)扩增在所述样品中存在的第一靶标HBV核酸序列，(c)使所述第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针与所述第一靶标HBV核酸序列杂交，(d)通过评估来自所述可检测标记中的每一种的信号检测第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与所述第一靶标HBV核酸序列的杂交，借此(i)所述信号的存在指示所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与所述第一靶标HBV核酸序列的杂交以及在所述样品中存在HBV，并且(ii)所述信号的不存在指示所述样品中不存在HBV。关于前述寡核苷酸组的本文所阐述的引物和探针寡核苷酸的描述也适用于本发明方法的那些相同方面。
如果样品获自疑似感染HBV的受试者(优选是人)，则如本文定义的样品“疑似”含有HBV。如果受试者患有HBV的风险增加，则该受试者疑似感染HBV。感染HBV的母亲所生的婴儿处于HBV感染的高风险下。HBV感染的其它高风险因素包括例如静脉药物使用、血友病、高危性行为、血液透析、医护人员针刺受伤以及身体穿刺和纹身。
样品可以是获自任何合适受试者，通常是哺乳动物(例如人)的任何合适样品。样品可以获自任何生物来源，诸如宫颈、阴道或肛门拭子或刷子、或生理流体，包括但不限于全血、血清、血浆、间质液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水液、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、阴道液、月经、羊水、精液等。样品可以使用本领域技术人员已知的常规技术获自受试者，并且样品可以获自生物来源直接使用或在预处理以改变样品的特征之后使用。这种预处理可以包括例如由血液制备血浆、稀释粘性流体、过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、使干扰组分失活、添加试剂、裂解等。
在从受试者获得样品之后，可以使样品与如本文所述的包含正向引物和反向引物以及第一探针和第二探针的寡核苷酸组接触以形成反应混合物。然后将该反应混合物置于扩增条件下。如果样品中存在，则使引物与第一靶标HBV核酸序列(例如，HBV表面抗原基因的至少一部分)杂交，并且扩增样品中存在的第一靶标HBV核酸序列。
扩增样品中的HBV核酸序列可以使用本领域中已知的任何合适的核酸序列扩增方法，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和连接酶链反应(LCR)。
因为HBV包含DNA基因组，所以HBV病毒核酸序列的扩增期望地使用PCR进行，并且优选地使用实时PCR进行，其中由底物DNA模板合成互补DNA(cDNA)片段。该反应通常涉及使用与底物DNA中的核苷酸序列互补的合成寡核苷酸引物，和使用DNA聚合酶。反应由一个循环组成，其中大量存在的寡核苷酸引物与底物DNA杂交以沿着互补核苷酸序列形成双链结构。引物-底物DNA:DNA复合物然后将充当由DNA聚合酶催化的cDNA合成反应的起始位点，从而导致合成与DNA链互补的cDNA链。如本文所用，“实时PCR”是指如下PCR方法：其中随着反应进行，实时地测量扩增产物的积累，在每个循环之后对产物定量，这与其中在终点分析中检测扩增的DNA产物的常规PCR形成对比。实时PCR在本领域中也被称为“定量PCR(qPCR)”。PCR产物的实时检测通常涉及使用非特异性荧光染料，该染料可嵌入任何双链DNA和序列特异性荧光标记的DNA探针。实时PCR技术和系统是本领域中已知的(参见例如Dorak,M.Tevfik编Real-time PCR.Taylor&Francis(2007)；和Fraga等人,“Real-time PCR,”Current protocols essential laboratory techniques:10-3(2008))并且从多种来源商购获得(例如，m2000rt REALTIMETMPCR系统(Abbott Molecular公司,Des Plaines,IL)；CFX实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories公司,Hercules,CA)；和TAQMANTM实时PCR系统(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA))，其中任一种都可以用于本文所述的方法中。
