ES2998500T3

ES2998500T3 - Substituted quinolinonyl piperazine compounds useful as t cell activators

Info

Publication number: ES2998500T3
Application number: ES20845303T
Authority: ES
Inventors: Louis CHUPAK; Richard Olson; Upender Velaparthi; Xiaofan Zheng; Robert Gentles; Min Ding; Jayakumar Warrier
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2025-02-20
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: KR20220119456A; IL294269A; EP4081513A1; CA3162992A1; JP7653441B2; CN115103841A; AU2020414688A1; EP4081513B1; MX2022007369A; BR112022012220A2; US20230061608A1; JP2023508055A; WO2021133748A1; CN115103841B

Abstract

Se describen compuestos de Fórmula (I) o una sal de los mismos, en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6 y m se definen en el presente documento. También se describen métodos para utilizar dichos compuestos para inhibir la actividad de una o ambas de las enzimas diacilglicerol quinasa alfa (DGKα) y diacilglicerol quinasa zeta (DGKξ), y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos. Estos compuestos son útiles en el tratamiento de infecciones virales y trastornos proliferativos, como el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de quinolinonilo piperazina sustituidos útiles como activadores de linfocitos T

Campo de la invención

La presente invención generalmente se refiere a compuestos de quinolinonilo sustituidos que activan los linfocitos T, promueven la proliferación de linfocitos T y/o exhiben actividad antitumoral. En el presente documento se proporcionan compuestos de quinolinonilo sustituidos, composiciones que comprenden tales compuestos y métodos para su uso. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de acuerdo con la invención que son útiles para el tratamiento de trastornos proliferativos, tales como el cáncer e infecciones víricas.

Antecedentes de la invención

Los cánceres humanos albergan numerosas alteraciones genéticas y epigenéticas, generando neoantígenos potencialmente reconocibles por el sistema inmunitario (Sjoblomet al.(2006) Science 314:268-74). El sistema inmunitario adaptativo, compuesto por los linfocitos T y B, tiene un poderoso potencial anticancerígeno, con una amplia capacidad y exquisita especificidad para responder a diversos antígenos tumorales. Además, el sistema inmunitario demuestra una plasticidad considerable y un componente de memoria. El aprovechamiento exitoso de todos estos atributos del sistema inmunitario adaptativo haría que la inmunoterapia fuera única entre todas las realizaciónes de tratamiento del cáncer. Sin embargo, aunque se observa una respuesta inmunitaria endógena al cáncer en modelos preclínicos y pacientes, esta respuesta es ineficaz y los cánceres establecidos se consideran "propios" y tolerados por el sistema inmunitario. Contribuyendo a este estado de tolerancia, los tumores pueden explotar varios mecanismos para subvertir activamente la inmunidad antitumoral Estos mecanismos incluyen la señalización de linfocitos T disfuncionales (Mizoguchiet al.,(1992) Science 258:1795-98), células reguladoras supresoras (Facciabeneet al.,(2012) Cancer Res. 72:2162-71), y la cooptación de "puntos de control inmunitarios" endógenos, que sirven para modular a la baja la intensidad de las respuestas inmunitarias adaptativas y proteger los tejidos normales del daño colateral, por parte de los tumores para evadir la destrucción inmunitaria (Topalianet al.,(2012) Curr. Opin. Immunol.

24:1-6; Mellmanet al.(2011) Nature 480:480-489).

Las diacilglicerol cinasas (DGK, por sus siglas en inglés) son lípidos cinasas que median la conversión de diacilglicerol en ácido fosfatídico, lo que termina con las funciones de los linfocitos T propagadas a través de la vía de señalización de TCR. Por lo tanto, las DGK sirven como puntos de control intracelulares y se espera que la inhibición de las DGK mejore las vías de señalización de los linfocitos T y la activación de los linfocitos T. La evidencia de respaldo incluye modelos de ratón con un gen desactivado ya sea de DGKa o DGK^ que muestran un fenotipo de linfocitos T hiperreactivos y una actividad inmunológica antitumoral mejorada (Riese M.J.et al.,Journal of Biological Chemistry, (2011) 7:5254-5265; Zha Yet al.,Nature Immunology, (2006) 12:1343; Olenchock B.A.et al.,(2006) 11:1174-81). Además, se observó que los linfocitos que se infiltran en el tumor, aislados de pacientes con carcinoma de células renales humanas sobreexpresaban DGKa, lo que dio como resultado la inhibición de la función de los linfocitos T (Prinz, P.U.et al.,J Immunology (2012) 12:5990-6000). Por lo tanto, DGKa y DGK^ se consideran objetivos para la inmunoterapia contra el cáncer (Riese M.J.et al.,Front Cell Dev Biol. (2016) 4: 108; Chen, S.S.et al.,Front Cell Dev Biol. (2016) 4: 130; Avila-Flores, A.et al.,Immunology and Cell Biology (2017) 95: 549-563; Noessner, E., Front Cell Dev Biol. (2017) 5: 16; Krishna, S.,et al.,Front Immunology (2013) 4:178, Jing, W.et al.,Cancer Research (2017) 77: 5676-5686.

Sigue existiendo la necesidad de compuestos útiles como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGK^. Además, sigue existiendo la necesidad de compuestos útiles como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGK^ que tengan selectividad sobre otras diacilglicerol cinasas, proteínas cinasas y/u otras lípidos cinasas.

En consecuencia, un agente que es seguro y eficaz para restaurar la activación de los linfocitos T, reducir el umbral del antígeno, mejorar la funcionalidad antitumoral y/o superar los efectos supresores de uno o más puntos de control inmunitarios endógenos, tales como PD-1, LAG-3 y TGFp, sería una adición importante para el tratamiento de pacientes con trastornos proliferativos, tales como el cáncer, así como infecciones víricas.

Sumario de la invención

Los solicitantes han encontrado compuestos que tienen actividad como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGK^. Además, los solicitantes han encontrado compuestos que tienen actividad como inhibidores de uno o ambos de DGKa y DGK^ y tienen selectividad sobre otras diacilglicerol cinasas, proteínas cinasas y/u otras lípidos cinasas. Estos compuestos se proporcionan para ser útiles como productos farmacéuticos con valores deseables de estabilidad, biodisponibilidad, índice terapéutico y toxicidad que son importantes para su comerciabilidad como fármacos.

La presente invención proporciona compuestos de quinolinonilo sustituidos de la fórmula (I), que son útiles como inhibidores de DGKa, DGK^, o tanto DGKa como DGK^ incluidas sus sales.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona compuestos para su uso en un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad de DGKa, DGK^, o tanto DGKa como DGK^, el método que comprende administrar a un paciente mamífero un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se describen (pero no se reivindican) procesos y compuestos intermediarios para preparar los compuestos de la fórmula (I) y/o sus sales.

La presente invención también proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.

La presente invención también proporciona el uso de los compuestos de la fórmula (I) y/o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos proliferativos, tales como el cáncer e infecciones víricas.

Los compuestos de la fórmula (I) y las composiciones que comprenden los compuestos de la fórmula (I) pueden usarse para tratar, prevenir, o curar infecciones víricas y diversos trastornos proliferativos, tales como el cáncer. Las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos son útiles para tratar, prevenir o retrasar la progresión de enfermedades o trastornos en una variedad de áreas terapéuticas, tales como las infecciones víricas y el cáncer.

Estas y otras características de la invención se expondrán en forma ampliada a medida que continúe la descripción.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Descripción detallada de la invención

El primer aspecto de la presente invención proporciona al menos un compuesto de la fórmula (I):

o una sal del mismo, en donde:

R1 es F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R-u cicloalquilo de C<3.4>sustituido con cero a 4 R-ia, alcoxi de C<1-3>, sustituido con cero a 4 Ría, -C(O)NRaRa, -NRaRa, -S(O)nRe o -P(O)ReRe;

cada Ría es independientemente F, Cl, -CN, -OH, -OCH<3>o -NRaRa;

cada Ra es independientemente H o alquilo de C<1-3>;

cada Re es independientemente cicloalquilo de C<3-4>o alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<1>a;

R<2>es H, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<2>a, alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 R<2>a, o cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 R<2>a;

cada R<2>a es independientemente F, Cl, -CN, -OH, -O(alquilo de C<1-2>), cicloalquilo de C<3-4>, alquenilo de C<3-4>o alquinilo de C<3-4>;

R<3>es H, F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>, fluoroalquilo de C<1-2>, cicloalquilo de C<3-4>, fluorocicloalquilo de C<3-4>, -NO<2>o piridinilo sustituido con cero a 2 R<3>a;

cada R<3>a es halo, -CN, alquilo de C<1-3>o alcoxi de C<1-3>;

R<4>es -CH<2>R<4>a, -CH<2>CH<2>R<4>a, -CH<2>CHR<4>aR<4>d, -CHR<4>aR<4>b o -CR<4>aR<4>bR<4>c;

R<4>a y R<4>b son independientemente:

(i) alquilo de C<1-6>sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -CN, -OH, -OCH<3>, -SCH<3>, fluoroalcoxi de C<1-3>, -NRaRa, -S(O)<2>Re o -NRaS (O)<2>Re;

(ii) cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, fenilo o heteroarilo, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -CN, -OH, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, hidroxialquilo de C<1-4>, -(CH<2>)<1-2>O(alquilo de C<1.3>), alcoxi de C<1.4>, -O(hidroxialquilo de C<1-4>), -O(CH)<1-3>O(alquilo de C<1.3>), fluoroalcoxi de C<1.3>, -O(CH)<1.3>NRcRc, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -C(O)(alquilo de C<1.4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1.4>), -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1-3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1>.

<4>), -P(O)(alquilo de ^<-3>)<2>, -S(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -O(CH<2>)<1-2>(cicloalquilo de C<3-6>), -O(CH<2>)<1-2>(morfolinilo), ciclopropilo, cianociclopropilo, metilazetidinilo, acetilazetidinilo, (terc-butoxicarbonil)azetidinilo, triazolilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiofenilo, metilpiperidinilo y Rd; o

(iii) alquilo de C<1-4>sustituido con un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, arilo y heteroarilo, tal grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1.6>, fluoroalquilo de C<1-3>, alcoxi de C<1.3>, fluoroalcoxi de C<1.3>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1.4>) y cicloalquilo de C<3-6>;

o R<4>a y R<4>b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un cicloalquilo de C<3-6>o un heterociclilo de 3 a 6 elementos, cada uno sustituido con cero a 3 Rf;

cada Rf es independientemente F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-3>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, o un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo de 3 a 6 elementos, fenilo, heteroarilo monocíclico y heteroarilo bicíclico, cada grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1.3>y -NRcRc;

R<4>c es alquilo de C<1.6>o cicloalquilo de C<3-6>, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -OH, alcoxi de C<1-2>, fluoroalcoxi de C<1-2>y -CN;

R4d es -OCH3;

cada Rc es independientemente H o alquilo de C<1-2>;

Rd es fenilo sustituido con cero a 1 sustituyente seleccionado de F, Cl, -CN, -CH<3>y -OCH<3>;

cada R<5>es independientemente F, Cl, -CN, -OH, alquilo de C<1-6>, sustituido con cero a 4 Rg, alcoxi de C<1-3>, sustituido con cero a 4 Rg, alquenilo de C<2-4>, sustituido con cero a 4 Rg, alquinilo de C<2-4>, sustituido con cero a 4 Rg, cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 Rg, fenilo sustituido con cero a 4 Rg, oxadiazolilo sustituido con cero a 3 Rg, piridinilo sustituido con cero a 4 Rg, -(CH<2>)<1-2>(heterociclilo sustituido con cero a 4 Rg), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)O(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcS(O)<2>(alquilo de C<1-4>), -C(O)(alquilo de C<1-4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1-4>), -C(O)O(cicloalquilo de C<3-4>), -C(O)NRaRa, o -C(O)NRa(cicloalquilo de C<3-4>), o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O;

cada Rg es independientemente F, Cl, -CN, -OH, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-3>, -O(CH<2>)<1-2>O(alquilo de C<1.2>), cicloalquilo de C<3-5>o -NRcRc;

cada R6 es H, F, Cl, -CN, -CH<3>, -CH<2>F, -CHF<2>, -CF<3>, o -OCH<3>;

m es cero, 1, 2 o 3; y

n es cero, 1 o 2.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde: R<1>es F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<1>a, ciclopropilo sustituido con cero a 3 R<1>a, alcoxi de C<1-3>sustituido con cero a 3 R<1>a, -C(O)NRaRa, -NRaRa, -S(O)nCH<3>, o -P(O)(C<h 3>)<2>; cada R<1>a es independientemente F, Cl o -CN; cada Ra es independientemente H o alquilo de C<1-3>; R<2>es H, alquilo de C<1-2>sustituido con cero a 2 R<2>a, o alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 2 R<2>a; cada R<2>a es independientemente F, Cl, -CN, -OH, -O(alquilo de C<1.2>), ciclopropilo, alquenilo de C<3-4>o alquinilo de C<3-4>; R<3>es H, F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-2>, fluoroalquilo de C<1-2>, cicloalquilo de C<3-4>, -NO<2>o piridinilo sustituido con cero a 2 R<3>a; R<4>a y R<4>b son independientemente: (i) alquilo de C<1-4>sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -CN, -OH, -OCH<3>, -SCH<3>, fluoroalcoxi de C<1.3>y -NRaRa; (ii) cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, fenilo o heteroarilo, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -CN, -OH, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, -CH<2>OH , -(CH<2>)<1-2>O(alquilo de C<1-2>), alcoxi de C<1.4>, -O(hidroxialquilo de C<1.4>), -O(CH)<1-2>O(alquilo de C<1-2>), fluoroalcoxi de C<1.3>, -<o>(<c>H)<1-2>NR<c>R<c>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -C(O)(alquilo de C<1.4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1.4>), -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1-3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1.4>), -P(O)(alquilo de C<1-2>)<2>, -S(O)<2>(alquilo de C<1-3>), -O(CH<2>)<1>-<2>(cicloalquilo de C<3-4>), -O(CH<2>)<1-2>(morfolinilo), ciclopropilo, cianociclopropilo, metilazetidinilo, acetilazetidinilo,(terc-butoxicarbonil)azetidinilo, triazolilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiofenilo, metilpiperidinilo, y Rd; o (iii) alquilo de C<1-3>sustituido con un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, fenilo y heteroarilo, tal grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-3>, fluoroalquilo de C<1-2>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-2>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1-3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1.4>) y cicloalquilo de C<3-4>; o R<4>a y R<4>b junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un cicloalquilo de C<3-6>o un heterociclilo de 3 a 6 elementos, cada uno sustituido con cero a 3 Rf; cada Rf es independientemente F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-4>, fluoroalquilo de C<1-2>, alcoxi de C<1>-<3>, fluoroalcoxi de C<1.2>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, o un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo de 3 a 6 elementos, fenilo, heteroarilo monocíclico y heteroarilo bicíclico, cada grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-4>, fluoroalquilo de C<1-2>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-2>y -NRcRc; R<4>c es alquilo de C<1-4>o cicloalquilo de C<3-6>, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -OH, alcoxi de C<1-2>, fluoroalcoxi de C<1-2>y -CN; cada R<5>es independientemente F, -CN, -OH, alquilo de C<1-5>sustituido con cero a 4 Rg, alcoxi de C<1-2>sustituido con cero a 3 Rg, alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 Rg, alquinilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 Rg, cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 Rg, fenilo sustituido con cero a 3 Rg, oxadiazolilo sustituido con cero a 3 Rg, piridinilo sustituido con cero a 3 Rg, -(CH<2>)<1-2>(heterociclilo sustituido con cero a 4 Rg), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)O(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcS(O)<2>(alquilo de C<1-4>), -C(O)(alquilo de C<1-4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1-4>), -C(O)O(cicloalquilo de C<3.4>), -C(O)NRaRa, o -C(O)NRa(cicloalquilo de C<3.4>), o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O; cada R6 es H, F o -CH<3>; y m es cero, 1, 2 o 3.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde: R<1>es F, -CN o -OCH<3>; R<2>es H, -CH<3>, -CH<2>CN, -CH<2>CH<2>F, o -CH<2>CH=CH<2>; R<3>es H, -CN, -CH<2>OH, -C(O)OCH<2>CH<3>, -NO<2>o piridinilo; R<4>es -CH<2>R<4>a o -CHR<4>aR<4>b; R<4>a es fenilo, naftalenilo o indolilo, cada uno sustituido con cero a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de F, -CH<3>, -CH<2>CH<3>y -OCH<3>; R<4>b es fenilo o fluorofenilo; cada R<5>es -CH<3>, o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O; y m es cero, 1 o 2.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<1>es F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<1>a, ciclopropilo sustituido con cero a 3 R<1>a, alcoxi de C<1-3>sustituido con cero a 3 R<1>a, -C(O)NRaRa, -NRaRa, -S(O)nCH<3>o -P(O)(CH<3>)<2>. En esta realización se incluyen compuestos en los que R<1>es F, Cl, Br, -CN, -CH<3>, -CHF<2>, -CF<3>, ciclopropilo o -OCH<3>. También se incluyen en esta realización compuestos en los que R<1>es F, -CN o -OCH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<2>es H, alquilo de C<1-2>sustituido con cero a 2 R<2>a, o alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 2 R<2>a. En esta realización se incluyen compuestos en los que R<2>es H, -CH<3>, -CH<2>CN, -CH<2>CH<2>F, o -CH<2>CH=CH<2>. También se incluyen en esta realización compuestos en los que R<2>es H, -CH<3>, -CH<2>CN o -CH<2>CH<2>F.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<3>es H, F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-2>, fluoroalquilo de C<1-2>, cicloalquilo de C<3-4>, -NO<2>, o piridinilo sustituido con cero a 2 R<3>a. En esta realización se incluyen compuestos en los que R<3>es H, -CN, -CH<2>OH, -C(O)OCH<2>CH<3>, -NO<2>o piridinilo. También se incluyen en esta realización compuestos en los que R<3>es H, -CN, -CH<2>OH, o -NO<2>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<4>es -CH<2>R<4>a o -CH<2>CH<2>R<4>a. En esta realización se incluyen compuestos en los que R<4>es -CH<2>R<4>a o -CD<2>R<4>a.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<4>es -CH<2>R<4>a. En esta realización se incluyen compuestos en los que R<4>es -CD<2>R<4>a.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<4>es -CHR<4>aR<4>b o -CR4aR4bR4b.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<4>es -CHR<4>aR<4>b.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<4>es -CH<2>R<4>a o -CHR4aR4b.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde m es 1, 2 o 3; y cada R<5>es independientemente F, -CN, -OH, alquilo de C<1-5>sustituido con cero a 4 Rg, alcoxi de C<1-2>sustituido con cero a 3 Rg, alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 Rg, alquinilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 Rg, cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 Rg, fenilo sustituido con cero a 3 Rg, oxadiazolilo sustituido con cero a 3 Rg, piridinilo sustituido con cero a 3 Rg, -(CH<2>)<1-2>(heterociclilo sustituido con cero a 4 Rg), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)(C<1-4>alquilo), -(CH<2>)<1>-<2>NRcC(O)O(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcS(O)<2>(alquilo de C<1-4>), -C(O)(alquilo de C<1-4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1>-<4>), -C(O)O(cicloalquilo de C<3-4>), -C(O)NRaRa, o -C(O)NRa(cicloalquilo de C<3-4>), o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O. En esta realización se incluyen compuestos en los que cada R<5>es independientemente F, -CN, -OH, alquilo de C<1-2>sustituido con cero a 3 Rg, alcoxi de C<1-2>sustituido con cero a 3 Rg, cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 2 Rg, -C(O)(alquilo de C<1-4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1-2>), o -C(O)NRaRa, o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O. También se incluyen en esta realización compuestos en los que cada R<5>es -CH<3>, o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde m es 2 y los dos R<5>están unidos al mismo átomo de carbono para formar =O.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde m es cero.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde m es 1, 2 o 3. En esta realización se incluyen compuestos en los que m es 1 o 2. También se incluyen en esta realización compuestos en los que m es 1.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde m es 2 o 3. En esta realización se incluyen compuestos en los que m es 2.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde m es 3.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo que tiene la estructura de la fórmula (III):

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo; en donde R<5>a es -CH<3>y R<5>c es -CH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo; en donde R<5>a es -CH<3>y R<5>c es -CH<2>CH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo, en donde R<5>a es -CH<2>CH<3>y R<5>c es -CH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo, en donde R<5>a es -CH<2>CH<3>y R<5>c es -CH<2>CH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo; en donde R<5>a es -CH<3>y R<5>c es -CH<2>OH.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo; en donde R<5>a es -CH<3>y R<5>c es -CH<2>OCH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o un compuesto de la fórmula (III) o una sal del mismo que tiene la estructura:

o

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R4 es: (i)

(ii)

o

(iii)

En esta realización se incluyen compuestos en los que Ri es Br, -CN o -OCH<3>; y R<2>es -CH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde R<4>es:

En esta realización se incluyen compuestos en los que R<1>es H, Br, -CN o -OCH<3>; y R<2>es -CH<3>. También se incluyen en esta realización compuestos en los que R<1>es -CN; y R<2>es -CH<3>.

En una realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo, en donde tal compuesto es: 6-fluoro-4-{4-[(3-fluorofenil)metil]piperazin-1-il}-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (1);

6-fluoro-4-{4-[(3-fluoro-5-metilfenil)metil]piperazin-1-il}-1 -metil-3-(piridin-4-il)-1,2-dihidroquinolin-2-ona (2);

4-(4-((1H-indol-4-il)metil)piperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (3);

4-{4-[(1-etil-1H-indol-4-il)metil]piperazin-1-il}-6-fluoro-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (4);

4-(4-bencil-3-oxopiperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (5);

4-[(2S,SR)-4-[bis(4-fluorofenil)metil]-2,5-dimetilpiperazin-1-il]-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-6-carbonitrilo (7); 6-metoxi-1-metil-4-{4-[(naftalen-1-il)metil]piperazin-1-il}-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (8).

Definiciones

Las características y ventajas de la invención pueden ser comprendidas más fácilmente por los expertos en la materia al leer la siguiente descripción detallada. Debe apreciarse que ciertas características de la invención que, por razones de claridad, se describen arriba y abajo en el contexto de realizaciones separadas, también pueden combinarse para formar una sola realización. A la inversa, varias características de la invención que, por razones de brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden combinarse para formar subcombinaciones de las mismas. Las realizaciones identificadas en el presente documento como ejemplares o preferidas pretenden ser ilustrativas y no limitativas.

