ES2913468T3

ES2913468T3 - Métodos para la detección del cáncer de pulmón.

Info

Publication number: ES2913468T3
Application number: ES17733137T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Zimmermann; Tudor Pompiliu Constantin; Raheleh Salari; Huseyin Eser Kirkizlar; Robert Charles Swanton; Mariam Jamal-Hanjani; Christopher Abbosh; Gareth Wilson
Original assignee: UCL Business Ltd; Natera Inc
Current assignee: UCL Business Ltd; Natera Inc
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2022-06-02
Anticipated expiration: 2037-04-17
Also published as: EP3443119A2; JP7280044B2; RU2018138508A3; CN109477138A; AU2017249594B2; WO2017181202A2; US20190106751A1; US12146195B2; DK3443119T3; WO2017181202A3; AU2017249594A1; CA3016360A1; JP2019517781A; EP3443119B8; RU2760913C2; BR112018070903A2; EP3443119B1; RU2018138508A

Abstract

Un método para determinar las variantes de un solo nucleótido presentes en un carcinoma de células escamosas de pulmón, que comprende generar un conjunto de amplicones al realizar una reacción de amplificación por PCR múltiple en ácidos nucleicos aislados de una muestra de plasma de sangre de un individuo sospechoso de tener un carcinoma de células escamosas de pulmón en donde la reacción de amplificación por PCR múltiple comprende combinar una polimerasa, trifosfatos de nucleótidos, fragmentos de ácidos nucleicos de una biblioteca de ácidos nucleicos generada a partir de la muestra de plasma y un conjunto de cebadores que se unen cada uno dentro de 150 pares de bases de los loci variantes de un solo nucleótido, o un conjunto de pares de cebadores que abarcan cada uno una región de 160 pares de bases o menos que comprenden los loci variantes de un solo nucleótido, un tiempo de hibridación de 15 minutos y una concentración de cebador de 10 nM, en donde se sabe que los loci variantes de un solo nucleótido están asociados con carcinoma de células escamosas de pulmón y cada amplicón del conjunto de amplicones abarca al menos un locus variante de un solo nucleótido de un conjunto de 25 a 1000 loci variantes de un solo nucleótido que se sabe que están asociados con el cáncer de pulmón; y determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones, en donde el segmento comprende un loci variante de un solo nucleótido, para determinar de esta manera las variantes de un solo nucleótido presentes en el carcinoma de células escamosas.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la detección del cáncer de pulmón

Campo de la invención

Las invenciones divulgadas se relacionan generalmente con métodos para detectar mutaciones y fusiones de ácidos nucleicos mediante el uso de métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Antecedentes de la invención

La detección de mutaciones asociadas con cánceres, ya sea antes del diagnóstico, al hacer un diagnóstico, para la estadificación de la enfermedad o para monitorear la eficacia del tratamiento, se ha basado tradicionalmente en muestras de biopsia de tumores sólidos. El muestreo es altamente invasivo y no está exento de riesgo de contribuir potencialmente a metástasis o complicaciones quirúrgicas. Se necesitan métodos mejores y menos invasivos para detectar mutaciones asociadas con el cáncer. Narayan y otros (2012: Cancer Research: p3492-3498) describe la medición de mutaciones en puntos críticos del ADN tumoral en sangre mediante el uso de secuenciación profunda multiplexada con supresión de errores. Couraurd y otros (2014: Biology of Human Tumours: p4613-4624) describe el diagnóstico no invasivo de la mutación tratable mediante la secuenciación profunda de ADN libre circulante en cáncer de pulmón de pacientes no fumadoras.

Resumen de la invención

La presente invención se define por el método de la reivindicación 1-12. Se proporciona un método para determinar las variantes de un solo nucleótido presentes en un carcinoma de células escamosas de pulmón. El método incluye generar un conjunto de amplicones al realizar una reacción de amplificación múltiple en ácidos nucleicos aislados de una muestra de plasma de un individuo sospechoso de tener un carcinoma de células escamosas de pulmón, en donde cada amplicón del conjunto de amplicones abarca al menos una variante de un solo nucleótido de un loci de un conjunto de 25-1000 variantes de un solo nucleótido de un loci que se sabe que están asociados con el cáncer de pulmón; y

determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones, en donde el segmento comprende un loci variante de un solo nucleótido, para determinar de esta manera las variantes de un solo nucleótido presentes en el carcinoma de células escamosas.

Un método para respaldar un diagnóstico de cáncer de pulmón para un individuo del que se sospecha que tiene carcinoma de células escamosas de pulmón a partir de una muestra de sangre o una fracción de la misma del individuo, puede comprender generar un conjunto de amplicones al realizar una reacción de amplificación múltiple en ácidos nucleicos aislados de la muestra, en donde cada amplicón del conjunto de amplicones abarca al menos un locus variante de un solo nucleótido de un conjunto de locus variantes de un solo nucleótido que se sabe que están asociados con el cáncer de pulmón; y

determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones, en donde el segmento comprende un loci variante de un solo nucleótido, para determinar de esta manera si una o más variantes de un solo nucleótido están presentes en la pluralidad de loci variantes de un solo nucleótido. De acuerdo con las modalidades ilustrativas,

la ausencia de una sola variante de nucleótido apoya un diagnóstico de adenocarcinoma en etapa 1a, 2a o 2b, la presencia de una variante de un solo nucleótido respalda un diagnóstico de carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 2b o 3a, y/o

la presencia de 5, 10, 15 o más variantes de un solo nucleótido respalda un diagnóstico de carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 2b o 3.

En ciertas modalidades, la presencia de 5, 10 o 15 o más variantes de un solo nucleótido respalda un diagnóstico de carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 3.

El método incluye una etapa de amplificación, la reacción de amplificación es una reacción de PCR múltiple, la temperatura de hibridación es entre 1 y 15 °C mayor que la temperatura de fusión de al menos 50, 60, 70, 85, 80, 90, 95 o 100 % de los cebadores del conjunto de cebadores, la duración de la etapa de hibridación en la reacción de PCR es de 15 minutos, la concentración de cebador en la reacción de amplificación es de 10 nM y los cebadores en el conjunto de cebadores están diseñados para minimizar el dímero de cebador formación.

En cualquiera de las modalidades del método de la invención, que incluyen determinar o detectar la presencia de un SNV mediante el uso de un método de amplificación, se puede determinar una eficiencia y una tasa de error por ciclo para cada reacción de amplificación de la reacción de amplificación múltiple del conjunto de una sola variante de nucléotidos del loci, y la eficiencia y la tasa de error pueden usarse para determinar si una única variante de nucleótido en el conjunto de loci de variantes únicas está presente en la muestra. En algunas de estas modalidades ilustrativas, se determina una confianza y se realiza una llamada de SNV si se excede un valor de confianza de corte, tal como una confianza del 90 %, 95 % o 98 %.

Otras modalidades y características y ventajas de las invenciones descritas serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

El archivo de la patente o de la solicitud contiene al menos un dibujo hecho a color. Las copias de esta publicación de patente o de la solicitud de patente con la (las) figura(s) a color se proporcionarán por la Oficina bajo petición y pago de la tarifa necesaria.

Las modalidades descritas actualmente se explicarán con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos, en donde las estructuras similares se denominan con números similares en las diversas vistas. Los dibujos que se muestran no están necesariamente a escala, en su lugar generalmente con énfasis de situar en la ilustración los principios de las modalidades actualmente descritas.

La Figura 1 es un diagrama de flujo de trabajo.

La Figura 2 Panel superior: el número de SNV por muestra; panel de parte inferior: los ensayos de trabajo, ordenados por categoría de controlador.

Figura 3. Concentración de cfDNA medida. Cada punto de datos se refiere a una muestra de plasma.

Figura 4. Muestras que muestran una buena correlación entre las mediciones de VAF tisular determinadas previamente (eje x) y aquí mediante el uso de mPCR-NGS (eje y). Cada muestra se muestra en un cuadro separado y los puntos de datos VAF están coloreados por subsección de tejido.

Figura 5. Muestras que muestran una correlación deficiente entre las mediciones de VAF tisular determinadas previamente (eje x) y aquí mediante el uso de mPCR-NGS (eje y). Cada muestra se muestra en un cuadro separado y los puntos de datos VAF están coloreados por subsección de tejido.

Figura 6A. Profundidad del histograma de lectura en función de la llamada resultante. Arriba: el ensayo no detectó el SNV de plasma esperado. Parte inferior: el ensayo detectó el SNV de plasma esperado.

Figura 7. Número de SNV detectados en plasma por tipo histológico.

Figura 8. Detección de SNV (izquierda) y detección de muestras (derecha) en plasma por etapa tumoral.

Figura 9. VAF plasmático en función del etapa tumoral y la clonalidad del SNV.

Figura 10. Número de SNV detectados en plasma de cada muestra en función de la cantidad de entrada de cfDNA. Figura 11. VAF plasmático en función del VAF tumoral promedio. Se calculó la VAF tumoral promedio en todas las subsecciones de tumor analizadas de cada tumor.

La Figura 12 muestra las proporciones clonales (rojo a azul) y la frecuencia de la variante del alelo mutante (MutVAF) de cada SNV detectado. Los SNV totales detectados de cada muestra se colocan en una sola columna y las muestras se clasifican por etapa tumoral (pTNMstage). Se incluyen muestras sin SNV detectados. La relación clonal se define como la relación entre el número de subsecciones tumorales en las que se observó SNV y el número total de subsecciones analizadas de ese tumor.

La Figura 13 muestra el estado clonal (azul para clonal y rojo para subclonal) y la frecuencia del alelo de la variante mutante (MutVAF) de cada SNV detectado. Los SNV totales detectados de cada muestra se colocan en una sola columna y las muestras se clasifican por etapa tumoral (pTNMstage). Se incluyen muestras sin SNV detectados. PyCloneCluster determinó el estado clonal mediante el uso de datos de secuenciación del exoma completo del tejido tumoral.

La Figura 14 muestra el estado clonal (azul para clonal y rojo para subclonal) y la frecuencia de la variante del alelo mutante (MutVAF) de cada SNV detectado, en donde el panel superior muestra solo los SNV clonales y el panel de la parte inferior muestra solo los SNV subclonales. Los SNV totales detectados de cada muestra se colocan en una sola columna y las muestras se clasifican por etapa tumoral (pTNMstage). Se incluyen muestras sin SNV detectados. PyCloneCluster determinó el estado clonal mediante el uso de datos de secuenciación del exoma completo del tejido tumoral.

La Figura 15 muestra el número de SNV detectados en plasma en función del tipo histológico y el tamaño del tumor. El tipo histológico y el etapa tumoral fueron determinados por el informe anatomopatológico. Cada punto de datos está coloreado por tamaño, donde el rojo indica el tamaño del tumor más grande y el azul indica el tamaño del tumor más pequeño.

La Figura 16 es una tabla de análisis de cfDNA que muestra la concentración de ADN, los equivalentes de copia del genoma en la preparación de la biblioteca, el grado de hemólisis del plasma y el perfil de cDNA en todas las muestras.

La Figura 17 es una tabla de SNV detectados en el plasma para cada muestra.

La Figura 18 es una tabla de SNV adicionales detectados en plasma.

La Figura 19 es una tabla de recuento de ensayos basada en genes para los experimentos del Ejemplo 1.

La Figura 20 es una tabla de información sobre las muestras analizadas en el estudio del Ejemplo 1, así como también los datos generados a partir del experimento proporcionado en el Ejemplo 1.

La Figura 21 es un ejemplo de ensayos detectados y sus fracciones alélicas de fondo para una muestra de plasma en el momento de la recaída (LTX103).

Las figuras identificadas anteriormente se proporcionan a modo de representación y no de limitación.

Descripción detallada de la invención

Los métodos proporcionados en la presente descripción mejoran la detección, el diagnóstico, la estadificación, la detección, el tratamiento y la gestión del cáncer de pulmón. Los métodos proporcionados en la presente descripción analizan las variantes de mutaciones de un solo nucleótido (SNV) en los fluidos circulantes, especialmente el ADN tumoral circulante. Los métodos proporcionan la ventaja de identificar más mutaciones que se encuentran en un tumor y mutaciones clonales así como también subclonales, en una sola prueba, en lugar de múltiples pruebas que serían necesarias, si fueran efectivas, que usan muestras tumorales. Los métodos y composiciones pueden ser útiles por sí solos, o pueden ser útiles cuando se usan junto con otros métodos para la detección, el diagnóstico, la estadificación, la detección, el tratamiento y el manejo del cáncer de pulmón, por ejemplo, para ayudar a soportar los resultados de estos otros métodos para proporcionar más confianza y/o un resultado definitivo.

En consecuencia, se proporciona en la presente descripción en una modalidad, un método para determinar las variantes de un solo nucleótido presentes en un carcinoma de células escamosas de pulmón mediante la determinación de las variantes de un solo nucleótido presentes en una muestra de plasma de ctDNA de un individuo, tal como un individuo que tiene o se sospecha que tiene, carcinoma de células escamosas, mediante el uso de un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA proporcionado en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un método para detectar carcinoma de células escamosas de pulmón en una muestra de plasma de un individuo, tal como un individuo sospechoso de tener un carcinoma de células escamosas, que incluye determinar las variantes de un solo nucleótido presentes en la muestra mediante el uso de un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA proporcionado en la presente descripción. La presencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 SNV en el extremo inferior del intervalo, y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40 o 50 SNV en el extremo superior del intervalo, en la muestra en la pluralidad de loci de un solo nucleótido es indicativo de la presencia de carcinoma de células escamosas.

Un método para detectar una variante clonal de un solo nucleótido en un tumor de pulmón de un individuo puede incluir realizar un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA como se proporciona en la presente descripción, y determinar la frecuencia de alelo variante para cada uno de los loci de SNV en función de la secuencia de la pluralidad de copias de la serie de amplicones. Una frecuencia de alelos relativa más alta en comparación con las otras variantes de un solo nucleótido de la pluralidad de loci de variantes de un solo nucleótido es indicativa de una variante clonal de un solo nucleótido en el tumor. Las frecuencias alélicas variantes se conocen bien en la técnica de la secuenciación. Se proporciona soporte para esta modalidad, por ejemplo, en las Figuras. 12-14.

