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ES2906965T3 - Conjugados de pirrolobenzodiazepina - Google Patents

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ES2906965T3
ES2906965T3 ES18758581T ES18758581T ES2906965T3 ES 2906965 T3 ES2906965 T3 ES 2906965T3 ES 18758581 T ES18758581 T ES 18758581T ES 18758581 T ES18758581 T ES 18758581T ES 2906965 T3 ES2906965 T3 ES 2906965T3
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ES
Spain
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group
alkyl
saturated
alkenyl
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18758581T
Other languages
English (en)
Inventor
Nazzareno Dimasi
Philip Wilson Howard
Luke Masterson
Arnaud Charles Tiberghien
Balakumar Vijayakrishnan
Jason White
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune Ltd
Original Assignee
MedImmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=63294219&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2906965(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by MedImmune Ltd filed Critical MedImmune Ltd
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Abstract

Un conjugado de fórmula I: **(Ver fórmula)** en la que Ab es un anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada D representa cualquiera del grupo D1 o D2: **(Ver fórmula)** la línea de puntos indica la presencia opcional de un enlace doble entre C2 y C3; cuando hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 se selecciona del grupo que consiste en: (ia) grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, carboxi, éster, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3; (ib) alquilo C1-5 alifático saturado; (ic) cicloalquilo C3-6 saturado; (id) **(Ver fórmula)** en donde cada uno de R11, R12 y R13 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2- 3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 5; (ie) **(Ver fórmula)** en donde uno de R15a y R15b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y (if) **(Ver fórmula)** donde R14 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; cuando hay un enlace sencillo presente entre C2 y C3, R2 se selecciona de H, OH, F, diF y **(Ver fórmula)** donde R16a y R16b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R16a y R16b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4; D' representa el grupo D'1 o el D'2: **(Ver fórmula)** en los que la línea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre C2' y C3'; cuando hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 se selecciona del grupo que consiste en: (iia) grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, carboxi, éster, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3; (iib) alquilo C1-5 alifático saturado; (iic) cicloalquilo C3-6 saturado; (iid) **(Ver fórmula)** en donde cada uno de R31, R32 y R33 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R22 no es mayor de 5; (iie) **(Ver fórmula)** en donde uno de R25a y R25b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y (iif) **(Ver fórmula)** donde R24 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; cuando hay un enlace sencillo presente entre C2' y C3', R22 se selecciona de H, OH, F, diF y **(Ver fórmula)** donde R26a y R26b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R26a y R26b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4; R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', nitro, Me3Sn y halo; donde R y R' se seleccionan independientemente de alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3- 20 y arilo C5-20; R7 se selecciona de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', nitro, Me3Sn y halo; R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, NRN2, donde RN2 es H o alquilo C1-4, y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina; Y e Y' se seleccionan de O, S o NH; R11a se selecciona de OH, ORA, donde RA es alquilo C1-4; R6', R7', R9' y R11a' se seleccionan de los mismos grupos que R6, R7, R9 y R11a, respectivamente; y RLL1 y RLL2 son engarces conectados al anticuerpo en diferentes sitios que son independientemente de fórmula IIIa': **(Ver fórmula)** en la que, Q es: **(Ver fórmula)** donde QX es tal que Q es un residuo de aminoácido, un residuo dipeptídico o un residuo tripeptídico; X es: **(Ver fórmula)** donde a = de 0 a 5, b = de 0 a 16, c = 0 o 1, d = de 0 a 5; GLL se selecciona de: **(Tabla)** ( donde Ar representa un grupo arileno C5-6, por ejemplo fenileno y X representa alquilo C1-4; donde CBA representa un agente de unión a células que es un anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada; en donde el término alquilo incluye las subclases alquenilo, alquinilo y cicloalquilo, el término alquileno incluye las subclases alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, el término alquenilo se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono y el término alquinilo se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de pirrolobenzodiazepina
La presente invención se refiere a conjugados que comprenden pirrolobenzodiazepinas y dímeros relacionados (PBD), y a los engarces de fármaco precursores utilizados para crear tales conjugados.
Antecedentes de la invención
Algunas pirrolobenzodiazepinas (las PBD) tienen la capacidad de reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN; la secuencia preferida es PuGPu. El primer antibiótico antitumoral de PBD, la antramicina, se descubrió en 1965 (Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). Desde entonces, se ha informado de una serie de PBD de origen natural y se han desarrollado más de 10 rutas de síntesis para diversos análogos (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994)). Algunos miembros de la familia incluyen abeimicina (Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), chicamicina (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Patente Japonesa 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicinas A y B (Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protracarcina (Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley y Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicina (DC-102) (Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicina (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) y tomamicina (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). Las PBD tienen la estructura general:
Figure imgf000002_0001
Difieren en el número, el tipo y la posición de los sustituyentes, tanto en sus anillos aromáticos A como en los anillos pirrolo C, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B hay una imina (N=C), una carbinolamina (NH-CH(OH)) o un metil éter de carbinolamina (NH-CH(OMe)) en la posición N10-C11, que es el centro electrófilo responsable de la alquilación del ADN. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuración (S) en la posición quiral C11a que les proporciona un giro dextrógiro cuando se observan desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les da la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN de forma B, dando lugar a un ajuste ceñido en el sitio de unión (Kohn, En Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, pág. 3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Su capacidad para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con el procesamiento del ADN, de ahí su uso como agentes antitumorales.
Se ha divulgado anteriormente que la actividad biológica de esta molécula se puede potenciar uniendo dos unidades de PBD entre sí a través de sus funcionalidades C8/C'-hidroxilo a través de un engarce de alquileno flexible (Bose, D.S., et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 4939-4941 (1992); Thurston, D.E., et al., J. Org. Chem., 61, 8141-8147 (1996)). Se cree que los dímeros de PBD forman lesiones selectivas de secuencia en el ADN, tales como el entrecruzamiento 5'-Pu-GATC-Py-3' palindrómico entre hebras (Smellie, M., et al., Biochemistry, 42, 8232-8239 (2003); Martin, C., et al., Biochemistry, 44, 4135-4147) lo que se cree que es el principal responsable de su actividad biológica.
Un ejemplo de un dímero de PBD es SG2000 (SJG-136):
Figure imgf000002_0002
(Gregson, S., et al., J. Med. Chem., 44, 737-748 (2001); Alley, M.C., et al., Cancer Research, 64, 6700-6706 (2004); Hartley, J.A., et al., Cancer Research, 64, 6693-6699 (2004)) que ha participado en ensayos clínicos como agente en solitario, por ejemplo, NCT02034227 que investiga su uso en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y la leucemia linfocítica crónica (véase: https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227).
Los compuestos de PBD diméricos que portan sustituyentes de arilo C2, tales como SG2202 (ZC-207), se divulgan en el documento WO 2005/085251:
Figure imgf000003_0001
y en el documento WO2006/111759, bisulfitos de tales compuestos de PBD, por ejemplo, SG2285 (ZC-423):
Figure imgf000003_0002
Se ha demostrado que estos compuestos son agentes citotóxicos muy útiles (Howard, P.W., et al., Bioorg. Med. Chem. (2009), doi: 10.1016/j.bmcl.2009.09.012).
El documento WO 2007/085930 describe la preparación de compuestos de PBD diméricos que tienen grupos de engarce para la conexión con un agente de unión a células, tal como un anticuerpo. El engarce está presente en el puente que enlaza las unidades de PBD monomérica del dímero.
En el documento WO 2011/130598 se describen compuestos de PBD diméricos que tienen grupos de engarce para su conexión con un agente de unión a células, tal como un anticuerpo. En estos compuestos, el engarce está unido a una de las posiciones N10 disponibles, y generalmente son escindidos por la acción de una enzima sobre el grupo de engarce. Si la posición N10 no unida está protegida con un grupo de protección, los grupos de protección de ejemplo tienen el mismo desencadenante de la escisión que el engarce al anticuerpo.
El documento WO 2014/057074 describe dos conjugados de dímeros de PBD específicos unidos a través de la posición N10 en un monómero, estando el otro monómero de PBD en forma de imina. Uno de los engarces de fármaco es SG3249, Tesirina:
Figure imgf000003_0003
que, cuando se conjuga con el rovalpituzumab anti-DLL3, se conoce como rovalpituzumab-tesirina (Rova-T), actualmente en evaluación para el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico (Tiberghien, A.C., et al., ACS Med. Chem. Lett., 2016, 7 (11), 983-987; DOI:10.1021/acsmedchemlett.6b00062). A principios de 2017 también se iniciaron ensayos con otros conjugados de este engarce de fármaco con una versión genomanipulada de tratuzumab y un anticuerpo humanizado contra CD19 humano por parte de ADC Therapeutics SA (Resúmenes n.° 51 y n.° 52 en Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 58, abril de 2017).
El documento WO 2015/052322 describe un conjugado de dímeros de PBD específico unido a través de la posición N10 en un monómero, estando el otro monómero de PBD en forma de imina. Además, describe un conjugado de dímeros de PBD específico unido a través de la posición N10 en un monómero, teniendo el otro monómero de PBD un grupo de protección con el mismo desencadenante de la escisión que el engarce al anticuerpo:
Figure imgf000004_0001
El documento WO 2016/166300 describe conjugados anticuerpo-fármaco específicos de sitio. El documento WO 2017/137553 describe conjugados que comprenden una pirrolobenzodiazepina (PBD) específica y el engarce de fármaco precursor utilizado para fabricar tales conjugados. Masterson L et al, Bioorgainc medicinal chemistry letters, vol. 6, n.° 2, pág. 252-256 describen la síntesis y evaluación biológica de profármacos de PBD para su uso en la terapia de profármacos enzimáticos dirigidos por anticuerpos.
Divulgación de la invención
La presente invención proporciona PBD, y conjugados de dímeros de PBD relacionados en donde las PBD se conjugan con anticuerpos que se han modificado para que tengan al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada, y donde la conjugación es a través de cada grupo N10 de la PBD mediante un engarce. Los presentes inventores han encontrado que tales conjugados son sorprendentemente eficaces, a pesar de la expectativa de que no era posible engarzar una sola PBD, o dímero relacionado, con un solo anticuerpo mediante dos engarces.
La presente invención también proporcionó engarces de fármaco de PBD y dímeros relacionados, adecuados para su conjugación con anticuerpos modificados, donde ambos grupos N10 portan grupos de enlace.
Un primer aspecto de la presente invención proporciona un conjugado de fórmula I:
Figure imgf000005_0001
Ab es un anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada; D representa el grupo D1 o el D2:
Figure imgf000005_0002
; la línea de puntos indica la presencia opcional de un enlace doble entre C2 y C3; cuando hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 se selecciona del grupo que consiste en:
(ia) grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, carboxi, éster, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y
bis-oxi-alquileno C1-3;
(ib) alquilo C1-5 alifático saturado;
(ic) cicloalquilo C3-6 saturado;
(id)
Figure imgf000005_0003
, en donde cada uno de R11, R12 y R13 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 5; (ie)
Figure imgf000005_0004
, en donde uno de R15a y R15b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y
(if)
Figure imgf000006_0001
, donde R14 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; cuando hay un enlace sencillo presente entre C2 y C3,
R2 se selecciona de H, OH, F, diF y
Figure imgf000006_0002
, donde R16ay R16b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R16a y R16b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4;
D' representa el grupo D'1 o el D'2:
Figure imgf000006_0003
en donde la línea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre C2' y C3'; cuando hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R12 se selecciona del grupo que consiste en:
(iia) grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, carboxi, éster, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3; (iib) alquilo C1-5 alifático saturado;
(iic) cicloalquilo C3-6 saturado;
(iid)
Figure imgf000006_0004
, en donde cada uno de R31, R32y R33 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R12 no es mayor de 5;
(iie)
Figure imgf000006_0005
, en donde uno de R25a y R25b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y
(iif)
Figure imgf000006_0006
, donde R24 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; cuando hay un enlace sencillo presente entre C2' y C3',
R12 se selecciona de H, OH, F, diF y
Figure imgf000007_0001
, donde R26a y R26b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R26a y R26b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4;
R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, N r R', nitro, Me3Sn y halo; donde R y R' se seleccionan independientemente de alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-20 y arilo C5-20;
R7 se selecciona de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', nitro, Me3Sn y halo;
R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, NRN2 (donde RN2 es H o alquilo C1-4), y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina;
Y e Y' se seleccionan de O, S o NH;
R11a se selecciona de OH, ORA, donde RA es alquilo C1-4;
R6', R7', R9' y R11a' se seleccionan de los mismos grupos que R6, R7, R9 y R11a, respectivamente;
y
r i_i_i y r LL2 son engarces conectados al anticuerpo en diferentes sitios que se seleccionan independientemente de:
(iiia):
Figure imgf000007_0002
en donde
Q es:
Figure imgf000007_0003
donde x es tal que Q es un residuo de aminoácido, un residuo dipeptídico o un residuo tripeptídico;
X es:
Figure imgf000007_0004
donde a = de 0 a 5, b = de 0 a 16, c = 0 o 1, d = de 0 a 5;
GLL es un engarce conectado al anticuerpo;
en donde el término alquilo incluye las subclases alquenilo, alquinilo y cicloalquilo, el término alquileno incluye las subclases alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, el término alquenilo se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono y el término alquinilo se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono.
Se cree que tales ADC que efectivamente tienen una relación fármaco-anticuerpo (DAR) de 1 podrían ofrecer ventajas significativas, incluyendo la reducción de la toxicidad fuera del objetivo y una ventana terapéutica mejorada mediante la reducción de la dosis mínima eficaz requerida sobre los ADC que consisten en mezclas heterogéneas con DAR más altas.
Un segundo aspecto de la presente invención comprende un compuesto con la fórmula II:
Figure imgf000008_0001
y sales y solvatos del mismo,
en donde D, R2, R6, R7, R9, R11a, Y, R", Y', D', R6', R7', R9', R11a' y R12 (incluyendo la pres enlaces entre C2 y C3 y C2' y C3' respectivamente) son como se han definido en el primer aspecto de la invención;
RL es un engarce para conectar con un agente de unión a células, que se selecciona de:
(iiia):
Figure imgf000008_0002
donde Q y X son como se han definido en el primer aspecto y GL es un engarce para conectar con un anticuerpo.
El tercer aspecto proporciona un conjugado para el primer aspecto de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa.
Un experto habitual en la materia es capaz de determinar fácilmente si un conjugado experimental trata o no una afección proliferativa para cualquier tipo de célula en particular. Por ejemplo, los ensayos que pueden usarse convenientemente para evaluar la actividad ofrecida por un compuesto en particular se describen en los ejemplos, a continuación.
Un conjugado del primer aspecto de la invención puede sintetizarse conjugando un compuesto (engarce de fármaco) del segundo aspecto de la invención con un anticuerpo como se define en el primer aspecto de la invención.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra el efecto de una dosis única de un conjugado de la invención en comparación con la ausencia de tratamiento en un modelo de xenoinjerto de NCl-N87;
La figura 2 muestra el efecto de una dosis única inferior del mismo conjugado de la invención en comparación con la ausencia de tratamiento en un modelo de xenoinjerto de NCl-N87.
La figura 3 muestra representaciones esquemáticas de (A) anticuerpos modificados adecuados para su uso en la presente invención, (B) un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende una PBD de la presente invención.
La figura 4 muestra una representación esquemática de la conjugación de un anticuerpo modificado con el Compuesto 10.
La figura 5 muestra las secuencias de cadena pesada y ligera de un Flexmab de Herceptin.
La figura 6 muestra la actividad de un conjugado de la presente invención en comparación con un conjugado que no es de la presente invención.
Definiciones
Sustituyentes
La expresión "opcionalmente sustituido", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo precursor que puede no estar sustituido o que puede estar sustituido.
A menos que se especifique de otra manera, el término "sustituido", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo precursor que porta uno o más sustituyentes. El término "sustituyente" se usa en el presente documento en el sentido convencional, y se refiere a un resto químico que está unido covalentemente a, o si fuera apropiado, condensado a, un grupo precursor. Se conoce bien una amplia diversidad de sustituyentes, y también se conocen bien los métodos para su formación e introducción en diversos grupos precursores.
A continuación se describen con más detalle algunos ejemplos de sustituyentes.
Alquilo C1-12: El término "alquilo C1-12", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono de un compuesto hidrocarbonado que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, que puede ser alifático o alicíclico y que puede estar saturado o insaturado (por ejemplo, parcialmente insaturado, completamente insaturado). El término "alquilo C1-4", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono de un compuesto hidrocarbonado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, que puede ser alifático o alicíclico y que puede estar saturado o insaturado (por ejemplo, parcialmente insaturado, completamente insaturado). Por lo tanto, el término "alquilo" incluye las subclases alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, etc., que se analizan a continuación.
Algunos ejemplos de grupos alquilo saturados incluyen, pero sin limitación, metilo (C1 ), etilo (C2), propilo (C3), butilo (C4), pentilo (C5), hexilo (Ce) y heptilo (C7).
Algunos ejemplos de grupos alquilo lineales saturados incluyen, pero sin limitación, metilo (C1 ), etilo (C2), n-propilo (C3), n-butilo (C4), n-pentilo (amilo) (C5), n-hexilo (Ce) y n-heptilo (C7).
Algunos ejemplos de grupos alquilo ramificados saturados incluyen iso-propilo (C3), iso-butilo (C4), sec-butilo (C4), terebutilo (C4), iso-pentilo (C5), y neo-pentilo (C5).
Alquenilo C2-12: El término "alquenilo C2-12", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono.
Algunos ejemplos de grupos alquenilo insaturados incluyen, pero sin limitación, etenilo (vinilo, -CH=CH2), 1-propenilo (-CH=CH-CH3), 2-propenilo (alilo, -CH-CH=CH2), isopropenilo (1-metilvinilo, -C(CH3)=CH2), butenilo (C4), pentenilo (C5) y hexenilo (Ce).
Alquinilo C2-12: El término "alquinilo C2-12", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono.
Algunos ejemplos de grupos alquinilo insaturados incluyen, pero sin limitación, etinilo (-C=CH) y 2-propinilo (propargilo, -CH2-CECH).
Cicloalquilo C3-12: El término "cicloalquilo C3-12", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo que es también un grupo ciclilo; es decir, un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo en el anillo alicíclico de un compuesto hidrocarbonado cíclico (carbocíclico), resto que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, incluyendo de 3 a 7 átomos en el anillo.
Algunos ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, los derivados de:
compuestos hidrocarbonados monocíclicos saturados:
ciclopropano (C3), ciclobutano (C4), ciclopentano (C5), ciclohexano (Ce), cicloheptano (C7), metilciclopropano (C4), dimetilciclopropano (C5), metilciclobutano (C5), dimetilciclobutano (Ce), metilciclopentano (Ce), dimetilciclopentano (C7) y metilciclohexano (C7);
compuestos hidrocarbonados monocíclicos insaturados:
ciclopropeno (C3), ciclobuteno (C4), ciclopenteno (C5), ciclohexeno (Ce), metilciclopropeno (C4), dimetilciclopropeno (C5), metilciclobuteno (C5), dimetilciclobuteno (Ce), metilciclopenteno (Ce), dimetilciclopenteno (C7) y metilciclohexeno (C7); y
compuestos hidrocarbonados policíclicos saturados:
norcarano (C7), norpinano (C7), norbornano (C7).
Heterociclilo C3-20: El término "heterociclilo C3-20", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un compuesto heterocíclico, resto que tiene de 3 a 20 átomos en el anillo, de los que de 1 a 10 son heteroátomos en el anillo. Preferentemente, cada anillo tiene de 3 a 7 átomos en el anillo, de los que de 1 a 4 son heteroátomos en el anillo.
En este contexto, los prefijos (por ejemplo, C3-20, C3-7, C5-6, etc.) indican el número de átomos en el anillo o el intervalo del número de átomos en el anillo, ya sean átomos de carbono o heteroátomos. Por ejemplo, el término "heterociclilo C5-6", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo heterociclilo que tiene 5 o 6 átomos en el anillo.
Algunos ejemplos de grupos heterociclilo monocíclicos incluyen, pero sin limitación, los derivados de:
N1 : aziridina (C3), azetidina (C4), pirrolidina (tetrahidropirrol) (C5), pirrolina (por ejemplo, 3-pirrolina, 2,5-dihidropirrol) (C5), 2H-pirrol o 3H-pirrol (isopirrol, isoazol) (C5),
piperidina (C6), tetrahidropiridina (C6), tetrahidropiridina (C6), azepina (C7);
O1 : oxirano (C3), oxetano (C4), oxolano (tetrahidrofurano) (C5), oxol (dihidrofurano) (C5), oxano (tetrahidropirano) (C6), dihidropirano (C6), pirano C6) y oxepina (C7);
S1 : tiirano (C3), tietano (C4), tiolano (tetrahidrotiofeno) (C5), tiano (tetrahidrotiopirano) (C6), tiepano (C7); O2: dioxolano (C5), dioxano (C6) y dioxepano (C7);
O3: trioxano (C6);
N2: imidazolidina (C5), pirazolidina (diazolidina) (C5), imidazolina (C5), pirazolina (dihidropirazol) (C5), piperazina (C6);
N1O1 : tetrahidrooxazol (C5), dihidrooxazol (C5), tetrahidroisoxazol (C5), dihidroisoxazol (C5), morfolina (C6), tetrahidrooxazina (C6), dihidrooxazina (C6), oxazina (C6);
N1S1 : tiazolina (C5), tiazolidina (C5), tiomorfolina (C6);
N2O1 : oxadiazina (C6);
O1S1 : oxatiol (C5) y oxatiano (tioxano) (C6); y,
N1O1S1 : oxatiazina (C6).
Algunos ejemplos de grupos heterociclilo monocíclicos sustituidos incluyen aquellos derivados de sacáridos, en forma cíclica, por ejemplo, furanosas (C5), tales como arabinofuranosa, lixofuranosa, ribofuranosa y xilofuranosa, y piranosas (C6), tales como alopiranosa, altropiranosa, glucopiranosa, manopiranosa, gulopiranosa, idopiranosa, galactopiranosa y talopiranosa.
Arilo C5-20: El término "arilo C5-20", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo en el anillo aromático de un compuesto aromático, resto que tiene de 3 a 20 átomos en el anillo. El término "arilo C5-7", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo en el anillo aromático de un compuesto aromático, resto que tiene de 5 a 7 átomos en el anillo, y el término "arilo C5-10", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo en el anillo aromático de un compuesto aromático, resto que tiene de 5 a 10 átomos en el anillo. Preferentemente, cada anillo tiene de 5 a 7 átomos de anillo.
En este contexto, los prefijos (por ejemplo, C3-20, C5-7, C5-6, C5-10, etc.) indican el número de átomos en el anillo o el intervalo del número de átomos en el anillo, ya sean átomos de carbono o heteroátomos. Por ejemplo, el término "C5-6 arilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo arilo que tiene 5 o 6 átomos en el anillo.
Los átomos del anillo pueden ser todos átomos de carbono, como en los "grupos carboarilo".
Algunos ejemplos de grupos carboarilo incluyen, pero sin limitación, los derivados del benceno (es decir, fenilo) (C6), naftaleno (C10), azuleno (C10), antraceno (C14), fenantreno (C14), naptaceno (C18) y pireno (C16).
Algunos ejemplos de grupos arilo que comprenden anillos condensados, siendo al menos uno de ellos un anillo aromático, incluyen, pero sin limitación, grupos derivados de indano (por ejemplo, 2,3-dihidro-1H-indeno) (C9), indeno (C9), isoindeno (C9), tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (C10), acenafteno (C12), fluoreno (C13), fenaleno (C13), acefenantreno (C15) y aceantreno (C16).
Como alternativa, los átomos del anillo pueden incluir uno o más heteroátomos, como en los "grupos heteroarilo". Algunos ejemplos de grupos heteroarilo monocíclicos incluyen, pero sin limitación, los derivados de:
N1 : pirrol (azol) (C5), piridina (azina) (C6);
O1 : furano (oxol) (C5);
S1 : tiofeno (tiol) (C5);
N1O1 :oxazol (C5), isoxazol (C5), isoxazina (C6);
N2O1 : oxadiazol (furazano) (C5);
N3O1 : oxatriazol (C5);
N1S1 : tiazol (C5), isotiazol (C5);
N2: imidazol (1,3-diazol) (C5), pirazol (1,2-diazol) (C5), piridazina (1,2-diazina) (C6), pirimidina (1,3-diazina) (C6) (por ejemplo, citosina, timina, uracilo), pirazina (1,4-diazina) (Ce);
N3: triazol (C5), triazina (Ca); y,
N4: tetrazol (C5).
