ES2994431T3 - In situ combinatorial labeling of cellular molecules - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para etiquetar de forma única o codificar con código de barras moléculas dentro de un núcleo, una pluralidad de núcleos, una célula, una pluralidad de células y/o un tejido. También se proporcionan kits para etiquetar de forma única o codificar con código de barras moléculas dentro de un núcleo, una pluralidad de núcleos, una célula, una pluralidad de células y/o un tejido. Las moléculas que se van a etiquetar pueden incluir, entre otras, ARN y/o ADNc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Mareaje combinatorio in situ de moléculas celulares

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos Núm. 62/561,806, presentada el 22 de septiembre de 2017.

Campo técnico

La presente descripción se refiere generalmente a métodos de marcaje o adjudicación de códigos de barras de manera única a moléculas dentro de un núcleo, una pluralidad de núcleos, una célula, una pluralidad de células y/o un tejido. La presente descripción se refiere, además, a kits para marcar, de manera única, moléculas dentro de un núcleo, una pluralidad de núcleos, una célula, una pluralidad de células y/o un tejido. En particular, los métodos y kits pueden relacionarse con el marcaje de los ARN y/o los ADNc.

Antecedentes

La secuenciación de próxima generación (NGS) puede usarse para identificar y/o cuantificar transcritos individuales a partir de una muestra de células. Sin embargo, dichas técnicas pueden ser demasiado complicadas para realizarlas en células individuales en muestras grandes. En dichos métodos, los transcritos de ARN se purifican generalmente a partir de células lisadas(es decir,células que se han roto), seguido de la conversión de los transcritos de ARN en ADN complementario (ADNc) mediante el uso de transcripción inversa. Después, las secuencias de ADNc pueden secuenciarse mediante el uso de NGS. En dicho procedimiento, todas las secuencias de ADNc se mezclan entre sí antes de la secuenciación, de manera que la expresión de ARN se mide para una muestra completa y las secuencias individuales no pueden vincularse de nuevo a una célula individual.

Los métodos para marcar o adjudicar códigos de barras de manera única a los transcritos de células individuales pueden implicar la separación manual de células individuales en recipientes de reacción separados y pueden requerir equipamiento especializado. Un enfoque alternativo para la secuenciación de transcritos individuales en células es usar microscopía para identificar bases fluorescentes individuales. Sin embargo, esta técnica puede ser difícil de implementar y limitarse a la secuenciación de un número bajo de células.

Rosenbergy otrosScience, vol. 360, núm. 6385, páginas 176-182 (2018) mencionan la determinación del perfil de células individuales del cerebro y la médula espinal del ratón en desarrollo con adjudicación de códigos de barras mediante división-agrupamiento. El documento de Estados Unidos US 2016/138016 menciona métodos de marcaje o adjudicación de códigos de barras de manera única a moléculas de una pluralidad de células y/o de un tejido.

Breve descripción de las figuras

Las modalidades descritas en la presente descripción serán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, tomadas junto con los dibujos adjuntos.

La figura 1 representa la ligación de etiquetas de ácido nucleico para formar un marcaje o código de barras. La figura 2 es una representación esquemática de la formación de ADNc mediante transcripción inversain situ.El panel A representa una célula que se fija y permeabiliza. El panel B representa la adición de un cebador poli(T), que puede servir de molde a la transcripción inversa de transcritos poliadenilados. El panel C representa la adición de un hexámero aleatorio, que puede servir de molde a la transcripción inversa de sustancialmente cualquier transcrito. El panel D representa la adición de un cebador que está diseñado para dirigirse a un transcrito específico de manera que solo un subconjunto de transcritos puede amplificarse. El panel E representa la célula del panel A después de la transcripción inversa, que ilustra un ADNc hibridado con un ARN.

La figura 3A representa la ligación sin molde de un adaptador monocatenario a un fragmento de ARN.

La figura 3B representa la ligación de un adaptador monocatenario mediante el uso de un híbrido parcial con cebadores hexaméricos aleatorios.

La figura 4 representa la unión del cebador.

La figura 5 representa la unión del cebador seguida de la transcripción inversa.

La figura 6 representa anticuerpos etiquetados con ADN para usar en el marcaje de proteínas celulares.

La figura 7 representa aptámeros para usar en el marcaje de proteínas celulares.

La figura 8 es una representación esquemática de la división, etiquetado y agrupamiento de células. Como se representa, las células pueden dividirse entre una pluralidad de recipientes de reacción. Se resalta una célula para mostrar su trayectoria a través del proceso ilustrado.

La figura 9A representa un flujo de trabajo ilustrativo.

La figura 9B representa un flujo de trabajo ilustrativo.

La figura 10 representa un cebador de la transcripción inversa (BC_0055).

La figura 11 representa un oligo de código de barras hibridado, del primer ciclo.

La figura 12 representa un oligo de código de barras hibridado del segundo ciclo.

La figura 13 representa un oligo de código de barras hibridado del tercer ciclo.

La figura 14 representa oligos de parada de la ligación.

La figura 15 representa un oligo adaptador de ADN monocatenario (BC_0047) ligado al extremo 3' de un ADNc. La figura 16 representa un producto de PCR formado mediante el uso de los cebadores BC_0051 y BC_0062 y el oligo adaptador 3' (BC_0047) después de que se ha ligado al ADNc codificado.

La figura 17 representa BC_0027, que incluye la secuencia de unión a la celda de flujo y el sitio de unión para el cebador de lectura 1 TRUSEQ™ y BC_0063, que incluye la secuencia de unión a la celda de flujo y la lectura 2 múltiple TruSeq y la secuencia de unión índice. La figura 17 ilustra, además, una región para un índice de muestra, que es GATCTG en este ejemplo.

La figura 18 es un gráfico de dispersión, en donde para cada combinación única de códigos de barras se traza el número de lecturas que se alinean con el genoma humano (eje x) y el genoma de ratón (eje y).

La figura 19 ilustra el tamaño del ADNc antes y después del etiquetado.

La figura 20 ilustra un experimento en donde se determinó el perfil de más de 150 000 núcleos de cerebros y médulas espinales de ratones entre P2 y P11 en un solo experimento que emplea más de seis millones de combinaciones de códigos de barras. Mediante el registro de cuál de las cuatro muestras iniciales (médula P2, cerebro P2, médula P11 o médula P11) se añadió a cada pocillo, las secuencias de códigos de barras del primer ciclo pueden usarse para identificar qué célula/núcleo se originó a partir de qué muestra.

La figura 21 muestra el número de núcleos en cada pocillo durante tres ciclos de adjudicación de códigos de barras. A pesar de pipetear las células a mano, la mayoría de los pocillos contienen números de núcleos aproximadamente iguales. La disociación de la médula espinal P2 dio como resultado menos células que las otras muestras, lo que explica el menor número de núcleos en los pocillos del primer ciclo correspondientes.

La figura 22 representa la distribución de los transcriptomas de núcleos individuales del cerebro y la médula espinal P2/P11 dentro del linaje de oligodendrocitos. Cada muestra de núcleos (médula P2, cerebro P2, médula P11 o médula P11) puede determinarse tras examinar el código de barras del primer ciclo a partir de cada combinación de códigos de barras de célula/núcleo.

La figura 23 representa una descripción general de un protocolo como se proporciona en la presente descripción. La figura 24 representa un diagrama molecular de un protocolo como se proporciona en la presente descripción.

Descripción detallada

La invención se define de acuerdo con las reivindicaciones. Por lo tanto, la invención proporciona un método de marcaje de moléculas de ARN de manera única dentro de una pluralidad de células, el método comprende: (a) fijar y permeabilizar una primera pluralidad de células antes de la etapa (b), en donde la primera pluralidad de células se fija y permeabiliza a 4 °C o por debajo de 4 °C; (b) transcribir de manera inversa las moléculas de ARN dentro de la primera pluralidad de células para formar moléculas de ADN complementario (ADNc) dentro de la primera pluralidad de células, en donde la transcripción inversa de las moléculas de ARN comprende acoplar cebadores a las moléculas de ARN, en donde los cebadores comprenden al menos una de una secuencia poli(T) o una secuencia aleatoria; (c) dividir la primera pluralidad de células que comprenden moléculas de ADNc en al menos dos alícuotas primarias, las al menos dos alícuotas primarias que comprenden una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria; (d) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria; (e) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas; (f) combinar las al menos dos alícuotas primarias; (g) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias comprenden una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (h) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; (i) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas; (j) combinar las alícuotas finales; (k) lisar la primera pluralidad de células para liberar las moléculas de ADNc de la primera pluralidad de células para formar un lisado; y (l) añadir un inhibidor de proteasas y un agente aglutinante al lisado de manera que las moléculas de ADNc se unan al agente aglutinante.

En una modalidad, antes de la etapa (k), el método comprende, además, dividir las alícuotas finales combinadas en al menos dos alícuotas finales, las al menos dos alícuotas finales comprenden una primera alícuota final y una segunda alícuota final.

En una modalidad, el inhibidor de proteasa es fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) o clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF).

En una modalidad, el método comprende, además: (m) llevar a cabo un cambio de molde de las moléculas de ADNc unidas al agente aglutinante; (n) amplificar las moléculas de ADNc para formar una solución de moléculas de ADNc amplificadas; y (o) introducir una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) a la solución de moléculas de ADNc amplificadas, en donde la relación de la solución de perlas de SPRI con respecto a la solución de moléculas de ADNc amplificadas está entre 0,9:1 y 0,7:1.

En una modalidad, se añade una secuencia adaptadora común al extremo 3' de las moléculas de ADNc liberadas mediante el cambio de molde.

En una modalidad, los cebadores de la etapa (b) comprenden además un primer código de barras específico; el método comprende, además: (p) transcribir de manera inversa las moléculas de ARN dentro de una segunda pluralidad de células para formar moléculas de ADNc dentro de la segunda pluralidad de células, en donde la transcripción inversa de las moléculas de ARN comprende acoplar cebadores específicos a las moléculas de ARN, en donde los cebadores comprenden un segundo código de barras específico y al menos una de una secuencia poli(T) o una secuencia aleatoria, en donde el primer código de barras específico es diferente del segundo código de barras específico de manera que las moléculas de ADNc de la primera pluralidad de células pueden identificarse en comparación con las moléculas de ADNc de la segunda pluralidad de células; (q) dividir la segunda pluralidad de células que comprenden moléculas de ADNc en al menos dos alícuotas primarias, las al menos dos alícuotas primarias comprenden una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria; (r) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a las al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria; (s) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas; (t) combinar las al menos dos alícuotas primarias; (u) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias comprenden una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (v) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; y (w) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas.

En una modalidad, cada una de las etiquetas de ácido nucleico comprende: una primera hebra que comprende: una secuencia de código de barras que comprende un extremo 3' y un extremo 5'; y una secuencia de hibridación en 3' y una secuencia de hibridación en 5' que flanquea el extremo 3' y el extremo 5' de la secuencia de código de barras, respectivamente; y una segunda hebra que comprende: una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia adaptadora; y una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

En una modalidad, el método comprende, además, ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a las moléculas de ADNc. En una modalidad, la ligación se realiza dentro de la primera pluralidad de células.

En una modalidad, el método comprende, además, ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a las moléculas de ADNc liberadas.

La presente descripción se refiere generalmente a métodos de marcaje o adjudicación de códigos de barras de manera única a moléculas dentro de un núcleo, una pluralidad de núcleos, una célula, una pluralidad de células y/o un tejido. La presente descripción se refiere, además, a kits para marcar o adjudicar códigos de barras de manera única a moléculas dentro de un núcleo, una pluralidad de núcleos, una célula, una pluralidad de células y/o un tejido. Las moléculas que se van a marcar pueden incluir, pero no se limitan a, ARN, ADNc, ADN, proteínas, péptidos y/o antígenos.

El término "unión" se usa ampliamente a lo largo de esta descripción para referirse a cualquier forma de unir o acoplar dos o más componentes, entidades u objetos. Por ejemplo, dos o más componentes pueden unirse entre sí a través de enlaces químicos, enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, fuerzas electrostáticas, hibridación de Watson-Crick, etc.

La descripción proporciona métodos de marcaje de ácidos nucleicos. Los métodos descritos en la presente descripción pueden comprender el marcaje de ácidos nucleicos en una primera célula. Los métodos pueden comprender: (a) generar ADN complementarios (ADNc) dentro de una pluralidad de células que comprenden la primera célula mediante la transcripción inversa de los ARN mediante el uso de un cebador de la transcripción inversa que comprende una secuencia saliente en 5'; (b) dividir la pluralidad de células en un número (n) de alícuotas; (c) proporcionar una pluralidad de etiquetas de ácido nucleico a cada una de las n alícuotas, en donde cada secuencia de marcaje de la pluralidad de etiquetas de ácido nucleico proporcionadas en una alícuota dada es la misma, y en donde se proporciona una secuencia de marcaje diferente en cada una de las n alícuotas; (d) unir al menos uno de los ADNc en cada una de las n alícuotas a las etiquetas de ácido nucleico; (e) combinar las n alícuotas; y (f) repetir las etapas (b), (c), (d), y (e) con la alícuota combinada. La pluralidad de células puede seleccionarse de células eucariotas y células procariotas. La pluralidad de células puede seleccionarse de, pero sin limitarse a, al menos una de células de mamíferos, células de levadura y/o células bacterianas.

Cada etiqueta de ácido nucleico puede comprender una primera hebra que incluye una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una secuencia de marcaje y una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la secuencia de marcaje. Cada etiqueta de ácido nucleico también puede comprender una segunda hebra que incluye una secuencia saliente. La secuencia saliente puede incluir (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'. La etiqueta de ácido nucleico (por ejemplo, la etiqueta de ácido nucleico final) puede comprender un agente de captura tal como, pero sin limitarse a, biotina en 5'. Un ADNc marcado con una etiqueta de ácido nucleico que comprende biotina en 5' puede permitir la unión o acoplamiento del ADNc a una perla magnética recubierta con estreptavidina. Una pluralidad de perlas puede recubrirse con una hebra de captura(es decir,una secuencia de ácido nucleico) que se configura para hibridar con una secuencia final que sobresale de un código de barras. El ADNc puede purificarse o aislarse mediante el uso de un kit disponible comercialmente (por ejemplo, un kit RNEASY™).

La etapa (f)(es decir,las etapas (b), (c), (d) y (e)) puede repetirse un número de veces suficiente para generar una serie única de secuencias de marcaje para los ADNc en la primera célula. Dicho de otra manera, la etapa (f) puede repetirse varias veces de manera que los ADNc en la primera célula pueden tener una primera serie única de secuencias de marcaje, los ADNc en una segunda célula pueden tener una segunda serie única de secuencias de marcaje, los ADNc en una tercera célula pueden tener una tercera serie única de secuencias de marcaje, etcétera. Los métodos de la presente descripción pueden proporcionar el marcaje de secuencias de ADNc de células individuales con códigos de barras únicos, en donde los códigos de barras únicos pueden identificar o ayudar a identificar la célula a partir de la cual se originó el ADNc. En otras palabras, una porción, una mayoría o sustancialmente todo el ADNc de una célula individual puede tener el mismo código de barras, y ese código de barras puede no repetirse en el ADNc que se origina de una o más células en una muestra (por ejemplo, de una segunda célula, una tercera célula, una cuarta célula, etcétera).

El ADNc con código de barras puede mezclarse y secuenciarse (por ejemplo, mediante el uso de NGS), de manera que los datos pueden recogerse con respecto a la expresión de<a>R<n>a nivel de una célula individual. Por ejemplo, los métodos de la presente descripción pueden ser útiles para evaluar, analizar o estudiar el transcriptoma(es decir,las diferentes especies de ARN transcritas a partir del genoma de una célula dada) de una o más células individuales.

Como se analizó anteriormente, una alícuota o grupo de células puede separarse en diferentes recipientes o contenedores de reacción y puede añadirse un primer conjunto de etiquetas de ácido nucleico a la pluralidad de transcritos de ADNc. Los recipientes o contenedores también pueden denominarse en la presente descripción receptáculos, muestras y pocillos. En consecuencia, los términos recipiente, contenedor, receptáculo, muestra y pocillo pueden usarse indistintamente en la presente descripción. Después, las alícuotas de células pueden reagruparse, mezclarse y separarse nuevamente y puede añadirse un segundo conjunto de etiquetas de ácido nucleico al primer conjunto de etiquetas de ácido nucleico. La misma etiqueta de ácido nucleico puede añadirse a más de una alícuota de células en un ciclo de marcaje dado o individual. Sin embargo, después de ciclos repetidos de separación, etiquetado y reagrupamiento, los ADNc de cada célula pueden unirse a una combinación o secuencia única de etiquetas de ácido nucleico que forman un código de barras. Las células en una muestra individual pueden separarse en una serie de recipientes de reacción diferentes. Por ejemplo, el número de recipientes de reacción puede incluir cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, una pluralidad de pocillos de una placa de 96 pocillos, u otro número y tipo adecuado de recipientes de reacción.

La etapa (f)(es decir,las etapas (b), (c), (d) y (e)) puede repetirse un número de veces en donde el número de veces se selecciona de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, etcétera. La etapa (f) puede repetirse un número suficiente de veces de manera que es probable que los ADNc de cada célula se unan a un código de barras único. El número de veces puede seleccionarse para proporcionar una probabilidad mayor que el 50 %, mayor que el 90 %, mayor que el 95 %, mayor que el 99 % de probabilidad o alguna otra probabilidad de que los ADNc en cada célula se unan a un código de barras único. La etapa (f) puede repetirse algún otro número adecuado de veces.