在扩增样品中存在的HBV病毒核酸序列(例如，HBV表面抗原基因的至少一部分)之后，本发明方法进一步包括使第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与靶标HBV核酸序列杂交。在一个实施方式中，可以在严格的杂交和洗涤条件下，使包含HBV扩增子的反应混合物与如本文所述的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针接触，所述探针优先与扩增子的靶核酸序列或其补体杂交，从而形成对检测稳定的杂交双链体。如本文所用，“杂交”是指由于互补碱基配对，由两个单链核酸形成双链体结构。杂交可以发生在完全互补的核酸链之间，或在含有错配的较小区域的“基本上互补”的核酸链之间。如本文所用，“严格的杂交条件”是指如下条件：在这些条件下，强烈优选完全互补的核酸链的杂交。在严格的杂交条件下，诸如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如引物)将与第二核酸序列(例如靶序列)杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将有所不同。严格条件可被选择为在限定的离子强度pH下低于特定序列的热熔点(Tm)约5℃-10℃。Tm可以是处于平衡时50％与靶标互补的寡核苷酸与靶标序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm下，在平衡时50％的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)。严格条件可以是其中在pH7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且针对短探针(例如，约10-50个核苷酸)的温度为至少约30℃，并且针对长探针(例如，大于约50个核苷酸)的温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。本领域中已知的用于使第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针与靶标HBV核酸序列杂交的任何合适的方法和条件可以用于本发明方法。
在第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与靶标HBV核酸序列杂交之后，该方法包括通过评估来自可检测标记中的每一种的信号检测所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与靶标HBV核酸序列的杂交，借此(i)所述信号的存在指示第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与第一靶标HBV核酸序列的杂交以及在所述样品中存在HBV，并且(ii)所述信号的不存在指示所述样品中不存在HBV。对来自第一探针和第二探针的信号的检测可以使用多种熟知的方法来进行，包括例如均相或异相技术。
均相检测方法涉及检测在扩增反应产物形成的同时检测这些产物，即以实时方式检测。结果，在反应混合物处于扩增条件下时形成并且检测扩增产物/探针杂合体。均相检测方法包括但不限于使用FRET标记，这些标记与探针连接并且在靶序列存在下发出信号：分子信标(参见Tyagi等人,Nature Biotechnol.,14:303-308(1996)；Tyagi等人,NatureBiotechnol.,16:49-53(1998)；Kostrikis等人,Science,279:1228-1229(1998)；Sokol等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:11538-11543(1998)；Marras等人,Genet.Anal.,14:151-156(1999)；和美国专利5,846,726、5,925,517、6,277,581和6,235,504)、
测定(参见例如美国专利5,210,015；5,804,375；5,487,792和6,214,979以及国际专利申请公布WO01/86001)、和杂交保护测定(HPA)，其利用用新吖啶酯(AE)标记的探针(参见例如Weeks等人,Clin.Chem.,29:1474-1479(1983)；Berry等人,Clin.Chem.,34:2087-2090(1988))。
异相检测系统一般采用捕获剂将反应混合物中的扩增序列与其它材料分离。捕获剂通常包含涂覆有一种或多种特异性结合序列的固体支持材料(例如，微量测试孔、微珠、芯片等)。结合序列可以与添加到本公开的寡核苷酸探针的尾巴序列互补。可选地，结合序列可以与捕获寡核苷酸的序列互补，该捕获寡核苷酸序列本身包含与探针的尾巴序列互补的序列。在从剩余的反应混合物中分离与捕获剂结合的扩增产物/探针杂合体之后，可以使用本领域中已知或本文所述的任何合适的检测方法来检测扩增产物/探针杂合体。
用于扩增和检测乙型肝炎病毒核酸序列的试剂盒和组合物