Algunos ejemplos de heteroarilo que comprenden anillos condensados, incluyen, pero sin limitación:
Cg (con 2 anillos condensados) derivados de benzofurano (O1), isobenzofurano (Oí), indol (N1 ), isoindol (N1 ), indolizina (Ní ), indolina (Ní ), isoindolina (Ní ), purina (N4) (por ejemplo, adenina, guanina), bencimidazol (N2), indazol (N2), benzoxazol (N1O1 ), bencisoxazol (N1O1 ), benzodioxol (O2), benzofurazano (N2O1 ), benzotriazol (N3), benzotiofurano (S1), benzotiazol (N1S1), benzotiadiazol (N2S);
C10 (con 2 anillos condensados) derivados de cromeno (O1), isocromeno (O1 ), cromano (O1 ), isocromano (O1 ), benzodioxano (O2), quinolina (N1 ), isoquinolina (N1 ), quinolizina (N1 ), benzoxazina (N1O1 ), benzodiazina (N2), piridopiridina (N2), quinoxalina (N2), quinazolina (N2), cinnolina (N2), ftalazina (N2), naftiridina (N2), pteridina (N4); C11 (con 2 anillos condensados) derivados de benzodiazepina (N2);
C13(con 3 anillos condensados) derivados de carbazol (N1 ), dibenzofurano (O1), dibenzotiofeno (S1), carbolina (N2), perimidina (N2), piridoindol (N2); y,
C14 (con 3 anillos condensados) derivados de acridina (N1 ), xanteno (O1 ), tioxanteno (S1), oxantreno (O2), fenoxatiina (O1S1), fenazina (N2), fenoxazina (N1O1 ), fenotiazina (N1S1 ), tiantreno (S2), fenantridina (N1), fenantrolina (N2), fenazina (N2).
Los grupos anteriores, bien solos o como parte de otro sustituyente, opcionalmente pueden estar ellos mismos sustituidos con uno o más grupos seleccionados de ellos mismos y los sustituyentes adicionales indicados a continuación.
Halo: -F, -Cl, -Br y -I.
Hidroxi: -OH.
Éter: -OR, en donde R es un sustituyente de éter, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (también denominado como un grupo alcoxi C1-7, analizado más adelante), un grupo heterociclilo C3-20 (también denominado como un grupo heterocicliloxi C3-20), o un grupo arilo C5-20 (también denominado como un grupo ariloxi C5-20), preferentemente un grupo alquilo C1-7.
Alcoxi: -OR, en donde R es un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos alcoxi C1-7 incluyen, pero sin limitación, -OMe (metoxi), -OEt (etoxi), -O(nPr) (n-propoxi), -O(iPr) (isopropoxi), -O(nBu) (nbutoxi), -O(sBu) (sec-butoxi), -O(iBu) (isobutoxi), y -O(tBu) (terc-butoxi).
Acetal: -CH(OR1)(OR2), en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes acetal, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7 o, en el caso de un grupo acetal "cíclico", R1 y R2, tomados junto con los dos átomos de oxígeno a los que están unidos y los átomos de carbono a los que están unidos, forman un anillo heterocíclico que tiene de 4 a 8 átomos en el anillo. Algunos ejemplos de grupos acetal incluyen, pero sin limitación, -CH(OMe)2, -CH(OEt)2 y -CH(OMe)(OEt).
Hemiacetal: -CH(OH)(OR1), en donde R1 es un sustituyente de hemiacetal, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos hemiacetal incluyen, pero sin limitación, -CH(OH)(OMe) y -CH(OH)(OEt).
Cetal: -CR(OR1)(OR2), donde R1 y R2 son como se han definido para los acetales, y R es un sustituyente de cetal diferente del hidrógeno, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos cetal incluyen, pero sin limitación, -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2,-C(Et)(OEt)2 y -C(Et)(OMe)(OEt).
Hemicetal: -CR(OH)(OR1), donde R1 es como se ha definido para los hemicetales, y R es un sustituyente de hemicetal diferente del hidrógeno, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos hemiacetal incluyen, pero sin limitación, -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) y -C(Et)(OH)(OEt).
Oxo (ceto, -ona): =O.
Tiona (tiocetona): =S.
Imino (imina): =NR, en donde R es un sustituyente de imina, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos éster incluyen, pero sin limitación, =NH, =NMe, =NEt y =NPh.
Formilo (carbaldehído, carboxaldehído): -C(=O)H.
Acilo (ceto): -C(=O)R, en donde R es un sustituyente de acilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (también denominado como alquilacilo C1-7 o alcanoilo C1-7), un grupo heterociclilo C3.20 (también denominado como heterociclilacilo C3-20), o un grupo arilo C5-20 (también denominado como arilacilo C5-20), preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos acilo incluyen, pero sin limitación, -C(=O)CH3 (acetilo), -C(=O)CH2CH3 (propionilo), -C(=O)C(CH3)3 (t-butirilo) y -C(=O)Ph (benzoílo, fenona).
Carboxi (ácido carboxílico): -C(=O)OH.
Tiocarboxi (ácido tiocarboxílico): -C(=S)SH.
Tiolocarboxi (ácido tiolocarboxílico): -C(=O)SH.
Tionocarboxi (ácido tionocarboxílico): -C(=S)OH.
Ácido imídico: -C(=NH)OH.
Ácido hidroxámico: -C(=NOH)OH.
Éster (carboxilato, éster de ácido carboxílico, oxicarbonilo): -C(=O)OR, en donde R es un sustituyente de éster, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos éster incluyen, pero sin limitación, -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 y -C(=O)OPh.
Aciloxi (éster inverso): -OC(=O)R, en donde R es un sustituyente de aciloxi, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos aciloxi incluyen, pero sin limitación, -OC(=O)CH3 (acetoxi), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph y -OC(=O)CH2Ph.
Oxicarboiloxi: -OC(=O)OR, en donde R es un sustituyente de éster, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos éster incluyen, pero sin limitación, -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3 y -OC(=O)OPh.
Amino: -NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7 (también denominado como alquilamino C1-7 o di-alquil C1.7 amino), un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente H o un grupo alquilo C1-7 o, en el caso de un grupo amino "cíclico", R1 y R2, tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico que tiene de 4 a 8 átomos en el anillo. Los grupos amino pueden ser primarios (-NH2), secundarios (-NHR1o terciarios (-NHR1R2) y, en forma catiónica, pueden ser cuaternarios (-+NR1R2R3). Algunos ejemplos de grupos amino incluyen, pero sin limitación, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(c H2CH3)2 y -NHPh. Algunos ejemplos de grupos amino cíclicos incluyen, pero sin limitación, aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino y tiomorfolino. Amido (carbamoílo, carbamilo, aminocarbonilo, carboxamida): -C(=O)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se define para los grupos amino. Algunos ejemplos de grupos amido incluyen, pero sin limitación, -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 y -C(=O)N(CH2CH3)2, así como grupos amido en los que R1 y R2, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman una estructura heterocíclica como en, por ejemplo, piperidincarbonilo, morfolincarbonilo, tiomorfolincarbonilo y piperazincarbonilo.
Tioamido (tiocarbamilo): -C(=S)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se define para los grupos amino. Algunos ejemplos de grupos amido incluyen, pero sin limitación, -C(=S)NH2, -c (=s )n h c h 3, -C(=S)N(CH3)2 y -C(=S)NHCH2CH3.
Acilamido (acilamino): -NR1C(=O)R2, en donde R1 es un sustituyente de amida, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7 y R2 es un sustituyente de acilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos acilamida incluyen, pero sin limitación, -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3 y -NHC(=O)Ph. R1 y R2 pueden formar juntos una estructura cíclica, como en, por ejemplo, succinimidilo, maleimidilo y ftalimidilo:
Figure imgf000013_0001
Aminocarboniloxi: -OC(=O)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se define para los grupos amino. Algunos ejemplos de grupos aminocarboniloxi incluyen, pero sin limitación, -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)Nme2 y -OC(=O)Net2.
Ureido: -N(R1)CONR2R3, en donde R2 y R3 son independientemente sustituyentes de amino, como se define para los grupos amino, y R1 es un sustituyente de ureido, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos ureido incluyen, pero sin limitación, -NHCONH2,-NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 y -NMeCONEt2.
Guanidino: -NH-C(=NH)NH2.
Tetrazolilo: un anillo aromático de cinco miembros que tiene cuatro átomos de nitrógeno y un átomo de carbono,
Figure imgf000013_0002
Imino: =NR, en donde R es un sustituyente de imina, por ejemplo, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente H o un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos imino incluyen, pero sin limitación, =NH, =NMe, y =NEt.
Amidina (amidino): -C(=NR)NR2, en donde cada R es un sustituyente de amidina, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente H o un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos amidina incluyen, pero sin limitación, -C(=NH)NH2, -C(=NH)Nme2 y -C(=NMe)NMe2.
Nitro: -NO2.
Nitroso: -NO.
Azido: -N3.
Ciano (nitrilo, carbonitrilo): -CN.
Isociano: -NC.
Cianato: -OCN.
Isocianato: -NCO.
Tiociano (tiocianato): -SCN.
Isotiociano (isotiocianato): -NCS.
Sulfhidrilo (tiol, mercapto): -SH.
Tioéter (sulfuro): -SR, en donde R es un sustituyente de tioéter, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (también denominado un grupo alquiltio C1-7), un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos alquiltio C1-7 incluyen, pero sin limitación, -SCH3 y -SCH2CH3.
Disulfuro: -SS-R, en donde R es un sustituyente de disulfuro, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7 (también denominado en el presente documento como disulfuro de alquilo C1-7). Algunos ejemplos de grupos disulfuro de alquilo C1-7 alquilo incluyen, pero sin limitación, -SSCH3 y -SSCH2CH3.
Sulfina (sulfinilo, sulfóxido): -S(=O)R, en donde R es un sustituyente de sulfina, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfina incluyen, pero sin limitación, -S(=O)CH3 y -S(=O)CH2CH3.
Sulfona (sulfonilo): -S(=O)2R, en donde R es un sustituyente de sulfona, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7, incluyendo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 fluorado o perfluorado. Algunos ejemplos de grupos sulfona incluyen, pero sin limitación, -S(=O)2c H3 (metanosulfonilo, mesilo), -S(=O)2CF3 (triflilo), -S(=O)2CH2CH3 (esilo), -S(=O)2C4Fg (nonaflilo), -s (=o )2CH2CF3 (tresilo), -S(=O)2CH2CH2NH2 (taurilo), -S(=O)2Ph (fenilsulfonilo, besilo), 4-metilfenilsulfonilo (tosilo), 4- clorofenilsulfonilo (closilo), 4-bromofenilsulfonilo (brosilo), 4-nitrofenilo (nosilo), 2-naftalenosulfonato (napsilo) y 5- dimetilamino-naftalen-1-ilsulfonato (dansilo).
Ácido sulfínico (sulfino): -S(=O)OH, -SO2H.
Ácido sulfónico (sulfo): -S(=O)2OH, -SO3H.
Sulfinato (éster de ácido sulfínico): -S(=O)OR; en donde R es un sustituyente de sulfinato, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfinato incluyen, pero sin limitación, -S(=O)OCH3 (metoxisulfinilo; sulfinato de metilo) y -S(=O)OCH2CH3 (etoxisulfinilo; sulfinato de etilo).
Sulfonato (éster de ácido sulfónico): -S(=O)2OR, en donde R es un sustituyente de sulfonato, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfonato incluyen, pero sin limitación, -S(=O)2OCH3 (metoxisulfonilo; sulfonato de metilo) y -S(=O)2OCH2CH3 (etoxisulfonilo; sulfonato de etilo).
Sulfiniloxi: -OS(=O)R, en donde R es un sustituyente de sulfiniloxi, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfiniloxi incluyen, pero sin limitación, -OS(=O)CH3 y -OS(=O)CH2CH3.
Sulfoniloxi: -OS(=O)2R, en donde R es un sustituyente de sulfoniloxi, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfoniloxi incluyen, pero sin limitación, -OS(=O)2CH3 (mesilato) y -OS(=O)2CH2CH3 (esilato).
Sulfato: -OS(=O)2OR; en donde R es un sustituyente de sulfato, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfato incluyen, pero sin limitación, -OS(=O)2OCH3 y -SO(=O)2OCH2CH3.
Sulfamilo (sulfamoílo; amida de ácido sulfínico; sulfinamida): -S(=O)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se define para los grupos amino. Algunos ejemplos de grupos sulfamilo incluyen, pero sin limitación, -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 y -S(=O)NHPh.
Sulfonamido (sulfinamoílo; amida de ácido sulfónico; sulfonamida): -S(=O)2NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se define para los grupos amino. Algunos ejemplos de grupos sulfonamido incluyen, pero sin limitación, -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 y -S(=O)2NHPh.
Sulfamino: -NR1S(=O)2OH, en donde R1 es un sustituyente de amino, como se define para los grupos amino. Algunos ejemplos de grupos sulfamino incluyen, pero sin limitación, -NHS(=O)2OH y -N(CH3)S(=O)2OH.
Sulfonamino: -NR1S(=O)2R, en donde R1 es un sustituyente de amino, como se define para los grupos amino, y R es un sustituyente de sulfonamino, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfonamino incluyen, pero sin limitación, -NHS(=O)2CH3 y -N(CH3)S(=O)2CaH5.
Sulfinamino: -NR1S(=O)R, en donde R1 es un sustituyente de amino, como se define para los grupos amino, y R es un sustituyente sulfinamino, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7. Algunos ejemplos de grupos sulfinamino incluyen, pero sin limitación, -NHS(=O)CH3 y -N(CH3)S(=O)CaH5.
Fosfino (fosfina): -PR2, en donde R es un sustituyente de fosfino, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosfino incluyen, pero sin limitación, -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2 y -P(Ph)2.
Fosfo: -P(=O)2.
Fosfinilo (óxido de fosfina): -P(=O)R2, en donde R es un sustituyente de fosfinilo, por ejemplo, un grupo alquilo Ci-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosfinilo incluyen, pero sin limitación, -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2 y -P(=O)(Ph)2.
Ácido fosfónico (fosfono): -P(=O)(OH)2.
Fosfonato (éster de fosfono): -P(=O)(OR)2, en donde R es un sustituyente de fosfonato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosfonato incluyen, pero sin limitación, -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 y -P(=O)(OPh)2.
Ácido fosfórico (fosfonoxi): -OP(=O)(OH)2.
Fosfato (éster de fosfonoxi): -OP(=O)(OR)2, donde R es un sustituyente de fosfato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosfato incluyen, pero sin limitación, -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 y -OP(=O)(OPh)2.
Ácido fosforoso: -OP(OH)2.
Fosfito: -OP(OR)2, donde R es un sustituyente de fosfito, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosfito incluyen, pero sin limitación, -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2 y -OP(OPh)2.
Fosforamidita: -OP(OR1)-NR22, donde R1 y R2 son sustituyentes de fosforamidita, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7 (opcionalmente sustituido), un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosforamidita incluyen, pero sin limitación, -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 y -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
Fosforamidato: -OP(=O)(OR1)-NR22, donde R1 y R2 son sustituyentes de fosforamidato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7 (opcionalmente sustituido), un grupo heterociclilo C3-20 o un grupo arilo C5-20, preferentemente -H, un grupo alquilo C1-7 o un grupo arilo C5-20. Algunos ejemplos de grupos fosforamidato incluyen, pero sin limitación, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 y -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
Alquileno
Alquileno C3-12: El término "alquileno C3-12", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto bidentado obtenido mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno, bien ambos del mismo átomo de carbono o bien uno de cada uno de dos átomos de carbono diferentes, de un compuesto hidrocarbonado que tiene de 3 a 12 átomos de carbono (salvo que se indique otra cosa), que puede ser alifático o alicíclico, y que puede ser saturado, parcialmente insaturado o completamente insaturado. Por lo tanto, el término "alquileno" incluye las subclases de alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, etc., que se analizan a continuación.
Algunos ejemplos de grupos alquileno C3-12 lineales saturados incluyen, pero sin limitación, -(CH2V donde n es un número entero de 3 a 12, por ejemplo, -CH2CH2CH2-(propileno), -CH2CH2CH2CH2-(butileno), -CH2CH2CH2CH2CH2-(pentileno) y -CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2-(heptileno).
Algunos ejemplos de grupos alquileno C3-12 ramificados saturados incluyen, pero sin limitación, -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2- y -CH2CH(CH2CH3)CH2-.
Algunos ejemplos de grupos alquileno C3-12 lineales parcialmente insaturados (alquenileno C3-12 y grupos alquinileno) incluyen, pero sin limitación, -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH=CH-CH2-,-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH=CH-, -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH- y -CH2-CEC-CH2-.
Algunos ejemplos de grupos alquileno C3-12 ramificados parcialmente insaturados (grupos alquenileno y alquinileno C3-12) incluyen, pero sin limitación, -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3)-y -CeC-CH(CH3)-.
Algunos ejemplos de grupos alquileno C3-12 alicíclicos saturados (cicloalquilenos C3-12) incluyen, pero sin limitación, ciclopentileno (por ejemplo, ciclopent-1,3-ileno) y ciclohexileno (por ejemplo, ciclohex-1,4-ileno).
Algunos ejemplos de grupos alquileno C3-12 alicíclicos parcialmente insaturados (cicloalquilenos C3-12) incluyen, pero sin limitación, ciclopentenileno (por ejemplo, 4-ciclopenten-1,3-ileno), ciclohexenileno (por ejemplo, 2-ciclohexen-1,4-ileno; 3-ciclohexen-1,2-ileno; 2,5-cidohexadien-1,4-ileno).
Unidad de ligando
Las unidades de ligando para su uso en la presente invención son agentes de unión a células, más específicamente anticuerpos modificados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que tienen al menos un sitio de conjugación en cada cadena pesada. En el documento WO 2012/064733 (presentado como PCT/US2011/059775) se divulgan ejemplos de anticuerpos modificados particulares adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención.
Anticuerpos
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos u obtenidos de otras especies. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunitario que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno específico. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un antígeno diana tiene generalmente numerosos sitios de unión, también llamados epítopos, reconocidos por las CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo distinto tiene una estructura distinta. Por tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión a antígeno que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno de una diana de interés o parte del mismo, incluyendo tales dianas, pero sin limitación, una célula o células cancerosas que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados a una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden obtenerse de cualquier especie, incluyendo el origen humano, murino o de conejo.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen F(ab')2, y fragmentos scFv, y fragmentos de unión a epítopos diméricos de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespecíficamente a antígenos de células cancerosas, antígenos víricos o antígenos microbianos, moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos modificados adecuados para su uso en la presente invención incluyen aquellos en donde los residuos de cisteína intercatenarios se han sustituido por residuos de aminoácidos que carecen de grupos tiol. Los anticuerpos pueden comprender al menos una sustitución adicional en cada cadena pesada de un residuo de aminoácido que comprende un grupo reactivo adecuado para la conjugación con un engarce. El aminoácido adicionalmente sustituido puede ser una cisteína o un aminoácido no natural. La posición que se sustituye puede seleccionarse de las que se exponen a continuación:
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Los ejemplos de anticuerpos modificados adecuados para su uso en la presente invención incluyen las estructuras Flexmab divulgadas en el documento WO 2012/064733. Dichos Flexmab tienen cisteínas con grupos tiol libres en la región bisagra del anticuerpo que pueden usarse como sitios de conjugación para enlazarse a través de los grupos N10 de las PBD de la presente invención.
Otros ejemplos de anticuerpos modificados adecuados para su uso en la presente invención incluyen aquellos en que se han insertado cisteínas en sitios seleccionados en los anticuerpos. Estos se describen en Dimasi, N., et al., Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995) y el documento WO2015/157595. En particular, son útiles los anticuerpos que se han modificado mediante la inserción de una cisteína después de la posición S239 (es decir, entre las posiciones 239 y 240).
Se hace referencia a los enumerados en las páginas 60 a 62 del documento WO 2012/064733. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser contra un antígeno asociado a tumor, por ejemplo: HER2 (ErbB2); EPHA2 (receptor de EPH A2); CD19; IL2RA (receptor de interleucina 2, alfa).
Los antígenos asociados a tumor y los anticuerpos afines para su uso en realizaciones de la presente invención se enumeran a continuación y se describen con más detalle en las páginas 14 a 86 del documento WO 2017/186894.
(1) BMPR1B (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea)
(2) E16 (LAT1, SLC7A5)
(3) STEAP1 (antígeno epitelial de próstata de seis transmembrana)
(4) 0772P (CA125, MUC16)
(5) MPF (MPF, MSLN, Sm R, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina)
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de vehículos de soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, vehículo de fosfato dependiente de sodio de tipo II 3b)
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema 25, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana I y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B)
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, gen de ADNc de RIKEN 2700050C12)
(9) ETBR (receptor de endotelina de tipo B)
(10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315)
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen asociado con cáncer de próstata 1, proteína asociada con cáncer de próstata 1, antígeno epitelial de seis transmembrana de próstata 2, proteína de seis transmembrana de próstata)
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico receptor de potencial transitorio 5, subfamilia M, miembro 4)
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma)
(14 ) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein-Barr) o Hs.73792)
(15 ) CD79b (CD79B, CD79p, Igb (beta asociada a inmunoglobulina), B29)
(16 ) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH21a), SPAP1B, SPAP1C)
(17) HER2 (ErbB2)
(18) NCA (CEACAM6)
(19) MDP (DPEP1)
(20) IL20R-alfa (IL20Ra, ZCYTOR7)
(21) Brevican (BCAN, BEHAB)
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5)
(23) ASLG659 (B7h)
(24) PSCA (precursor de antígeno de células madre de próstata)
(25) GEDA
(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, BlyS de receptor 3, BR3)
(27) CD22 (isoforma del receptor de linfocitos B CD22-B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814)
(27a) CD22 (molécula CD22)
(28) CD79a (CD79A, CD79alfa), alfa asociado a inmunoglobulina, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B), pl: 4,84, PM: 25028 TM: 2 [P] Cromosoma del gen: 19q13.2).
(29) CXCR5 (receptor de linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a proteína G que se activa por la quimiocina CXCL13, actúa en la migración de linfocitos y la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma y leucemia); 372 aa, pi: 8,54 PM: 41959 TM: 7 [P] Cromosoma del gen: 11q23.3,
(30) HLA-DOB (subunidad beta de la molécula MHC de clase II (antígeno Ia) que se une a péptidos y 20 los presenta a linfocitos T CD4+); 273 aa, pi: 6,56, PM: 30820.TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 6p21.3)
(31) P2X5 (canal de iones dependientes de ligando P2X de receptor prurinérgico 5, un canal de iones dependiente de ATP extracelular puede estar implicado en la transmisión sináptica y la neurogénesis, su deficiencia puede contribuir a la fisiopatología de la inestabilidad del detrusor idiopática); 422 aa), pi: 7,63, PM: 47206 TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 17p13.3).
(32) CD72 (antígeno de diferenciación de linfocitos B CD72, Lyb-2); 359 aa, pi: 8,66, PM: 40225, TM: 15 [P] cromosoma del gen: 9p13.3).
(33) LY64 (Antígeno de linfocitos 64 (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación y la apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función se asocia con una actividad aumentada de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso sistémico); 661 aa, pi: 6,20, PM: 74147 TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 5q12).