Los métodos de marcaje de ácidos nucleicos en la primera célula pueden comprender fijar la pluralidad de células antes de la etapa (a). Por ejemplo, los componentes de una célula pueden fijarse o reticularse de manera que los componentes se inmovilizan o se mantienen en su lugar. La pluralidad de células puede fijarse mediante el uso de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La pluralidad de células puede fijarse, por ejemplo, en formaldehído a aproximadamente 1-4 % en PBS. La pluralidad de células puede fijarse mediante el uso de metanol (por ejemplo, metanol al 100 %) a aproximadamente -20 °C. La pluralidad de células puede fijarse mediante el uso de etanol (por ejemplo, etanol a aproximadamente 70-100 %) a aproximadamente -20 °C. La pluralidad de células puede fijarse mediante el uso de ácido acético, por ejemplo, a aproximadamente -20 °C. La pluralidad de células puede fijarse mediante el uso de acetona, por ejemplo, a aproximadamente -20 °C. Otros métodos adecuados para fijar la pluralidad de células también están dentro del alcance de esta descripción.

Los métodos de marcaje de ácidos nucleicos en la primera célula pueden comprender permeabilizar la pluralidad de células antes de la etapa (a). Por ejemplo, pueden formarse agujeros o aberturas en membranas externas de la pluralidad de células. TRITON™ X-100 puede añadirse a la pluralidad de células, seguido de la adición opcional de HCl para formar el uno o más agujeros. Puede añadirse TRITON™ X-100 a aproximadamente 0,2 % a la pluralidad de células, por ejemplo, seguido de la adición de HCl a aproximadamente 0,1 N. La pluralidad de células puede permeabilizarse mediante el uso de etanol (por ejemplo, etanol a aproximadamente 70 %), metanol (por ejemplo, metanol a aproximadamente 100 %), Tween 20 (por ejemplo, Tween 20 a aproximadamente 0,2 %) y/o NP-40 (por ejemplo, NP-40 a aproximadamente 0,1 %).

Las células pueden ser células adherentes (por ejemplo, células adherentes de mamíferos). La fijación, permeabilización y/o transcripción inversa puede llevarse a cabo en células adherentes (por ejemplo, en células que se adhieren a una placa). Por ejemplo, las células adherentes pueden fijarse, permeabilizarse y/o experimentar transcripción inversa seguida de tripsinización para separar las células de una superficie. Alternativamente, las células adherentes pueden separarse antes de las etapas de separación y/o etiquetado. Las células adherentes pueden tripsinizarse antes de las etapas de fijación y/o permeabilización.

Los métodos de marcaje de ácidos nucleicos en la primera célula pueden comprender ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a los ADNc. La ligación puede llevarse a cabo antes o después de las etapas de lisado y/o purificación del ADNc. La ligación puede comprender enlazar covalentemente las secuencias de fosfato en 5' en las etiquetas de ácido nucleico al extremo 3' de una hebra adyacente o etiqueta de ácido nucleico de manera que las etiquetas individuales se formen en una secuencia de código de barras continua, o sustancialmente continua, que se une al extremo 3' de la secuencia de ADNc. Una ligasa de ARN o ADN bicatenario puede usarse con una hebra enlazadora adicional que se configura para contener una etiqueta de ácido nucleico junto con un ácido nucleico adyacente en una conformación bicatenaria “con muesca”. Después, la ligasa de ARN o ADN bicatenario puede usarse para sellar la “muesca”. Una ligasa de ARN o ADN monocatenario puede usarse sin un enlazador adicional. La ligación puede realizarse dentro de la pluralidad de células.

La figura 1 ilustra la ligación de una pluralidad de etiquetas de ácido nucleico para formar una etiqueta o código de barras sustancialmente continuo. Por ejemplo, después de una pluralidad de adiciones de etiquetas de ácido nucleico, cada transcrito de ADNc puede unirse o enlazarse a una serie de etiquetas de ácido nucleico. El uso de una ligasa puede ligar o enlazar covalentemente una porción de las etiquetas de ácido nucleico para formar un marcaje o código de barras sustancialmente continuo que se une a un transcrito de ADNc.

Los métodos pueden comprender lisar la pluralidad de células (es decir, romper la estructura celular) para liberar los ADNc a partir de la pluralidad de células, por ejemplo, después de la etapa (f). La pluralidad de células puede lisarse en una solución de lisis (por ejemplo, Tris-HCl 10 mM (pH 7,9), EDTA 50 mM (pH 7,9), NaCl 0,2 M, SDS 2,2 %, ANTI-ARNasa 0,5 mg/ml (un inhibidor de proteína ribonucleasas; Am BION®) y proteinasa K 1000 mg/ml (AMBION®)), por ejemplo, a aproximadamente 55 °C durante aproximadamente de 1-3 horas con agitación (por ejemplo, agitación vigorosa). La pluralidad de células puede lisarse mediante el uso de ultrasonicación y/o tras pasarlas a través de una aguja de jeringa de calibre 18-25 al menos una vez. La pluralidad de células puede lisarse tras calentarse a aproximadamente 70-90 °C. Por ejemplo, la pluralidad de células puede lisarse tras calentarse a aproximadamente 70-90 °C durante aproximadamente una o más horas. Después, los ADNc pueden aislarse a partir de las células lisadas. La ARNasa H puede añadirse al ADNc para eliminar el ARN. Los métodos pueden comprender, además, ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a los ADNc liberados. Los métodos de marcaje de ácidos nucleicos en la primera célula pueden comprender ligar al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, etcétera de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a los ADNc.

Los métodos de marcaje de ácidos nucleicos en la primera célula pueden comprender eliminar una o más etiquetas de ácido nucleico no unidas (por ejemplo, lavar la pluralidad de células). Por ejemplo, los métodos pueden comprender eliminar una porción, una mayoría o sustancialmente todas las etiquetas de ácido nucleico no unidas. Las etiquetas de ácido nucleico no unidas pueden eliminarse de manera que los ciclos adicionales de los métodos descritos no se contaminen con una o más etiquetas de ácido nucleico no unidas de un ciclo anterior de un método dado. Las etiquetas de ácido nucleico no unidas pueden eliminarse a través de centrifugación. Por ejemplo, la pluralidad de células puede centrifugarse de manera que se forme un sedimento de células en el fondo de un tubo de centrífuga. El sobrenadante(es decir,el líquido que contiene las etiquetas de ácido nucleico no unidas) puede eliminarse de las células centrifugadas. Después, las células pueden resuspenderse en un tampón (por ejemplo, un tampón fresco que está libre o sustancialmente libre de etiquetas de ácido nucleico no unidas). En otro ejemplo, la pluralidad de células puede acoplarse o enlazarse a perlas magnéticas que se recubren con un anticuerpo que se configura para unirse a la membrana celular o nuclear. Después, la pluralidad de células puede sedimentarse mediante el uso de un imán para extraerlas a un lado del recipiente de reacción. La pluralidad de células puede colocarse en un filtro de células (por ejemplo, un filtro de células PLURISTRAINER®) y lavarse con un tampón de lavado. Por ejemplo, la pluralidad de células puede permanecer en el filtro de células mientras el tampón de lavado pasa a través del filtro de células. El tampón de lavado puede incluir un surfactante, un detergente y/o formamida a aproximadamente 5-60 %.

Como se analizó anteriormente, la pluralidad de células puede reagruparse y el método puede repetirse cualquier número de veces, con la adición de más etiquetas a los ADNc lo que crea un conjunto de etiquetas de ácido nucleico que pueden actuar como un código de barras. A medida que se añaden más y más ciclos, aumenta el número de trayectorias que puede tomar una célula y, en consecuencia, aumenta el número de posibles códigos de barras que pueden crearse. Dados suficientes ciclos y divisiones, el número de posibles códigos de barras será mucho mayor que el número de células, lo que da como resultado que cada célula tenga probablemente un código de barras único. Por ejemplo, si la división tuviera lugar en una placa de 96 pocillos, después de 4 divisiones habría 964 = 84934656 posibles códigos de barras.

El cebador de la transcripción inversa puede configurarse para transcribir de manera inversa todo, o sustancialmente todo el ARN en una célula (por ejemplo, un hexámero aleatorio con un saliente en 5'). El cebador de la transcripción inversa puede configurarse para transcribir de manera inversa el ARN que tiene una cola de poli(A) (por ejemplo, un cebador poli(dT), tal como un cebador dT(15), con un saliente en 5'). El cebador de la transcripción inversa puede configurarse para transcribir de manera inversa los ARN predeterminados (por ejemplo, un cebador específico del transcrito). Por ejemplo, el cebador de la transcripción inversa puede configurarse para adjudicar códigos de barras a transcritos específicos de manera que pueda determinarse el perfil de menos transcritos por célula, pero de manera que pueda determinarse el perfil de cada uno de los transcritos en un mayor número de células.

La figura 2 ilustra la formación de ADNc mediante transcripción inversain situ.El panel A representa una célula que está fijada y permeabilizada. El panel B representa la adición de un cebador poli(T), como se analizó anteriormente, que puede servir de molde a la transcripción inversa de transcritos poliadenilados. El panel C representa la adición de un hexámero aleatorio, como se analizó anteriormente, que puede servir de molde a la transcripción inversa de sustancialmente cualquier transcrito. El panel D representa la adición de un cebador que está diseñado para dirigirse a un transcrito específico, como se analizó anteriormente, de manera que solo puede amplificarse un subconjunto de transcritos. El panel E representa la célula del panel A después de la transcripción inversa, que ilustra un ADNc hibridado con un ARN.

La transcripción inversa puede llevarse a cabo en la pluralidad de células. La transcripción inversa puede llevarse a cabo en una pluralidad de células fijadas y/o permeabilizadas. Pueden usarse variantes de la transcriptasa inversa M-MuLV en la transcripción inversa. Cualquier método adecuado de transcripción inversa está dentro del alcance de esta descripción. Por ejemplo, una mezcla de transcripción inversa puede incluir un cebador de la transcripción inversa que incluye un saliente en 5' y el cebador de la transcripción inversa puede configurarse para iniciar la transcripción inversa y/o para actuar como una secuencia de unión para etiquetas de ácido nucleico. Una porción de un cebador de la transcripción inversa que se configura para unirse al ARN y/o iniciar la transcripción inversa puede comprender uno o más de los siguientes: un hexámero aleatorio, un septámero, un octámero, un nonámero, un decámero, un fragmento de nucleótidos poli(T) y/o uno o más cebadores específicos de genes.

La descripción también proporciona métodos de marcaje de moléculas de manera única dentro de una célula o dentro de una pluralidad de células. El método puede comprender: (a) unir una secuencia adaptadora, o adaptador universal, a moléculas dentro de la pluralidad de células; (b) dividir la pluralidad de células en al menos dos alícuotas primarias, en donde las al menos dos alícuotas primarias comprenden al menos una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria; (c) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria; (d) unir las secuencias adaptadoras dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas; (e) combinar las al menos dos alícuotas primarias; (f) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias comprenden al menos una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (g) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a las al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; y (h) unir las moléculas dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas.

El método puede comprender, además, la etapa (i),es decir,repetir las etapas (e), (f), (g) y (h) con alícuotas subsecuentes. La etapa (i) puede repetirse un número de veces suficiente para generar una serie única de etiquetas de ácido nucleico para las moléculas en una célula individual. El número de veces puede seleccionarse de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, etcétera. La etapa (i) puede repetirse otro número adecuado de veces.

Las moléculas pueden disponerse dentro de la célula o dentro de la pluralidad de células. Las moléculas pueden acoplarse a la célula o a la pluralidad de células. Por ejemplo, las moléculas pueden ser moléculas de superficie celular. Las moléculas pueden disponerse dentro y/o acoplarse a la célula o a la pluralidad de células.

Como se analizó anteriormente, el método puede comprender fijar y/o permeabilizar la pluralidad de células antes de la etapa (a). Cada una de las etiquetas de ácido nucleico puede comprender una primera hebra. La primera hebra puede comprender una secuencia de código de barras que incluye un extremo 3' y un extremo 5'. La primera hebra puede comprender, además, una secuencia de hibridación en 3' y una secuencia de hibridación en 5' que flanquea el extremo 3' y el extremo 5' de la secuencia de código de barras, respectivamente. Cada una de las etiquetas de ácido nucleico puede comprender una segunda hebra. La segunda hebra puede comprender una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia adaptadora y una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

Las moléculas pueden ser macromoléculas. Las moléculas pueden seleccionarse de al menos uno de ARN, ADNc, ADN, proteína, péptidos y/o antígenos.

Las moléculas pueden ser ARN y la secuencia adaptadora puede ser monocatenaria. Además, la etapa (a) puede comprender uno de ligar un extremo 5' de la secuencia adaptadora monocatenaria a un extremo 3' del ARN y/o ligar un extremo 3' de la secuencia adaptadora monocatenaria a un extremo 5' del ARN. Las moléculas pueden ser ARN y la etapa (a) puede comprender hibridar la secuencia adaptadora con el ARN.

Pueden usarse métodos relacionados con la unión o acoplamiento de una secuencia adaptadora a un ARN, por ejemplo, en secuenciación de transcriptoma de ARN, determinación del perfil de ribosomas, secuenciación de ARN pequeño, secuenciación de ARN no codificante y/o determinación del perfil de la estructura de ARN. La pluralidad de células puede fijarse y/o permeabilizarse. El extremo 5' de una secuencia adaptadora monocatenaria puede ligarse al extremo 3' de un ARN(véanselas Figuras 3A y 3B). La ligación puede llevarse a cabo o realizarse mediante la T4 ligasa 1 de ARN. La ligación puede llevarse a cabo mediante t 4 ligasa 1 de ARN con una secuencia adaptadora monocatenaria que incluye un fosfato en 5'. La ligación puede llevarse a cabo mediante THERMOSTABLE 5' APPDNA/RNA LIGASE™ (NEW ENGLAND BIOLABS®). La ligación puede llevarse a cabo mediante THERMOSTABLE 5' APPDNA/RNA LIGASE™ con una secuencia adaptadora monocatenaria preadenilada en 5 ’. Otras ligasas y secuencias adaptadoras adecuadas también están dentro del alcance de esta descripción.

El ARN puede marcarse con la secuencia adaptadora mediante el uso de hibridación, por ejemplo, a través del apareamiento de bases de Watson-Crick(véasela figura 4). Después de las etapas de marcaje y/o lisis celular, como se analizó anteriormente, la secuencia adaptadora puede configurarse para cebar la transcripción inversa para formar 0 generar ADNc(véasela figura 5).

El extremo 3' de una secuencia adaptadora monocatenaria puede ligarse al extremo 5' de un ARN. La ligación puede llevarse a cabo o realizarse mediante la T4 ligasa 1 de ARN. La ligación puede llevarse a cabo mediante la T4 ligasa 1 de ARN con un ARN que incluye un fosfato en 5'. La ligación puede llevarse a cabo mediante THERMOSTABLE 5' APPDNA/RNA LIGASE™ (NEW ENGLAND BIOLABS®). La ligación puede llevarse a cabo por THERMOSTABLE 5' APPDNA/RNA LIGASE™ con un ARN preadenilado en 5 ’. Como se indicó anteriormente, otras ligasas y secuencias adaptadoras adecuadas también están dentro del alcance de esta descripción.

Las moléculas pueden ser ADNc. Pueden usarse métodos relacionados con la unión o acoplamiento de una secuencia adaptadora a un ADNc, por ejemplo, en la secuenciación de transcriptoma de ARN. La pluralidad de células puede fijarse y/o permeabilizarse. La transcripción inversa puede realizarse en la pluralidad de células fijadas y/o permeabilizadas con un cebador que incluye la secuencia adaptadora en el extremo 5'. Como se analizó anteriormente, el extremo 3' del cebador puede ser específico de un gen, un hexámero aleatorio o una secuencia poli(T). El ADNc resultante puede incluir la secuencia adaptadora en su extremo 5'(véasela figura 5).

En donde las moléculas son ADN (por ejemplo, ADN genómico), el método puede comprender, además, digerir el ADN con una enzima de restricción antes de la etapa (a). Además, la etapa (a) puede comprender ligar la secuencia adaptadora al ADN digerido.

Pueden usarse métodos relacionados con la unión o acoplamiento de una secuencia adaptadora a un ADN, por ejemplo, en la secuenciación de genoma completo, secuenciación de genoma dirigida, DNase-Seq, secuenciación de ChIP y/o ATAC-seq. Pueden usarse una o más enzimas de restricción para digerir ADN en al menos uno de los fragmentos de extremo romo y/o fragmentos que tienen secuencias salientes. Una secuencia bicatenaria parcial con el adaptador universal monocatenario o la secuencia adaptadora que sobresale en un extremo puede ligarse al ADN genómico digerido. Por ejemplo, una secuencia bicatenaria parcial con la secuencia adaptadora monocatenaria que tiene un saliente, en donde el saliente es compatible con el saliente generado por la una o más enzimas de restricción, puede ligarse al ADN genómico digerido.