本公开还提供一种用于扩增和检测样品中的人HBV的试剂盒。该试剂盒包含正向引物寡核苷酸、反向引物寡核苷酸、包含可检测标记的第一探针寡核苷酸、包含可检测标记的第二探针寡核苷酸，以及用于扩增和检测HBV的试剂和说明书。关于前述方法的本文所阐述的引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文所述的试剂盒的那些相同方面。试剂盒中包含的合适试剂(除本文所述的寡核苷酸引物和探针之外)的实例包括用于核酸扩增反应的常规试剂，诸如像一种或多种具有聚合酶活性的酶、酶辅因子(诸如镁或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、盐、缓冲液、脱氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸三磷酸(dNTP/rNTP；例如，脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸)阻断剂、标记剂等。许多这类试剂在本文中描述或另外在本领域中是已知的并且可商购获得。该试剂盒可含有多孔测定盘。该试剂盒可以含有两个多孔测定盘，一个可以在分离的孔中含有冻干的单位剂量RT-PCR扩增/检测试剂，和冻干的单位剂量内部对照、以及蛋白酶K，并且另一个可以含有液体活化试剂。
在一个实施方式中，该试剂盒可以包含以下各者、基本上由其组成、或由其组成：(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列；(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；和(f)使用说明书，其中所述第一探针和第二探针中的每一种包含可检测标记。
试剂盒可以包含用于使用本文所述的扩增试剂和引物以及探针寡核苷酸的说明，例如用于处理测试样品、提取核酸分子、和/或进行测试的说明；以及用于解释所获得结果的说明，以及政府机构规定的形式的注意事项。这类说明可以任选地呈印刷形式或在CD、DVD或其它录制媒体形式上。
本公开还提供一种用于扩增和检测样品中的HBV的组合物。该组合物包含正向引物寡核苷酸、反向引物寡核苷酸、包含可检测标记的第一探针寡核苷酸、和包含可检测标记的第二探针寡核苷酸、基本上由其组成或由其组成。关于前述方法和试剂盒的本文所阐述的引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文所述的组合物的那些相同方面。在一些实施方式中，该组合物包含载体、优选地药学上(例如生理上可接受)的载体。在本发明的上下文内可以使用任何合适的载体，并且这类载体在本领域中是熟知的。该组合物可以任选地是无菌的或除了本文所述的寡核苷酸之外是无菌的。
前述试剂盒和组合物可以进一步包含如本文所述的扩增和检测内部对照核酸序列的引物和探针寡核苷酸。就此而言，试剂盒和/或组合物可以包含：包含SEQ ID NO:5的内部对照正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO:6的内部对照反向引物寡核苷酸序列、和包含SEQ ID NO:7的内部对照探针寡核苷酸序列，该内部对照探针寡核苷酸序列包含可检测标记。
该试剂盒和/或组合物可以呈固体(例如冻干)或液体形式供应。在一个实施方式中，引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和其它试剂被冻干(即，冷冻干燥)。如上所论述，本领域中已知的许多单靶标HBV检测系统提供呈液体形式的PCR试剂，该液体形式需要冷冻储存和分批测试。然而，本文所述的试剂盒和组合物的各种组分的冻干消除了冷冻储存的需要，并且允许以单位剂量形式递送测定组分，使得使用者可以进行所需准确数目的测定，从而使试剂浪费最小化。对于每种单独的组分(例如引物寡核苷酸、探针寡核苷酸或缓冲液)，本发明的试剂盒和组合物的各种组分可以任选地含在不同的容器(例如小瓶、安瓿瓶、试管、烧瓶或瓶)内。每种组分一般在等分于其各自的容器中或以浓缩形式提供时是合适的。还可以提供适合于进行扩增/检测测定的某些步骤的其它容器。优选将各个容器保持严格密闭以便商业销售。
以下实施例进一步说明了本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
此实施例说明了根据本公开用于扩增和检测样品中的人HBV的方法。
利用实时PCR扩增和检测从人血浆或血清样本中提取的HBV DNA基因组序列的HBV检测方法已经由Abbott Molecular公司(Des Plaines,IL)以商品名ALINITYm TMHBV开发出来。该测定预期用于(1)通过测量基线HBV水平来评估疾病预后和通过测量血清或血浆中HBV DNA水平的变化来评估病毒对抗逆转录病毒治疗的应答；(2)协助诊断HBV感染，和证实来自对HBV免疫测定有反应结果的个体的血浆或血清中的HBV感染。
ALINITYm TMHBV测定由样品制备、RT-PCR组装、扩增/检测以及结果计算和报告组成。ALINITYm TMHBV测定程序的所有阶段都通过ALINITYm TM仪器自动执行。使用ALINITYm TM样品制备试剂盒2、ALINITYm TM裂解溶液和ALINITYm TM稀释溶液在Abbott ALINITYm TM仪器上自动提取人血浆或血清中的HBV DNA，它们利用磁性微粒技术促进核酸捕获、洗涤和洗脱。