(34) FcRH1 (proteína similar al receptor de Fc 1, un supuesto receptor del dominio Fc de inmunoglobulina que contiene dominios similares a Ig de tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B); 429 aa, pi: 5,28, PM: 46925 TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 1q21-1q22)
(35) IRTA2 (receptor de la superfamilia de las inmunoglobulina asociado a translocación 2, un supuesto inmunorreceptor con posibles papeles en el desarrollo de linfocitos B y la linfomagénesis; la desregulación del gen por translocación se produce en algunas neoplasias malignas de linfocitos B); 977 aa, pi: 6,88, PM: 106468, TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 1q21)
(36) TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, TR, supuesto proteoglucano transmembrana, relacionado con la familia de factores de crecimiento de EGF/herregulina y folistatina); 374 aa)
(37) PSMA-FOLH1 (folato hidrolasa (antígeno de membrana específico de próstata) 1)
(38) SST (receptor de somatostatina; cabe señalar que hay 5 subtipos)
(38.1) Ss Tr 2 (Receptor de somatostatina 2)
(38.2 ) SSTR5 (Receptor de somatostatina 5 )
(38.3) SSTR1
(38.4) SSTR3
(38.5) SSTR4
AvB6 - Ambas subunidades (39+40)
(39) ITGAV (integrina, alfa V)
(40 ) ITGB6 (integrina, beta 6)
(41) CEACAM5 (molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5)
(42) MET (protooncogén met; receptor del factor de crecimiento de hepatocitos)
(43) MUC1 (Mucina 1, asociada a la superficie celular)
(44 ) CA9 (anhidrasa carbónica IX)
(45) EGFRvIII (receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), variante de transcrito 3,
(46) CD33 (molécula CD33)
(47) CD19 (molécula CD19)
(48) IL2RA (receptor de interleucina 2, alfa); secuencia de referencia del NCBI: NM_000417.2);
(49) AXL (receptor tirosina cinasa AXL)
(50) CD30 - TNFRSF8 (Superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 8)
(51) BCMA (antígeno de maduración de linfocitos B) - TNFRSF17 (superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 17)
(52) Ag de CT - ATC (antígenos de cáncer testículo)
(53) CD174 (Lewis Y) - FUT3 (fucosiltransferasa 3 (galactósido 3(4)-L-fucosiltransferasa, grupo sanguíneo de Lewis)
(54) CLEC14A (familia de dominios de lectina de tipo C 14, miembro A; n.° de referencia de Genbank NM175060) (55) GRP78 - HSPA5 (proteína de choque térmico de 70k Da 5 (proteína regulada por glucosa, 78 kDa) (56) CD70 (molécula CD70) L08096
(57) Antígenos específicos de células madre. Por ejemplo:
5T4 (véase la entrada (63) a continuación)
CD25 (véase la entrada (48) anterior)
CD32
LGR5/GPR49
Prominina/CD133
(58) ASG-5
(59) ENPP3 (Ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 3)
(60) PRR4 (rico en prolina 4 (lagrimal))
(61) GCC - GUCY2C (guanilato ciclasa 2C (receptor de enterotoxina termoestable)
(62) Liv-1 - SLC39A6 (familia de vehículos de soluto 39 (vehículo de zinc), miembro 6)
(63) 5T4, Glucoproteína de trofoblastos, TPBG - TPBG (glucoproteína de trofoblastos)
(64) CD56 - NCMA1 (molécula de adhesión de células neurales 1)
(65) CanAg (antígeno asociado a tumor CA242)
(66) FOLR1 (receptor de folato 1)
(67) GPNMB (glucoproteína (transmembrana) nmb
(68) TIM-1 - HAVCR1 (receptor celular del virus de la hepatitis A 1)
(69) RG-1/Diana de tumor de próstata Mindin - Mindin/RG-1
(70) B7-H4 - VTCN1 (dominio V-set que contiene el inhibidor de la activación de linfocitos T 1
(71) PTK7 (proteína tirosina cinasa 7 PTK7)
(72) CD37 (molécula CD37)
(73) CD138 - SDC1 (sindecano 1)
(74) CD74 (molécula CD74, complejo principal de histocompatibilidad, cadena invariante de clase II)
(75) Claudinas - las CL (Claudinas)
(76) EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico)
(77) Her3 (ErbB3) - ERBB3 (homólogo del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica v-erb-b23 (aviar)) (78) RON - MST1R (receptor del estimulador de macrófagos 1 (tirosina cinasa relacionada con c-met))
(79) EPHA2 (receptor de EPH A2)
(80) CD20 - MS4A1 (4 dominios transmembrana, subfamilia A, miembro 1)
(81) Tenascina C - TNC (Tenascina C)
(82) FAP (proteína de activación de fibroblastos, alfa)
(83) DKK-1 (homólogo de Dickkopf 1 (Xenopus laevis)
(84) CD52 (molécula CD52)
(85) CS1 - SLAMF7 (miembro de la familia SLAM 7)
(86) Endoglina - ESP (endoglina)
(87) Anexina A1 -ANXA1 (Anexina A1)
(88) V-CAM (CD106) - Vc Am 1 (molécula de adhesión de células vasculares 1)
Conexión de la unidad de engarce a la unidad de ligando
La unidad de ligando puede conectarse a la unidad de engarce a través de un enlace disulfuro.
En una realización, la conexión entre la unidad de ligando y el engarce de fármaco se forma entre un grupo tiol de un residuo de cisteína de la unidad de ligando y un grupo maleimida de la unidad de engarce de fármaco. Otros posibles grupos para el enlace, y los grupos de enlace resultantes, se muestran a continuación.
Los residuos de cisteína de la unidad de ligando pueden estar disponibles para la reacción con el grupo funcional de la unidad de engarce para formar una conexión. En otras realizaciones, por ejemplo, donde la unidad de ligando es un anticuerpo, los grupos tiol del anticuerpo pueden participar en enlaces disulfuro intercatenarios. Estos enlaces intercatenarios se pueden convertir en grupos tiol libres, por ejemplo, mediante el tratamiento del anticuerpo con DTT antes de la reacción con el grupo funcional de la unidad de engarce.
En algunas realizaciones, el residuo de cisteína se introduce en la cadena pesada o ligera de un anticuerpo. Las posiciones para la inserción de cisteínas por sustitución en cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos incluyen las descritas en la Solicitud Publicada de Ee .UU. N.° 2007-0092940 y la publicación de la Patente Internacional WO2008/070593.
Métodos de tratamiento
Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en un método de terapia. A un sujeto que necesita tratamiento se le puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de fórmula I. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad suficiente para mostrar un beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos la mejoría de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la velocidad y la evolución temporal de la administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, está dentro de la responsabilidad de los facultativos generales y otros médicos.
Un conjugado puede administrarse solo o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial dependiendo de la afección a tratar. Los ejemplos de tratamientos y terapias incluyen, pero sin limitación, quimioterapia (la administración de agentes activos, entre ellos, por ejemplo, fármacos; cirugía; y radioterapia.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para su uso en conformidad con la presente invención, pueden comprender, además del principio activo, es decir, un conjugado de fórmula I, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante farmacéuticamente aceptables u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo o de otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, o por inyección, por ejemplo, cutánea, subcutánea o intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser en forma de comprimido, cápsula, polvo o líquido. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido tal como agua, aceites de petróleo, animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Una cápsula puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina.
Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de la dolencia, el principio activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, sin pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario.
Los conjugados pueden utilizarse para tratar una enfermedad proliferativa y una enfermedad autoinmunitaria. La expresión "enfermedad proliferativa" se refiere a una proliferación celular no deseada o incontrolada de células excesivas o anómalas que no es deseada, tal como, un crecimiento neoplásico o hiperplásico, ya sea in vitro o in vivo.
Los ejemplos de afecciones proliferativas incluyen, pero sin limitación, proliferación celular benigna, premaligna y maligna, incluyendo, pero no se limitan, neoplasias y tumores (por ejemplo, histocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), cánceres (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón microcítico, cáncer gastrointestinal, cáncer de intestino, cáncer de colon, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, sarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), leucemias, psoriasis, osteopatías, trastornos fibroproliferativos (por ejemplo, de tejidos conectivos) y ateroesclerosis. Otros cánceres de interés incluyen, pero sin limitación, neoplasias malignas hemáticas tales como leucemias y linfomas, tales como linfoma no hodkiniano, y subtipos tales LDLBG, linfoma de la zona marginal, de la zona del manto y folicular, de Hodgkin, LMA y otros cánceres de origen en linfocitos B o T.
Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen los siguientes: artritis reumatoide, enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias (por ejemplo, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica), artropatía psoriásica, oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, enfermedad de Graves, glomerulonefritis, trastorno hepatológico autoinmunitario, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn), anafilaxia, reacción alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus de tipo I, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, polimiositis, dermatomiositis, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, uveítis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, adrenalitis, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, ateroesclerosis, lupus eritematoso cutáneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, pénfigo vulgar, pénfigo, dermatitis herpetiforme, alopecia areata, penfigoide, esclerodermia, esclerodermia generalizada, síndrome de CERST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, desmotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmunitaria masculina y femenina, espondolitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, poliarteritis nodosa, vasculitis necrosante sistémica, dermatitis atópica, rinitis atópica, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumática, asma, aborto recurrente, síndrome antifosfolipídico, enfermedad del pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome poscardiotomía, síndrome de Cushing, hepatitis activa crónica autoinmunitaria, neumopatía de los avicultores, necrólisis epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolitis, alveolitis alérgica, alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, eritema nodular, piodermia gangrenosa, reacción a transfusiones, arteritis de Takayasu, polimialgia reumática, arteritis de la temporal, esquistosomiasis, arteritis de células gigantes, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, eccema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Caplan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, endoftalmia, eritema elevado persistente, psoriasis, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariosis, ciclitis, ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, ciclitis de Fuch, nefropatía por IgA, púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedad de injerto contra el hospedador, rechazo de trasplantes, miocardiopatía, síndrome de Eaton-Lambert, policondritis recidivante, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, síndrome de Evan e insuficiencia gonadal autoinmunitaria.
En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria es un trastorno de los linfocitos B (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes de tipo I), linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, tuberculosis, o enfermedad de injerto contra hospedador), o linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico, asma atópica, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis generalizada y enfermedad del injerto contra el hospedador crónica). En general, los trastornos que implican células dendríticas implican trastornos de linfocitos Th1 o linfocitos Th2. En algunas realizaciones, el trastorno autoinmunitario es un trastorno inmunológico mediado por linfocitos T.
El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 mg/kg por dosis. El conjugado puede administrarse en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 mg/kg por dosis.
Carga de fármaco
La carga de fármaco (p) es el número promedio de fármacos de PBD por agente de unión a células, por ejemplo, anticuerpo. En la presente invención, es siempre 1. Sin embargo, cualquier composición puede comprender anticuerpos en los que se conjuga una PBD y anticuerpos en los que no se conjuga una PBD. Así, para una composición, la carga de fármaco (o DAR) puede ser inferior a 1, por ejemplo 0,75 y superior, 0,80 y superior, 0,85 y superior, 0,90 y superior o 0,95 o superior.
Rutas de síntesis generales
La síntesis de los compuestos PBD se analiza ampliamente en las siguientes referencias:
a) documento WO 00/12508 (páginas 14 a 30);
b) documento WO 2005/023814 (páginas 3 a 10);
c) documento WO 2004/043963 (páginas 28 a 29); y
d) documento WO 2005/085251 (páginas 30 a 39).
Ruta de síntesis
Los compuestos de la presente invención de fórmula I:
Figure imgf000021_0001
pueden sintetizarse a partir de un compuesto de Fórmula 2:
Figure imgf000021_0002
donde R2, R6, R7, R9, R11a, R6', R7', R9', R11a', Y, Y' y R" son como se han definido para los compuestos de fórmula I, Rpre-L1 es un precursor de RL1 y Rpre-L2 es un precursor de RL2 - este método es particularmente aplicable a compuestos de fórmula I donde RL1 y RL2 son de fórmula IIIa. Para estos compuestos, Rpre-L1 y Rpre-L2 normalmente serán porciones de RL1 y RL2, tal como un grupo de fórmula IIIa':
. En tal caso, la reacción implica añadir el grupo GL
Los compuestos de Fórmula 2 se pueden preparar desprotegiendo los compuestos de Fórmula 3:
Figure imgf000022_0001
donde R2, R6, R7, R9, R11a, R6', R7', R9', R11a', Y, Y' y R" son como se han definido para los compuestos de fórmula I, Rpre-i_iProt es una versión protegida de Rpre-L1, Rpre-L2Pr°t es una versión protegida de Rpre-L2 y Prot representa un grupo protector de carboxi/hidroxi apropiado.
Los compuestos de fórmula 3 pueden prepararse por cierre de anillo de los compuestos de Fórmula 4:
Figure imgf000022_0002
donde el cierre del anillo se realiza por oxidación, por ejemplo de tipo Swern.
Los compuestos de fórmula 4 pueden sintetizarse a partir de compuestos de fórmula 5:
Figure imgf000022_0003
mediante la adición de los grupos protectores de amino. Si los grupos son diferentes, la adición por etapas puede lograrse mediante la simple protección de un grupo amino (por ejemplo, mediante Fmoc), seguido de la instalación de un grupo protector deseado en el otro grupo amino. Esto puede ser seguido por la eliminación del grupo protector simple, y luego la instalación del otro grupo amino protector deseado.
Los compuestos de fórmula I donde RL1 y RL2 son de fórmula IlIb, pueden sintetizarse de manera similar, aunque el grupo RL1 y/o RL2 completo puede instalarse a partir de un compuesto Fórmula 5, en lugar de utilizar un precursor protegido.
Los compuestos de Fórmula 5 pueden sintetizarse por métodos conocidos, tales como los divulgados en el documento WO 2011/130598.
Síntesis de conjugados de fármacos
Los anticuerpos pueden conjugarse con el compuesto engarce de fármaco generalmente como se describe en Doronina etal., Nature Biotechnology, 2003, 21, 778-784). Brevemente, los anticuerpos (4-5 mg/ml) en PBS con borato de sodio 50 mM a pH 7,4 se reducen con clorhidrato de tris(carboxietil)fosfina (TCEP) a 37 °C. El progreso de la reacción, que reduce los disulfuros entre cadenas, se controla por reacción con 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) y se deja avanzar hasta que se consigue el nivel deseado de tioles/mAb. El anticuerpo reducido se enfría entonces a 0 °C y se alquila con 3 equivalentes de engarce de fármaco por anticuerpo. Después de 1 hora, la reacción se interrumpió mediante la adición de 5 equivalentes de N-acetil cisteína. El engarce de fármaco inactivado se elimina filtración en gel sobre una columna de PD-10. El ADC se filtra luego en condiciones estériles a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm. La concentración de proteína puede determinarse por análisis espectral a 280 nm y 329 nm, respectivamente, con corrección por la contribución de la absorbancia del fármaco a 280 nm. Puede utilizarse cromatografía de exclusión por tamaño para determinar el grado de agregación de los anticuerpos, y puede utilizarse RP-HPLC para determinar los niveles de engarce de fármaco remanentes inactivado por NAC.
Preferencias adicionales
Las siguientes preferencias pueden aplicarse a todos los aspectos de la invención como se han descrito anteriormente, o pueden referirse a un único aspecto. Las preferencias pueden combinarse entre sí en cualquier combinación.
R6' R7', R9', R11a' e Y' se seleccionan de los mismos grupos que R6, R7, R9, R11a e Y respectivamente. En algunas realizaciones, R6', R7', R9', R11a' e Y' son iguales que R6, R7, R9, R11a e Y respectivamente.
En algunas realizaciones, R12 es igual que R2.
Enlace del dímero
En algunas realizaciones, Y e Y' son ambos O.
En algunas realizaciones, R" es un grupo alquileno C3.7 sin sustituyentes. En algunas de estas realizaciones, R" es un alquileno C3, C5 o C7. En particular, R" puede ser un alquileno C3 o C5.
En otras realizaciones, R" es un grupo de fórmula:
Figure imgf000023_0001
donde r es 1 o 2.
R6 a R9
En algunas realizaciones, R9 es H.
En algunas realizaciones, R6 se selecciona de H, OH, OR, SH, NH2, nitro y halo, y puede seleccionarse de H o halo. En algunas de estas realizaciones R6 es H.
En algunas realizaciones, R7 se selecciona de H, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' y halo. En algunas de estas realizaciones R7 se selecciona de H, OH y OR, donde R se selecciona de grupos alquilo C1-7, heterociclilo C3-10 y arilo C5-10 opcionalmente sustituidos. R puede ser más preferentemente un grupo alquilo C1-4, que puede estar sustituido o no. Un sustituyente de interés es un grupo arilo C5-6 (por ejemplo, fenilo). Los sustituyentes particularmente preferidos en las posiciones 7 son OMe y OCH2Ph. Otros sustituyentes de particular interés son dimetilamino (es decir — NMe2); -(OC2H4)qOMe, donde q es de 0 a 2; heterociclilos C6 que contienen nitrógeno, incluyendo morfolino, piperidinilo y N-metil-piperazinilo.
Estas realizaciones y preferencias también se aplican a R9', R6' y R7' respectivamente.
D y D'
En algunas realizaciones, D y D' son D1 y D'1 respectivamente.
En algunas realizaciones, D y D' son D2 y D'2 respectivamente.
R2
Cuando hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 se selecciona de:
(a) un grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3;
(b) alquilo C1-5 alifático saturado;
(c) cicloalquilo C3-6 saturado;
Figure imgf000024_0001
, en donde cada uno de R11, R12 y R13 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 5;
Figure imgf000024_0002
, en donde uno de R15a y R15b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halometilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y
Figure imgf000024_0003
, donde R14 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halometilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo.
Cuando R2 es un grupo arilo C5-10, puede ser un grupo arilo C5-7. Un grupo arilo C5-7 puede ser un grupo fenilo o un grupo heteroarilo C5-7, por ejemplo, furanilo, tiofenilo y piridilo. En algunas realizaciones, R2 es preferentemente fenilo. En otras realizaciones, R2 es preferentemente tiofenilo, por ejemplo, tiofen-2-ilo y tiofen-3-ilo.
Cuando R2 es un grupo arilo C5-10, puede ser un arilo C8-10, por ejemplo, un grupo quinolinilo o isoquinolinilo. El grupo quinolinilo o isoquinolinilo puede estar unido al núcleo de PBD a través de cualquier posición disponible en el anillo. Por ejemplo, el quinolinilo puede ser quinolin-2-ilo, quinolin-3-ilo, quinolin-4-ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo y quinolin-8-ilo. De estos, pueden preferirse quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo. El isoquinolinilo puede ser isoquinolin-1-ilo, isoquinolin-3-ilo, isoquinolin-4-ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo e isoquinolin-8-ilo. De estos, pueden preferirse isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo.
Cuando R2 es un grupo arilo C5-10, puede portar cualquier número de grupos sustituyentes. Preferentemente porta entre 1 y 3 grupos sustituyentes, siendo más preferidos con 1 y 2, y siendo los más preferidos los grupos monosustituidos. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición.
Donde R2 es un grupo arilo C5-7, es preferible un único sustituyente en un átomo del anillo que no esté adyacente al enlace con el resto del compuesto, es decir, preferentemente está en p o y con respecto al enlace con el resto del compuesto. Por consiguiente, donde el grupo arilo C5-7 es fenilo, el sustituyente está preferentemente en las posiciones meta- o para- y, más preferentemente, está en la posición para-.
Donde R2 es un grupo arilo C8-10, por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, puede portar cualquier número de sustituyentes en cualquier posición de los anillos de quinolina o isoquinolina. En algunas realizaciones, porta uno, dos o tres sustituyentes, y éstos pueden estar o en cualquiera de los anillos proximal y distal o en ambos (si hay más de un sustituyente).
Sustituyentes R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10
Si un sustituyente de R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10, es halo, preferentemente es F o Cl, más preferentemente Cl.
Si un sustituyente de R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10, es éter, en algunas realizaciones puede ser un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi C1-7 (por ejemplo, metoxi, etoxi) o en algunas realizaciones puede ser un grupo ariloxi C5-7 (por ejemplo fenoxi, piridiloxi, furanoiloxi). El propio grupo alcoxi puede estar adicionalmente sustituido, por ejemplo, por un grupo amino (por ejemplo, dimetilamino).
Si un sustituyente de R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10, es alquilo C1-7, puede ser preferentemente un grupo alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo, etilo, proprilo, butilo).
Si un sustituyente de R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10, es heterociclilo C3-7, en algunas realizaciones puede ser un grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno, por ejemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estos grupos pueden estar unidos a la parte restante del resto PBD a través del átomo de nitrógeno. Estos grupos pueden estar adicionalmente sustituidos, por ejemplo, por grupos alquilo C1-4. Si el grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno es piperazinilo, dicho sustituyente adicional puede estar en el segundo átomo de nitrógeno del anillo. Si un sustituyente de R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10, es bis-oxi-alquileno C1-3, éste es preferentemente bis-oximetileno o bis-oxi-etileno.
Si un sustituyente de R2, cuando R2 es un grupo arilo C5-10, es éster, éste es preferentemente éster de metilo o éster de etilo.
Algunos sustituyentes particularmente preferidos cuando R2 es un grupo arilo C5-10 incluyen metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metiltiofenilo. Otros sustituyentes particularmente preferidos para R2 son dimetilaminopropiloxi y carboxi.
Algunos grupos R2 sustituidos particularmente preferidos cuando R2 es un grupo arilo C5-10 incluyen, pero sin limitación, 4-metoxi-fenilo, 3-metoxi-fenilo, 4-etoxi-fenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-fluoro-fenilo, 4-cloro-fenilo, 3,4-bisoximetilen-fenilo, 4-metiltiofenilo, 4-cianofenilo, 4-fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo y naftilo. Otro posible grupo R12 sustituido es 4-nitrofenilo. Algunos grupos R12 de particular interés incluyen 4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilo y 3,4-bisoximetilen-fenilo.
Cuando R2 es alquilo C1-5 alifático saturado, puede ser metilo, etilo, propilo, butilo o pentilo. En algunas realizaciones, puede ser metilo, etilo o propilo (n-pentilo o isopropilo). En algunas de estas realizaciones, puede ser metilo. En otras realizaciones, puede ser butilo o pentilo, que puede ser lineal o ramificado.
Cuando R2 es cicloalquilo C3-6 saturado, puede ser ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. En algunas realizaciones, puede ser ciclopropilo.
Cuando R2 es
Figure imgf000025_0001
, cada uno de R11, R12 y R13 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 5. En algunas realizaciones, el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 4 o no es mayor de 3.
En algunas realizaciones, uno de R11, R12 y R13 es H, seleccionándose los otros dos grupos de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo.
En otras realizaciones, dos de R11, R12y R13 son H, seleccionándose el otro grupo de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo.
En algunas realizaciones, los grupos que no son H se seleccionan de metilo y etilo. En algunas de estas realizaciones, los grupos que no son H son metilo.
En algunas realizaciones, R11 es H.
En algunas realizaciones, R12 es H.
En algunas realizaciones, R13 es H.
En algunas realizaciones, R11 y R12 son H.
En algunas realizaciones, R11 y R13 son H.
En algunas realizaciones, R12 y R13 son H.
Un grupo R2 de particular interés es:
Figure imgf000026_0001
Cuando R2 es
Figure imgf000026_0002
, uno de R15a y R15b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo. En algunas realizaciones, el grupo que no es H es fenilo opcionalmente sustituido. Si el sustituyente opcional de fenilo es halo, es preferentemente flúor. En alguna realización, el grupo fenilo no está sustituido.
Cuando R2 es
Figure imgf000026_0003
, R14 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halometilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo. Si el sustituyente opcional de fenilo es halo, es preferentemente flúor. En alguna realización, el grupo fenilo no está sustituido.
En algunas realizaciones, R14 se selecciona de H, metilo, etilo, etenilo y etinilo. En algunas de estas realizaciones, R14 se selecciona de H y metilo.
Cuando hay un enlace sencillo presente entre C2 y C3,
R2 es H o
Figure imgf000026_0004
, donde R16a y R16b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R16a y R16b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, R2 es H.
En algunas realizaciones, R2 es
Figure imgf000026_0005
En algunas realizaciones, se prefiere que R16a y R16b sean ambos H.
En otras realizaciones, se prefiere que R16a y R16bsean ambos metilo.
En realizaciones adicionales, se prefiere que uno de R16a y R16b sea H, y el otro se selecciona de alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos. En estas realizaciones adicionales, puede ser adicionalmente preferido que el grupo que no es H se seleccione entre metilo y etilo.
R22
Cuando hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 se selecciona de:
(a) grupo arilo C510, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3;
(b) alquilo C1-5 alifático saturado;
(c) cicloalquilo C3-6 saturado;
(d)
Figure imgf000027_0001
, en donde cada uno de R31, R32 y R33 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R22 no es mayor de 5; (e)
Figure imgf000027_0002
, en donde uno de R25a y R25b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halometilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y
(f)
Figure imgf000027_0003
, donde R24 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halometilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo.
Cuando R22 es un grupo arilo C5-10, puede ser un grupo arilo C5-7. Un grupo arilo C5-7 puede ser un grupo fenilo o un grupo heteroarilo C5-7, por ejemplo, furanilo, tiofenilo y piridilo. En algunas realizaciones, R22 es preferentemente fenilo. En otras realizaciones, R22 es preferentemente tiofenilo, por ejemplo, tiofen-2-ilo y tiofen-3-ilo.
Cuando R22 es un grupo arilo C5-10, puede ser un arilo C8-10, por ejemplo, un grupo quinolinilo o isoquinolinilo. El grupo quinolinilo o isoquinolinilo puede estar unido al núcleo de PBD a través de cualquier posición disponible en el anillo. Por ejemplo, el quinolinilo puede ser quinolin-2-ilo, quinolin-3-ilo, quinolin-4-ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo y quinolin-8-ilo. De estos, pueden preferirse quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo. El isoquinolinilo puede ser isoquinolin-1-ilo, isoquinolin-3-ilo, isoquinolin-4-ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo e isoquinolin-8-ilo. De estos, pueden preferirse isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo.