A menos que se indique específicamente de otra manera en este documento, las referencias hechas en singular también pueden incluir el plural. Por ejemplo, "un" y "una" pueden referirse a uno, o uno o más.

Como se usa en el presente documento, la frase "compuestos y/o sales de los mismos" se refiere a al menos un compuesto, al menos una sal de los compuestos o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los compuestos de la fórmula (I) y/o sus sales incluyen un compuesto de la fórmula (I); dos compuestos de la fórmula (I); una sal de un compuesto de la fórmula (I); un compuesto de la fórmula (I) y una o más sales del compuesto de la fórmula (I); y dos o más sales de un compuesto de la fórmula (I).

A menos que se indique de otra manera, se supone que cualquier átomo con valencias insatisfechas tiene suficientes átomos de hidrógeno para satisfacer las valencias.

A continuación se enumeran las definiciones de varios términos usados para describir la presente invención. Estas definiciones se aplican a los términos tal como se usan a lo largo de la especificación (a menos que estén limitados de otro modo en casos específicos), ya sea individualmente o como parte de un grupo más grande.

A lo largo de la descripción, los grupos y sustituyentes de los mismos pueden ser elegidos por un experto en la materia para proporcionar porciones y compuestos estables.

De acuerdo con una convención usada en la técnica,

se usa en las fórmulas estructurales del presente documento para representar el enlace que es el punto de unión de la porción o sustituyente a la estructura del núcleo o la cadena principal.

Los términos "halo" y "halógeno", como se usan en este documento, se refieren a F, Cl, Br e I.

El término “ciano” se refiere al grupo -CN.

El término "amino" se refiere al grupo NH<2>.

El término "oxo" se refiere al grupo =O.

El término "alquilo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a grupos hidrocarbonados alifáticos saturados de cadena lineal y ramificada que contienen, por ejemplo, de 1 a 12 átomos de carbono, de 1 a 6 átomos de carbono y de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, entre otros, metilo (Me), etilo (Et), propilo (por ejemplo, n-propilo e i-propilo), butilo (por ejemplo, n-butilo, i-butilo, sec-butilo, y t-butilo) y pentilo (por ejemplo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo), n-hexilo, 2 metilpentilo, 2-etilbutilo, 3-metilpentilo y 4-metilpentilo. Cuando los números aparecen en un subíndice después del símbolo "C", el subíndice define con mayor especificidad el número de átomos de carbono que puede contener un grupo en particular. Por ejemplo, “alquilo de C<1-4>” denota grupos alquilo de cadena lineal y ramificada con uno a cuatro átomos de carbono.

El término "fluoroalquilo", como se usa en el presente documento, está propuesto para incluir grupos hidrocarbonados alifáticos saturados tanto de cadena ramificada como de cadena lineal sustituidos con uno o más átomos de flúor. Por ejemplo, "fluoroalquilo de C<1-4>" está propuesto para incluir grupos alquilo de C<1>, C<2>, C<3>y C<4>sustituidos con uno o más átomos de flúor. Los ejemplos representativos de grupos fluoroalquilo incluyen, entre otros, -CF<3>y CH<2>CF<3>.

El término "hidroxialquilo" incluye grupos alquilo saturados tanto de cadena lineal como ramificada sustituidos con uno o más grupos hidroxilo. Por ejemplo, "hidroxialquilo" incluye -CH<2>OH, -CH<2>CH<2>OH e hidroxialquilo de C<1-4>.

El término "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada que contiene de 2 a 12 átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. Tales grupos ejemplares incluyen etenilo o alilo. Por ejemplo, "alquenilo de C<2-6>" indica grupos alquenilo de cadena lineal y ramificada con dos a seis átomos de carbono. El término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada que contiene de 2 a 12 átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos de tales grupos incluyen etinilo. Por ejemplo, "alquinilo de C<2-6>" indica grupos alquinilo de cadena lineal y ramificada con dos a seis átomos de carbono. El término "cicloalquilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo derivado de una molécula de hidrocarburo monocíclico o policíclico no aromático mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono del anillo saturado. Los ejemplos representativos de grupos cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Cuando aparecen números en un subíndice después del símbolo "C", el subíndice define con más especificidad el número de átomos de carbono que puede contener un grupo cicloalquilo en particular. Por ejemplo, “cicloalquilo de metía C<3-6>” denota grupos cicloalquilo con tres a seis átomos de carbono.

El término "fluorocicloalquilo", como se usa en el presente documento, está propuesto para incluir un grupo cicloalquilo sustituido con uno o más átomos de flúor.

El término "alcoxi", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo unido a la porción molecular principal a través de un átomo de oxígeno, por ejemplo, un grupo metoxi (-OCH<3>). Por ejemplo, “alcoxi de C<1-3>” denota grupos alcoxi con uno a tres átomos de carbono.

Los términos "fluoroalcoxi" y "O(fluoroalquilo)" representan un grupo fluoroalquilo como se definió anteriormente unido a través de un enlace de oxígeno (-O-). Por ejemplo, “fluoroalcoxi de C<1-4>” está propuesto para incluir grupos fluoroalcoxi de C<1>, C<2>, C<3>y C<4>.

Los términos "carbociclo", "carbocíclico" o "carbociclilo" se pueden usar indistintamente y se refieren a grupos cíclicos que tienen al menos un anillo no aromático saturado o parcialmente saturado, en donde todos los átomos de todos los anillos son carbono. El anillo de carbociclilo puede no estar sustituido o puede contener uno o más sustituyentes según lo permita la valencia. Así, el término incluye anillos no aromáticos tales como, por ejemplo, anillos cicloalquilo, cicloalquenilo y cicloalquinilo. Los ejemplos de grupos carbociclilo bicíclicos incluyen indanilo, indenilo, dihidronaftenilo, tetrahidronaftenilo, hexahidronaftenilo, octahidronaftenilo, decahidronaftalenilo, bicicloheptanilo, biciclooctanilo y biciclononanilo.

El término "arilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de átomos derivados de una molécula que contiene anillo(s) aromático(s) mediante la eliminación de un hidrógeno que está unido al(a los) anillo(s) aromático(s). Los ejemplos representativos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo y naftilo. El anillo de arilo puede no estar sustituido o puede contener uno o más sustituyentes según lo permita la valencia.

El término "bencilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo metilo en el que uno de los átomos de hidrógeno se reemplaza por un grupo fenilo. El anillo de fenilo puede no estar sustituido o puede contener uno o más sustituyentes según lo permita la valencia.

El término "heteroátomo" se refiere al oxígeno (O), azufre (S) y nitrógeno (N).

Los términos "heterociclo", "heterocíclico" o "heterociclilo" se pueden usar indistintamente y se refieren a grupos cíclicos que tienen al menos un anillo no aromático saturado o parcialmente saturado y en donde uno o más de los anillos tienen al menos un heteroátomo (O, S o N), tal anillo que contiene heteroátomos tiene preferentemente de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y/o N. El anillo de tal grupo que contiene un heteroátomo puede contener uno o dos átomos de oxígeno o azufre y/o de uno a cuatro átomos de nitrógeno siempre que el número total de heteroátomos en cada anillo sea de cuatro o menos, y además siempre que el anillo contenga al menos un átomo de carbono. Los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y los átomos de nitrógeno pueden cuaternizarse opcionalmente. El grupo heterociclo puede estar unido a cualquier átomo de carbono o nitrógeno disponible. El anillo de heterociclo puede no estar sustituido o puede contener uno o más sustituyentes según lo permita la valencia.

Los grupos heterocíclicos monocíclicos ejemplares incluyen pirrolidinilo, imidazolinilo, oxazolidinilo, isoxazolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, tetrahidrofuranilo, piperidinilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolodinilo, 2-oxoazepinilo, azepinilo, 4-piperidonilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, tiamorfolinilo sulfona, 1,3-dioxolano, tetrahidro-1,1 -dioxotienilo, dihidroisoindolilo, y tetrahidroquinolinilo.

El término "heteroarilo" se refiere a grupos monocíclicos de 5 o 6 elementos aromáticos sustituidos y no sustituidos y grupos bicíclicos de 9 o 10 elementos que tienen al menos un heteroátomo (O, S o N) en al menos uno de los anillos, tal anillo que contiene heteroátomos preferentemente con 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y/o N. Cada anillo del grupo heteroarilo que contiene un heteroátomo puede contener uno o dos átomos de oxígeno o azufre y/o de uno a cuatro átomos de nitrógeno siempre que el número total de heteroátomos en cada anillo sea cuatro o menos y cada anillo tenga al menos un átomo de carbono. Los anillos fusionados que completan el grupo bicíclico son aromáticos y pueden contener solo átomos de carbono. Los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y los átomos de nitrógeno pueden cuaternizarse opcionalmente. Los grupos heteroarilo bicíclicos deben incluir solo anillos aromáticos. El grupo heteroarilo puede estar unido a cualquier átomo de carbono o nitrógeno disponible de cualquier anillo. El sistema de anillo de heteroarilo puede no estar sustituido o puede contener uno o más sustituyentes.

Los ejemplos de grupos heteroarilo monocíclicos incluyen pirrolilo, pirazolilo, pirazolinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, isotiazolilo, furanilo, tiofenilo, oxadiazolilo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo y triazinilo.

Los ejemplos de grupos heteroarilo bicíclicos incluyen indolilo, benzotiazolilo, benzodioxolilo, benzoxazolilo, benzotienilo, quinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzopiranilo, indolizinilo, benzofuranilo, cromonilo, cumarinilo, benzopiranilo, cinolinilo, quinoxalinilo, indazolilo y pirrolopiridilo.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.

Los compuestos de la fórmula (I) pueden formar sales que también están dentro del alcance de esta invención. A menos que se indique de otra manera, se entiende que la referencia a un compuesto de la invención incluye la referencia a una o más de sus sales. El término “sal(es)” denota sales ácidas y/o básicas formadas con bases y ácidos inorgánicos y/u orgánicos. Además, el término “sal(es) puede incluir iones dipolares (sales internas), por ejemplo, cuando un compuesto de la fórmula (I) contiene una porción básica, tal como una amina o un anillo de piridina o imidazol, y una porción ácida, tal como un ácido carboxílico. Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente aceptables), tales como, por ejemplo, sales de aminas y metales aceptables en las que el catión no contribuye significativamente a la toxicidad o actividad biológica de la sal. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles, por ejemplo, en etapas de aislamiento o purificación que pueden emplearse durante la preparación y, por lo tanto, se contemplan dentro del alcance de la invención. Las sales de los compuestos de la fórmula (I) se pueden formar, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula (I) con una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el que precipita la sal o en un medio acuoso seguido de liofilización.

Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen los acetatos (tales como los formados con ácido acético o ácido trihaloacético, por ejemplo, ácido trifluoroacético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforatos, alcanforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, clorhidratos (formados con ácido clorhídrico), bromhidratos (formados con bromuro de hidrógeno), yodhidratos, maleatos (formados con ácido maleico), 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, metanosulfonatos (formados con ácido metanosulfónico), 2-naftalenosulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (tales como los formados con ácido sulfúrico), sulfonatos (tales como los mencionados aquí), tartratos, tiocianatos, toluenosulfonatos tales como tosilatos, undecanoatos y similares.

Los ejemplos de sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, litio y potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como las sales de calcio y magnesio; las sales de bario, zinc y aluminio; sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) tales como trialquilaminas como trietilamina, procaína, dibencilamina, N-bencil-p-fenetilamina, 1-efenamina, N,N'-dibenciletilendiamina, deshidroabietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, diciclohexilamina o aminas y sales farmacéuticamente aceptables similares con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. Los grupos básicos que contienen nitrógeno se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo inferior (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), sulfatos de dialquilo (por ejemplo, sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo), haluros de cadena larga (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo), haluros de aralquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo) y otros. Las sales preferidas incluyen sales de monoclorhidrato, hidrogenosulfato, metanosulfonato, fosfato o nitrato.

Los compuestos de la fórmula (I) se pueden proporcionar como sólidos amorfos o sólidos cristalinos. Puede emplearse la liofilización para proporcionar los compuestos de la fórmula (I) como un sólido.

Debe entenderse además que los solvatos (por ejemplo, los hidratos) de los compuestos de la fórmula (I) también están dentro del alcance de la presente invención. El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto de la fórmula (I) con una o más moléculas de disolvente, ya sean orgánicas o inorgánicas. Esta asociación física incluye enlaces de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo, cuando se incorporan una o más moléculas de disolvente en la red cristalina del sólido cristalino. “Solvato” abarca tanto la fase de solución como los solvatos aislables. Los solvatos ejemplares incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos, isopropanolatos, solvatos de acetonitrilo y solvatos de acetato de etilo. Los métodos de solvatación ya son conocidos en la técnica.

Además, los compuestos de la fórmula (I), con posterioridad a su preparación, pueden aislarse y purificarse para obtener una composición que contenga una cantidad en peso igual o superior al 99 % de un compuesto de la fórmula (I) (“sustancialmente puro”), que a continuación se usa o formula como se describe en este documento. Tales compuestos "sustancialmente puros" de la fórmula (I) también se contemplan aquí como parte de la presente invención.

"Compuesto estable" y "estructura estable" se entiende que indican un compuesto que es lo suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza de una mezcla de reacción y la formulación en un agente terapéutico eficaz. La presente invención está propuesta para incorporar compuestos estables.

“Cantidad terapéuticamente efectiva” está propuesta para incluir una cantidad de un compuesto de la presente invención solo o una cantidad de la combinación de compuestos reivindicados o una cantidad de un compuesto de la presente invención en combinación con otros principios activos efectivos para actuar como inhibidor de DGKa y/o DGK^, o eficaz para tratar o prevenir infecciones víricas y trastornos proliferativos, tales como el cáncer.

Como se usa aquí, "tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de un estado de enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que el estado de enfermedad ocurra en un mamífero, en particular, cuando tal el mamífero está predispuesto al estado de enfermedad pero aún no se le ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir el estado de enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y/o (c) aliviar el estado de enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado de enfermedad.

Se pretende que los compuestos de la presente invención incluyan todos los isótopos de átomos que se encuentran en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferente número de masa. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio (D) y tritio (T). Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos de la invención marcados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica o mediante procesos análogos a los descritos aquí, usando un reactivo marcado isotópicamente en lugar del reactivo no marcado que se emplea de otro modo.

Los compuestos de acuerdo con la fórmula (I) y/o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden administrarse por cualquier medio adecuado para la afección a tratar, que puede depender de la necesidad de un tratamiento específico del sitio o de la cantidad de compuesto de la fórmula (I) que se va a administrar.

También se incluye dentro de esta invención una clase de composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la fórmula (I) y/o sus sales farmacéuticamente aceptables; y uno o más portadores y/o diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos (denominados colectivamente en el presente documento como materiales “portadores”) y, si se desea, otros principios activos. Los compuestos de la fórmula (I) pueden administrarse por cualquier vía adecuada, preferentemente en la forma de una composición farmacéutica adaptada a tal vía, y en una dosis eficaz para el tratamiento propuesto. Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral, por la mucosa o parenteral, incluidas las vías intravascular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular e intraesternal en formulaciones de unidades de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. Por ejemplo, el portador farmacéutico puede contener una mezcla de manitol o lactosa y celulosa microcristalina. La mezcla puede contener componentes adicionales, como un agente lubricante, por ejemplo, estearato de magnesio y un agente desintegrante tal como la crospovidona. La mezcla de portadores puede llenarse en una cápsula de gelatina o comprimirse como una tableta. La composición farmacéutica se puede administrar como una forma de dosificación oral o una infusión, por ejemplo.

Para la administración oral, la composición farmacéutica puede estar en la forma, por ejemplo, de una tableta, cápsula, cápsula líquida, suspensión o líquido. La composición farmacéutica se prepara preferentemente en la forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad particular del principio activo. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede proporcionar como una tableta o cápsula que comprende una cantidad del principio activo en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1000 mg, preferentemente de aproximadamente 0,25 a 250 mg, y más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 100 mg. Una dosis diaria adecuada para un humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la condición del paciente y otros factores, pero puede determinarse usando los métodos de rutina.

Cualquier composición farmacéutica contemplada en este documento, por ejemplo, puede administrarse por vía oral a través de cualquier preparación oral aceptable y adecuada. Los ejemplos de preparaciones orales incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas y oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras y blandas, cápsulas líquidas, jarabes y elixires. Las composiciones farmacéuticas destinadas a la administración oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para fabricar composiciones farmacéuticas destinadas a la administración oral. Con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente apetecibles, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener al menos un agente seleccionado de agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, emolientes, antioxidantes y agentes conservadores.

Se puede preparar una tableta, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un excipiente no tóxico farmacéuticamente aceptable adecuado para la fabricación de comprimidos. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como, por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio y fosfato de sodio; agentes de granulación y disgregación, tales como, por ejemplo, celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica, almidón de maíz y ácido algínico; agentes aglutinantes, tales como, por ejemplo, almidón, gelatina, polivinilpirrolidona y goma arábiga; y agentes lubricantes, tales como, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. Además, una tableta puede estar sin recubrir o recubrirse mediante técnicas conocidas para enmascarar el mal sabor de un fármaco de sabor desagradable o retrasar la desintegración y absorción del principio activo en el tracto gastrointestinal, manteniendo así los efectos del principio activo por más tiempo. Los materiales de enmascaramiento del sabor solubles en agua a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa. Los ejemplos de materiales de retardo de tiempo incluyen, pero no se limitan a, etilcelulosa y butirato y acetato de celulosa.

Las cápsulas de gelatina dura se pueden preparar, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal del mismo con al menos un diluyente sólido inerte, tal como, por ejemplo, carbonato de calcio; fosfato de calcio; y caolín.

Las cápsulas de gelatina blanda se pueden preparar, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un portador soluble en agua, tal como, por ejemplo, polietilenglicol; y al menos un medio oleoso, tal como por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida, y aceite de oliva.

Se puede preparar una suspensión acuosa, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un excipiente adecuado para la fabricación de una suspensión acuosa. Los ejemplos de excipientes adecuados para la fabricación de una suspensión acuosa incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes de suspensión, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, ácido algínico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; agentes dispersantes o humectantes, tales como, por ejemplo, un fosfátido natural, por ejemplo, lecitina; productos de condensación de óxido de alquileno con ácidos grasos, tales como por ejemplo estearato de polioxietileno; productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, tal como por ejemplo heptadecaetileno-oxicetanol; productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitol; y productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de polietilensorbitan. Una suspensión acuosa también puede contener al menos un conservandor, tal como, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo; al menos un agente colorante; al menos un agente saborizante; y/o al menos un agente edulcorante, incluidos, entre otros, la sacarosa, sacarina y aspartamo.

Las suspensiones oleosas se pueden preparar, por ejemplo, suspendiendo al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuete; aceite de oliva; aceite de sésamo; y aceite de coco; o en un aceite mineral, tal como por ejemplo parafina líquida. Una suspensión oleosa también puede contener al menos un agente espesante, tal como por ejemplo cera de abejas; parafina dura; y alcohol cetílico. Para proporcionar una suspensión oleosa apetecible, se puede añadir a la suspensión oleosa al menos uno de los agentes edulcorantes ya descritos anteriormente, y/o al menos un agente saborizante. Una suspensión oleosa puede contener además al menos un conservador, que incluye, entre otros, un antioxidante, tal como, por ejemplo, hidroxianisol butilado y alfa-tocoferol.

Los polvos y gránulos dispersables se pueden preparar, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un agente dispersante y/o humectante; al menos un agente de suspensión; y/o al menos un conservador. Los agentes dispersantes, humectantes y de suspensión adecuados son los ya descritos anteriormente. Los conservadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico. Además, los polvos y gránulos dispersables también pueden contener al menos un excipiente, incluidos, entre otros, por ejemplo, agentes edulcorantes; agentes saborizantes; y agentes colorantes.

Una emulsión de al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede prepararse, por ejemplo, como una emulsión de aceite en agua. La fase oleosa de las emulsiones que comprenden compuestos de la fórmula (I) puede estar constituida a partir de ingredientes conocidos de la manera conocida. La fase oleosa puede ser proporcionada por, pero no se limita a, por ejemplo, un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de oliva y aceite de cacahuete; un aceite mineral tal como, por ejemplo, parafina líquida; y mezclas de los mismos. Aunque la fase puede comprender solamente un emulsionante, puede comprender una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con una grasa y un aceite. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fosfátidos naturales, por ejemplo, lecitina de soja; ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, tales como, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán. Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizador. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el(los) emulsionante(s) con o sin estabilizador(es) forman la llamada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa forman la así llamada base de ungüento emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones de crema. Una emulsión también puede contener un agente edulcorante, un agente saborizante, un conservador y/o un antioxidante. Los emulsionantes y estabilizadores de emulsión adecuados para su uso en la formulación de la presente invención incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo, laurilsulfato de sodio, diestearato de glicerilo solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica.

Los compuestos de la fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos pueden administrarse, por ejemplo, también por vía intravenosa, subcutánea y/o intramuscular a través de cualquier forma inyectable farmacéuticamente aceptable y adecuada. Las formas inyectables ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, soluciones acuosas estériles que comprenden vehículos y disolventes aceptables, tales como, por ejemplo, agua, una solución de Ringer y una solución isotónica de cloruro de sodio; microemulsiones estériles de aceite en agua; y suspensiones acuosas u oleaginosas.

Las formulaciones para administración parenteral pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones inyectables estériles isotónicas acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles usando uno o más de los portadores o diluyentes mencionados para su uso en las formulaciones para administración oral o usando otros agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. Los compuestos pueden disolverse en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro de sodio, goma de tragacanto y/o diversas soluciones amortiguadoras. Otros adyuvantes y modos de administración son bien y conocidos y de manera amplia en la técnica farmacéutica. El principio activo también se puede administrar por inyección como una composición con portadores adecuados que incluyen una solución salina, dextrosa o agua, o con ciclodextrina (es decir, Captisol), solubilización con un codisolvente (es decir, propilenglicol) o solubilización micelar (es decir, Tween 80).

La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de sustancias inyectables.

Una microemulsión de aceite en agua inyectable estéril puede prepararse, por ejemplo, 1) disolviendo al menos un compuesto de la fórmula (I) en una fase oleosa, tal como, por ejemplo, una mezcla de aceite de soja y lecitina; 2) combinar la fase oleosa que contiene la fórmula (I) con una mezcla de agua y glicerol; y 3) procesar la combinación para formar una microemulsión.