在ALINITYm TM样品制备过程开始时，将1X下的冻干内部对照(含有线性化质粒DNA)和蛋白酶K通过ALINITYm TM仪器在测定板上自动再水合，并且递送到每个样品制备反应中。内部对照线性化质粒由经纯化的质粒DNA组成，该质粒DNA克隆到载体pBlueScript KS-中，含有与HBV不相关的南瓜植物西葫芦的羟基丙酮酸还原酶基因的566bp部分。经纯化的质粒用限制性内切酶Bgl I切割，产生具有分子量1267bp和2251bp的2个片段。蛋白酶K(pK)是一种有效消化蛋白质的枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶。pK用于协助裂解病毒颗粒，去除与HBV DNA基因组共价连接的HBV聚合酶，并且在样品制备期间使内源核酸酶和其它干扰蛋白失活。
然后通过整个样品制备和PCR程序连同样本、校准物和对照对内部对照和pK进行处理，以证明恰当的样品处理和测定有效性。内部对照试剂通过混合赋形剂、pK和2X内部对照体(由TE缓冲液中的非感染性内部对照靶标质粒DNA组成)来制备。内部对照的配方阐述于下表1中。
表1.内部对照配方
通过组合KAPA2G DNA聚合酶、UDG、赋形剂、正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物(如本文所述)、第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针(如本文所述)、分子生物学级水、PCR缓冲液组分、dNTP、和Cal610被动参考染料来制备PCR主混合物(master mix)试剂。
KAPA2G聚合酶是一种工程化酶，通过定向进化实现更高的持续合成能力和速度，其延伸速率比野生型
DNA聚合酶快得多。KAPA2G具有高度进行性5'-3’DNA聚合酶，但缺乏3'-5'核酸外切酶活性。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)催化从含尿嘧啶的DNA中释放游离尿嘧啶，并且为含有尿嘧啶的外部扩增子提供一种污染控制手段。
主混合物配方在表2中阐述。
表2.主混合物试剂配方
主混合物和内部对照试剂各自批量制备，并且作为单位剂量等分试样填充在多孔试剂板中。组装的测定试剂板然后经冻干/干燥、箔密封在干燥环境中、标记，并且进一步用干燥剂包装且密封到箔袋中。
通过混合分子生物学级水、氯化镁和四甲基氯化铵(TMAC)制备液体活化试剂。液体活化试剂的配方示出在表3中。活化剂试剂经批量制备，并且作为单位剂量填充在单独的多孔试剂板中，但活化剂未经冻干。
表3.液体活化试剂配方
| 组分 | 组分浓度(在21μL PCR中) |
| (氯化镁)MgCl<sub>2</sub> | 13mM |
| 四甲基氯化铵(TMAC) | 120mM |
ALINITYm TMHBV测定所使用的实时PCR循环条件在表4中示出。
表4.实时PCR循环条件
可以进一步修改上文所述的PCR配方和循环条件以优化测定。
需要HBV校准曲线以确定HBV DNA浓度。为此，通过样品制备和PCR处理两个水平的校准物，以生成校准曲线。然后根据储存的校准曲线计算样本和对照中HBV DNA的浓度。制备野生型(WT)HBV质粒，其由克隆到载体pSP72中的经纯化的质粒DNA组成，该质粒DNA含有整个HBV基因组。经纯化的质粒用限制性内切酶BamHI切割，从而产生具有分子量1372bp、1852bp和3082bp的三个片段。失活的HBV阳性原液由高效价HBV阳性患者血浆样品组成，该血浆样品在阴性血浆中稀释至大约1x107拷贝/mL的浓度，并且然后经热灭活以降低感染性。
在处于或高于确立的最低频率下测试测定对照，以确保仪器和试剂性能保持令人满意。在每个对照事件期间，通过与用于样本的那些相同的样品制备和PCR程序处理阴性对照、低阳性对照和高阳性对照。
通过测试在HBV阴性人血浆和血清中制备的乙型肝炎病毒用于核酸扩增技术的第三次世界卫生组织(WHO)国际标准(NIBSC代码：10/264；基因型A)的稀释液来确定检测限(LOD)。在多天内使用4批扩增试剂对每种HBV DNA浓度进行测试。针对血浆(表5)和血清(表6)概述了代表Alinity m HBV的分析性灵敏度性能的结果。
表5.血浆中的Alinity m HBV检测限(LOD)
数据的概率分析确定血浆中以95％概率检测到的HBV DNA的浓度是6.72IU/mL(95％CI为5.28至9.27IU/mL)。
表6.血清中的Alinity m HBV检测限(LOD)
数据的概率分析确定血清中以95％概率检测到的HBV DNA的浓度是9.62IU/mL(95％CI为7.14至14.43IU/mL)。
如表7中所示，ALINITYm TMHBV测定从7IU/mL至2,000,000,000IU/mL是线性的，其中对于血浆R值是0.998(图1)并且对于血清R值是0.999(图2)。具体而言，通过测试包括和跨越预期的测定动态范围(10到109IU/mL)的9个组水平来评估线性度，所述水平包括针对在10IU/mL下预期的定量下限(LLOQ)的水平和等于在109IU/mL下预期的定量上限(ULOQ)的水平。另外，在两倍于预期ULOQ下制备2个血清组水平并且在测试中包括一个低于LLOQ的水平。测试每个组水平的最少24个复制。
对于在血浆(图3)和血清(图4)中的基因型B、C、D、E、F、G、H和I而言，ALINITYm TMHBV检测从10IU/mL到1,000,000,000IU/mL是线性的。