En ciertas modalidades, el método incluye además determinar un plan de tratamiento, terapia y/o administrar un compuesto al individuo que se dirige a una o más variantes clonales de un solo nucleótido. En ciertos ejemplos, los SNV subclonales y/u otros clonales no son el objetivo de la terapia. Las terapias específicas y las mutaciones asociadas se proporcionan en otras secciones de esta especificación y son conocidas en la técnica. En consecuencia, en determinados ejemplos, el método incluye además la administración de un compuesto al individuo, cuando se sabe que el compuesto es específicamente efectivo en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de pulmón que tiene una o más de las variantes de un solo nucleótido determinadas.

En ciertos aspectos de esta modalidad, una frecuencia de alelo variante superior al 0,25 %, 0,5 %, 0,75 %, 1,0 %, 5 % o 10 % es indicativa de una variante clonal de un solo nucleótido. Estos cortes están soportados por los datos en forma tabular de la Figura. 20.

En determinados ejemplos de esta modalidad, el carcinoma de células escamosas es un carcinoma de células escamosas en etapa 1a, 1b o 2a. En determinados ejemplos de esta modalidad, el carcinoma de células escamosas es un carcinoma de células escamosas en etapa 1a o 1b. En ciertos ejemplos de la modalidad, el individuo no se somete a cirugía. En ciertos ejemplos de la modalidad, el individuo no se somete a una biopsia.

En algunos ejemplos de esta modalidad, un SNV clonal se identifica o se identifica aún más si otras pruebas, tal como las pruebas directas de tumores, sugieren que un SNV en la prueba es un SNV clonal, para cualquier SNV en la prueba que tenga una frecuencia de alelos variable mayor que al menos un cuarto, un tercio, la mitad o tres cuartos de las otras variantes de un solo nucleótido que se determinaron.

En algunas modalidades, los métodos en la presente descripción para detectar SNV en ctDNA pueden usarse en lugar del análisis directo de ADN de un tumor. Los resultados proporcionados en la presente descripción demuestran que las SNV que tienen muchas más probabilidades de ser SNV clonales tienen VAF más altas (véanse, por ejemplo, las figuras 12-14).

En ciertos ejemplos de cualquiera de las modalidades del método proporcionadas en la presente descripción, antes de realizar una amplificación dirigida en ctDNA de un individuo, se proporcionan datos sobre los SNV que se encuentran en un tumor del individuo. En consecuencia, en estas modalidades, se realiza una reacción de amplificación/secuenciación de SNV en una o más muestras de tumor del individuo. En estos métodos, la reacción de amplificación/secuenciación de ctDNA SNV proporcionada en la presente descripción sigue siendo ventajosa porque proporciona una biopsia líquida de mutaciones clonales y subclonales. Además, como se establece en la presente descripción, las mutaciones clonales se pueden identificar de manera más inequívoca en un individuo que tiene cáncer de pulmón, si se determina un alto porcentaje de VAF, por ejemplo, más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 % de VAF en una muestra de ctDNA del individuo para un SNV.

Para determinar si aislar y analizar ctDNA de ácidos nucleicos libres circulantes de un individuo con cáncer de pulmón, primero se determina si el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma o un carcinoma de células escamosas. Si el cáncer de pulmón es un carcinoma de células escamosas, los ácidos nucleicos libres circulantes se aíslan del individuo. El método puede incluir la determinación de la etapa del cáncer de pulmón, en donde si el cáncer de pulmón es un carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 3a, los ácidos nucleicos libres circulantes se aíslan del individuo. Los resultados proporcionados en la Figura 15 y en forma tabular en la Figura 20 demuestran que las SNV son frecuentes en el carcinoma de células escamosas o el adenocarcinoma en etapa 3a. Sin embargo, las SNV son mucho menos frecuentes en los ADC en etapas más tempranas. En consecuencia, se pueden lograr importantes ahorros en el cuidado de la salud ahorrando en las pruebas de SNV en pacientes con ADC en etapa 1a, 1b y/o 2a.

En ejemplos, si el cáncer de pulmón es un carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 3a, los ácidos nucleicos libres circulantes se aíslan del individuo. Además, en algunos ejemplos, si

el cáncer de pulmón es carcinoma de células escamosas en etapa o adenocarcinoma en etapa 3a los ácidos nucleicos de no se aíslan del tumor de pulmón del individuo.

Una composición puede incluir fragmentos de ácidos nucleicos tumorales circulantes que comprenden un adaptador universal, en donde los ácidos nucleicos tumorales circulantes se originaron a partir de una muestra de sangre o una fracción de la misma, de un individuo con carcinoma de células escamosas de pulmón. Los resultados presentados en el Ejemplo 1 demuestran la sorprendente ventaja de los métodos de prueba de amplificación/secuenciación de ctDNA SNV. Estos métodos suelen incluir típicamente la formación de fragmentos de ctDNA que incluyen un adaptador universal. Además, dichos métodos típicamente incluyen la formación de un soporte sólido, especialmente un soporte sólido para la secuenciación de alto rendimiento, que incluye una pluralidad de poblaciones clonales de ácidos nucleicos, en donde las poblaciones clonales comprenden amplicones generados a partir de una muestra de ácidos nucleicos libres circulantes, en donde el ctDNA. En modalidades ilustrativas basadas en los sorprendentes resultados proporcionados en la presente descripción, el ctDNA se originó a partir de un tumor de carcinoma de células escamosas de pulmón.

En ciertas modalidades, los fragmentos de ácido nucleico en diferentes poblaciones clonales comprenden el mismo adaptador universal. Dicha composición normalmente se forma típicamente durante una reacción de secuenciación de alto rendimiento en los métodos de la presente invención, como se realiza en el Ejemplo 1.

Las poblaciones clonales de ácidos nucleicos se pueden derivar de fragmentos de ácidos nucleicos de un conjunto de muestras de dos o más individuos. En estas modalidades, los fragmentos de ácido nucleico comprenden uno de una serie de códigos de barras moleculares correspondientes a una muestra en el conjunto de muestras.

Los métodos analíticos detallados se proporcionan en la presente descripción como Métodos SNV 1 y Método SNV 2 en la sección analítica en la presente descripción. Cualquiera de los métodos proporcionados en este documento puede incluir además las etapas analíticos proporcionados en la presente descripción. En consecuencia, en ciertos ejemplos, los métodos para determinar si una variante de un solo nucleótido está presente en la muestra incluyen la identificación de un valor de confianza para cada determinación de alelo en cada uno del conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido, que puede basarse, al menos en parte, en una profundidad de lectura para los loci. El límite de confianza se puede establecer al menos en 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 96 %, 98 % o 99 %. El límite de confianza se puede establecer en diferentes niveles para diferentes tipos de mutaciones.

El método se puede realizar con una profundidad de lectura para el conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 10000, 25000, 50000, 100000, 250000, 500000 o 1 millón. La Figura 20 proporciona datos de profundidad de lectura para loci SNV analizados con éxito en el Ejemplo 1.

En ciertas modalidades, un método de cualquiera de las modalidades en la presente descripción incluye determinar una eficiencia y/o una tasa de error por ciclo para cada reacción de amplificación de la reacción de amplificación múltiple de los loci de variantes de un solo nucleótido. La eficiencia y la tasa de error se pueden usar luego para determinar si una sola variante de nucleótido en el conjunto de loci de variantes únicas está presente en la muestra. También se pueden incluir etapas analíticas más detalladas proporcionados en el Método 2 de SNV proporcionados en el método analítico, en ciertas modalidades.

En modalidades ilustrativas, de cualquiera de los métodos en la presente descripción, el conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido incluye todos los loci de variantes de un solo nucleótido identificados en los conjuntos de datos TCGAy COSMIC para cáncer de pulmón, o para adenocarcinoma de pulmón y/o especialmente carcinoma de células escamosas de pulmón.

En los métodos en la presente descripción, el conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido incluye 25 loci de variantes de un solo nucleótido que se sabe que están asociados con SCC de pulmón en el extremo inferior del intervalo, y 1000 en el extremo superior del intervalo.

En cualquiera de los métodos para detectar SNV en la presente descripción incluidos que incluyen un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA, se pueden emplear parámetros de amplificación mejorados para PCR múltiple. Por ejemplo, en donde la reacción de amplificación es una reacción de PCR y la temperatura de hibridación es entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 °C mayor que la temperatura de fusión en el extremo inferior del intervalo, y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 ° en el extremo superior del intervalo para al menos 10, 20, 25, 30, 40, 50, 06, 70, 75, 80, 90, 95 o 100 % de cebadores del juego de cebadores.

La reacción de amplificación es una reacción de PCR y la duración de la etapa de hibridación en la reacción de PCR es de 15 minutos. La concentración de cebador en la reacción de PCR es de 10 nM. Además, en modalidades ilustrativas, los cebadores en el conjunto de cebadores están diseñados para minimizar la formación de dímeros de cebadores.

En consecuencia, en un ejemplo de cualquiera de los métodos en la presente descripción que incluyen una etapa de amplificación, la reacción de amplificación es una reacción de PCR, la temperatura de hibridación es entre 1 y 10 °C mayor que la temperatura de fusión de al menos el 90 % de los cebadores de la conjunto de cebadores, la duración de la etapa de hibridación es de 15 minutos, la concentración de cebador en la reacción de amplificación es de 10 nM y los cebadores del conjunto de cebadores están diseñados para minimizar la formación de dímeros de cebadores. La reacción de amplificación múltiple se realiza en condiciones de cebador limitante.

Un método para respaldar un diagnóstico de cáncer de pulmón para una persona, tal como una persona sospechosa de tener cáncer de pulmón, a partir de una muestra de sangre o una fracción de la misma de la persona, puede incluir la modalidad de un flujo de trabajo de secuenciación/amplificación de SNV de ctDNA como se proporciona en la presente descripción, para determinar si una o más variantes de un solo nucleótido están presentes en la pluralidad de loci de variantes de un solo nucleótido. En esta modalidad, se aplican los siguientes elementos, declaraciones, directrices o reglas:

la ausencia de una sola variante de nucleótido respalda un diagnóstico de adenocarcinoma en etapa 1a, 1b o 2a, la presencia de una variante de un solo nucleótido respalda un diagnóstico de carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 2b o 3a, y/o

la presencia de diez o más variantes de un solo nucleótido respalda un diagnóstico de carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma en etapa 2b o 3.

Los elementos, declaraciones, pautas o reglas anteriores están soportados por los resultados del Ejemplo 1 (ver, por ejemplo, los datos tabulares en la Figura 20). Estos resultados identifican el análisis mediante el uso de un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA de muestras de ADC y SCC de pulmón de un individuo como un método valioso para identificar los SNV que se encuentran en un tumor ADC, especialmente para los tumores ADC en etapa 2b y 3a, y especialmente un tumor SCC en cualquier etapa (Véase, por ejemplo, la Figura 15 y la Figura 20).

En determinados ejemplos, esta modalidad incluye además determinar la etapa de una lesión de cáncer de pulmón mediante un método no invasivo. Por ejemplo, el tamaño de un tumor puede determinarse mediante métodos no invasivos.

Los métodos para detectar SNV pueden usarse para dirigir un régimen terapéutico. Hay terapias disponibles y en desarrollo que se dirigen a mutaciones específicas asociadas con ADC y SCC (Nature Review Cancer. 14:535-551 (2014). Por ejemplo, la detección de una mutación de EGFR en L858R o T790M puede ser informativa para seleccionar una terapia. Erlotinib, gefitinib, afatinib, AZK9291, CO-1686 y HM61713 son terapias actuales aprobadas en los Estados Unidos o en ensayos clínicos, que se dirigen a mutaciones específicas de EGFR. En otro ejemplo, puede usarse una mutación G12D, G12C o G12V en KRAS para dirigir a un individuo a una terapia de una combinación de selumetinib más docetaxel. Como otro ejemplo, puede usarse una mutación de V600E en BRAF para dirigir a un sujeto a un tratamiento de vemurafenib, dabrafenib y trametinib.

Una muestra analizada en los métodos de la presente invención, en ciertas modalidades ilustrativas, es un plasma. Los métodos proporcionados en la presente descripción, en ciertas modalidades, están especialmente adaptados para amplificar fragmentos de ADN, especialmente fragmentos de ADN tumoral que se encuentran en el ADN tumoral circulante (ctDNA). Los fragmentos suelen tener típicamente una longitud de aproximadamente 160 nucleótidos.

Se sabe en la técnica que el ácido nucleico libre de células (cfNA), por ejemplo, cfDNA, puede liberarse en la circulación a través de diversas formas de muerte celular tales como apoptosis, necrosis, autofagia y necroptosis. El cfDNA está fragmentado y la distribución del tamaño de los fragmentos varía de 150-350 pb a > 10000 pb. (ver Kalnina y otros World J Gastroenterol. 2015 Nov 7; 21(41): 11636-11653). Por ejemplo, las distribuciones de tamaño de los fragmentos de ADN plasmático en pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) abarcaron un intervalo de 100-220 pb de longitud con un pico en la frecuencia de recuento de aproximadamente 166 pb y la concentración de ADN tumoral más alta en fragmentos de 150-180 pb de longitud. (ver: Jiang y otros, Proc Natl Acad Sci USA 112:E1317-E1325).

En una modalidad ilustrativa, el ADN tumoral circulante (ctDNA) se aísla de la sangre mediante el uso de un tubo EDTA-2Na después de eliminar los restos celulares y las plaquetas por centrifugación. Las muestras de plasma se pueden almacenar a -80 °C hasta que se extraiga el ADN mediante el uso de, por ejemplo, el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Hilden, Alemania), (por ejemplo, Hamakawa y otros, Br J Cancer. 2015; 112:352-356). Hamakava y otros informaron una concentración media de ADN libre de células extraído de todas las muestras de 43,1 ng por mL de plasma (intervalo 9,5-1338 ng/mL) y un intervalo de fracción mutante de 0,001-77,8 %, con una mediana de 0,90 %.