Se puede preparar una suspensión acuosa u oleaginosa estéril de acuerdo con los métodos ya conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede preparar una solución o suspensión acuosa estéril con un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, tal como, por ejemplo, 1,3-butanodiol; y se puede preparar una suspensión oleaginosa estéril con un disolvente aceptable no tóxico estéril o un medio de suspensión, tal como, por ejemplo, aceites fijos estériles, por ejemplo, mono o diglicéridos sintéticos; y ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido oleico.

Los portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, entre otros, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS) tales como succinato de polietilenglicol 1000 d-alfa-tocoferol, tensioactivos usados en formas de dosificación farmacéuticas tales como Tweens, aceite de ricino polietoxilado tal como el tensioactivo CREMOPHOR (BASF) u otras matrices poliméricas similares, proteínas séricas, tales como la albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras tales como los fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato ácido de disodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las ciclodextrinas tales como alfa, beta y gamma-ciclodextrina, o derivados químicamente modificados tales como hidroxialquilciclodextrinas, incluyendo las 2 y 3-hidroxipropil-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados también se pueden usar ventajosamente para mejorar la administración de los compuestos de las fórmulas descritas aquí.

Los compuestos farmacéuticamente activos de esta invención pueden procesarse de acuerdo con los métodos convencionales de farmacia para producir agentes medicinales para administrar a pacientes, incluidos los seres humanos y otros mamíferos. Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, soluciones amortiguadoras, etc. Las tabletas y píldoras también pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entéricos. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Las cantidades de compuestos que se administran y el régimen de dosificación para tratar una enfermedad con los compuestos y/o composiciones de esta invención dependen de una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso, el sexo, la condición médica del sujeto, el tipo de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la vía y frecuencia de administración, y el compuesto particular empleado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera rutinaria usando los métodos estándar. Una dosis diaria de aproximadamente 0,001 a 100mg/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 0,0025 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y más preferentemente entre aproximadamente 0,005 y 10 mg/kg de peso corporal, puede ser apropiada. La dosis diaria se puede administrar en una a cuatro dosis por día. Otros programas de dosificación incluyen una dosis por semana y una dosis por ciclo de dos días.

Para fines terapéuticos, los compuestos activos de esta invención normalmente se combinan con uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración indicada. Si se administran por vía oral, los compuestos pueden mezclarse con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ésteres de alquilo de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma arábiga, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y/o alcohol polivinílico, y a continuación puden ser comprimidos o encapsulados para una administración conveniente. Tales cápsulas o tabletas pueden contener una formulación de liberación controlada que se puede proporcionar en una dispersión del compuesto activo en hidroxipropilmetilcelulosa.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos una de sus sales farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, un agente adicional seleccionado de cualquier portador, adyuvante y vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones alternativas de esta invención comprenden un compuesto de la fórmula (I) descrito en el presente documento, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Utilidad

Los compuestos de la fórmula (I) son útiles para el tratamiento del cáncer.

Puede usarse una preparación combinada de un compuesto de la fórmula (I), y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un estereoisómero del mismo o un tautómero del mismo, y agente(s) terapéutico(s) adicional(es) para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento y/o profilaxis de múltiples enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del objetivo de DGK en los linfocitos T.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) para su uso en un método para tratar a un paciente que padece de, o que es susceptible de padecer una afección médica que está asociada con la inhibición del objetivo de DGK en los linfocitos T. Se pueden tratar varias condiciones médicas. El método puede comprender administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un estereoisómero del mismo o un tautómero del mismo. Por ejemplo, los compuestos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar o prevenir infecciones víricas y enfermedades proliferativas tales como el cáncer.

Los compuestos de la fórmula (I) y las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la fórmula (I) son útiles para tratar o prevenir cualquier enfermedad o condición que esté asociada con la inhibición del objetivo de DGK en los linfocitos T. Estas pueden incluir infecciones víricas y de otro tipo (por ejemplo, infecciones cutáneas, infecciones GI, infecciones del tracto urinario, infecciones genitourinarias, infecciones sistémicas) y enfermedades proliferativas (por ejemplo, el cáncer). Los compuestos de la fórmula (I) y las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la fórmula (I) pueden administrarse a animales, preferentemente mamíferos (por ejemplo, animales domésticos, gatos, perros, ratones, ratas) y más preferentemente a los seres humanos. Se puede usar cualquier método de administración para administrar el compuesto o la composición farmacéutica al paciente. El compuesto de la fórmula (I) o la composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto de la fórmula (I) puede administrarse por vía oral. La fórmula (I) o la composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto de la fórmula (I) puede administrarse por vía parenteral.

Los compuestos de la fórmula (I) pueden inhibir la actividad de la diacilglicerol cinasa alfa y zeta (DGKa/Q. Por ejemplo, los compuestos de la fórmula (I) se pueden usar en un método para inhibir la actividad de DGKa y DGK^ en una célula o en un individuo que necesita la modulación de DGKa y DGK^ mediante la administración de una cantidad inhibidora de un compuesto de la fórmula (I) o una sal del mismo.

La presente invención proporciona además compuestos de la fórmula (I) para su uso en métodos para tratar enfermedades asociadas con la actividad o la expresión, incluida la actividad anormal y/o la sobreexpresión, de DGKa y DGK^ en un individuo (por ejemplo, un paciente) mediante la administración al individuo que necesita tal tratamiento de cantidad o dosis de una sustancia terapéuticamente eficaz de un compuesto de la fórmula (I) o una composición farmacéutica del mismo. Las enfermedades ejemplares pueden incluir cualquier enfermedad, trastorno o condición que esté directa o indirectamente relacionada con la expresión o actividad de la enzima DGKa y DGK^, tal como sobreexpresión o actividad anormal. Una enfermedad asociada con DGKa y DGK^ también puede incluir cualquier enfermedad, trastorno o condición que pueda prevenirse, mejorarse o curarse mediante la modulación de la actividad enzimática de DGKa y DGK^. Los ejemplos de enfermedades asociadas con DGKa y DGK^ incluyen el cáncer e infecciones víricas tales como la infección por VIH, la hepatitis B y la hepatitis C.

Los compuestos de la fórmula (I) pueden administrarse secuencialmente antes de la administración del agente inmunooncológico. El(los) compuesto(s) de la fórmula (I) puede(n) administrarse simultáneamente con el agente inmunooncológico. El(los) compuesto(s) de la fórmula (I) puede(n) administrarse secuencialmente después de la administración del agente inmuno-oncológico.

Los compuestos de la fórmula (I) se pueden co-formular con un agente inmuno-oncológico.

Los agentes de inmuno-oncología incluyen, por ejemplo, un fármaco de moléculas pequeñas, un anticuerpo u otra molécula biológica o pequeña. Los ejemplos de agentes inmuno-oncológicos biológicos incluyen, entre otros, las vacunas contra el cáncer, anticuerpos y citoquinas. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal puede estar humanizado o ser humano.

El agente de inmuno-oncología puede ser (i) un agonista de un receptor estimulador (que incluye un co-estimulador) o (ii) un antagonista de una señal inhibidora (que incluye una señal co-inhibidora) en los linfocitos T, ambos de los cuales dan como resultado la amplificación de las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno (a menudo denominados reguladores de puntos de control inmunitarios).

Algunas de las moléculas estimulantes e inhibidoras son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF). Una familia importante de ligandos unidos a la membrana que se unen a los receptores co-estimuladores o co inhibidores es la familia B7, que incluye B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) y B7-H6. Otra familia de ligandos unidos a la membrana que se unen a los receptores co-estimuladores o co-inhibidores es la familia de moléculas TNF que se unen a miembros afines de la familia de receptores TNF, que incluye CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137 (4-1BB), TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, linfotoxina a ip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR.

Las respuestas de los linfocitos T pueden estimularse mediante una combinación de un compuesto de la fórmula (I) y uno o más de (i) un antagonista de una proteína que inhibe la activación de los linfocitos T (por ejemplo, los inhibidores de los puntos de control inmunitarios) tales como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4, y (ii) un agonista de una proteína que estimula la activación de linfocitos T tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H.

Otros agentes que pueden combinarse con los compuestos de la fórmula (I) para el tratamiento del cáncer incluyen antagonistas de los receptores inhibidores en los linfocitos NK o los agonistas de los receptores activadores en los linfocitos NK. Por ejemplo, los compuestos de la fórmula (I) se pueden combinar con los antagonistas de KIR, tales como lirilumab.

Otros agentes más para terapias combinadas incluyen agentes que inhiben o agotan los macrófagos o monocitos, incluidos, entre otros, los antagonistas de CSF-1R tales como los anticuerpos antagonistas de CSF-1R, incluido el RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) o FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357).

Los compuestos de la fórmula (I) pueden usarse con uno o más agentes agonistas que ligan los receptores coestimuladores positivos, los agentes bloqueadores que atenúan la señalización a través de receptores inhibidores, antagonistas y uno o más agentes que aumentan sistémicamente la frecuencia de los linfocitos T antitumorales, agentes que superan distintas vías inmunosupresoras dentro del microambiente tumoral (por ejemplo, bloquean la participación del receptor inhibitorio (por ejemplo, interacciones de PD-L1/PD-1), agotan o inhiben las Treg (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal anti CD25 (por ejemplo, daclizumab) o mediante el agotamiento de microesferas de anti CD25ex vivo),inhiben las enzimas metabólicas tales como IDO, o revierten/previenen la anergia o el agotamiento de los linfocitos T) y agentes que desencadenan la activación inmunitaria innata y/o la inflamación en sitios tumorales.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de CTLA-4, tal como un anticuerpo antagonista de CTLA-4. Los anticuerpos de CTLA-4 adecuados incluyen, por ejemplo, YERVOY (ipilimumab) o tremelimumab.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de PD-1, tal como un anticuerpo antagonista de PD-1. Los anticuerpos de PD-1 adecuados incluyen, por ejemplo, OPDIVO (nivolumab), KEYTRUDA (pembrolizumab) o MEDI-0680 (AMP-514; WO2012/145493). El agente de inmuno-oncología también puede incluir pidilizumab (CT-011), aunque se ha cuestionado su especificidad para la unión a PD-1. Otro método para apuntar al receptor PD-1 es la proteína recombinante compuesta por el dominio extracelular de PD-L2 (B7-DC) fusionado con la porción Fc de IgG1, llamada AMP-224.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de PD-L1, tal como un anticuerpo antagonista de PD-L1. Los anticuerpos de PD-L1 adecuados incluyen, por ejemplo, MPDL3280A (RG7446; WO2010/077634), durvalumab (MEDI4736), BMS-936559 (WO2007/005874) y MSB0010718C (WO2013/79174).

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de LAG-3, tal como un anticuerpo del antagonista de LAG-3. Los anticuerpos de LAG3 adecuados incluyen, por ejemplo, BMS-986016 (WO10/19570, WO14/08218), o IMP-731 o IMP-321 (WO08/132601, WO09/44273).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de CD137 (4-1BB), tal como un anticuerpo agonista de CD137. Los anticuerpos de CD137 adecuados incluyen, por ejemplo, urelumab y PF-05082566 (WO12/32433).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de GITR, tal como un anticuerpo agonista de GITR. Los anticuerpos de GITR adecuados incluyen, por ejemplo, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO06/105021, WO09/009116) y MK-4166 (WO11/028683).

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de IDO. Los antagonistas de IDO adecuados incluyen, por ejemplo, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoximod, BMS-986205 o NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de OX40, tal como un anticuerpo agonista de OX40, Los anticuerpos de OX40 adecuados incluyen, por ejemplo, MEDI-6383 o MEDI-6469.

El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de OX40L, tal como un anticuerpo antagonista de OX40, Los antagonistas de OX40L adecuados incluyen, por ejemplo, RG-7888 (WO06/029879).

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de CD40, tal como un anticuerpo de CD40 agonista. El agente inmuno-oncológico puede ser un antagonista de CD40, tal como un anticuerpo antagonista de CD40, Los anticuerpos de CD40 adecuados incluyen, por ejemplo, lucatumumab o dacetuzumab.

El agente inmuno-oncológico puede ser un agonista de CD27, tal como un anticuerpo agonista de CD27. Los anticuerpos de CD27 adecuados incluyen, por ejemplo, varlilumab.

El agente inmuno-oncológico puede ser MGA271 (para B7H3) (WO11/109400).

La terapia de combinación está propuesta para abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, en una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una única forma de dosificación que tenga una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples formas de dosificación únicas para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de las membranas de las mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección intravenosa. La terapia combinada también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describió anteriormente en combinación adicional con otros principios biológicamente activos y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía o radioterapia). Cuando la terapia combinada comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado siempre que se logre un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento no farmacológico se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.

Como se usa en el presente documento, el término "célula" se refiere a una célula que estáin vitro, ex vivooin vivo.Una célulaex vivopuede ser parte de una muestra de tejido extirpada de un organismo tal como un mamífero. Una célulain vitropuede ser una célula en un cultivo celular. Una célulain vivopuede ser una célula que vive en un organismo tal como un mamífero.

Como se usa en el presente documento, el término "poner en contacto" se refiere a la unión de las porciones indicados en un sistemain vitroo un sistemain vivo.Por ejemplo, "poniendo en contacto" la enzima DGKa y DGK^ con un compuesto de la fórmula (I) incluye la administración de un compuesto de la presente invención a un individuo o paciente, como un ser humano, que tiene DGKa y DGK^, así como, por ejemplo, la introducción un compuesto de la fórmula (I) en una muestra que contiene una preparación celular o purificada que contiene DGKa y DGK^.

El término "inhibidor de DGKa y DGK^" se refiere a un agente capaz de inhibir la actividad de diacilglicerol cinasa alfa y/o diacilglicerol cinasa zeta (DGKa y DGKQ en linfocitos T que dan como resultado la estimulación de linfocitos T. El inhibidor de DGKa y DGK^ puede ser un inhibidor de DGKa y DGK^ reversible o irreversible. "Un inhibidor reversible de DGKa y DGK^" es un compuesto que inhibe reversiblemente la actividad enzimática de DGKa y DGK^ ya sea en el sitio catalítico o en un sitio no catalítico y "un inhibidor irreversible de DGKa y DGK^" es un compuesto que destruye irreversiblemente la actividad enzimática de DGKa y DGK^ al formar un enlace covalente con la enzima.

Los tipos de cánceres que pueden tratarse con el compuesto de la fórmula (I) incluyen, entre otros, cánceres de cerebro, cánceres de piel, cánceres de vejiga, cánceres de ovario, cánceres de mama, cánceres gástricos, cánceres de páncreas, cánceres de próstata, cánceres de colon, cánceres de sangre, cánceres de pulmón y cánceres de huesos. Los ejemplos de tales tipos de cáncer incluyen neuroblastoma, carcinoma de intestino tal como carcinoma de recto, carcinoma de colon, carcinoma de poliposis adenomatosa familiar y cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, carcinoma de esófago, carcinoma labial, carcinoma de laringe, carcinoma de hipofaringe, carcinoma de lengua, carcinoma de glándulas salivales, carcinoma gástrico, adenocarcinoma, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma renal, carcinoma de parénquima renal, carcinoma de ovario, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de cuerpo uterino, carcinoma de endometrio, carcinoma de corion, carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, carcinoma de testículo, carcinoma de mama, carcinoma urinario, melanoma, tumores cerebrales como glioblastoma, astrocitoma, meningioma, meduloblastoma y tumores neuroectodérmicos periféricos, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, leucemia linfática aguda (ALL), leucemia linfática crónica (CLL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma leucémico de linfocitos T del adulto, linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL), carcinoma hepatocelular, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma bronquial, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, mieloma múltiple, basalioma, teratoma, retinoblastoma, melanoma coroideo, seminoma, rabdomiosarcoma, craneofaringioma, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Ewing y plasmocitoma.

Uno o más agentes farmacéuticos o métodos de tratamiento adicionales como, por ejemplo, agentes antivíricos, quimioterapéuticos u otros agentes contra el cáncer, potenciadores inmunológicos, inmunosupresores, radiación, vacunas antitumorales y antivíricas, terapia con citoquinas (por ejemplo, IL2 y GM-CSF), y/o los inhibidores de tirosina cinasa se pueden usar opcionalmente en combinación con los compuestos de la fórmula (I) para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas a DGKa y DGK^. Los agentes pueden combinarse con los presentes compuestos en una sola forma de dosificación, o los agentes pueden administrarse simultánea o secuencialmente como formas de dosificación separadas.

Los agentes quimioterapéuticos u otros agentes anticancerígenos adecuados incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes (incluidos, entre otros, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos) como mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (CYTOXAN®), ifosfamida, melfalan, clorambucilo, pipobromano, trietilenmelamina, trietilentiofosforamina, busulfan, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida.

En el tratamiento del melanoma, los agentes adecuados para su uso en combinación con los compuestos de la fórmula (I) pueden incluir: dacarbazina (DTIC), opcionalmente, junto con otros fármacos de quimioterapia tales como carmustina (BCNU) y cisplatino; el "régimen de Dartmouth", que consiste en DTIC, BCNU, cisplatino y tamoxifeno; una combinación de cisplatino, vinblastina y DTIC, temozolomida o YERVOY™. Los compuestos de la fórmula (I) también pueden combinarse con fármacos de inmunoterapia, incluidas las citocinas tales como interferón alfa, interleucina 2 y factor de necrosis tumoral (TNF) en el tratamiento del melanoma.

Los compuestos de la fórmula (I) también se pueden usar en combinación con la terapia de vacunas en el tratamiento del melanoma. Las vacunas contra el melanoma son, en cierto modo, similares a las vacunas antivirus que se usan para prevenir enfermedades causadas por virus como la poliomielitis, el sarampión y las paperas. Se pueden inyectar células de melanoma debilitadas o partes de células de melanoma llamadas antígenos en un paciente para estimular el sistema inmunitario del cuerpo a fin de que destruya las células de melanoma.

Los melanomas que están confinados a los brazos o las piernas también pueden tratarse con una combinación de agentes que incluyen uno o más compuestos de la fórmula (I), usando una técnica de perfusión hipertérmica de elementos aislados. Este protocolo de tratamiento separa temporalmente la circulación de la extremidad afectada del resto del cuerpo e inyecta altas dosis de quimioterapia en la arteria que alimenta la extremidad, proporcionando así altas dosis al área del tumor sin exponer los órganos internos a estas dosis que de otro modo podrían causar efectos secundarios severos. Por lo general, el fluido se calienta a 38,9 °C a 40 °C. El melfalan es el fármaco más usado en este procedimiento de quimioterapia. Esto se puede administrar con otro agente llamado factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés).

Los agentes quimioterapéuticos u otros anticancerosos adecuados incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (incluidos, entre otros, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina desaminasa) tales como metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina.

Los agentes quimioterapéuticos u otros agentes anticancerígenos adecuados incluyen además, por ejemplo, ciertos productos naturales y sus derivados (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfoquinas y epipodofilotoxinas) tales como vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, ara-C, paclitaxel (Taxol), mitramicina, desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, interferones (especialmente IFN-a), etopósido y tenipósido.

Otros agentes citotóxicos incluyen navelbene, CPT-11, anastrozol, letazol, capecitabina, reloxafina y droloxafina.

También son adecuados los agentes citotóxicos tales como epidofilotoxina; una enzima antineoplásica; un inhibidor de topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino; modificadores de la respuesta biológica; inhibidores del crecimiento; agentes terapéuticos antihormonales; leucovorina; tegafur; y factores de crecimiento hematopoyéticos.

Otros agentes contra el cáncer incluyen terapias de anticuerpos como trastuzumab (HERCEPTIN®), anticuerpos contra moléculas coestimuladoras como CTLA-4, 4-1BB y PD-1, o anticuerpos contra citoquinas (IL-1O o TGF-p).

Otros agentes anticancerígenos también incluyen aquellos que bloquean la migración de células inmunitarias, como los antagonistas de los receptores de quimiocinas, incluidos CCR2 y CCR4.

Otros agentes anticancerígenos también incluyen aquellos que aumentan el sistema inmunitario, como los adyuvantes o la transferencia de linfocitos T adoptivos.

Las vacunas contra el cáncer incluyen células dendríticas, péptidos sintéticos, vacunas de ADN y virus recombinantes.

La composición farmacéutica de la invención puede incluir opcionalmente al menos un inhibidor de la transducción de señales (STI). Un "inhibidor de la transducción de señales" es un agente que inhibe selectivamente uno o más etapas vitales en las vías de señalización, en la función normal de las células cancerosas, lo que conduce a la apoptosis. Las STI adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (i) inhibidores de cinasa bcr/abl tales como, por ejemplo, STI 571 (GLEEVEC®); (ii) inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) tales como, por ejemplo, inhibidores de cinasa (IRESSA®, SSI-774) y anticuerpos (Imclone: C225 [Goldsteinet al.,Clin. Cancer Res., 1:1311-1318 (1995)] y Abgenix: ABX-EGF); (iii) inhibidores del receptor her-2/neu tales como inhibidores de farnesil transferasa (<f>T<i>) tales como, por ejemplo, L-744,832 (Kohlet al.,Nat. Med., 1(8):792-797 (1995)); (iv) inhibidores de las cinasas de la familia Akt o de la vía Akt, como, por ejemplo, rapamicina (véase, por ejemplo, Sekulicet al.,Cancer Res., 60:3504-3513 (2000)); (v) inhibidores de la cinasa del ciclo celular como, por ejemplo, flavopiridol y UCN-O1 (véase, por ejemplo, Sausville, Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents, 3:47-56 (2003)); y (vi) inhibidores de fosfatidil inositol cinasa tales como, por ejemplo, LY294002 (véase, por ejemplo, Vlahoset al.,J. Biol. Chem., 269:5241-5248 (1994)). Alternativamente, al menos un STI y al menos un compuesto de la fórmula (I) pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Al menos un compuesto de la fórmula (I) y al menos un STI pueden administrarse al paciente de forma concurrente o secuencial. En otras palabras, al menos un compuesto de la fórmula (I) puede administrarse primero, al menos un STI puede administrarse primero, o al menos un compuesto de la fórmula (I) y al menos un STI pueden administrarse al mismo tiempo. Además, cuando se usa más de un compuesto de la fórmula (I) y/o STI, los compuestos pueden administrarse en cualquier orden.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una infección vírica crónica en un paciente que comprende al menos un compuesto de la fórmula (I), opcionalmente al menos un fármaco quimioterapéutico y, opcionalmente, al menos un agente antivírico, en un portador farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona un compuesto de la fórmula (I) para su uso en un método para tratar una infección vírica crónica en un paciente mediante la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica anterior.