Las secuencias adaptadoras pueden integrarse (por ejemplo, integrarse directamente) en el ADN genómico mediante el uso de transposasa Tn5 y la transposasa puede liberarse para exponer las secuencias adaptadoras mediante la adición de dodecilsulfato de sodio (SDS). Otras transposasas y métodos para integrar las secuencias adaptadoras en el ADN genómico también están dentro del alcance de esta descripción.

Las moléculas pueden ser una proteína, un péptido y/o un antígeno, y la secuencia adaptadora puede unirse a una secuencia identificadora única (por ejemplo, que comprende ácidos nucleicos) que se acopla a un anticuerpo. La secuencia identificadora única puede configurarse para identificar de manera única el anticuerpo al cual se une la secuencia identificadora única. Además, la etapa (a) puede comprender unir los anticuerpos, que comprenden cada una de la secuencia adaptadora y la secuencia identificadora única, a la proteína, el péptido y/o el antígeno. Las moléculas pueden ser una proteína, un péptido y/o un antígeno, y la secuencia adaptadora puede integrarse en un aptámero. Además, la etapa (a) puede comprender la unión del aptámero a la proteína, el péptido y/o el antígeno.

Pueden usarse métodos relacionados con la unión o acoplamiento de una secuencia adaptadora a una proteína, un péptido y/o un antígeno, por ejemplo, en la cuantificación de proteínas, la cuantificación de péptidos y/o la cuantificación de antígenos. La secuencia adaptadora puede unirse (por ejemplo, unirse químicamente) a un anticuerpo. Por ejemplo, la secuencia adaptadora puede unirse a un anticuerpo mediante el uso de química conocida por el experto en la técnica para mediar los enlaces ADN-proteína. Los anticuerpos para diferentes proteínas pueden marcarse con secuencias o hebras de ácido nucleico que incluyen una secuencia identificadora única además de la secuencia adaptadora. Después, el anticuerpo, o conjunto de anticuerpos, pueden usarse en un experimento de inmunotinción para marcar una proteína, o conjunto de proteínas, en células o tejido fijados y/o permeabilizados (véase la figura 6). Subsecuentemente, las células pueden someterse a un procedimiento de marcaje o adjudicación de códigos de barras como se describe en la presente descripción.

Las secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, las moléculas de ADN) unidas a los anticuerpos pueden liberarse de los anticuerpos y/o secuencias adaptadoras. Una reacción de secuenciación puede revelar una secuencia identificadora única asociada con una proteína dada así como también la etiqueta o código de barras asociado con una célula o células únicas. Dicho método puede revelar o identificar el número y/o tipo de proteínas presentes en una o más células.

Puede usarse un aptámero de ADN y/o un aptámero de ARN en lugar de, o además de, un anticuerpo modificado con ácido nucleico (o modificado con ADN) como se describió anteriormente(véasela figura 7). La secuencia adaptadora (y el anticuerpo específico de la proteína diana) pueden integrarse (por ejemplo, integrarse directamente) en la secuencia de un aptámero dado.

La descripción también proporciona métodos de adjudicación de códigos de barras a ácidos nucleicos dentro de una célula. Los métodos de adjudicación de códigos de barras a ácidos nucleicos dentro de una célula descrita en la presente descripción pueden comprender: (a) generar los ADNc dentro de una pluralidad de células mediante la transcripción inversa de los ARN mediante el uso de un cebador de la transcripción inversa que comprende una secuencia saliente en 5'; (b) dividir la pluralidad de células en al menos dos alícuotas; (c) proporcionar una pluralidad de etiquetas de ácido nucleico a cada una de las al menos dos alícuotas, en donde cada secuencia de código de barras de la pluralidad de etiquetas de ácido nucleico introducidas en una alícuota dada es la misma, y en donde se introduce una secuencia de código de barras diferente en cada alícuota; (d) unir al menos uno de los ADNc en cada una de las al menos dos alícuotas a las etiquetas de ácido nucleico; (e) combinar las al menos dos alícuotas; y (f) repetir las etapas (b), (c), (d), y (e) al menos una vez con la alícuota combinada.

Cada etiqueta de ácido nucleico puede comprender una primera hebra que comprende una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una secuencia de código de barras y una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la secuencia de código de barras. Cada etiqueta de ácido nucleico también puede comprender una segunda hebra que comprende una secuencia saliente, en donde la secuencia saliente comprende (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

La figura 8 representa la división, etiquetado y agrupamiento de células. Las células que se han transcrito de manera inversa pueden dividirse entre recipientes o pocillos de reacción. En la figura 8, se muestran 4 pocillos. Como se analizó anteriormente, sin embargo, puede usarse cualquier número adecuado de recipientes o pocillos de reacción. Se resalta una célula para mostrar su trayectoria a través del proceso. Como se representa, la célula resaltada primero termina en el pocillo 'a', en donde es la 1a etiqueta añadida la que se hibrida con el saliente de todos los transcritos de ADNc (se muestra en el cuadro). La etiqueta lleva una región de código de barras única 'a', que identifica el pocillo en el que estaba la célula. Después de la hibridación, todas las células se lavan para eliminar el exceso de etiquetas, se reagrupan y después, se dividen nuevamente entre el mismo número de pocillos. Después, la célula resaltada termina en el pocillo 'c' y tiene una 2a etiqueta añadida que identifica el pocillo en el que estaba. Después del segundo ciclo, las células podrían haber tomado 42 = 16 trayectorias posibles a través de los tubos. El proceso puede repetirse, con la adición de más etiquetas a los transcritos de ADNc y el aumento del número de trayectorias posibles que pueden tomar las células. Las Figuras 9A y 9B representan dos flujos de trabajo ilustrativos.

La descripción también proporciona kits para marcar ácidos nucleicos dentro de al menos una primera célula. El kit puede comprender al menos un cebador de la transcripción inversa que comprende una secuencia saliente en 5'. El kit también puede comprender una pluralidad de primeras etiquetas de ácido nucleico. Cada primera etiqueta de ácido nucleico puede comprender una primera hebra. La primera hebra puede incluir una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una primera secuencia de marcaje y una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la primera secuencia de marcaje. Cada primera etiqueta de ácido nucleico puede comprender además una segunda hebra. La segunda hebra puede incluir una secuencia saliente, en donde la secuencia saliente puede comprender (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' del cebador de la transcripción inversa y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

El kit puede comprender, además, una pluralidad de segundas etiquetas de ácido nucleico. Cada segunda etiqueta de ácido nucleico puede comprender una primera hebra. La primera hebra puede incluir una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una segunda secuencia de marcaje y una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la segunda secuencia de marcaje. Cada segunda etiqueta de ácido nucleico puede comprender, además, una segunda hebra. La segunda hebra puede comprender una secuencia saliente, en donde la secuencia saliente puede comprender (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' del cebador de la transcripción inversa y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'. La primera secuencia de mareaje puede ser diferente de la segunda secuencia de marcaje.

El kit también puede comprender una o más pluralidades adicionales de etiquetas de ácido nucleico. Cada etiqueta de ácido nucleico de la una o más pluralidades adicionales de etiquetas de ácido nucleico puede comprender una primera hebra. La primera hebra puede incluir una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una secuencia de marcaje y una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la secuencia de marcaje. Cada etiqueta de ácido nucleico de la una o más pluralidades adicionales de etiquetas de ácido nucleico también puede comprender una segunda hebra. La segunda hebra puede incluir una secuencia saliente, en donde la secuencia saliente comprende (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' del cebador de la transcripción inversa y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'. La secuencia de marcaje puede ser diferente en cada pluralidad adicional dada de etiquetas de ácido nucleico.

El kit puede comprender, además, al menos uno de una transcriptasa inversa, un agente de fijación, un agente de permeabilización, un agente de ligación y/o un agente de lisis.

La descripción también proporciona kits para marcar moléculas dentro de al menos una primera célula. Por ejemplo, los kits como se describieron anteriormente pueden adaptarse para marcar uno o más de ARN, ADNc, ADN, proteína, péptidos o antígenos dentro de al menos una primera célula.

La invención proporciona un método de marcaje de moléculas de ARN de manera única dentro de una pluralidad de células como se define en las reivindicaciones, el método comprende: (a) fijar y permeabilizar una primera pluralidad de células antes de la etapa (b), en donde la primera pluralidad de células se fija y permeabiliza a 4 °C o por debajo de 4 °C; (b) transcribir de manera inversa las moléculas de ARN dentro de la primera pluralidad de células para formar moléculas de ADN complementario (ADNc) dentro de la primera pluralidad de células, en donde la transcripción inversa de las moléculas de ARN incluye acoplar cebadores a las moléculas de ARN, en donde los cebadores incluyen al menos una de una secuencia poli(T) o una secuencia aleatoria; (c) dividir la primera pluralidad de células que incluye moléculas de ADNc en al menos dos alícuotas primarias, las al menos dos alícuotas primarias incluyen una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria; (d) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria; (e) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas; (f) combinar las al menos dos alícuotas primarias; (g) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias incluyen una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (h) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; (i) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas; (j) combinar las alícuotas finales; (k) lisar la primera pluralidad de células para liberar las moléculas de ADNc de la primera pluralidad de células para formar un lisado; y/o (l) añadir un inhibidor de proteasas y/o un agente aglutinante al lisado de manera que las moléculas de ADNc se unan al agente aglutinante. El método puede comprender repetir las etapas (f), (g), (h) e (i) con alícuotas subsecuentes, en donde las etiquetas de ácido nucleico finales incluyen un agente de captura.

El método puede incluir además dividir las alícuotas finales combinadas en al menos dos alícuotas finales, las al menos dos alícuotas finales incluyen una primera alícuota final y una segunda alícuota final. En algunas modalidades, la primera pluralidad de células puede fijarse y permeabilizarse a 4 °C, por debajo de 4 °C,por debajo de aproximadamente 3 °C, por debajo de aproximadamente 2 °C, o por debajo de aproximadamente 1 °C. Los métodos pueden incluir dividir las células. Por ejemplo, después del último ciclo o ciclo final de adjudicación de códigos de barras (a través de ligación), las células pueden agruparse antes de la lisis y después, las células pueden dividirse en diferentes alícuotas de lisado. Cada alícuota de lisado puede incluir un número predeterminado de células.

Con referencia, por ejemplo, a la etapa (l), el inhibidor de proteasas puede incluir fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF), sus combinaciones, y/u otro inhibidor de proteasas adecuado. El agente de captura puede incluir biotina u otro agente de captura adecuado. Además, el agente aglutinante puede incluir avidina (por ejemplo, estreptavidina) u otro agente aglutinante adecuado.

En ciertas modalidades, los métodos de marcaje de moléculas de ARN de manera única dentro de una pluralidad de células pueden incluir además (por ejemplo, después de la etapa (l)): (m) llevar a cabo un cambio de molde de las moléculas de ADNc unidas al agente aglutinante mediante el uso de un oligonucleótido de cambio de molde; (n) amplificar las moléculas de ADNc para formar una solución de moléculas de ADNc amplificadas; y/u (o) introducir una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) a la solución de moléculas de ADNc amplificadas, en donde la relación de la solución de perlas de SPRI a la solución de moléculas de ADNc amplificadas está entre 0,9:1 y 0,8:1. La solución de perlas de SPRI puede añadirse para eliminar polinucleótidos de menos de aproximadamente 200 pares de bases, menos de aproximadamente 175 pares de bases, o menos de aproximadamente 150 pares de bases(véaseDeAngelis, MM,y otros,Nucleic Acids Research (1995) 23(22):4742). En otras palabras, las moléculas de ADNc pueden unirse a perlas de estreptavidina dentro de un lisado. Puede realizarse el cambio de molde de las moléculas de ADNc unidas a las perlas (por ejemplo, para añadir un adaptador al extremo 3' de las moléculas de ADNc). Después, puede realizarse la amplificación por PCR de las moléculas de ADNc, seguida de la adición de perlas de SPRI para eliminar polinucleótidos de menos de aproximadamente 200 pares de bases. La relación entre la solución de perlas de SPR<i>y la solución de moléculas de ADNc amplificadas puede estar entre aproximadamente 0,9:1 y aproximadamente 0,7:1, entre aproximadamente 0,875:1 y aproximadamente 0,775:1, entre aproximadamente 0,85:1 y aproximadamente 0,75:1, entre aproximadamente 0,825:1 y aproximadamente 0,725:1, aproximadamente 0,8:1, u otra relación adecuada. Además, la solución de perlas de SPRI puede incluir entre aproximadamente 1 M y 4 M de NaCl, entre aproximadamente 2 M y 3 M de NaCl, entre aproximadamente 2,25 M y 2,75 M de NaCl, aproximadamente 2,5 M de NaCl, u otra cantidad adecuada de NaCl. La solución de perlas de SPRi puede incluir, además, entre aproximadamente 15 % p/v y 25 % p/v de polietilenglicol (PEG), en donde el peso molecular del PEG está entre aproximadamente 7000 g/mol y 9000 g/mol (PEG 8000). La solución de perlas de SPRI puede incluir entre aproximadamente 17 % p/v y 23 % p/v de PEG 8000, entre aproximadamente 18 % p/v y 22 % p/v de PEG 8000, entre aproximadamente 19 % p/v y 21 % p/v de PEG 8000, aproximadamente 20 % p/v de PEG 8000, u otro % p/v de PEG 8000 adecuado.

Los métodos de marcaje de manera única de moléculas de ARN dentro de una pluralidad de células pueden incluir, además, añadir una secuencia adaptadora común al extremo 3' de las moléculas de ADNc liberadas. La secuencia adaptadora común puede ser una secuencia adaptadora que es la misma, o sustancialmente la misma, para cada una de las moléculas de ADNc(es decir,dentro de un experimento dado). La adición del adaptador común puede llevarse a cabo o realizarse en una solución que incluye hasta aproximadamente 10 % p/v de PEG, en donde el peso molecular del PEG está entre aproximadamente 7000 g/mol y 9000 g/mol. En determinadas modalidades, la secuencia adaptadora común puede añadirse al extremo 3' de las moléculas de ADNc liberadas mediante cambio de molde(véasePicelli, S,y otros.Nature Methods 10, 1096-1098 (2013)).

El método puede comprender repetir las etapas (f), (g), (h) e (i) con alícuotas subsecuentes un número de veces suficiente para generar una serie única de etiquetas de ácidos nucleicos para los ácidos nucleicos en una célula individual. Por ejemplo, el número de veces puede seleccionarse de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, y 100.

En varias modalidades, los cebadores de la etapa (b) pueden incluir, además, un primer código de barras específico. Dicho de otra manera, el primer código de barras añadido a las moléculas de ADNc en un contenedor, mezcla, reacción, receptáculo, muestra, pocillo o recipiente específico puede predeterminarse (por ejemplo, específico para el contenedor, mezcla, reacción, receptáculo, muestra, pocillo o recipiente dado). Por ejemplo, pueden usarse 48 conjuntos de diferentes cebadores de RT específicos de pocillos (por ejemplo, en una placa de 48 pocillos). En consecuencia, si hay 48 muestras (por ejemplo, células, tejidos, etc.), cada muestra puede obtener un código de barras único específico del pocillo. Sin embargo, si solo hay cuatro muestras, cada muestra puede tener 12 conjuntos diferentes de cebadores de RT específicos del pocillo. Un usuario puede saber cuáles de los 12 corresponden a cada muestra, de manera que el usuario puede recuperar las identidades de las muestras. Otros números de primeros códigos de barras específicos (o cebadores de Rt específicos del pocillo) también están dentro del alcance de esta descripción. Dicha configuración puede permitir o proporcionar el análisis múltiple del método como se explica más adelante en el Ejemplo 16.

Los métodos pueden incluir además: (p) transcribir de manera inversa moléculas de ARN dentro de una segunda pluralidad de células para formar moléculas de ADNc dentro de la segunda pluralidad de células, en donde la transcripción inversa de las moléculas de ARN incluye acoplar cebadores específicos a las moléculas de ARN, en donde los cebadores incluyen un segundo código de barras específico y al menos una de una secuencia poli(T) o una secuencia aleatoria, en donde el primer código de barras específico es diferente del segundo código de barras específico de manera que las moléculas de ADNc de la primera pluralidad de células pueden identificarse en comparación con las moléculas de ADNc de la segunda pluralidad de células; (q) dividir la segunda pluralidad de células que incluyen moléculas de ADNc en al menos dos alícuotas primarias, las al menos dos alícuotas primarias que incluyen una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria; (r) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria; (s) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas; (t) combinar las al menos dos alícuotas primarias; (u) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias que incluyen una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (v) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a las al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; y (w) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas. El método puede comprender, además, repetir las etapas (t), (u), (v) y (w) con alícuotas subsecuentes, en donde las etiquetas de ácido nucleico finales incluyen un agente de captura. Las etapas anteriores (por ejemplo, las etapas (j), (k) y (l)) como se usaron con la primera pluralidad de células también pueden adaptarse para usar con la segunda pluralidad de células.

En varias modalidades, cada una de las etiquetas de ácido nucleico puede incluir una primera hebra, en donde la primera hebra incluye (i) una secuencia de código de barras que incluye un extremo 3' y un extremo 5' y (ii) una secuencia de hibridación en 3' y una secuencia de hibridación en 5' que flanquea el extremo 3' y el extremo 5' de la secuencia de código de barras, respectivamente. Cada una de las etiquetas de ácido nucleico puede incluir, además, una segunda hebra, en donde la segunda hebra incluye (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia adaptadora y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

Los métodos de marcaje de manera única de moléculas de ARN dentro de una pluralidad de células pueden incluir, además, ligar al menos dos (o más) de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a las moléculas de ADNc. La ligación puede realizarse dentro de la primera pluralidad de células.