Se conocen métodos en la técnica para aislar ácidos nucleicos de un tumor y para crear una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de dicha muestra de ADN dadas las enseñanzas de aquí. Además, dadas las enseñanzas en la presente descripción, un experto en la materia reconocerá cómo crear una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de otras muestras tales como otras muestras líquidas en las que el ADN flota libremente además de las muestras de ctDNA.

Los métodos de la presente invención en ciertas modalidades, típicamente incluyen la etapa de generar y amplificar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra (es decir, preparación de la biblioteca). Los ácidos nucleicos de la muestra durante la etapa de preparación de la biblioteca pueden tener adaptadores de ligadura, a menudo denominados etiquetas de biblioteca o etiquetas de adaptador de ligadura (LT), adjuntos, donde los adaptadores de ligadura contienen una secuencia de cebado universal, seguida de una amplificación universal. En una modalidad, esto se puede hacer mediante el uso de un protocolo estándar diseñado para crear bibliotecas de secuenciación después de la fragmentación. En una modalidad, la muestra de ADN puede tener extremos romos y luego puede agregarse una A en el extremo 3'. Se puede agregar y ligar un adaptador en Y con un voladizo en T. En algunas modalidades, pueden usarse otros extremos adhesivos distintos de un voladizo en A o T. En algunas modalidades, se pueden agregar otros adaptadores, por ejemplo, adaptadores de ligadura en bucle. En algunas modalidades, los adaptadores pueden tener una etiqueta diseñada para la amplificación por PCR.

Varias de las modalidades proporcionadas en la presente descripción incluyen la detección de los SNV en una muestra de ctDNA. Dichos métodos en modalidades ilustrativas incluyen una etapa de amplificación y una etapa de secuenciación (algunas veces denominado en la presente descripción "flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de ctDNA SNV"). En un ejemplo ilustrativo, un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de ctDNA puede incluir la generación de un conjunto de amplicones mediante la ejecución de una reacción de amplificación múltiple en ácidos nucleicos aislados de una muestra de sangre o una fracción de la misma de un individuo, tal como un individuo del que se sospecha que tiene un carcinoma de células escamosas, en donde cada amplicón del conjunto de amplicones abarca al menos un loci de variante de un solo nucleótido de un conjunto de loci variantes de un solo nucleótido, tal como un loci SNV que se sabe que está asociado con el cáncer de pulmón; y

determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones, en donde el segmento comprende un único loci variante de nucleótido. De esta forma, este método ilustrativo determina las variantes de un solo nucleótido presentes en la muestra.

Los flujos de trabajo ilustrativos de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA en más detalle pueden incluir la formación de una mezcla de reacción de amplificación mediante la combinación de una polimerasa, trifosfatos de nucleótidos, fragmentos de ácido nucleico de una biblioteca de ácido nucleico generada a partir de la muestra y un conjunto de cebadores que se unen a una distancia efectiva de un loci de variante de un solo nucleótido, o un conjunto de pares de cebadores que abarcan cada uno una región efectiva que incluye un loci de variante de un solo nucleótido. El loci de variante de un solo nucleótido, en modalidades ilustrativas, es conocido por estar asociado con cáncer de pulmón, por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón y/o en modalidades especialmente ilustrativas, carcinoma de células escamosas. Luego, someter la mezcla de reacción de amplificación a condiciones de amplificación para generar un conjunto de amplicones que comprenden al menos un loci de variante de un solo nucleótido de un conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido, preferentemente asociado con cáncer de pulmón; y

determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones, en donde el segmento comprende un único loci variante de nucleótido.

La distancia efectiva de unión de los cebadores está dentro de los 150 pares de bases de un loci SNV. El intervalo efectivo que abarca un par de cebadores típicamente incluye un SNV y normalmente es de 160 pares de bases o menos.

En otras secciones de esta especificación se proporcionan más detalles sobre los métodos de amplificación que pueden usarse en un flujo de trabajo de amplificación/secuenciación de SNV de ctDNA para detectar SNV para usar en métodos de la invención.

Análisis de llamadas de SNV

Durante la modalidad de los métodos proporcionados en la presente descripción, se generan datos de secuenciación de ácidos nucleicos para los amplicones creados por la PCR múltiple en mosaico. Hay disponibles herramientas de diseño de algoritmos que pueden usarse y/o adaptar para analizar estos datos para determinar, dentro de ciertos límites de confianza, si una mutación, tal como un SNV, está presente en un gen objetivo, como se ilustra en el Ejemplo 1 en la presente descripción.

Las lecturas de secuenciación pueden desmultiplexarse con una herramienta interna y mapearse con el software de alineación Burrows-Wheeler, la función Bwa mem (BWA, software de alineación Burrows-Wheeler (ver Li H. y Durbin R. (2010)) alineación con Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, Epub. [PMID: 20080505]) en modo de extremo único mediante el uso de lecturas combinadas de pera en el genoma hg19. El control de calidad de las estadísticas de amplificación se puede realizar mediante el análisis del total de lecturas, el número de lecturas asignadas, el número de lecturas asignadas en el objetivo y el número de lecturas contadas.

En ciertas modalidades, cualquier método analítico para detectar un SNV a partir de la detección de datos de secuenciación de ácidos nucleicos puede usarse con los métodos de la invención que incluyen una etapa para detectar un SNV o determinar si un SNV está presente. En ciertas modalidades ilustrativas, se usan métodos de la invención que usan el Método SNV 1 más abajo. En otras modalidades, aún más ilustrativas, los métodos de la invención que incluyen una etapa para detectar un SNV o determinar si un SNV está presente en un loci de SNV, utilizan el Método SNV 2 más abajo.

Método SNV 1: Para esta modalidad, un modelo de error de fondo se construye mediante el uso de muestras de plasma normales, que se secuenciaron en el mismo ciclo de secuenciación para tener en cuenta los artefactos específicos del ciclo. En ciertas modalidades, se analizan 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250 o más de 250 muestras de plasma normal en el mismo proceso de secuenciación. En ciertas modalidades ilustrativas, se analizan 20, 25, 40 o 50 muestras de plasma normal en el mismo proceso de secuenciación. Se eliminan las posiciones ruidosas con una frecuencia de alelo variante con mediana normal mayor que un límite. Por ejemplo, este límite en ciertas modalidades es > 0,1 %, 0,2 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 % o 10 %. En determinadas modalidades ilustrativas, se eliminan las posiciones ruidosas con una frecuencia de alelo variante con mediana normal superior al 0,5 %. Las muestras atípicas se eliminaron iterativamente del modelo para tener en cuenta el ruido y la contaminación. En ciertas modalidades, las muestras con una puntuación Z superior a 5, 6, 7, 8, 9 o 10 se eliminan del análisis de datos. Para cada sustitución de base de cada loci genómico, se calcula la profundidad de la media ponderada de lectura y la desviación estándar del error. Las posiciones de las muestras de plasma sin células o tumorales con al menos 5 lecturas variantes y una puntuación Z de 10 frente al modelo de error de fondo, por ejemplo, pueden denominarse mutación candidata.

Método SNV 2:Para esta modalidad, las variantes de un solo nucleótido (SNV) se determinan mediante el uso de datos de ctDNA de plasma. El proceso de PCR se modela como un proceso estocástico, estimando los parámetros mediante el uso de un conjunto de entrenamiento y haciendo las llamadas finales de SNV para un conjunto de prueba separado. Se determina la propagación del error a través de múltiples ciclos de PCR y se calculan la media y la varianza del error de fondo y, en modalidades ilustrativas, el error de fondo se diferencia de las mutaciones reales.

Para cada base se estiman los siguientes parámetros:

p= eficiencia (probabilidad de que cada lectura se replique en cada ciclo)

p ^e = tasa de error por ciclo para el tipo de mutación e (probabilidad de que ocurra un error de tipo e)

X ^o= número inicial de moléculas

A medida que se replica una lectura en el transcurso del proceso de PCR, se producen más errores. Por lo tanto, el perfil de error de las lecturas está determinado por los grados de separación de la lectura original. Nos referimos a una lectura como kma generación si ha pasado por k repeticiones hasta que se ha generado.

Definamos las siguientes variables para cada base:

X ^ij= número de lecturas de generación i generadas en el ciclo de PCRj

Y ^ij= número total de lecturas de generación i al final del ciclo j

X ^{i f} = número de lecturas de generación de i con mutación e generadas en el ciclo de PCR j

Además, además de las moléculas normales X o, si hay moléculas adicionales f^eX ^o con la mutación e al comienzo del proceso de PCR (por lo tanto fe / (1 fe ) será la fracción de moléculas mutadas en la mezcla inicial).

Dado el número total de lecturas de la generación i-1 en el ciclo j-1, el número de lecturas de la generación i generadas en el ciclo j tiene una distribución binomial con un tamaño de muestra de Y ^{i - i , j - i} y parámetro de probabilidad de p. Por lo tanto, ECX^j, \Y ^{i - i j - i}, p ) = p Y ^{¡ - i j - i} y Var(X ^j, \Y ^{i - i , j - i}, p )= p (1 -p ) Y ^{i - i j - i}.

_{También tenemos} Y- _{l -¡}■ ⁼ _¿Y_Jj_{k = i}X- _ik _{por |0 tanto, por recursión, simulación o métodos similares, podemos determinar}E(X^{j ,}). De manera similar, podemos determinar Var(X ^j) = E(Var(X^j,\p)) Var(E(X ^j,\p)) mediante el uso de la distribución d e p. por último, E (X ij^e\ Y ^{i - i j - i}, p ^e) = p ^eY ^{i - i j - i} y Var(X f \ Y ^{i- i , ¡ - i}, p)= p ^e ( i - p ^e) Y ^{i - i j - i}, y podemos usar estos para calcular E(X^{j e}) y Var(X ^{j e}).

En ciertas modalidades, el método SNV 2 se realiza de la siguiente manera:

a) Estimar una eficiencia de PCR y una tasa de error por ciclo mediante el uso de un conjunto de datos de entrenamiento;

b) Estimar un número de moléculas iniciales para el conjunto de datos de prueba en cada base mediante el uso de la distribución de la eficiencia estimada en la etapa (a);

c) Si es necesario, actualice la estimación de la eficiencia para el conjunto de datos de prueba mediante el uso del número inicial de moléculas estimado en la etapa (b);

d) Estimar la media y la varianza para el número total de moléculas, moléculas de error de fondo y moléculas de mutación real (para un espacio de búsqueda que consiste de un porcentaje inicial de moléculas de mutación real) mediante el uso de datos del conjunto de prueba y parámetros estimados en las etapas (a), ( b) y (c);

e) Ajustar una distribución al número de moléculas de error total (error de fondo y mutación real) en las moléculas totales, y calcular la posibilidad de cada porcentaje de mutación real en el espacio de búsqueda; y

f) Determinar el porcentaje de mutación real más probable y calcular la confianza mediante el uso de los datos de la etapa (e).

Puede usarse un límite de confianza para identificar un SNV en un loci de SNV. Por ejemplo, puede usarse un límite de confianza del 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % para llamar a un SNV.

Algoritmo ilustrativo del Método SNV 2

El algoritmo comienza estimando la eficiencia y la tasa de error por ciclo mediante el uso del conjunto de entrenamiento. Dejar n indique el número total de ciclos de PCR.

El número de lecturas R ^b en cada base b se puede aproximar por ( i p ^b) ⁿX ^o, donde p ^b es la eficiencia en la base b. Entonces (R ^b/X ^o) ^i/n puede usarse para aproximar i p ^b. Entonces, podemos determinar la media y la variación estándar de p ^b en todas las muestras de entrenamiento, para estimar los parámetros de la distribución de probabilidad (tales como distribuciones normales, beta o similares) para cada base.

De manera similar, el número de error e de lecturas R ^be en cada base b puede usarse para estimar p ^e. Después de determinar la media y la desviación estándar de la tasa de error en todas las muestras de entrenamiento, aproximamos su distribución de probabilidad (tales como distribuciones normales, beta o similares) cuyos parámetros se estiman mediante el uso de estos valores de media y desviación estándar.

Luego, para los datos de prueba, estimamos la copia inicial en cada base como donde f(.) es

una distribución estimada del conjunto de entrenamiento. J 0^1—

Cl+ ^R p ^b *) ⁿ " ^f(Pb)dpb donde f(.) es una distribución estimada del conjunto de entrenamiento.

Por lo tanto, hemos estimado los parámetros que se usarán en el proceso estocástico. Luego, mediante el uso de estas estimaciones, podemos estimar la media y la varianza de las moléculas creadas en cada ciclo (tenga en cuenta que hacemos esto por separado para las moléculas normales, las moléculas de error y las moléculas de mutación).

Finalmente, mediante el uso de un método probabilístico (tal como la máxima posibilidad o métodos similares), podemos determinar el mejor valor de f e que se ajusta mejor a la distribución del error, la mutación y las moléculas normales. Más específicamente, estimamos la relación esperada de las moléculas de error a las moléculas totales para varios valores de fe en las lecturas finales, y determine la posibilidad de nuestros datos para cada uno de estos valores, y luego seleccione el valor con la posibilidad más alta.

Las colas de cebadores pueden mejorar la detección de ADN fragmentado de bibliotecas etiquetadas universalmente. Si la etiqueta de la biblioteca y las colas del cebador contienen una secuencia homóloga, la hibridación se puede mejorar (por ejemplo, la temperatura de fusión (Tm) se reduce) y los cebadores se pueden extender si solo una porción de la secuencia objetivo del cebador está en el fragmento de ADN de la muestra. En algunas modalidades, pueden usarse 13 o más pares de bases específicas de la diana. En algunas modalidades, pueden usarse de 10 a 12 pares de bases específicas de la diana. En algunas modalidades, pueden usarse de 8 a 9 pares de bases específicas de la diana. En algunas modalidades, pueden usarse de 6 a 7 pares de bases específicas de la diana.

En una modalidad, las bibliotecas se generan a partir de las muestras anteriores ligando adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN de las muestras, o a los extremos de los fragmentos de ADN generados a partir del ADN aislado de las muestras. A continuación, los fragmentos se pueden amplificar mediante el uso de PCR, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente protocolo ilustrativo:

95 °C, 2 minutos; 15 x [95 °C, 20 s, 55 °C, 20 s, 68 °C, 20 s], 68 °C 2 min, 4 °C en espera.