表7.针对血清样品的ALINITYm TMHBV测定的线性度
| 血浆 | 血清 | |
| 标本量(n) | 286 | 286 |
| 相关系数(r) | 0.998 | 0.999 |
| 斜率 | 1.03 | 1.00 |
| 95％CI的斜率 | (1.02,1.03) | (0.99,1.01) |
| 截距 | 0.06 | -0.13 |
| 95％CI的截距 | (0.02,0.09) | (-0.17,-0.10) |
在冻干循环进行期间，在冻干器的多个位置测试冻干扩增试剂。在LOD和10X LOD下样品的精度和检测在表8中示出。Ct(阈值循环)是PCR反应中靶标浓度的相对量度。
表8.样品的精度和检测
| 样品 | N | 检测 | 平均HBV Ct | HBV Ct SD | 平均IC Ct | IC Ct SD |
| LOD | 209 | 100％ | 31.04 | 0.28 | 28.76 | 0.35 |
| 10X LOD | 210 | 99.5％ | 34.09 | 0.58 | 28.75 | 0.37 |
使用与在上文所述的线性研究中所测试的靶标水平相同的靶标水平检查了在HBV病毒载量的线性范围内的内部对照(IC)信号稳健性。两种校准物之间的ΔIC Ct是约0.3Ct。在3.3至6log IU/mL(接近两种校准物的目标浓度)下HBV样品之间的ΔIC Ct是约0.4Ct。如表9中所示，校准物和样品之间的ΔIC Ct类似(图5)。
表9.在HBV病毒载量的线性范围内的IC信号稳健性
此实施例的结果展示了使用本文所述的寡核苷酸组扩增和检测样品中HBV的方法。
实施例2
此实施例描述了与Abbott REALTIMETMm2000 HBV检测系统相比，使用本文所述的ALINITYm HBVTM系统对HBV核酸序列的扩增和检测。
如同本文所述的ALINITYm TMHBV系统，Abbott REALTIMETMm2000 HBV系统靶向HBV表面抗原基因(HbsAg)并且利用两种探针。在REALTIMETMm2000 HBV检测系统中利用的寡核苷酸引物和探针在美国专利7,015,317中详细描述。ALINITYm TMHBV和REALTIMETMm2000 HBV系统共有相同的正向引物寡核苷酸和反向引物寡核苷酸，但ALINITYm TMHBV系统的第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与m2000系统中使用的序列不同。
使用在引物/探针中不同位置处含有突变的
基因片段(IntegratedDNA Technologies公司,Coralville,IA)(本文也称为“基因块”)，将ALINITYm TMHBV系统对HBsAg靶序列的扩增和检测与m2000系统进行了比较，如图6中所示。
基因片段是经过序列验证的基因组块，其具有高序列保真度，可以用于快速基因构建或修饰，或其它需要双链DNA的应用。具体而言，产生具有约400个碱基对的合成双链靶序列以表示不同的突变。
在一个或多个寡核苷酸中具有突变，其中(x,x,x,x)分别是指正向引物位点、m2000第一探针位点、ALINITYm TMHBV第二探针位点和反向引物位点，并且与这些位点的每一个相关的数目指示在该特定位点引入的突变数目(如下表10中所示)。
用m2000设计和ALINITYm TMHBV设计两者探询了表示公共和Abbott专有序列收藏中鉴定出的某种最具挑战性序列的合成DNA。对于基因块29和36，T表示在主探针位点的位置12处C变化为T。对于基因块29，除了C至T位置变化，将另外两种突变引入主探针位点处。进行C至T变化以将基因型C的定量不足降到最低。使用m2000 HBV探针(WT HBV探针和mutC探针)未检测到基因块29，但是使用ALINITYm TMHBV第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针检测到了基因块29。将mutC探针用于REALTIMETMm2000中以克服基因型C的定量不足。
表10.由HBV基因组中的突变诱导的ΔCT(viola标准化)
“ΔCT”是指野生型的ΔCT；“代表性”指示突变在公共数据库和Abbott收藏中出现的频率
为了证明用mutC探针代替ALINITYm TMHBV中的第二探针不会造成基因型C(基因块0T00，其中在主探针位点处仅位置12处的C变为T)的定量不足，测试了测定性能，比较WT基因块与此突变的合成DNA。对于基因块0T00和WT两者，REALTIMETMm2000 HBV系统中所用的mutC探针表现出比ALINITYm TMHBV中的第二探针更迟的Ct(大约0.8至1)和更低的强度。ALINITYm TMHBV中的第二探针表现出与mutC相比类似但稍早的Ct，表明ALINITYm TMHBV检测到了基因型C1(参见图7和表11)，并且ALINITYm TMHBV中的第二探针表现出比mutC探针更早的FAM Ct。
表11.定量基因型C
| 样品ID | 靶标 | 平均FAM Ct | dCt(X-WT) |