Los métodos pueden incluir, además, eliminar etiquetas de ácidos nucleicos no unidas. En algunas modalidades, los métodos pueden incluir ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a las moléculas de ADNc liberadas. La mayoría de las moléculas de ADNc unidas a etiquetas de ácido nucleico a partir de una célula individual pueden incluir la misma serie de etiquetas de ácidos nucleicos unidas. Las pluralidades de células (por ejemplo, la primera y segunda pluralidad de células) pueden seleccionarse de al menos una de células de mamíferos, células de levadura y células bacterianas.

La descripción proporciona, además, métodos de marcaje de ácidos nucleicos dentro de una primera célula. Los métodos pueden incluir: (a) generar moléculas de ADNc dentro de una pluralidad de células que incluyen la primera célula mediante la transcripción inversa de ARN mediante el uso de al menos uno de (i) un primer cebador de transcripción inversa que incluye una secuencia saliente en 5', en donde el primer cebador de transcripción inversa se configura para transcribir de manera inversa el ARN que tiene una cola poli(A) y/o (ii) un segundo cebador de transcripción inversa que incluye una secuencia saliente en 5' y al menos uno de un hexámero aleatorio, un septámero aleatorio, un octámero aleatorio, un nonámero aleatorio, y un decámero aleatorio; (b) dividir la pluralidad de células en un número (n) de alícuotas; (c) proporcionar una pluralidad de etiquetas de ácido nucleico a cada una de las n alícuotas; (d) unir al menos una de las moléculas de ADNc en cada una de las n alícuotas a las etiquetas de ácido nucleico; (e) combinar las n alícuotas; (f) repetir las etapas (b), (c), (d), y (e) con la alícuota combinada; (g) combinar alícuotas finales; (h) lisar la pluralidad de células que incluyen la primera célula para liberar las moléculas de ADNc a partir de la pluralidad de células que incluyen la primera célula para formar un lisado; y/o (i) añadir un inhibidor de proteasas y/o un agente aglutinante al lisado de manera que las moléculas de ADNc se unan al agente aglutinante.

Con referencia, por ejemplo, a la etapa (c), cada etiqueta de ácido nucleico puede incluir una primera hebra que incluye (i) una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una secuencia de marcaje y (ii) una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la secuencia de marcaje. Cada etiqueta de ácido nucleico puede incluir, además, una segunda hebra que incluye una secuencia saliente, la secuencia saliente que incluye (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'. La secuencia de marcaje de la pluralidad de etiquetas de ácido nucleico proporcionadas en una alícuota dada puede ser la misma y una secuencia de marcaje diferente puede proporcionarse en cada una de las n alícuotas.

La etapa (f) puede repetirse un número de veces suficiente para generar una serie única de secuencias de marcaje para las moléculas de ADNc en la primera célula. Por ejemplo, el número de veces puede seleccionarse de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, y 100.

Las moléculas de ADNc pueden formarse o generarse en una alícuota (por ejemplo, una mezcla de reacción). La concentración del primer cebador de transcripción inversa en la alícuota puede estar entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 10 pM, entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 7 pM, entre aproximadamente 1,5 pM y aproximadamente 4 pM, entre aproximadamente 2 pM y aproximadamente 3 pM, aproximadamente 2,5 pM u otra concentración adecuada. La concentración del segundo cebador de transcripción inversa en la alícuota puede estar entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 10 pM, entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 7 pM, entre aproximadamente 1,5 pM y aproximadamente 4 pM, entre aproximadamente 2 pM y aproximadamente 3 pM, aproximadamente 2,5 pM u otra concentración adecuada.

Los métodos pueden incluir fijar la pluralidad de células antes de la etapa (a). La pluralidad de células puede fijarse por debajo de aproximadamente 8 °C, por debajo de aproximadamente 7 °C, por debajo de aproximadamente 6 °C, por debajo de aproximadamente 5 °C, a aproximadamente 4 °C, por debajo de aproximadamente 4 °C, por debajo de aproximadamente 3 °C, por debajo de aproximadamente 2 °C, por debajo de aproximadamente 1 °C, o a otra temperatura adecuada. Los métodos pueden incluir permeabilizar la pluralidad de células antes de la etapa (a). La pluralidad de células puede permeabilizarse por debajo de aproximadamente 8 °C, por debajo de aproximadamente 7 °C, por debajo de aproximadamente 6 °C, por debajo de aproximadamente 5 °C, a aproximadamente 4 °C, por debajo de aproximadamente 4 °C, por debajo de aproximadamente 3 °C, por debajo de aproximadamente 2 °C, por debajo de aproximadamente 1 °C, o a otra temperatura adecuada.

Los métodos de mareaje de ácidos nucleicos dentro de una primera célula pueden incluir, además, ligar al menos dos de las etiquetas de ácidos nucleicos que se unen a las moléculas de ADNc. La ligación puede realizarse dentro de la pluralidad de células. Los métodos pueden incluir eliminar las etiquetas de ácido nucleico no unidas. Además, al menos uno del primer y segundo cebadores de transcripción inversa puede transcribir de manera inversa los ARN predeterminados o configurarse para transcribir de manera inversa los ARN predeterminados.

Las etiquetas de ácido nucleico finales pueden incluir un agente de captura. Además, los métodos pueden incluir lisar la pluralidad de células para liberar las moléculas de ADNc a partir de la pluralidad de células después de la etapa (f) para formar un lisado. Los métodos pueden incluir, además, añadir un inhibidor de proteasas y/o un agente aglutinante al lisado para aislar las moléculas de ADNc. Como se analizó anteriormente, el inhibidor de proteasas puede incluir PMSF, a Eb SF, sus combinaciones y/u otro inhibidor de proteasas adecuado. El agente de captura puede incluir biotina u otro agente de captura adecuado y el agente aglutinante puede incluir avidina (por ejemplo, estreptavidina) u otro agente aglutinante adecuado.

Los métodos de marcaje de ácidos nucleicos dentro de una primera célula también pueden incluir: (j) llevar a cabo un cambio de molde de las moléculas de ADNc unidas al agente aglutinante; (k) amplificar las moléculas de ADNc para formar una solución de moléculas de ADNc amplificadas; y (l) introducir una solución de perlas de SPRI a la solución de moléculas de ADNc amplificadas para eliminar polinucleótidos de menos de aproximadamente 200 pares de bases, menos de aproximadamente 175 pares de bases o menos de aproximadamente 150 pares de bases. La relación entre la solución de perlas de SPRI y la solución de moléculas de ADNc amplificadas puede estar entre aproximadamente 0,9:1 y aproximadamente 0,7:1, entre aproximadamente 0,875:1 y aproximadamente 0,775:1, entre aproximadamente 0,85:1 y aproximadamente 0,75:1, entre aproximadamente 0,825:1 y aproximadamente 0,725:1, aproximadamente 0,8:1, u otra relación adecuada.

Además, la solución de perlas de SPRI puede incluir entre aproximadamente 1 M y 4 M de NaCl, entre aproximadamente 2 M y 3 M de NaCl, entre aproximadamente 2,25 M y 2,75 M de NaCl, aproximadamente 2,5 M de NaCl, u otra cantidad adecuada de NaCl. La solución de perlas de SPRI puede incluir, además, entre aproximadamente 15 % p/v y 25 % p/v de PEG, en donde el peso molecular del PEG está entre aproximadamente 7000 g/mol y 9000 g/mol. La solución de perlas de SPRI puede incluir entre aproximadamente 17 % p/v y 23 % p/v de PEG 8000, entre aproximadamente 18 % p/v y 22 % p/v de PEG 8000, entre aproximadamente 19 % p/v y 21 % p/v de PEG 8000, aproximadamente 20 % p/v de PEG 8000, u otro % p/v de PEG 8000 adecuado.

Los métodos de marcaje de manera única de moléculas de ARN dentro de una pluralidad de células descritos en la presente descripción pueden incluir, además, añadir una secuencia adaptadora común al extremo 3' de las moléculas de ADNc liberadas. Como se analizó anteriormente, la adición del adaptador común puede llevarse a cabo o realizarse en una solución que comprende hasta aproximadamente 10 % p/v de PEG, en donde el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 7000 g/mol y 9000 g/mol. La secuencia adaptadora común puede añadirse al extremo 3' de las moléculas de ADNc liberadas mediante el cambio de molde.

Los métodos descritos anteriormente pueden adaptarse para el marcaje de moléculas de ácido nucleico dentro de un núcleo o pluralidad de núcleos. Por ejemplo, los métodos pueden incluir el marcaje de manera única de moléculas de ARN dentro de una pluralidad de núcleos o el marcaje de ácidos nucleicos dentro de un primer núcleo.

La descripción proporciona, además, kits para el marcaje de ácidos nucleicos dentro de una primera célula. El kit puede incluir un primer cebador de transcripción inversa que incluye una secuencia saliente en 5' y puede configurarse para transcribir de manera inversa el ARN que tiene una cola de poli(A). El kit puede incluir, además, un segundo cebador de transcripción inversa que incluye una secuencia saliente en 5' y al menos uno de un hexámero aleatorio, un septámero aleatorio, un octámero aleatorio, un nonámero aleatorio y/o un decámero aleatorio.

El kit puede incluir una pluralidad de primeras etiquetas de ácido nucleico. Como se analizó anteriormente, cada primera etiqueta de ácido nucleico puede incluir una primera hebra que incluye (i) una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una primera secuencia de marcaje y (ii) una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la primera secuencia de marcaje. Cada primera etiqueta de ácido nucleico puede incluir, además, una segunda hebra que incluye una secuencia saliente. La secuencia saliente puede incluir (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' del primer y segundo cebadores de transcripción inversa y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

El kit puede incluir, además, una pluralidad de segundas etiquetas de ácido nucleico. Cada segunda etiqueta de ácido nucleico puede incluir una primera hebra que incluye (i) una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una segunda secuencia de marcaje y (ii) una secuencia de hibridación en 5' que se extiende a partir de un extremo 5' de la segunda secuencia de marcaje. Cada segunda etiqueta de ácido nucleico puede incluir, además, una segunda hebra que incluye una secuencia saliente. La secuencia saliente puede incluir (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' del primer y segundo cebadores de transcripción inversa y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'. Además, la primera secuencia de marcaje puede ser diferente de la segunda secuencia de marcaje.

El kit puede incluir, además, una pluralidad de etiquetas de ácido nucleico finales. Cada etiqueta de ácido nucleico final puede incluir una primera hebra que incluye (i) una secuencia de hibridación en 3' que se extiende a partir de un extremo 3' de una secuencia de marcaje final y (ii) una secuencia de hibridación en 5' que se extiende desde un extremo 5' de la secuencia de marcaje final. Cada etiqueta de ácido nucleico final puede incluir, además, una segunda hebra que incluye una secuencia saliente. La secuencia saliente puede incluir (i) una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia saliente en 5' del primer y segundo cebadores de transcripción inversa y (ii) una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'. Cada etiqueta de ácido nucleico final puede incluir, además, un agente de captura. Además, la secuencia de marcaje final puede ser diferente de la primera y segunda secuencias de marcaje (y/o cualquier otra secuencia de marcaje). El kit puede incluir, además, al menos una de una transcriptasa inversa, un agente de fijación, un agente de permeabilización, un agente de ligación, un agente de lisis, un inhibidor de proteasa y/o cualquier otro componente adecuado.

Como entenderá un experto en la técnica, cada modalidad descrita en la presente descripción puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en su elemento, etapa, ingrediente, o componente particular indicado. Como se usa en la presente descripción, el término de transición "comprende" o "comprende" significa que incluye, pero no se limita a, y permite la inclusión de elementos, etapas, ingredientes o componentes no especificados, incluso en cantidades mayores. La frase de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa, ingrediente o componente no especificado. La frase de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de la modalidad a los elementos, etapas, ingredientes o componentes especificados, y a aquellos que no afectan materialmente la modalidad.

Sin perjuicio de que los intervalos numéricos y parámetros que exponen el amplio alcance de la descripción son aproximaciones, los valores numéricos que se exponen en los ejemplos específicos se informan de la manera más precisa posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores necesariamente resultantes de la desviación estándar encontrada en sus mediciones de prueba respectivas.

Los términos "un", "una", "el" y referencias similares usados en el contexto de describir la descripción (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra forma en la presente descripción o se contradiga claramente por el contexto. La mención de intervalos de valores en la presente descripción simplemente pretende servir como un método abreviado de referencia individual a cada valor separado que cae dentro del intervalo. A menos que se indique de otra forma en la presente descripción, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se mencionara individualmente en la presente descripción. Todos los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra forma en la presente descripción o se contradiga claramente de cualquier otra manera por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente descripción pretende simplemente iluminar mejor la descripción y no plantea una limitación en el alcance de la descripción reivindicada de cualquier otra manera. Ningún lenguaje en la descripción debe interpretarse como que indica ningún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la descripción.

Las agrupaciones de elementos alternativos o modalidades de la descripción descrita en la presente descripción no deben interpretarse como limitaciones. Cada miembro del grupo puede denominarse y reivindicarse individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos encontrados en la presente descripción. Se prevé que uno o más miembros de un grupo pueden incluirse en, o eliminarse de, un grupo por motivos de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce dicha inclusión o eliminación, se considera que la descripción contiene el grupo modificado, cumpliendo de esta manera la descripción escrita de todos los grupos Markush usados en las reivindicaciones adjuntas.

Las definiciones y explicaciones que se usan en la presente descripción pretenden controlar en cualquier construcción futura a menos que se modifiquen de manera clara e inequívoca en los siguientes ejemplos o cuando la aplicación del significado haga que cualquier construcción sea sin significado o esencialmente sin significado en los casos en los que la construcción del término la haga sin significado o esencialmente sin significado, la definición debe tomarse del diccionario de Webster, 3ra edición o un diccionario conocido por los expertos en la técnica, tal como el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de los métodos y composiciones descritos. A la luz de esta descripción, los expertos en la técnica reconocerán que serían posibles variaciones de estos ejemplos y otros ejemplos de los métodos y composiciones descritos sin experimentación indebida.

Ejemplo 1 - Fijación y transcripción inversa

Las células NIH/3T3 (ratón) y Hela-S3 (humanas) pueden cultivarse hasta la confluencia en dos placas de cultivo celular de 10 cm separadas. Las células pueden enjuagarse dos veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X, puede añadirse 1 ml de tripsina al 0,05 % a cada placa y las placas pueden incubarse a 37 °C durante 5 minutos. Las células pueden separarse mediante la inclinación de cada placa en un ángulo de 45° mientras se pipetea la tripsina a través de las placas, que puede continuarse hasta que todas, o sustancialmente todas, las células se desprendan. Cada línea celular puede transferirse a su propio tubo de centrífuga cónico de 15 ml (FALCON™). Pueden añadirse 2 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino (FBS) al 10 % a cada tubo. El número de células en cada tubo puede calcularse (por ejemplo, con un hemocitómetro o en un citómetro de flujo). Por ejemplo, pueden transferirse 200 pl de la muestra a partir de cada tubo a tubos de microcentrífuga separados de 1,7 ml (EPPENDORF®) y pueden procesarse 100 pl de la muestra en un Citómetro de flujo ACCURI™ para calcular la concentración celular.

El mismo número de células a partir de cada tubo puede combinarse en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 ml (FALCON™), mediante el uso de tantas células como sea posible. Puede llevarse a cabo un centrifugado de 5 minutos a 500 x g en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml (FALCON™). Puede ser útil usar una centrífuga de cubeta de manera que las células se sedimenten en el fondo del tubo en lugar de en el lado del tubo. El líquido puede aspirarse sin alterar el sedimento celular y las células pueden resuspenderse en 500 pl de formaldehído al 4 %. Después, las células pueden dejarse a temperatura ambiente (es decir, 20-25 °C) durante 10 minutos. Pueden añadirse 1,5 ml de TRITON™ X-100 al 0,5 % al tubo y mezclarse suavemente con una pipeta. Después, el tubo puede centrifugarse a 500 x g durante 5 minutos. Nuevamente, el líquido puede aspirarse sin alterar el sedimento y el sedimento puede lavarse dos veces con 1 ml de PBS sin resuspender el sedimento. Si el lavado altera el sedimento, puede omitirse el segundo lavado. Después, el sedimento puede resuspenderse en 1 ml de HCl 0,1 N e incubarse a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Pueden añadirse 2 ml de Tris-HCl (pH 8,0) a un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 ml (FALCON™). Las células fijadas en HCl, de la etapa anterior, pueden transferirse al tubo con Tris-HCl para neutralizar el HCl. Después, el número de células en el tubo puede calcularse como se analizó anteriormente (por ejemplo, con un hemocitómetro o en un citómetro de flujo). Las células fijadas en Tris-HCl pueden centrifugarse a 500 x g durante 5 minutos y el líquido puede aspirarse sin alterar el sedimento. El sedimento puede lavarse dos veces con 1 ml de agua de grado molecular sin ARNasa, sin alterar el sedimento. Después, las células pueden resuspenderse a una concentración de 2,5 millones de células/ml (para hacer esto, puede usarse la concentración calculada antes de la última etapa de centrifugación).