En la técnica se conocen muchos kits y métodos para la generación de bibliotecas de ácidos nucleicos que incluyen sitios de unión de cebadores universales para la amplificación posterior, por ejemplo, la amplificación clonal, y para la secuenciación de subsecuencias. Para ayudar a facilitar la ligadura de la biblioteca de adaptadores, la preparación y la amplificación pueden incluir la reparación y adenilación de los extremos (es decir, cola A). Los kits especialmente adaptados para preparar bibliotecas a partir de pequeños fragmentos de ácido nucleico, especialmente ADN libre circulante, pueden ser útiles para practicar los métodos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, los kits NEXTflex Cell Free comercializado por Bioo Scientific () o el Natera Library Prep Kit (comercializado por Natera, Inc. San Carlos, CA). Sin embargo, dichos kits típicamente se modificarían para incluir adaptadores personalizados para las etapas de amplificación y secuenciación de los métodos proporcionados en la presente descripción. La ligadura del adaptador se puede realizar mediante el uso de kits disponibles comercialmente, tal como el kit de ligadura que se encuentra en el kit AGILENT SURESELECT (Agilent, CA).

A continuación, se amplifican las regiones diana de la biblioteca de ácidos nucleicos generada a partir del ADN aislado de la muestra, especialmente una muestra de ADN libre circulante para los métodos de la presente invención. Para esta amplificación se usa una serie de cebadores o pares de cebadores, que pueden ser entre 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 25000, o 50000 en el extremo inferior del intervalo y 15, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 20 000, 25 000, 50000, 60 000, 75000, o 100000 cebadores en el extremo superior del intervalo, cada uno de los cuales se une a uno de una serie de sitios de unión de cebadores.

Los diseños de cebadores se pueden generar con Primer3 (Untergrasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG (2012) "Primer3 - new capabilities and interfaces." Nucleic Acids Research 40(15):e115 y Koressaar T, Remm M (2007) "Enhancements and modifications of primer design program Primer3." Bioinformatics 23(10):1289-91) código fuente disponible en primer3.sourceforge.net). La especificidad del cebador puede evaluarse mediante BLAST y agregarse a los criterios de canalización de diseño de cebadores existentes:

Las especificidades de los cebadores se pueden determinar mediante el uso del programa BLASTn del paquete ncbiblast-2.2.29+. La opción de tarea "blastn-short" puede usarse para mapear los cebadores contra el genoma humano hg19. Los diseños de cebadores se pueden determinar como "específicos" si el cebadortiene menos de 100 aciertos en el genoma y el acierto superior es la región de unión del cebador complementario objetivo del genoma y tiene al menos dos puntuaciones más que otros aciertos (la puntuación se define mediante BLASTn programa). Esto se puede hacer para tener un único acierto en el genoma y no tener muchos otros aciertos en todo el genoma.

Los cebadores seleccionados finales se pueden visualizar en IGV (James T. Robinson, Helga Thorvaldsdóttir, Wendy Winckler, Mitchell Guttman, Eric S. Lander, Gad Getz, Jill P. Mesirov. Integrative Genomics Viewer. Nature Biotechnology 29, 24-26 (2011)) y UCSC browser (Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. El navegador del genoma humano en UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006) mediante el uso de archivos de cama y mapas de cobertura para la validación.

Los métodos de la presente invención, en ciertas modalidades, incluyen formar una mezcla de reacción de amplificación. La mezcla de reacción típicamente se forma combinando una polimerasa, nucleótidos trifosfatos, fragmentos de ácidos nucleicos de una biblioteca de ácidos nucleicos generada a partir de la muestra, un conjunto de cebadores directos e inversos específicos para las regiones objetivo que contienen SNV. Las mezclas de reacción proporcionadas en la presente descripción, formando ellas mismas en modalidades ilustrativas, un aspecto separado de la invención.

Una mezcla de reacción de amplificación útil para la presente invención incluye componentes conocidos en la técnica para la amplificación de ácidos nucleicos, especialmente para la amplificación por PCR. Por ejemplo, la mezcla de reacción típicamente incluye trifosfatos de nucleótidos, una polimerasa y magnesio. Las polimerasas que son útiles para la presente invención pueden incluir cualquier polimerasa que pueda usarse en una reacción de amplificación, especialmente aquellas que son útiles en las reacciones de PCR. En ciertas modalidades, las polimerasas Taq de arranque en caliente son especialmente útiles. Las mezclas de reacción de amplificación útiles para practicar los métodos proporcionados en la presente descripción, tal como la mezcla maestra AmpliTaq Gold (Life Technologies, Carlsbad, CA), están disponibles comercialmente.

Las condiciones de amplificación (por ejemplo, ciclos de temperatura) para PCR se conocen bien en la técnica. Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir cualquier condición de ciclo de PCR que resulte en la amplificación de ácidos nucleicos diana tales como ácidos nucleicos diana de una biblioteca. En la sección de Ejemplos en la presente descripción se proporcionan condiciones de ciclado ilustrativas no limitantes.

Hay muchos flujos de trabajo que son posibles al realizar PCR; algunos flujos de trabajo típicos de los métodos descritos en la presente descripción se proporcionan en la presente descripción. Las etapas descritas en la presente descripción no pretenden excluir otras etapas posibles ni implican que ninguna de las etapas descritas en la presente descripción sea necesario para que el método funcione correctamente. En la bibliografía se conocen un gran número de variaciones de parámetros u otras modificaciones, y se pueden realizar sin afectar a la esencia de la invención.

En ciertas modalidades del método proporcionado en la presente descripción, se determina al menos una porción y, en ejemplos ilustrativos, la secuencia completa de un amplicón, tal como un amplicón diana del cebador externo. Los métodos para determinar la secuencia de un amplicón son conocidos en la técnica. Cualquiera de los métodos de secuenciación conocidos en la técnica, por ejemplo, la secuenciación de Sanger, puede usarse para dicha determinación de secuencias. En modalidades ilustrativas, técnicas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento (también denominadas en la presente descripción técnicas de secuenciación masiva en paralelo) tales como, entre otras, las empleadas en MYSEQ (ILLUMINA), HISEQ (ILLUMINA), ION TORRENT (LIFE TECHNOLOGIES), GENOME ANALYZER ILX (ILLUMINA), GS FLEX+ (ROCHE 454), pueden usarse para secuenciar los amplicones producidos por los métodos proporcionados en la presente descripción.

Los secuenciadores genéticos de alto rendimiento son aptos para el uso de códigos de barras (es decir, etiquetado de muestras con secuencias distintivas de ácidos nucleicos) para identificar muestras específicas de individuos, de esta manera permite el análisis simultáneo de múltiples muestras en una sola ejecución del secuenciador de ADN. El número de veces que se secuencia una región dada del genoma en una preparación de biblioteca (u otra preparación nucleica de interés) (número de lecturas) será proporcional al número de copias de esa secuencia en el genoma de interés (o nivel de expresión en el caso de las preparaciones que contienen ADNc). Los sesgos en la eficiencia de la amplificación pueden tenerse en cuenta en dicha determinación cuantitativa.

Genes diana

Los genes diana de la presente invención en modalidades ejemplares son genes relacionados con el cáncer y, en muchas modalidades ilustrativas, genes relacionados con el cáncer de pulmón. Un gen relacionado con el cáncer (por ejemplo, un gen relacionado con el cáncer de pulmón o un gen relacionado con el SCC de pulmón o un gen relacionado con el ADC de pulmón) se refiere a un gen asociado con un riesgo alterado de cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón o SCC de pulmón o pulmón ADC, respectivamente) o un pronóstico alterado para un cáncer. Genes ilustrativos relacionados con el cáncer que promueven el cáncer incluyen oncogenes; genes que potencian la proliferación, invasión o metástasis celular; genes que inhiben la apoptosis; y genes pro-angiogénesis. Los genes relacionados con el cáncer que inhiben el cáncer incluyen, entre otros, genes supresores de tumores; genes que inhiben la proliferación, invasión o metástasis celular; genes que promueven la apoptosis; y genes anti-angiogénesis.

Una modalidad del método de detección de mutaciones comienza con la selección de la región del gen que se convierte en el objetivo. La región con mutaciones conocidas se usa para desarrollar cebadores para mPCR-NGS para amplificar y detectar la mutación.

Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden usarse para detectar prácticamente cualquier tipo de mutación, especialmente mutaciones que se sabe que están asociadas con cáncer y, más particularmente, los métodos proporcionados en la presente descripción están dirigidos a mutaciones, especialmente SNV, asociadas con cáncer de pulmón, específicamente adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas. Los SNV ilustrativos pueden estar en uno o más de los siguientes genes: EGFR, FGFR1, FGFR2, ALK, MET, ROS1, NTRK1, RET, HER2, DDR2, PDGFRA, KRAS, NF1, BRAF, PIK3CA, MEK1, NOTCH1, MLL2, EZH2, TET2, DNMT3A, SOX2, MYC, KEAP1, CDKN2A, NRG1, TP53, LKB1 y PTEN, que se han identificado en varias muestras de cáncer de pulmón como mutados, con un mayor número de copias o fusionados con otros genes y sus combinaciones (Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Chen y otros, Nat. Rev. Cancer. 2014 Ago 14(8):535-551). En otro ejemplo, la lista de genes son los enumerados anteriormente, donde se han informado SNV, tal como en el citado en la referencia Chen y otros. En otra modalidad, los SNV pueden incluir SNV que se encuentran en uno de los genes que se encuentran en la Tabla 19 en la presente descripción. Los SNV en los genes enumerados en la Tabla 19 se analizaron en el experimento del Ejemplo 1. Los SNV en estos genes se detectaron en muestras de tumores que coincidían con las muestras de ctDNA del Ejemplo 1. En algunas modalidades, los SNV que se analizan en los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir cualquiera de los genes enumerados en este párrafo anterior o cualquiera de los genes en la Tabla 19 que no se enumeran anteriormente. En la presente descripción se proporcionan métodos que usan la determinación específica de un SNV particular en un gen particular para dirigir una terapia farmacológica dirigida.

Mezclas de reacción de amplificación (por ejemplo PCR):

Los métodos de la presente invención incluyen la formación de una mezcla de reacción de amplificación. La mezcla de reacción típicamente se forma mediante la combinación de una polimerasa, nucleótidos trifosfatos, fragmentos de ácido nucleico de una biblioteca de ácidos nucleicos generada a partir de la muestra, una serie de cebadores externos directos específicos de la diana y un cebador universal externo inverso de primera cadena. Otra modalidad ilustrativa es una mezcla de reacción que incluye cebadores internos específicos de la diana directa en lugar de los cebadores externos específicos de la diana directa y amplicones de una primera reacción de PCR mediante el uso de los cebadores externos, en lugar de fragmentos de ácido nucleico de la biblioteca de ácidos nucleicos. Las mezclas de reacción proporcionadas en la presente descripción, formando ellas mismas en modalidades ilustrativas, un aspecto separado de la invención. En modalidades ilustrativas, las mezclas de reacción son mezclas de reacción de PCR. Las mezclas de reacción de PCR típicamente incluyen magnesio.

En algunas modalidades, la mezcla de reacción incluye ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), magnesio, cloruro de tetrametil amonio (TMAC) o cualquiera de sus combinaciones. En algunas modalidades, la concentración de TMAC está entre 20 y 70 mM, inclusive. Si bien no pretende vincularse a ninguna teoría en particular, se cree que TMAC se une al ADN, estabiliza los dúplex, aumenta la especificidad de los cebadores y/o iguala las temperaturas de fusión de diferentes cebadores. En algunas modalidades, TMAC aumenta la uniformidad en la cantidad de productos amplificados para los diferentes objetivos. En algunas modalidades, la concentración de magnesio (tal como el magnesio procedente del cloruro de magnesio) está entre 1 y 8 mM.

La gran cantidad de cebadores usados para el PCR múltiple de una gran cantidad de blancos puede quelar una gran cantidad de magnesio (2 fosfatos en los cebadores quelan 1 magnesio). Por ejemplo, si se usan suficientes cebadores de manera que la concentración de fosfato de los cebadores sea ~9 mM, entonces los cebadores pueden reducir la concentración efectiva de magnesio en -4,5 mM. En algunas modalidades, se usa EDTA para disminuir la cantidad de magnesio disponible como cofactor para la polimerasa, ya que las altas concentraciones de magnesio pueden dar como resultado errores de PCR, tal como la amplificación de loci no objetivo. En algunas modalidades, la concentración de EDTA reduce la cantidad de magnesio disponible entre 1 y 5 mM (tal como entre 3 y 5 mM).

En algunas modalidades, el pH está entre 7,5 y 8,5, tal como entre 7,5 y 8, 8 y 8,3 u 8,3 y 8,5, inclusivo. En algunas modalidades, Tris se usa, por ejemplo, en una concentración de entre 10 y 100 mM, tal como entre 10 y 25 mM, 25 y 50 mM, 50 y 75 mM o 25 y 75 mM, inclusive. En algunas modalidades, cualquiera de estas concentraciones de Tris se usó a un pH entre 7,5 y 8,5. En algunas modalidades, una combinación de KCl y (N H ^S O ⁴se usa, tal como entre 50 y 150 mM KCl y entre 10 y 90 mM de (NH⁴)²SO⁴, inclusivo. En algunas modalidades, la concentración de KCl está entre 0 y 30 mM, entre 50 y 100 mM o entre 100 y 150 mM, inclusive. En algunas modalidades, la concentración de (NH4)zSOa está entre 10 y 50 mM, 50 y 90 mM, 10 y 20 mM, 20 y 40 mM, 40 y 60 mM o 60 y 80 mM de (NH⁴)²SO⁴, inclusive. En algunas modalidades, el amonio [NH⁴⁺] la concentración está entre 0 y 160 mM, tal como entre 0 y 50, 50 a 100 o 100 a 160 mM, inclusive. En algunas modalidades, la suma de las concentraciones de potasio y amonio ([K⁺] [NH⁴⁺]) está entre 0 y 160 mM, tal como entre 0 y 25, 25 a 50, 50 a 150, 50 a 75, 75 a 100, 100 a 125 o 125 a 160 mM, inclusive. Un tampón ilustrativo con [K⁺] [NH⁴⁺] = 120 mM es 20 mM KCl y 50 mM de (NH⁴)²SO⁴. En algunas modalidades, el tampón incluye Tris de 25 a 75 mM, pH de 7,2 a 8, KCl de 0 a 50 mM, sulfato de amonio de 10 a 80 mM y magnesio de 3 a 6 mM, inclusive. En algunas modalidades, el tampón incluye Tris de 25 a 75 mM, pH de 7 a 8,5, MgCl de 3 a 6 mM, KCl de 10 a 50 mM y de 20 a 80 mM de (NH4) ²SO⁴, inclusive. En algunas modalidades, se usan de 100 a 200 unidades/mL de polimerasa. En algunas modalidades, se usan 100 mM KCl, 50 mM (NH⁴)²SO⁴, MgCl²3 mM, 7,5 nM de cada cebador de la biblioteca, TMAC 50 mM y 7 uL de plantilla de ADN en un volumen final de 20 ul a pH 8,1.