Cuando R22 es un grupo arilo C5-10, puede portar cualquier número de grupos sustituyentes. Preferentemente porta entre 1 y 3 grupos sustituyentes, siendo más preferidos con 1 y 2, y siendo los más preferidos los grupos monosustituidos. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición.
Donde R22 es un grupo arilo C5-7, es preferible un único sustituyente en un átomo del anillo que no esté adyacente al enlace con el resto del compuesto, es decir, preferentemente está en p o y con respecto al enlace con el resto del compuesto. Por consiguiente, donde el grupo arilo C5-7 es fenilo, el sustituyente está preferentemente en las posiciones meta- o para- y, más preferentemente, está en la posición para-.
Donde R22 es un grupo arilo C8-10, por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, puede portar cualquier número de sustituyentes en cualquier posición de los anillos de quinolina o isoquinolina. En algunas realizaciones, porta uno, dos o tres sustituyentes, y éstos pueden estar o en cualquiera de los anillos proximal y distal o en ambos (si hay más de un sustituyente).
Sustituyentes R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10
Si un sustituyente de R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10, es halo, preferentemente es F o Cl, más preferentemente Cl.
Si un sustituyente de R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10, es éter, en algunas realizaciones puede ser un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi C1-7 (por ejemplo, metoxi, etoxi) o en algunas realizaciones puede ser un grupo ariloxi C5-7 (por ejemplo fenoxi, piridiloxi, furanoiloxi). El propio grupo alcoxi puede estar adicionalmente sustituido, por ejemplo, por un grupo amino (por ejemplo, dimetilamino).
Si un sustituyente de R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10, es alquilo C1-7, puede ser preferentemente un grupo alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo, etilo, proprilo, butilo).
Si un sustituyente de R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10, es heterociclilo C3-7, en algunas realizaciones puede ser un grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno, por ejemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estos grupos pueden estar unidos a la parte restante del resto PBD a través del átomo de nitrógeno. Estos grupos pueden estar adicionalmente sustituidos, por ejemplo, por grupos alquilo C1-4. Si el grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno es piperazinilo, dicho sustituyente adicional puede estar en el segundo átomo de nitrógeno del anillo.
Si un sustituyente de R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10, es bis-oxi-alquileno C1-3, éste es preferentemente bisoxi-metileno o bis-oxi-etileno.
Si un sustituyente de R22, cuando R22 es un grupo arilo C5-10, es éster, éste es preferentemente éster de metilo o éster de etilo.
Algunos sustituyentes particularmente preferidos cuando R22 es un grupo arilo C5-10 incluyen metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metiltiofenilo. Otros sustituyentes particularmente preferidos para R22 son dimetilaminopropiloxi y carboxi.
Algunos grupos R22 sustituidos particularmente preferidos cuando R22 es un grupo arilo C5-10 incluyen, pero sin limitación, 4-metoxi-fenilo, 3-metoxi-fenilo, 4-etoxi-fenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-fluoro-fenilo, 4-cloro-fenilo, 3,4-bisoximetilenfenilo, 4-metiltiofenilo, 4-cianofenilo, 4-fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo y naftilo. Otro posible grupo R22 sustituido es 4-nitrofenilo. Algunos grupos R22 de particular interés incluyen 4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilo y 3,4-bisoximetilen-fenilo.
Cuando R22 es alquilo C1-5 alifático saturado, puede ser metilo, etilo, propilo, butilo o pentilo. En algunas realizaciones, puede ser metilo, etilo o propilo (n-pentilo o isopropilo). En algunas de estas realizaciones, puede ser metilo. En otras realizaciones, puede ser butilo o pentilo, que puede ser lineal o ramificado.
Cuando R22 es cicloalquilo C3-6 saturado, puede ser ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. En algunas realizaciones, puede ser ciclopropilo.
Cuando R22 es
Figure imgf000028_0001
, cada uno de R31, R32 y R33 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R22 no es mayor de 5. En algunas realizaciones, el número total de átomos de carbono en el grupo R22 no es mayor de 4 o no es mayor de 3.
En algunas realizaciones, uno de R31, R32 y R33 es H, seleccionándose los otros dos grupos de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo.
En otras realizaciones, dos de R31, R32 y R33 son H, seleccionándose el otro grupo de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo.
En algunas realizaciones, los grupos que no son H se seleccionan de metilo y etilo. En algunas de estas realizaciones, los grupos que no son H son metilo.
En algunas realizaciones, R31 es H.
En algunas realizaciones, R32 es H.
En algunas realizaciones, R33 es H.
En algunas realizaciones, R31 y R32 son H.
En algunas realizaciones, R31 y R33 son H.
En algunas realizaciones, R32 y R33 son H.
Un grupo R22 de particular interés es:
Figure imgf000029_0001
Cuando R22 es
Figure imgf000029_0002
, uno de R25a y R25b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo. En algunas realizaciones, el grupo que no es H es fenilo opcionalmente sustituido. Si el sustituyente opcional de fenilo es halo, es preferentemente flúor. En alguna realización, el grupo fenilo no está sustituido.
Cuando R22 es
Figure imgf000029_0003
, R24 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halometilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo. Si el sustituyente opcional de fenilo es halo, es preferentemente flúor. En alguna realización, el grupo fenilo no está sustituido.
En algunas realizaciones, R24 se selecciona de H, metilo, etilo, etenilo y etinilo. En algunas de estas realizaciones, R24 se selecciona de H y metilo.
Cuando hay un enlace sencillo presente entre C2' y C3',
R22 es H o
Figure imgf000029_0004
, donde R26a y R26b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R26a y R26b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, R22 es H.
En algunas realizaciones, R22 es
Figure imgf000030_0001
En algunas realizaciones, se prefiere que R26a y R26b sean ambos H.
En otras realizaciones, se prefiere que R26a y R26bsean ambos metilo.
En realizaciones adicionales, se prefiere que uno de R26a y R26b sea H, y el otro se selecciona de alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos. En estas realizaciones adicionales, puede ser adicionalmente preferido que el grupo que no es H se seleccione entre metilo y etilo.
R11
En algunas realizaciones, R11a es OH.
En algunas realizaciones, R11a es ORA, donde RA es alquilo C1.4. En algunas de estas realizaciones, RA es metilo. En algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención son de fórmula la-1, la-2 o la-3:
Figure imgf000031_0001
donde R2a y R22a son iguales y se seleccionan de:
(a)
Figure imgf000031_0002
(b)
Figure imgf000031_0003
(c)
Figure imgf000031_0004
(d)
Figure imgf000031_0005
(e)
Figure imgf000031_0006
(f)
Figure imgf000031_0007
(g)
Figure imgf000031_0008
y
(h)
Figure imgf000032_0001
R1a se selecciona de metilo y bencilo;
Ri_u, ru_2 y R11a son como se han definido anteriormente.
En algunas realizaciones de la presente invención ambos R2 y R22 no comprenden más de 3 átomos de carbono. Por tanto, en estas realizaciones donde hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 puede seleccionarse de: (i) Metilo;
Figure imgf000032_0002
(ii) Etilo;
Figure imgf000032_0003
y
(iii) Propilo;
Figure imgf000032_0004
(iv) Ciclopropilo;
Por tanto, en estas realizaciones no hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 puede seleccionarse de: (i) H; (iii)
Figure imgf000032_0005
y (ii)
Figure imgf000032_0006
(iv)
Figure imgf000032_0007
Por tanto, en estas realizaciones donde hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 puede seleccionarse de: (i) Metilo;
Figure imgf000033_0001
(ii) Etilo;
Figure imgf000033_0002
y
(iii) Propilo;
Figure imgf000033_0003
(iv) Ciclopropilo;
Por tanto, en estas realizaciones donde no hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 puede seleccionarse de: (i) H;
Figure imgf000033_0004
y
(ii)
Figure imgf000033_0005
En algunas de estas realizaciones ambos R2 y R22 no comprenden más de 2 átomos de carbono.
Por tanto, en estas realizaciones donde hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 puede seleccionarse de: (i) Metilo; (vi)
Figure imgf000033_0006
(ii) Etilo; y
Por tanto, en estas realizaciones no hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 puede seleccionarse de:
(i) H; (iii)
Figure imgf000033_0007
(ii)
Figure imgf000033_0008
; y
Por tanto, en estas realizaciones donde hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 puede seleccionarse de: (i) Metilo; (vi)
Figure imgf000034_0001
(ii) Etilo; y
Por tanto, en estas realizaciones donde no hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 puede seleccionarse de: (i) H; (iii)
Figure imgf000034_0002
(ii)
Figure imgf000034_0003
; y
En otras de estas realizaciones ambos R2 y R22 no comprenden más de 1 átomo de carbono.
Por tanto, en estas realizaciones donde hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 puede ser metilo. Por tanto, en estas realizaciones no hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 puede seleccionarse de: (i) H; y (ii)
Figure imgf000034_0004
Por tanto, en estas realizaciones donde hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 puede ser metilo. Por tanto, en estas realizaciones donde no hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 puede seleccionarse de: (i) H; y (ii)
Figure imgf000034_0005
Sin desear quedar ligados a teoría alguna, donde el sustituyente en la posición C2 de los dímeros de PBD es pequeño, se cree que el uso de la unidad de protección terminal de glucurónido en estos engarces de fármaco es especialmente ventajoso, ya que aumenta significativamente la hidrofilia del engarce de fármaco, haciendo que los engarces de fármaco sean más fáciles de conjugar con una unidad de ligando.
Estas realizaciones y preferencias también se aplican al segundo aspecto de la invención.
Enlazador (RL/RLL)
En algunas realizaciones, RLL1 y RLL2 son de fórmula Illa'. En algunas realizaciones, RL1 y RL2 son de fórmula Ilia. GL GL puede seleccionarse de
Figure imgf000035_0001
continuación
Figure imgf000036_0001
donde Ar representa un grupo arileno C5-6, por ejemplo fenileno, y X representa alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, GL se selecciona de GL1-1 y GL1-2 En algunas de estas realizaciones, GL es GL1-1. GLL GLL puede seleccionarse de:
Figure imgf000036_0002
continuación
Figure imgf000037_0002
donde Ar representa un grupo arileno C5-6, por ejemplo, fenileno y X representa alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, GLL se selecciona de GLL1-1 y GLL1-2 En algunas de estas realizaciones, GLL es GLL1-1. X
X es:
Figure imgf000037_0001
donde a = de 0 a 5, b = de 0 a 16, c = 0 o 1, d = de 0 a 5.
a puede ser 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, a es de 0 a 3. En algunas de estas realizaciones, a es 0 o 1. En realizaciones adicionales, a es 0.
b puede ser 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En algunas realizaciones, b es de 0 a 12. En algunas de estas realizaciones, b es de 0 a 8, y puede ser 0, 2, 4 u 8.
c puede ser 0 o 1.
d puede ser 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, d es de 0 a 3. En algunas de estas realizaciones, d es 1 o 2. En realizaciones adicionales, d es 2.
En algunas realizaciones de X, a es 0, c es 1 y d es 2, y b puede ser de 0 a 8. En algunas de estas realizaciones, b es 0, 4 u 8.
QX
En una realización, QX es un residuo de aminoácido. El aminoácido puede ser un aminoácido natural o un aminoácido no natural.
En una realización, QX se selecciona de: Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg y Trp, donde Cit es citrulina.
En una realización, QX comprende un residuo dipeptídico. Los aminoácidos del dipéptido pueden ser cualquier combinación de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones, el dipéptido comprende aminoácidos naturales. Cuando el engarce es un engarce lábil de catepsina, el dipéptido es el sitio de acción para la escisión mediada por la catepsina. El dipéptido es entonces un sitio de reconocimiento para la catepsina.
En una realización, QX se selecciona de:
CO-Phe-Lys-NH,
CO-Val-Ala-NH,
CO-Val-Lys-NH,
CO-Ala-Lys-NH,
CO-Val-Cit-NH,
CO-Phe-Cit-NH,
CO-Leu-Cit-NH,
CO-lle-Cit-NH,
CO-Phe-Arg-NH, y
CO-Trp-Cit-NH;
donde Cit es citrulina.
Preferentemente, QX se selecciona de:
CO-Phe-Lys-NH,
CO-Val-Ala-NH,
CO-Val-Lys-NH,
CO-Ala-Lys-NH,
CO-Val-Cit-NH.
Más preferentemente, QX se selecciona de CO-Phe-Lys-NH, CO-Val-Cit-NH y CO-Val-Ala-NH.
Otras combinaciones de dipéptidos de interés incluyen:
CO-Gly-Gly-NH,
CO-Pro-Pro-NH, y
CO-Val-Glu-NH.
Se pueden usar otras combinaciones de dipéptidos, incluyendo los descritos por Dubowchik et al, Bioconjugate Chemistry, 2002, 13855-869.
En algunas realizaciones, QX es un residuo de tripeptídico. Los aminoácidos del tripéptido pueden ser cualquier combinación de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones, el tripéptido comprende aminoácidos naturales. Cuando el engarce es un engarce lábil de catepsina, el tripéptido es el sitio de acción para la escisión mediada por catepsina. El tripéptido es entonces un sitio de reconocimiento para catepsina.
En una realización, la cadena lateral aminoacídica está protegida químicamente, cuando sea apropiado. El grupo protector de la cadena lateral puede ser un grupo como se analiza a continuación. Las secuencias de aminoácidos protegidas son escindibles por enzimas. Por ejemplo, una secuencia dipeptídica que comprende un residuo de Lis protegido con cadena lateral Boc es escindible mediante catepsina.
Los grupos protectores para las cadenas laterales de aminoácidos son bien conocidos en la técnica y se describen en el catálogo de Novabiochem. y, como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, RL1 y RL2 son iguales.
En algunas realizaciones, RLL1 y RLL2 son iguales.
En una realización particular, el primer aspecto de la invención comprende un conjugado de fórmula Id:
Figure imgf000039_0001
donde m es un número entero de 2 a 8.
En una realización particular, en el segundo aspecto de la invención, el engarce de fármaco (DL) es de fórmula (Id'):
Figure imgf000039_0002
donde m es un número entero de 2 a 8.
En algunas realizaciones, RL1 y RL2 son diferentes.
En algunas realizaciones, RLL1 y RLL2 son diferentes.
En particular, en las realizaciones en las que los grupos de enlace son diferentes, las diferencias pueden estar solo en los grupos G, de manera que el resto de los grupos de enlace son iguales (de manera que los desencadenantes de la escisión son iguales).
En algunas realizaciones de la presente invención, el sustituyente C11 puede estar en la siguiente disposición estereoquímica con respecto a los grupos vecinos:
Figure imgf000039_0003
En otras realizaciones, el sustituyente C11 puede estar en la siguiente disposición estereoquímica con respecto a los grupos vecinos:
Figure imgf000040_0001
Los compuestos de interés particular incluyen los de los ejemplos.
Ejemplos
La cromatografía ultrarrápida se realizó usando gel de sílice a presión. Se comprobó la pureza de las fracciones mediante cromatografía en capa fina (TLC) utilizando gel de sílice Merck Kieselgel 60 F254, con indicador fluorescente en placas de aluminio. La visualización de la TLC se realizó con luz ultravioleta o vapor de yodo, a menos que se indique otra cosa. Los disolventes de extracción y cromatografía se adquirieron y utilizaron sin purificación adicional en VWR U.K. Todos los productos de química fina se adquirieron en Sigma-Aldrich, a menos que se indique otra cosa. Los reactivos pegilados se obtuvieron de Quanta biodesign US a través de Stratech UK o de Pierce Scientific a través de Thermo Fisher
Los espectros de RMN de 1H y 13C se obtuvieron en un espectrómetro Bruker Avance® 400. Las constantes de acoplamiento se indican en hercios (Hz). Los desplazamientos químicos se recogen en partes por millón (ppm) con referencia a tetrametilsilano. Las multiplicidades de espín se denominan s (singlete), sa (singlete ancho), d (doblete), t (triplete) y m (multiplete).
Las condiciones analíticas LC/MS (para la monitorización de la reacción y la determinación de la pureza) fueron las siguientes: La espectrometría de masas por electronebulización en modo positivo se realizó utilizando un LCMS-2020 Shimadzu Nexera®/Prominence®. Las fases móviles utilizadas fueron el disolvente A (H2O con ácido fórmico al 0,1 %) y el disolvente B (CH3CN con ácido fórmico al 0,1 %). Gradiente para pasada rutinaria de 3 minutos: Composición inicial 5 % de B mantenida durante 25 segundos, luego se aumentó de 5 % de B a 100 % de B durante un periodo de 1 minuto y 35 segundos. La composición se mantuvo durante 50 segundos al 100 % de B, luego volvió a 5 % de B en 5 segundos y se mantuvo así durante 5 segundos. La duración total de la pasada del gradiente fue de 3,0 minutos. Gradiente para pasada de 15 minutos: Composición inicial de 5 % de B mantenida durante 1,25 minutos, luego se aumentó de 5 % B a 100 % de B durante un periodo de 8,75 minutos. La composición se mantuvo durante 2,5 minutos al 100 % de B, luego volvió a 5 % de B en 30 segundos y se mantuvo durante 2 minutos. La duración total de la pasada del gradiente fue de 15,0 minutos. El caudal fue de 0,8 ml/minuto (durante una pasada de 3 minutos) y de 0,5 ml/minuto (durante una pasada de 15 minutos). La detección se realizó a 254 nm. Columnas: Waters Acquity UPLC® BEH Shield RP18 de 1,7 ^m 2,1 x 50 mm a 50 °C equipada con una pre-columna Waters Acquity UPLC® BEH Shield RP18 VanGuard, 130 A, 1,7 ^m, 2,1 mm x 5 mm (pasada rutinaria de 3 minutos); y Waters Acquity UPLC CSH C18, 1,7^, 2.1 x 100 mm equipada con una pre-columna Waters Acquity UPLC® BEH Shield RP18 VanGuard, 130 A, 1,7 ^m, 2.1 mm x 5 mm (pasada de 15 minutos).
Las condiciones de HPLC preparativa fueron las siguientes: La cromatografía líquida ultrarrápida de alto rendimiento (UFLC) en fase inversa se realizó en un equipo Shimazdzu Prominence® utilizando una columna Phenomenex® Gemini NX 5 ^ C18 (a 50 °C) de 150 x 21,2 mm. Los eluyentes utilizados fueron el disolvente A (H2O con ácido fórmico al 0,05 %) y el disolvente B (CH3CN con ácido fórmico al 0,05 %). Todos los experimentos de UFLC se realizaron con las condiciones de gradiente: Composición inicial 13% de B, la composición se incrementó hasta el 100% de B durante un total de 17 minutos a un gradiente adecuado para efectuar la separación deseada, luego se mantuvo durante 1 minuto al 100 % de B, luego se volvió al 13 % de B en 0,1 minutos y se mantuvo así durante 1,9 minutos. La duración total de la pasada del gradiente fue de 20,0 minutos. El flujo fue de 20,0 ml/minuto y la detección se realizó a 254 y 280 nm.
Ejemplo 1
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
(a) ( S )-(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-il)(4-hidroxi-5-metoxi-2-nitrofenil)metanona (2)
Se añadió acetato de litio dihidrato (3,52 g, 34,5 mmol, 1,0 equiv.) a una solución agitada de TIPS éter (1) (19,96 g, 34.5 mmol, 1,0 equiv.) en DMF/H2O (300 ml/4 ml). La solución roja resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3.5 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (600 ml) y se lavó con solución 1 M de ácido cítrico (2 x 250 ml), H2O (2 x 250 ml), salmuera saturada (300 ml) y se secó (MgSO4). El disolvente se evaporó a presión reducida para proporcionar el producto en forma de un sólido de color amarillo (14,57 g, 100 %). El producto se usó sin purificación adicional. Datos analíticos: LC/MS, TR 1,74 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 423 ([M + H]+-, 100); 445 ([M Na])+, 75).
(b) ((Pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitro-4,1-fenilen))bis((( S )-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-il)metanona) ( 3 )
Se añadió carbonato potásico (5,03 g, 36,44 mmol, 1,1 equiv.) a una solución agitada de fenol (2) (14 g, 33,13 mmol, 1,0 equiv.) y 1,5 diyodopentano (21,46 g, 9,86 ml, 66,26 mmol, 2,0 equiv.) en DMF (250 ml). La solución se calentó a 70 °C durante 3,5 h. La solución se vertió en una mezcla de hielo/agua (800 ml) y se extrajo con EtOAc (4 x 500 ml). Los extractos combinados se lavaron con H2O (2 x 250 ml), salmuera saturada (400 ml), se secaron (MgSO4) y se evaporaron a presión reducida para dar un aceite de color pardo. La purificación por cromatografía en columna ultrarrápida [n-heptano/EtOAc de 40 % a 80 % en incrementos del 10 %] dio el producto en forma de una espuma de color amarillo (12,7 g, 85 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 2,16 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 913 ([M + H]+-, 100); 935 ([M Na])+; 100).
(c) ((Pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(2-amino-5-metoxi-4,1-fenilen))bis((( S )-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-il)metanona) ( 4 )
Se trató polvo de zinc (19,9 g, 304 mmol, 40 equiv.) con HCl 1 M (100 ml) y se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se sonicó durante 10 minutos y el zinc activado se recogió por filtración al vacío y se lavó con HCI 1 M (50 ml), H2O (a pH de 6 a 7), MeOH y se secó al vacío sobre el lecho corto de filtro. El zinc activado se añadió a una solución agitada vigorosamente del compuesto bis nitro (3) (6,94 g, 7,6 mmol, 1,0 eq.) en EtOH/H2O/EtOAc (60 ml/4 ml/60 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se trató gota a gota con una solución de HCO2H al 5 % v/v en MeOH (76 ml). Se observó un cambio de color de verde a gris metálico y una exotermia a 42 °C. Una vez que la exotermia se redujo a 30 °C, la LC/MS indicó que la reacción no se había completado. Se añadió otra porción de HCO2H al 5 % v/v en MeOH (20 ml) y se observó otra exotermia (34 °C) La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente momento en el que el análisis por LC/MS reveló la conversión completa al producto deseado. La mezcla se filtró a través de Celite® y el lecho corto se lavó con EtOAc. El filtrado se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 300 ml), agua (300 ml), salmuera saturada (300 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó al vacío para proporcionar la bis-anilina en forma de una espuma de color amarillo (6,22 g, 96 %). El producto se usó sin purificación adicional. Datos analíticos: LC/MS, TR 2,12 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 853 ([M H]+-, 15).
(d) Bis(4-(( S )-2-(( S )-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bendl) ((pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(6-(( S )-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (6)
Se añadió trietilamina (0,171 g, 235 pl, 1,69 mmol, 4,4 equiv.) mediante una jeringa a una solución agitada de bis anilina (4) (0,33 g, 0,38 mmol, 1,0 equiv.) y trifosgeno (0,082 g, 0,28 mmol, 0,72 equiv.) en THF seco en una atmósfera de argón. La suspensión resultante se calentó a 40 °C y después de 5 min se muestreó en MeOH para LC/MS como el bis metil carbamato (MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 969 ([M H]+-, 80); 992 ([M Na])+; 100). Se añadieron dilaurato de dibutilestaño (0,024 g, 23 pl, 38 pmol, 0,1 equiv.) después engarce sólido (5) (0,319 g, 0,85 mmol, 2,2 equiv.) y trimetilamina (0,085 g, 118 pl, 0,85 mmol, 2,2 equiv.) y la mezcla se calentó a 40 °C con agitación en una atmósfera de argón durante 5 h. La mezcla de reacción se dejó enfriar, se filtró y el THF se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida [CHCh/MeOH 0%, 1 %, 1,5%, 2%, elución en gradiente] para dar el producto en forma de una espuma de color amarillo (0,42 g, 66 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 2,16 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1660 ([M + H]+-, 60); 1682 ([M Na])+, 65).
(e) Bis(4-(( S )-2-(( S )-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) ((pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(6-(( S )-2-(hidroximetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (7)
Se añadió ácido p-toluenosulfónico (0,296 g, 1,7 mmol, 2,2 equiv.) a una solución agitada de bis-terc-butildimetilsilil éter (6) (1,26 g, 0,76 mmol, 1,0 equiv.) en H2O al 10 % v/v en THF. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con solución saturada de NaHCO3 (2 x 100 ml), H2O (100 ml), salmuera saturada (100 ml), se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida [CHCh/MeOH de 0 % a 5 % en incrementos del 1 %] para dar el producto en forma de una espuma de color blanco (0,896 g, 92 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 1,61 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1432 ([M + H]+-, 5); 1454 ([M Na])+, 5).