Puede hacerse una mezcla de transcripción inversa (55 pl de tampón de transcriptasa inversa M-MuLV (ENZYMATICS®), 55 pl de transcriptasa inversa M-MuLV (ENZYMATICS®), 5,5 pl de dNTP (25 mM por base), 3,44 pl de inhibidor de ARNasa (ENZYMATICS®, 40 unidades/pl), 210,4 pl de agua libre de nucleasa y 2,75 pl de cebador de RT (BC_0055, 100 pM)). En un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos, pueden combinarse 300 pl de la mezcla de transcripción inversa con 200 pl de las células fijadas (~500000 células) y mezclarse suavemente mediante pipeteado. Después, la mezcla puede incubarse a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que el cebador de transcripción inversa hibride y después, la mezcla puede incubarse a 37 °C en una incubadora humidificada durante toda la noche(es decir,~16 horas).

Un cebador que puede usarse para la transcripción inversa (BC_0055) se representa en la figura 10. Este es un cebador anclado, diseñado para unirse al inicio de una cola de poli(A) de un ARN mensajero. El cebador puede sintetizarse con las 4 bases en el extremo 3' (N) y cada base excepto T en la segunda posición más 3' (V). El cebador también puede incluir 15 dT consecutivos. El cebador puede incluir más de 15 dT. El cebador puede incluir menos de 15 dT. En donde el cebador incluye menos de 15 dT, la temperatura de fusión del cebador puede reducirse. El dominio s0 puede no hibridar con ARN mensajeros, sino que puede proporcionar un dominio de unión accesible para un oligo enlazador. El cebador también incluye un fosfato en 5' que puede permitir la ligación del cebador a otro oligo mediante la T4 ligasa de ADN.

Ejemplo 2 - Preparación de códigos de barras

Los códigos de barras se solicitaron en placas de 96 pocillos a concentraciones de 100 pM. Cada código de barras se hibridó con su oligo enlazador correspondiente(véanselas Figuras 10-12).

La figura 11 representa un oligo de código de barras hibridado del primer ciclo. Se usaron 96 oligos de código de barras del primer ciclo con secuencias únicas en el dominio i8a. En el primer ciclo, la secuencia única en el dominio i8a es la región de la secuencia que se usa como código de barras. Mediante la variación de 8 nucleótidos, hay 65 536 posibles secuencias únicas. Más de 8 nucleótidos pueden estar presentes en el dominio i8a. Menos de 8 nucleótidos pueden estar presentes en el dominio i8a. Los códigos de barras del primer ciclo se prehibridaron con una hebra enlazadora (BC_0056) a través de secuencias complementarias en el dominio s1. La cadena enlazadora puede incluir una secuencia complementaria a parte del cebador de transcripción inversa (dominio s0) que puede permitirle hibridar y llevar el extremo 3' de los códigos de barras del primer ciclo muy cerca del extremo 5' del cebador de transcripción inversa. Después, el fosfato del cebador de transcripción inversa puede ligarse al extremo 3' de los códigos de barras del primer ciclo mediante la T4 ligasa de ADN. El dominio s2 puede proporcionar un dominio de unión accesible para que un oligo enlazador se use en otro ciclo de asignación de códigos de barras. Los oligos de código de barras del primer ciclo pueden incluir un fosfato en 5' que puede permitir la ligación al extremo 3' de otro oligo mediante la T4 ligasa de ADN.

La figura 12 representa un oligo de código de barras del segundo ciclo hibridado. Se usaron 96 oligos de código de barras del segundo ciclo con secuencias únicas en el dominio i8b. En el segundo ciclo, la secuencia única en el dominio i8b es la región de la secuencia que se usa como un código de barras. Mediante la variación de 8 nucleótidos, hay 65 536 posibles secuencias únicas. Más de 8 nucleótidos pueden estar presentes en el dominio i8b. Menos de 8 nucleótidos pueden estar presentes en el dominio i8b. Los códigos de barras del segundo ciclo pueden prehibridarse con una hebra enlazadora (BC_0058) a través de secuencias complementarias en el dominio s3. La hebra enlazadora puede incluir una secuencia complementaria a parte del oligo de código de barras del primer ciclo (dominio s2) que puede permitirle hibridar y llevar el extremo 3' de los códigos de barras del primer ciclo muy cerca del extremo 5' del oligo de código de barras del segundo ciclo. Después, el fosfato del oligo de código de barras del primer ciclo puede ligarse al extremo 3' de los códigos de barras del segundo ciclo mediante la T4 ligasa de ADN. El dominio s4 puede proporcionar un dominio de unión accesible para que un oligo enlazador se use en otro ciclo de asignación de códigos de barras. Los oligos de código de barras del segundo ciclo pueden incluir un fosfato en 5' que puede permitir la ligación al extremo 3' de otro oligo mediante la T4 ligasa de ADN.

La figura 13 representa un oligonucleótido de código de barras hibridado del tercer ciclo. Se usaron 96 oligos de código de barras del tercer ciclo con secuencias únicas en el dominio i8c. En el tercer ciclo, la secuencia única en el dominio i8c es la región de la secuencia que se usa como un código de barras. Mediante la variación de 8 nucleótidos, hay 65 536 posibles secuencias únicas. Más de 8 nucleótidos pueden estar presentes en el dominio i8c. Pueden estar presentes menos de 8 nucleótidos en el dominio i8c. El tercer ciclo de códigos de barras puede prehibridarse con una hebra enlazadora (BC_0060) a través de secuencias complementarias en el dominio s5. La hebra enlazadora puede incluir una secuencia complementaria a parte del oligonucleótido de código de barras del segundo ciclo (dominio s4) que puede permitirle hibridar y llevar el extremo 3' de los códigos de barras del segundo ciclo muy cerca del extremo 5' del oligo de código de barras del tercer ciclo. Después, el fosfato del oligo del código de barras del segundo ciclo puede ligarse al extremo 3' de los códigos de barras del tercer ciclo mediante la T4 ligasa de ADN. Los oligos de código de barras del tercer ciclo pueden sintetizarse con identificadores moleculares únicos (UMI;véaseIslam,y otros,Nature Methods, 2014) que consiste en 10 nucleótidos aleatorios (UMI de dominio: NNNNNNNNNN). Debido al sesgo de la amplificación de la PCR, pueden originarse múltiples lecturas de secuenciación a partir del ADNc. Mediante el uso de un UMI, cada ADNc puede contarse solo una vez. Los códigos de barras del tercer ciclo pueden incluir, además, un dominio correspondiente a parte del adaptador ILLUMINA® TruSeq. Los códigos de barras del tercer ciclo pueden sintetizarse con una molécula de biotina en el extremo 5' de manera que el ADNc completamente con código de barras pueda aislarse con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina.

Partiendo de una solución de trabajo de 100 pM de cada oligo de código de barras(es decir,en placas de 96 pocillos, una para cada ciclo), se transfirieron 11 pl de oligo de código de barras a placas de PCR de 96 pocillos. A la placa con los códigos de barras del ciclo 1, se añadieron 9 pl de BC_0056 (solución de trabajo 100 pM) a cada pocillo. A la placa con los códigos de barras del ciclo 2, se añadieron 9 pl de BC_0058 (solución de trabajo 100 pM) a cada pocillo. A la placa con los códigos de barras del ciclo 3, se añadieron 9 pl de BC_0060 (solución de trabajo 100 pM) a cada pocillo. Después, cada placa se colocó en un termociclador, con el siguiente programa, para hibridar los códigos de barras con el oligo enlazador correspondiente: calentar hasta 90 °C, reducir el calor 0,1 °C/segundo y detenerse cuando la temperatura alcanza 25 °C. Se transfirieron 2,2 pl de cada pocillo que tenía los códigos de barras del ciclo 1 a una nueva placa de 96 pocillos (denominada placa L1). Se transfirieron 3,8 pl de cada pocillo con los códigos de barras del ciclo 2 a una nueva placa de 96 pocillos (denominada placa L2). Se transfirieron 6,1 pl de cada pocillo con los códigos de barras del ciclo 3 a una nueva placa de 96 pocillos (denominada placa L3).

Ejemplo 3 - Preparación de oligos para detener la ligación

Después de cada ciclo de ligación, la ligación puede detenerse mediante la adición de un exceso de oligo que es complementario a las hebras enlazadoras(véasela figura 14). Para detener cada ligación de código de barras, pueden añadirse hebras de oligo que son totalmente complementarias a los oligos enlazadores. Estos oligos pueden unir las hebras enlazadoras unidas a códigos de barras no ligados y desplazar los códigos de barras no ligados a través de una reacción de desplazamiento de la hebra. Después, los códigos de barras no ligados pueden ser completamente monocatenarios. Dado que la T4 ligasa de ADN no puede ligar ADN monocatenario a otro ADN monocatenario, la reacción de ligación dejará de progresar. Para garantizar que todos los oligos enlazadores se unan a los oligos complementarios, se añade un exceso molar de los oligos complementarios (con relación a los oligos enlazadores). Para detener la ligación del primer ciclo, se añade BC_0064 (complementario a BC_0056). Para detener la ligación del segundo ciclo, se añade BC_0065 (complementario a BC_0058). Para detener la ligación del tercer ciclo, se añade BC_0066 (complementario a BC_0060).

Pueden prepararse diluciones para cada hebra de detención de ligación (BC_0064, BC_0065, BC_0066) de la siguiente manera: 264 pl de hebra para detener la ligación (BC_0064, BC_0065, BC_0066), 300 pl de tampón de la T4 ligasa de ADN 10X y 636 pl de agua libre de nucleasas.

Ejemplo 4 - Ligación de códigos de barras al ADNc

Pueden añadirse 5 μl de TRITON™ X-100 al 10% ala reacción de transcripción inversa (a una concentración final de 0,1 %) en la placa de 24 pocillos descrita anteriormente. La reacción de transcripción inversa (RT) con células puede transferirse a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml (FALCON™). Las reacciones de RT pueden centrifugarse durante 10 minutos a 500 * g y resuspenderse en 2 ml de agua libre de nucleasas. Las células pueden combinarse con una mezcla de ligasa (600 μl de tampón de la T4 ligasa 10X, 2040 μl de agua libre de nucleasas, todas las células resuspendidas (2000 jl), 100 μl de la T4 ligasa de ADN (NEW ENGLAND BIOLABS®, 400 000 unidades/ml) y 60 μl de TRITON™ X-100 al 10 %) en un depósito de pipeteado desechable (10 ml)). Las células y la mezcla de ligasa pueden mezclarse mediante inclinación suave del depósito hacia delante y hacia atrás varias veces. Mediante el uso de una pipeta multicanal, pueden añadirse 40 μl de las células en la mezcla de ligasa a cada pocillo de los códigos de barras hibridados del ciclo 1 (placa L1). Cada pocillo puede mezclarse mediante pipeteado hacia arriba y hacia abajo suavemente 2-3 veces. Las células en la mezcla de ligasa pueden incubarse a 37 °C durante 60 minutos.

Pueden añadirse 10 μl del BC_0064 diluido a cada pocillo para detener la ligación. Después, las muestras pueden incubarse a 37 °C durante 30 minutos. Todas las células pueden recogerse en un nuevo depósito de pipeteado desechable (10 ml). Las células pueden pasar a través de un filtro de 40 jM hacia un nuevo depósito de pipeteado desechable (10 ml) mediante el uso de una pipeta de 1 ml. Pueden añadirse 100 μl de la T4 ligasa de ADN (NEW ENGLAND BIOLABS®, 400 000 unidades/ml) a las células en el depósito. Las células y la mezcla de ligasa pueden mezclarse mediante la inclinación suave del depósito hacia atrás y hacia delante varias veces y mediante el uso de una pipeta multicanal, pueden añadirse 40 μl de las células en la mezcla de ligasa a cada pocillo de los códigos de barras hibridados del ciclo 2 (placa L2). Cada pocillo puede mezclarse mediante pipeteado hacia arriba y hacia abajo suavemente 2-3 veces y las muestras pueden incubarse a 37 °C durante 60 minutos.

Pueden añadirse 10 μl del BC_0065 diluido a cada pocillo para detener la ligación. Las muestras pueden incubarse a 37 °C durante 30 minutos y después, las células pueden recogerse en un nuevo depósito de pipeteado desechable (10 ml). Las células pueden pasar a través de un filtro de 40 jM hacia un nuevo depósito de pipeteado desechable (10 ml) mediante el uso de una pipeta de 1 ml. Pueden añadirse 100 μl de la T4 ligasa de ADN (NEW ENGLAND BIOLABS®, 400 000 unidades/ml) a las células en el depósito. Las células y la mezcla de ligasa pueden mezclarse mediante inclinación suave del depósito hacia delante y hacia atrás varias veces. Mediante el uso de una pipeta multicanal, pueden añadirse 40 μl de las células en la mezcla de ligasa a cada pocillo de los códigos de barras hibridados del ciclo 3 (placa L3). Después, cada pocillo puede mezclarse mediante pipeteado hacia arriba y hacia abajo suavemente 2-3 veces y las muestras pueden incubarse a 37 °C durante 60 minutos.

Pueden añadirse 10 μl del BC_0066 diluido a cada pocillo para detener la ligación. Las muestras pueden incubarse a 37 °C durante 30 minutos. Todas las células pueden recogerse en un nuevo depósito de pipeteado desechable (10 ml). Las células pueden transferirse a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml (FALCON™) y el tubo puede llenarse con tampón de lavado (agua libre de nucleasas, Tween 20 al 0,05 % y formamida al 25 %) a 15 ml. Las muestras pueden incubarse durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, las células pueden sedimentarse a 500 * g durante 10 minutos y el líquido puede retirarse sin alterar el sedimento. Cada tubo de células puede resuspenderse en 100 μl de PBS y las células pueden contarse (por ejemplo, en un hemocitómetro o en un citómetro de flujo). En un ejemplo, se conservaron 57 000 células. Puede elegirse el número de células a secuenciar. En un ejemplo, las células se dividieron en alícuotas de 25 células, 250 células, 2500 células y 25000 células. Pueden añadirse 300 μl de tampón de lisis (NaF 10 mM, Na3VO41 mM, tampón DOC al 0,5 % y TRITON™ X-100 al 0,5 %) a cada una de las alícuotas celulares y cada una de las alícuotas celulares puede pasarse a través de una aguja de calibre 25 ocho veces.

Ejemplo 5 - Unión del ADNc con código de barras a perlas recubiertas de estreptavidina

Primero, las perlas de Estreptavidina C1 de DYNABEADS® MYONE™ pueden resuspenderse. Pueden añadirse 20 μl de perlas de Estreptavidina C1 de DYNABEADS® MYONE™ resuspendidas (para cada alícuota de células) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml (EPPENDORF®). Las perlas pueden lavarse 3 veces con solución salina tamponada con fosfato Tween 20 1X (PBST) y resuspenderse en PBST 20 jl. Pueden añadirse 900 μl de PBST a la alícuota celular y pueden añadirse 20 μl de perlas de C1 lavadas a la alícuota de células lisadas. Las muestras pueden colocarse en un rodillo suave durante 15 minutos a temperatura ambiente y después lavarse 3 veces con 800 μl de PBST mediante el uso de una rejilla de tubo magnético (EPPENDORF®). Después, las perlas pueden resuspenderse en 100 μl de PBS.

Ejemplo 6 - Tratamiento de las perlas con ARNasa

Un tubo de microcentrífuga (EPPENDORF®) que comprende una muestra puede colocarse contra una rejilla de tubo magnético (EPPENDORF®) durante 2 minutos y después puede aspirarse el líquido. Las perlas pueden resuspenderse en una reacción de ARNasa (3 μl de mezcla de ARNasa (ROCHE™), 1 μl de ARNasa H (NEW ENGLAND BIOLABS®), 5 μl de tampón de ARNasa H 10<x>(NEW ENGLAND BI<o>L<a>BS®) y 41 μl de agua libre de nucleasas). La muestra puede incubarse a 37 °C durante 1 hora, retirarse de 37 °C y colocarse contra una rejilla de tubo magnético (EPPENDORF®) durante 2 minutos. La muestra puede lavarse con 750 μl de agua libre de nucleasas Tween 20 al 0,01 % (H2O-T), sin resuspender las perlas y mantener el tubo dispuesto contra la rejilla del tubo magnético. Después, puede aspirarse el líquido. La muestra puede lavarse con 750 μl de H2O-T sin resuspender las perlas y mientras se mantiene el tubo dispuesto contra la rejilla del tubo magnético. A continuación, el líquido puede aspirarse mientras se mantiene el tubo dispuesto contra la rejilla del tubo magnético. Después, el tubo puede retirarse de la rejilla del tubo magnético y la muestra puede resuspenderse en 40 μl de agua libre de nucleasas.

Ejemplo 7 - Ligación del adaptador 3'

Con referencia a la figura 15, para facilitar la amplificación por PCR, un oligo adaptador de ADN monocatenario (BC_0047) puede ligarse al extremo 3' del ADNc. Para evitar los concatámeros del oligo adaptador, puede incluirse la didesoxicitidina (ddC) en el extremo 3' del oligo adaptador. BC_0047 se generó con un fosfato en el extremo 5' y ddC en el extremo 3'. Varias enzimas son capaces de ligar oligo monocatenario al extremo 3' del ADN monocatenario. En la presente descripción, se usó la T4 ligasa 1 de ARN (NEW ENGLAND BIOLABS®). La ligasa termoestable 5' AppDNA/RNA (NEW ENGLAND BIOLABS®) puede usarse, además, con un oligo adaptador preadenilado.