En algunas modalidades, se usa un agente de aglutinación, tal como polietilenglicol (PEG, tal como PEG 8000) o glicerol. En algunas modalidades, la cantidad de PEG (tal como PEG 8,000) está entre el 0,1 y el 20 %, como entre el 0,5 y el 15 %, entre el 1 y el 10 %, entre el 2 y el 8 % o entre el 4 y el 8 %, inclusive. En algunas modalidades, la cantidad de glicerol está entre el 0,1 y el 20 %, tal como entre el 0,5 y el 15 %, entre el 1 y el 10 %, entre el 2 y el 8 % o entre el 4 y el 8 %, inclusive. En algunas modalidades, un agente de aglutinación permite usar una baja concentración de polimerasa y/o un tiempo de hibridación más corto. En algunas modalidades, un agente de aglutinación mejora la uniformidad del DOR y/o reduce los abandonos (alelos no detectados). P o lim e ra s a s En algunas modalidades, se usan una polimerasa con actividad de corrección de pruebas, una polimerasa sin (o con actividad de corrección de pruebas insignificante), o una mezcla de una polimerasa con actividad de corrección de pruebas y una polimerasa sin (o con actividad de corrección de pruebas insignificante). En algunas modalidades, se usa una polimerasa de inicio en caliente, una polimerasa de inicio no en caliente o una mezcla de una polimerasa de inicio en caliente y una polimerasa de inicio no en caliente. En algunas modalidades, se usa una polimerasa de ADN HotStarTaq (véase, por ejemplo, el catálogo de QIAGEN Núm. 203203). En algunas modalidades, se usa la ADN polimerasa AmpliTaq Gold^®. En algunas modalidades, se usa una ADN polimerasa PrimeSTAR GXL, una polimerasa de alta fidelidad que proporciona una amplificación por PCR eficiente cuando hay un exceso de molde en la mezcla de reacción y cuando se amplifican productos largos (Takara Clontech, Mountain View, CA). En algunas modalidades, se usa la ADN polimerasa KAPA Taq o la ADN polimerasa KAPA Taq HotStart; se basan en la subunidad única, ADN polimerasa T a q de tipo salvaje de la bacteria termófila T h e rm u s a q u a tic u s . Las ADN polimerasas KAPA Taq y KAPA de arranque en caliente tienen actividades de polimerasa 5'-3' y exonucleasa 5'-3', pero no tienen actividad de exonucleasa (corrección) de 3' a 5' (ver, por ejemplo, el catálogo KAPA BIOSYSTEMS Núm. BK1000). En algunas modalidades, se usa la ADN polimerasa P fu ; es una polimerasa de ADN altamente termoestable del archaeum hipertermofílico P y ro c o c c u s fu r io s u s . La enzima cataliza la polimerización dependiente de la plantilla de nucleótidos en ADN dúplex en la dirección 5 '^3 '. La ADN polimerasa P fu también exhibe actividad de exonucleasa 3 '^ 5 ' (corrección de pruebas) que permite que la polimerasa corrija errores de incorporación de nucleótidos. No tiene actividad de exonucleasa 5 '^ 3 ' (véase, por ejemplo, el catálogo de Thermo Scientific Núm. EP0501). En algunas modalidades se usa Klentaql; es un análogo del fragmento Klenow de la ADN polimerasa Taq, no tiene actividad exonucleasa o endonucleasa (véase, por ejemplo, DNA POLYMERASE TECHNOLOGY, Inc, St. Louis, Missouri, catálogo Núm. 100). En algunas modalidades, la polimerasa es una ADN polimerasa PHUSION, tal como la ADN polimerasa de alta fidelidad PHUSION (M0530S, New England BioLabs, Inc.) o la ADN polimerasa PHUSION arranque en caliente Flex (M0535S, New England BioLabs, Inc.). En algunas modalidades, la polimerasa es una ADN polimerasa Q5®,tal como la ADN polimerasa Q5®de alta fidelidad (M0491S, New England BioLabs, Inc.) o la ADN polimerasa Q5®de alta fidelidad arranque en caliente (M0493S, New England BioLabs, Inc.). En algunas modalidades, la polimerasa es una ADN polimerasa T4 (M0203S, New England BioLabs, Inc.).

En alguna modalidad, se usan entre 5 y 600 Unidades/mL (Unidades por 1 mL de volumen de reacción) de polimerasa, tal como entre 5 a 100, 100 a 200, 200 a 300, 300 a 400, 400 a 500 o 500 a 600 unidades/mL, inclusive.

Métodos de PCR

En algunas modalidades, la PCR de inicio en caliente se usa para reducir o prevenir la polimerización antes del termociclado de la PCR. Los métodos ilustrativos de PCR de inicio en caliente incluyen la inhibición inicial de la ADN polimerasa o la separación física de la reacción de los componentes de la reacción hasta que la mezcla de reacción alcanza temperaturas más altas. En algunas modalidades, se usa la liberación lenta de magnesio. La ADN polimerasa requiere iones de magnesio para su actividad, por lo que el magnesio se separa químicamente de la reacción al unirse a un compuesto químico y se libera en la solución solo a alta temperatura. En algunas modalidades, se usa la unión no covalente de un inhibidor. En este método, un péptido, anticuerpo o aptámero se unen de forma no covalente a la enzima a baja temperatura e inhiben su actividad. Después de la incubación a temperatura elevada, se libera el inhibidor y comienza la reacción. En algunas modalidades, se usa una Taq polimerasa sensible al frío, tal como una ADN polimerasa modificada que casi no tiene actividad a baja temperatura. En algunas modalidades, se usa modificación química. En este método, una molécula se une covalentemente a la cadena lateral de un aminoácido en el sitio activo de la ADN polimerasa. La molécula se libera de la enzima mediante la incubación de la mezcla de reacción a temperatura elevada. Una vez que se libera la molécula, la enzima se activa.

En algunas modalidades, la cantidad de ácidos nucleicos molde (tal como una muestra de ARN o ADN) está entre 20 y 5000 ng, tal como entre 20 y 200, 200 a 400, 400 a 600, 600 a 1000; 1000 a 1500; o 2000 a 3000 ng, inclusive.

En algunas modalidades se usa un kit de PCR QIAGEN Multiplex (Núm. de catálogo de QIAGEN 206143). Para 100 x 50 |jL de reacciones de PCR múltiple, el kit incluye 2x mezcla maestra de PCR múltiple de QIAGEN (que proporciona una concentración final de 3 mM MgCh, 3 * 0,85 mL), solución Q 5x (1 * 2,0 mL) y agua sin ARNasa (2 * 1,7 mL). mezcla maestra de PCR múltiple de QIAGEN (MM) contiene una combinación de KCl y (NH4)2SO4 así como también el aditivo de PCR, Factor MP, que aumenta la concentración local de cebadores en la plantilla. El factor MP estabiliza los cebadores unidos específicamente, lo que permite una extensión eficaz de los cebadores mediante la ADN polimerasa HotStarTaq. La ADN polimerasa HotStarTaq es una forma modificada de la ADN polimerasa T a q y no tiene actividad polimerasa a temperatura ambiente. En algunas modalidades, la ADN polimerasa HotStarTaq se activa mediante una incubación de 15 minutos a 95 °C que se puede incorporar a cualquier programa de termociclador existente.

Puede usarse una concentración final de QIAGEN MM 1x (la concentración recomendada), 7,5 nM de cada cebador de la biblioteca, TMAC 50 mM y 7 ul de plantilla de ADN en un volumen final de 20 ul. Las condiciones de termociclado de la PCR pueden incluir 95 °C durante 10 minutos (inicio en caliente); 20 ciclos de 96 °C por 30 segundos; 65 °C durante 15 minutos; y 72 °C durante 30 segundos; seguido de 72 °C durante 2 minutos (extensión final); y luego en espera a 4 °C.

Puede usarse una concentración final de QIAGEN MM 2x (el doble de la concentración recomendada), 2 nM de cada cebador de la biblioteca, TMAC 70 mM y 7 ul de plantilla de ADN en un volumen total de 20 ul. En algunas modalidades, también se incluye EDTA hasta 4 mM. Las condiciones de termociclado de la PCR incluyen 95 °C durante 10 minutos (arranque en caliente); 25 ciclos de 96 °C por 30 segundos; 65 °C durante 20, 25, 30, 45, 60, 120 o 180 minutos; y opcionalmente 72 °C durante 30 segundos); seguido de 72 °C durante 2 minutos (extensión final); y luego en espera a 4 °C.

Un enfoque de PCR semianidado puede incluir una primera reacción de PCR que usa 20 ul de un volumen de reacción con una concentración final de QIAGEN MM de 2x, 1,875 nM de cada cebador en la biblioteca (cebadores directos e inversos externos) y una plantilla de ADN. Los parámetros de termociclado incluyen 95 °C durante 10 minutos; 25 ciclos de 96 °C por 30 segundos, 65 °C por 1 minuto, 58 °C por 6 minutos, 60 °C por 8 minutos, 65 °C por 4 minutos y 72 °C por 30 segundos; y luego 72 °C durante 2 minutos, y luego en espera a 4 °C. A continuación, 2 ul del producto resultante, diluido 1:200, se usan como entrada en una segunda reacción de PCR. Esta reacción usa un volumen de reacción de 10 ul con una concentración final de QIAGEN MM 1x, 20 nM de cada cebador directo interno y 1 uM de etiqueta de cebador inverso. Los parámetros de termociclado incluyen 95 °C durante 10 minutos; 15 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 65 °C por 1 minuto, 60 °C por 5 minutos, 65 °C por 5 minutos y 72 °C por 30 segundos; y luego 72 °C durante 2 minutos, y luego en espera a 4 °C. La temperatura de hibridación puede ser opcionalmente más alta que las temperaturas de fusión de algunos o todos los cebadores, como se analiza en la presente descripción (ver solicitud de patente de Estados Unidos núm 14/918,544, presentada el 20 de octubre de 2015).

La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que la mitad (50 %) de un dúplex de ADN de un oligonucleótido (tal como un cebador) y su complemento perfecto se disocia y se convierte en ADN de una sola cadena. La temperatura de hibridación (Ta) es la temperatura a la que se ejecuta el protocolo PCR. Para los métodos anteriores, por lo general es 5 °C más abajo de la Tm más baja de los cebadores usados, por lo que se forman casi todos los dúplex posibles (de manera que esencialmente todas las moléculas de cebador se unen al ácido nucleico molde). Si bien esto es altamente eficiente, a temperaturas más bajas es probable que ocurran más reacciones inespecíficas. Una consecuencia de tener una Ta demasiado baja es que los cebadores pueden hibridarse con secuencias distintas a la verdadera diana, ya que pueden tolerarse los desajustes internos de una sola base o la hibridación parcial. En algunas modalidades de la presente invención, la Ta es mayor que Tm, donde en un momento dado solo una pequeña fracción de los objetivos tiene un cebador hibridado (tal como solo ~ 1-5 %). Si estos se extienden, se eliminan del equilibrio de hibridación y disociación de los cebadores y el objetivo (a medida que la extensión aumenta Tm rápidamente a más de 70 °C), y un nuevo ~1-5 % de los objetivos tiene cebadores. Por lo tanto, al darle a la reacción un tiempo prolongado para el hibridación, se puede obtener ~100 % de los objetivos copiados por ciclo.

En varias modalidades, la temperatura de hibridación está entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 °C y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 15 °C en el extremo superior del intervalo, mayor que la temperatura de fusión (tal como la T m) medida empíricamente o calculada de al menos 25, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 95 o 100 % de los cebadores no idénticos. En varias modalidades, la temperatura de hibridación está entre 1 y 15 °C (tal como entre 1 y 10, 1 a 5, 1 a 3, 3 a 5, 5 a 10, 5 a 8, 8 a 10, 10 a 12, o de 12 a 15 °C, inclusive) superior a la temperatura de fusión (tal como la Tm medida empíricamente o calculada) de al menos 25; 50; 75; 100; 300; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 15 000; 19 000; 20 000; 25 000; 27 000; 28 000; 30 000; 40 000; 50 000; 75 000; 100 000; o todos los cebadores no idénticos. En varias modalidades, la temperatura de hibridación está entre 1 y 15 °C (tales como, entre 1 y 10, 1 y 5, 1 y 3, 3 y 5, 3 y 8, 5 y 10, 5 y 8, 8 y 10, 10 a 12, o 12 a 15 °C, inclusive) mayor que la temperatura de fusión (como la Tm medida empíricamente o calculada) de al menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o todos los cebadores no idénticos, y la duración de la etapa de hibridación (por ciclo de PCR) es entre 5 y 180 minutos, tal como 15 y 120 minutos, 15 y 60 minutos, 15 y 45 minutos, o 20 y 60 minutos, ambos inclusive.

Métodos ilustrativos de PCR múltiple

Se usan largos tiempos de hibridación (como se discute en la presente descripción y se ejemplifica en el Ejemplo 12) y bajas concentraciones de cebador. De hecho, en ciertas modalidades, se usan concentraciones y/o condiciones de cebador limitantes. La duración de la etapa de hibridación es de 15 minutos. La concentración de cebador es de 10 nM.