(f) Bis(4-(( S )-2-(( S )-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8 '-(pentano-1,5-diilbis(oxi))(11S, 11aS,11 S , 11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-10(5H)-carboxilato) ( 8 )
Se añadió peryodinano de Dess-Martin (0,24 g, 0,57 mmol, 2,0 equiv.) a una solución agitada de bis-alcohol (7) en DCM seco (20 ml). La suspensión de color blanco resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y se extrajo con solución saturada de NaHCO3 (2 x 100 ml), agua (100 ml), salmuera saturada (100 ml), se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna ultrarrápida [CHCh/MeOH de 0 % a 3 % en incrementos del 0,5 %] dio el producto en forma de una espuma de color blanco (0,28 g, 69 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 1,58 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1428 ([M + H]+ , 20); 1450 ([M Na])+, 30).
(g) Bis(4-(( S )-2-(( S )-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diilbis(oxi))(11S,11aS,11 'S,11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-10(5H)-carboxilato) ( 9 )
Se añadió Pd(PPh3)4 (8 mg,7 pmol, 0,04 equiv.) a una solución agitada del derivado bis-aloc (8) (0,25 g, 0,176 mmol 1.0 equiv.) y pirrolidina (31 mg, 36 pl 0,44 mmol, 2,5 equiv.) en DCM seco (10 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se repartió entre solución saturada de NH4Cl (50 ml) y DCM (50 ml). El DCM se separó y se lavó con salmuera saturada (100 ml), se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida. El residuo sólido se trituró/sonicó con Et2O (3 x 15 ml) y se secó al vacío para dar el producto en forma de un sólido de color blanco (0,207 g, 93 %). El producto se usó sin purificación adicional. Datos analíticos: LC/MS, TR 1,06 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 630 ([M 2H]+-, 100).
(h) Bis(4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diil-bis(oxi))(11 S, 11aS,11'S, 11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]ben-zodiazepin-10(5H)-carboxilato) ( 10 )
Se añadió EDCI.HCI (56 mg, 0,29 mmol, 3 equiv.) a una solución agitada de bis-amina (9) (0,123 g, 98 pmol, 1.0 equiv.) y MaldPEG®OH (0,128 g, 0,22 mmol, 2,2 equiv.) en CHCh (15 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min después se diluyó con CHCh (50 ml), se lavó con H2O (100 ml), salmuera saturada (100 ml), se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida. La purificación por HPLC preparativa seguido de liofilización dio el producto en forma de una espuma de color blanco (0,047 g, 20 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 6,61 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1205 ([M + 2H]+-, 55).
Figure imgf000044_0001
Bis(4-((2S,5S)-25-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,23-trioxo-10,13,16,19-tetraoxa-3,6,22-triazapentacosanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diilbis(oxi))(11 S, 11aS,11'S, 11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo- 11,11a-dihidro- 1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-10(5H)-carboxilato) (11)
Se añadió DIPEA (30 mg, 42 ^l, 0,23 mmol, 3 equiv.) a una solución agitada de b/s-amina (9) (98 mg, 78 ^mol, 1,0equiv.) y MalPEG4Osu (88 mg, 0,17 mmol, 2,2 equiv.) en CHCh (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 72 h, después se diluyó con CHCh (50 ml), se lavó con H2O (100 ml), salmuera saturada (100 ml), se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida. La purificación por HPLC preparativa seguido de liofilización dio el producto en forma de una espuma de color blanco (0,043 g, 25 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 6,11 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1028 ([M + 2H]+-, 80).
Ejemplo 3
Figure imgf000045_0001
bis(4-(( S )-2-(( S )-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8-(pentano-1,5-diilbis(oxi))(11S, 11aS, 11'S, 11a'S)-bis(11-hidmxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidm-1H-pirmlo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-10(5H)-carboxilato) (12)
Se añadió EDCI.HCI (50 mg, 0,26 mmol, 3 equiv.) a una solución agitada de b/s-amina (9) (0,109 g, 86,5 pmol, 1,0 equiv.) y MCOSu (40 mg, 0,19 mmol, 2,2 equiv.) en CHCh (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min después se diluyó con CHQ3 (50 ml), se lavó con H2O (100 ml), salmuera saturada (100 ml), se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida. La purificación por HPLC preparativa seguido de liofilización dio el producto en forma de una espuma de color blanco (0,045 g, 32 %). Datos analíticos: LC/MS, TR 6,82 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1646 ([M + H]+-, 20); 1667 ([M Na])+, 30).
Figure imgf000046_0001
(a) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bendl) ((propano-1,3-diilbis(oxi))bis(6-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)pirrolidin-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (14)
Se añadió trifosgeno (472 mg, 1,59 mmol, 0,72 equiv.) en una porción a una mezcla de 13 (1,77 g, 2,21 mmol) y trietilamina (1,35 ml, 9,69 mmol, 4,38 equiv.) en diclorometano (3,6 ml). Después de 10min, se añadió 5 (1,83 g, 4,85 mmol, 2,19 equiv.) en una porción como un polvo fino, seguido de trietilamina (0,68 ml, 4,9 mmol, 2,2 equiv.) y dilaurato de dibutilestaño (132 pl, 0,221 mmol, 0,1 equiv.). La mezcla de reacción se dejó en agitación a 37 °C durante 4 h, seguido de agitación a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua y se decantó en un cartucho de filtración. El DCM se eliminó por evaporación, y el residuo se cargó seco sobre gel de sílice, seguido de cromatografía con un cartucho ultra biotage de 50 g (gradiente DCM/DCM:MeOH 90:10, de 5 % hasta 32 %, elución al 32 %). Las fracciones puras se combinaron para producir el producto 14 (2,35 g, 1,46 mmol, rendimiento del 66,2 %). Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 2,24 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1608,9 ([M + H]+-, 100);
(b) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) ((propano-1,3-diilbis(oxi))bis(6-((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato ( 15 )
Se añadió ácido paratoluenosulfónico hidrato (277 mg, 1,46 mmol, 1 equiv.) en una porción a una mezcla de 14 (2,34 g, 1,46 mmol) en tetrahidrofurano (53,0 ml) y agua (5,00 ml) a 0 °C (baño de hielo/agua). La mezcla de reacción se dejó en agitación a 20 °C durante 7 h hasta su finalización, tal y como se comprobó por LCMS. La mezcla de reacción se repartió entre acetato de etilo y agua, y se lavó con NaHCO3, después salmuera. Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía (50 g ultra, se cargó seco sobre una pequeña muestra, DCM frente a DCM:MeOH 90:10, gradiente de 20 % a 64 %, elución de alrededor del 64 %. Las fracciones puras se combinaron y se concentraron al vacío para dar el producto 15 (1,60 g, 1,16 mmol, rendimiento del 79,7 %) en forma de un sólido de color blanco.
Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,50 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1380,9 ([M + H]+-, 100);
(c) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benál) 8,8’-(propano-1,3-diilbis(oxi))(11S, 11aS, 1l'S, 11a'S)-bis(11-hidroxi-1-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetmhidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) ( 16 )
Se añadió solución de Stahl Tempo 0,2 M (2,10 ml, 0,420 mmol, 0,44 equiv.) seguido de triflato de tetraquisacetonitrilo de cobre (I) (160 mg, 0,425 mmol, 0,44 equiv.) a una solución de 15 (1,32 g, 0,957 mmol) en DMF (4,00 ml) en un matraz de 500 ml. La mezcla de reacción se agitó rápidamente y se calentó a 40 °C durante 5 h, luego 35 °C durante 18 h bajo un globo de aire, momento en el que se observó la finalización por LCMS. Los disolventes se eliminaron por evaporación. Las trazas de DMF se eliminaron mediante una segunda evaporación con butanona, seguido de alto vacío. El residuo se cargó seco sobre una pequeña muestra (10 g) con acetona, seguido de cromatografía con una columna ultra de 50 g en un sistema biotage isolera. Gradiente con 10 % de MeOH en DCM/DCM, de 20 % hasta 63 % en 8 CV. Elución y mantenimiento de alrededor del 60 %. Las fracciones delanteras impuras se repurificaron usando el mismo sistema en una columna de 25 g. Se combinaron todas las fracciones puras. El residuo se disolvió en acetona. La adición de heptano causó la precipitación de un producto de color blanco. Los volátiles se evaporaron para dar el producto 16 en forma de un polvo de color blanco después de un alto vacío. (892 mg, 0,648 mmol, rendimiento del 67,8 %) Datos analíticos: Lc /MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,42 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1376,6 ([M + H]+-, 100);
(d) bis(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8'-(propano-1,3-diil-bis(oxi))(11S, 11aS, 11S, 11a'S)-bis(11-hidmxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetmhidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) ( 17 )
Se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (10,0 mg, 0,00865 mmol, 0,034 equiv.) a una mezcla de 16 (350 mg, 0,254 mmol) y pirrolidina (65,0 pl, 0,780 mmol, 3,07 equiv.) en diclorometano (7,50 ml) y metanol (0,5 ml). La mezcla de reacción se agitó en atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 1 h 30 minutos y se observó su finalización por LCMS. Se añadió cloruro de amonio en agua (30 ml, 34,3 mmol, 6 % en masa) y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se decantó después en un cartucho de separación de fases biotage. La capa de DCM se evaporó a sequedad al vacío. El residuo se disolvió en cloroformo (20 ml) y el disolvente se eliminó por evaporación al vacío a 35 °C. Este ciclo se repitió una segunda vez, seguido de secado a alto vacío (3 mbar) para dar el producto en bruto 17 (307 mg, 0,254 mmol, 100 %) en forma de un sólido de color blanco que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, 2 picos, TR 0,22 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 604,9 ([M 2H]2+-, 100); 1208,2 ([M H]+-, 10);
(e) bis(4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)bencil) 8,8'-(propano-1,3-diil-bis(oxi))(11S, 11aS, 11'S, 11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) ( 18 )
Se añadieron cloroformo (10,00 ml) y metanol (0,4 ml) a 17 en bruto (307 mg, 0,254 mmol) seguido de ácido malamidopeg8 (339 mg, 0,561 mmol, 2,2 equiv.) y EDCI (107 mg, 0,558 mmol, 2,19 equiv.). Se dejó transcurrir la reacción a temperatura ambiente durante 45 min cuando se observó su finalización por LCMS. Se añadió cloruro de amonio en agua (30 ml, 6 % en masa) y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se decantó en un cartucho de separación de fases biotage. La capa de DCM se evaporó a sequedad al vacío. Los volátiles se eliminaron por rotoevaporación y el residuo en bruto se purificó por cromatografía (50 g Ultra, Biotage, gradiente de 30/70 a 100/0 de 16 % de MeOH en DCM/DCM en 10 CV; Elución a más del 10 % de MeOH). Todas las fracciones se analizaron por TLC (MeOH al 10 % en DCM). Las fracciones puras se combinaron. El disolvente se eliminó por evaporación para dar 18 (200 mg). El análisis por LCMS mostró trazas de ácido mal-peg8, y el material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa, se secó por congelación, se dividió en alícuotas en diclorometano, y se secó a alto vacío para dar 18 en forma de un sólido de color blanco. La pureza fue del 99,45 %. (B, 110 mg, 0,0467 mmol, rendimiento del 18,3 %). Datos analíticos: LC/MS, método de 15 min, TR 5,90 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1179,5 ([M 2H]2+-, 100); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,92 (s, 2H), 8,16 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 7,99 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 7,86 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,55 (s, 4H), 7,18 (s, 4H), 7,07 (s, 2H), 7,00 (s, 4H), 6,79 (s, 2H), 6,50 (s, 2H), 5,48 (s, 2H), 5,23 - 4,77 (m, 4H), 4,39 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 4,22 (dd, J = 8,7; 6,6 Hz, 2H), 4,10 (s, 4H), 3,77 (s, 6H), 3,64 - 3,55 (m, 8H), 3,55 - 3,42 (m, 56H), 3,37 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 3,28 (t, J = 8,3 Hz, 2H), 3,15 (c, J = 5,8 Hz, 4H), 2,49 - 2,37 (m, 4H), 2,37 - 2,30 (m, 4H), 2,17 (s, 2H), 2.09 - 1,73 (m, 10H), 1,30 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 0,85 (dd, J = 15,3, 6,7 Hz, 12H).
Figure imgf000048_0001
(a) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bendl) ((propano-1,3-diilbis(oxi))bis(6-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidin-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (20)
Se añadió trifosgeno (816 mg, 2,75 mmol, 0,72 equiv.) en una porción a una mezcla de 19 (3,15 g, 3,82 mmol) y trietilamina (2,34 ml, 16,8 mmol, 4,4 equiv.) en diclorometano (75 ml) a 0 °C. El baño de hielo se eliminó, y después de 15 min, se añadió el alcohol 5 (3,17 g, 8,40 mmol, 2,2 equiv.) en una porción como un polvo fino, seguido de trietilamina (1,17 ml, 8,39 mmol, 2,2 equiv.) y dilaurato de dibutilestaño (229 pl, 0,383 mmol, 0,1 equiv.). La mezcla de reacción se dejó en agitación a 37 °C durante 1 h, seguido de agitación a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con agua (200 ml), cloruro de amonio saturado (100 ml), y salmuera (50 ml), seguido de secado sobre sulfato de magnesio. Los volátiles se eliminaron por evaporación a presión reducida. El producto en bruto se cargó seco sobre gel de sílice y se eluyó en una Ultra de 340 g, con un gradiente de acetato de etilo - acetona, de 20 % hasta 100 % en 7 CV. La elución rápida en 2 CV a alrededor de 30 % de acetona dio fracciones puras que se secaron al vacío para dar 20 (4,00 g, 2,45 mmol, 100 % en masa, rendimiento del 64,2 %). Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 2,34 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1661,1 ([M + H]+-, 100);
(b) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) ((propano-1,3-diilbis(oxi))bis(6-((S)-2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (21)
Se disolvieron bis-TBS éter 20 (4,00 g, 2,45 mmol) y ácido paratoluenosulfónico hidrato (300 mg, 1,58 mmol) en una mezcla de 2-metiltetrahidrofurano (25,0 ml, 249 mmol, 100 % en masa), ácido acético (4,00 ml, 69,8 mmol, 100 % en masa) y agua (4,00 ml, 222 mmol, 100 % en masa). La mezcla se calentó a 40 °C. Después de 2 h, se observó la finalización por LCMS. La mezcla de reacción se repartió entre acetato de etilo (150 ml) y agua (200 ml), luego se lavó con NaHCO3 saturado (150 ml), y salmuera (100 ml). Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía (100 g ultra, se cargó seco sobre una pequeña muestra de 10 g, acetato de etilo/acetona, gradiente de 85/15 a 0/100, elución a alrededor del 80 % de acetona. Las fracciones puras se combinaron y se concentraron al vacío para dar el producto puro 21 (960 mg, 0,684 mmol, rendimiento del 27,9 %) en forma de un sólido de color blanco. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,54 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1402,3 ([M + H]+-, 100);
(c) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benál) 8,8’-(propano-1,3-diilbis(oxi))(11S, 11aS, 11S, 11a'S)-bis(11-hidmxi-7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,11,11a-tetmhidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (22)
Se añadió solución de Stahl Tempo 0,2 M (1,34 ml, 0,268 mmol, 0,4 equiv.) seguido de triflato de tetrakisacetonitrilo de cobre (I) (190 mg, 0,504 mmol, 0,75 equiv.) a una solución de alcohol 21 (940 mg, 0,670 mmol) en DMF (3,00 ml) y DCM (13,0 ml) en un matraz de 500 ml. La mezcla de reacción se agitó rápidamente y se calentó a 37 °C durante 5 h (casi completa), seguido de -20 °C durante 96 h, momento en el que la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (60 ml) y agua (60 ml) y se agitó durante 5 min. La mezcla de reacción se decantó en un separador de fases y la fase de DCM se secó a presión reducida. Se añadió MEK (60 ml) y la DMF residual se eliminó por formación de un azeótropo con MEK a presión reducida (2 veces) para dar el producto en bruto en forma de un sólido. Este se disolvió de nuevo en DCM/isopropanol 80/20 (de 5 a 10 ml) y se cargó una pequeña muestra Biotage (10 g), se secó y se cargó en una columna Ultra de 100 g. Gradiente de 88/12 DCM/20 % de MeOH en DCM hasta 70/30 en 10 CV. Las fracciones puras se combinaron para dar 22 puro (602 mg, 0,430 mmol, rendimiento del 64,2 %) en forma de un producto de color blanco. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,51 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1401,5 ([M + H]+-, 100);
(d) bis(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8'-(propano-1,3-diil-bis(oxi))(11S, 11aS, 11S, 11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (23)
Se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (8,2 mg, 0,0071 mmol, 100 % en masa) a una mezcla de 22 (250 mg, 0,179 mmol) y pirrolidina (37,0 pl, 0,444 mmol, 2,49 equiv.) en DCM (7,50 ml) y metanol (0,5 ml). La mezcla de reacción se agitó en atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 1 h 30 minutos y se encontró completa por LCMS.
Se añadió cloruro de amonio en agua (30 ml, 6 % en masa) y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se decantó después en un cartucho de separación de fases biotage. La capa de DCM se evaporó a sequedad al vacío. El residuo se disolvió en cloroformo (20 ml) y el disolvente se eliminó por rotoevaporación al vacío a 35 °C. Este ciclo se repitió una segunda vez, seguido de secado a alto vacío (3 mbar, en un rotoevaporador) para dar el producto 23 en bruto (220 mg, 0,179 mmol, 100 %) en forma de un sólido de color blanco que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. Datos analíticos: LC/MS, método de 3 min, 2 picos, TR 1,15 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 616,9 ([M+ 2H]2+-, 100); 1232,1 ([M H]+-, 10).
(e) bis(4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)bencil) 8,8'-(propano-1,3-diil-bis(oxi))(11S, 11aS, 11'S, 11a'S)-bis(11-hidroxi-7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (24)
Se añadieron cloroformo (4,1 ml) y metanol (0,2 ml) a 23, seguido de ácido mal-amido-peg8 (238 mg, 0,394 mmol, 2,2 equiv.) y EDCI (85,0 mg, 0,443 mmol, 2,48 equiv.). Se dejó transcurrir la reacción a temperatura ambiente durante 45 min cuando se observó su finalización por LCMS. La mezcla de reacción se concentró (2 ml), se cargó sobre una pequeña muestra de 3 g de sílice biotage y se secó al vacío. La pequeña muestra se cargó sobre una columna Ultra Biotage de 25 g, y se eluyó (gradiente 10/90 a 58/42 de MeOH al 20 % en DCM/DCM en 12 CV; Elución a alrededor del 55 % de MeOH al 20 %). Todas las fracciones se analizaron por TLC (MeOH al 10 % en DCM). Las fracciones puras se combinaron. El disolvente se eliminó por evaporación para dar 24 (250 mg, 0,105 mmol, rendimiento del 58,8 %). Datos analíticos: LC/MS, método de 15 min, TR 6,20 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1191,5 ([M 2H]2+ , 100); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,92 (s, 2H), 8,16 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 7,99 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 7,86 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,68 - 7,42 (m, 4H), 7,39 - 7,11 (m, 4H), 7,07 (s, 2H), 7,00 (s, 4H), 6,81 (s, 2H), 6,60 (s, 2H), 5,46 -5,30 (m, 2H), 5,21 - 4,79 (m, 8H), 4,39 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 4,22 (dd, J = 8,7; 6,7 Hz, 2H), 4,15 - 3,88 (m, 8H), 3,77 (s, 6H), 3,65 - 3,55 (m, 8H), 3,54 - 3,40 (m, 58H), 3,37 (t, J = 5,9 Hz, 4H), 3,15 (c, J = 5,8 Hz, 4H), 2,95 - 2,79 (m, 2H), 2,57 - 2,52 (m, 2H), 2,49 - 2,37 (m, 4H), 2,37 - 2,29 (m, 4H), 2,22 - 2,10 (m, 2H), 2,03 - 1,88 (m, 2H), 1,30 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 0,85 (dd, J = 15,3, 6,7 Hz, 12H).
empo
(i) Síntesis de (S,E)-(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-etilidenpirrolidin-1-il)(5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)fenil)metanona ( 29 )
Figure imgf000050_0001
El compuesto 25 se describe en Tiberghien et al., ACS Med. Chem. Lett., 2016, 7 (11), pág. 983-987. El compuesto 26 se describe en Smits y Zemribo, Org. Lett., 2013, 15 (17), pág. 4406-4409.
(a) (S,E)-4-etiliden-1-(5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)benzoil)pirrolidin-2-carboxilato de metilo (27)
Se disolvieron 25 (325 g, 1,2 equiv.) y 26 (1,0 equiv.) en DCM (3,25 l) y se enfriaron a -40 °C. Se añadió T3P (2 equiv.) en porciones a -40 °C, seguido de DIEA (6,0 equiv.). La mezcla se agitó durante 1 h a -40 °C. Se observó la finalización de la reacción por LCMS. Se añadió ácido acético acuoso (10 %, 3,25 l) a 0 °C. La fase orgánica se separó y se lavó una segunda vez con ácido acético acuoso (10 %, 3,25 l), seguido de salmuera (3,25 l). Los volátiles se eliminaron al vacío para dar el producto 27 en bruto en forma de un aceite de color pardo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc, gradiente de 100/1 a 10/1, recolección de 20/1. (591 g, pureza del 87,6 % por LC, 70 % por RMN, rendimiento = 60 %). RT: 6,374 min.
Método analítico usado para el compuesto 27
Columna: Agilent Poroshell 120 EC-C184,6*100 mm, 2,7 ^m
Fase móvil A: TFA al 0,05 % en Agua
Fase móvil B: TFA al 0,05 % en ACN
Diluyente: ACN
Caudal: 1,0 ml/min
Volumen de inyección: 1 ^l
Temperatura de la columna: 40 °C
Detector: 220 nm
Tiempo de ejecución: 8,1 minutos
Tiempo posterior: 2 minutos
T l ^ r i n
Figure imgf000050_0002
(b) (S,E)-(4-etiliden-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)(5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)fenil)metanona (28)
Se disolvió 27 (591 g, 1 equiv.) en DCM y se enfrió a 0 °C. Se añadió borohidruro de litio (2,0 equiv.) en porciones. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 6 h. Se observó la finalización de la reacción por LCMS. Se añadió ácido acético acuoso (10 %, 5,9 l) a 0 °C. La fase orgánica se separó y se lavó una segunda vez con ácido acético acuoso (10 %, 5,9 l), seguido de salmuera (5,9 l). Los volátiles se eliminaron al vacío para dar un residuo que se purificó por cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc, gradiente de 50/1 a 1/1. Recolección de 5/1) para dar 28 en forma de un sólido de color blanquecino (250 g, rendimiento del 64 %). TR: 7,922 min.