Específicamente, pueden añadirse 20 μl de las perlas tratadas con ARNasa a un tubo único de PCR. 80 μl de mezcla de ligasa (5 μl de la T4 ligasa 1 de ARN (NEW ENGLAND BIOLABS®), 10 μl de tampón de la T4 ligasa de ARN 10X, 5 μl de oligo BC_0047 a 50 μl de PEG 8000 50 jM al 50 %, y 10 μl de ATP 10 mM) pueden añadirse a los 20 μl de perlas en el tubo de PCR. 50 μl de ligasa mezclada con las perlas pueden transferirse a un nuevo tubo de PCR para evitar que demasiadas perlas se asienten en el fondo de un tubo único y la muestra puede incubarse a 25 °C durante 16 horas.

Ejemplo 8 - Generación de productos de secuenciación compatibles con ILLUMINA®

Las reacciones de ligación de ambos tubos de PCR pueden combinarse en un tubo único de microcentrífuga de 1,7 ml (EPPENDORF®). Pueden añadirse 750 μl de H2O-T a cada muestra. Cada uno de los tubos puede colocarse en una rejilla de tubo magnético (EPPENDORF®) durante 2 minutos, el líquido puede aspirarse y las muestras pueden resuspenderse en 40 μl de agua. Las muestras pueden transferirse a tubos de PCR. Pueden añadirse 60 μl de mezcla de PCR a cada tubo (50 μl de mezcla maestra de ADN polimerasa PHUSION® 2X (THERMO FISHER™ Scientific), 5 μl de BC_0051 (10 jM ) y 5 μl de BC_0062 (10 jM)). Pueden procesarse 10 ciclos de PCR (98 °C durante 3 minutos, repetir 10 veces (98 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 60 segundos) y 72 °C durante 5 minutos). La figura 16 representa el producto de PCR. Después de que el oligo adaptador en 3' (BC_0047) se ha ligado al ADNc con código de barras, el ADNc puede amplificarse mediante el uso de PCR. Como se muestra en la figura 16, se usaron los cebadores BC_0051 y BC_0062.

Las muestras de PCR de la etapa anterior pueden obtenerse y las perlas magnéticas pueden desplazarse al fondo de cada tubo con un imán. 90 μl de reacción de PCR pueden transferirse a un nuevo tubo de 1,7 ml sin transferir ninguna de las perlas magnéticas. 10 μl de agua libre de nucleasas puede añadirse a cada uno de los tubos de 1,7 ml a un volumen total de 100 jl. 60 μl de perlas AMPURE™ pueden añadirse a los 100 μl de reacción de PCR (SPRI 0,6X) y unirse durante 5 minutos. Los tubos pueden colocarse contra un imán durante 2 minutos y las muestras pueden lavarse con 200 μl de etanol al 70 % (espera de 30 segundos) sin resuspender las perlas. Las muestras pueden lavarse de nuevo con 200 μl de etanol al 70 % (espera de 30 segundos) sin resuspender las perlas y después, las muestras pueden secarse al aire durante 5-10 minutos hasta que el etanol se haya evaporado.

Cada una de las muestras puede resuspenderse en 40 μl de agua libre de nucleasas. Los tubos pueden colocarse contra una rejilla magnética durante 2 minutos. Mientras los tubos de microcentrífuga (EPPENDORF®) aún se disponen contra la rejilla magnética, pueden transferirse 38 μl de solución a un nuevo tubo de 1,7 ml, sin transferir perlas. Pueden añadirse 62 μl de agua libre de nucleasas a las muestras a un volumen total de 100 jl. Después, pueden añadirse 60 μl de perlas AMPURE™ a 100 μl de la reacción de PCR (SPRI 0,6X) y unirse durante 5 minutos. Los tubos pueden colocarse contra un imán durante 2 minutos y después las muestras pueden lavarse con 200 μl de etanol al 70 % (espera de 30 segundos) sin resuspender las perlas. Las muestras pueden lavarse de nuevo con 200 μl de etanol al 70 % (espera de 30 segundos) sin resuspender las perlas y después las muestras pueden secarse al aire durante 5-10 minutos hasta que el etanol se haya evaporado.

Las muestras pueden resuspenderse en 40 μl de agua libre de nucleasas y cada tubo puede colocarse contra una rejilla magnética durante 2 minutos. Mientras el tubo aún está dispuesto contra la rejilla magnética, pueden añadirse 38 μl de solución a un nuevo tubo de 1,7 ml, sin transferir ninguna perla. Pueden añadirse 20 μl de la elución de 38 μl a un tubo de PCR óptico. Además, puede añadirse una mezcla de PCR al tubo (25 μl de mezcla maestra de ADN polimerasa PHUSION® (THERMO FISHER™ Scientific), 2,5 μl de BC_0027 (10 jM ), 2,5 μl de BC_0063 (10 jM ) y 2,5 μl de EVAGREEN® 20X (BIOTIUM™)). Después de la PCR representada en la figura 16, las secuencias del adaptador ILLUMINA® completas pueden introducirse a través de otro ciclo de PCR. Como se representa en la figura 17, BC_0027 incluye la secuencia de unión a la celda de flujo y el sitio de unión para el cebador de lectura 1 TRUSEQ™. BC_0063 incluye la secuencia de unión a la celda de flujo y la lectura 2 de TruSeq multiplex y el índice de secuencia de unión. Además, hay una región para el índice de muestra, que es GATCTG en este ejemplo.

Las muestras anteriores pueden procesarse en una máquina de qPCR con las siguientes condiciones de ciclado: 1) 98 °C durante 3 minutos, 2) 98 °C durante 10 segundos, 3) 65 °C durante 15 segundos, 4) 72 °C durante 60 segundos y 5) repetir las etapas 2-4 (por ejemplo, 10-40 veces, en dependencia de cuándo la fluorescencia deja de aumentar exponencialmente). El tubo puede transferirse a un termociclador ajustado a 72 °C durante 5 minutos. La reacción de qPCR puede correrse en un gel de agarosa al 1,5%durante 40 minutos y puede eliminarse una banda de 450-550 pb y extraerse el gel (kit de extracción de gel QIAQUICK®). Los productos pueden secuenciarse en un MISEQ™ ILLUMINA® mediante el uso de secuenciación de extremos pareados. Los cebadores de secuenciación pueden ser los cebadores estándar TRUSEQ™ multiplex. La lectura 1 puede secuenciar la secuencia de ADNc, mientras que la lectura 2 puede cubrir el identificador molecular único así como también las 3 secuencias de código de barras (8 nucleótidos cada una). La lectura de índices 1 puede usarse para secuenciar códigos de barras de muestras, de manera que múltiples muestras pueden secuenciarse juntas.

Ejemplo 9 - Análisis de datos

Las lecturas de secuenciación se agruparon por códigos de barras celulares (tres códigos de barras de ocho nucleótidos cada uno, 96*96*96 = 884 736 combinaciones totales). Cada combinación de códigos de barras debe corresponder al ADNc de una célula individual. Solo se conservaron las lecturas con códigos de barras válidos. Las lecturas de secuenciación con cada combinación de códigos de barras se alinearon tanto con el genoma humano como con el genoma de ratón. Se desecharon las lecturas que se alinean con ambos genomas. Se contaron múltiples lecturas con el mismo identificador molecular único como una única lectura. Se asumió que las lecturas con identificadores moleculares únicos con dos o menos errores de apareamiento se generan por errores de secuenciación y se contaron como una única lectura. Para cada combinación de códigos de barras única, se representó el número de lecturas que se alineaban con el genoma humano (eje x) y el genoma de ratón (eje y)(véasela figura 18). Como cada célula es de ratón o humana, idealmente debe incluir solo un tipo de ARN. Por lo tanto, un gráfico ideal tendría cada punto a lo largo del eje x o y. El hecho de que la mayoría de los puntos en el gráfico de la figura 18 estén cerca de un eje indica que el método es viable.

Cada punto del gráfico corresponde al ADNc con la misma combinación de códigos de barras y debe representar el ADNc de una célula individual. Para cada punto, el número de lecturas que se mapean de manera única al genoma del ratón se grafican en el eje y, mientras que el número de lecturas que se mapean de manera única al genoma humano se grafican en el eje x. Si los ADNc con una combinación específica de códigos de barras provienen de una célula individual, todo el ADNc con la combinación específica de códigos de barras debe mapearse completamente al genoma humano o completamente al genoma de ratón. Como se indicó anteriormente, el hecho de que la mayoría de las combinaciones de códigos de barras se relacionen cerca del eje x (células humanas) o del eje y (células de ratón) indica que el método puede producir de hecho datos de secuenciación de ARN de células individuales.

Ejemplo 10 - Métodos de marcaje de manera única de moléculas de una pluralidad de células

Para el siguiente protocolo descrito, el tiempo experimental proyectado es de dos (2) días. Como se indica más abajo, el inhibidor de ARNasa puede añadirse a los tampones. En consecuencia, cuando cualquier tampón incluye el término “+RI”, esto indica que el inhibidor de la ARNasa ENZYMATICS® debe añadirse a una concentración final de 0,1 U/pl. Las etapas de centrifugación pueden realizarse con un rotor de cubeta giratorio. El uso de una centrífuga de ángulo fijo puede conducir a más pérdida celular. En dependencia del tipo de tejido, las velocidades de centrifugación pueden necesitar cambiarse para optimizar la retención celular (por ejemplo, células más pequeñas = velocidades más altas).

Para la generación de placas de ADN al que se le asigna código de barras puede ser necesario lo siguiente: i) tres placas de 96 pocillos de IDT®, cebadores de código de barras de transcripción inversa, las placas de oligo de solución de trabajo de ADN para el ciclo de ligación 1 y el ciclo de ligación 2 (100 pM); ii) dos oligos enlazadores, BC_0215 y BC_0060 (Nota: se supone que estos están en una concentración de trabajo de 1 mM, de esta manera, corregir el volumen si se va a usar otra concentración de trabajo (por ejemplo, solución de trabajo100 pM)); y iii) Seis placas de PCR de 96 pocillos (por ejemplo, tres (3) placas de solución de trabajo que durarán al menos 10 experimentos, y tres (3) placas para el primer experimento). Tenga en cuenta que esto puede generar 100 pl de ADN con códigos de barras para cada pocillo. Cada experimento generalmente requiere solo 4 pl/pocillo de la solución de cebador de transcripción inversa que puede durar 25 experimentos. Cada experimento generalmente requiere solo 10 pl/pocillo de las soluciones de código de barras/enlazadores, por lo que estas placas pueden durar un total de 10 experimentos.

Cebadores con código de barras de transcripción inversa del ciclo 1 (concentraciones finales del hexámero aleatorio de 12,5 pM y cebadores 15 dT de 12,5 pM en cada uno de los 48 pocillos): 1) mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 12,5 pl de las hileras A-D en los cebadores de código de barras de transcripción inversa IDT® a las hileras A -D de la placa de PCR de 96 pocillos de la solución de trabajo BC; 2) mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 12,5 pl de las hileras E-H en los cebadores de código de barras de transcripción inversa IDT® a las hileras A-D de la placa de PCR de 96 pocillos de la solución de trabajo BC (mediante la mezcla de poli dT con el cebador de hexámero aleatorio aquí); 3) añadir 75 pl de agua a las hileras A-D de la placa de PCR de 96 pocillos de la solución de trabajo BC.

Ciclo 2 Ciclo de ligación (concentraciones finales de códigos de barras de 12 pM, enlazador-BC_0215 11 pM): 1) mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 12 pl de códigos de barras del ciclo 2 de IDT® a la placa de PCR de 96 pocillos de solución de trabajo R1; 2) añadir 138,6 pl de BC_0215 (1 mM) a 10,9494 ml de agua en un cuenco (BC_0215_dil); y 3) mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 88 pl de BC_0215_dil a cada pocillo de la placa de PCR de 96 pocillos de solución de trabajo R2.

Ciclo de ligación 3 (concentraciones finales de códigos de barras de 14 j M, enlazador-BC_0060 13 j M): 1) mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 14 μl de códigos de barras del ciclo 3 a la placa de PCR de 96 pocilios de solución de trabajo R3; 2) añadir 163,8 μl de BC_0060 (1 mM) a 10,6722 ml de agua en un cuenco (BC_0060_dil); y 3) mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 86 μl de BC_0060 a cada placa de PCR de 96 pocillos de solución de trabajo R3.

Para cada placa de ligación (R2 y R3, sin incluir los códigos de barras de transcripción inversa), hibride los oligos de código de barras y enlazadores con el siguiente protocolo de termociclado: 1) calentar a 95 °C durante dos (2) minutos y 2) reducir a 20 °C con una velocidad de 0,1 °C/s; y 3) 4 °C.

Dividir en alícuotas de 10 μl de cada placa con solución de trabajo de código de barras/enlazador en tres (3) nuevas placas de PCR de 96 pocillos. Estas son las placas que deben usarse para la adjudicación de códigos de barras de ADN en las etapas de ligación y división-agrupamiento en el protocolo.

I. Extracción de núcleos (opcional): 1) prepare los siguientes elementos, a) mantenga el homogeneizador Dounce a 4 °C hasta su uso, b) 15 ml de PBS 1X SUPERASE-IN™ 37,5 inhibidor de ARNasa ENZYMATICS® 19 μl (conservado en hielo) y c) centrífuga preenfriada a 4 °C.

2) Preparar el tampón NIM1 (Tabla 1):

Tabla 1: Tam ón NIM1

3) Preparar el tampón de homogeneización (Tabla 2):

Tabla 2: Tam ón de homo eneización

4) Homogeneizador Dounce: a) añadir muestra de tejido/células al homogeneizador Dounce; si son células, resuspender en 700 μl de tampón de homogeneización; b) añadir tampón de homogeneización a -700 jl; c) realizar 5 golpes del pistón suelto; d) realizar 10-15 del pistón ajustado; e) añadir tampón de homogeneización hasta 1 ml; y f) comprobar la lisis celular con 5 μl de azul de tripán y 5 μl de células en el hemocitómetro para ver si se han liberado los núcleos.

5) Filtrar el homogenado con un filtro de 40 jm en tubos EPPENDORF™ de 5 ml (o tubos FALCON™ de 15 ml). Inclinar el filtro 45° mientras que el filtrado sobre el tubo puede garantizar que el lisado pase a través de él según lo previsto. Nota: este proceso de filtrado es diferente de los procesos de filtrado más abajo.

6) Centrifugar durante 4 minutos a 600 * g (4 °C) y retire el sobrenadante (puede dejar aproximadamente 20 μl para evitar aspirar el sedimento).7) Resuspender en 1 ml de PBS 1X RI. 8) Añadir 10 μl de b Sa .9) Centrifugar a 600 * g durante 4 minutos. 10) Resuspender en 200 μl de PBS 1X RI.

11) Tomar 50 μl de las células resuspendidas de la etapa 4 y añadir 150 μl de PBS 1X RI. Contar la muestra en el hemocitómetro y/o el citómetro de flujo. El volumen de células resuspendidas de la etapa 4 puede cambiarse en función de las consideraciones del usuario.12) Pasar las células a través de un filtro de 40 jm a un tubo FALCON™ de 15 ml nuevo y colóquelo en hielo(véasela nota siguiente en la etapa 4 de II. Fijación y permeabilización).13) Resuspender la cantidad deseada de núcleos (típicamente 2M) en 1 ml de PBS 1X RI y continúe con la etapa 5 en el siguiente protocolo de fijación y permeabilización.

II. Fijación y permeabilización: 1) preparar los siguientes tampones (calculados para dos experimentos): a) una solución de formalina al 1,33 % (360 μl de solución de formaldehído al 37 % (SIGMA®) 9,66 ml de PBS) y almacenar a 4 °C; b) 6 ml de PBS 1X RI (15 μl de SUPERASE-IN™ y 7,5 μl de inhibidor de ARNasa ENZYMATICS®); c) 2 ml de PBS 0,5X RI (5 μl de SUPERASE-IN™ y 2,5 μl de inhibidor de ARNasa ENZYMATICS®); d) 500 μl de TRITON X-100™ al 5 % RI (2 μl de SUPERASE-IN™); e) 500 μl de Tris 100 mM pH 8,0 2 μl de SUPERASE-IN™; y f) ajustar la centrífuga a 4 °C.

2) Sedimentar las células mediante centrifugación a 500 * g durante 3 minutos a 4 °C (algunas células pueden requerir una centrifugación más rápida). 3) Resuspender las células en 1 ml de PBS frío RI. Mantener las células en hielo entre estas etapas. 4) Pasar las células a través de un filtro de 40 jm en un tubo FALCON™ de 15 ml nuevo y colóquelo en hielo. Nota: no es probable que la resuspensión celular pase pasivamente a través del filtro, lo que puede causar pérdida celular. En su lugar, con una pipeta de 1 ml llena con la resuspensión, presione el extremo de la punta directamente sobre el filtro y empuje activamente el líquido a través de él. El movimiento debería tardar aproximadamente un (1) segundo. 5) Añadir 3 ml de formaldehído frío al 1,33 % (concentración final del formaldehído al 1 %). Fijar las células en hielo durante 10 minutos. 6) Añadir 160 μl de TRI<t>O<n>X-100™ al 5 % RI a las células fijas y mezclar mediante pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 1 ml. Permeabilizar las células durante 3 minutos en hielo. 7) Centrifugar las células a 500 * g durante 3 minutos a 4 °C. 8) Aspirar con cuidado y resuspender las células en 500 μl de PBS RI frío. 9) Añadir 500 μl de Tris-HCl 100 mM frío, pH 8,0. 10) Añadir 20 μl de TRITON X-100™ al 5 %. 11) Centrifugar las células a 500 * g durante 3 minutos a 4 °C. 12) Aspirar y resuspender las células en 300 μl de PBS 0,5X RI frío.