A un alto nivel de multiplexación, la solución puede volverse viscosa debido a la gran cantidad de cebadores en la solución. Si la solución es demasiado viscosa, se puede reducir la concentración de cebadores a una cantidad que aún sea suficiente para que los cebadores se unan al ADN molde. En varias modalidades, se usan entre 1000 y 100 000 cebadores diferentes y la concentración de cada cebador es de 10 nM.

Ejemplos

Ejemplo 1. Análisis de variantes de un solo nucleótido (SNV) en el ADN tumoral circulante (ctDNA) de pacientes con cáncer de pulmón

Un estudio piloto anterior demostró la detección exitosa de mutaciones puntuales relevantes para el cáncer en el plasma de pacientes con cáncer. En ese estudio, el perfil de mutación de 4 tumores de cáncer de pulmón se determinó mediante secuenciación del exoma completo (WES) o Ampliseq (Life Technologies, Carlsbad, CA), y un subconjunto de esas mutaciones se detectó con éxito en las muestras de plasma correspondientes mediante el uso de un método de PCR múltiple-secuenciación de próxima generación (mPCR-NGS). En este experimento, llamado TRACERx, se usó el método mPCR-NGS para detectar y rastrear a lo largo del tiempo mutaciones específicas del cáncer en el plasma de pacientes con cáncer, y para evaluar la utilidad del método para monitorear la progresión de la enfermedad durante el tratamiento. El diseño general del proyecto se muestra en la Figura 1. La primera fase del proyecto fue la determinación del perfil de mutaciones de referencia en el plasma de 50 pacientes con cáncer de pulmón sin tratamiento previo. Se obtuvieron muestras de ADN genómico purificado de varias regiones tumorales (2-7 regiones por tumor), muestras de ADN de línea germinal purificado y muestras de plasma intacto de 50 pacientes. WES y AmpliSeq determinaron previamente el perfil de mutaciones de todas las regiones tumorales, y mPCR-NGS analizó un subconjunto de mutaciones por paciente. Esas mutaciones incluían mutaciones tanto conductoras como pasajeras y mutaciones clonales y subclonales. Con base en estos datos, diseñamos ensayos de PCR múltiple, preparamos grupos de cebadores (los cebadores se obtuvieron de IDT, Coralville, Iowa), controlamos los grupos de cebadores y optimizamos el protocolo de mPCR para cada grupo. El cfDNA de plasma se purificó, cuantificó y convirtió en bibliotecas. Luego, las bibliotecas se usaron como entrada en mPCR, y los productos se secuenciaron y analizaron. Se aplicó un protocolo similar al ADN genómico del tumor y muestras normales emparejadas.

Descripción de las muestras

Muestras. Para cada uno de los primeros 50 pacientes con TRACERx, se aislaron 4-5 mL de plasma obtenido antes de la resección del tumor y antes de cualquier terapia. Las muestras de plasma se dividieron en alícuotas en tubos de 2 mL y se enviaron congeladas en hielo seco. El ADN genómico purificado de hasta 7 subsecciones tumorales, de los ganglios linfáticos afectados (donde esté disponible) y de la fracción de glóbulos blancos (denominada normal compatible) se purificaron y 500 ng de ADN purificado de cada muestra, se normalizó a 10 ng/ pl, y se analizó. Las muestras de ADN purificado se congelaron y enviaron en hielo seco.

Información del SNV. El perfil de mutaciones, incluidas las variantes de un solo nucleótido (SNV) y las variantes del número de copias (CNV), de cada subsección tumoral se determinó mediante TRACERx mediante el uso de WES. Se usó el perfil de mutaciones completo de cada tumor para detectar la estructura clonal y reconstruir el árbol filogenético de cada tumor. PyClone (PyClone: statistical inference of clonal population structure in cancer. Roth y otros, Nature Methods 11, 396-398 (2014)) se usó para detectar la estructura clonal. PyClone identifica una lista de subclones de SNV y calcula su fracción de células cancerosas. También clasifica los SNV como clonales o subclonales. La categoría de conductora de cada SNV se determinó y proporcionó como la categoría de conductora (1-4, donde 1 es más probable que sea una mutación conductora y 4 es la menos probable). Para cada paciente, se analizaron hasta 108 SNV, que abarcan todas las categorías de conductoras e incluyen mutaciones clonales y subclonales. Se compararon las fracciones alélicas detectadas de cada SNV en cada subsección tumoral, ganglio linfático y muestra de ADN normal coincidente junto con la información del grupo clonal/subclonal de PyClone.

Información adicional. Para cada paciente, se disponía de la siguiente información: tamaño del tumor (mm), localización del tumor (lóbulo pulmonar), etapa del tumor, tipo patológico del tumor, número de ganglios linfáticos afectados, estado de invasión vascular, así como también información anonimizada sobre la recolección. hospital.

Diseño de ensayos y optimización de protocolos.

Diseño de ensayo. Se usó la tubería de diseño de ensayo estándar de Natera para diseñar los cebadores de PCR derecho e izquierdo para todos los SNV dados. Un par de cebadores de PCR derecho e izquierdo dirigidos a un SNV se define como un ensayo para ese SNV en particular. Tenga en cuenta que es posible que un ensayo cubra más de 1 SNV objetivo si están muy cerca. Para cada par de ensayos, se calculó la probabilidad de formar un dímero de cebador. Los datos de la fracción de alelos de SNV en cada tumor se usaron para reconstruir árboles filogenéticos mediante el uso de Lichee (Fast and scalable inference of multi-sample cancer lineages. Popic y otros, Genome Biol.

2015 Mayo 6;16:91). La lista de ensayos para cada muestra se filtró para eliminar los cebadores que se prevé que formen dímeros de cebadores, al mismo tiempo que se da gran prioridad a los ensayos que cubren los SNV de los controladores 1 y 2. Los ensayos restantes se usaron para construir 5 grupos equilibrados. Todos los ensayos combinados fueron compatibles, lo que significa que no se predijo que los cebadores formaran dímeros de cebadores en un grupo. En cada etapa, los ensayos se eligieron de manera que los ensayos que cubren las SNV de las conductores 1 y 2 tienen la prioridad más alta y para cada paciente, la cantidad de SNV seleccionadas por rama fue proporcional a la cantidad total de SNV de esa rama del árbol filogenético reconstruido. Más específicamente, tratamos de tener una muestra uniforme de SNV de las ramificaciones del árbol filogenético reconstruido, asegurándonos de que los ensayos seleccionados proporcionaran una buena cobertura del árbol reconstruido. El diseño final constaba de 972 ensayos, distribuidos equitativamente entre 5 grupos, y que contienen de 15-20 ensayos para cada muestra. El número de SNV y el número de ensayos por muestra por categoría de conductoras se muestran en la Figura 2. Los genes en los que se encuentran los SNV y el número de SNV que se analizaron por gen se encuentran en la Figura 19.

Mezcla QC y optimización. Los 972 pares de cebadores se obtuvieron (IDT, Coralville, lowa) en pocillos individuales, se desalinizaron y normalizaron a 100 pM. Los ensayos se agruparon de acuerdo con el esquema de agrupación, y cada grupo se usó en un experimento combinado de QC/optimización. Para el experimento de optimización, se variaron varios parámetros de PCR y se evaluaron los efectos sobre el rendimiento de secuenciación, así como también el número de ensayos de abandono, a partir de los datos de secuencia. Se determinaron las condiciones de PCR que produjeron el mejor porcentaje de lecturas en el objetivo, profundidad de uniformidad de lectura y tasa de error. Los cebadores que eran responsables de la mayoría de los dímeros de cebadores se identificaron y eliminaron de cada grupo (por cada cebador eliminado, también se eliminó su pareja correspondiente). Después de esta etapa, quedaron 908 ensayos en total, distribuidos equitativamente entre los 5 grupos.

Preparación de las muestras

Extracción de ADN y control de calidad. Todas las alícuotas de plasma de cada paciente se agruparon antes de la extracción de cfDNA, y el grado de hemólisis de cada muestra de plasma agrupada se evaluó visualmente (sin hemólisis, hemólisis leve o hemólisis grave). El cfDNA se extrajo mediante el uso del kit Qiagen NA (Valencia, CA) siguiendo un protocolo optimizado para 5 mL de plasma. Todas las muestras de cfDNA se sometieron a control de calidad en chips Bioanalyzer High Sensitivity (Agilent, Santa Clara, CA). Las mismas ejecuciones de Bioanalyzer High Sensitivity también se usaron para cuantificar las muestras de cfDNA mediante la interpolación de la altura del pico mononucleosomal en una curva de calibración preparada a partir de una muestra pura de cfDNA que se cuantificó previamente. Esto fue necesario porque el cfDNA a veces contiene una fracción de ADN intacta que se superpone con el marcador de gran tamaño en el chip, lo que hace que la cuantificación del pico mononucleosomal no sea confiable. Se cuantificó un subconjunto representativo de las muestras de ADN genómico purificado (de subsecciones de tumores, ganglios linfáticos y glóbulos blancos) mediante el uso Nanodrops (Wilmington, DE). Todas las muestras cuantificadas estaban en el intervalo esperado (~10 ng/pL).

Preparación de la biblioteca de cfDNA. La cantidad total de cfDNA de cada muestra de plasma se usó como entrada en Library Prep mediante el uso del kit de preparación de bibliotecas de Natera y siguiendo las instrucciones del kit. Para dos muestras con cantidades extremadamente altas de cfDNA, la cantidad de entrada en Library Prep se restringió a ~50 000 equivalentes de genoma (165 ng). Las bibliotecas se amplificaron hasta la meseta y luego se purificaron mediante el uso perlas Ampure (Beckman Coulter, Brea, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas purificadas se sometieron a control de calidad en el LabChip.

Secuenciación y PCR múltiple de cfDNA. El material de la biblioteca de cada muestra de plasma se usó como entrada en la PCR múltiple (mPCR) mediante el uso del conjunto de ensayos relevante y un protocolo de mPCR de plasma optimizado. El protocolo utilizó un tiempo de hibridación de 15 minutos a una temperatura de 60 °C o 62,5 °C, que estaba por encima de la Tm de los cebadores. Las Tm de los cebadores mediante el uso de cálculos teóricos fue de 53 a 59 °C. Se usó una concentración de cebador de 10 nM. Los productos de mPCR se codificaron con barras en una etapa de PCR separado, y los productos de PCR con códigos de barras se agruparon de acuerdo con la información de agrupación del ensayo (consulte la sección anterior) en 5 agrupaciones. Los conjuntos se purificaron mediante el uso de perlas Ampure siguiendo el protocolo del fabricante, se sometieron a control de calidad en un chip Bioanalyzer DNA1000 (Agilent, Santa Clara, CA) y se cuantificaron con el kit Qubit dsDNA Broad Range (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Cada grupo contenía bibliotecas preparadas como se ha descrito anteriormente, a partir de 10 muestras de plasma de pacientes con cáncer y 20 controles negativos (preparados a partir de cfDNA extraído de presuntos voluntarios sanos). Las muestras de control negativo se obtuvieron siguiendo los procedimientos reglamentarios necesarios. Cada grupo se secuenció en un ciclo HiSeq 2500 Rapid separado (Illumina, San Diego, CA) con lecturas de índice único de extremo emparejado de 50 ciclos.

Secuenciación y PCR múltiple de ADNg. Las muestras de ADN genómico se usaron como entrada en una mPCR similar mediante el uso de los conjuntos de ensayos relevantes y un protocolo de mPCR genómico optimizado. Los productos de mPCR se codificaron con barras en una etapa de PCR separado y todos los productos con códigos de barras se combinaron en un grupo. El conjunto se purificó mediante el uso de perlas Ampure siguiendo el protocolo del fabricante, se sometió a control de calidad en un chip Bioanalyzer DNA1000 y se cuantificó con el kit Qubit dsDNA Broad Range. El conjunto se secuenció en un único experimento HiSeq2500 Rapid con lecturas de índice único de extremo único de 50 ciclos.

Resultados

La Figura 20 es una tabla que muestra los resultados detallados del análisis e información detallada sobre las muestras que se analizaron en este estudio.

Extracción y análisis de cfDNA. La distribución de las concentraciones de cfDNA para las 50 muestras de plasma (figura 3) siguió la distribución esperada basada en 5 mL de plasma (mediana de 2200 equivalentes de copia del genoma por mL de plasma). Las concentraciones de cfDNA, el grado de hemólisis (estimado visualmente) y la evaluación cualitativa del perfil de tamaño de cfDNA (estimado visualmente a partir de las trazas del Bioanalyzer) se muestran en forma de tabla en la Figura. 16

Análisis de ADNc. La concentración de cfDNA purificado, el grado de hemólisis plasmática y el perfil de cfDNA se muestran en la Figura 16. Concentración de cfDNA se refiere únicamente al pico mononucleosómico y se determinó a partir de la altura del pico mononucleosómico mediante el uso de una curva de calibración. Los equivalentes de copia del genoma se calcularon mediante el uso de un factor de conversión de 3,3 pg/genoma; se usan 40 pl de cfDNA purificado como entrada en Library Prep; puntos destacados en verde: para esas muestras, la entrada en la preparación de la biblioteca se restringió a 50000 equivalentes de genoma. Perfil de tamaño de cfDNA:1: la mayor parte del cfDNA está en el pico mononucleosómico; 2: la mayor parte del cfDNA está en el pico mononucleosómico, pero se observan otros tamaños; 3: se observa un gran pico de ADN intacto (>1000 pb) junto con el pico mononucleosómico y algunos picos de mayor peso molecular. La hemólisis se estimó visualmente en base al color del plasma. 0: sin hemólisis (plasma amarillo); 1: hemólisis leve (plasma rosa pálido); 2: hemólisis grave (plasma rosa o rojo brillante).