Al menos un compuesto de la fórmula (I) y al menos un agente quimioterapéutico pueden administrarse al paciente al mismo tiempo o secuencialmente. En otras palabras, al menos un compuesto de la fórmula (I) puede administrarse primero, al menos un agente quimioterapéutico puede administrarse primero, o al menos un compuesto de la fórmula (I) y al menos un STI pueden administrarse al mismo tiempo. Además, cuando se usa más de un compuesto de la fórmula (I) y/o agente quimioterapéutico, los compuestos pueden administrarse en cualquier orden. De manera similar, cualquier agente antivírico o STI también puede administrarse en cualquier momento en comparación con la administración del compuesto de la fórmula (I).

Las infecciones víricas crónicas que pueden tratarse con el presente tratamiento combinado incluyen, entre otras, enfermedades causadas por: virus de la hepatitis C (HCV), virus del papiloma humano (HPV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes simple (HSV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la varicela zóster, virus de coxsackie, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En particular, las infecciones parasitarias (por ejemplo, la malaria) también pueden tratarse mediante los métodos anteriores en donde se añaden opcionalmente compuestos que se sabe que tratan las afecciones parasitarias en lugar de los agentes antivíricos.

Los agentes antivíricos adecuados contemplados para usar en combinación con el compuesto de la fórmula (I) pueden comprender inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos y nucleótidos (NRTI), inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos (NNRTI), inhibidores de proteasa y otros fármacos antivíricos.

Los ejemplos de NRTI adecuados incluyen zidovudina (AZT); didanosina (ddl); zalcitabina (ddC); estavudina (d4T); lamivudina (3TC); abacavir (1592U89); adefovir dipivoxil [bis(POM)-PMEA]; lobucavir; BCH-I0652; emitricitabina [(-)-FTC]; beta-L-FD4 (también llamado beta-L-D4C y denominado beta-L-2',3'-didesoxi-5-fluoro-citideno); DAPD, ((-)-beta-D-2,6-diamino-purina dioxolano); y lodenosina (FddA). Los NNRTI adecuados típicos incluyen nevirapina (BI-RG-587); delaviradina (BHAP, U-90152); efavirenz (DMP-266); PNU-142721; AG-1549; MKC-442 (1-(etoxi-metil)-5-(1-metiletil)-6-(fenilmetil)-(2,4(1H,3H)-pirimidindiona) y (+)-calanolida A (NSC-675451) y B. Los inhibidores de proteasa adecuados típicos incluyen saquinavir (Ro 31-8959); ritonavir (ABT-538); indinavir (MK-639); nelfnavir (AG-1343); amprenavir (141W94); lasinavir; DMP-450; BMS-2322623, ABT-378 y<a>G-1549. Otros agentes antivíricos incluyen hidroxiurea, ribavirina, IL-2, IL-12, pentafusida y Yissum Proyecto N.° 11607.

Los kits farmacéuticos útiles, por ejemplo, en el tratamiento o prevención de enfermedades o trastornos asociados con DGKa y DGK^, y otras enfermedades mencionadas en este documento pueden incluir uno o más envases que contienen una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la fórmula (I). Tales kits pueden incluir además, si se desea, uno o más de varios componentes de kits farmacéuticos convencionales, como, por ejemplo, recipientes con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, recipientes adicionales, como será fácilmente evidente para los expertos en la técnica. También se pueden incluir en el kit instrucciones, ya sea como insertos o etiquetas, que indiquen las cantidades de los componentes que se administrarán, las pautas para la administración y/o las pautas para mezclar los componentes.

La terapia de combinación está propuesta para abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, en una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una única forma de dosificación que tenga una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples formas de dosificación únicas para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membranas mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección intravenosa. La terapia de combinación también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describe anteriormente en combinación adicional con otros principios biológicamente activos y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía o tratamiento con radiación). Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico se puede realizar en cualquier momento adecuado siempre que se logre un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento no farmacológico se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos de la fórmula (I), formulados junto con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos descritos anteriormente.

Los compuestos de esta invención se pueden administrar para cualquiera de los usos descritos en el presente documento por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, como tabletas, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación sostenida o de liberación controlada), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones (incluyendo nanosuspensiones, microsuspensiones, dispersiones atomizadas), jarabes y emulsiones; sublingualmente; bucalmente; por vía parenteral, tal como por inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal, o técnicas de infusión (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); por vía nasal, incluida la administración a las membranas nasales, por ejemplo mediante un aerosol para inhalación; tópicamente, como en la forma de una crema o ungüento; o por vía rectal, como en la forma de supositorios. Pueden administrarse solos, pero generalmente se administrarán con un portador farmacéutico seleccionado sobre la base de la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.

La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, como un rellenador líquido o sólido, diluyente, excipiente, auxiliar de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o zinc, o ácido estérico), o un material de encapsulación de disolvente, implicado en llevar o transportar el compuesto en cuestión desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación, incluidos, por ejemplo, los adyuvantes, excipientes o vehículos, tales como los diluyentes, agentes conservadores, rellenadores, agentes reguladores de flujo, agentes desintegrantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes de dosificación, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y formas de dosificación; y no perjudicial para el paciente.

El término "composición farmacéutica" significa una composición que comprende un compuesto de la invención en combinación con al menos un portador farmacéuticamente aceptable adicional.

Los portadores farmacéuticamente aceptables se formulan de acuerdo con una serie de factores dentro del alcance de los expertos en la materia. Estos incluyen, sin limitación: el tipo y la naturaleza del agente activo que se formula; el sujeto al que se va a administrar la composición que contiene el agente; la ruta prevista de administración de la composición; y la indicación terapéutica a la que se dirige. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen medios líquidos acuosos y no acuosos, así como una variedad de formas de dosificación sólidas y semisólidas. Tales portadores pueden incluir una serie de diferentes ingredientes y aditivos además del agente activo, tales ingredientes adicionales se incluyen en la formulación por una variedad de razones, por ejemplo, la estabilización del agente activo, aglutinantes, etc., bien conocidos por aquellos con habilidad ordinaria en la técnica. Las descripciones de portadores farmacéuticamente aceptables adecuados y los factores implicados en su selección se encuentran en una variedad de fuentes fácilmente disponibles como, por ejemplo, Allen, L. V. Jr.et al.Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2 volúmenes), 22/a. edición (2012), Pharmaceutical Press.

El régimen de dosificación para los compuestos de la presente invención, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, edad, sexo, salud, condición médica y peso del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado.

A modo de guía general, la dosis oral diaria de cada principio activo, cuando se usa para los efectos indicados, oscilará entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 5000 mg por día, preferentemente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1000 mg por día, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 250 mg por día. Por vía intravenosa, las dosis más preferidas oscilarán entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg/kg/minuto durante una infusión a velocidad constante. Los compuestos de esta invención pueden administrarse en una sola dosis diaria, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día.

Los compuestos se administran normalmente mezclados con diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticos adecuados (denominados colectivamente en el presente documento como portadores farmacéuticos) adecuadamente seleccionados con respecto a la forma de administración prevista, por ejemplo, tabletas orales, cápsulas, elixires y jarabes, y con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Las formas de dosificación (composiciones farmacéuticas) adecuadas para la administración pueden contener desde aproximadamente 1 miligramo hasta aproximadamente 2000 miligramos del principio activo por unidad de dosificación. En estas composiciones farmacéuticas, el principio activo normalmente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,1-95 % en peso con respecto al peso total de la composición.

Una cápsula típica para administración oral puede contener al menos uno de los compuestos de la presente invención (250 mg), lactosa (75 mg) y estearato de magnesio (15 mg). La mezcla se pasa a través de un tamiz de malla 60 y se envasa en una cápsula de gelatina N.° L.

Una preparación inyectable típica se produce colocando asépticamente al menos uno de los compuestos de la presente invención (250 mg) en un vial, liofilizando y sellando asépticamente. Para su uso, el contenido del vial se mezcla con 2 ml de la solución salina fisiológica, para producir una preparación inyectable.

La presente invención incluye dentro de su alcance composiciones farmacéuticas que comprenden, como principio activo, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los compuestos de la presente invención, solo o en combinación con un portador farmacéutico. Opcionalmente, los compuestos de la presente invención se pueden usar solos, en combinación con otros compuestos de la invención, o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente anticancerígeno u otro material farmacéuticamente activo.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante los métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica para un paciente, una composición y un modo de administración en particular, sin ser tóxico para el paciente.

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción o metabolismo del compuesto particular que se emplea, la velocidad y el grado de absorción, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, el sexo, el peso, el estado de salud general y la historia médica del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Un médico o veterinario que tenga una experiencia ordinaria en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar la dosificación de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto.

En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Generalmente, las dosis orales, intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas de los compuestos de esta invención para un paciente oscilarán entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por día.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. En ciertos aspectos de la invención, la dosificación es una administración por día.

Si bien es posible que un compuesto de la presente invención se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición).

Los otros agentes terapéuticos anteriores, cuando se emplean en combinación con los compuestos de la presente invención, se pueden usar, por ejemplo, en las cantidades indicadas en Physicians' Desk Reference (PDR) o según lo determine un experto en la materia. En los métodos de la presente invención, tales otros agentes terapéuticos pueden administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de los compuestos de la invención.

Métodos de preparación

Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse mediante muchos métodos disponibles para los expertos en la técnica de la química orgánica. Los esquemas sintéticos generales para preparar los compuestos de la presente invención se describen a continuación. Estos esquemas son ilustrativos y no pretenden limitar las posibles técnicas que un experto en la materia puede usar para preparar los compuestos descritos en el presente documento. Los diferentes métodos para preparar los compuestos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Los ejemplos de compuestos de la presente invención preparados mediante los métodos descritos en los esquemas generales se dan en la sección de ejemplos que se expone a continuación. La preparación de ejemplos homoquirales puede llevarse a cabo mediante las técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los compuestos homoquirales se pueden preparar por separación de productos racémicos o diastereómeros por HPLC preparativa de fase quiral. Alternativamente, los compuestos de ejemplo pueden prepararse mediante métodos conocidos por dar productos enantioméricamente o diastereoisómeros enriquecidos.

Las reacciones y técnicas descritas en esta sección se realizan en solventes apropiados para los reactivos y materiales empleados y son adecuados para las transformaciones que se efectúan. Además, en la descripción de los métodos de síntesis que se da a continuación, debe entenderse que todas las condiciones de reacción propuestas, incluida la elección del disolvente, la atmósfera de reacción, la temperatura de reacción, la duración del experimento y los procedimientos de elaboración, se eligen como condiciones estándar para esa reacción, que debe ser reconocida fácilmente por un experto en la técnica. Se entiende por un experto en la técnica de la síntesis orgánica que la funcionalidad presente en varias porciones de la molécula debe ser compatible con los reactivos y reacciones propuestos. Tales restricciones a los sustituyentes que son compatibles con las condiciones de reacción serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica, y se requieren alternativas cuando están presentes sustituyentes incompatibles. Esto a veces requerirá un juicio para modificar el orden de las etapas sintéticas o seleccionar un esquema de proceso particular sobre otro para obtener un compuesto de la invención. También se reconocerá que otra consideración importante en la planificación de cualquier ruta sintética en este campo es la elección juiciosa de un grupo protector usado para la protección de grupos funcionales reactivos presentes en los compuestos descritos en esta invención. Una fuente autorizada que describe las muchas alternativas al profesional capacitado es Wuts y Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, cuarta edición, Wiley and Sons (2007).

Las metodologías que pueden emplearse en la síntesis de compuestos intermediarios útiles en la preparación de ejemplos de la presente invención se muestran en el siguiente esquema de reacción.

Las benzooxazina-2,4(1H)-dionas del tipo que se muestra se pueden tratar con una base fuerte y un reactivo de metilación como el yoduro de metilo para producir 1-metil-2H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4(1H)-dionas. Estos pueden tratarse con acetatos activados, por ejemplo, nitroacetatos, malonatos y cianoacetatos para generar 1-metil-3-nitroquinolina-2,4(1H,3H)-dionas, 1-metil-3-carboxietilquinolina-2,4(1H,3H)-dionas y 1-metil-3-cianoquinolina-2,4(1H,3H)-dionas, respectivamente. Los derivados de 3 ésteres se pueden transformar adicionalmente mediante hidrólisis básica y descarboxilación ácida para proporcionar la 6-fluoro-4-hidroxi-1-metilquinolin-2(1H)-ona.

Esquema de reacción 1

Alternativamente, las quinolin dionas se pueden preparar a partir de ácidos 2-aminobenzoicos sustituidos. Por ejemplo, el 2-amino-5-bromobenzoato de metilo se puede transformar en 4-hidroxM-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolina-6-carbonitrilo en cuatro etapas.

Esquema de reacción 2

Tales quinolin dionas se pueden convertir a su vez en los derivados de 4-cloro o 4-triflato relacionados que se pueden hacer reaccionar con una diversidad de piperazinas funcionalizadas para producir compuestos protegidos como el 4-(6-fluoro-1-metil-2 -oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazin-1-carboxilato de tere-butilo o los ejemplos de la presente invención.

Esquema de reacción 3

Las piperazinas protegidas, como el 4-(6-fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazin-1-carboxilato deterc-butilo, pueden transformarse aún más mediante la desprotección de la piperazina con, por ejemplo, TFA en diclorometano y la reacción con un electrófilo como bromuro de 3-fluorobencilo para proporcionar la 6-fluoro-4-{4-[(3-fluorofenil)metil]piperazin-1-il}-1 -metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona.

Esquema de reacción 4

Los compuestos de la invención también se pueden preparar mediante la reacción de quinolin dionas o amino quinolonas con electrófilos tales como oxicloruro de fósforo en DMF, ácido nítrico en ácido acético o N-bromosuccinimida en DMF para dar, por ejemplo, el 4-(4-bencidrilpiperazin-1 -il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-3-carbaldehído, 4-hidroxi-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona y 4-(3-bromo-6-fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, respectivamente. Estos compuestos pueden transformarse adicionalmente según sea necesario para dar los compuestos de la invención. Los ejemplos de la invención se pueden preparar a partir de la 4-hidroxi-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona siguiendo las etapas descritas en el esquema de reacción 3.

Esquema de reacción 5

El 4-(3-bromo-6-fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo se puede hacer reaccionar con ácidos borónicos de arilo y heteroarilo o estaninas en la presencia de un catalizador adecuado para proporcionar, por ejemplo, el 4-(6-fluoro-1-metil-2-oxo-3-(piridin-4-il)-1,2-dihidroquinolin-4-il) piperazin-1-carboxilato de terc-butilo. Estos ejemplos se pueden transformar aún más mediante la desprotección y la alquilación de la piperazina como se muestra en el esquema de reacción 3.

Esquema de reacción 6

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran las realizaciones particulares y preferidas de la presente invención y no limitan el alcance de la presente invención. Las abreviaturas y los símbolos químicos, así como las abreviaturas y los símbolos científicos, tienen sus significados habituales a menos que se especifique de otra manera. Las abreviaturas adicionales empleadas en los ejemplos y en otras partes de esta solicitud son como se definieron anteriormente. Los compuestos intermediarios comunes son generalmente útiles para la preparación de más de un ejemplo y se identifican secuencialmente (por ejemplo, compuesto intermediario 1, compuesto intermediario 2, etc.) y se abrevian como Int. 1 o I1, Int. 2 o I2, etc. Los compuestos de los ejemplos se identifican por el ejemplo y la etapa en la que se prepararon (por ejemplo, "1-A" denota el ejemplo 1, etapa A), o por el ejemplo solo donde el compuesto es el título compuesto del ejemplo (por ejemplo, "1" denota el compuesto del título del ejemplo 1). En algunos casos, se describen preparaciones alternativas de los compuestos intermediarios o ejemplos. Con frecuencia, los químicos expertos en la técnica de la síntesis pueden idear preparaciones alternativas que pueden ser deseables en función de una o más consideraciones, como un tiempo de reacción más corto, materiales de partida menos costosos, facilidad de operación o aislamiento, rendimiento mejorado, susceptible de catálisis, evitación de reactivos tóxicos, accesibilidad de instrumentación especializada y disminución del número de etapas lineales, etc. La intención de describir preparaciones alternativas es permitir aún más la preparación de los ejemplos de esta invención. En algunos casos, algunos grupos funcionales en los ejemplos y reivindicaciones descritos pueden reemplazarse por reemplazos bioisostéricos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el reemplazo de un grupo de ácido carboxílico con un tetrazol o una porción de fosfato. Los datos de RMN 1H recopilados en sulfóxido de dimetilo deuterado usaron supresión de agua en el procesamiento de datos. Los espectros informados no están corregidos por los efectos de la supresión de agua. Los protones adyacentes a la frecuencia de supresión de agua de 3,35 ppm exhiben una intensidad de señal disminuida.

Abreviaturas

Ac acetilo

AcOH ácido acético

Ac<2>O anhídrido acético

anhid. anhidro

ac. acuoso

Boc ferc-butoxicarbonilo

BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris-(dimetilamino)-fosfonio

Bu butilo

DCM diclorometano

DEA dietilamina

DIEA o DIPEA diisopropiletilamina

DMF dimetilformamida

DMSO sulfóxido de dimetilo

dppf 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno

EDTA ácido etilendiaminotetraacético

Et etilo

Et<3>N trietilamina

EtOAc acetato de etilo

EtOH etanol

h, horas o hrs hora(s)

HCl ácido clorhídrico

HPLC cromatografía líquida de alta presión

LC cromatografía líquida

LCMS cromatografía líquida - espectrometría de masas

M molar

M+1 (M+H)+

Me metilo

Mel yoduro de metilo

MeOH metanol

Mesil-Cl cloruro de metanosulfonilo

MHz megahercios

mins minuto(s)

mM milimolar

MS espectrometría de masas

n o N normal

NBS N-bromosuccinimida

NH<4>OAc acetato de amonio

KHMDS bis(trimetilsilil)amida de potasio

nM nanomolar

NMP N-metilpirrolidinona

Pd<2>(dba<)3>tris-(dibencilidenacetona)dipaladio

éter de pet éter de petróleo

Fe fenilo

POCl<3>oxicloruro de fósforo

rt o tiempo de Ret tiempo de retención

sat. saturado

TEA trietilamina

Tetrakis tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0)

TFA ácido trifluoroacético

Tf<2>O anhídrido trifluorometilsulfónico

THF tetrahidrofurano.

Compuesto intermediario 1

6-Fluoro-1-metil-2H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4(1H)-diona

A una solución de 6-fluoro-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (10,2 g, 56,3 mmol) en DMF (60 ml), se agregó en porciones una dispersión al 60 % de hidruro de sodio (2,70 g, 67,6 mmol) en aceite mineral a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 30 min. A continuación se añadió gota a gota yoduro de metilo (4,23 ml, 67,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se inactivó con agua. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción. Se recogió un sólido amarillo claro como 6-fluoro-1-metil-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (9,55 g, 48,9 mmol, 87% de rendimiento). LC/MS: columna de LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 1,982 min, 196,0 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 87,82-7,73 (m, 2H), 7,56 7,46 (m, 1H), 3,47 (s, 3H).

Compuesto intermediario 2

6-Fluoro-1-metil-3-nitroquinolina-2,4(1H,3H)-diona

A una solución de 2-nitroacetato de etilo (3,38 g, 25,4 mmol) en NMP (15 ml) en un matraz de fondo redondo a 0 °C, se añadió una dispersión al 60 % de hidruro de sodio (1,107 g, 27,7 mmol) en aceite mineral en porciones. La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a 0 °C y a continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió 6-fluoro-1-metil-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (4,5 g, 23,06 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 2 h. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. La reacción se inactivó con hielo-agua. La mezcla de reacción se acidificó con una solución de HCl 1 N. Se añadió éter etílico y se recogió un sólido amarillo como la 6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolina-2,4(1H,3H)-diona (2,69 g, 11,29 mmol, 49,0% de rendimiento). LC/MS: Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 1,488 min, 237,1 (M-H‘). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 87,85 (dd, J=9,2, 2,6 Hz, 1H), 7,72-7,47 (m, 2H), 6,73 (s, amp., 1H), 3,58 (s, 3H).

Compuesto intermediario 3

4-Cloro-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona

En un tubo sellado, se añadieron 6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolina-2,4(1H,3H)-diona (1,4 g, 5,88 mmol) y oxicloruro de fósforo (10 ml, 107 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 95 °C durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se vertió sobre hielo-agua y se neutralizó con una solución saturada de NaHCO<3>. La mezcla se extrajo usando diclorometano (2 x 40 ml) y las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO<4>) y se concentraron para dar la 4-cloro-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona como un sólido naranja (1,28 g, 4,99 mmol, 85% de rendimiento). Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 2,648 min, 257,0 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 87,93 (d, J=9,5 Hz, 1H), 7,86-7,79 (m, 2H), 3,72 (s, 3H).

Compuesto intermediario 4

4-(6-Fluoro-1-metil-3-nitro-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazin-1-carboxilato de íerc-butilo

A una solución de 4-cloro-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (600 mg, 2,338 mmol) en DMF (8 ml), se agregaron piperazina-1-carboxilato de tere-butilo (435 mg, 2,338 mmol) y trietilamina (0,978 ml, 7,01 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. La reacción se inactivó con agua. Se recogió un sólido amarillo como el producto de 4-(6-fluoro-1-metil-3-nitro-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de tere-butilo (765 mg, 1,882 milimoles, 81 % de rendimiento). LC/MS: Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 3,0 min, 407,1 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 87,79-7,63 (m, 3H), 3,65 (s, 3H), 3,58 (s amp., 4H), 3,07 (s amp., 4H), 1,43 (s, 9H).

Compuesto intermediario 5

6-Fluoro-1-metil-3-nitro-4-(piperazin-1-il)quinolin-2(1H)-ona, TFA

A una solución de 4-(6-fluoro-1-metil-3-nitro-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de ferc-butilo (2,1 g, 5,17 mmol) en CH<2>CI<2>(10 ml), se añadió TFA (5 ml, 64,9 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. La mezcla de reacción se concentró y se añadió acetato de etilo. Se obtuvo un sólido amarillo como el producto de 6-fluoro-1-metil-3-nitro-4-(piperazin-1-il)quinolin-2(1H)-ona, TFA (1,72 g, 4,09 mmol, 79 % de rendimiento). Columna LC/MS: Phenomenex L<u>NA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: metanol:agua 10:90 con TFA al 0,1 %; fase móvil B: metanol:agua 90:10 con TFA al 0,1 %; Gradiente: 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 1,62 min, 307,2 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 7,73-7,67 (m, 2H), 7,64 (d, J=10,0 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,11-3,03 (m, 4H), 2,93 (s amp., 4H).