13) Haga pasar las células a través de un filtro de 40 jM en un nuevo tubo de 1,7 ml(véasela nota anterior en la etapa 4 de II. Fijación y permeabilización). 14) Contar las células mediante el uso de un hemocitómetro o un citómetro de flujo y diluir la suspensión celular a 1 000 000 de células/ml. Mientras se cuentan las células, mantenga la suspensión celular en hielo. Nota: esta etapa determinará cuántas células entran en los ciclos de divisiónagrupamiento. Será posible secuenciar solo un subconjunto de las células que entran en los ciclos de divisiónagrupamiento (puede hacerse durante la generación de la subgenoteca en la etapa de lisis). El número total de combinaciones de códigos de barras que se utilizarán debe calcularse para determinar el número máximo de células que pueden secuenciarse con mínimas colisiones de códigos de barras. Sin estar ligado a ninguna teoría en particular, el número de células que se procesarán no debe exceder más del 5 % de las combinaciones totales de códigos de barras. Generalmente, aquí puede usarse una dilución entre 500k y 1M de células/ml (igual a 4-8k células que van a cada pocillo para ciclos de adjudicación de códigos de barras con transcripción inversa).

III. Transcripción inversa: 1) formar alícuotas de 4 μl de la placa con solución de trabajo con los códigos de barras RT en las cuatro (4) hileras superiores (48 pocillos) de una nueva placa de 96 pocillos. Cubrir esta placa con un sello adhesivo hasta que esté lista para usar.

2) Crear la siguiente mezcla de transcripción inversa (RT) en hielo (Tabla 3):

Tabla 3: Mezcla de RT

3) Añadir 8 μl de la mezcla de RT a cada uno de los 48 pocillos superiores. Cada pocillo debe contener ahora un volumen de 12 jl. 4) Añadir 8 μl de células en PBS 0,5X RI a cada uno de los 48 pocillos superiores. Cada pocillo debe contener ahora un volumen de 20 μl . 5) Añadir la placa a un termociclador con el siguiente protocolo: a) 50 °C durante 10 minutos; b) ciclo tres (3) veces, i) 8 °C durante 12 segundos, ii) 15 °C durante 45 segundos, iii) 20 °C durante 45 segundos, y iv) 30 °C durante 30 segundos, v) 42 °C durante 2 minutos, vi) 50 °C durante 3 minutos; c) 50 °C durante 5 minutos; y d) mantener a 4 °C.

6) Colocar la placa de RT en hielo. 7) Preparar 2 ml de tampón NEB 1X 3,1 con 20 μl de inhibidor de ARNasa ENZYMATICS®. 8) Transferir cada reacción de RT a un tubo fA lCON™ de 15 ml (también en hielo). 9) Añadir 9,6 μl de TRITON X-100™ al 10 % para obtener una concentración final de 0,1 %. 10) Centrifugar la reacción de RT agrupada durante 3 minutos a 500 * g. 11) Aspirar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de tampón NEB 1X 3,1 20 μl de inhibidor de ARNasa ENZYMATICS®.

IV. Adjudicación de códigos de barras con ligación: 1) preparar la siguiente mezcla maestra de ligación en hielo (Tabla 4):

T l 4: M z l m r li i n

Nota: la concentración final tiene en cuenta el volumen añadido de códigos de barras de ADN. La concentración de esta mezcla no es la concentración final en el momento de la adjudicación de códigos de barras.

2) Añadir los 2 ml de células en el tampón NEB 3.1 a la mezcla de ligación. La mezcla debe tener ahora un volumen de 4,04 ml. 3) Añadir la mezcla en un cuenco. 4) Con una pipeta multicanal, añadir 40 μl de mezcla de ligación (con células) en cada pocillo de la placa de código de barras de AD<n>ciclo 1. 5) Cubrir la placa de código de barras de ADN del ciclo 1 con un sello de placa adhesiva e incubar durante 30 minutos a 37 °C con rotación suave (50 rpm). 6) Preparar la solución de bloqueo del ciclo 1 y añadir a un nuevo cuenco (Tabla 5).

Tabla 5: Solución de blo ueo del Ciclo 1

7) Retirar la placa de adjudicación de códigos de barras de ADN del ciclo 1 de la incubadora y retirar la cubierta. 8) Con una pipeta multicanal, añadir 10 μl de la solución de bloqueo del ciclo 1 a cada uno de los 96 pocillos de la placa de adjudicación de códigos de barras de ADN del ciclo 1. 9) Cubrir la placa de código de barras de ADN del ciclo 1 con un sello de placa adhesiva e incubar durante 30 minutos a 37 °C con rotación suave (50 rpm). 10) Retirar la placa de adjudicación de códigos de barras de ADN del ciclo 1 de la incubadora, retirar la cubierta y mezclar todas las células en un nuevo cuenco. 11) Pasar todas las células de este cuenco a través de un filtro de 40 jm hacia otro cuenco(véasenota anterior en la etapa 4 de Fijación y Permeabilización). 12) Añadir 100 μl de T4 ligasa de ADN al cuenco y mezclar mediante pipeteado aproximadamente 20 veces. 13) Con una pipeta multicanal, añadir 50 μl de solución de células/ligasa en cada pocillo de la placa de código de barras de ADN del ciclo 2. 14) Cubrir la placa de código de barras de ADN del ciclo 2 con un sello de placa adhesiva e incubar durante 30 minutos a 37 °C con rotación suave (50 rpm).

15) Preparar la solución de bloqueo del ciclo 2 y añadir a un nuevo cuenco (Tabla 6).

Tabla 6: Solución de blo ueo del ciclo 2

16) Retirar la placa de adjudicación de códigos de barras de ADN del ciclo 2 de la incubadora y retirar la cubierta. 17) Mediante el uso de una pipeta multicanal, añadir 20 μl de la solución de bloqueo y terminación del ciclo 2 a cada uno de los 96 pocillos en la placa de adjudicación de códigos de barras de ADN del ciclo 2. 18) Mezclar todas las células en un nuevo cuenco (sin incubación para la etapa de bloqueo final). 19) Pasar todas las células de este cuenco a través de un filtro de 40 jm hacia un tubo FALCON™ de 15 ml(véasela nota anterior en la etapa 4 de Fijación y Permeabilización). 19) Contar las células en un citómetro de flujo. Asegúrese de que las células estén bien mezcladas antes de dividir en alícuotas la muestra para el recuento.

V. Lisis: 1) preparar el tampón de lisis 2X (Tabla 7).

Tabla 7: Tam ón de lisis 2X

2) Si aparece precipitado blanco, calentar a 37 °C hasta que el precipitado vuelva a estar en solución (aproximadamente 10-15 minutos).

3) Preparar el siguiente tampón de lavado (Tabla 8).

Tabla 8: Tam ón de lavado

4) Añadir 70 μl de TRITON X-100™ al 10 % a las células (concentración final -0,1 %). 5) Centrifugar durante 5 minutos a 1000 x g en un tubo de 15 ml. Nota: el sedimento para las etapas siguientes puede ser muy pequeño y puede no ser visible. 6) Aspirar el sobrenadante, dejar aproximadamente 30 μl para evitar retirar el sedimento, a) si es posible, retire tanto sobrenadante como sea posible con una pipeta de 20 jl. 7) Resuspender con 4 ml de tampón de lavado.

8) Centrifugar durante 5 minutos a 1000 x g. 9) Aspirar el sobrenadante y resuspender en 50 μl de PBS 1X RI.

10) Diluir 5 μl en 195 μl de PBS 1X y contar mediante citometría de flujo. O tomar 5 μl en 5 μl de PBS 1X y contar en el hemocitómetro (puede ser difícil distinguir los restos de las células). 11) Determinar cuántas subgenotecas se van a generar (núm. de subgenotecas = núm. de tubos necesarios) y cuántas células se deben tener para cada una de estas subgenotecas. 12) Dividir en alícuotas el número deseado de células para cada subgenoteca en nuevos tubos de 1,7 ml. Añadir PBS 1X a cada tubo hasta un volumen final de 50 jl.

13) Añadir 50 μl de tampón de lisis 2X a cada tubo. 14) Añadir 10 μl de Proteinasa K (20 mg/ml) a cada lisado. 15) Incubar a 55 °C durante 2 horas con agitación a 200 rpm. 16) Punto de parada (opcional): congelar lisado(s) a -80 °C.

VI. Preparar los tampones. En primer lugar, prepare las siguientes soluciones de trabajo (Tablas 9-11).

Tabla 9: Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)

I PMSF 100 mM I

Tabla 10: B&W 2X

Tabla 11: B&W-T 1X

A continuación, preparar las siguientes alícuotas más pequeñas (con adición de inhibidor de ARNasa; Tablas 12-14):

Tabla 12: B&W-T 1X RI

Tabla 13: B&W 2X RI

Tabla 14: Tris-T RI

VII. Purificación de ADNc. Nota: las etapas de agitación se han realizado en un agitador de vórtice con un soporte de tubo de espuma de 1,7 ml en un ajuste bajo (2/10).

Lavar las perlas MYONE™ C1 DYNABEADS®: 1) para cada lisado que se va a procesar, añadir 44 μl de MYONE™ C1 DYNABEADS® a un tubo de 1,5 ml (por ejemplo, 1 lisado = 44 jl, 2 lisados = 88 jl, 3 lisados = 132 jl, etcétera).2) Añadir 800 μl de tampón B&W-T 1X.3) Colocar la muestra contra una rejilla magnética y esperar hasta que el líquido se aclare (1-2 minutos).4) Retirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 800 μl de tampón B&W-T 1X.5) Repetir las etapas 3-4 dos veces más para un total de 3 lavados.6) Colocar la muestra contra una rejilla magnética y esperar a que el líquido se aclare.7) Resuspender las perlas en 100 μl (por muestra) de tampón B&W 2X RI.

Unión de la muestra a estreptavidina: 1) añadir 5 μl de PMSF 100 jM a cada muestra y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos. 2) Añadir 100 μl de perlas de C1 resuspendidas a cada tubo.3) Para unir el ADNc a las perlas de C1, agitarlas a temperatura ambiente durante 60 minutos.4) Colocar la muestra contra una rejilla magnética y esperar hasta que el líquido se aclare (1-2 minutos).5) Retirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 250 μl de B&W 1X.

6) Agitar las perlas durante 5 minutos a temperatura ambiente.7) Repetir las etapas 5 y 6.8) Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 250 μl de Tris+T 10 mM. 9) Agitar las perlas durante 5 minutos a temperatura ambiente.10) Dejar las perlas en la solución de lavado final en hielo.

Cambio de molde. Preparar la siguiente mezcla en dependencia del número de muestras (tabla 15).

Tabla 15: Mezclar

1) Colocar la muestra contra una rejilla magnética y esperar a que el líquido se aclare. 2) Con la muestra aún en la rejilla magnética, retirar el sobrenadante y lavar con 250 μl de agua (no resuspender las perlas esta vez). 3) Resuspender la muestra en 200 μl de la mezcla de cambio de molde. 4) Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación o enrollado. 5) Incubar a 42 °C durante 90 minutos con agitación o rodamiento (la incubadora se ha agitado a 100 rpm).

6) Posible punto de parada. Si se detiene, realice lo siguiente (o salte de cualquier otra manera a la siguiente sección): a) colocar la muestra contra una rejilla magnética y espere a que el líquido se aclare y b) resuspender en 250 μl de Tris-T.

VIII. Amplificación del ADNc. Preparar la siguiente mezcla de PCR en dependencia del número de muestras (tabla 16).

Tabla 16: Mezcla de PCR

1) Colocar la muestra contra una rejilla magnética y esperar a que el líquido se aclare. 2) Con la muestra contra la magnética lavar con 250 μl de agua libre de nucleasas (no resuspender). 3) Resuspender la muestra con una mezcla de PCR de 220 μl y dividirla por igual en cuatro (4) tubos de PCR diferentes.

4) Ejecutar el siguiente programa de termociclado: a) 95 °C, 3 minutos; b) 98 °C, 20 segundos; c) 65 °C, 45 segundos; d) 72 °C, 3 minutos; e) repetir (b-d) cuatro veces (5 ciclos totales); y f) 4 °C, mantener.

5) Combinar las cuatro (4) reacciones en un solo tubo de 1,7 ml. Asegúrese de resuspender las perlas que puedan estar adheridas a la parte inferior o a los lados de los tubos de PCR antes de combinar las reacciones. 6) Colocar la muestra contra una rejilla magnética y esperar a que el líquido se aclare. 7) Transferir 200 μl de sobrenadante a cuatro (4) tubos de qPCR de grado óptico (50 μl en cada tubo). 8) Añadir 2,5 μl de EVAGREEN® 20X a cada tubo de qPCR.

9) Ejecutar el siguiente programa de qPCR (asegúrese de retirar las muestras, una vez que la señal comience a salir de la fase exponencial para evitar la sobreamplificación): a) 95 °C, 3 minutos; b) 98 °C, 20 segundos; c) 67 °C, 20 segundos; d) 72 °C, 3 minutos; e) repetir (b-d) hasta que la señal se estabilice fuera de la amplificación exponencial; f) 72 °C, 5 minutos; y g) 4 °C, mantener.

10) Opcional: correr un gel de agarosa o bioanalizar la qPCR resultante. Es probable que exista una combinación de ADNc y dímero presente.

Selección del tamaño mediante SPRI (0,8X). 1) Combinar las reacciones de qPCR en un solo tubo.2) Extraer 180 μl de la reacción de qPCR agrupada y colocarlos en un nuevo tubo de 1,7 ml.3) Añadir 144 μl de perlas Pure Beads KAPA™ al tubo y centrifugar con vórtice brevemente para mezclar. Espere cinco (5) minutos para unir el ADN. 4) Coloque el tubo contra la rejilla magnética y espere hasta que el líquido se aclare. 5) Retirar el sobrenadante. 6) Con los tubos aún en la rejilla magnética, lavar con 750 μl de etanol al 85 %. No resuspender las perlas. 7) Repetir la etapa 6.

8) Retirar el etanol y secar al aire las perlas (~5 minutos). No dejar que las perlas se sequen demasiado ni se agrieten.

9) Resuspender las perlas de cada tubo en 20 μl de agua. Una vez que las perlas se resuspenden completamente en el agua, incubar el tubo a 37 °C durante 10 minutos. 10) Unir los tubos contra la rejilla magnética y esperar a que el líquido se aclare. 11) Transferir 18,5 μl de eluyente a un nuevo tubo de PCR de grado óptico. 12) Correr una traza del bioanalizador en 10 μl del eluyente.

13) Si no hay dímero después de seleccionar por tamaño, vaya directamente a la sección “Etiquetado y generación de amplicones ILLUMINA®” más abajo. Si el dímero aún está presente, continúe con la etapa 14 para realizar una segunda etapa de amplificación y selección por tamaño. Esto puede ser necesario para células con bajo contenido de ARN, pero no debería ser necesario para células con alto contenido de ARN (por ejemplo, HeLa-S3, NIH/3T3, etc.).

Segunda qPCR (opcional). 14) Preparar la siguiente mezcla de qPCR en dependencia del número de muestras (Tabla 17).

Tabla 17: mezcla de PCR

15) Añadir 31,5 μl de la mezcla maestra de qPCR a cada tubo de PCR óptico con la muestra de PCR anterior. Mezclar suavemente mediante golpes leves y centrifugar brevemente los tubos en una centrífuga de mesa para eliminar las burbujas de aire. 16) Ejecutar el siguiente programa de qPCR (asegúrese de retirar las muestras, una vez que la señal comience a salir de la fase exponencial para evitar la sobreamplificación): a) 95 °C, 3 minutos; b) 98 °C, 20 segundos; c) 67 °C, 20 segundos; d) 72 °C, 3 minutos; e) repetir (b-d) hasta que la señal se estabilice fuera de la amplificación exponencial; f) 72 °C, 5 minutos; y g) 4 °C, mantener.

17) Correr un gel de agarosa o bioanalizar la qPCR resultante. Aunque puede aún haber dímero, el ADNc amplificado debe ser claramente visible entre 500 pb y 2500 pb(véasela figura 19, lado izquierdo para la distribución de tamaño esperada).

Segunda selección por tamaño mediante SPRI (0,8X). 18) Combinar las reacciones de qPCR en un solo tubo.19) Extraer 40 μl de la reacción de qPCR y colocarlos en un nuevo tubo de 1,7 ml.20) Añadir 32 μl de perlas Pure Beads KAPA™ a cada tubo y agitar con vórtice brevemente para mezclar. Esperar 5 minutos para unir el ADN.