Análisis VAF en subsecciones tumorales. Los datos de secuencia de cada una de las subsecciones tumorales se analizaron para determinar la frecuencia de alelos variante (VAF) de cada SNV en cada subsección tumoral, ganglio linfático y muestra normal coincidente. Estos datos se compararon con los datos combinados proporcionados por separado de un sitio de prueba diferente mediante el uso de diferentes métodos de prueba, tal como la secuenciación del genoma completo y la secuenciación del exoma. Para la mayoría de las muestras, los valores de VAF de tejido previamente determinados de cada subsección del tumor coincidieron estrechamente con los valores de VAF de tejido recién derivados (Figura 4). Sin embargo, hubo un gran número de muestras en las que se observaron discrepancias significativas (Figura 5). Se observaron tres tipos de discrepancias: (i) para una o dos subsecciones, todos los VAF son 0 o cercanos a 0 en el análisis anterior, pero no son cero (y abarcan el intervalo de VAF visto en otras subsecciones de la misma muestra) en el análisis mPCR-NGS (por ejemplo: LTX041, LTX111); (ii) para varios ensayos, los VAF son 0 en el análisis mPCR-NGS, pero no son cero (y abarcan el intervalo de VAF visto en otras subsecciones de la misma muestra) en el análisis anterior, y no se agruparon por subsección visto con este modo de discrepancia (por ejemplo: LTX093, LTX074); (iii) para varios ensayos o regiones, ninguno de los ensayos falló, pero la concordancia entre los VAF obtenidos en los dos análisis fue generalmente deficiente (por ejemplo, LTX063, LTX059).

También identificamos 16 SNV somáticas de muestras de tejido que no se informaron en las llamadas de TRACERx SNV. Entre estos nuevos SNV somáticos, 7 también se denominaron cfDNA en su plasma correspondiente. Consulte la lista en la Figura. 18.

Una muestra (U_LTX206, con 19 ensayos) falló en la secuenciación y se eliminó del análisis. Se analizaron 889 ensayos que cubren 911 SNV. Los ensayos con una profundidad de lectura de menos de 1000 se consideraron fallidos y sus SNV correspondientes se marcaron como "sin asignar". En total, se eliminaron del análisis 21 SNV "sin asignar"; Se analizaron 890 SNV totales.

Cada ejecución pertenecía aun conjunto de ensayos y contenía 10 muestras de cáncer, así como también 20 muestras de control. El conjunto de SNV cubiertos por los ensayos en un conjunto se consideran SNV objetivo para la ejecución asociada. Para fabricar una llamada SNV en una posición específica de una muestra de cáncer, primero se construyó un modelo de error de fondo para esa posición. El modelo de error se construyó en base a las 20 muestras negativas y las muestras de cáncer restantes (8 o 9) que no se esperaba que contuvieran un SNV en esa posición, según la información proporcionada. Las posiciones con VAF > 20 % fueron excluidas del modelo de error de fondo. Se realizó una llamada de SNV de plasma positiva si la confianza para esa mutación en la muestra de plasma correspondiente superó nuestro umbral de confianza de 95 a 98 %.

La tasa general de detección de SNV en plasma es del 35,5 % (310 de 890), similar a un estudio piloto anterior. Si bien el algoritmo hizo las llamadas positivas verdaderas más confiables, la cantidad de llamadas positivas falsas se encuentra en un número aceptable (<0,25 %). La frecuencia promedio de alelos mutantes para los SNV detectados con alta confianza es 0,875 %, con un intervalo de 0,011 % a 13,93 %. Una muestra se consideró "detectada en plasma" si al menos un SNV que se esperaba que estuviera presente en esa muestra se detectó con seguridad en el plasma. Mediante el uso de esta definición, la tasa general de detección de muestras en plasma fue del 69 % (34 de 49 muestras), y para ellas, la cantidad promedio de SNV detectadas en plasma fue de 9,1 (intervalo de 1 a 19). La cantidad de SNV detectadas en plasma para cada muestra se muestra en forma tabular en la Figura. 17.

Análisis de SNV que no fueron detectados en plasma. Varias líneas de evidencia soportan la conclusión de que la falla en la detección de >60 % (580 de 911) de los SNV esperados en el plasma se debe al hecho de que no hay suficiente evidencia de la presencia de esas mutaciones en la muestra de cfDNA, como opuesto a alguna falla del método mPCR-NGS: La distribución de la profundidad de lectura (DOR) es similar para los ensayos que detectaron el SNV de ^{plasma esperado y los que no detectaron el SNV esperado (Figura}6a) (DOR promedio de 45551 para los ensayos que detectaron el SNV esperado frente a 45 133 para los eso no lo hizo). Esto sugiere que los ensayos correspondientes a las llamadas SNV negativas falsas son tan eficientes como los de las llamadas positivas verdaderas. Además, a pesar de la alta DOR en la posición SNV de destino, el número de lecturas mutantes es casi insignificante. De hecho, el 36 % de ellos tiene 0 lecturas mutantes, el 75 % tiene más de 5 lecturas mutantes y el 25 % restante de llamadas falsas negativas tiene VAF < ,1 %.

Factores que influyen en la detección de SNV en plasma.

Se han evaluado varios factores que influyen en la detectabilidad del SNV en plasma. La cantidad de cfDNA y la información de estadificación del tumor, el tamaño del tumor y las frecuencias de SNV en las subsecciones del tumor se determinaron en ubicaciones separadas.

Tipo histológico. El predictor más importante de la detección de un tumor en particular en el plasma parece ser el tipo histológico: El 100 % de los tumores de carcinoma de células escamosas (SQCC) se detectaron en plasma, mientras que solo el 50 % (15/29) de los tumores de adenocarcinoma (ADC) se detectaron en plasma en este estudio (Figura 7). Además, el número promedio de SNV detectados por muestra fue de 12,7 (mediana = 13) para SQCC y de 2,6 (mediana = 1) para ADC. Solo había un tumor de carcinosarcoma y un tumor adenoescamoso en esta cohorte, por lo que no se pudieron derivar conclusiones sobre su detectabilidad general en plasma sobre esos tipos de tumores en este momento.

Etapa y tamaño del tumor. La etapa y el tamaño del tumor fueron algunos de los factores más importantes identificados que influyen en el número de SNV detectados en la muestra de plasma correspondiente (Figura 8). Los tumores en etapa 1a tenían la probabilidad más baja de que se detectara al menos una ^sN^v, así como también la tasa de éxito más baja en la detección de SNV en el plasma. La distribución de VAF para los SNV que se detectaron a partir de tumores en etapa 1a también fue menor que para el resto de los tumores (Figura 9). Como el tamaño del tumor y la etapa están correlacionados, se observó una tendencia similar con el tamaño del tumor. Como esto no se debió a la falla del ensayo o a los límites de sensibilidad (ver más abajo), la explicación más probable es que dichos tumores tienden a no tener cfDNA presente en el plasma en cantidades detectables en los volúmenes de plasma usados en este estudio. El efecto de la etapa y el tamaño del tumor en el número de SNV detectados en ctDNA varió entre las muestras de ADC y SQCC. Las muestras de ADC eran más dependientes de estos factores con una tendencia general de muchos menos SNV detectados en ctDNA que los detectados en ctDNA de las muestras de SCC. De hecho, se detectaron SNV en el ctDNA de todas las muestras de SQCC independientemente de la etapa: Se detectaron tres SNV en el ctDNA de una de las muestras de SCC y al menos 5 SNV detectados en el ctDNA del resto de las muestras de SCC (Figura 15). De hecho, se detectaron entre 3 y 19 SNV en el ctDNA de las muestras de SCC. En 6 muestras de ADC que estaban en la etapa 1a, solo se detectó un SNV en una de las muestras de ctDNA, y en esa muestra solo se detectó un único SNV. En ninguna de las muestras de ADC de la etapa 1a se detectó más de 1 SNV en el ctDNA. En las muestras de ADC de etapa 1b, se identificaron menos de 5 SNV en todas las muestras excepto en dos, con 7 SNV identificadas en una de las muestras de ADC de etapa 1b y 18 SNV identificadas en una de las muestras de etapa 1b.

VAF tumoral y clonalidad. La relación de clonalidad se calculó para cada mutación como (número de subsecciones de un tumor donde se detecta la mutación)/(número total de subsecciones de ese tumor analizado). Las mutaciones que se observaron en todas las secciones tumorales analizadas se consideran "clonales", todas las demás se consideran "subclonales". El VAF de los SNV detectados en plasma se correlaciona con la "clonalidad" de las mutaciones, siendo más mutaciones clonales las responsables de los valores más altos de VAF en plasma (Figuras 9 y 12); De manera similar, los SNV presentes en múltiples subsecciones de tumores tienden a ser responsables de VAF plasmáticos más altos en las muestras de plasma correspondientes. Además de la relación de clonalidad, PyCloneCluster clasificó el estado clonal de cada SNV en función de los datos WES del tejido tumoral. Los SNV clonales tendían a tener VAF más altos (Figuras 13 y 14).

Entrada de cfDNA y VAF tumoral. No hubo correlación entre la cantidad de cfDNA y el número y la proporción de SNV detectados en las muestras de plasma. La cantidad de entrada de cfDNA no predice el número de SNV detectados en el plasma; sin embargo, todas las muestras con entrada alta (>25000 copias) tenían al menos un SNV detectado en plasma (Figura 10). El plasma SNV VAF también se correlaciona con el tumor SNV VAF (Figura 11).

Análisis multivariable. Se realizó un análisis de regresión para determinar las variables que pueden usarse para predecir nuestra detección de mutaciones. Más específicamente, se usó una variable de respuesta 0/1 para anotar las mutaciones que llamamos presentes o no. Las siguientes variables independientes fueron incluidas en nuestro modelo:

1. VAF tumoral

2. PyCloneCluster (variable categórica)

3. Etapa del cáncer (variable categórica)

4. Tamaño del tumor

5. Cantidad de ADN de entrada

6. Tipo patológico (variable categórica)

7. Número de ganglios linfáticos afectados

8. Invasión vascular (variable categórica)

9. Lóbulo afectado

Una regresión logística mostró que las siguientes variables tenían una asociación estadísticamente significativa con la detección de una mutación (con valores de p < 5 %):

1. VAF tumoral (p = 4,3e-6)

2. PyCloneCluster (p = 1,6e-4)

3. Tamaño del tumor (p = 3,5e-4)

4. Tipo patológico (p = 8,3e-30)

Conclusiones. Demostramos en este ejemplo la detección exitosa de SNV relacionados con el cáncer de pulmón en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Mediante el uso de un panel de PCR múltiple personalizado adaptado para esta cohorte de muestra, se detectaron SNV con una fracción de alelo variante tan baja como 0,01 %. De los SNV analizados, el 35 % se detectaron en las muestras de plasma y el 67 % de las muestras analizadas tenían al menos un SNV de plasma detectado. También identificamos algunos de los factores que contribuyen a la detección exitosa de SNV en plasma. Estos incluyen el tipo de tumor, la etapa del tumor, el tamaño del tumor, la frecuencia del alelo SNV en el tumor y, en menor medida, la cantidad de cfDNA analizado. El hallazgo de que no todos los SNV se detectaron en el plasma, y que no todas las muestras tienen SNV detectables en el plasma, no parece deberse a las limitaciones del ensayo o del protocolo, ya que esos ensayos fueron funcionales (como lo demuestra la profundidad de lectura de la secuenciación) y su límite de detección fue suficiente para detectar cualquier SNV, en caso de que estuviera presente en la muestra de cfDNA. Más bien, la falla en detectar esos SNV probablemente se debió al hecho de que no están presentes en la muestra. Las muestras de tumores de bajo grado y tumores pequeños tenían más probabilidades de tener cantidades limitadas de ADN tumoral circulante. De manera similar, los SNV que estaban presentes con una frecuencia de alelos baja en el tumortenían menos probabilidades de estar presentes en el plasma. Sin embargo, incluso los tumores de alto grado y tamaño relativamente grande pueden no tener SNV detectados en el plasma. Es posible que otras razones biológicas sean responsables de esto (tal como la cantidad de ctDNA que se desprende del tumor) y que analizar más SNV por muestra aumente la posibilidad de detectar algunos. dNTP 0,4 mM (véase la figura 12-3C).

Los expertos en la técnica pueden idear muchas modificaciones y otras modalidades dentro del alcance y el espíritu de las invenciones actualmente descritas. De hecho, los artesanos expertos pueden realizar variaciones en los materiales, métodos, dibujos, ejemplos de experimentos y modalidades descritas sin cambiar los aspectos fundamentales de las invenciones descritas. Cualquiera de las modalidades descritas pueden usarse en combinación con cualquier otra modalidad descrita.

Las modalidades, los ejemplos y los experimentos divulgados no pretenden limitar el alcance de la descripción ni representar que los experimentos más abajo son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados ( p o r e je m p lo , cantidades, temperatura, e tc ), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Debe entenderse que se pueden realizar variaciones en los métodos como se describió sin cambiar los aspectos fundamentales que los experimentos pretenden ilustrar.

Ejemplo 2. Un protocolo de PCR múltiple personalizado para rastrear mutaciones tumorales en plasma

El protocolo de PCR múltiple (mPCR) a medida de Natera está diseñado para estimar el nivel de ctDNA en plasma mediante el seguimiento de un conjunto de mutaciones específicas del paciente identificadas a partir de muestras de tejido tumoral. Dado un perfil de mutación específico del paciente, diseñamos paneles de mPCR personalizados que se pueden aplicar a muestras de plasma de series temporales del paciente correspondiente.

Objetivos SNV. El perfil de mutaciones, que incluía variantes de un solo nucleótido (SNV) para cada subsección tumoral, se determinó en base a análisis de secuenciación tumoral. Se usó el perfil de mutaciones completo de cada tumor para reconstruir el árbol filogenético de cada tumor. PyClone (Roth, y otros, (2014). PyClone: Statistical inference of clonal population structure in cancer. Nature Methods 11: 396-398) se usó para identificar grupos de SNV y calcular su fracción de células cancerosas. Esto se usó para categorizar los SNV como clonales o subclonales. Se determinó la categoría de conductora de cada SNV (1-4, donde 1 era más probable que fuera una mutación conductora y 4 era la menos probable).