(c) (S,E)-(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-etilidenpirrolidin-1-il)(5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)fenil)metanona ( 29 )
Se disolvieron 28 (250 g, 1 equiv.) e imidazol (2 equiv.) en DCM (1,5 L, 6 V) a temperatura ambiente. Se añadió TBSCI (1,5 equiv.) en porciones mientras se mantenía la temperatura por debajo de 30 °C. La mezcla de reacción se dejó en agitación a 25 °C durante 1 hora, cuando se observó la desaparición del material de partida por HPLC. La mezcla se filtró a través de lana de algodón. La torta de filtro se lavó con DCM (500 ml). El filtrado se lavó con ácido acético acuoso (10 %, 2,5 l) a 10 °C, seguido de salmuera (2,5 l). La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro y se concentró al vacío para dar el producto 29 en forma de un aceite de color amarillo que se encontró que era suficientemente puro como para usarlo en la siguiente etapa (285 g, rendimiento del 92,2%). TR: 11,002 min. MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 663,4 ([M H]+-, 100);
Método analítico usado para los compuestos 28 y 29
Columna: Agilent Poroshell 120 EC-C184,6*100 mm, 2,7 pm
Fase móvil A: TFA al 0,05 % en Agua
Fase móvil B: TFA al 0,05 % en ACN
Diluyente: ACN
Caudal: 1,0 ml/min
Volumen de inyección: 2 pl
Temperatura de la columna: 40 °C
Detector: 220 nm
Tiempo de ejecución: 12,1 minutos
Tiempo posterior: 2 minutos
T l r i n
Figure imgf000051_0001
(ii) Síntesis de bis(4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diilbis(oxi))(2E,2'E,11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(2-etiliden-11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (37)
Figure imgf000052_0001
(a) (S,E)-(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-etilidenpirrolidin-1-il)(4-hidroxi-5-metoxi-2-nitrofenil)metanona (30)
Se disolvió fenol protegido con TIPS 29 (10,0 g, 16,9 mmol) en una mezcla de acetato de etilo (20,0 ml) y DMF (20,0 ml) a 40 °C. Se añadió una solución de acetato de litio (0,668 g, 10,1 mmol, 0,6 eq ) en agua (3,0 ml). Se dejó que la reacción transcurriera a 40 °C durante 4 h momento en el que se observó su finalización por LCMS. La mezcla de reacción se repartió entre 2-MeTHF (200 ml) y ácido cítrico al 2 % en agua (200 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (70 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. Los volátiles se eliminaron al vacío. El residuo sólido se precipitó mediante la adición de éter dietílico (50 ml) y hexano (200 ml). El producto se recogió por filtración, se lavó con un poco de éter dietílico y se secó durante una noche al vacío para dar 30 en forma de un sólido de color amarillo pálido. (5,8 g, 13 mmol, rendimiento del 79 %). Datos analíticos: Lc /MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,82 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 437,8 ([M H]+-, 100);
(b) ((pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitro-4,1-fenilen))bis(((S,E)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-etilidenpirrolidin-1-il)metanona) ( 31 )
Se añadió 1,5-dibromopentano (0,986 g, 4,29 mmol, 0,5 equiv.) seguido de carbonato potásico (1,30 g, 9,41 mmol, 1,1 equiv.) a una solución de 30 (3,74 g, 8,57 mmol) y yoduro de tetrabutilamonio (0,63 g, 1,7 mmol, 0,2 equiv.) en acetona (20,0 ml) en un matraz de fondo redondo de 100 ml. La mezcla de reacción se agitó rápidamente y se calentó a 60 °C durante 2 h, y luego se dejó en agitación a 45 °C durante una noche. La reacción se consideró completa por LCMS. La mezcla se repartió en acetato de etilo (150 ml) y agua (200 ml, luego se lavó con salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato de magnesio. Los volátiles se eliminaron al vacío para dar el producto 31 (4,04 g, 4,29 mmol, rendimiento del 100 %), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 2,39 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 942,3 ([M + H]+-, 100);
(c) ((pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(2-amino-5-metoxi-4,1-fenilen))bis(((S,E)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-etilidenpirrolidin-1-il)metanona) (32)
Se añadió zinc (20,6 g, 315 mmol, 74 equiv.) a una mezcla de etanol (64,0 ml), agua (4,00 ml), y ácido fórmico (4,00 ml, 106 mmol, 25 equiv.) a 10 °C (baño de hielo), y se agitó vigorosamente. A esta mezcla, se le añadió una solución de 31 (4,00 g, 4,25 mmol) en etanol (16,0 ml) gota a gota con una pipeta, mientras se mantenía la temperatura por debajo de 35 °C. La masa de zinc se agitó ocasionalmente de forma manual. Se dejó que la reacción transcurriera adicionalmente durante 30 min a temperatura ambiente, cuando se alcanzó la finalización. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (200 ml). Los sólidos se eliminaron por filtración sobre celite. El sinterizado se enjuagó con acetato de etilo (200 ml). El filtrado se lavó con agua (300 ml), bicarbonato sódico saturado (150 ml) y salmuera (100 ml), y se secó sobre sulfato de magnesio. Los volátiles se eliminaron por evaporación y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida automatizada (Ultra biotage, de 100 g, gradiente de acetato de etilo/hexano de 30 % hasta 80 % en 8 CV, elución desde 58 % a partir de 10 CV, para dar 32 (1,94 g, 2,20 mmol, rendimiento del 51,8 %) en forma de una espuma de color amarillo pálido. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 2,29 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 882,4 ([M H]+-, 100);
(d) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) ((pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(6-((S,E)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-etilidenpirrolidin-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (33)
S añadió trifosgeno (0,461 g, 1,55 mmol, 0,72 equiv.) en una porción a una mezcla de 32 (1,90 g, 2,16 mmol) y trietilamina (1,32 g, 13,0 mmol, 6 equiv.) en DCM (45 ml) a 0 °C. El baño de hielo se eliminó y, después de 15 min, se añadió 5 (1,79 g, 4,74 mmol, 2,2 equiv.) en una porción como un polvo fino, seguido de trietilamina (0,661 g, 6,53 mmol, 3 equiv.) y dilaurato de dibutilestaño (0,129 ml, 0,215 mmol, 0,1 equiv.). La mezcla de reacción se dejó en agitación a 37 °C durante 4 h, seguido de agitación a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con agua (200 ml), cloruro de amonio saturado (100 ml), y salmuera (50 ml), seguido de secado sobre sulfato de magnesio. Los volátiles se eliminaron por evaporación a presión reducida para dar 3 (3,00 g, 1,78 mmol, rendimiento del 82 %). El producto en bruto se hizo reaccionar directamente en la siguiente etapa. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 2,31 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1689,6 ([M + H]+-, 100);
(e) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) ((pentano-1,5-diilbis(oxi))bis(6-((S,E)-4-etiliden-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-carbonil)-4-metoxi-3,1-fenilen))dicarbamato (34)
Se disolvió bis-TBS éter 33 (3,00 g, 1,78 mmol) en una mezcla de 2-metiltetrahidrofurano (9 ml), ácido acético (9 ml) y agua (1,5 ml). La mezcla se calentó a 40 °C durante 2 h. La monitorización por LCMS indicó una velocidad de reacción insatisfactoria (40%) a la finalización. Se añadió ácido paratoluenosulfónico hidrato (203 mg, 1,07 mmol, 0,6 equiv.), lo que aceleró la reacción. Se observó la finalización en 30 min.
La mezcla de reacción se repartió entre acetato de etilo (150 ml) y agua (200 ml), luego se lavó con NaHCO3 saturado (150 ml), y salmuera (100 ml). Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía (50 g ultra, se cargó seco sobre gel de sílice suelto, acetato de etilo/acetona, gradiente de 85/15 a 0/100, elución a alrededor del 55% de acetona. Las fracciones puras se combinaron y se concentraron al vacío para dar el producto puro 34 (2,20 g, 1,51 mmol, rendimiento del 84,8 %) en forma de un sólido de color blanco. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,67 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa ) 1461,6 ([M + H]+-, 100);
(f) bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diilbis(oxi))(2E,2E, l1s ,l1aS , 11'S, 11a'S)-bis(2-etiliden-11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (35)
Se añadió solución de Stahl Tempo 0,2 M (3,50 ml, 0,700 mmol, 0,47 equiv.) seguido de triflato de tetraquisacetonitrilo de cobre (I) (290 mg, 0,770 mmol, 0,52 equiv.) a una solución de 34 (2,17 g, 1,49 mmol) en DMF (3,00 ml) en un matraz de 500 ml. La mezcla de reacción se agitó rápidamente y se calentó a 40 °C durante 5 h (finalización), seguido de 30 °C durante 18 h bajo un globo de aire, momento en el que la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (60 ml) y agua (60 ml) y se agitó durante 5 min. La mezcla de reacción se decantó en un separador de fases y la fase de DCM se secó a presión reducida. Se añadió MEK (60 ml) y la DMF residual se eliminó formando un azeótropo a presión reducida (2 veces) para dar el producto en bruto en forma de un sólido. Este se disolvió de nuevo en DCM (de 5 a 10 ml) y se cargó en una columna Ultra de 100 g. Gradiente de 75/25 DCM/MeOH al 10 % en DCM hasta 40/60 (elución a alrededor de 50/50). Las fracciones puras se combinaron para dar 35 (1,35 g, 0,927 mmol, rendimiento del 62,4 %) en forma de un producto de color blanco. Datos analíticos: LC/MS, método lipófilo de 3 min, TR 1,63 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1457,3 ([M H]+-, 100); método de 15 min, TR 7,52 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1456,6 ([M H]+-, 100);
(g) bis(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diil-bis(oxi))(2E,2'E, 11S,11aS, 11'S, 11a'S)-bis(2-etiliden-11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-bemzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (36)
Se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (10,0 mg, 0,0086 mmol, 0,01 equiv.) a una mezcla de 35 (1,33 g, 0,914 mmol) y pirrolidina (190 pl, 2,28 mmol, 2,5 equiv.) en DCM (7,50 ml) y metanol (0,5 ml). La mezcla de reacción se agitó en atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 1 h 30 minutos y se encontró completa por LCMS. Se añadió cloruro de amonio en agua (30 ml, 6 % en masa) y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se decantó después en un cartucho de separación de fases biotage. La capa de DCM se evaporó a sequedad al vacío. El residuo se disolvió en cloroformo (20 ml) y el disolvente se eliminó por evaporación al vacío a 35 °C. Este ciclo se repitió una segunda vez, seguido de secado a alto vacío (3 mbar) para dar 36 en bruto (1,17 g, 0,914 mmol, rendimiento del 100 % ) en forma de un sólido de color blanco. Datos analíticos: LC/MS, método de 3 min, TR 1,23 min, 2 picos; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 645,0 ([M 2H]2+-, 100); 1288,8 ([M H]+-, 10).
(h) bis(4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo-10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)bencil) 8,8'-(pentano-1,5-diil-bis(oxi))(2E,2'E, 11S,11aS, 11'S, 11a'S)-bis(2-etiliden-11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato) (37)
Se añadieron DCM (10,00 ml) y metanol (0,4 ml) a 36 (393 mg, 0,305 mmol), seguido de ácido mal-amido-peg8 (380 mg, 0,628 mmol, 2,06 equiv.) y EDCI (128 mg, 0,668 mmol, 2,2 equiv.). Se dejó que la reacción transcurriera a temperatura ambiente durante 4 h, cuando se observó su finalización por LCMS. Se añadió cloruro de amonio en agua (30 ml, 6 % en masa) y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se decantó en un cartucho de separación de fases biotage. La capa de DCM se evaporó hasta sequedad al vacío y el residuo en bruto se purificó por cromatografía (Ultra de 25 g, gradiente de 15/85 a 100/0 de MeoH al 20 % en d Cm /DCM en 12 CV; mantenido a una elución de alrededor del 48%). Las fracciones se analizaron por TLC (MeOH al 10% en DCM). Las fracciones puras se combinaron. El disolvente se eliminó por evaporación. El residuo se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa (gradiente de 15 a 75 % agua/acetonitrilo ácido fórmico al 0,01 %) seguido de secado por congelación y formación de alícuotas a partir de DCM para dar 37 (516 mg, 0,212 mmol, rendimiento del 69,4 % ) en forma de una espuma de color blanco. La pureza fue del 97,65%. Datos analíticos: LC/MS, método de 15 min, TR 6,61 min; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1219,7 ([M+ 2H]2+-, 100); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,92 (s, 2H), 8,17 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 8,01 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 7,87 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,72 - 7,44 (m, 4H), 7,39 - 7,10 (m, 4H), 7,05 (s, 2H), 7,00 (s, 4H), 6,76 (s, 2H), 6,66 - 6,46 (m, 2H), 5,56 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 5,34 (dd, J = 9,7; 5,9 Hz, 2H), 5,21 - 4,70 (m, 4H), 4,39 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 4,22 (dd, J = 8,7; 6,7 Hz, 2H), 4,15 - 4,01 (m, 2H), 3,94 (d, J = 15,3 Hz, 4H), 3,86 - 3,72 (m, 8H), 3,60 (t, J = 7,3 Hz, 8H), 3,55 - 3,42 (m, 58H), 3,37 (t, J = 5,9 Hz, 4H), 3,15 (c, J = 5,8 Hz, 4H), 2,76 - 2,56 (m, 4H), 2,46 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,40 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,36 - 2,29 (m, 4H), 1,96 (c, J = 6,7 Hz, 2H), 1,78 (s, 4H), 1,66 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 1,57 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 1,30 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 0,85 (dd, J = 15,2, 6,7 Hz, 12H).
Producción de anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228
Aspectos generales
Líneas celulares SKBR-3 (HER2+, 1,5x 106 receptores/célula), MDA-MB-453 (HER2+, 7,7x 104 receptores/célula), y MCF-7 (HER2‘) se obtuvieron de la ATCC y se mantuvieron en matraces de cultivo celular T175 (Corning) usando el medio recomendado por el fabricante (Sk Br-3: McCoys 5A FBS al 10 %, MDA-MB-453: DMEM FBS al 10 %, y MCF-7: DMEM FBS al 10%). Las células 293F (Invitrogen) usadas para la trasfección se mantuvieron en medio 293F Freestyle (Invitrogen). Las células SKBR-3, MDA-MB-453 y MCF-7 se cultivaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2. Las células 293F se cultivaron en matraces de agitación (2 l, Corning) a 37 °C con 8 % de CO2 y rotación a 120 rpm. Todos los reactivos se adquirieron de Sigma Aldrich, VWR, o JT Baker a menos que se indique otra cosa, y se usaron sin purificación adicional.
Diseño y construcción de anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228
El anticuerpo Herceptin de tipo silvestre se usó como molde para genomanipular el Flexmab de Herceptin. La cadena ligera de Flexmab de Herceptin consiste en dos mutaciones, F118C y C214V, mientras que la cadena pesada contiene tres mutaciones, L124C, C216V y C225V (véanse las figuras 3 y 5 - en la figura 5, C representa cisteínas genomanipuladas, V representa mutaciones cisteína a valina y C representa la cisteína usada para conjugación/formación de nuevos puentes). La mutación F118C en la cadena ligera forma un enlace disulfuro con la mutación L124C en la cadena pesada. Este disulfuro genomanipulado no está expuesto a disolvente, sino que sirve para preservar la unión covalente entre las cadenas ligera y pesada. La cisteína de la bisagra C222 se dejó sin modificar y sirvió como la localización para la conjugación específica de sitio con el engarce de fármaco basado en pBD. Se optimizaron los codones de las secuencias de la cadena ligera y la cadena pesada para el Flexmab de Herceptin para la expresión en mamífero y se adquirieron en GeneArt (Life Technologies). La construcción del Flexmab de Herceptin optimizada se subclonó con técnicas convencionales de biología molecular usando los sitios BssHII/Nhel (cadena ligera) y los sitios Sall/Notl (cadena pesada) en un vector de expresión en mamífero patentado por Medlmmune que contiene un péptido señal de la cadena ligera de IgG para la secreción y promotores de citomegalovirus para la expresión recombinante. El plásmido de expresión en mamífero finalizado, pOE-Flexmab de Herceptin se confirmó por secuenciación del ADN. El anticuerpo Flexmab de NIP228 de control negativo se generó como se ha descrito para el Flexmab de Herceptin aunque utilizando el anticuerpo NIP228 de tipo silvestre (patentado por Medlmmune) como molde.
Expresión y purificación de los anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228
La expresión y purificación de los anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228 se realizó de acuerdo con los métodos publicados previamente (Dimasi, N., et al., Journal of Molecular Biology, 2009, 393, 672-692; DOI: 10.1016/j.jmb.2009.08.032). Tras la expresión transitoria en 293F y la purificación por proteína A, los anticuerpos se formularon en el tampón de conjugación (PBS 1X, EDTA 0,1 mM, pH 7,2) usando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer a 4 °C (MWCO 10 kDa, Thermo) y se concentraron a 8,0 mg/ml (Flexmab de Herceptin) y 5,52 mg/ml (Flexmab de NIP228) utilizando concentradores Vivaspin (MWCO (forma siglada de molecular weight cut-off, limite de peso molecular) 10 kDa, GE Healthcare). Las concentraciones finales se determinaron usando un espectrofotómetro Nanodrop (A280, Thermo). Los rendimientos de la expresión transitoria después de 6 días fueron de 500 mg/l y 150 mg/l para Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228, respectivamente.
Ejemplo 7 - Construcción de los ADC de Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228
Flexmab de Herceptin (15 mg, 100 nmoles) en tampón de conjugación (PBS 1X, EDTA 1 mM, pH 7,2, 3 ml) se redujo usando TCEP (3 equiv., 300 nmoles, Thermo) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la reducción, se añadió DMSO (10 % v/v, 300 |jl) al anticuerpo reducido, seguido de la adición del compuesto 10 (3 equiv., 300 nmoles). Se dejó transcurrir la reacción de conjugación a temperatura ambiente durante 3 h. El exceso del compuesto 10 se inactivó usando N-acetil cisteína (5 equiv. sobre el compuesto 10, 1,5 jmoles, Sigma Aldrich) y el ADC se dializó contra tres intercambios de tampón de conjugación a 4 °C utilizando un casete de diálisis Slide-A-Lyzer (MWCO 10 kDa, Thermo). El ADC se diluyó 1:5 con H2O desionizada y se cargó en una columna de hidroxiapatita cerámica de tipo II (Bio-Rad) a 5 ml/min utilizando una FPLC de AKTA Pure (GE Healthcare) y la columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón CHT A (NaPO310 mM, pH 7). La elución del ADC se realizó utilizando un gradiente lineal de tampón CHT B (NaCl 0-2 M en NaPO310 mM, pH 7) durante 20 min. El ADC eluido se dializó durante la noche a 4 °C en el tampón de conjugación utilizando un casete de diálisis Slide-A-Lyzer (MWCO 10 kDa) y se diluyó 1:5 con el tampón HIC A (Tris-HCl 25 mM, (N H ^S O 41,5 M, pH 8). El ADC se cargó en una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) semipreparativa (HiTrap Butil-S FF, GE Healthcare) a 1 ml/min usando una FPLC de AKTA Pure y se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón HIC A. El ADC se eluyó utilizando un gradiente lineal de tampón HIC B (Tris-HCl 25 mM, alcohol isopropílico al 5 %) durante 45 min a 1 ml/min. El Flexmab de Herceptin-10 purificado se dializó en el tampón de conjugación durante una noche a 4 °C, se concentró utilizando un concentrador Vivaspin (MWCO 10 kDa) hasta 2 mg/ml, y se esterilizó por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 jm (Pall Corporation). El proceso se muestra esquemáticamente en la figura 4. Las V resaltadas representan mutaciones de valina.
La conjugación específica de sitio del compuesto 10 con el Flexmab de NIP228 y la posterior purificación se llevaron a cabo como se describe para el Flexmab de Herceptin-10.
Ejemplo 8 - Caracterización analítica de los ADC
SDS-PAGE
Se utilizó SDS-PAGE para confirmar los pesos moleculares de las construcciones Flexmab de Herceptin, Flexmab de Herceptin-10, Flexmab de NIP228 y Flexmab de NIP228-10. Las muestras (2 jg , parental o conjugado) se mezclaron 1:4 con tampón de muestra LDS Bolt (Invitrogen), 1:10 con tampón reductor NuPAGE (Invitrogen), y se calentaron a 70 °C durante 10 minutos seguido de carga en gel Bis-tris al 10% Bolt (Invitrogen). Los geles se sometieron a electroforesis a 150 V y se tiñeron con el reactivo de tinción Simply Blue (Invitrogen) y se decoloraron con H2O desionizada. Se obtuvieron imágenes de los geles con el sistema Gel Doc EZ Imaging (Bio-RAD).
Se utilizó SDS-PAGE reducido para confirmar el peso molecular de los anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228 y los ADC purificados. Los resultados demuestran la separación de las cadenas ligeras (LC) y pesadas (HC) del Flexmab de Herceptin con pesos moleculares de ~25 kDa y 50 kDa, respectivamente. La conjugación de la carga activa de compuesto 10 de maleimida doble con el Flexmab de Herceptin dio como resultado una formación de puente muy eficaz de las cadenas pesadas con la presencia de una banda de 100 kDa. Se observaron resultados similares con el Flexmab de NIP228, con una clara identificación de las cadenas ligera y pesada en condiciones reductoras. Se observó una formación de puentes disulfuro altamente eficiente de las cadenas pesadas del Flexmab de NIP228 con el compuesto 10. No se observó ninguna agregación ni en el anticuerpo ni en el ADC.
Cromatografía de interacción hidrófoba
Se utilizó la cromatografía de interacción hidrófoba analítica para evaluar las eficacias de conjugación del compuesto 10 en los anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228 y para evaluar las relaciones fármaco-anticuerpo (DAR) para cada ADC. Los ADC (500 jg en 50 j l ) se cargaron individualmente en una columna Proteomix HIC Butil-NP5 (D.I. 4,6 mm x 3,5 cm x 5 jm , Sepax) utilizando el tampón HIC A (Tris-HCl 25 mM, (NH4)2SO41,5 M, pH 8) y los ADC se eluyeron usando un gradiente lineal de tampón HIC B (Tris-HCl 25 mM, alcohol isopropílico al 5 %, pH 7, 5-100%) durante 13min a 0,8 ml/min. La absorbancia se midió a 280nm y 330nm y los picos eluidos se integraron manualmente para determinar la eficacia de conjugación de cada ADC. Las eficacias de conjugación y las DAR se calcularon basándose en la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente.
Ecuación 1: Eficacia de Conjugación
___________Á r e a Conjuggdo___________
_Á r e a NoConjugado + Á r e a Conjuggdo . x 100
• Á r e a DAR1+ 2 ( Á r e a DAR2) n ( Á r e a D A R n ) 1
Ecuación 2: DAR = . (ÁreaDAR0+ Á r ea DAR1+ Á r ea DAR2+ Á r ea DAR/n)i
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Cromatografía de exclusión por tamaños
Se llevó a cabo una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) con los anticuerpos parentales y los ADC para analizar la pureza y la agregación utilizando una HPLC Agilent de la serie 1200. Las muestras (100 |jg en 100 j l de tampón de conjugación) se inyectaron en una columna TSK Gel (G3000SW, D.I. 8 mm x 30 cm x 5 jm , Tosoh Bioscience) usando NaPO40,1 M, NaSO40,1 M, isopropanol al 10 %, pH 6,8 como fase móvil a un caudal de 1 ml/min. La absorbancia de los picos eluidos se midió a 280nm, seguida de una integración manual para determinar la pureza y el porcentaje de agregación de cada muestra.
Después de la purificación por proteína A, cada anticuerpo produjo un alto contenido monomérico superior al 98 %, y estas características se mantuvieron tras la conjugación de la carga activa de compuesto 10 para generar los ADC con DAR=1. Flexmab de Herceptin y Flexmab de Herceptin-10 eluyeron con tiempos de retención (Tr) de 8,65 min y 8,66 min, y 9,01 min, respectivamente. Flexmab de NIP228 y Flexmab de NIP228-10 eluyeron con un Tr=8,52 min y 8,54 min respectivamente.
HPLC de fase inversa reducida
Para confirmar la conjugación específica de sitio del compuesto 10 en la cadena pesada de los anticuerpos, se utilizó la HPLC de fase inversa reducida (rRP-HPLC). Los ADC se trataron con ditiotreitol (DTT, 50 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la reducción, los ADC se inyectaron en una columna PLRP-S (1000Á, 2,1 mm x 50 mm, Agilent) y se eluyeron usando una fase móvil de gradiente de disolvente A de RP-HPLC (ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua) y disolvente B de RP-HPLC (ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo) que consistía en un 5 % de disolvente B - 100 % de disolvente B durante 25 min. Las eluciones en gradiente se realizaron a 80 °C utilizando un caudal de 1 ml/min. La absorbancia se midió a 280nm.
Los cromatogramas del ADC de Flexmab de Herceptin y Flexmab de Herceptin-10 se superpusieron. Las cadenas ligeras de ambas especies eluyeron conjuntamente (Tr de Flexmab de Herceptin-10 = 17,57 min; Tr de Flexmab de Herceptin = 17,54 min), sin embargo, hubo un marcado cambio en el tiempo de retención para la cadena pesada del Flexmab de Herceptin-10 (Tr = 21,31 min) en comparación con el anticuerpo Flexmab de Herceptin no conjugado (Tr = 19,75 min). En el cromatograma de Flexmab de Herceptin-10 también era visible una pequeña cantidad de cadena pesada no conjugada (Tr = 19,97 min).
Los cromatogramas de los controles negativos Flexmab de NIP228 y Flexmab de NIP228-10 también se superpusieron para realizar un análisis comparativo. La cadena pesada del ADC de Flexmab de NIP228-10 mostró un cambio en el tiempo de retención (Tr=21,57 min) en comparación con la cadena pesada del Flexmab de NIP228 (Tr=20,09 min). Una pequeña cantidad de cadena pesada no conjugada era visible para el Flexmab de NIP228-10 (Tr=20,35 min).