Ejemplo 1

6-Fluoro-4-{4-[(3-fluorofenil)metil]piperazin-1-il}-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona

Se preparó una solución de 6-fluoro-1-metil-3-nitro-4-(piperazin-1-il)quinolin-2(1H)-ona, TFA (340 mg, 816 pmol) y DIPEA (646 ml, 3,6 mmol) en DMF (17,0 ml). Al bromuro de 3-fluorobencilo pesado en un vial roscado de 16 x 100 mm se añadieron 500 pl de 6-fluoro-1-metil-3-nitro-4-(piperazin-1-il)quinolin-2(1H)-ona, solución de TFA/DIPEA. Se tapó el vial y se dejó agitar a temperatura ambiente hasta que se completó la reacción según se midió mediante análisis LCMS (aproximadamente 24 horas). Se añadió una alícuota de 500 pl de DMF al vial y el material bruto se purificó mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo: agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % B durante 15 minutos, a continuación una retención de 5 minutos al 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contuvieron el producto se combinaron y secaron mediante evaporación centrífuga. Condiciones de LC/MS: Columna: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: metanol:agua 10:90 con TFA al 0,1 %; fase móvil B: metanol:agua 90:10 con TFA al 0,1 %; Gradiente: 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Ion de MS observado 415,1, tiempo de retención 1,23 minutos.

Compuesto intermediario 6

6-Fluoro-1-metil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolina-3-carboxilato de etilo

A una solución de malonato de dietilo (0,903 g, 5,64 mmol) en NMP (10 ml) en un matraz de fondo redondo a 0 °C, se añadió una dispersión al 60 % de hidruro de sodio (0,246 g, 6,15 mmol) en aceite mineral en porciones. La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a 0°C y a continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la 6-fluoro-1-metil-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (1 g, 5,12 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 2 h. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. La reacción se inactivó con hieloagua y se acidificó con una solución de HCl 1 N. Se añadió éter etílico y se recogió un sólido beige como el producto de 6-fluoro-1-metil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolina-3-carboxilato de etilo (245 mg, 0,924 mmol, 18,03% de rendimiento). Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 1,660 min, 264,1 (M-H‘). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 87,77 (dd, J=9,3, 2,9 Hz, 1H), 7,68-7,54 (m, 2H), 4,32 (c, J=7,1 Hz, 2H), 3,56 (s, 3H), 1,30 (t, J=7,1 Hz, 3H).

Compuesto intermediario 7

6-Fluoro-4-hidroxi-1-metilquinolin-2(1H)-ona

Se calentó una suspensión de 6-fluoro-4-hidroxi-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo (6,5 g, 24,51 mmol) en hidróxido de sodio 2 M (150 ml, 300 mmol) a 100 °C durante 12 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron gota a gota con agitación 50 ml de HCl 6 N. Después de aproximadamente 30 min, los sólidos se recogieron por filtración. El filtrado se lavó con agua y a continuación se secó al vacío durante la noche. El sólido se secó adicionalmente suspendiéndolo en tolueno y evaporando a sequedad (2x) para dar el producto como un sólido blanquecino (4,93 g, 24,51 mmol, 100 % de rendimiento). m/z; 194 (M+H)+.

Compuesto intermediario 8

4-Cloro-6-fluoro-1-metilquinolin-2(1H)-ona

En un vial seco equipado con un agitador magnético, se añadió la 6-fluoro-1-metilquinolina-2,4(1H,3H)-diona (1000 mg, 5,18 mmol) seguido de la adición de oxicloruro de fósforo (5790 pl, 62,1 mmol). La mezcla se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno y se colocó en un baño de aceite a 100 °C por un período de 1 h. La mezcla de reacción se retiró del baño de aceite y se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de evaporarse al vacío. El residuo se disolvió/suspendió en acetonitrilo y se colocó en un baño de hielo. Se añadieron cristales de hielo y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío para eliminar el acetonitrilo. La suspensión resultante se filtró y el producto se recogió por filtración. El sólido color marrón se secó al vacío a 50 °C para dar el compuesto del título como un sólido de color marrón-rojizo (974 mg). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 87,82-7,58 (m, 3H), 7,05 (s, 1H), 3,64 (s, 3H).

Compuesto intermediario 9

4-(6-Fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de tere-butilo

Se disolvieron la 4-cloro-6-fluoro-1-metilquinolin-2(1H)-ona (940 mg, 4,44 mmol) y el piperazin-1-carboxilato deterc-butilo (910 mg, 4,89 mmol) en una mezcla de DMA (20 ml) y t-BuOH (5,00 ml). Se añadió carbonato de cesio (4342 mg, 13,33 mmol) con metanosulfonato de (2-diciclohexilfosfino-2',6'-diisopropoxi-1,1'-bifenil)[2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladio (ii) (186 mg, 0,222 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó y a continuación se lavó con nitrógeno y a continuación se calentó a 85 °C durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con una solución de EDTA 0,1 M y se añadió EtOAc. La mezcla se filtró a través de Celite para eliminar el paladio precipitado coloidal. A continuación, la capa orgánica se separó y la mezcla acuosa se volvió a extraer con EtOAc (2x). Los extractos combinados se lavaron una vez con salmuera, a continuación se secaron sobre MgSO<4>, se filtraron y se concentraron al vacío para dar el producto crudo como un aceite viscoso de color púrpura oscuro. El residuo se disolvió en DCM y se adsorbió sobre gel de sílice. A continuación, el material se fraccionó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc al 90-100 % en hexanos. Las fracciones homogéneas se combinaron para dar el producto como un aceite incoloro, 960 mg. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 87,63-7,44 (m, 3H), 6,13 (s, 1H), 3,57 (s, 7H), 2,99 (t amp., J=4,6 Hz, 4H), 1,44 (s, 9H).

Compuesto intermediario 10

4-(3-Bromo-6-fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de tere-butilo

Se disolvió el 4-(6-fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (98 mg, 0,271 mmol) en DMF (2 ml) en un matraz de fondo redondo mantenido bajo una atmósfera de nitrógeno. La solución se enfrió a 0 °C y se añadió N-bromosuccinimida (43,9 mg, 0,247 mmol) en una sola porción. A continuación, la mezcla se retiró del baño de hielo y se dejó calentar ligeramente durante 15 min. A continuación se eliminó el solvente a alto vacío y el residuo resultante se disolvió en DCM, se adsorbió sobre SiO<2>y a continuación se cromatografió usando EtOAc al 40 % en hexanos. Las fracciones homogéneas se combinaron y evaporaron al vacío para dar el producto como una película incolora (98 mg, 88 % de rendimiento). RMN 1H (400<m>H<z>, cloroformo-d) 87,80-7,73 (m, 1H), 7,39 7,30 (m,<2>H), 3,78 (s, 3H), 1,51 (s, 9H). La señal de Dc M se observó a 5,3 ppm.

Compuesto intermediario 11

4-(6-Fluoro-1-metil-2-oxo-3-(piridin-4-il)-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de tere-butilo

Se disolvieron el 4-(3-bromo-6-fluoro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazina-1-carboxilato de ferc-butilo (562 mg, 1,276 mmol) y 4-(tributilestañil)piridina (0,392 ml, 1,276 mmol) en DMF anhidra (10 ml). El matraz de reacción se evacuó y se lavó tres veces con nitrógeno. A continuación se añadió tetraquis (147 mg, 0,128 mmol) y el procedimiento de evacuación/lavado se repitió dos veces. La mezcla de reacción se calentó a 100 °C bajo nitrógeno en un tubo sellado durante 48 h. A continuación, la mezcla de reacción se fraccionó mediante cromatografía ultrarrápida usando MeOH al 5 % en DCM. Las fracciones homogéneas se combinaron y evaporaron al vacío para dar el producto como un aceite de color amarillo, 928 mg.

Compuesto intermediario 12

6-Fluoro-1-metil-4-(piperazin-1-il)-3-(piridin-4-il)quinolin-2(1H)-ona

Se añadió ácido trifluoroacético (8,15 ml, 106 mmol) a una solución de 4-(6-fluoro-1-metil-2-oxo-3-(piridin-4-il)-1,2-dihidroquinolin-4-il)piperazin-1 -carboxilato de ferc-butilo (928 mg, 2,116 mmol) en DCM (8 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante un período de 1 h. A continuación, la mezcla se diluyó con agua y la capa acuosa fuertemente ácida se separó de la solución de diclorometano. La capa orgánica se volvió a extraer con agua adicional (el extracto acuoso permaneció muy ácido). Los extractos acuosos agrupados se combinaron y a continuación se basificaron (pH~14) mediante la adición de KOH sólido. La mezcla resultante se extrajo usando DCM (3x) y los extractos combinados se secaron sobre MgSO<4>, se filtraron y evaporaron al vacío para dar un aceite que solidificó al reposar durante la noche (243 mg).

Ejemplo 2

6-Fluoro-4-{4-[(3-fluoro-5-metilfenil)metil]piperazin-1-il}-1-metil-3-(piridin-4-il)-1,2-dihidroquinolin-2-ona

A una solución de 6-fluoro-1-metil-4-(piperazin-1-il)-3-(piridin-4-il)quinolin-2(1H)-ona (22 mg, 0,065 mmol) en DMF (1,5 ml), se añadió 4-formil-3-hidroxibenzonitrilo (14,35 mg, 0,098 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, después de lo cual se añadió cianoborohidruro de sodio (8,18 mg, 0,130 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El producto de reacción se purificó mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |im; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo: agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 35-75 % B durante 20 minutos, a continuación una retención de 5 minutos al 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contuvieron el producto se combinaron y secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 13,5 mg y su pureza estimada por análisis de LCMS fue del 100 %. Se usó LC/MS analítico para determinar la pureza final. Condiciones de inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 mm; fase móvil A: 5:95 acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0 % B a 100 % B durante 3 min, a continuación una retención de 0,75 min al 100 % B; Flujo: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Resultados de la inyección 1: Pureza: 100,0 %; Masa observada: 461,22; Tiempo de retención: 1,48 min. Condiciones de inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 |im; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0 % B a 100 % B durante 3 min, a continuación una retención de 0,75 min al 100 % B; Flujo: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Resultados de la inyección 2: Pureza: 100,0 %; Masa observada: 461,2; Tiempo de Retención: 2,26 min. RMN 1H (500 MHz, DMSO-da) 88,74 (d, J=6,6 Hz, 2H), 7,79 (d, J=6,6 Hz, 2H), 7,70-7,63 (m, 2H), 7,62-7,53 (m, 1H), 7,00-6,92 (m, 1H), 6,89 (d amp., J=8,8 Hz, 2H), 3,63 (s, 3H), 3,49 (s, 2H), 2,82 (s amp., 4H), 2,50-2,44 (m, 4H), 2,31 (s, 3H).

Compuesto intermediario 13

4-(Piperazin-1-ilmetil)-1H-indol, 2 TFA

A una solución de piperazina-1-carboxilato de tere-butilo (481 mg, 2,58 mmol) en DMF (1,5 ml), se añadió 1H-indol-4-carbaldehído (250 mg, 1,722 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación se añadió cianoborohidruro de sodio (325 mg, 5,17 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 días. A continuación, la mezcla de reacción se añadió a metanol, se filtró y el filtrado se purificó mediante HPLC preparativa usando el sistema amortiguador de CH<3>CN-H<2>O-TFA. Las fracciones se recogieron y se concentraron en un aparato speed-vac durante la noche. La LC/MS mostró que la mayor parte del material estaba sin el grupo boc. El material se disolvió en diclorometano (5 ml) y se añadió 1 ml de TFA. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se concentró para proporcionar el 4-(piperazin-1-ilmetil)-1H-indol, 2 TFA (420 mg, 0,947 mmol, 55,0 % de rendimiento) como un sólido blanco. Columna<l>C/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0% B, 0-100% B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100%B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 1,577 min, 216,1 (MH+).

Ejemplo 3

4-(4-((1H-indol-4-il)metil)piperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona

A una solución de 4-cloro-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (150 mg, 0,585 mmol) en DMF (5 ml), se añadieron el 4-(piperazin-1-ilmetil)-1H-indol, 2TFA (285 mg, 0,643 mmol) y trietilamina (0,326 ml, 2,338 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. El producto bruto se purificó por HPLC preparativa usando el sistema amortiguador de CH<3>CN-H<2>O-TFA. Las fracciones se recogieron y se concentraron en un aparato speed-vac durante la noche. El producto se purificó nuevamente por HPLC preparativa usando el sistema amortiguador de CH<3>CN-H<2>O-acetato de amonio. Las fracciones se recogieron y se concentraron en un aparato speed-vac durante la noche. Se obtuvo como producto final un sólido amarillo de 4-(4-((1H-indol-4-il)metil)piperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (180 mg, 0,413 mmol, 70,7 % de rendimiento). Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 3,1 min, 436,1 (MH+).

Ejemplo 4

4-{4-[(1-Etil-1H-indol-4-il)metil]piperazin-1 -il}-6-fluoro-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona

A una solución de 4-(4-((1H-indol-4-il)metil)piperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (15 mg, 0,034 mmol) en DMF (1,5 ml), se añadió una dispersión al 60 % de hidruro de sodio (2,76 mg, 0,069 mmol) en aceite mineral. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación se añadió yodoetano (10,75 mg, 0,069 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La LC/M<s>mostró la finalización de la reacción. La reacción se inactivó con metanol. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se purificó mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo: agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 20-100 % B durante 15 minutos, a continuación una retención de 5 minutos al 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contuvieron el producto se combinaron y secaron mediante evaporación centrífuga. Condiciones de LC/MS: Columna: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm: Ion MS observado 464,1, tiempo de retención 2,28 minutos. RMN 1H (500 MHz, DMSO-da) 87,80-7,65 (m, 2H), 7,63-7,49 (m, 1H), 7,45-7,32 (m, 2H), 7,17-7,06 (m, 1H), 7,03-6,94 (m, 1H), 6,73-6,51 (m, 1H), 4,20 (c, J=9,3 Hz, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,64 (s, 3H), 3,16-3,09 (m, 4H), 2,71-2,59 (m, 4H), 1,37 (t, J=9,3 Hz, 3H).

Ejemplo 5

4-(4-Bencil-3-oxopiperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona

Se disolvieron la 4-cloro-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (25 mg, 0,097 mmol), 1-bencilpiperazin-2-ona (20,39 mg, 0,107 mmol) y la base de Hunig (0,037 ml), 0,214 mmol) en DMF (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución que contuvo el producto se fraccionó usando LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 21 61 % B durante 20 minutos, a continuación una retención de 4 minutos al 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contuvieron el producto se combinaron y secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 24,1 mg y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 100 %. Se usó LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0 % B a 100 % B durante 3 min, a continuación una retención de 0,75 min al 100 % B; Flujo: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Resultados de la inyección 1: Pureza: 100,0 %; Masa observada: 411,2; Tiempo de retención: 1,6 min. Condiciones de inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: 5:95 acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0 % B a 100 % B durante 3 min, a continuación una retención de 0,75 min al 100 % B; Flujo: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Resultados de la inyección 2: Pureza: 100,0%; Masa observada: 411,02; Tiempo de retención: 1,6 min. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 87,77-7,61 (m, 3H), 7,43-7,36 (m, 2H), 7,35-7,27 (m, 3H), 4,62 (s, 2H), 3,88 (s, 2H), 3,66 (s, 3H), 2,56 (s, 4H).

Compuesto intermediario 14

4-Hidroxi-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-3-carbonitrilo

En un matraz de fondo redondo, se disolvió el 2-cianoacetato de metilo (4,95 g, 50 mmol) en NMP (40 ml) y la mezcla se enfrió a 0 °C. Se añadió hidruro de sodio (1,818 g, 50,0 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a 0 °C y a continuación 15 minutos a temperatura ambiente. A temperatura ambiente, se añadió la 1-metil-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (8,86 g, 50,0 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 2 horas. El análisis de LCMS mostró que la reacción estaba completa. La mezcla de reacción se diluyó con 60 ml de éter dietílico y la mezcla se vertió sobre 50 ml de hielo y 100 ml de HCl 1 N. Los sólidos resultantes se recogieron (6 g). A medida que se evaporaba el éter, se formaron sólidos adicionales en el filtrado y estos sólidos se recogieron por separado (2,2 g). La RMN y LCMS de ambas muestras sólidas fueron idénticas y consistentes con el producto. LC/Ms 2,15 min., M+1: 201,2, Masa exacta: 200,1. % B inicial = 0, % B final = 100, Tiempo del gradiente = 4 minutos, Velocidad de flujo = 0,8 ml/min, Longitud de nm, Par de disolventes = Agua-Metanol-0,1 % TFA, Disolvente A = 90 % Agua-10 % Metanol-0,1 % TFA, Disolvente B = 10 % Agua-90 % Metanol-0,1 % TFA, Columna = Phenomenex-Luna 2,0 X 50 mm 3 pm. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 88,11 (dd, J=8,1, 1,2 Hz, 1H), 7,77 (ddd, J=8,6, 7,2, 1,6 Hz, 1H), 7,56 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,34 (t, J=7,6 Hz, 1H), 3,57 (s, 3H).

Compuesto intermediario 15

4-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolina-3-carbonitrilo

En un matraz de fondo redondo, se combinaron a temperatura ambiente el 1-metil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-3- carbonitrilo (6 g, 30,0 mmol) y oxicloruro de fósforo (13,97 ml, 150 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 110 °C durante 40 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, las sustancias volátiles se eliminaron en un aparato Rotovap. Se añadieron al material bruto 50 ml de éter dietílico y las sustancias volátiles se eliminaron de nuevo en un aparato Rotovap. Se añadió agua lentamente con agitación vigorosa y los sólidos se recogieron por filtración. El residuo se colocó al vacío durante la noche para proporcionar el compuesto del título (4,6 g) como un sólido de color amarillo pálido. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 88,14 (dd, J=8,2, 1,3 Hz, 1H), 7,82 (ddd, J=8,6. 7,1, 1,5 Hz, 1H), 7,51-7,42 (m, 2H), 3,79 (s, 3H).

Ejemplo 7

4- [(2S,5R)-4-[bis(4-fluorofenil)metil]-2,5-dimetilpiperazin-1-il]-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-6-carbonitrilo (homoquiral)

A una solución agitada de 4-((2S,5R)-2,5-dimetilpiperazin-1-il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-6-carbonitrilo (0,08 g, 0,270 mmol) en acetonitrilo (5 ml) a temperatura ambiente se añadieron DIPEA (0,141 ml, 0,810 mmol) y 4,4'-(bromometileno)bis(fluorobenceno) (0,115 g, 0,405 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na<2>SO<4>y se concentró a presión reducida para producir el producto bruto que se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa. Método: Columna: Waters XBridge C18, 150 mm x 19 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo: agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: una retención de 0 minutos al 15 % de B, del 15 al 65 % de B durante 25 minutos, a continuación una retención de 5 minutos al 100 % de B; Tasa de flujo: 15 ml/min. La fracción se concentró a presión reducida para purificar el 4-((2S,5R)-4-(bis(4-fluorofenil)metil)-2,5-dimetilpiperazin-1-il)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-6-carbonitrilo (50 mg, 0,100 mmol, 37,2 % de rendimiento). LCMS: m/z = 499,2 (M+H); rt 2,426 min. Método LCMS: Columna: XBridge BEH XP C18 (50 x 2,1) mm, 2,5 pm fase móvil A: 95% agua: 5% acetonitrilo; NH<4>OAC 10 mM, fase móvil B: 5% de agua: 95% de acetonitrilo; NH<4>OAC 10 mM Flujo: 1,1 ml/min, temperatura: 50 °C, RMN<1>H (400 MHz, DMSO-d<6>)<8>ppm 8,12 (d, J=1,71 Hz, 1 H), 7,97 (dd, J=8,80, 1,71 Hz, 1 H), 7,66 (d, J=8,80 Hz, 1 H), 7,51-7,62 (m, 4 H), 7,15 (dt, J=17,61, 8,80 Hz, 4 H), 6,06 (s, 1 H), 4,82 (s, 1 H), 3,75-3,83 (m, 1 H), 3,55-3,65 (m, 1 H), 3,33 (s, 3 H), 3,01-3,11 (m, 2 H), 2,65 (dd, J=11,86, 2,57 Hz, 1 H), 2,27 (dd, J=11,49, 1,96 Hz, 1 H), 1,09 (d, J=6,60 Hz, 3 H), 1,04 (d, J=6,36 Hz, 3 H).

Compuesto intermediario 16

6-Metoxi-1 -metil-2H-benzo[d][1,3]oxazin-2,4(1H)-diona

A una solución de 6-metoxi-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (3 g, 15,53 mmol) en DMF (20 ml), se agregó una dispersión de hidruro de sodio al 60 % (0,745 g, 18,64 mmol) en aceite mineral en porciones a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 30 min. A continuación se añadió gota a gota yoduro de metilo (1,165 ml, 18,64 mmol). A continuación, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se inactivó con agua. Se añadió éter dietílico a la mezcla. El producto, 6-metoxi-1-metil-1H-benzo[d][1,3]oxazina-2,4-diona (3,11 g, 15,01 mmol, 97 % de rendimiento), se recogió como un sólido beige. Columna LC/m S: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 2,032 min, 208,0 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 87,68-7,23 (m, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,46 (s, 3H).

Compuesto intermediario 17

6-Metoxi-1 -metil-3-nitroquinolin-2,4(1H,3H)-diona

A una solución de 2-nitroacetato de etilo (2,120 g, 15,93 mmol) en NMP (10 ml) en un matraz de fondo redondo a 0 °C, se le añadió una dispersión al 60% de hidruro de sodio (0,695 g, 17,38 mmol) en aceite mineral en porciones. La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a 0 °C, a continuación 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se añadió 6-metoxi-1-metil-1H-benzo[d][1,3]oxazin-2,4-diona (3 g, 14,48 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 3 h. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. La reacción se inactivó con hieloagua. La mezcla se acidificó con una solución de HCl 1 N. Se añadió éter etílico y 6-metoxi-1-metil-3-nitroquinolin-2,4(1H,3H)-diona (1,66 g, 6,63 mmol, 45,8 % de rendimiento) como un sólido amarillo. Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0% B, 0-100% B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 1,613 min, 251,1 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 87,61 (d, J=2,7 Hz, 1H), 7,54 (d, J=9,3 Hz, 1H), 7,39 (dd, J=9,2, 2,8 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,59 (s, 3H).