Diseño de ensayo. Se usó la tubería de diseño de ensayo estándar de Natera para diseñar cebadores de PCR para todos los SNV dados con los siguientes parámetros:

• Temperatura de fusión óptima [Tm] 56 °C, intervalo permitido, 53 °C-59 °C

• Longitud del amplicón, 50-70 pb

• Contenido de GC, 30-70 %

Nos referimos a un par de cebadores de PCR derecho e izquierdo dirigidos a un SNV como un ensayo para ese SNV en particular. Es posible que un ensayo cubra más de 1 SNV objetivo, si estuvieran muy cerca. Para cada par de ensayos, la probabilidad de formar un dímero de cebador se calculó mediante el uso de un enfoque termodinámico (SantaLucia JR (1998) "A unified view of polymer, dumbbell and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics", Proc Natl Acad Sci 95:1460-65) para estimar la estabilidad de la estructura de hibridación conjunta del primer par. Los ensayos se agruparon para minimizar el número de cebadores con una alta probabilidad de formar dímeros de cebadores en el mismo grupo. Para cada paciente, los ensayos se priorizaron de manera que, 1) los ensayos que cubrían los SNV conductoras tenían la máxima prioridad, y 2) había un muestreo uniforme del árbol filogenético.

Mezcla QC y optimización. Los cebadores se ordenaron a IDT en pocillos individuales, se desalinizaron y se normalizaron a 100 uM. Los ensayos se agruparon en Natera de acuerdo con el esquema de agrupación, para crear conjuntos de ensayos en los que cada cebador estaba a 250 nM en agua. Cada grupo se usó en un experimento combinado de QC/optimización. Para el experimento de optimización, se variaron los parámetros de PCR (concentración de cebador y temperatura de hibridación) y los efectos sobre el porcentaje de lecturas en el objetivo, la uniformidad de la profundidad de lectura (medida como la relación del percentil 80/percentil 20) y se evaluó el número de ensayos de abandono (definidos como ensayos con <1000 lecturas) a partir de los datos de secuenciación. Se determinaron las condiciones de PCR que producen el mejor porcentaje de lecturas en el objetivo, la uniformidad de la profundidad de lectura y el menor número de abandonos. Para todos los grupos, las condiciones óptimas fueron cebadores 10 nM y una temperatura de hibridación de 60 °C o 62,5 °C.

Los cebadores que eran responsables de la mayoría de los dímeros de cebadores se identificaron y eliminaron de cada grupo (por cada cebador eliminado, también se eliminó su pareja correspondiente).

Extracción de ADN y control de calidad. Se agruparon alícuotas de plasma de cada paciente antes de la extracción de cfDNA, y se evaluó visualmente el grado de hemólisis de cada muestra de plasma agrupada y se anotó (sin hemólisis, hemólisis leve o hemólisis grave). El cfDNA se extrajo en Natera mediante el uso del kit Qiagen NA siguiendo un protocolo optimizado para 5 mL de plasma. Todas las muestras de cfDNA se sometieron a control de calidad en chips Bioanalyzer High Sensitivity. Las mismas ejecuciones de Bioanalyzer High Sensitivity también se usaron para cuantificar las muestras de cfDNA mediante la interpolación de la altura del pico mononucleosómico en una curva de calibración preparada a partir de una muestra pura de cfDNA que se cuantificó previamente. Esto es necesario porque el cfDNA a veces contiene una fracción de ADN intacta que se superpone con el marcador de gran tamaño en el chip, lo que hace que la cuantificación del pico mononucleosomal no sea confiable.

Las muestras de ADN genómico (de subsecciones de tumores, ganglios linfáticos y glóbulos blancos) se cuantificaron en Nanodrop.

Preparación de la biblioteca de cfDNA. La cantidad total de cfDNA de cada muestra de plasma se usó como entrada en Library Prep mediante el uso del kit de preparación de bibliotecas de Natera y siguiendo las instrucciones del kit. Para dos muestras con cantidades extremadamente altas de cfDNA, la cantidad de entrada en Library Prep se restringió a ~50 000 equivalentes de genoma (165 ng). En resumen, 40 ul de ADN extraído del plasma, que está presente en fragmentos de longitud mononucleosómica y polinucleosómica, se repararon en los extremos y se les dio una cola en A, y se ligaron los adaptadores personalizados de Natera. Las bibliotecas se amplificaron durante 15 ciclos hasta la meseta y luego se purificaron mediante el uso de perlas Ampure siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas purificadas se sometieron a control de calidad en el LabChip.

Secuenciación y PCR múltiple de cfDNA. El material de la biblioteca de cada muestra de plasma se usó como entrada en la PCR múltiple mediante el uso del conjunto de ensayos relevante y un protocolo de mPCR de plasma optimizado. La composición de PCR fue: Mezcla maestra de PCR interna 1x, cebadores 10 nM, biblioteca de cfDNA de 3 uL (correspondiente a ~600 ng de ADN), en un volumen de reacción total de 10 uL. Las condiciones de termociclado fueron: 95 °C, 10 minutos; 10 ciclos de (95 °C, 30 segundos; 60 °C o 62,5 °C, 15 minutos; 72 °C, 30 segundos); 72 °C, 2 minutos, en espera a 4 °C.

Los productos de mPCR se codificaron en un etapa de PCR separado y los productos de PCR con código de barras se agruparon de acuerdo con la información de agrupación del ensayo.

Los conjuntos se purificaron mediante el uso de perlas Ampure siguiendo el protocolo del fabricante, se sometieron a control de calidad en un chip Bioanalyzer DNA1000 y se cuantificaron con el kit Qubit dsDNA Broad Range. Cada grupo contenía productos de mPCR con código de barras de 10 bibliotecas de plasma de cáncer y 20 controles negativos (preparados a partir de cfDNA extraído de voluntarios sanos). Las muestras de control negativo se obtuvieron siguiendo los procedimientos reglamentarios necesarios. Cada conjunto se secuenció en experimentos separados de HiSeq2500 Rapid con lecturas de índice único de extremo emparejado de 50 ciclos.

Secuenciación y PCR múltiple de ADN genómico. Las muestras de ADN genómico (ADNg) se usaron como entrada en una mPCR similar mediante el uso de los conjuntos de ensayos relevantes y un protocolo de mPCR genómico optimizado; Se usaron 50 ng de ADNg como entrada. Los productos de mPCR se codificaron con barras en una etapa de PCR separado y todos los productos con códigos de barras se combinaron en un grupo. El conjunto se purificó mediante el uso de perlas Ampure siguiendo el protocolo del fabricante, se sometió a control de calidad en un chip Bioanalyzer DNA1000 y se cuantificó con el kit Qubit dsDNA Broad Range. El conjunto se secuenció en un único experimento HiSeq2500 Rapid con lecturas de índice único de extremo único de 50 ciclos.

Canalización bioinformática. Las lecturas de extremos emparejados se asignaron al genoma de referencia hg19 con Novoalign v2.08.02 y se clasificaron e indexaron mediante el uso de SAMtools (Li H.*, Handsaker B.*, Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R. y 1000 Genome Project Data Processing Subgroup (2009) El formato de mapa/alineación de secuencias (SAM) y SAMtools. Bioinformática, 25, 2078-9). Todas las lecturas de extremos emparejados se fusionaron mediante el uso de Pear (J. Zhang, K. Kobert, T. Flouri, A. Stamatakis. PEAR: A fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics 30(5): 614-620, 2014) (mediante el uso de parámetros predeterminados). Dado que todos los amplicones tienen menos de 70 bases de longitud, con lecturas emparejadas de 50 pb generadas por Illumina HiSeq 2500, todas las lecturas en el objetivo se fusionaron con una superposición mínima de 30 pb. Las lecturas no ensambladas están fuera del objetivo y se filtraron en esta etapa. Los amplicones se diseñaron de manera que las posiciones de SNV de destino estuvieran ubicadas en la región solapada. Las bases que no coincidían en las lecturas directa e inversa o que tenían un puntaje de calidad de Phred inferior a 20 se filtraron para minimizar los errores de secuenciación en las etapas posteriores. Las lecturas combinadas con una calidad de mapeo superior a 30 y a lo máximo un desajuste en la secuencia de cebadores se marcaron como objetivo. Los objetivos con menos de 1000 lecturas se consideraron fallidos y se filtraron de análisis posteriores. El control de calidad (QC) se realizó mediante el uso de un programa interno de Java que buscaba una amplia lista de estadísticas por muestra que incluía números totales de lecturas, lecturas asignadas, lecturas en el objetivo, número de objetivos fallidos y tasa de error promedio. Una muestra con menos del 90 % de lecturas asignadas y más de 3 objetivos fallidos no se aprobó y fue necesario volver a secuenciarla.

Modelo estadístico. El proceso de PCR se modeló como un proceso estocástico, estimando los parámetros de error mediante el uso de un conjunto de 29 muestras de plasma de control y al realizar las llamadas finales de SNV en las muestras de cáncer objetivo. Para cada SNV objetivo, construimos un modelo de error de fondo específico del objetivo al estimar los siguientes parámetros de las muestras de control.

• Eficiencia PCR (p): Probabilidad de que cada molécula se replique en un ciclo de PCR.

• Tasa de error (pe): Tasa de error por ciclo para el tipo de mutación e (por ejemplo, alelo A de tipo salvaje a alelo G mutante).

• Número inicial de moléculas (X0)

Se usó el modelo de propagación de error específico del objetivo para caracterizar la distribución de moléculas de error. A medida que se replica una molécula en el transcurso del proceso de PCR, se producen más errores. Si ocurre un error en el ciclo i y hay Xi moléculas de tipo salvaje en el sistema, esa molécula de error se duplica en el siguiente ciclo con probabilidad p y se producen nuevas moléculas de error a partir de moléculas de fondo de tipo salvaje de acuerdo con un proceso binomial B (Xi, pe). Mediante el uso de una relación recursiva, calculamos la media y la varianza del número de moléculas totales Xn y número de moléculas de error En después de n ciclos de PCR como se muestra en la Figura. 21.

Etapas del algoritmo:

a. Estimación de la eficiencia de la PCR y la tasa de error por ciclo mediante el uso de las muestras de control normales.

b. Mediante el uso de la estimación de eficiencia, calcule el número inicial de moléculas en el conjunto de prueba. c. Use este número de copia inicial y la distribución de eficiencia anterior del conjunto de entrenamiento para estimar la eficiencia de la PCR en la muestra de prueba.

d. Para un intervalo de posibles valores reales de fracción mutante 0 entre 0 y 1 (usamos 0,15 como límite superior), estimamos la media y la varianza para el número total de moléculas, moléculas de error de fondo y moléculas de mutación real mediante el uso del modelo de propagación de error descrito en último párrafo y parámetros estimados en etapas a-c.

e. Use la media y la varianza estimadas en la etapa d para calcular la posibilidad L(0) de cada fracción mutante real potencial. Seleccione el valor de 0 que maximiza esta posibilidad (indicado por 0 ^mle) y calcular la puntuación , L( 6ML^e) x

de confianza L (O )+ L (0 m l e ) .

f. Llame a una mutación si la puntuación de confianza es >>95 % para las transiciones y >98 % para las transversiones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar las variantes de un solo nucleótido presentes en un carcinoma de células escamosas de pulmón, que comprende generar un conjunto de amplicones al realizar una reacción de amplificación por PCR múltiple en ácidos nucleicos aislados de una muestra de plasma de sangre de un individuo sospechoso de tener un carcinoma de células escamosas de pulmón en donde la reacción de amplificación por PCR múltiple comprende combinar una polimerasa, trifosfatos de nucleótidos, fragmentos de ácidos nucleicos de una biblioteca de ácidos nucleicos generada a partir de la muestra de plasma y un conjunto de cebadores que se unen cada uno dentro de 150 pares de bases de los loci variantes de un solo nucleótido, o un conjunto de pares de cebadores que abarcan cada uno una región de 160 pares de bases o menos que comprenden los loci variantes de un solo nucleótido, un tiempo de hibridación de 15 minutos y una concentración de cebador de 10 nM, en donde se sabe que los loci variantes de un solo nucleótido están asociados con carcinoma de células escamosas de pulmón y cada amplicón del conjunto de amplicones abarca al menos un locus variante de un solo nucleótido de un conjunto de 25 a 1000 loci variantes de un solo nucleótido que se sabe que están asociados con el cáncer de pulmón; y determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones, en donde el segmento comprende un loci variante de un solo nucleótido, para determinar de esta manera las variantes de un solo nucleótido presentes en el carcinoma de células escamosas.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el carcinoma de células escamosas es un carcinoma de células escamosas en etapa Ia, Ib o 2a.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende además determinar la frecuencia del alelo variante para cada una de las variantes de un solo nucleótido a partir de la determinación de la secuencia.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además desarrollar un plan de tratamiento contra el cáncer de pulmón basado en las determinaciones de frecuencia de alelos variantes.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde se pretende administrar al individuo un compuesto que se sabe que es específicamente efectivo en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de pulmón que tiene una o más de las variantes de un solo nucleótido determinadas o una de las variantes de un solo nucleótido determinadas con una frecuencia de alelos variable mayor que al menos la mitad de las otras variantes de un solo nucleótido.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los ácidos nucleicos se aíslan de un tumor del individuo y las variantes de un solo nucleótido se identifican en el tumor para el conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido antes de determinar la secuencia de al menos un segmento de cada amplicón del conjunto de amplicones para la muestra de plasma.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde determinar si una variante de un solo nucleótido está presente en la muestra de plasma comprende identificar un valor de confianza para cada determinación de alelo en cada uno del conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido basado al menos en parte en una profundidad de lectura para los loci.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde se realiza una designación de variante de un solo nucleótido si el valor de confianza para la presencia de una variante de un solo nucleótido es superior al 90 % o al 95 %.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido comprende todos los loci de variantes de un solo nucleótido identificados en los conjuntos de datos TCGA y COSMIC para el cáncer de pulmón.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el método se realiza con una profundidad de lectura para el conjunto de loci de variantes de un solo nucleótido de al menos 1000.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde se determina una eficiencia y una tasa de error por ciclo para cada reacción de amplificación de la reacción de amplificación múltiple de los loci de variantes de un solo nucleótido, y la eficiencia y la tasa de error se usan para para determinar si una variante de un solo nucleótido en el conjunto de loci de variantes únicas está presente en la muestra de plasma.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde los cebadores del conjunto de cebadores están diseñados para minimizar la formación de dímeros de cebadores.