Espectrometría de masas
Se utilizó la cromatografía líquida en fase inversa con espectrometría de masas (LCMS) intacta y reducida para confirmar los pesos moleculares de los anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228 y los ADC. Se inyectaron aproximadamente 2 jg (4 j l ) de anticuerpo o ADC en una HPLC Agilent de la serie 1200 conectada en serie a una LC-MS Agilent 6520 de tiempo de vuelo de masa precisa (TOF). El anticuerpo o ADC se cargó en una columna HD de resolución rápida de difenilo Zorbax 300 (2,1 mm x 50 mm x 1,8 jm ) y se eluyó utilizando un caudal de 0,5 ml/min que consistía en un gradiente escalonado de 1-80% de disolvente B (ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo) después de 2 min (disolvente A: ácido fórmico al 0,1 % en agua). Los datos se adquirieron y analizaron con el software MassHunter (Agilent).
El Flexmab de Herceptin purificado produjo un pico a 147.985,36 Da (G0f calc: 147.980,8 Da). Después de la conjugación de la carga activa de compuesto 10 (PM: 2408,67 Da), la LCMS reveló que el peso molecular del Flexmab de Herceptin 3-10 era de 150.396,71 Da (G0f calc: 150.394,03 Da). El análisis del Flexmab de NIP228 por LCMS reveló un pico a 146.770,36 Da (G0f calc: 146743,98 Da). La conjugación de la carga activa de compuesto 1o produjo un pico con un PM de 149.199,75 Da (G0f calc: 149.152,65 Da).
Calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés)
Los anticuerpos y los ADC se dializaron extensamente en histidina 25 mM, pH 6, a 4 °C y se formularon a 0,5 mg/ml. Los experimentos de DSC se llevaron a cabo utilizando un instrumento MicroCal VP-DSC (Malvern). Los datos en bruto se normalizaron para la concentración y la velocidad de exploración (1 °C/min). El análisis de datos y la desconvolución se llevaron a cabo utilizando el software Origin 7 (Malvern). El análisis de desconvolución se realizó utilizando un modelo de no dos estados y los mejores ajustes se obtuvieron utilizando 10-15 ciclos de iteración. Las temperaturas de desnaturalización, Tm, correspondientes al máximo de los picos de transición se determinaron para cada construcción.
Los resultados de los experimentos DSC revelaron las temperaturas de transición Tm para los dominios CH2 y Fab de los anticuerpos de tipo silvestre Herceptin (Tm1 de CH2 =68,95 °C, Tm2 de Fab = 81,43 °C) y NIP228 (Tm1 de CH2 = 69,09 °C, Tm2 de Fab = 74,22 °C) anticuerpos de tipo silvestrees (Wakankar, A.A., et al., Bioconjugate Chemistry, 2010, 21, 1588-1595; DOI: 10.1021/bc900434c). El anticuerpo NIP228 mostró una tercera temperatura de transición Tm para el dominio CH3 a 81,92 °C. La introducción de la tecnología Flexmab en estos anticuerpos hizo que estas temperaturas de transición Tm se invirtieran, teniendo el dominio Fab una temperatura de transición Tm menor en comparación con el dominio CH2 (Flexmab de Herceptin Fab Tm1=68,21 °C, Ch 2 Tm1=81,05 °C; Flexmab de NIP228 Fab Tm1=66,58 °C, CH2 Tm3=81,85 °C). Como se ha visto con el anticuerpo NIP228 de tipo silvestre, se observó una tercera temperatura de transición Tm en el Flexmab de NIP228 para el dominio CH3 (Tm2=76,28 °C). Como era de esperar, después de la conjugación del compuesto 10 a los anticuerpos Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228, se observaron cambios muy pequeños en las temperaturas de transición Tm. (Tm1 de Fab de Flexmab de Herceptin-10 = 67,83 °C, Tm1 de CH2 = 81,11 °C; Tm1 de Fab de Flexmab de NIP228-10 = 66,11 °C, Tm3 de CH2 = 82,19 °C). La tercera temperatura de transición Tm para el dominio CH3 de Flexmab de NIP228-10 (Tm2=78,78 °C) cambió mínimamente en comparación con el Flexmab de NIP228.
Ejemplo 9 - Caracterización in vitro de anticuerpos, y ADC de, Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228
Unión celular por citometría de flujo
Las afinidades y especificidades de unión de los ADC de Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228 se confirmaron utilizando citometría de flujo. El día del estudio, se disociaron células SKBR-3 (HER2+) y MCF-7 (HER2‘) de su matraz con tripsina TrypLE (Life Technologies) y se resuspendieron en sus respectivos medios de cultivo. Las células se contaron en un citómetro ViCell (Beckman Coulter) y se llevaron a una concentración de 1x106 células/ml. Las células se transfirieron por duplicado a pocillos (5x104 células/pocillo) de una placa de 96 pocillos (Falcon) y se centrifugaron a 1200 rpm a 4 °C. Las células sedimentadas se resuspendieron en 180 pl de tampón de citometría de flujo (PBS pH 7,2, SFB al 2 %, en hielo) y se añadieron anticuerpos o ADC individualmente a las células (20 pl de dilución en serie: 200 pg/ml-0,01 pg/ml; concentración final de 20 pg/ml-0,001 pg/ml). Los anticuerpos y las células se incubaron a 4 °C durante 1 hora, después de lo cual se lavaron con tampón de citometría de flujo y se sedimentaron mediante centrifugación (2x, 1200 rpm). Después de la centrifugación final, los sedimentos celulares se resuspendieron en anticuerpo secundario antihumano conjugado con AlexaFluor 647 (150 pl, 8 pg/ml, en PBS pH 7,2, SFB al 2 %) y se incubó a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron con tampón de citometría de flujo y se centrifugaron (2x, 1200 rpm), seguido de resuspensión en 135 pl de tampón de citometría de flujo. Se añadió DAPI (15 pl de solución madre 10X, 1 pM final, Sigma Aldrich) a cada suspensión celular para que actúe como una tinción de vivas/muertas. Los datos de fluorescencia de las células se recolectaron utilizando un citómetro de flujo LSRII (Beckton Dickson) y los datos se analizaron utilizando el software de análisis FlowJo (Versión 9, FlowJo, LLC). Las curvas de unión se generaron utilizando GraphPad Prism (Versión 6, software GraphPad, Inc.).
El ADC de Flexmab de Herceptin10 mostró alta afinidad (CE50=0,24 pg/ml) y selectividad para la línea celular SKBR-3 mientras que no se observó unión con la línea celular MCF-7.
Estudios de estabilidad sérica
Se filtró suero de ratón (Jackson Immunoresearch Labs) a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm (Pall Corporation) en tubos de polipropileno estériles y se mantuvo en hielo. Se añadió ADC (200 pg) al suero de ratón a una concentración final de 200 pg/ml y las muestras se incubaron a 37 °C. Se utilizó p Bs como control negativo. Se tomaron alícuotas de 200 pl de cada muestra a T=0, 24, 72 y 148 horas de incubación. El punto de tiempo T=0 se colocó en hielo seco dentro de los primeros minutos después de la adición del ADC al suero. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se sometieron a captura por afinidad y análisis por LCMS. Se utilizó agarosa anti-IgG humana (específica de Fc) (Sigma Aldrich) para capturar por afinidad los ADC del suero de ratón. Para cada punto de tiempo, se mezclaron 50 pl de perlas de agarosa anti-Fc humano con 300 pl de PBS y 100 pl de muestra de suero durante 30 min a temperatura ambiente con rotación continua. Las perlas se lavaron tres veces con PBS 1 x para eliminar las proteínas séricas no unidas y los ADC se eluyeron con 100 |jl de tampón de elución de IgG (Thermo Scientific) y se neutralizaron con 20 j l de Tris 1 M pH 8. Las muestras individuales (20 j l ) se analizaron mediante LCMS como se describe anteriormente y los datos en bruto se analizaron utilizando el software Masshunter.
Después de siete días de incubación, la LCMS reveló que menos del 1 % de la carga activa del compuesto 10 se perdió en el Flexmab de Herceptin-10. Esta buena estabilidad in vitro sugiere que la toxicidad inespecífica podría estar reducida in vivo.
Ensayos de citotoxicidad
SKBR-3, Las células MDA-MD-453 y MCF-7 se mantuvieron como se describe anteriormente. El día anterior al tratamiento, las células se disociaron de su matraz con tripsina TrypLE y se resuspendieron en medio de cultivo. Las células se contaron en un citómetro ViCell y se llevaron a una concentración de 1,0x105 células/ml en sus respectivos medios de cultivo. Las suspensiones celulares (100 jl, 1,0x104 células/pocillo) se transfirieron a pocillos de una placa de 96 pocillos de pared blanca y fondo transparente (Corning). Se permitió que las células se adhirieran durante una noche en una incubadora a 37 °C con el 5 % de CO2. El día del tratamiento, se prepararon diluciones en serie de los ADC con un intervalo de 30 jg/ml-1,5 ng/ml y se añadieron 50 j l de cada dilución a los pocillos por triplicado (concentraciones finales de ADC de 10 jg/ml-0,5 ng/ml, 150 j l volumen total/pocillo). Además, se añadieron a cada placa pocillos no tratados apropiados para que sirvieran como controles. El día 5, se retiraron las placas de la incubadora y se dejaron equilibrar hasta la temperatura ambiente durante. Las placas se centrifugaron (1300 rpm, 5 min) y se aspiraron los sobrenadantes. Se añadieron los medios (SKBR-3: McCoy's 5A, MDA-MB-453 y MCF-7: DMEM) sin rojo fenol ni SFB a cada pocillo (50 jl), seguido de la adición del reactivo CellTiter-Glo® (50 jl). Las placas se agitaron durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente y se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas Envision™ (PerkinElmer). El porcentaje de viabilidad se calculó como: (Desconocido/Controles promedio)*100. Los datos experimentales se representaron gráficamente utilizando GraphPad Prism para generar curvas de CI50.
Después de 3 días de incubación en células MDA-MB-453 (expresión baja de HER2; 7,7x104 receptores HER2/célula), Flexmab de Herceptin-10 mostró una CI50 = 1,08 nM con ~ el 90 % de viabilidad celular. Después de 5 días, Flexmab de Herceptin-10 tenía una CI50 = 0,0375 nM con ~ el 35 % de viabilidad celular.
Después de 3 días de incubación en células SKBR-3 (alta expresión de HER2; 1,5x106 receptores de HER2/célula) Flexmab de Herceptin-10 mostró un a CI50 = 0,229 nM con ~ el 30 % de viabilidad celular. Después de 5 días, El Flexmab de Herceptin-10 tuvo una CI50 = 0,0355 nM con ~ el 5 % de viabilidad celular.
Ejemplo 10 - Caracterización in vivo de los anticuerpos y ADC de Flexmab de Herceptin y Flexmab de NIP228
Todos los estudios relacionados con el uso de animales se realizaron compasivamente con un protocolo aprobado por el Medlmmune Institutional Animal Care and Use Committee en una instalación acreditada por AAALAC International.
Xenoinjertos
Se inocularon células NCI-N87 (5x106) en Matrigel al 50 % por vía subcutánea en ratones lampiños atímicos hembra (Harlan) de 4-6 semanas. Cuando los tumores alcanzaron los 200 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos, 5 ratones por grupo. Los ADC se administraron i.v. a las dosis indicadas y se dosificaron el día 5 posinoculación de las células. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana con compases calibradores. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula A x L x W2 (L = longitud; A = anchura). Se midieron los pesos corporales para evaluar la tolerabilidad de los tratamientos. Las curvas de crecimiento tumoral y de peso corporal se representaron gráficamente utilizando el software Prism5 (GraphPad, La Jolla, CA). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± ETM.
La figura 1 muestra el efecto de una dosis única de 1,0 mg/kg (♦) en comparación con sin tratamiento (•)
- la dosis produjo regresión tumoral seguida de estasis tumoral durante 55 días.
La figura 2 muestra el efecto de una dosis única de 0,3 mg/kg (♦) en comparación con sin tratamiento (•)
- la dosis también produjo regresión tumoral seguida de estasis tumoral durante 55 días.
Toxicidad
Se administró a ratas Sprague Dawley macho (de 8-12 semanas, 5 por grupo) una única inyección i.v. (día 1) de 0,75, 1,5, 3 o 4 mg/kg de Flexmab de Herceptin-10 y las ratas se evaluaron durante 21 días. Se incluyeron animales "satélite" para toxicocinética (TK) (3 por grupo) en cada grupo de tratamiento para medir la concentración plasmática de anticuerpo total y de ADC. A las ratas de control (5 por grupo) se les administró una única inyección i.v. de control de vehículo el día 1. Todos los animales del estudio principal se evaluaron en cuanto a los signos clínicos, los cambios en el peso corporal, la medicina de laboratorio, la anatomía patológica macroscópica con pesos de órganos y observaciones microscópicas. Todos los animales satélite de TK se evaluaron en cuanto a los signos clínicos, los cambios en el peso corporal y el análisis farmacocinético. Las muestras de hematología y bioquímica sérica se recogieron y analizaron los días 8 y 15. Se recogieron y analizaron muestras adicionales para análisis de coagulación únicamente el día 22. Las muestras de sangre para el análisis farmacocinético se recogieron en tubos de K2 EDTA antes de la dosificación y en múltiples punto de tiempo los días 1, 8, 15 y 22. Se realizó anatomía patológica macroscópica en todos los animales del estudio principal y se incluyó en parafina un listado convencional de órganos, entre ellos el cerebro, el pulmón, el hígado, el riñón, el bazo, el timo, los testículos, el corazón y hueso, se cortaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina, y un patólogo veterinario certificado los examinó al microscopio.
Fueron bien toleradas dosis tan altas como 4 mg/kg de Flexmab de Herceptin-10.
Índice terapéutico
El Índice terapéutico puede calcularse dividiendo la dosis única máxima tolerada (DMT) de ADC no dirigido en rata, por la dosis única eficaz mínima (DEM) de un ADC que se tiene como diana. La DEM es la dosis única necesaria para lograr la estasis tumoral en un modelo in vivo a los 28 días (para el xenoinjerto de NCI-N87). Por tanto, para Flexmab de Herceptin-10 el Índice terapéutico calculado es de al menos 13,3.
Ejemplo 11
Los anticuerpos Herceptin y R347 genomanipulados para tener una cisteína insertada entre las posiciones 239 y 240 se produjeron siguiendo los métodos descritos en Dimasi, N., et al., Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOl:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995).
ADC de HerC239i-10
Se añadió DTT (100 equivalentes molares/anticuerpo, 26,7 micromoles) a una solución de anticuerpo Herceptin-C239i (40 mg, 266,7 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4 y el volumen final se completó hasta 8 ml. La reducción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 4 horas con agitación suave, antes de eliminar el DTT mediante filtración por centrifugación utilizando el filtro para centrifugación de MWCO de 30 kDa Ultracell de Amicon. Al anticuerpo reducido (5 mg/ml, 8 ml) se le añadió ácido (L)-deshidroascórbico (DHAA, 20 equivalentes molares/anticuerpo, 5,3 micromoles, 106,7 pl a 50 mM en DMSO) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, y la reoxidación tuvo lugar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. El DHAA se eliminó por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 pm y el Compuesto 10 se añadió como una solución de DMSO (3 equivalentes molares/anticuerpo, 0,8 micromoles, en 0,9 ml de DMSO) a 8,1 ml del anticuerpo reoxidado (40 mg, 266,7 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, para una concentración final de DMSO del 10 % (v/v). La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 4 horas con agitación suave. La conjugación se inactivó mediante la adición de N-acetilcisteína (4 micromoles, 40 pl a 100 mM) y se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba utilizando FPLC y columna butilo de HP (5 ml) con una pasada del gradiente de (NH4 )2SO41 M, fosfato de potasio 25 mM pH 6,0 y fosfato de potasio 25 mM pH 6,0. Las fracciones que contenían más del 95 % de DAR1 se agruparon, concentraron, se le cambio el tampón a PBS, pH 7,4, por filtración por centrifugación usando un filtro para centrifugación de MWCO de 50 kDA Ultracell de Amicon de 15 ml, se esterilizaron por filtración y se analizaron.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence usando una columna Proteomix HIC Butil-NP5, de 5 pm, no porosa de 4,6x35 mm (Sepax) eluyendo con un gradiente de sulfato de amonio 1,5 M, acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 y acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 con acetonitrilo al 20 % (v/v) en una muestra pura de ADC de HerC239i-10 a 214 nm muestra únicamente el Compuesto 10 conjugado de forma individual, en concordancia con una relación de fármaco por anticuerpo (DAR) de 1,00 moléculas de Compuesto 10 por anticuerpo.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence utilizando una columna Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP de 4 pm 4,6 x 150 mm (con una precolumna de 4 pm 3,0 x 20 mm) eluyendo con 0,3 ml/minuto de tampón de SEC esterilizado por filtración que contenía de fosfato de potasio 200 mM pH 6,95, cloruro de potasio 250 mM e isopropanol al 10 % (v/v) en una muestra pura del ADC de HerC239i-10 a 280 nm muestra una pureza de monómero del 99%. El análisis UHPLC SEC proporciona una concentración final de ADC de HerC239i-10 a 1,71 mg/ml en 11,1 ml, la masa obtenida del ADC de HerC239i-10 es de 18,9 mg (rendimiento del 47 %).
ADC de R347C239i-10
Se añadió DTT (100 equivalentes molares/anticuerpo, 133,3 micromoles) a una solución de anticuerpo R347-Maia (200 mg, 1,33 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4 y el volumen final se completó hasta 40 ml. La reducción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 4 horas con agitación suave, antes de eliminar el DTT mediante filtración de flujo tangencial (filtro de fibra de 30 kDa). Al anticuerpo reducido (4 mg/ml, 50 ml) se le añadió ácido (L)-deshidroascórbico (DHAA, 20 equivalentes molares/anticuerpo, 26,7 micromoles, 533,3 pl a 50 mM en DMSO) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, y la reoxidación tuvo lugar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. El DHAA se eliminó por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 pm y el Compuesto 10 se añadió como una solución de DMSO (2 equivalentes molares/anticuerpo, 2,67 micromoles, en 5,6 ml de DMSO) a 50,5 ml del anticuerpo reoxidado (200 mg, 1,33 micromoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, para una concentración final de DMSO del 10 % (v/v). La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 4 horas con agitación suave. La conjugación se inactivó mediante la adición de N-acetilcisteína (6,7 micromoles, 66,7 j l a 100 mM) y se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba utilizando FPLC y columna butilo de HP (5 ml) con una pasada del gradiente de (NH4 )2SO41 M, fosfato de potasio 25 mM pH 6,0 y fosfato de potasio 25 mM pH 6,0. Las fracciones que contenían más del 95 % de DAR1 se agruparon, concentraron, se cambió el tampón a histidina 25 mM, sacarosa 200 mM, pH 6,0, por filtración por centrifugación usando un filtro para centrifugación de MWCO de 50 kDA Ultracell de Amicon de 15 ml, se esterilizaron por filtración y se analizaron.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence usando una columna Proteomix HIC Butil-NP5, de 5 jm , no porosa de 4,6x35 mm (Sepax) eluyendo con un gradiente de sulfato de amonio 1,5 M, acetato de sodio 25 mM, pH 7.4 y acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 con acetonitrilo al 20 % (v/v) en una muestra pura de ADC de R347C239i-10 a 214 nm muestra únicamente el Compuesto 10 conjugado de forma individual, en concordancia con una relación de fármaco por anticuerpo (DAR) de 1,00 moléculas de Compuesto 10 por anticuerpo.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence utilizando una columna Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP de 4 jm 4,6 x 150 mm (con una precolumna de 4 jm 3,0 x 20 mm) eluyendo con 0,3 ml/minuto de tampón de SEC esterilizado por filtración que contenía de fosfato de potasio 200 mM pH 6,95, cloruro de potasio 250 mM e isopropanol al 10 % (v/v) en una muestra pura del ADC de R347C239i-10 a 280 nm muestra una pureza de monómero del 99 %. El análisis UHPLC SEC proporciona una concentración final de ADC de R347C239i-10 a 1,72 mg/ml en 55 ml, la masa obtenida del ADC de R347C239i-10 es de 94,5 mg (rendimiento del 47 %).
ADC de 1C1C239Í-10
Se añadió DTT (100 equivalentes molares/anticuerpo, 3,3 micromoles) a una solución de anticuerpo 1C1-Maia (5 mg, 33,3 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4 y el volumen final se completó hasta 2,5 ml. La reducción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 5 horas con agitación suave, antes de eliminar el DTT mediante filtración por centrifugación utilizando el filtro para centrifugación de MWCO de 30 kDa Ultracell de Amicon. Al anticuerpo reducido (2 mg/ml, 2,5 ml) se le añadió ácido (L)-deshidroascórbico (DHAA, 20 equivalentes molares/anticuerpo, 0,67 micromoles, 13,3 j l a 50 mM en DMSO) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, y la reoxidación tuvo lugar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. El DHAA se eliminó por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 jm y el Compuesto 10 se añadió como una solución de DMSO (3 equivalentes molares/anticuerpo, 0,1 micromoles, en 0,27 ml de DMSO) a 2,5 ml del anticuerpo reoxidado (5 mg, 33,3 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, para una concentración final de DMSO del 10 % (v/v). La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 5 horas con agitación suave. La conjugación se inactivó mediante la adición de N-acetilcisteína (2 micromoles, 39,6 j l a 100 mM) y se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaños preparativa utilizando FPLC y columna Superdex 20026/600 con PBS pH 7,4 como tampón de elución. Las fracciones que contenían más del 95 % de monómeros se agruparon, concentraron, se cambió el tampón a histidina 25 mM, sacarosa 200 mM, pH 6,0 por filtración por centrifugación usando un filtro para centrifugación de MWCO de 50 kDA Ultracell de Amicon de 15 ml, se esterilizaron por filtración y se analizaron.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence usando una columna Proteomix HIC Butil-NP5, de 5 jm , no porosa de 4,6x35 mm (Sepax) eluyendo con un gradiente de sulfato de amonio 1,5 M, acetato de sodio 25 mM, pH 7.4 y acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 con acetonitrilo al 20 % (v/v) en una muestra pura de ADC de 1C1C239i-10 a 214 nm muestra anticuerpo sin conjugar y una mezcla de Compuesto 10 conjugado de forma sencilla y forma doble, en concordancia con una relación de fármaco por anticuerpo (DAR) de 1,04 moléculas de Compuesto 10 por anticuerpo.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence utilizando una columna Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP de 4 jm 4,6 x 150 mm (con una precolumna de 4 jm 3,0 x 20 mm) eluyendo con 0,3 ml/minuto de tampón de SEC esterilizado por filtración que contenía de fosfato de potasio 200 mM pH 6,95, cloruro de potasio 250 mM e isopropanol al 10 % (v/v) en una muestra pura del ADC de 1C1C239i-10 a 280 nm muestra una pureza de monómero del 100 %. El análisis UHPLC SEC proporciona una concentración final de ADC de 1C1C239i-10 a 1,45 mg/ml en 2,3 ml, la masa obtenida del ADC de 1C1C239i-10 es de 3,34 mg (rendimiento del 67 %).
ADC de HerC239i-11
Se añadió DTT (100 equivalentes molares/anticuerpo, 3,3 micromoles) a una solución de anticuerpo Herceptin-Maia (5 mg, 33,3 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4 y el volumen final se completó hasta 2,5 ml. La reducción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 5 horas con agitación suave, antes de eliminar el DTT mediante filtración por centrifugación utilizando el filtro para centrifugación de MWCO de 30 kDa Ultracell de Amicon. Al anticuerpo reducido (2 mg/ml, 2,5 ml) se le añadió ácido (L)-deshidroascórbico (DHAA, 20 equivalentes molares/anticuerpo, 0,67 micromoles, 13,3 j l a 50 mM en DMSO) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, y la reoxidación tuvo lugar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. El DHAA se eliminó por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 jm y el Compuesto 11 se añadió como una solución de DMSo (1,5 equivalentes molares/anticuerpo, 0,05 micromoles, en 0,27 ml de DMSO) a 2,5 ml del anticuerpo reoxidado (5 mg, 33,3 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, para una concentración final de DMSO del 10 % (v/v). La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. La conjugación se inactivó mediante la adición de N-acetilcisteína (2 micromoles, 39,6 j l a 100 mM) y se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaños preparativa utilizando FPLC y columna Superdex 20026/600 con PBS pH 7,4 como tampón de elución. Las fracciones que contenían más del 95 % de monómeros se agruparon, concentraron, se cambió el tampón a histidina 25 mM, sacarosa 200 mM, pH 6,0 por filtración por centrifugación usando un filtro para centrifugación de MWCO de 50 kDA Ultracell de Amicon de 15 ml, se esterilizaron por filtración y se analizaron.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence usando una columna Proteomix HIC Butil-NP5, de 5 jm , no porosa de 4,6x35 mm (Sepax) eluyendo con un gradiente de sulfato de amonio 1,5 M, acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 y acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 con acetonitrilo al 20 % (v/v) en una muestra pura de ADC de HerC239i-l1 a 214 nm muestra anticuerpo sin conjugar y una mezcla de Compuesto 11 conjugado de forma sencilla y forma doble, en concordancia con una relación de fármaco por anticuerpo (DAR) de 1,10 moléculas de Compuesto 11 por anticuerpo.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence utilizando una columna Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP de 4 jm 4,6 x 150 mm (con una precolumna de 4 jm 3,0 x 20 mm) eluyendo con 0,3 ml/minuto de tampón de SEC esterilizado por filtración que contenía de fosfato de potasio 200 mM pH 6,95, cloruro de potasio 250 mM e isopropanol al 10 % (v/v) en una muestra del ADC de HerC239i-11 a 280 nm muestra una pureza de monómero del 99%. El análisis UHPLC SEC proporciona una concentración final de ADC de HerC239i-11 a 1,29 mg/ml en 4,0 ml, la masa obtenida del ADC de HerC239i-11 es de 3,23 mg (rendimiento del 65 %).