Compuesto intermediario 18

4-Cloro-6-metoxi-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona

En un tubo sellado, se añadieron la 6-metoxi-1-metil-3-nitroquinolin-2,4(1H,3H)-diona (1,65 g, 6,59 mmol) y oxicloruro de fósforo (10 ml, 107 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 95 °C durante 4 horas. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el residuo se vertió en hielo-agua y se neutralizó con NaHCO<3>sólido. La mezcla se extrajo con diclorometano (2 x 40 ml) y las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO<4>) y se concentraron para dar la 4-cloro-6-metoxi-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (1,58 g, 5,88 mmol, 89% de rendimiento) como un sólido anaranjado. Columna LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 2,703 min, 269,1 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 87,76 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,57 (d, J=9,5 Hz, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,72 (s, 3H).

Ejemplo 8

6-Metoxi-1 -metil-4-{4-[(naftalen-1-il)metil]piperazin-1-il}-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona

A una solución de 4-cloro-6-metoxi-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (15 mg, 0,056 mmol) en DMF (1 ml), se añadieron la 1-(naftalen-1-ilmetil)piperazina (12,64 mg, 0,056 mmol) y trietilamina (0,023 ml, 0,168 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. A continuación, se añadió CH<3>CN a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se purificó mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo: agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 15 minutos, a continuación una retención de 5 minutos al 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contuvieron el producto se combinaron y secaron mediante evaporación centrífuga. LC/MS: Columna: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con acetato de amonio 10 mM; fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Ion MS observado 459,2, tiempo de retención de 2,34 minutos. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 88,31 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,95-7,89 (m, 1H), 7,88-7,83 (m, 1H), 7,61-7,37 (m, 6H), 7,36-7,31 (m, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,88 (s, 3H), 3,60 (s, 3H), 3,13 (amp., s, 4H), 2,69 (amp., s, 4H).

Compuesto intermediario 22

6-Fluoro-1-metil-2-oxo-4-(((trifluorometil)sulfonil)oxi)-1,2-dihidroquinolin-3-carboxilato de etilo

Se añadió 1,1,1-trifluoro-N-fenil-N-(trifluorometil)sulfonil metanosulfonamida (404 mg, 1,131 mmol) a una solución de 6-fluoro-1-metil-2,4-dioxo-1,2 3,4-tetrahidroquinolin-3-carboxilato de etilo (100 mg, 0,377 mmol) y DIEA (0,263 ml, 1,508 mmol) en THF (3 ml). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana. La LC/MS mostró la finalización de la reacción. La mezcla de reacción se concentró. El producto bruto se purificó mediante una columna Biotage usando hexanos hasta acetato de etilo al 40 % en hexanos como eluyente. El producto apareció a ~30 % de acetato de etilo en hexanos. Las fracciones se recogieron y concentraron para dar el 6-fluoro-1-metil-2-oxo-4-(((trifluorometil)sulfonil)oxi)-1,2-dihidroquinolin-3-carboxilato de etilo (71 mg, 0,179 mmol, 47,4% rendimiento) como un sólido amarillo claro. Columna de LC/MS: Phenomenex LUNA C18, 2,0 X 50 mm, partículas de 3 mm; fase móvil A: metanol:agua 10:90 con TFA al 0,1 %; fase móvil B: metanol:agua 90:10 con TfA al 0,1 %; Gradiente: 0 100 % B durante 4 minutos, a continuación mantener 1 minuto en 100 % B; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Tiempo de retención 3,9 min, 397,9 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) 87,60 (dd, J=8,3, 2,7 Hz, 1H), 7,55 7,44 (m, 2H), 4,48 (c, J=7,1 Hz, 2H), 3,78 (s, 3H), 1,44 (t, J=7,2 Hz, 3H).

Ensayos biológicos

Las propiedades farmacológicas de los compuestos de esta invención pueden confirmarse mediante una serie de ensayos biológicos. Los ensayos biológicos ejemplificados, que siguen, se han llevado a cabo con compuestos de la invención.

Ensayo 1: Ensayos de inhibición de DGK in vitro - Método A

Las reacciones de DGKa y DGK^ se realizaron usando liposomas extruidos (ensayos LIPGLO de DGKa y DGKQ. Las reacciones se llevaron a cabo en MOPS 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCh 10 mM, CaCh 1 |iM y DTT 1 mM (amortiguador de ensayo). Las concentraciones de sustrato lipídico fueron PS 2 mM, DAG 0,25 mM y PC 2,75 mM para las reacciones de liposomas extruidos. Las reacciones se llevaron a cabo en ATP 150 |iM. Las concentraciones de enzima para DGKa y DGK^ fueron de 5 nM.

Los estudios de inhibición de compuestos se llevaron a cabo de la siguiente manera: se transfirieron gotas de 50 nl de cada compuesto de prueba (concentración superior 10 mM con 11 puntos, series de dilución de 3 veces para cada compuesto) solubilizados en DMSO a cavidades de una placa blanca de 1536 cavidades (Corning 3725). Se preparó una solución de enzima/sustrato de 5 ml a una concentración de reacción final de 2x combinando 2,5 ml de la solución de enzima 4x (DGKa y DGK^ 20 nM (preparada como se describe a continuación) en el amortiguador de ensayo) y 2,5 ml de una solución de liposomas 4x (composiciones descritas a continuación) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se añadió 1 |il de solución de enzima/sustrato 2x a las cavidades que contuvieron el compuesto de prueba y se iniciaron las reacciones con la adición de 1 |il de ATP 300 uM. Se permitió que las reacciones prosiguieran durante 1 h, después de lo cual se añadieron 2 |il de reactivo Glo (Promega V9101) y se incubaron durante 40 minutos. A continuación, se agregaron 4 |il de reactivo de detección de cinasa y se incubó durante 30 minutos. La luminiscencia se registró usando un lector de microplacas EnVision. El porcentaje de inhibición se calculó a partir de la conversión de ATP generada por las reacciones sin control enzimático para una inhibición del 100 % y reacciones con vehículo solo para una inhibición del 0 %. Los compuestos se evaluaron a 11 concentraciones para determinar la CI<50>,

Preparación de liposomas 4x

La composición de lípidos fue 5 % mol de DAG (Avanti 800811O), 40 % mol de PS (Avanti 840035P) y 55 % mol de PC (Avanti 850457) con una concentración total de lípidos de 15,2 mg/ml para la solución de liposomas 4x. El PC, DAG y PS se disolvieron en cloroformo, se combinaron y se secaron al vacío hasta formar una película delgada. Los lípidos se hidrataron a 20 mM en MOPS 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCh 5 mM y se congelaron y descongelaron cinco veces. La suspensión lipídica se extruyó once veces a través de un filtro de policarbonato de 100 nm. Se llevó a cabo una dispersión dinámica de la luz para confirmar el tamaño de los liposomas (radio de 50-60 nm). La preparación de liposomas se almacenó a 4 °C durante cuatro semanas.

Expresión de baculovirus de DGKa y DGK£ humanas

Se generaron muestras de baculovirus DGK-alfa-TVMV-His-pFBgate humano y DGK-zeta-transcript variant-2-TVMV-His-pFBgate humano usando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN usado para la expresión de DGK-alfa y DGK-zeta tiene las SEC ID NO: 1 y 3, respectivamente. La amplificación de baculovirus se logró usando células Sf9 infectadas en proporciones de virus/célula de 1:1500 y se cultivaron durante 65 horas a 27 °C después de la transfección.

El escalamiento de la expresión para cada proteína se llevó a cabo en el Cellbag 50L WAVE-Bioreactor System 20/50 de GE Healthcare Bioscience. Se infectaron 12 l de 2 * 106 células/ml de células Sf9 (Expression System, Davis, CA) cultivadas en el medio de insecto ESF921 (Expression System) con un material en almacenamiento del virus en proporciones de virus/célula de 1:200, y se cultivaron durante 66-68 horas a 27 °C post-infección. El cultivo celular infectado se cosechó por centrifugación a 2000 rpm durante 20 min 4 °C en una centrífuga SORVALL® RC12BP. Los sedimentos celulares se almacenaron a -70 °C hasta su purificación. ;;Purificación de DGK-alfa y DGK-zeta humanas;;Se purificaron DGKa y DGK^ humanas de longitud completa, cada una expresada con una secuencia de etiqueta Hexa-His C-terminal escindible con TVMV (SEC ID NO: 2 y 4, respectivamente) y producidas como se describió anteriormente, a partir de una pasta celular de insecto infectada con baculovirus Sf9. Las células se lisaron usando el método de cavitación de nitrógeno con una bomba de nitrógeno (Parr Instruments), y los lisados se clarificaron por centrifugación. Los lisados clarificados se purificaron hasta una homogeneidad de ~90 % mediante tres etapas sucesivas de cromatografía en columna en un sistema ÁKTA Purifier Plus. La cromatografía en columna de tres etapas incluyó la captura de la resina de afinidad de níquel (es decir, un material bruto de HisTrap FF, GE Healthcare), seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (es decir, HiLoad 26/600 Superdex 200 grado preparativo, GE Healthcare para DGK-alfa y HiPrep 26/600 Sephacryl S 300_HR, GE Healthcare para DGK-zeta). El tercer paso fue la cromatografía de intercambio iónico y fue diferente para las dos isoformas. DGKa se pulió mediante cromatografía de intercambio aniónico Q-Sepharose (GE Healthcare). La DGK^ se pulió mediante cromatografía de intercambio catiónico SP Sepharose (GE Healthcare). Las proteínas se administraron en concentraciones de > 2 mg/ml. Las soluciones amortiguadoras de formulación fueron idénticas para ambas proteínas: Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 500 mM, glicerol al 10 % v/v, TCEP 1 mM y EDTA 0,5 mM. ;;Ensayo 2: Ensayos de inhibición de DGK in vitro - Método B;;Las reacciones de DGKa y DGK^ se realizaron usando liposomas extruidos (ensayos de LIPGLO de DGKa y DGKQ. Las reacciones se llevaron a cabo en MOPS 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCh 10 mM, CaCh 1 |iM y DTT 1 mM (amortiguador de ensayo). Las concentraciones del sustrato lipídico fueron PS 2 mM, DAG 0,25 mM y PC 2,75 mM para las reacciones de liposomas extruidos (lípido total 5 mM). Las reacciones se llevaron a cabo en ATP 150 |iM. Las concentraciones de enzima para DGKa y DGK^ fueron de 5 nM. ;;Los estudios de inhibición de compuestos se llevaron a cabo de la siguiente manera: se transfirieron gotas de 25 nl de cada compuesto de prueba (concentración superior 10 mM con 11 puntos, series de dilución de 3 veces para cada compuesto) solubilizados en DMSO a cavidades de una placa blanca de 1536 cavidades (Corning 3725). Se preparó una solución de sustrato de lípido/enzima de 5 ml a una concentración de reacción final de 2x combinando 2,5 ml de la solución de enzima 4x (DGKa o DGK^ 20 nM (preparada como se describe a continuación) en el amortiguador de ensayo) y 2,5 ml de solución de micelas de lípidos/detergente 4x (composiciones descritas a continuación) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se añadió 1 |il de la solución de enzima/sustrato lipídico 2x a las cavidades que contuvieron el compuesto de prueba y se iniciaron las reacciones con la adición de 1 |il de ATP 300 uM. Se permitió que las reacciones prosiguieran durante 2 horas, después de lo cual se añadieron 2 |il del reactivo Glo (Promega V9101) y se incubaron durante 40 minutos. A continuación, se agregaron 4 |il del reactivo de detección de cinasa y se incubó durante 30 minutos. La luminiscencia se registró usando un lector de microplacas EnVision. El porcentaje de inhibición se calculó a partir de la conversión de ATP generada por reacciones sin control enzimático para el 100 % de inhibición y reacciones con vehículo solo para el 0 % de inhibición. Los compuestos se evaluaron a 11 concentraciones para determinar la CI<50>, ;;Preparación de liposomas 2x;;La composición de lípidos fue de 5 % mol de DAG (Avanti 8008110), 40 % mol de PS (Avanti 840035P) y 55 % mol de PC (Avanti 850457) con una concentración total de lípidos de 7-8 mg/ml para la solución de liposomas. El PC, DAG y PS se disolvieron en cloroformo, se combinaron y se secaron al vacío hasta formar una película delgada. Los lípidos se hidrataron a 20 mM en MOPS 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCh 5 mM y se congelaron y descongelaron cinco veces. La suspensión de lípidos se extruyó a través de un filtro de policarbonato de 100 nm 10-12 veces. Se llevó a cabo una dispersión dinámica de la luz para confirmar el tamaño de los liposomas (radio de 50-60 nm). La preparación de liposomas se almacenó a 4 °C durante cuatro semanas. ;;Expresión de baculovirus de DGKa humano de longitud casi completa y DGK£ de longitud completaSe generaron muestras de baculovirus humano MA-hDGKa-(S9-S727)-Ct-TVMV-His-pFBgate y DGK^-transcript variant-2-TVMV-His-pFBgate humano de longitud completa usando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante (nota: MA- en el nombre de los reactivos DGKa indica que se agregaron dos aminoácidos adicionales antes de Ser-9). El ADN usado para la expresión de DGKa(9-727) y DGK^ tiene las SEC ID NO: 5 y 3, respectivamente. La amplificación de baculovirus se logró usando células Sf9 infectadas en proporciones de virus/célula de 1:1500 y se cultivaron durante 65 horas a 27 °C después de la transfección. ;;El escalamiento de la expresión para la proteína DGKa(9-727) de longitud casi completa se llevó a cabo en frascos de 2 l, y la DGK^ de longitud completa se realizó con un sistema 20/50 de biorreactor WAVE Cellbag de 50 l de GE Healthcare Bioscience. Las proteínas se expresaron en diferentes volúmenes usando condiciones similares. Para la expresión de DGKa(9-727), se usaron matraces de 2 x 2 l, cada uno con un volumen final de 0,8 l del medio de cultivo, y se cultivó DGK^ a una escala de 12 l en un Cellbag de 50 l. Para cada uno, se sembró una densidad inicial de 2 * 106 células/ml de células Sf9 (Expression System, Davis, CA) en el medio de insecto ESF921 (Expression System), se infectaron con una reserva del virus en proporciones de virus/células de 1:200 y se cultivaron durante 66-68 horas a 27 °C post-infección. Los cultivos de células infectadas se recolectaron por centrifugación a 2000 rpm durante 20 min a 4°C en una centrífuga SORVALL® RC12BP. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C hasta su purificación.

Purificación de DGK-alfa y DGK-zeta humanas

La DGKa(9-727) humana y la DGK^ de longitud completa, cada una expresada conteniendo una secuencia etiqueta Hexa-His C-terminal escindible con TVMV (SEC ID NO: 2 y 4, respectivamente) y producida como se describió anteriormente, se purificaron a partir de una pasta de células de insecto infectadas con el baculovirus Sf9. Las pastas celulares se descongelaron y se suspendieron en una solución amortiguadora (HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 300 mM, glicerol al 10 % v/v, TCEP 1 mM que contuvo benzonasa e inhibidores de proteasa), hasta 1:10 v/v del volumen de cultivo original. La lisis se realizó usando el método de cavitación de nitrógeno con una bomba de nitrógeno (Parr Instruments) y los lisados se clarificaron mediante centrifugación a alta velocidad. Los lisados clarificados se purificaron hasta una homogeneidad de ~90 % mediante dos o tres etapas sucesivas de cromatografía en columna, respectivamente, en un sistema ÁKTA Purifier Plus. Ambas isoformas se purificaron mediante purificación por afinidad con níquel con elución en gradiente de imidazol (es decir, HisTrap FF, GE Healthcare), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (es decir, HiLoad 26/600 Superdex 200 grado de preparación, GE Healthcare, para DGKa(9-727), y HiPrep 26/600 Sephacryl S 300 HR, GE Healthcare, para DGKQ. Estas dos etapas produjeron DGKa(9-727) con una pureza > 90 %. Lograr una pureza similar para DGK^ de longitud completa requirió una tercera etapa, empleando cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose FF, GE Healthcare) y eluyendo con un gradiente de NaCl. Las soluciones amortiguadoras de formulación final fueron similares para ambas proteínas, con DGKa(9-727) preparado en Hepes 50 mM, pH 7,3, NaCl 300 mM, glicerol al 10% v/v y TCEP 1 mM, y DGK^ de longitud completa preparado en Hepes 50 mM, pH 7,3, NaCl 500 mM, glicerol al 5% v/v y TCEP 1 mM. Las proteínas se concentraron a 1-2 mg/ml, se congelaron instantáneamente y se mantuvieron a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.

Ensayo 3: Ensayo de IL2 de linfocitos T CD4 de Raji

Se realizó un ensayo de IL-2 de 1536 cavidades en un volumen de 4 pl usando linfocitos T CD4 preactivados y células de Raji. Antes del ensayo, los linfocitos T CD4 se preactivaron mediante el tratamiento con a-CD3, a-CD28 y PHA a 1,5 pg/ml, 1 pg/ml y 10 pg/ml, respectivamente. Las células de Raji se trataron con enterotoxina estafilocócica B (SEB) a 10,000 ng/ml. Los compuestos diluidos en serie se transfirieron primero a una placa de ensayo de 1536 cavidades (Corning, n.° 3727), seguido de la adición de 2 pl de linfocitos T CD4 preactivados (densidad final a 6000 células/cavidad) y 2 pl de células de Raji tratadas con SEB (2000 células/cavidad). Después de 24 horas de incubación en una incubadora a 37 °C/CO<2>al 5 %, se añadieron 4 pl de reactivos de detección de IL-2 a la placa de ensayo (Cisbio, n.° 64IL2PEC). Las placas de ensayo se leyeron en un lector Envision. Para evaluar la citotoxicidad del compuesto, se incubaron los linfocitos T de CD4 o de Raji con los compuestos diluidos en serie. Después de 24 horas de incubación, se añadieron 4 pl de Cell Titer Glo (Promega, n.° G7572) y las placas se leyeron en un lector Envision. La concentración efectiva al 50 % (CI<50>) se calculó usando la fórmula logística de cuatro parámetros y = A+((B-A)/(1+((C/x)AD))), donde A y B indican el % mínimo y máximo de activación o inhibición, respectivamente, C es la CI<50>, D es la pendiente de la colina y x representa la concentración del compuesto.

Ensayo 4: Ensayo de proliferación de linfocitos T CD8 CellTiter-Glo

Los linfocitos T CD8 humanos sin tratar congelados se descongelaron en RPMI FBS al 10 %, se incubaron durante 2 h a 37 °C y se contaron. La placa de cultivo de tejidos de 384 cavidades se recubrió durante la noche a 4 °C con 20 pl de anti CD3 humano a 0,1 pg/ml en RPMI simple, que se retiró de la placa antes de que se añadieran 20k/40 pl de linfocitos T CD8 con 0,5 pg/ml de anti CD28 humano soluble a cada cavidad. El efecto de los compuestos en la placa de células se notó inmediatamente después de sembrar las células. Después de 72 h de incubación a 37 °C, se agregaron 10 pl de reactivo CellTiter-glo (número de catálogo Promega G7570) a cada cavidad. La placa se agitó vigorosamente durante 5 minutos, se incubó a temperatura ambiente durante otros 15 minutos y se leyó en Envision para determinar la proliferación de linfocitos T CD8. En el análisis, la señal de los linfocios T CD8 estimulados con 0,1 |jg/ml de anti CD3 y 0,5 jg/m l de anti CD28 fue el fondo. El compuesto de referencia, el 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo, a 3 jM se usó para establecer el intervalo de 100 % y la EC<50>se fijó en 50 % absoluto para normalizar los datos.

Ensayo 5: Ensayo del informador AP1 de DGK

El informador de API-luciferasa de Jurkat se generó usando el kit Cignal Lenti AP1 Reporter (luc) de SABiosciences (CLS-011L).

Los compuestos se transfirieron desde una placa Echo LDV a cavidades individuales de una placa de 384 cavidades (placa blanca, de fondo sólido, opaca PE CulturPlate 6007768) usando un instrumento Echo550, El tamaño de la muestra fue de 30 nl por cavidad; y una placa de destino por placa de origen. Las suspensiones celulares se prepararon transfiriendo 40 ml de células (2 x 20 ml) a tubos cónicos limpios de 50 ml. Las células se concentraron por centrifugación (1200 rpm; 5 min; temperatura ambiente). Se eliminó el sobrenadante y todas las células se suspendieron en RPMI (Gibco 11875) FBS al 10 % para obtener una concentración de 1,35 x 106 células/ml. Las células se añadieron manualmente usando una pipeta multicanal, 30 jl/cavidad de suspensión celular a una placa TC de 384 cavidades que contuvo los compuestos, 4,0x104 células por cavidad. Las placas de células se incubaron durante 20 minutos a 37 °C y 5 % de CO<2>.

Durante la incubación, se prepararon soluciones de anticuerpos anti CD3 (aCD3) mezclando 3 j l de aCD3 (1,3 mg/ml) con 10 ml del medio [concentración final = 0,4 jg/ml]. A continuación, se mezclaron 1,5 j l de aCD3 (1,3 mg/ml) con 0,5 ml del medio [conc. final = 4 jg/ml]. Después de 20 minutos, se agregaron 10 j l del medio a todas las cavidades en la columna 1, cavidades A a M, y 10 j l de aCD3 (4 ug/ml) por cavidad en la columna 1, filas N a P como referencia. A continuación, usando una pipeta multicanal, se agregaron 10 j l de aCD3 (0,4 ug/ml) por cavidad. Las células tratadas con el compuesto /- estimuladas con aCD3 se incubaron a 37 °C, CO<2>al 5 % durante 6 horas.

Durante este período de incubación, el reactivo Steady-Glo (Promega E2520) se descongeló lentamente a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 20 j l del reactivo Steady-Glo por cavidad usando un dispensador Combi multigota. Las burbujas se eliminaron por centrifugación (2000 rpm, temperatura ambiente, 10 segundos). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las muestras se caracterizaron midiendo las unidades de luz relativas (RLU) con un instrumento Envision Plate Reader en un protocolo de luminiscencia. Los datos se analizaron usando el compuesto de referencia, el 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridin-2-carbonitrilo, para normalizar la inhibición al 100 %.

Ensayo 6: Ensayo de linfocitos T citotóxicos de murino

Se desarrolló un ensayo de linfocitos T citolíticos específicos para el antígeno (CTL) para evaluar funcionalmente la capacidad de los inhibidores de DGKa y DGK^ para mejorar la actividad de destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T efectores. Los linfocitos T CD8+ aislados del ratón transgénico OT-1 reconocen las células presentadoras de antígeno, MC38, que presentan el péptido derivado de ovoalbúmina SIINFEKL. El reconocimiento del antígeno afín inicia la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno OT-1.