21) Colocar los tubos contra la rejilla magnética y esperar hasta que el líquido se aclare.22) Retirar el sobrenadante.23) Con los tubos aún en la rejilla magnética, lavar con 750 μl de etanol al 85 %.24) Repetir la etapa 5.25) Retirar el etanol y secar al aire las perlas (~5 minutos). No dejar que las perlas se sequen demasiado ni se agrieten. 26) Resuspender las perlas de cada tubo en 20 μl de agua y esperar 5 minutos. 27) Unir los tubos contra la rejilla magnética y esperar a que el líquido se aclare.28) Transferir 18,5 μl de eluyente a un tubo de 1,7 ml. 29) Correr un gel de agarosa o bioanalizar la qPCR resultante. En este punto, casi no debería haber dímero. Si queda dímero, realice otro ciclo de qPCR seguida de otra selección por tamaño mediante SPRI 0,8X.

IX. Etiquetado y generación de amplicones ILLUMINA®. 1) Determinar el cúbit del ADNc amplificado y diluir a 0,12 ng/jl.2) Precalentar un termociclador a 55 °C. 3) Para cada muestra, combinar 600 pg de ADNc purificado con H2O en un volumen total de 5 jl.4 ) A cada tubo, añadir 10 μl de tampón Nextera TD y 5 μl de enzima de segmento etiquetado de Amplicón (el volumen total de la reacción ahora es 20 jl). Mezclar mediante pipeta aproximadamente 5 veces y darle la vuelta. 5) Incubar a 55 °C durante 5 minutos. 6) Añadir 5 μl de tampón de neutralización. Mezclar mediante pipeta aproximadamente 5 veces y darle la vuelta (las burbujas son normales).7)Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

8) Añadir a cada tubo de PCR en el siguiente orden: i) 15 μl de mezcla de PCR Nextera; ii). 8 μl de H2O; iii) 1 μl de 10 |jM (cebador indexado N7, uno de BC_0076-BC_0083); y iv) 1 μl de 10 jiM de oligo N501 de Nextera (BC_0118). 9) Ejecutar el siguiente programa de termociclado: i) 95 °C, 30 segundos; ii) 12 ciclos de: a) 95 °C, 10 segundos; b) 55 °C, 30 segundos; y c) 72 °C, 30 segundos; y iii) después, 72 °C, 5 minutos y 4 °C mantener.

10) Transferir 40 μl de la reacción de 50 μl a un tubo de 1,7 ml. 11) Añadir 28 μl de Pure Beads KAPA™ para realizar una limpieza 0,7X. Eluir en 20 jl. 12) Bioanalizar la muestra resultante y determinar el cúbit antes de secuenciar(véasela figura 19, lado derecho, para la distribución de tamaño esperada).

X. Secuenciación de ILLUMINA®. 1) Usar una corrida de secuenciación de extremos apareados con un kit de 150 pb.2) Ajustar la lectura1 a 66 nt (secuencia de transcripto). 3) Ajustar la lectura2 a 94 nt (códigos de barras específicos de células y UMI). 4) Incluir un índice de lectura 1 de 6 nt a índices subgenotecas listos.

Ejemplo 11 - Fijación de células en hielo y mantenimiento de células en hielo para la permeabilización

Los índices moleculares únicos (UMI) son códigos de barras moleculares aleatorios que se añaden a cada transcrito/ADNc antes de la amplificación. Permiten la eliminación computacional de duplicados de PCR, ya que estos duplicados tienen la misma secuencia de UMI. Por lo tanto, cada transcrito original solo se contará una vez, incluso si se secuencian múltiples duplicados de PCR.

La medición de los UMI por célula indica cuántas moléculas de ARN únicas pueden detectarse por célula, lo que está directamente relacionado con la eficiencia con la que las moléculas pueden codificarse con códigos de barras para permitir la detección mediante secuenciación de próxima generación. Esta medida es generalmente el estándar de oro en el campo y la mayoría de los investigadores en el espacio de secuenciación de ARN de células individuales determinan qué tan bien funcionó su experimento en base a cuántos UMI por célula se detectan con una cantidad dada de lecturas de secuenciación sin procesar (por ejemplo, 10 000 UMI por célula con 50 000 lecturas de secuenciación por célula).

Para cada uno de los Ejemplos 11-16, todas las condiciones dentro de la misma tabla(es decir,la Tabla 18, la Tabla 19, la Tabla 20, la Tabla 21 y la Tabla 22) se secuenciaron al mismo nivel de saturación, lo que permite una comparación precisa entre las condiciones. Cada condición tenía el mismo número de lecturas de secuenciación sin procesar en comparación con otra condición, lo que indica que las diferencias en los UMI detectados por célula detectada se debieron al cambio en las condiciones en lugar de la profundidad de la secuenciación.

En otros protocolos(véase,por ejemplo, Rosenberg, AB,y otros,BioRxiv (2017): 105163) la fijación con formaldehído se realiza a temperatura ambiente. En la presente descripción, los experimentos se realizaron y mostraron una mejora sustancial cuando las células se mantuvieron en hielo (por ejemplo, a 4 °C) durante la fijación y permeabilización(véaseTabla 18).

Tabla 18: Tem eratura ambiente frente a 4 °C

Ejemplo 12 - Adición de un inhibidor de proteasas (PMSF) y unión directa a las perlas de estreptavidina

En otros protocolos(véase,por ejemplo, Rosenberg, AB,y otros,BioRxiv (2017): 105163) los ácidos nucleicos se aíslan primero de la solución de lisis con una limpieza con perlas de SPRI antes de unir los ácidos nucleicos deseados (que contienen biotina en 5') a las perlas con estreptavidina. En la presente descripción, se encontró que añadir PMSF a los lisados y después añadir directamente las perlas de estreptavidina (y de esta manera omitir el primer aislamiento por SPRI de los ácidos nucleicos) mejoró el número de moléculas únicas que se detectaron por célula(véaseTabla 19).

T l 1 : l i n r r vi in PM F

Ejemplo 13 - Limpieza por SPRI 0,6X frente a 0,8X

En otros protocolos(véase,por ejemplo, Rosenberg, AB,y otros,BioRxiv (2017): 105163), después de la amplificación del ADNc, se realizó una limpieza por SPRI 0,6X. Después de la amplificación del ADNc, los productos cortos(es decir,productos por debajo de aproximadamente 200 pares de bases) pueden eliminarse mediante el uso de una limpieza por SPRI. En la presente descripción, se encontró que añadir las perlas de SPRI respecto al producto de PCR a una relación de 0,8:1 dio como resultado más moléculas de ARN únicas detectadas por célula que la relación 0,6:1 anterior de SPRI respecto a los productos de PCR(véaseTabla 20).

T l 2 : Lim i z r RI X fr n X

Ejemplo 14 - Concentraciones de hexámero aleatorio y cebadores polidT de RT

En otros protocolos(véase,por ejemplo, Rosenberg, AB,y otros,BioRxiv (2017): 105163) se realiza la transcripción inversa mediante el uso de únicamente cebadores polidT para la transcripción inversa. En la presente descripción, se encontró que al combinar cebadores de hexámero aleatorios con código de barras adjudicados y alterar las concentraciones condujo a un aumento significativo en los UMI/célula. Con referencia a la Tabla 21, Protocolo, la Versión 2.1 usa la condición número 4 (729 UMI/célula). Con referencia continua a la Tabla 21, en la presente descripción, se usó la condición número 10 (1263 UMI/célula). En consecuencia, combinar cebadores de hexámero aleatorio y polidT para la transcripción inversa junto a concentraciones específicas aumenta la eficiencia de la transcripción inversain situ.

Tabla 21

Ejemplo 15 - Uso del primer ciclo de códigos de barras como identificador de muestra

Se usaron cebadores de transcripción inversa con adjudicación de código de barras para generar códigos de barras del primer ciclo en moléculas de ADNc. Después, a estas moléculas de ADNc se les adjudican códigos de barras adicionales mediante la adición de códigos de barras en el extremo 5' con ligación como se describió anteriormente.

Una prueba de concepto se describe en Rosenberg, AB,y otros,(2018) Science, 360(6385);176-182. Como se describió allí, un experimento incluyó cuatro (4) muestras únicas y se realizó un seguimiento esencial de la célula que pertenecía a cada muestra mediante la observación del primer código de barras (incorporado a través de RT). Esta identificación de la muestra puede requerir conocer la secuencia de código de barras correspondiente a cada pocillo y qué muestras se colocaron en cada pocilio. Con esta información, se puede crear una tabla de búsqueda desde las primeras secuencias de código de barras de los ciclos hasta los ID de las muestras.

Las Figuras 20 y 21 muestran una configuración experimental para analizar múltiples muestras. En este caso específico, se realizó un análisis múltiple de 4 muestras en 48 pocillos en una placa de 96 pocillos. Se puede ver cómo esta misma lógica se puede expandir a realizar análisis múltiples hasta 96 muestras en un solo experimento.

Con referencia a la figura 22, se muestra el análisis de los transcriptomas mediante el uso de la incorporación de vecinos estocásticos distribuidos en T (t-SNE) en un experimento con cuatro muestras biológicas diferentes. Cada punto representa el transcriptoma de una célula individual. Mediante el uso de la identidad de los códigos de barras incorporados durante la r T (con cebadores de RT con código de barras), puede determinarse la identidad de la muestra de cada transcriptoma.

Ejemplo 16 - Incorporación de PEG para el cambio de molde de ADN/ARN unido a perlas magnéticas

Un oligo biotinilado unido al ARN transcrito inverso (híbrido de ADNc/ARN) se une a una perla magnética recubierta de estreptavidina. Después, el cambio de molde se realiza en este híbrido de ADNc/ARN de manera que una única secuencia adaptadora común puede incorporarse al extremo 3' del ADNc. La incorporación de hasta un 10 % p/v de PEG (peso molecular 7000-9000) en la reacción de cambio de molde, que incluye un híbrido de ADNc/ARN unido a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, puede mejorar la eficiencia de esta etapa medida mediante detección de transcritos por célula (Tabla 22).

Tabla 22: Cambio de molde con o sin PEG 8000

Ejemplo 18 - Métodos ilustrativos de marcaje único de moléculas de ARN

El panel A de la figura 23 representa el marcaje de transcriptomas con adjudicación de códigos de barras para divisiónagrupamiento. En cada ciclo de división-agrupamiento, las células o núcleos fijos pueden distribuirse aleatoriamente en pocillos y los transcritos pueden marcarse con códigos de barras específicos para los pocillos. Los cebadores de RT con código de barras pueden usarse en el primer ciclo. Los códigos de barras del segundo y tercer ciclos pueden añadirse al ADNc mediante ligación. Puede añadirse un cuarto código de barras a las moléculas de ADNc mediante PCR durante la preparación de la genoteca de secuenciación. El esquema inferior muestra la molécula final de ADNc con código de barras.

El panel B de la figura 23 muestra un experimento de mezcla de especies con una biblioteca preparada a partir de 1758 células completas. Los UBC humanos se extienden horizontalmente a lo largo del eje x, los UBC de ratón se extienden verticalmente a lo largo del eje y, y los UBC de especies mezcladas se disponen entre los UBC humanos y de ratón. La tasa estimada de colisión de códigos de barras es del 0,2 %, mientras que la pureza de la especie es >99 %.

El panel C de la figura 23 muestra los recuentos de UMI de los experimentos de mezcla realizados con células y núcleos frescos y congelados (almacenados a -80 °C durante 2 semanas). Mediana de los recuentos de UMI humano para células frescas: 15365; células congeladas: 15078; núcleos: 12113; núcleos congelados: 13636.

El panel D de la figura 23 muestra que la expresión génica medida mediante los métodos proporcionados aquí está altamente correlacionada entre células congeladas y células procesadas inmediatamente (r de Pearson: 0,987). Las células congeladas y frescas se procesaron en dos experimentos SPLiT-seq diferentes.

Como se ilustra en la figura 24, las células fijas y permeabilizadas pueden dividirse aleatoriamente en pocillos que contienen cada uno cebadores de transcripción inversa con un código de barras específico de pocillos.La transcripción inversa in situconvierte el ARN en ADNc al tiempo que añade el código de barras específico del pocillo. Después, las células pueden agruparse y dividirse de nuevo aleatoriamente en un segundo conjunto de pocillos, cada uno de los cuales contiene un código de barras único específico de cada pocillo. Estos códigos de barras pueden hibridar y ligarse al extremo 5' del cebador de transcripción inversa con código de barras para agregar un segundo ciclo de adjudicación de códigos de barras. Las células pueden agruparse nuevamente y puede realizarse un ciclo de división-ligaciónagrupamiento posterior. Después del último ciclo de ligación, las moléculas de ADNc contienen una combinación de códigos de barras específica de las células, un identificador molecular único y un mango de PCR universal en el extremo 5'. Se puede realizar un cuarto ciclo de adjudicación de códigos de barras durante la etapa de PCR de preparación de genoteca.

Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 23 se usaron en los Ejemplos anteriores. “rG” es una base de ARN y “+G” es una base de ácido nucleico bloqueada.

T l 2: li n l i

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para marcar de manera única las moléculas de ARN dentro de una pluralidad de células, el método comprende:

(a) fijar y permeabilizar una primera pluralidad de células antes de la etapa (b), en donde la primera pluralidad de células se fija y permeabiliza a 4 °C o por debajo de 4 °C;

(b) transcribir inversamente las moléculas de ARN dentro de la primera pluralidad de células para formar moléculas de ADN complementario (ADNc) dentro de la primera pluralidad de células, en donde transcribir inversamente las moléculas de ARN comprende acoplar cebadores a las moléculas de ARN, en donde los cebadores comprenden al menos una de una secuencia poli(T) o una secuencia aleatoria;

(c) dividir la primera pluralidad de células que comprenden moléculas de ADNc en al menos dos alícuotas primarias, las al menos dos alícuotas primarias comprenden una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria;

(d) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a las al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria;

(e) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas;

(f) combinar las al menos dos alícuotas primarias;

(g) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias comprenden una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (h) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a las al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; (i) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas;

(j) combinar las alícuotas finales;

(k) lisar la primera pluralidad de células para liberar las moléculas de ADNc desde dentro de la primera pluralidad de células para formar un lisado; y

(l) añadir un inhibidor de proteasas y un agente aglutinante al lisado de manera que las moléculas de ADNc se unan al agente aglutinante.

2. El método de la reivindicación 1, en donde antes de la etapa (k), el método comprende, además dividir las alícuotas finales combinadas en al menos dos alícuotas finales, las al menos dos alícuotas finales comprenden una primera alícuota final y una segunda alícuota final.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el inhibidor de proteasa es fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) o clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF).

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende, además:

(m) llevar a cabo un cambio de molde de las moléculas de ADNc unidas al agente aglutinante;

(n) amplificar las moléculas de ADNc para formar una solución de moléculas de ADNc amplificadas; e (o) introducir una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) a la solución de moléculas de ADNc amplificadas, en donde la relación de la solución de perlas de SPRI respecto a la solución de moléculas de ADNc amplificadas está entre 0,9:1 y 0,7:1.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde se añade una secuencia adaptadora común al extremo 3' de las moléculas de ADNc liberadas mediante el cambio de molde.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde los cebadores de la etapa (b) comprenden además un primer código de barras específico; el método comprende además:

(p) transcribir inversamente moléculas de ARN dentro de una segunda pluralidad de células para formar moléculas de ADNc dentro de la segunda pluralidad de células, en donde la transcripción inversa de las moléculas de ARN comprende acoplar cebadores específicos a las moléculas de ARN, en donde los cebadores comprenden un segundo código de barras específico y al menos una de una secuencia poli(T) o una secuencia aleatoria, en donde el primer código de barras específico es diferente del segundo código de barras específico de manera que las moléculas de ADNc de la primera pluralidad de células pueden identificarse en comparación con las moléculas de ADNc de la segunda pluralidad de células;

(q) dividir la segunda pluralidad de células que comprenden moléculas de ADNc en al menos dos alícuotas primarias, las al menos dos alícuotas primarias comprenden una primera alícuota primaria y una segunda alícuota primaria;

(r) proporcionar etiquetas de ácido nucleico primarias a las al menos dos alícuotas primarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la primera alícuota primaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas a la segunda alícuota primaria;

(s) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas primarias con las etiquetas de ácido nucleico primarias proporcionadas;

(t) combinar las al menos dos alícuotas primarias;

(u) dividir las alícuotas primarias combinadas en al menos dos alícuotas secundarias, las al menos dos alícuotas secundarias comprenden una primera alícuota secundaria y una segunda alícuota secundaria; (v) proporcionar etiquetas de ácido nucleico secundarias a las al menos dos alícuotas secundarias, en donde las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la primera alícuota secundaria son diferentes de las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas a la segunda alícuota secundaria; y

(w) acoplar las moléculas de ADNc dentro de cada una de las al menos dos alícuotas secundarias con las etiquetas de ácido nucleico secundarias proporcionadas.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde cada una de las etiquetas de ácido nucleico comprende:

una primera hebra que comprende:

una secuencia de código de barras que comprende un extremo 3' y un extremo 5'; y

una secuencia de hibridación en 3' y una secuencia de hibridación en 5' que flanquean el extremo 3' y el extremo 5' de la secuencia de código de barras, respectivamente; y

una segunda hebra que comprende:

una primera porción complementaria a al menos una de la secuencia de hibridación en 5' y la secuencia adaptadora; y una segunda porción complementaria a la secuencia de hibridación en 3'.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende, además:

ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a las moléculas de ADNc.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la ligación se realiza dentro de la primera pluralidad de células.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende, además:

ligar al menos dos de las etiquetas de ácido nucleico que se unen a las moléculas de ADNc liberadas.