| 第二探针 | 0T00 | 29.97 | -0.25 |
| mutC | 0T00 | 30.97 | -0.04 |
| 第二探针 | WT | 30.21 | |
| mutC | WT | 31.01 |
通过样品提取并且使用ALINITYm TMHBV测定，在两次运行中，进行从1LOG至>8LOGIU/mL含有HBV的靶板的线性度分析(参见图8)。通过在HBV阴性正常血清中以8.9log IU/ml至10IU/ml为目标稀释HBV阳性样本来制备四个目标水平。
此实施例的结果表明，在检测从人血浆或血清样本中提取的HBV DNA基因组序列方面，ALINITYm HBVTM系统优于Abbott REALTIMETMm2000 HBV检测系统。
在此所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请、和专利)均通过引用特此并入，其引用的程度如同每个参考文献被个别地并且明确地指示通过引用并入并且以其全部内容在此阐述。
除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)使用术语“一(a和an)”和“所述”以及“至少一个(种)”和类似指示物应解释为涵盖单数与复数二者。除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则术语“至少一个(种)”之后接一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个(种)”)应解释为意指选自所列项目的一个项目(A或B)或所列项目中的两个或更多个的任意组合(A和B)。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。短语“基本上由……组成”也应解释为开放性短语，意在包括不实质上影响所述产品或方法的基本和新颖特征的步骤或材料。短语“由……组成”应解释为封闭式短语，其排除说明书或权利要求书中未明确指定的任何要素、步骤或成分。除非本文另外说明，否则本文叙述的值的范围仅仅打算作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。在本文所述的所有方法能够以任何合适顺序进行，除非本文另有说明或另外与上下文明显相矛盾。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述描述之后，那些优选实施方式的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当时采用这类变型，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括被可适用法律允许的附在后面的权利要求中引用的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元件呈其所有可能变型的任何组合。
序列表
<110> 雅培分子公司
<120> 用于检测乙型肝炎病毒（HBV）的测定
<130> 13122USL1
<160> 7
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
agagtctaga ctcgtggtgg a 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
aagaagatga ggcatagcag caggatg 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
tggccaaaat tcgcagtccc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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tggatgtgtc tgcggcgt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
cuucacuuuc ucuugcag 18
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
acaaatttgg aagccatcca tca 23
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
aagctgacga gttcatgagg gcaggccgct 30
Claims (13)
1.一种用于扩增和检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)核酸序列的寡核苷酸序列组，包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；
(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；和