ADC de 1C1C239Í-11
Se añadió DTT (100 equivalentes molares/anticuerpo, 3,3 micromoles) a una solución de anticuerpo 1C1-Maia (5 mg, 33,3 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4 y el volumen final se completó hasta 2,5 ml. La reducción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 5 horas con agitación suave, antes de eliminar el DTT mediante filtración por centrifugación utilizando el filtro para centrifugación de MWCO de 30 kDa Ultracell de Amicon. Al anticuerpo reducido (2 mg/ml, 2,5 ml) se le añadió ácido (L)-deshidroascórbico (DHAA, 20 equivalentes molares/anticuerpo, 0,67 micromoles, 13,3 j l a 50 mM en DMSO) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, y la reoxidación tuvo lugar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. El DHAA se eliminó por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 jm y el Compuesto 11 se añadió como una solución de DMSo (1,5 equivalentes molares/anticuerpo, 0,05 micromoles, en 0,27 ml de DMSO) a 2,5 ml del anticuerpo reoxidado (5 mg, 33,3 nanomoles) en PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, para una concentración final de DMSO del 10 % (v/v). La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante una noche con agitación suave. La conjugación se inactivó mediante la adición de N-acetilcisteína (2 micromoles, 39,6 j l a 100 mM) y se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaños preparativa utilizando FPLC y columna Superdex 20026/600 con PBS pH 7,4 como tampón de elución. Las fracciones que contenían más del 95 % de monómeros se agruparon, concentraron, se cambió el tampón a histidina 25 mM, sacarosa 200 mM, pH 6,0 por filtración por centrifugación usando un filtro para centrifugación de MWCO de 50 kDA Ultracell de Amicon de 15 ml, se esterilizaron por filtración y se analizaron.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence usando una columna Proteomix HIC Butil-NP5, de 5 jm , no porosa de 4,6x35 mm (Sepax) eluyendo con un gradiente de sulfato de amonio 1,5 M, acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 y acetato de sodio 25 mM, pH 7,4 con acetonitrilo al 20 % (v/v) en una muestra pura de ADC de 1C1C239i-11 a 214 nm muestra anticuerpo sin conjugar y una mezcla de Compuesto 11 conjugado de forma sencilla y forma doble, en concordancia con una relación de fármaco por anticuerpo (DAR) de 1,05 moléculas de Compuesto 11 por anticuerpo.
El análisis por UHPLC en un sistema Shimadzu Prominence utilizando una columna Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP de 4 jm 4,6 x 150 mm (con una precolumna de 4 jm 3,0 x 20 mm) eluyendo con 0,3 ml/minuto de tampón de SEC esterilizado por filtración que contenía de fosfato de potasio 200 mM pH 6,95, cloruro de potasio 250 mM e isopropanol al 10 % (v/v) en una muestra del ADC de 1C1C239i-11 a 280 nm muestra una pureza de monómero del 99%. El análisis UHPLC SEC proporciona una concentración final de ADC de 1C1C239i-11 a 1,50 mg/ml en 2,2 ml, la masa obtenida del ADC de 1c 1c 239í-11 es de 3,3 mg (rendimiento del 66 %).
Se llevaron a cabo conjugaciones adicionales con los siguientes anticuerpos con el Compuesto 10: RSV-C239i; B7H4-E02-C239i; PSMA-C239i; y CDH6-50B-C239i.
Ejemplo 12
Ensayo de 1C1 en PC3 in vitro
Se aspiró el medio de células PC3 subconfluentes (confluencia del 80-90 %) en un matraz T75 y se lavó el matraz con PBS (aproximadamente 20 ml), y se vació. Se añadió tripsina-EDTA (5 ml), el matraz devolvió a la incubadora con gas a 37 °C durante unos 5 minutos, luego se golpeó bruscamente para desprender y disociar las células del plástico. La suspensión celular se transfirió a un tubo de centrífuga estéril con tapa de rosca de 50 ml, se diluyó con medio de cultivo hasta un volumen final de 15 ml y a continuación se centrifugó (400g durante 5 min). Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 10 ml de medio de cultivo. Puede ser necesario pipetear repetidamente para producir suspensiones de células monodispersas. Se miden la concentración y la viabilidad celular de células teñidas con azul tripano, utilizando el LUNA II. Las células se diluyeron a 1500 células/pocillo, se dispensan (50 pl/pocillo) en placas blancas de fondo plano de 96 pocillos y se incuban durante una noche antes de su uso.
Se preparó una solución madre (1 ml) de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) (20 pg/ml) mediante dilución del ADC esterilizado por filtración en medio de cultivo celular. Se preparó un conjunto de 8x diluciones al décimo del ADC de reserva en una placa de 24 pocillos mediante la transferencia en serie de 100 pl a 900 pl de medio de cultivo celular. Se dispensó la dilución de ADC (50 pl/pocillo) en 4 pocillos repetidos de la placa de 96 pocillos, que contenían 50 pl de suspensión celular sembrada el día anterior. Los pocillos de control recibieron 50 pl de medio de cultivo celular. La placa de 96 pocillos que contenía células y ADC se incubó a 37 °C en una incubadora con gas CO2 durante 6 días. Al final del periodo de incubación, las placas se equilibraron hasta temperatura ambiente durante 30 min antes de dispensar CellTiter-Glo (Promega) (100 pl por pocillo) en cada pocillo. Las placas se colocaron en un agitador orbital durante 2 min antes de la estabilización a temperatura ambiente durante 10 min. Se midió la luminiscencia de los pocillos y se calculó el porcentaje de supervivencia celular a partir de la luminiscencia media de los 4 pocillos tratados con ADC en comparación con la luminiscencia media de los 4 pocillos de control no tratados (100%). La CI50 se determinó a partir de los datos de respuesta a la dosis utilizando GraphPad Prism utilizando el algoritmo de ajuste de curva no lineal: respuesta a la dosis sigmoidal, X es log(concentración). El medio de cultivo celular para PC3 fue: F12K con glutamina, suero fetal bovino HyClone™ al 10 %.
Figure imgf000062_0002
Ensayo de MTS in vitro
La actividad de los ADC in vitro se midió en la línea celular que expresa Her2 NCI-N87 y la línea celular negativa para Her2 MDA-MB-468.
La concentración y la viabilidad de células de un matraz T75 subconfluente (confluencia del 80-90 %) se miden mediante tinción con azul tripano y se cuentan utilizando el citómetro automatizado LUNA-II™. Las células se diluyeron a 2x105/ml, se dispensaron (50 pl por pocillo) en placas de fondo plano de 96 pocillos.
Se preparó una solución madre (1 ml) de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) (20 pg/ml) mediante dilución del ADC esterilizado por filtración en medio de cultivo celular. Se preparó un conjunto de 8x diluciones al décimo del ADC de reserva en una placa de 24 pocillos mediante la transferencia en serie de 100 pl en 900 pl de medio de cultivo celular. Se dispensó la dilución de ADC (50 pl por pocillo) en 4 pocillos repetidos de la placa de 96 pocillos, que contenían 50 pl de suspensión celular sembrada previamente. Los pocillos de control recibieron 50 pl de medio de cultivo celular. La placa de 96 pocillos que contenía células y ADC se incubó a 37 °C en una incubadora con gas CO2 durante el tiempo de exposición.
Al final del periodo de incubación, la viabilidad celular se midió mediante ensayo de MTS. Se dispensó MTS (Promega) (20 pl por pocillo) en cada pocillo y se incubó durante 4 horas a 37 °C en la incubadora con gas CO2. Se midió la absorbancia de los pocillos a 490 nm. El porcentaje de supervivencia celular se calculó a partir de la absorbancia media en los 4 pocillos tratados con ADC en comparación con la absorbancia media en los 4 pocillos de control sin tratar (100 %). La CI50 se determinó a partir de los datos de respuesta a la dosis utilizando GraphPad Prism utilizando el algoritmo de ajuste de curva no lineal: curva dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable.
Los tiempos de incubación con ADC fueron 4 días con MDA-MB-468 y 7 días para NCI-N87. MDA-MB-468 y NCI-N87 se cultivaron en RPMI 1640 con Glutamax suero fetal bovino H Cl ne™ al 10 % v/ ).
Figure imgf000062_0001
Ejemplo 13
Ratones
Los ratones hembra con inmunodeficiencia combinada grave (Fox Chase SCID®, C.B-17/Icr-Prkdcscid, Charles River) tenían diez semanas y un intervalo de peso corporal (PC) de 16,2 a 21,9 gramos el día 1 del estudio. Se alimentó a los animales a demanda con agua (ósmosis inversa, 1 ppm Cl) y NIH 31 Lab Diet® modificada e irradiada que consistía en proteína bruta al 18,0 %, grasa bruta al 5,0 % y fibra bruta al 5,0 %. Se alojó a los ratones en lechos para animales de laboratorio Enrich-o'cobs™ irradiados en microaislantes estáticos en un ciclo de 12 horas de luz a 20-22 °C (68­ 72 °F) y humedad del 40-60 %. CR Discovery Services cumple específicamente con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de los animales de laboratorio con respecto a la sujeción, la cría, los procedimientos quirúrgicos, la regulación de la alimentación y los líquidos, y los cuidados veterinarios. El programa de cuidado y uso de animales en CR Discovery Services está acreditado por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC), que garantiza el cumplimiento de las normas aceptadas para el cuidado y uso de los animales de laboratorio.
Xenoinjertos de JIMT-1
Cultivo de células tumorales
Se cultivaron células de carcinoma de mama humano JIMT-1 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM, penicilina G de sodio 100 unidades/ml, sulfato de estreptomicina 100 pg/ml y gentamicina 25 pg/ml. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera del 5 % de CO2 y el 95 % de aire.
Implante in vivo y crecimiento tumoral
El día del implante, las células JIMT-1 se recolectaron durante el crecimiento en fase logarítmica y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 x 108 células/ml en MatrigelTM al 50 % (BD Biosciences). Los xenoinjertos se iniciaron implantando por vía subcutánea 1 x 107 células JIMT-1 (0,1 ml de suspensión) en el flanco derecho de cada animal de prueba. Los tumores se controlaron a medida que sus volúmenes se acercaban al intervalo diana de 100 a 150 mm3y se midieron en dos dimensiones utilizando compases calibradores. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula:
Volumen tumoral (mm3) - = *x
donde a = anchura y l = longitud, en mm, del tumor. El peso del tumor se puede estimar asumiendo que 1 mg es equivalente a 1 mm3 de volumen tumoral.
Tratamiento
Catorce días después de la implantación del tumor, designado como el día 1 del estudio, los animales se clasificaron en grupos (n=10) con unos volúmenes tumorales individuales de 75 a 162 mm3 y unos volúmenes tumorales medios del grupo de 115 a 117 mm3.
Los ADC de HerC239i-10 y HerC239i-SG3249 se administraron por vía intravenosa en una dosis única de 0,3 mg/kg en el día 1. Un grupo tratado con vehículo sirvió como control del crecimiento tumoral. Los tumores se midieron dos veces por semana.
HerC239i-SG3249 es un conjugado fabricado a partir de SG32349, como se describe, por ejemplo, en Dimasi, N., et al., Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995).
El efecto sobre el volumen tumoral se muestra en la figura 6, donde:
Figure imgf000063_0001
El ADC de HerC239i-10 demuestra una actividad equivalente a ADC de HerC239i-SG3249, a pesar de tener solo la mitad de los agentes de dímero de PBD.

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de fórmula I:
Figure imgf000064_0001
en la que
Ab es un anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada
D representa cualquiera del grupo D1 o D2:
Figure imgf000064_0002
la línea de puntos indica la presencia opcional de un enlace doble entre C2 y C3; cuando hay un doble enlace presente entre C2 y C3, R2 se selecciona del grupo que consiste en:
(ia) grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, carboxi, éster, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3;
(ib) alquilo C1-5 alifático saturado;
(ic) cicloalquilo C3-6 saturado;
(id)
Figure imgf000064_0003
en donde cada uno de R11, R12 y R13 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 5; (ie)
Figure imgf000064_0004
en donde uno de R15a y R15b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y
(if)
Figure imgf000065_0001
donde R14 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; cuando hay un enlace sencillo presente entre C2 y C3,
R2 se selecciona de H, OH, F, diF y
Figure imgf000065_0002
donde R16a y R16b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R16a y R16b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4;
D' representa el grupo D'1 o el D'2:
Figure imgf000065_0003
en los que la línea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre C2' y C3';
cuando hay un doble enlace presente entre C2' y C3', R22 se selecciona del grupo que consiste en:
(iia) grupo arilo C5-10, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende: halo, nitro, ciano, éter, carboxi, éster, alquilo C1-7, heterociclilo C3-7 y bis-oxi-alquileno C1-3; (iib) alquilo C1-5 alifático saturado;
(iic) cicloalquilo C3-6 saturado;
(iid)
Figure imgf000065_0004
en donde cada uno de R31, R32 y R33 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo, donde el número total de átomos de carbono en el grupo R22 no es mayor de 5;
(iie)
Figure imgf000065_0005
en donde uno de R25a y R25b es H y el otro se selecciona de: fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo; y
(iif)
Figure imgf000066_0001
donde R24 se selecciona de: H; alquilo C1-3 saturado; alquenilo C2-3; alquinilo C2-3; ciclopropilo; fenilo, fenilo que está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado de halo, metilo, metoxi; piridilo; y tiofenilo;
cuando hay un enlace sencillo presente entre C2' y C3',
R22 se selecciona de H, OH, F, diF y
Figure imgf000066_0002
donde R26a y R26b se seleccionan independientemente de H, F, alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de alquil C1-4 amido y éster de alquilo C1-4; o, cuando uno de R26a y R26b es H, el otro se selecciona de nitrilo y un éster de alquilo C1-4;
R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, Sr , NH2, NHR, NRR', nitro, Me3Sn y halo; donde R y R' se seleccionan independientemente de alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, grupos heterociclilo C3-20 y arilo C5-20;
R7 se selecciona de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', nitro, Me3Sn y halo;
R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, NRN2, donde RN2 es H o alquilo C1-4, y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina;
Y e Y' se seleccionan de O, S o NH;
R11a se selecciona de OH, ORA, donde RA es alquilo C1-4;
R6', R7', R9' y R11a' se seleccionan de los mismos grupos que R6, R7, R9 y R11a, respectivamente;
y
RLL1 y RLL2 son engarces conectados al anticuerpo en diferentes sitios que son independientemente de fórmula Illa':
Figure imgf000066_0003
en la que
Q es:
Figure imgf000066_0004
donde QX es tal que Q es un residuo de aminoácido, un residuo dipeptídico o un residuo tripeptídico;
X es:
Figure imgf000066_0005
donde a = de 0 a 5, b = de 0 a 16, c = 0 o 1, d = de 0 a 5;
GLL se selecciona de:
Figure imgf000067_0001
donde Ar representa un grupo arileno C5-6, por ejemplo fenileno y X representa alquilo C1-4; donde CBA representa un agente de unión a células que es un anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada; en donde el término alquilo incluye las subclases alquenilo, alquinilo y cicloalquilo, el término alquileno incluye las subclases alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, el término alquenilo se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono y el término alquinilo se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono.
2. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:
a) ambos Y e Y' son O; y/o
b) R" es alquileno C3-7 o un grupo de fórmula:
Figure imgf000068_0001
donde r es 1 o 2 ; y/o
c) R9 es H; y/o
d) R6 es H; y/o
e) R7 se selecciona de H, OH, OR o un grupo alquiloxi C1-4.
3. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en donde D es D1, hay un doble enlace entre C2 y C3, y R2 es:
a) un grupo arilo C5-7 en donde R2 tiene opcionalmente de uno a tres grupos sustituyentes seleccionados de metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metil-tiofenilo; o
b) un grupo arilo C8-10 en donde R2 tiene opcionalmente de uno a tres grupos sustituyentes seleccionados de metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metil-tiofenilo; o
c) un grupo alquilo C1-5 alifático saturado, opcionalmente en donde R2 es metilo, etilo o propilo; o
d) un grupo de fórmula:
Figure imgf000068_0002
opcionalmente en la que:
i) el número total de átomos de carbono en el grupo R2 no es mayor de 4;
ii) uno de R11, R12 y R13 es H, seleccionándose los otros dos grupos de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo; o
iii) dos de R11, R12 y R13 son H, seleccionándose el otro grupo de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo; o
e) un grupo de fórmula:
Figure imgf000068_0003
f) el grupo:
Figure imgf000068_0004
g) un grupo de fórmula:
Figure imgf000069_0001
h) un grupo cicloalquilo C3-6 saturado, opcionalmente en donde R2 es ciclopropilo.
4. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en donde D es D1 hay un enlace sencillo entre C2 y C3, y R2 es:
a) H; o,
b)
Figure imgf000069_0002
y R16a y R16b son ambos H; o
c)
Figure imgf000069_0003
y R16a y R16b son ambos metilo; o
d)
Figure imgf000069_0004
uno de R16a y R16b es H y el otro se selecciona de alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos.
5. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde D' es D'1, hay un doble enlace entre C2' y C3', y R22 es:
a) un grupo arilo C5-7 en donde en donde R22 tiene opcionalmente de uno a tres grupos sustituyentes seleccionados de metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metil-tiofenilo; o
b) un grupo arilo C8-10 en donde en donde R22 tiene opcionalmente de uno a tres grupos sustituyentes seleccionados de metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metil-tiofenilo; o c) un grupo alquilo C1-5 alifático saturado; o
d) un grupo cicloalquilo C3-6 saturado; o
e) un grupo de fórmula:
Figure imgf000069_0005
en donde:
i) el número total de átomos de carbono en el grupo R22 no es mayor de 4; o
ii) uno de R31, R32 y R33 es H, seleccionándose los otros dos grupos de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo; o
iii) dos de R31, R32 y R33 son H, seleccionándose el otro grupo de H, alquilo C1-3 saturado, alquenilo C2-3, alquinilo C2-3 y ciclopropilo; o
f) un grupo de fórmula:
Figure imgf000070_0001
g) el grupo:
Figure imgf000070_0002
h) un grupo de fórmula:
Figure imgf000070_0003
en la que R24 se selecciona de H, metilo, etilo, etenilo y etinilo.
6. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde D' es D'1, hay un enlace sencillo entre C2' y C3', y R22 es:
a) H; o
b)
Figure imgf000070_0004
y R26a y R26b son ambos H; o
c)
Figure imgf000070_0005
y R26a y R26b son ambos metilo; o
d)
Figure imgf000070_0006
uno de R26a y R26b es H y el otro se selecciona de alquilo C1-4 saturado, alquenilo C2-3, grupos alquilo y alquenilo que están opcionalmente sustituidos.
7. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en donde R11a es:
a) OH; o
b) ORA, donde RA es alquilo C1-4.
8. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde:
a) R6' se selecciona de los mismos grupos que R6, R7' se selecciona de los mismos grupos que R7, R9' se selecciona de los mismos grupos que R9, R11a' se selecciona de los mismos grupos que R11a e Y' se selecciona de los mismos grupos que Y; y/o
b) R6' es el mismo grupo que R6, R7' es el mismo grupo que R7, R9' es el mismo grupo que R9, R11a' es el mismo grupo que R11a e Y' es el mismo grupo que Y; y/o
c) R22 es el mismo grupo que R2.
9. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, que es de fórmula Ia-1, Ia-2 o Ia-3:
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
(d)
Figure imgf000072_0002
(e)
Figure imgf000072_0003
(f)
Figure imgf000072_0004
(g)
Figure imgf000072_0005
y
(h)
Figure imgf000072_0006
R1a se selecciona de metilo y bencilo;
Ri_u, ru_2 y R11a son como se han definido en la reivindicación 1.
10. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde RLL1 es de fórmula IIIa', y Qx es:
a) un residuo de aminoácido seleccionado de Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg y Trp; o
b) un residuo dipeptídico seleccionado de:
CO-Phe-Lys-NH,
CO-Val-Ala-NH,
CO-Val-Lys-NH,
CO-Ala-Lys-NH,
CO-Val-Cit-NH,
CO-Phe-Cit-NH,
CO-Leu-Cit-NH,
CO-Ile-Cit-NH,
CO-Phe-Arg-NH, y
CO-Trp-Cit-NH; o
c) un residuo tripeptídico.
11. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde RLL1 es de fórmula Illa' y: a) es de 0 a 3; y/o
b) b es de 0 a 12; y/o
c) d es de 0 a 3.
12. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde RLL1 es de fórmula IIIa' y a es 0, c es 1 y d es 2, y b es de 0 a 8 opcionalmente en donde b es 0, 4 u 8.
13. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde RLL2 es de fórmula IIIa', y Qx es:
a) un residuo de aminoácido seleccionado de Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg y Trp; o
b) un residuo dipeptídico seleccionado de:
CO-Phe-Lys-NH,
CO-Val-Ala-NH,
CO-Val-Lys-NH,
CO-Ala-Lys-NH,
CO-Val-Cit-NH,
CO-Phe-Cit-NH,
CO-Leu-Cit-NH,
CO-Ile-Cit-NH,
CO-Phe-Arg-NH y
CO-Trp-Cit-NH; o
c) un residuo tripeptídico.
14. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde RLL2 es de fórmula IIIa' y: a) es de 0 a 3; y/o
b) b es de 0 a 12; y/o
c) d es de 0 a 3.
15. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde RLL2 es de fórmula IIIa' y a es 0, c es 1 y d es 2, y b es de 0 a 8.
16. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula Id:
Figure imgf000073_0001
donde m es un número entero de 2 a 8.
17. El conjugado de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde:
a) el anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4; y opcionalmente
b) el anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada es un anticuerpo humano; o
c) el anticuerpo modificado que tiene al menos un sitio de conjugación libre en cada cadena pesada es un anticuerpo humanizado.
18. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 17:
a) en donde el anticuerpo modificado se ha modificado de modo que los residuos de cisteína intercatenarios nativos se han sustituido por residuos de aminoácidos que carecen de grupos tiol; y/o
b) en donde el anticuerpo modificado comprende al menos una sustitución adicional en cada cadena pesada de un residuo de aminoácido, en donde el aminoácido adicionalmente sustituido es una cisteína o un aminoácido no natural; y/o
c) en donde el anticuerpo modificado se ha modificado para tener al menos una sustitución adicional en cada cadena pesada de un aminoácido en donde la posición que está sustituida se selecciona de las expuestas a continuación:
Figure imgf000074_0002
19. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para su uso en terapia.
20. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y un diluyente, un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables.
21. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa en un sujeto, opcionalmente en donde la enfermedad tratada es cáncer.
22. Un compuesto de fórmula II:
Figure imgf000074_0001
y sales y solvatos del mismo,
en donde D, R2, R6, R7, R9, R11a, Y, R", Y', D', R6', R7', R9', R11a' y R12 (incluyendo la presencia o ausencia de dobles enlaces entre C2 y C3 y C2' y C3' respectivamente) son como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; RL1 y RL2 son engarces para conexión a un agente de unión a células, que son independientemente de fórmula IIIa:
Figure imgf000075_0001
donde Q y X son como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 10 a 12 y 13 a 15 y GL se selecciona de:
Figure imgf000075_0002
continuación
Figure imgf000076_0002
donde Ar representa un grupo arileno C5-6, por ejemplo fenileno, y X representa alquilo C1-4.
23. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el compuesto es de fórmula Id':
Figure imgf000076_0001
donde m es un número entero de 2 a 8.
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