Las células CTL funcionales se generaron de la siguiente manera: se aislaron y expandieron esplenocitos OT-1 de ratones de 8 a 12 semanas de edad en la presencia del péptido SIINFEKL a 1 jg/m l y mIL2 a 10 U/ml. Después de tres días, se añadió medio fresco con mIL2 U/ml. El día 5 de la expansión, los linfocitos T CD8+ fueron aisladas y estuvieron listos para su uso. Las células CTL activadas pueden almacenarse congeladas durante 6 meses. Por separado, un millón de células tumorales MC38 fueron pulsadas con 1 jg/m l del péptido SIINFEKL-OVA durante 3 horas a 37 °C. Las células se lavaron (3X) con medio nuevo para eliminar el exceso de péptido. Finalmente, las células CTL que se pretrataron con inhibidores de DGK durante 1 hora en una placa con fondo de U de 96 cavidades se combinaron con las células tumorales MC38 cargadas con antígeno en una proporción de 1:10, A continuación, las células se centrifugaron a 700 rpm durante 5 min y se colocaron en una incubadora durante la noche a 37 °C. Después de 24 horas, se recogió el sobrenadante para el análisis de los niveles de citocinas de IFN-y mediante AlphaLisa adquirido de Perkin Elmer.

Ensayo 7: Ensayo de proliferación de PHA

Se incubaron células blásticas estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) de reservas congeladas en el medio RPMI (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante una hora antes de agregarlas a cavidades individuales de una placa de 384 cavidades (10,000 células por cavidad). Los compuestos se transfirieron a cavidades individuales de una placa de 384 cavidades y las células tratadas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO<2>durante 72 h en el medio de cultivo que contuvo IL2 humana (20 ng/ml) antes de medir el crecimiento usando el reactivo MTS [3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio] siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). El porcentaje de inhibición se calculó comparando los valores entre el control estimulado con IL2 (0 % de inhibición) y el control no estimulado (100 % de inhibición). Las determinaciones de la concentración de inhibición (CI<50>) se calcularon sobre la base de una inhibición del 50 % en el número de veces de inducción entre tratamientos estimulados y no estimulados con IL2.

Ensayo 8: Ensayo de IFN-yde linfocitos T CD8 humanos

Los linfocitos T CD8 humanos sin tratar congelados se descongelaron en medio AIM-V, se incubaron durante 2 h a 37 °C y se contaron. La placa de cultivo de tejidos de 384 cavidades se cubrió durante la noche a 4 °C con 20 pl de anti CD3 humano a 0,05 pg/ml en PBS, que se retiró de la placa antes de que se agregaran 40,000 células por 40 microlitros de linfocitos T CD8 con 0,1 pg /ml de anti CD28 humano soluble a cada cavidad. Los compuestos se transfirieron usando un manipulador de líquidos Echo a la placa de células inmediatamente después de sembrar las células. Después de 20 h de incubación en una incubadora a 37 °C, se transfirieron 3 microlitros por cavidad de los sobrenadantes a una nueva placa de ensayo blanca de 384 cavidades para la medición de citoquinas.

El interferón-y (IFN-y) se cuantificó usando el kit AlphLISA (n.° de cat. AL217) como se describe en el manual del fabricante (Perkin Elmer). Los recuentos de cada cavidad se convirtieron a concentración de IFN-y (pg/ml). Los valores de EC<50>del compuesto se determinaron estableciendo 0,05 pg/ml de anti CD3 más 0,1 pg/ml de anti CD28 como línea de base y coestimulando con 3 pM del compuesto de referencia, el 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridina-2-carbonitrilo, con anti CD3 más anti CD28 como activación al 100 %.

Ensayo 9: Ensayo de pERK de linfocitos T CD8 humanos

Los linfocitos T CD8 humanos sin tratar congelados se descongelaron en el medio AIM-V, se incubaron durante 2 h a 37 °C y se contaron. Los linfocitos T positivos para CD8 se añadieron a una placa de cultivo tisular de 384 cavidades a razón de 20,000 células por cavidad en el medio AIM-V. Se añadió un compuesto a cada cavidad, a continuación se añadieron mAb anti CD3 humano y anti CD28 unidos a perlas a una concentración final de 0,3 pg/ml. Las células se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. La reacción se detuvo añadiendo una solución amortiguadora de lisis del kit AlphaLISA Surefire. (Perkin Elmer, número de cat. ALSU-PERK-A). El lisado (5 pl por cavidad) se transfirió a una nueva placa blanca de ensayo de 384 cavidades para medir la activación de pERK.

Se determinó la EC<50>del compuesto ajustando el anti CD3 más anti CD28 como la línea de base y la coestimulación de 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil)piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridina-2-carbonitrilo 3 pM con anti CD3 más anti CD28 como activación al 100 %.

Ensayo 10: Ensayo de IFN-yen sangre entera humana

La sangre entera venosa humana (22,5 pl por cavidad), obtenida de donantes sanos, se pretrató con los compuestos durante una hora a 37 °C en una incubadora humidificada con 95 % de aire/5 % de CO<2>. La sangre se estimuló con 2,5 pl de mAb anti CD3 humano y anti CD28 a una concentración final de 1 pg/ml cada uno durante 24 horas a 37 °C. El IFN-<y>en los sobrenadantes se midió usando el kit AlphLISA (n.° de cat. AL217).

Se determinó la EC<50>del compuesto ajustando el anti CD3 más anti CD28 como la línea de base, y la coestimulación de 3 pM del compuesto de referencia, el 8-(4-(bis(4-fluorofenil)metil) piperazin-1-il)-5-metil-7-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-1,5-naftiridina-2-carbonitrilo, con anti CD3 más anti CD28 como activación al 100 %.

Ensayo 11: Ensayo pERK de sangre entera humana DGK

El ensayo de fosforilación de ERK en sangre completa humana se realizó con sangre venosa completa humana obtenida de donantes sanos (extraída con heparina como anticoagulante). Se añadieron diluciones en serie de compuestos (11 puntos, 3 veces) en DMSO a placas de 384 cavidades a 20 nl/cavidad usando un dispensador acústico ECHO 550 (Labcyte) para lograr una concentración inicial final de 20 pM en el ensayo. Se añadió sangre completa humana heparinizada a la placa compuesta a razón de 9 pl por cavidad y se incubó durante una hora a 37 °C en un incubador humidificado al 95 % aire/5 % CO<2>. Después de una hora de incubación del compuesto, se añadió a la cavidad 1 pl del anticuerpo anti CD3 humano (interno) en la presencia de IgG de cabra anti ratón reticulante (4 pg/ml) a una concentración final de 1 pg/ml para la estimulación de la vía y, además, se incuba durante 15 minutos a 37 °C. La estimulación se detuvo añadiendo 90 pl de una solución amortiguadora Fix/Lyse (BD 558049). Las células se lavaron y tiñeron con anticuerpos anti CD8 PE (BD 555635) durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo y se permeabilizaron en hielo usando una solución amortiguadora Perm III (BD 558050) durante 30 minutos. A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo Alexa Fluor® 647 anti ERK1/2 fosfo (Thr202/Tyr204) (Bioleged 675504) durante 60 minutos a una dilución de 1:50, Las muestras se lavaron y se resuspendieron en dPBS que contuvo BSA al 1 % (dPBS, Gibco 14190136; BSA, Sigma-Aldrich A9205). Las muestras se analizaron con Intellicyt® iQue Screener PLUS. La activación de pERK se cuantificó por el porcentaje de población positiva para pERK dentro de la población positiva para CD8. Los cálculos de las potencias de los compuestos se basaron en el compuesto interno a una concentración de 20 pM como una activación del 100 % y el control anti CD3 como una activación del 0 %.

Tabla A

Valores de actividad de CI de inhibición de DGK in vitro

La tabla A enumera los valores de actividad de CI<50>de inhibición de DGKin vitromedidos en los ensayos de liposomas de DGKa y DGKC (LIPGLO).

Los compuestos de la presente invención poseen actividad como inhibidor(es) de una o ambas enzimas DGKa y DGK^ y, por lo tanto, pueden usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con la inhibición de la actividad de DGKa y DGKC

Secuencia de nucleótidos que codifica hDGKa-(M1-S735)-Ct-TVMV-His:

1 ATGGCCAAGG AGAGGGGCCT AATAAGCCCC AGTGATTTTG CCCAGCTGCA

51 AAAATACATG GAATACTCCA CCAAAAAGGT CAGTGATGTC CTAAAGCTCT

101 TCGAGGATGG CGAGATGGCT AAATATGTCC AAGGAGATGC CATTGGGTAC

151 GAGGGATTCC AGCAATTCCT GAAAATCTAT CTCGAAGTGG ATAATGTTCC

201 CAGACACCTA AGCCTGGCAC TGTTTCAATC CTTTGAGACT GGTCACTGCT

251 TAAATGAGAC AAATGTGACA AAAGATGTGG TGTGTCTCAA TGATGTTTCC

301 TGCTACTTTT CCCTTCTGGA GGGTGGTCGG CCAGAAGACA AGTTAGAATT

351 CACCTTCAAG CTGTACGACA CGGACAGAAA TGGGATCCTG GACAGCTCAG

401 AAGTGGACAA AATTATCCTA CAGATGATGC GAGTGGCTGA ATACCTGGAT

451 TGGGATGTGT CTGAGCTGAG GCCGATTCTT CAGGAGATGA TGAAAGAGAT

501 TGACTATGAT GGCAGTGGCT CTGTCTCTCA AGCTGAGTGG GTCCGGGCTG

551 GGGCCACCAC CGTGCCACTG CTAGTGCTGC TGGGTCTGGA GATGACTCTG

601 AAGGACGACG GACAGCACAT GTGGAGGCCC AAGAGGTTCC CCAGACCAGT

651 CTACTGCAAT CTGTGCGAGT CAAGCATTGG TCTTGGCAAA CAGGGACTGA

701 GCTGTAACCT CTGTAAGTAC ACTGTTCACG ACCAGTGTGC CATGAAAGCC

751 CTGCCTTGTG AAGTCAGCAC CTATGCCAAG TCTCGGAAGG ACATTGGTGT

801 CCAATCACAT GTGTGGGTGC GAGGAGGCTG TGAGTCCGGG CGCTGCGACC

851 GCTGTCAGAA AAAGATCCGG ATCTACCACA GTCTGACCGG GCTGCATTGT

901 GTATGGTGCC ACCTAGAGAT CCACGATGAC TGCCTGCAAG CGGTGGGCCA

951 TGAGTGTGAC TGTGGGCTGC TCCGGGATCA CATCCTGCCT CCATCTTCCA

1001 TCTATCCCAG TGTCCTGGCC TCTGGACCGG ATCGTAAAAA TAGCAAAACA

1051 AGCCAGAAGA CCATGGATGA TTTAAATTTG AGCACCTCTG AGGCTCTGCG

1101 GATTGACCCT GTTCCTAACA CCCACCCACT TCTCGTCTTT GTCAATCCTA

1151 AGAGTGGCGG GAAGCAGGGG CAGAGGGTGC TCTGGAAGTT CCAGTATATA

1201 TTAAACCCTC GACAGGTGTT CAACCTCCTA AAGGATGGTC CTGAGATAGG

1251 GCTCCGATTA TTCAAGGATG TTCCTGATAG CCGGATTTTG GTGTGTGGTG

1301 GAGACGGCAC AGTAGGCTGG ATTCTAGAGA CCATTGACAA AGCTAACTTG

1351 CCAGTTTTGC CTCCTGTTGC TGTGTTGCCC CTGGGTACTG GAAATGATCT

1401 GGCTCGATGC CTAAGATGGG GAGGAGGTTA TGAAGGACAG AATCTGGCAA

1451 AGATCCTCAA GGATTTAGAG ATGAGTAAAG TGGTACATAT GGATCGATGG

1501 TCTGTGGAGG TGATACCTCA ACAAACTGAA GAAAAAAGTG ACCCAGTCCC

1551 CTTTCAAATC ATCAATAACT ACTTCTCTAT TGGCGTGGAT GCCTCTATTG

1601 CTCATCGATT CCACATCATG CGAGAGAAAT ATCCGGAGAA GTTCAACAGC

1651 AGAAT GAAGA ACAAGCTATG GTACTTCGAA TTTGCCACAT CTGAATCCAT

1701 CTTCTCAACA TGCAAAAAGC TGGAGGAGTC TTTGACAGTT GAGATCTGTG

1751 GGAAACCGCT GGATCTGAGC AACCTGTCCC TAGAAGGCAT CGCAGTGCTA

1801 AACATCCCTA GCATGCATGG TGGCTCCAAC CTCTGGGGTG ATACCAGGAG

1851 ACCCCATGGG GATATCTATG GGATCAACCA GGCCTTAGGT GCTACAGCTA

1901 AAGTCATCAC CGACCCTGAT ATCCTGAAAA CCTGTGTACC AGACCTAAGT

1951 GACAAGAGAC TGGAAGTGGT TGGGCTGGAG GGTGCAATTG AGATGGGCCA

2001 AATCTATACC AAGCTCAAGA ATGCTGGACG TCGGCTGGCC AAGTGCTCTG

2051 AGATCACCTT CCACACCACA AAAACCCTTC CCATGCAAAT TGACGGAGAA

2101 CCCTGGATGC AGACGCCCTG TACAATCAAG ATCACCCACA AGAACCAGAT

2151 GCCCATGCTC ATGGGCCCAC CCCCCCGCTC CACCAATTTC TTTGGCTTCT

2201 TGAGCGGATC CTCGGAGACA GTGCGGTTTC AGGGACACCA CCACCATCAC

2251 CACTGA

(SEC ID NO: 1)

Secuencia de aminoácidos de hDGKa-(M1-S735)-Ct-TVMV-His:

0001 MAKERGLISP SDFAQLQKYM EYSTKKVSDV LKLFEDGEMA KYVQGDAIGY EGFQQFLKIY 0060

0061 LEVDNVPRHL SLALFQSFET GHCLNETNVT KDWCLNDVS CYFSLLEGGR PEDKLEFTFK 0120

0121 LYDTDRNGIL DSSEVDKIIL QMMRVAEYLD WDVSELRPIL QEMMKEIDYD GSGSVSQAEW 0180

0181 VRAGATTVPL LVLLGLEMTL KDDGQHMWRP KRFPRPVYCN LCESSIGLGK QGLSCNLCKY 0240

0241 TVHDQCAMKA LPCEVSTYAK SRKDIGVQSH VWVRGGCESG RCDRCQKKIR IYHSLTGLHC 0300

0301 VWCHLEIHDD CLQAVGHECD CGLLRDHILP PSSIYPSVLA SGPDRKNSKT SQKTMDDLNL 0360

0361 STSEALRIDP VPNTHPLLVF VNPKSGGKQG QRVLWKFQYI LNPRQVFNLL KDGPEIGLRL 0420

0421 FKDVPDSRIL VCGGDGTVGW ILETIDKANL PVLPPVAVLP LGTGNDLARC LRWGGGYEGQ 0480

0481 NLAKILKDLE MSKWHMDRW SVEVIPQQTE EKSDPVPFQI INNYFSIGVD ASIAHRFHIM 0540

0541 REKYPEKFNS RMKNKLWYFE FATSESIFST CKKLEESLTV EICGKPLDLS NLSLEGIAVL 0600

0601 NIPSMHGGSN LWGDTRRPHG DIYGINQALG ATAKVITDPD ILKTCVPDLS DKRLEWGLE 0660

0661 GAIEMGQIYT KLKNAGRRLA KCSEITFHTT KTLPMQIDGE PWMQTPCTIK ITHKNQMPML 0720

0721 MGPPPRSTNF FGFLSGSSET VRFQGHHHHH H 0751

(SEC ID NO: 2)

Secuencia de nucleótidos que codifica hDGK£r (M1-A928)-transcripción variante-2 Ct-TVMV-His:

1 ATGGAGCCGC GGGACGGTAG CCCCGAGGCC CGGAGCAGCG ACTCCGAGTC

51 GGCTTCCGCC TCGTCCAGCG GCTCCGAGCG CGACGCCGGT CCCGAGCCGG

101 ACAAGGCGCC GCGGCGACTC AACAAGCGGC GCTTCCCGGG GCTGCGGCTC

151 TTCGGGCACA GGAAAGCCAT CACGAAGTCG GGCCTCCAGC ACCTGGCCCC

201 CCCTCCGCCC ACCCCTGGGG CCCCGTGCAG CGAGTCAGAG CGGCAGATCC

251 GGAGTACAGT GGACTGGAGC GAGTCAGCGA CATATGGGGA GCACATCTGG

301 TTCGAGACCA ACGTGTCCGG GGACTTCTGC TACGTTGGGG AGCAGTACTG

351 TGTAGCCAGG ATGCTGCAGA AGTCAGTGTC TCGAAGAAAG TGCGCAGCCT

401 GCAAGATTGT GGTGCACACG CCCTGCATCG AGCAGCTGGA GAAGATAAAT

451 TTCCGCTGTA AGCCGTCCTT CCGTGAATCA GGCTCCAGGA ATGTCCGCGA

501 GCCAACCTTT GTACGGCACC ACTGGGTACA CAGACGACGC CAGGACGGCA

551 AGTGTCGGCA CTGTGGGAAG GGATTCCAGC AGAAGTTCAC CTTCCACAGC

601 AAGGAGATTG TGGCCATCAG CTGCTCGTGG TGCAAGCAGG CATACCACAG

651 CAAGGTGTCC TGCTTCATGC TGCAGCAGAT CGAGGAGCCG TGCTCGCTGG

701 GGGTCCACGC AGCCGTGGTC ATCCCGCCCA CCTGGATCCT CCGCGCCCGG

751 AGGCCCCAGA ATACTCTGAA AGCAAGCAAG AAGAAGAAGA GGGCATCCTT

801 CAAGAGGAAG TCCAGCAAGA AAGGGCCTGA GGAGGGCCGC TGGAGACCCT

851 TCATCATCAG GCCCACCCCC TCCCCGCTCA TGAAGCCCCT GCTGGTGTTT

901 GTGAACCCCA AGAGTGGGGG CAACCAGGGT GCAAAGATCA TCCAGTCTTT

951 CCTCTGGTAT CTCAATCCCC GACAAGTCTT CGACCTGAGC CAGGGAGGGC

1001 CCAAGGAGGC GCTGGAGATG TACCGCAAAG TGCACAACCT GCGGATCCTG

1051 GCGTGCGGGG GCGACGGCAC GGTGGGCTGG ATCCTCTCCA CCCTGGACCA

1101 GCTACGCCTG AAGCCGCCAC CCCCTGTTGC CATCCTGCCC CTGGGTACTG

1151 GCAACGACTT GGCCCGAACC CTCAACTGGG GTGGGGGCTA CACAGATGAG

1201 CCTGTGTCCA AGATCCTCTC CCACGTGGAG GAGGGGAACG TGGTACAGCT

1251 GGACCGCTGG GACCTCCACG CTGAGCCCAA CCCCGAGGCA GGGCCTGAGG

1301 ACCGAGATGA AGGCGCCACC GACCGGTTGC CCCTGGATGT CTTCAACAAC

1351 TACTTCAGCC TGGGCTTTGA CGCCCACGTC ACCCTGGAGT TCCACGAGTC

1401 TCGAGAGGCC AACCCAGAGA AATTCAACAG CCGCTTTCGG AATAAGATGT

1451 TCTACGCCGG GACAGCTTTC TCTGACTTCC TGATGGGCAG CTCCAAGGAC

1501 CTGGCCAAGC ACATCCGAGT GGTGTGTGAT GGAATGGACT TGACTCCCAA

1551 GATCCAGGAC CTGAAACCCC AGTGTGTTGT TTTCCTGAAC ATCCCCAGGT

1601 ACTGTGCGGG CACCATGCCC TGGGGCCACC CTGGGGAGCA CCACGACTTT

1651 GAGCCCCAGC GGCATGACGA CGGCTACCTC GAGGTCATTG GCTTCACCAT

1701 GACGTCGTTG GCCGCGCTGC AGGTGGGCGG ACACGGCGAG CGGCTGACGC

1751 AGTGTCGCGA GGTGGTGCTC ACCACATCCA AGGCCATCCC GGTGCAGGTG

1801 GATGGCGAGC CCTGCAAGCT TGCAGCCTCA CGCATCCGCA TCGCCCTGCG

1851 CAACCAGGCC ACCATGGTGC AGAAGGCCAA GCGGCGGAGC GCCGCCCCCC

1901 TGCACAGCGA CCAGCAGCCG GTGCCAGAGC AGTTGCGCAT CCAGGTGAGT

1951 CGCGTCAGCA TGCACGACTA TGAGGCCCTG CACTACGACA AGGAGCAGCT

2001 CAAGGAGGCC TCTGTGCCGC TGGGCACTGT GGTGGTCCCA GGAGACAGTG

2051 ACCTAGAGCT CTGCCGTGCC CACATTGAGA GACTCCAGCA GGAGCCCGAT

2101 GGTGCTGGAG CCAAGTCCCC GACATGCCAG AAACTGTCCC CCAAGTGGTG

2151 CTTCCTGGAC GCCACCACTG CCAGCCGCTT CTACAGGATC GACCGAGCCC

2201 AGGAGCACCT CAACTATGTG ACTGAGATCG CACAGGATGA GATTTATATC

2251 CTGGACCCTG AGCTGCTGGG GGCATCGGCC CGGCCTGACC TCCCAACCCC

2301 CACTTCCCCT CTCCCCACCT CACCCTGCTC ACCCACGCCC CGGTCACTGC

2351 AAGGGGATGC TGCACCCCCT CAAGGTGAAG AGCTGATTGA GGCTGCCAAG

2401 AGGAACGACT TCTGTAAGCT CCAGGAGCTG CACCGAGCTG GGGGCGACCT

2451 CATGCACCGA GAC GAGCAGA GTCGCACGCT CCTGCACCAC GCAGTCAGCA

2501 CTGGCAGCAA GGATGTGGTC CGCTACCTGC TGGACCACGC CCCCCCAGAG

2551 ATCCTTGATG CGGTGGAGGA AAACGGGGAG ACCTGTTTGC ACCAAGCAGC

2601 GGCCCTGGGC CAGCGCACCA TCTGCCACTA CATCGTGGAG GCCGGGGCCT

2651 CGCTCATGAA GACAGACCAG CAGGGCGACA CTCCCCGGCA GCGGGCTGAG

2701 AAGGCTCAGG ACACCGAGCT GGCCGCCTAC CTGGAGAACC GGCAGCACTA

2751 CCAGATGATC CAGCGGGAGG ACCAGGAGAC GGCTGTGGGA TCCTCGGAGA

2801 CAGTGCGGTT TCAGGGACAC CACCACCATC ACCACTGA

(SEC ID NO: 3)