(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列，其中所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列中的每一种包含可检测标记。
2.如权利要求1所述的组，其进一步包含：
(e)包含SEQ ID NO:5的内部对照正向引物寡核苷酸序列；
(f)包含SEQ ID NO:6的内部对照反向引物寡核苷酸序列；和
(g)包含SEQ ID NO:7和可检测标记的内部对照探针寡核苷酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的组，其中所述可检测标记是荧光团。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组，其中所述探针寡核苷酸中的每一种进一步包含淬灭剂部分。
5.一种用于检测疑似含有HBV的样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的方法，包括：
(a)使获自人的样品与如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸序列组和用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，
(b)扩增在所述样品中存在的第一靶标HBV核酸序列，
(c)使所述第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针与所述第一靶标HBV核酸序列杂交，
(d)通过评估来自所述可检测标记中的每一种的信号检测所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与所述第一靶标HBV核酸序列的杂交，借此
(i)所述信号的存在指示所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与所述第一靶标HBV核酸序列的杂交以及在所述样品中存在HBV，并且
(ii)所述信号的不存在指示所述样品中不存在HBV。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一靶标HBV核酸序列包含HBV表面抗原基因的至少一部分。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述样品包含血清或血浆。
8.一种用于检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的试剂盒，包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；
(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；
(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列；
(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；和
(f)使用说明书，
其中所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列中的每一种包含可检测标记。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其进一步包含：
(g)包含SEQ ID NO:5的内部对照正向引物寡核苷酸序列；
(h)包含SEQ ID NO:6的内部对照反向引物寡核苷酸序列；和
(i)包含SEQ ID NO:7和可检测标记的内部对照探针寡核苷酸序列。
10.如权利要求8或权利要求9所述的试剂盒，其中所述引物、探针和试剂是冻干的。
11.一种用于扩增和检测样品中的人乙型肝炎病毒(HBV)的组合物，包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的正向引物寡核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO:2的反向引物寡核苷酸序列；
(c)包含SEQ ID NO:3的第一探针寡核苷酸序列；和
(d)包含SEQ ID NO:4的第二探针寡核苷酸序列，其中所述第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列中的每一种包含可检测标记。
12.如权利要求11所述的组合物，其进一步包含：
(a)包含SEQ ID NO:5的正向引物寡核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO:6的反向引物寡核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID NO:7和可检测标记的探针寡核苷酸序列。
13.如权利要求11或权利要求12所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和试剂是冻干的。
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