Secuencia de aminoácidos de hDGK¿A(M1-A928)-transcripción variante-2 Ct-TVMV-His:

0001 MEPRDGSPEA RSSDSESASA SSSGSERDAG PEPDKAPRRL NKRRFPGLRL FGHRKAITKS 0060

0061 GLQHLAPPPP TPGAPCSESE RQIRSTVDWS ESATYGEHIW FETNVSGDFC YVGEQYCVAR 0120

0121 mLQKSVSRRK CAACKIWHT PCIEQLEKIN FRCKPSFRES GSRNVREPTF VRHHWVHRRR 0180

0181 QDGKCRHCGK GFQQKFTFHS KEIVAISCSW CKQAYHSKVS CFMLQQIEEP CSLGVHAAW 0240

0241 IPPTWILRAR RPQNTLKASK KKKRASFKRK SSKKGPEEGR WRPFIIRPTP SPLMKPLLVF 0300

0301 VNPKSGGNQG AKIIQSFLWY LNPRQVFDLS QGGPKEALEM YRKVHNLRIL ACGGDGTVGW 0360

0361 ILSTLDQLRL KPPPPVAILP LGTGNDLART LNWGGGYTDE PVSKILSHVE EGNWQLDRW 0420

0421 DLHAEPNPEA GPEDRDEGAT DRLPLDVFNN YFSLGFDAHV TLEFHESREA NPEKFNSRFR 0480

0481 NKMFYAGTAF SDFLMGSSKD LAKHIRWCD GMDLTPKIQD LKPQCWFLN IPRYCAGTMP 0540

0541 WGHPGEHHDF EPQRHDDGYL EVIGFTMTSL AALQVGGHGE RLTQCREWL TTSKAIPVQV 0600

0601 DGEPCKLAAS RIRIALRNQA TMVQKAKRRS AAPLHSDQQP VPEQLRIQVS RVSMHDYEAL 0660

0661 HYDKEQLKEA SVPLGTVWP GDSDLELCRA HIERLQQEPD GAGAKSPTCQ KLSPKWCFLD 0720

0721 ATTASRFYRI DRAQEHLNYV TEIAQDEIYI LDPELLGASA RPDLPTPTSP LPTSPCSPTP 0780

0781 RSLQGDAAPP QGEELIEAAK RNDFCKLQEL HRAGGDLMHR DEQSRTLLHH AVSTGSKDW 0840

0841 RYLLDHAPPE ILDAVEENGE TCLHQAAALG QRTICHYIVE AGASLMKTDQ QGDTPRQRAE 0900

0901 KAQDTELAAY LENRQHYQMI QREDQETAVG SSETVRFQGH HHHHH 0945

(SEC ID NO: 4)

Secuencia de nucleótidos que codifica MA-hDGKa-(S9-S727)-Ct-TVMV-His:

0001 ATGGCTTCCC CAAGCGACTT CGCCCAGCTG CAGAAGTACA TGGAATACAG CACCAAGAAG 0060 0061 GTGTCTGACG TCCTGAAGCT GTTCGAGGAC GGTGAAATGG CTAAGTACGT CCAGGGCGAC 0120 0121 GCTATCGGAT ACGAGGGATT CCAGCAGTTC CTGAAGATCT ACCTGGAAGT GGACAACGTC 0180 0181 CCCAGGCACC TGTCACTGGC TCTGTTCCAG TCCTTCGAGA CTGGCCACTG CCTGAACGAA 0240 0241 ACCAACGTCA CTAAGGACGT GGTCTGCCTG AACGACGTGA GCTGCTACTT CTCTCTGCTG 0300 0301 GAGGGTGGCA GACCAGAGGA CAAGCTGGAA TTCACCTTCAAGCTGTACGA CACTGACCGC 0360 03 61 AACGGAATCC TGGACTCCAG CGAAGTGGAC AAGATCATCC TGCAGATGAT GCGTGTCGCT 0420 0421 GAGTACCTGG ACTGGGACGT GAGCGAACTG AGGCCTATCC TGCAGGAGAT GATGAAGGAA 0480 0481 ATCGACTACGACGGCTCTGG ATCAGTGTCC CAGGCTGAGT GGGTCCGCGC TGGTGCTACC 0540 0541 ACTGTGCCAC TGCTGGTCCT GCTGGGACTG GAAATGACCC TGAAGGACGA CGGTCAGCAC 0600 0601 ATGTGGCGCC CAAAGCGTTT CCCCAGGCCA GTCTACTGCAACCTGTGCGA GTCTTCAATC 0660 0661 GGTCTGGGCA AGCAGGGCCT GTCATGCAAC CTGTGCAAGT ACACCGTGCA CGACCAGTGC 0720 0721 GCTATGAAGG CCCTGCCCTG CGAGGTCTCA ACTTACGCTAAGTCCCGTAA GGACATCGGA 0780 0781 GTGCAGTCAC ACGTGTGGGT CAGGGGAGGT TGCGAATCCG GTAGATGCGA CCGCTGCCAG 0840 0841 AAGAAGATCC GTATCTACCA CTCCCTGACC GGACTGCACT GCGTCTGGTG CCACCTGGAG 0900 0901 ATCCACGACG ACTGCCTGCA GGCCGTGGGA CACGAATGCG ACTGCGGTCT GCTGCGTGAC 0960 0961 CACATCCTGC CTCCCTCCAG CATCTACCCT TCAGTCCTGG CTTCCGGTCC CGACAGGAAG 1020 1021 AACAGCAAGA CCTCTCAGAA GACTATGGAC GACCTGAACC TGAGCACCTC TGAGGCCCTG 1080 1081 CGCATCGACC CTGTGCCCAA CACTCACCCA CTGCTGGTGT TCGTCAACCC TAAGAGCGGC 1140 1141 GGAAAGCAGG GTCAGAGAGT CCTGTGGAAG TTCCAGTACA TCCTGAACCC ACGCCAGGTG 1200

1201 TTCAACCTGC TGAAGGACGG CCCTGAGATC GGACTGAGAC TGTTCAAGGA CGTGCCCGAC 1260 12 61 TCTCGCATCC TCGTCTGCGG TGGCGACGGT ACTGTGGGAT GGATCCTGGA AACTATCGAC 1320 1321 AAGGCTAACC TGCCAGTGCT GCCACCTGTG GCTGTCCTGC CACTGGGAAC CGGTAACGAC 1380 1381 CTGGCTCGTT GCCTGCGTTG GGGAGGTGGC TACGAGGGAC AGAACCTGGC CAAGATCCTG 1440 1441 AAGGACCTGG AAATGAGCAA GGTGGTCCAC ATGGACAGAT GGTCTGTGGA GGTCATCCCA 1500 1501 CAGCAGACTGAGGAAAAGTC AGACCCAGTC CCTTTCCAGA TCATCAACAA CTACTTCAGC 1560 1561 ATCGGTGTGG ACGCTTCTAT CGCCCACAGA TTCCACATCA TGCGCGAGAA GTACCCTGAA 1620 1621 AAGTTCAACT CCCGCATGAA GAACAAGCTG TGGTACTTCG AGTTCGCTAC CTCAGAATCC 1680

1681 ATCTTCTCAA CTTGCAAGAA GCTGGAGGAA TCCCTGACCG TCGAGATCTG CGGCAAGCCT 1740

1741 CTGGACCTGT CAAACCTGTC CCTGGAAGGC ATCGCTGTGC TGAACATCCC AAGCATGCAC 1800

1801 GGAGGTTCTA ACCTCTGGGG CGACACTAGG AGGCCTCACG GTGACATCTA CGGCATCAAC 1860

1861 CAGGCCCTGG GAGCTACCGC CAAGGTCATC ACTGACCCCG ACATCCTGAA GACCTGCGTG 1920

1921 CCAGACCTGA GCGACAAGCG TCTGGAGGTG GTCGGACTGG AGGGTGCCAT CGAAATGGGC 1980

1981 CAGATCTACA CTAAGCTGAA GAACGCTGGA AGGAGACTGG CCAAGTGCTC TGAGATCACC 2040

2041 TTCCACACCA CTAAGACTCT GCCTATGCAG ATCGACGGTG AACCCTGGAT GCAGACCCCA 2100

2101 TGCACTATCA AGATCACCCA CAAGAACCAG ATGCCCATGC TGATGGGTCC TCCTCCTCGC 2160

2161 TCTGGATCTT CAGAAACTGT GAGGTTCCAG GGCCACCACC ACCACCACCA CTGA 2214

(SEC ID NO: 5)

Secuencia de aminoácidos de MA-hDGKa-(S9-S727)-Ct-TVMV-His:

0001 MASPSDFAQL QKYMEYSTKK VSDVLKLFED GEMAKYVQGD AIGYEGFQQF LKIYLEVDNV 0060

0061 PRHLSLALFQ SFETGHCLNE TNVTKDWCL NDVSCYFSLL EGGRPEDKLE FTFKLYDTDR 0120

0121 NGILDSSEVD KIILQMMRVA EYLDWDVSEL RPILQEMMKE IDYDGSGSVS QAEWVRAGAT 0180

0181 TVPLLVLLGL EMTLKDDGQH MWRPKRFPRP VYCNLCESSI GLGKQGLSCN LCKYTVHDQC 0240

0241 AMKALPCEVS TYAKSRKDIG VQSHVWVRGG CESGRCDRCQ KKIRIYHSLT GLHCVWCHLE 0300

0301 IHDDCLQAVG HECDCGLLRD HILPPSSIYP SVLASGPDRK NSKTSQKTMD DLNLSTSEAL 0360

0361 RIDPVPNTHP LLVFVNPKSG GKQGQRVLWK FQYILNPRQV FNLLKDGPEI GLRLFKDVPD 0420

0421 SRILVCGGDG TVGWILETID KANLPVLPPV AVLPLGTGND LARCLRWGGG YEGQNLAKIL 0480

0481 KDLEMSKWH MDRWSVEVIP QQTEEKSDPV PFQIINNYFS IGVDASIAHR FHIMREKYPE 0540

0541 KFNSRMKNKL WYFEFATSES IFSTCKKLEE SLTVEICGKP LDLSNLSLEG IAVLNIPSMH 0600

0601 GGSNLWGDTR RPHGDIYGIN QALGATAKVI TDPDILKTCV PDLSDKRLEV VGLEGAIEMG 0660

0661 QIYTKLKNAG RRLAKCSEIT FHTTKTLPMQ IDGEPWMQTP CTIKITHKNQ MPMLMGPPPR 0720

0721 SGSSETVRFQ GHHHHHH 0737

(SEC ID NO: 6)

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la fórmula (I):

o una sal del mismo, en donde: R1 es F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R-ia, cicloalquilo de C<3.4>sustituido con cero a 4 R-ia, alcoxi de C<1-3>, sustituido con cero a 4 Ría, -C(O)NRaRa, -NRaRa, -S(O)nRe o -P(O)ReRe; cada R<1>a es independientemente F, Cl, -CN, -OH, -OCH<3>o -NRaRa; cada Ra es independientemente H o alquilo de C<1-3>; cada Re es independientemente cicloalquilo de C<3-4>o alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<1>a; R<2>es H, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<2>a, alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 R<2>a, o cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 R<2>a; cada R<2>a es independientemente F, Cl, -CN, -OH, -O(alquilo de C<1-2>), cicloalquilo de C<3-4>, alquenilo de C<3-4>o alquinilo de C<3-4>; R<3>es H, F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>, fluoroalquilo de C<1.2>, cicloalquilo de C<3-4>, fluorocicloalquilo de C<3-4>, -NO<2>o piridinilo sustituido con cero a 2 R<3>a; cada R<3>a es halo, -CN, alquilo de C<1-3>o alcoxi de C<1.3>; R<4>es -CH<2>R<4>a, -CH<2>CH<2>R<4>a, -CH<2>CHR<4>aR<4>d, -CHR<4>aR<4>b o -CR<4>aR<4>bR<4>c; R<4>a y R<4>b son independientemente: (i) alquilo de C<1-6>sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -CN, -OH, -OCH<3>, -SCH<3>, fluoroalcoxi de C<1-3>, -NRaRa, -S(O)<2>Re, o -NRaS(O)<2>Re; (ii) cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, fenilo o heteroarilo, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -CN, -OH, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, hidroxialquilo de C<1.4>, -(CH<2>)<1-2>O(alquilo de C<1-3>), alcoxi de C<1.4>, -O(hidroxialquilo de C<1.4>), -O(CH)<1-3>O(alquilo de C<1.3>), fluoroalcoxi de C<1.3>, -O(CH)<1-3>NRcRc, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -C(O)(alquilo de C<1.4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1.4>), -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1-3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1>. <4>), -P(O)(alquilo de C<1-3>)<2>, -S(O)<2>(alquilo de C<1-3>), -O(CH<2>)<1-2>(cicloalquilo de C<3-6>), -O(CH<2>)<1-2>(morfolinilo), ciclopropilo, cianociclopropilo, metilazetidinilo, acetilazetidinilo, (terc-butoxicarbonil)azetidinilo, triazolilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiofenilo, metilpiperidinilo y Rd; o (iii) alquilo de C<1-4>sustituido con un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, arilo, y heteroarilo, tal grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1.3>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1.4>) y cicloalquilo de C<3-6>; o R<4>a y R<4>b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un cicloalquilo de C<3-6>o un heterociclilo de 3 a 6 elementos, cada uno sustituido con cero a 3 Rf; cada Rf es independientemente F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-3>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, o un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo de 3 a 6 elementos, fenilo, heteroarilo monocíclico y heteroarilo bicíclico, cada grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-3>y -NRcRc; R<4>c es alquilo de C<1-6>o cicloalquilo de C<3-6>, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -OH, alcoxi de C<1-2>, fluoroalcoxi de C<1-2>y -CN; R4d es -OCH3; cada Rc es independientemente H o alquilo de C<1-2>; Rd es fenilo sustituido con cero a 1 sustituyente seleccionado de F, Cl, -CN, -CH<3>y -OCH<3>; cada R<5>es independientemente F, Cl, -CN, -OH, alquilo de C<1-6>, sustituido con cero a 4 Rg, alcoxi de C<1-3>, sustituido con cero a 4 Rg, alquenilo de C<2-4>sustituido con cero a 4 Rg, alquinilo de C<2-4>, sustituido con cero a 4 Rg, cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 Rg, fenilo sustituido con cero a 4 Rg, oxadiazolilo sustituido con cero a 3 Rg, piridinilo sustituido con cero a 4 Rg, -(CH<2>)<1-2>(heterociclilo sustituido con cero a 4 Rg), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)O(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcS(O)<2>(alquilo de C<1-4>), -C(O)(alquilo de C<1-4>), -C(O)OH, C(O)O(alquilo de C<1-4>), -C(O)O(cicloalquilo de C<3-4>), -C(O)NRaRa, o -C(O)NRa(cicloalquilo de C<3-4>), o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O; cada Rg es independientemente F, Cl, -CN, -OH, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-3>, -O(CH<2>)<1-2>O(alquilo de C<1.2>), cicloalquilo de C<3-5>o -NRcRc; cada Ra es H, F, Cl, -CN, -CH<3>, -CH<2>F, -CHF<2>, -CF<3>, o -OCH<3>; m es cero, 1, 2 o 3; y n es cero, 1 o 2.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde: R<1>es F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-3>sustituido con cero a 4 R<1>a, ciclopropilo sustituido con cero a 3 R<1>a, alcoxi de C<1-3>sustituido con cero a 3 R<1>a, -C(O)NRaRa, -NRaRa, -S(O)nCH<3>, o -P(O)(CH<3>)<2>; cada R<1>a es independientemente F, Cl o -CN; cada Ra es independientemente H o alquilo de C<1-3>; R<2>es H, alquilo de C<1-2>sustituido con cero a 2 R<2>a, o alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 2 R<2>a; cada R<2>a es independientemente F, Cl, -CN, -OH, -O(alquilo de C<1-2>), ciclopropilo, alquenilo de C<3-4>, o alquinilo de C3-4; R<3>es H, F, Cl, Br, -CN, alquilo de C<1-2>, fluoroalquilo de C<1.2>, cicloalquilo de C<3-4>, -NO<2>, o piridinilo sustituido con cero a 2 R<3>a; R<4>a y R<4>b son independientemente: (i) alquilo de C<1-4>sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -CN, -OH, -OCH<3>, -SCH<3>, fluoroalcoxi de C<1-3>y -NRaRa; (ii) cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, fenilo o heteroarilo, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -CN, -OH, alquilo de C<1-6>, fluoroalquilo de C<1-3>, -CH<2>OH, -(CH<2>)<1-2>O(alquilo de C<1.2>), alcoxi de C<1-4>, -O(hidroxialquilo de C<1.4>), -O(CH)<1-2>O(alquilo de C<1.2>), fluoroalcoxi de C<1.3>, -O(CH)<1-2>NRcRc, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -C(O)(alquilo de C<1.4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1.4>), -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1.4>), -P(O)(alquilo de C<1>-<2>)<2>, -S(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -O(CH<2>)<1-2>(cicloalquilo de C<3-4>), -O(CH<2>)<1-2>(morfolinilo), ciclopropilo, cianociclopropilo, metilazetidinilo, acetilazetidinilo, (terc-butoxicarbonil)azetidinilo, triazolilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiofenilo, metilpiperidinilo, y Rd; o (iii) alquilo de C<1-3>sustituido con un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo, fenilo, y heteroarilo, tal grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-3>, fluoroalquilo de C<1-2>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1.2>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, -NRaS(O)<2>(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)(alquilo de C<1.3>), -NRaC(O)O(alquilo de C<1.4>), y cicloalquilo de C<3-4>; o R<4>a y R<4>b junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un cicloalquilo de C<3-6>o un heterociclilo de 3 a 6 elementos, cada uno sustituido con cero a 3 Rf; cada Rf es independientemente F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-4>, fluoroalquilo de C<1-2>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-2>, -OCH<2>CH=CH<2>, -OCH<2>C=CH, -NRcRc, o un grupo cíclico seleccionado de cicloalquilo de C<3-6>, heterociclilo de 3 a 6 elementos, fenilo, heteroarilo monocíclico, y heteroarilo bicíclico, cada grupo cíclico sustituido con cero a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, Br, -OH, -CN, alquilo de C<1-4>, fluoroalquilo de C<1-2>, alcoxi de C<1-3>, fluoroalcoxi de C<1-2>y -NRcRc; R<4>c es alquilo de C<1.4>o cicloalquilo de C<3-6>, cada uno sustituido con cero a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de F, Cl, -OH, alcoxi de C<1-2>, fluoroalcoxi de C<1-2>y -CN; cada R<5>es independientemente F, -CN, -OH, alquilo de C<1-5>sustituido con cero a 4 Rg, alcoxi de C<1-2>sustituido con cero a 3 Rg, alquenilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 Rg, alquinilo de C<2-3>sustituido con cero a 4 Rg, cicloalquilo de C<3-4>sustituido con cero a 4 Rg, fenilo sustituido con cero a 3 Rg, oxadiazolilo sustituido con cero a 3 Rg, piridinilo sustituido con cero a 3 Rg, -(CH<2>)<1-2>(heterociclilo sustituido con cero a 4 Rg), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcC(O)O(alquilo de C<1-4>), -(CH<2>)<1-2>NRcS(O)<2>(alquilo de C<1-4>), -C(O)(alquilo de C<1-4>), -C(O)OH, -C(O)O(alquilo de C<1-4>), -C(O)O(cicloalquilo de C<3-4>), -C(O)NRaRa, o -C(O)NRa(cicloalquilo de C<3-4>), o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O; cada R6 es H, F o -CH<3>; y m es cero, 1, 2 o 3.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde: R<1>es F, -CN o -OCH<3>; R<2>es H, -CH<3>, -CH<2>CN, -CH<2>CH<2>F, o -CH<2>CH=CH<2>; R<3>es H, -CN, -CH<2>OH, -C(O)OCH<2>CH<3>, -NO<2>o piridinilo; R<4>es -CH<2>R<4>a o -CHR<4>aR<4>b; R<4>a es fenilo, naftalenilo o indolilo, cada uno sustituido con cero a 2 sustituyentes seleccionados independientemente de F, -CH<3>, -CH<2>CH<3>y -OCH<3>; R<4>b es fenilo o fluorofenilo; cada R<5>es -CH<3>, o dos R<5>unidos al mismo átomo de carbono forman =O; y m es cero,<1>o<2>.
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, que tiene la estructura:

en donde: R<5>a y R<5>b se seleccionan independientemente de R<5>.
5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, que tiene la estructura:
<6>. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde R<4>es -CH<2>R<4>a o -CH<2>CH<2>R<4>a.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde R<4>es -CH<2>R<4>a. <8>.
El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde R<4>es -CHR<4>aR<4>b o -CR<4>aR<4>bR<4>b.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde R<4>es -CHR<4>aR<4>b.
10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde R<4>es -CH<2>R<4>a o -CHR<4>aR<4>b.
11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde dicho compuesto es: 6-fluoro-4-{4-[(3-fluorofenil)metil]piperazin-1-il}-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (1); 6-fluoro-4-{4-[(3-fluoro-5-metilfenil)metil]piperazin-1-il}-1-metil-3-(piridin-4-il)-1,2-dihidroquinolin-2-ona (2); 4-(4-((1H-indol-4-il)metil)piperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitroquinolin-2(1H)-ona (3); 4-{4-[(1-etil-1H-indol-4-il)metil]piperazin-1-il}-6-fluoro-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (4); 4-(4-bencil-3-oxopiperazin-1-il)-6-fluoro-1-metil-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (5); 4-[(2S,SR)-4-[bis(4-fluorofenil)metil]-2,5-dimetilpiperazin-1-il]-1-metil-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-6-carbonitrilo (7); 6-metoxi-1-metil-4-{4-[(naftalen-1-il)metil]piperazin-1-il}-3-nitro-1,2-dihidroquinolin-2-ona (<8>).
12. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones<1>a<11>o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable.
13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia.
14. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer o infecciones víricas.
15. El compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona del cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, linfoma, leucemia y melanoma.